KR100254759B1 - 단량체 및 이량체 항체-단편 융합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항체의 Fv-단편을 포함하나 불변 항체 도메인을 이용하지 않는 새로운 부류의 항원 결합 분자를 제공한다. 또한 이들 분자는 다른 항체 단편 분자 또는 비-항체 단편 분자와 이량화되어 각각 이- 또는 다-작용성 항체-단편 융합 단백질 및 소위 미니항체를 형성한다. 신규 융합 단백질은 진단 및 치료 의학의 광범위한 분야에서 사용될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
단량체 및 이량체 항체-단편 융합 단백질
[기술분야]
본 발명은 항체의 Fv-단편을 포함하나 항체의 불변 도메인을 이용하지 않는 새로운 부류의 항원 결합 분자에 관한 것이다. 이들 분자는 또한 다른 항체 단편 분자 또는 비-항체 단편 분자와 이량화 되어 각각 이- 또는 다-작용성 항체-단편 융합 단백질 및 소위 미니 항체를 형성할 수 있다. 신규의 융합 단백질은 진단 및 치료 의학의 폭넓은 분야에서 이용될 수 있다.
[배경기술]
최근에 좀더 특이적이고 개개적인 항체 분자를 얻기 위하여 천연의 항체를 변형시키는 생물공학 분야에 많은 관심이 집중되고 있다. 이에 (변형된)항체 단편을 생산하려는 노력이 경주되어 왔다. 모든 종류의 천연 항체는 적어도 2 개의 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 Fab 단편과 같은 1 가 단편보다 더 높은 친화성(매우 높은)으로 항체를 표면에 결합하게 한다. 최근에 작용성 항체 단편을 대장균에서 생산할 수 있는 방법이 보고되었다[Skerra ＆ Pluckthun, 1988, Science 240, 1038-1040; Better et al., 1988, Science 240, 1041-1043].
이 단편들은 FV단편(VH및 VL로 구성되는 헤테로이량체) 및 Fab 단편 (H-사슬의 첫번째 두 도메인 VH및 CH1뿐만 아니라 VL및 CL도메인을 가지는 완전한 L-사슬로 구성됨)을 포함한다.
그러나 FV단편은 VH및 VL로 해리되는 경향이 있어 두 도메인이 공유적으로 결합하기 쉽다. 이들을 결합시키는 특정한 한 방법은 VH-링커-VL또는 VL-링커-VH방향성을 가지는 펩티드 링커를 설계하는 것이다[Bird et al., 1988, Science 242, 423; Huston et al., 1988, Proc. Natl, Acad. Sci, USA 85, 5879]. 생성된 단편은 단일 사슬 FV단편으로 불리운다.
그러나, 이들 모든 단편들은 1 가 단편이다. 본 발명자들은 본 발명에 의해 양쪽성 나선을 형성하는 펩티드에 기초한 작은 이량화 도메인을 설계하는 방법을 개시한다. 이 펩티드는 "개재자"(intercalating) 로 언급되며 이 용어는 이량화 접촉면의 특정 구조에 대한 한정이 아니라 표적된 결합능을 나타냄을 의미한다.
본 명세서에 기술된 방법이 원칙적으로 Fab, FV또는SCFV단편에 적용된다 할지라도 그 이용이 가장 바람직한 것은 후자의 것이다. 이 경우, 2 가 단편은 매우 작은 크기로 구성될 수 있으며 단편 사슬의 잘못된 연결, 예컨대 VL-VL뿐만 아니라 VL및 VH로의 해리도 여전히 방지될 수 있다.
작은 크기의 항체 단편이 많은 분야에서 특히 바람직하다. 진단 분야(예컨대, ELISA, RIA 등)에서, 작은 분자 표면은 비특이적인 상호작용의 문제점을 감소시키며, 이는 흔히 불변 도메인과 관련된다. 친화성 크로마토그래피에서 리간드로 항체 단편을 사용하는 경우에도 마찬가지이다. 종양의 진단 또는 치료에 있어, 주입된 항체의 상당한 비율이 조직을 투과하여 종양으로 이송되는 것이 중요하며 이는 분자 크기에 좌우된다[Colcher et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82, 1191-1197]. 또한 재조합 단백질의 발현 수율 및 분비 효율도 사슬 크기의 함수이며[Skerra ＆ Pluckthun, 1991, Protein Eng. 4, 971] 따라서 작은 크기의 단백질이 이와 같은 이유에서 바람직하다. 그러므로 작은 크기의 분자는 여러가지 면에서 바람직하다.
이전에는 항체의 분자 크기를 감소시키는 것은 단백질분해성 단편의 제조를 의미하였다. 가장 작은 2 가 단편인(Fab)'2단편은 여전히 본 발명 단편의 크기의 약 2배이다. 그러므로 이들 신규의 단편은 3 가지 특성을 함께 가진다; a) 작은 크기, b) 2 가 또는 2 작용성 및 c) 대장균에서 작용적 발현능.
많은 분야에서 이작용성 항체에 대한 관심이 증가하고 있다. 이작용성 항체는 동일한 항원의 두 에피토프에 대해 또는 다른 두 항원에 대해 다른 두 특이성을 가지는 것으로 정의될 수 있다.
최근에 이작용성 항체를 생산하는 다양한 방법이 개발되고 있다. 그러나 이들 방법은 생체내에서 전적으로 이작용성 항체를 생한하지는 않으며 분자의 혼합물 형태로 항상 생성되어 복잡하고 비용이 많이 소요되는 분리 공정을 필요로 한다.
4가지의 주요 방법으로 구분될 수 있다. 첫번째는 헤테로 이작용성 가교결합제를 바람직하게 이용하는 화학적 가교결합을 이용한다. 이 방법에 의하여 전 항체(Staerz et al., 1985, Nature 314, 628; Perez et al., 1985, Nature 316, 354-356), Fab 단편(Carter et al., 1992, Biotechnology 10, 163) 및 scFv 단편(Cumber et al., 1992, J. Immunol. 149, 120)은 정제후 화학적으로 가교결합된다.
제 2 방법은 2개의 하이브리도마의 융합에 의하여 소위 헤테로하이브리도마 또는 "쿼드로마(quadroma)"를 형성하는 방법이다. 이 방법에서는 L-사슬은 H-사슬과 쌍을 지을 수 있으며 두 H-사슬은 호모이량체 또는 헤테로이량체를 형성하여 매우 복잡한 혼합 생성물을 초래한다[Milstein ＆ Cuello, 1983, Nature 305, 537].
제 3의 방법은 제 2 방법과 연관되며 제 2 항체의 H- 및 L- 사슬을 암호화하는 두 발현 플라스미드(Lenz ＆ Weidle, 1990, Gene 87, 213) 또는 레트로바이러스 벡터(De MOnte et al., 1990, Acad. Sci. 87, 2941-2945)를 하이브리도마 세포에 형질감연시키는 것으로 구성된다. 그러나, 일단 도입되면, 혼합 생성물은 제 2 방법에서와 동일하다.
마지막 방법은 항체를 환원, 혼합 및 재산화시키는 방법이다[Staerz ＆ Bevan, 1986, Immunology Today 7]. 이 방법도 매우 복잡한 혼합 생성물을 형성하며 복잡한 분리 및 품질 조절 공정이 요망된다.
따라서 여전히 화학적 가교결합으로부터 요망되는 복잡한 제조과정없이 직접 배타적으로 헤테로이량체 항체를 단리하는 방법이 필요하다. 본 발명에서 이러한 문제점은 i) scFv 단편의 대응 VH및 VL도메인을 공유결합시키고 ii) 특정 류신 지퍼(zipper) 및 유도체와 같은, 헤테로이량체만을 형성하게 하는 이량화 도메인을 이용함으로써 해결될 수 있다.
본 발명의 다른 중요한 점은 상기에서 상세히 설명한 바와 같은 이유에서 이특이적 항체의 분자량(MW)을 가능한 작게 만든다는 점이다. 이 점은 scFv 단편을 이용함으로써 달성된다.
이특이적 항체의 다양한 용도가 기술되어 있으며 이들 용도의 대부분의 새로운 기술로부터 유래된다. 예컨대 이특이적 항체는 종량의 치료에 특히 유용하다. 항체의 한 팔(arm)은 종양 표지에 결합하고 다른 팔은 T-세포 에피토프, 독소 또는 방사핵종 결합 펩티드 또는 단백질에 결합하여 종양 세포를 죽이는 작용을 부여할 수 있다. 진단 분야에서, 한 팔은 해당 분석물과 결합하고 다른 팔은 용이하게 정량화할 수 있는 요소, 예컨대 효소에 결합한다. 끝으로 세포적 용도에서는 동일한 세포 표면에서 2 개의 다른 에피토프 또는 동일한 단백질 복합체가 인식될 수 있거나 또는 2 개의 다른 단백질이 인식될 수 있다면 더 높은 결합 선택성이 얻어지는 것이 바람직하다.
따라서 본 발명의 목적은 2- 또는 다-작용성 결합 부위를 가지는 신규의 개개적인 안정한 항체 단편 융합 단백질을 제조하는 것이다.
Fv-단편을 함유하는 항체 단편 융합 단백질을 특이적이고 개선된 성질을 나타내는 유전공학적 방법으로 생산될 수 있다.
그러므로 본 발명의 목적은 비공유 상호작용에 의하여 다른 펩티드와 이량화될 수 있는 펩티드 및 항체의 Fv-단편으로 필수적으로 구성되는 단량체 항체 단편 융합 단백질을 제공하는 것이다.
"비공유 상호작용" 이란 용어는 공유결합과 관련이 없는, 정상 조건하에서 존재하는 모든 안정한 결합, 예컨대 반데르 발스 힘, 양친매성(amphiphilic) 펩티드(특히 펩티드 나선)의 (입체적) 맞물림(interdigitation), 반대 전하를 띠는 아미노산 잔기를 가지는 펩티드에 의한 결합을 의미한다. 해당하는 유효 펩티드는 상기 및 하기에서 상호작용 또는 개재 펩티드로 언급된다. 양친매성 펩티드는 50 개이하의 아미노산으로 구성된다. 바람직하게는 이들은 10 내지 30 개의 아미노산으로 구성된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상호작용 펩티드는 펩티드 나선 번들 (나선, 돌기(turn) 및 또하나의 나선으로 구성됨, 상기 참조)이다. 다른 구체예에서, 상호작용 펩티드는 매 7 번째 아미노산이 류신 잔기인, 몇개의 반복 아미노산을 가지는 펩티드로 구성된 류신 지퍼이다. 본 발명에 따른 다른 경우에 있어서 상기 펩티드는 (+) 또는 (-) 전하를 디는 잔기, 예컨대 라이신 (+) 또는 글루탐산(-)을 가져 이 펩티드(제 1 단량체 단위)가 반대 전하를 띠는 다른 펩티드(제 2 단량체 단위)와 결합할 수 있게 한다.
Fv-다편과 개재 펩티드는 함께 링커 펩티드에 의해 결합되거나 직접 결합되는데 링커 펩티드에 의해 결합되는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 링커 펩티드는 항체의 힌지 영역 서열이다.
정의한 바와 같이, Fv-단편은 항체의 VL및 VH영역으로 구성된다. 본 발명에 따른 Fv-단편은 바람직하게는 단일 사슬 단편이다. 단일 사슬 단편은 표준 링커 분자를 이용한 표준 기술에 따라 얻어질 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 하나 이상의 단량체 단위가 상기한 바와 같이 항체-Fv-단편 융합 단백질인 2 개의 단량체 융합 단백질로 필수적으로 구성되는 이량체 융합 단백질이다(여기서, 단량체 단위의 결합은 같거나 다른 펩티드의 비공유 상호작용에 기초한다.)
이량체가 2 개의 Fv-단편을 함유한다면 Fv-단편은 같을 수 있거나(동일한 항원 결합 부위) 또는 다를 수 있다(다른 항원 결합 부위). 이들 경우에 일- 및 이-특이적(Fv)-미니항체가 얻어질 수 있다. 본 발명에 따라서, 이특이적 미니-항체가 바람직하다.
상호작용 펩티드는 같거나 또는 다를 수 있다. 동일한 것이 바람직하다. 개재 펩티드는 평행 또는 역평행 형태로 결합될 수 있다.
그러므로 본 발명의 목적은 무엇보다도 다른 특이성(항원 결합 부위)을 가지는 2개의 Fv-단편 및 동일한 개재 나선 펩티드로 구성되는 이량체 융합 단백질이다(항체 단편 및 펩티드는 함께 힌지 영역 서열에 의해 결합된다).
또한 본 발명의 목적은 Fv-단편이 비-항체 펩티드로 대체된 Fv-단편 및 다른 단량체 단위를 포함하는 단량체 단위로 구성되는 이량체이다. 비-항체 펩티드는 리신과 같은 독소, 킬레이트화제 또는 금속 결합 펩티드 또는 효소(예컨대 표지 효소), 또는 검출가능한 표지(예컨대 방사선 동위원소)를 함유하는 펩티드일 수 있다.
또한 비-항체 펩티드는 상기 그룹에 대한 대응 결합 부위를 가질 수 있다. 결합 부위에는 T-세포 또는 T-세포 단편에 대한 결합 부위가 포함된다.
또한 본 발명은 상호작용 펩티드가 상기한 바와 같이 표적 단백질/펩티드에 C-말단에서 부가적으로 융합된(대응 결합 부위가 포함됨), 상기 한 바와 같은 단량체 및 이량체에 관한 것이다. 따라서 생성된 융합 단백질 및 미니항체는 각각 다작용성이다.
또한 본 발명은 Fv-단편, 상호작용 펩티드 및 필요하다면 링커 펩티드를 암호화하는 유전자를 발현 플라스미드에 클로닝하고 이 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환시키고 자양액에서 숙주 세포를 배양하고 단량체 융합 단백질이 세포에서 발현되거나 또는 배지에 분비되는 것을 특징으로 하는, 상기한 바와 같은 단량체 항체 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
끝으로, 본 발명의 목적은 완전한 단량체 용합 단백질 또는 그의 부분을 암호화하는 유전자를 하나 이상의 발현 플라스미드에 클로닝하고 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환시키고 숙주 세포를 자양액에서 배양하고 완전한 이량체 융합 단백질을 세포에 또는 배지에 발현시키거나 또는 단량체 융합 단백질을 별도로 발현시키고 두 단량체 단위사이의 비공유 결합이 배지 또는 실험관내에서 형성되고 융합 단백질의 일부만이 클로닝될 경우에 단백질 조작 단계는 부가적으로 표준기술에 따라 실시하는 것을 특징으로 하는, 상기한 바와 같은 이량체 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 융합 단백질을 함유하는 이량체 Fv-단편은 대응 항원에 대한 높은 친화성 및 만족스러운 안정성을 나타낸다. 이들 신규한 2 가 또는 이작용성 분자는 대장균에서 접히고 조립된 분자로 제조될 수 있다. 이들 미니항체는 분비에 의한 작용적 발현과 화합가능하다.
[발명의 상세한 설명]
올리고머화 도메인은 바람직하게 작은 분자량을 가지고 막을 통한 단백질의 이송작용과 화합될 수 있는 것을 기준으로 선택한다. 이들은 양친매성 나선의 다른 두 유형에 기초한다.
양친매성 나선은 전적으로는 아니지만 주로 다른 두 분자 구조와 관련되는 것으로 알려져 있다: 4 개의 나선 번들 및 감겨진 코일. 나선 번들의 설계 및 제조는 이미 연구되어 있다[Eisenberg et al., 1986, Proteins 1, 16-22; Ho ＆ deGrado, 1987, J. Am. Chem. Soc. 109, 6751-6758; Regan ＆ deGrado, 1988, Science 241, 976-978; Hill et al., 1990, Science 294, 543-546]. 또한 이 분자 결합은 천연 단백질에도 알려져 있다[Richardson, 1981, Adv. Prot. Chem. 34, 167].
4 개의 별도 분자(각각은 1 개의 나선을 형성), 각각 2 개의 나선을 함유하는 2개의 분자(나선-돌기-나선 형태로 연결), 또는 나선-돌기-나선-돌기-나선-돌기-나선 모티프를 함유하는 1 개의 분자로부터 4개의 나선 번들이 형성될 수 있다. 이량화 및 다량화를 위해서는 첫번째의 두 분자만이 적당 하다.
후자의 3 개 변형을 시험하였다. 첫번째에서는 아이젠베르그(Eisenberg et al., 1986, Proteins 1, 16-22)가 제시한 서열의 한 나선을 이용하였다. 두번째에서는 이 서열에 시스테인으로 끝나는 작은 친수성 펩티드를 연장시켰다. 일단 나선이 연결되면 친수성 펩티드는 충분하게 근접되어서 이들이 충돌하여 대장균의 주변세포질(periplasm)과 같은 산화 조건하에서 이황화결합이 형성될 수 있다. 세번째 변형에서는 짧은 돌기 암호화 펩티드로 분리된 나란한 두 나선을 이용하였다.
두번째 설계에서 소위 감겨진 코일 구조를 형성할 수 있는 펩티드를 사용한다. 이와 같은 펩티드는 효모의 GCN4와 같은 전사 인자에서 찾아 볼 수 있으며 류신 지퍼라고 불리운다[Landschulz et al., 1988, Science 240, 1759-1764]. 이 펩티드의 결정 구조는 최근에 밝혀졌으며[O'Shea et al., 1991, Science 254, 539-544] 나선의 평행한 배열을 나타냈다.
나선의 공유 결합은 다시 시스테인을 함유하는 작은 펩티드 신장에 의하여 가능하다. 나선은 이제 평행하기 때문에 펩티드 신장은 거리가 더욱 짧아져 더욱 작아질 수 있다.
그러나 다양한 이량화 수단(개재 나선)은 직접 항체 도메인에 융합되지는 않는다. 나선의 시작부와 scFv 단편 말단사이에 유연성 펩티드를 도입하는 것이 바람직하다. 예로서, 마우스 IgG3의 상단 힌지 영역을 사용하였다. 그러나 다양한 힌지를 사용할 수 있다. 이것은 이량화 자체에는 필요하지 않으나 전체 항체의 항원 결합 부위와 유사한 두개의 scFv 도메인의 공간을 제공한다. 이러한 방법으로 두 결합 부위는 더 큰 간격의 거리로 떨어져 있으며 그럼으로써 고체 표면상에서 인접한 항원에 이를 수 있다.
항체의 천연 힌지는 2 가 미니항체에서 힌지의 바람직한 구체예이다. 이작용성 미니항체의 경우에 힌지는 다른 표면으로부터의 분자가 가능한 근접하여 가교결합되어야 하며 이량체의 유연성이 필요하지 않기 때문에 더욱 짧을 수 있다. 힌지의 선택은 원하는 잔기 서열, 길이(Argos, 1990, J. Mol. Biol. 211, 943-958), 접힘 구조와의 화합성 및 양친매성 나선의 안정성(Richardson ＆ Richardson, 1988, Science 240, 1648-1652), 분비 및 프로타제에 대한 내성 등의 요소에 의하여 좌우된다.
본 발명은 이량화 수단으로 펩티드를 이용하나 이것은 가능한 작아야 한다. 바람직한 한 구체예는 양쪽성 나선을 형성할 수 있는 펩티드를 이용하는 것이다. 이와 같은 나선은 이량화 또는 다량화에 의해 소수성 표면을 차단한다. 이와 같은 유형의 나선은 나선의 한 면에 소수성 부분을 가지고 충분한 수의 나선-형성 잔기를 포함하는 특징을 가진다. 이와 같은 펩티드에 대한 요건은 문헌에 기술되어 있다[Eisenberg et al., 1986, O' Shea et al., 1991, Science 254, 539-544, 1992, Cell 68, 699-708].
이와 같은 유형의 천연 펩티드는 류신(매 7 번째 잔기) 및 다른 친수성 잔기(예컨대 발린; 역시 매 7 번째 잔기)의 주기적인 존재를 특징으로 하는 소위 류신 지퍼로 알려져 있다. 이와 같은 규칙이 알려짐으로써(상기한 문헌 O'shea et al., 1991, 1992) 서열은 바람직하지 않는 호모이량체를 결합시키나 헤테로이량체의 결합에 유리한 잔기를 혼입시켜 변형시킬 수 있다. 이와 같은 서열의 변화는 예컨대 전하 브리지의 혼입과 관련 되어 호모이량체에서는 전하가 서로 반발하고 헤테로이량체에서는 반대 전하가 서로 끌어 당긴다(하기 참조).
또한 본 발명은 이작용성 미니항체에 연장될 수 있다. 이 경우 호모이량체가 아닌 헤테로이량체만을 형성하게 하는 이량화수단(개재 펩티드)이 사용되어야 한다. 이와 같은 본 발명의 바람직한 구체예는 천연 류신 지퍼, 예컨대 전사 요소 단백질 준(jun) 및 포스(fos)[O'Shea et al., 1989, Science 245, 646-648]로부터 2 개의 다른 감겨진-코일 나선이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 불변 scFv-힌지-나선은 C-말단에서 연장되어 융합 단백질을 형성한다. 예컨대 효소에의 융합이 이루어져 이와 같은 2 가 구성체를 진단 분야에 이용할 수 있다. 이와 같은 효소로는 예컨대 알칼라인 포스파타제, 루시페라제 또는 양 고추냉이 과산화효소와 같은 효소를 들 수 있다. 항체-효소 융합 단백질의 장점은 항체의 2 가 작용성이 표면-결합 항원에의 결합을 증가시킬 수 있다는 점이다. 종래 기술(즉, 선택 효소에의 항체의 화학적 커플링)에 의해 제조된 융합 단백질에 대한 장점은 더 높은 배치-투-배치(batch-to-batch) 밀도, 생성물의 균일성 및 단순한 제조 방법, 즉 대장균에서 단일 단계로 이루어지는 더욱 단순환 제조 방법 등을 들 수 있다.
동일한 방식으로 미니항체는 독소를 혼입하기 위하여 C-말단에서 연장될 수 있다. 이와 같은 면역독소는 2 가이거나 또는 이특이적이고 따라서 면역독소에 대해 알려진 종양 치료법의 장점 및 상기에서 결합된 항체 단편의 장점을 함께 가지게 된다. 유사하게 금속 결합 펩티드 또는 단백질은 유전공학적으로 결합되어 종양 영상화 또는 방사선 면역요법에 사용될 수 있다. 유전공학적으로 암호화된 하이브리드 단백질에 대한 장점이 항체-효소 웅합에 대해 상기에서 주어진 바와 같이 동일하게 적용된다.
본 발명의 다른 구체예에서, scFv-힌지-나선 유형의 구조체는 이특이적 미니항체의 형성에 대하여 상기한 바와 완전히 유사하게 이량화 도메인에 융합된 다른 단백질과 이량체를 형성하도록 만들어질 수 있다. 이와 같은 방식으로는 scFv 단편은 예컨대 포스 단백질의 나선과 어울릴 수 있다. scFv 단편과 헤테로이량체를 형성하도록 만들어질 수 있는 이와 같은 외부 단백질은 방사선 면역요법 또는 방사선 영상화에 유용한 진단, 독소, 금속-결합 펩티드 또는 단백질에 유용한 효소이다.
본 발명의 원리에 따라서 본 발명에서 주어진 이량화 도메인은 또한 정제 목적으로도 사용될 수 있다. 어떠한 종류의 재조합 단백질도 이량화 도메인, 예컨대 힌지-포스-지퍼에 융합될 수 있다. scFv-힌지-준과의 동시발현후 헤테로이량체는 scFv-특이성에 대한 친화성 컬럼으로 한 단계로 정제할 수 있다. 다른 방법으로는 컬럼 지지체에 결합된 "상반(opposite)" 지퍼는 조 세포 추출물로서 컬럼을 통과할 경우 단백질-힌지-지퍼를 포획한다(catch).
컬럼으로부터 순수 융합 단백질의 용출은 지퍼의 풀림 온도를 이용함으로써 가능하다. 이량화 도메인으로부터 후속적인 분리는 단백질분해 부위, 예컨대 혈액 응고 인자 Xa 를 힌지에 도입함으로써 달성될 수 있다[Nagai ＆ Thogerson, 1987, Meth, Enzymol. 152, 461-481].
본 발명에서 기술된 미니항체의 특정 장점은 대장균에 작용성을 모을 수 있는 능력이다. 호모 2가 구성체의 경우에 호모 이량체를 형성하게 하는 이량화 원칙이 이용된다. 상기한 예는 효모 단백질 GCN4의 감겨진 코일 나선(류신 지퍼) 또는 역평행 4-나선 번들로부터의 나선이다. 이 경우에 scFv 단편은 박테리아 신호 서열의 존재하에 발현되어 scFv 단편 유전자의 말단에 이량화 나선 또는 나선-돌기-나선 및 힌지를 위한 코돈을 가진다. 나선은 대장균의 주변세포질 공간에의 분비와 화합될 수 있다(주변세포질 공간에서 단백질 접힘, 이황화 결합의 형성 및 조립이 일어난다). 이 조건하에서, 호모이량체 단백질은 자체적으로 형성되어 이량체 형태로 직접 단리될 수 있다.
헤테로 2가 구성체가 요망될 경우에는 다른 단백질과 결합되는 한 scFv 단편 또는 2 개의 다른 scFv 단편이 결합될 필요성이 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 조립될 두 단백질은 동일한 세포에서, 바람직하게는 2 시스트론 오페론으로서 동일한 플라스미드상에서 발현된다. 인위적인 2 시스트론 오페론의 설계는 예컨대 문헌[Skerra et al., 1991, Protein Eng. 4, 971]에 설명되어 있다. scFv 단편은 산화 환경에서만 접힘으로 인하여, 조립은 주변세포질에서 일어나야 하기 때문에 두 단백질은 이송되어 신호 서열과 맞아야 한다. 이량화 펩티드는 다른 두 단백질의 결합을 촉진하고 각 호모이량체의 결합을 방지하도록 선택되어야 한다. 이와 같은 단백질의 예로는 단백질 포스 및 준(상기 참조)의 류신 지퍼 펩티드를 들 수 있다.
동일한 세포에서 발현되지 않을 경우 다른 scFv-힌지-지퍼 구성체는 조 세포 추출물 또느 정제된 단백질로서 함께 혼합되고 높은 온도로 처리되어야 한다. "상반" 지퍼가 없을 경우에는 예컨대 scFv-힌지-준-지퍼 구성체는 호모이량체를 형성할 수 있다. 약 40℃의 용융 온도까지 잠시 가열한 후 원하지 않는 호모이량체의 지퍼는 풀리고 더욱 안정한 헤테로이량체를 형성한다[O'Shea et al., 1992, Cell 68, 699-708]. 온도를 높이지 않고 실험관내에서 헤테로이량체의 형성은 실험한 바와 같이 불가능하다.
[도면 및 서열표의 간단한 설명]
제1도는 scFv 단편을 함유하는 scFv-발현 벡터 pLISC-SE.
제2도는 2 시스트론 scFv-힌지-지퍼 발현 벡터 pACKxFyJ.
제3도 작용적 ELISA; OD280으로 측정한 친화성 정제 단백질의 농도(세로축)는 웰당 결합 부위의 몰 수(가로축)를 의미한다. ELISA 플레이트는 포스포콜린-BSA으로 피복되고 정제된 포스포콜린-특이적 미니항체-단백질이 결합되었으며 항-McPC 603 항혈청을 검출되었다.
제3a도는 다양한 미니항체의 비교를 나타내고,
제3b도는 ScFv 및 전체 IgA와 미니항체 scHLXc의 비교를 나타낸다.
제4도 작용성 항-라이소자임 ELISA; 동시발현된 항-PC-안티-라이소자임 이특이적 미니항체의 PC-친화성 정제 샘플. 가로축상의 O 및 X는 억제자의 유/무를 의미한다.
첨부된 서열표는 서열 식별 번호를 나타낸다.
서열 식별 번호 1 : pLISC-SE 벡터의 전체 뉴클레오티드- 및 아미노산 서열.
서열 식별 번호 2 : 개재성 GCN4-류신 지퍼의 유전자 카셋트(뉴클레오티드- 및 아미노산 서열).
서열 식별 번호 3 : 개재성 역평행 나선-돌기-나선을 암호화하는 유전자 카셋트 (뉴클레오티드- 및 아미노산 서열).
서열 식별 번호 4 : 개재성 준-지퍼 및 IgG3-힌지 영역을 암호화하는 유전자 카셋트.
서열 식별 번호 5 : 개재성 포스-지퍼 및 IgG3-힌지 영역을 암호화하는 유전자 카셋트.
서열 식별 번호 6 : 개재성 준-지퍼 및 설계된 링커를 암호화하는 유전자 카셋트.
서열 식별 번호 7 : 개재성 포스-지퍼 및 설계된 링커를 암호화하는 유전자 카셋트.
[실시예 1]
개재 펩티드 유전자를 도입하기 위한 제한 부위를 포함하는, 분비된 단일-사슬 단일-사슬 단편을 위한 벡터의 제조
재조합 DNA-기술은 삼브룩[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, New York]의 문헌에 기술된 바에 따랐다. 대장균 JM83에서 단일-사슬 Fv 단편 및 미니항체의 작용성 발현은 pASK-lisc 벡터(Skerra et al., 1991, Protein Eng. 4, 971)와 유사한 벡터로 실시하였다. 부위 지향 돌연변이는 헬퍼 파지 M13K07(Vieira ＆ Messing, 1987, Meth. Enzymol. 153, 3-11)를 이용하여 쿤켈(Kunkel et al., 1987, Meth. Enzymol 154, 367-382) 및 게이셀소더(Geisselsoder et al., 1987, Biotechniques 5, 786-791)의 방법에 따라 직접 실시하였다. SDS-PAGE는 플링 및 그레게르슨(Fling ＆ Gregerson, 1986, Anal. Biochem. 155, 83-88)의 방법에 따라 실시하였다. 친화성-정제 단백질의 농도는 계산된 소광 계수를 이용하여 OD280으로 측정하였다(Gill ＆ von Hippel, 1989, Anal. Biochem. 182, 319-326). 복제 개시점, 조절 가능 프로모터, 박테리아 신호 서열 및 그 뒤의 다수의 클로닝 부위, 전사 종결자 및 단일 가닥 파지를 위한 개시점을 포함하는, pASK40(Skerra et al., 1991, Protein Eng. 4, 971)과 같은 벡터를 사용하였다. 단일-사슬 Fv 단편에 대한 유전자는 다음과 같이 설계하였다: VH도메인의 뉴클레오티드 서열 바로 뒤에 바람직하게는 약 15 잔기, 바람직하게는 서열 (Gly4Ser)3이 위치하고, 그 뒤에 VL도메인의 서열이 위치한다. 다른 한편으로는 VL도메인 서열 바로 뒤에 링커 서열 및 그 뒤에 VH도메인 서열이 위치한다.
항체의 서열이 밝혀져 있을 경우 scFv 단편의 완전한 유전자는 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있다. 항체 유전자의 유전자 합성을 위한 상세한 실험 공정은 문헌[Pluckthun et al., 1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 105-112]에 기술되어 있다.
VH및 VL도메인의 유전자가 다른 벡터에 존재할 경우 scFv 단편을 위한 유전자는 제한 단편으로부터 조립될 수 있다. 예컨대 VH도메인의 대부분을 암호화하는 제한 단편은 다른 플라스미드로부터 잘려질 수 있으며 VL도메인의 대부분을 암호화하는 단편은 또 다른 플라스미드로부터 잘려질 수 있다. scFv 단편을 위한 링커 및 VL및 VH의 나머지 부분은 합성 올리고뉴클레오티드의 카셋트에 의해 제공될 수 있으며 이 카셋트는 표준 방법에 의해 연결될 필요성이 있다[Sambrook et al., 1989, 상기한 문헌]. 단편의 혼합물을 벡터 pASK40 또는 적당한 제한 부위 쌍을 함유하는 유사한 플라스미드에 연결한다.
항체의 유전자가 미리 클로닝되지 않았을 경우에는 이들은 중합효소 연쇄 반응(PCR; PCR 방법은 McPherson et al., 1991, PCR-A Practical Approach Oxford University Press, New York에 기술되어 있다)에 의해 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 직접 얻어질 수 있다. VH및 VL도메인의 증폭에 적합한 프라이머는 오랜디(Orlandi)등의 (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837), 휴스(Huse)등의 (1989, Science 246, 1275-1281) 및 라릭(Larrick) 등의 (1989, Biotechnology 7, 934-938)로부터 입수하였다. 하이브리도마로부터 mRNA을 얻는 방법은 상기 문헌에 역시 기술되어 있다. 각각의 VH및 VL유전자는 별도의 벡터에 클로닝될 수 있으며 scFv 유전자는 상기한 바와 같은 원칙에 따라 조립될 수 있다.
연결된 단편이 scFv 단편의 올바른 해독틀을 형성하지 않을 경우 플라스미드상에 있는 신호 서열 코돈과의 정교한 융합을 부위 지향 돌연변이법으로 형성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 설계 및 실행은 당업자에 자명하다.
이렇게 얻어진 scFv 발현 플라스미드는 조절가능한 플로모터의 통제하에 박테리아 신호 서열을 위한 코돈, 바로 뒤에 제 1 가변 도메인(VH또는 VL), 링커 및 제 2 가변 도메인(VH또는 VL)을 포함한다.
scFv 단백질의 C-말단에 대응하는 이 유전자의 3' 말단에 독특한 제한 부위를 발현 플라스미드로 도입하여 개재 펩티드를 암호화하는 카셋트를 삽입한다. 제한 부위는 문헌[Kunkel, 1987, Meth. Enzymol. 154, 367-382]의 방법에 따라 부위 저향 돌연변이법으로 도입 하였다.
개재 펩티드를 수용하기에 적합한 단일-사슬 Fv 발현 플라스미드 pLISC-SE의 완전한 서열 예는 제 1 도 및 서열 식별 번호 1에 도시되어 있다(서열표 참조).
[실시예 2]
류신 지퍼의 개재 펩티드를 암호화하는 유전자 카셋트의 설계 및 제조
scFv 단편 유전자의 3' 말단에 제한 부위와 화합가능하도록 제한 부위와 적합하게 만들어진 유전자 카셋트는 힌지(scFv 단편을 개재 펩티드에 연결) 및 개재 펩티드 자체의 서열을 암호화하여야 한다. 그러나 힌지 영역은 제외될 수 있다.
예로서 마우스 IgG3(Dangl et al., 1988 EMBO J 7, 1989-1994)의 상부 힌지 영역의 서열, 그 다음 효모 단백질 GCN4(Oas et al., 1990, Biochemistry T29, 2891-2894)의 류신 지퍼 서열은 흔히 사용되는 대장균 코돈에 역-해독된다(서열 식별 번호 2). 올리고뉴클레오티드를 합성하고 미리 EcoRI 및 Hind III로 절단된 벡터 pLISC-SE에 연결한다.
[실시예 3]
4-나선 번들이 개재 펩티드를 암호화하는 유전자 카셋트의 설계 및 제조
실시예 2와 유사하게 마우스 IgG3의 상부 힌지 영역, 그 다음 4 나선 번들(Eisenberg et al., 1986, 상기한 문헌)의 나선-돌기-나선의 서열을 흔히 사용되는 대장균 코돈으로 역해독한다(서열 식별 번호 3). 올리고뉴클레오티드를 합성하고 미리 Eco RI 및 Hind III로 절단된 벡터 pLISC-SE에 연결한다.
[실시예 4]
류신 지퍼의 개재 펩티드를 암호화하는 두 유전자 카셋트의 설계 및 제조 및 이들의 동시발현
실시예 2와 유사하게 마우스 IgG3의 상부 힌지 영역, 그 다음 준 단백질(O'Shea et al., 1992, 상기한 문헌)의 지퍼 서열을 흔히 사용되느 대장균 코돈으로 역해독한다(서열 식별 번호 4), 올리고뉴클레오티드를 합성하고 미리 Eco RI 및 Hind III로 절단된 벡터 pLISC-SE에 연결한다.
평행 반응에서 마우스 IgG3의 상부 힌지 영역, 그 다음 포스 단백질(O'Shea et al., 1992, Cell 68, 699-708)의 지퍼 서열을 흔히 사용되는 대장균 코돈으로 역해독한다(서열 식별 번호 5). 올리고뉴클레오티드를 합성하고 미리 Eco RI 및 Hind III로 절단된 벡터 pLISC-SE에 연결한다. 이렇게 얻어진 두 벡터는 각각 다른 항체 scFv 단편, 그 다음 힌지 펩티드 및 그 다음 다른 류신 지퍼 펩티드를 암호화한다. 두 scFv 단편을 동시발현시키기 위하여 포스-함유 생성물의 전체 scFv-힌지-지퍼 유전자를 Xba I-Hind III 단편으로서 벡터로부터 잘라내고 이미 다른 항체의 scFv 유전자를 포함하는 pLISC-SE-scFv-준 벡터에 연결한다.
그 다음 새로이 얻어진 벡터는 2 시스트론 오페론으로서 단일 프로모터로부터 scFv1-링커1-포스-지퍼 및 scFv2-링커2-준-지퍼를 발현한다.
포스 및 준 지퍼의 서열에서 힌지 영역에 대한 개선된 서열은 서열 식별 번호 6 및 7에 도시되어 있다. 이 힌지는 짧아서 단백질 분해작용에 민감하지 않다. 두 결합 부위간의 거리가 중요하지 않는 일부 경우에 따라서는 이와 같은 짧은 힌지가 바람직하다. 이 경우 scFv 단편의 "꼬리"는 짧아지며 개재 펩티드를 위한 유전자를 수용하는 EcoRI 부위는 4개 잔기 상류로 이동한다.
[실시예 5]
대장균으로부터 2 가 미니항체의 정제
실시예 2 및 3에서와 같이 제조한 플라스미드를 포함하는 대장균 JM83을 O.D. 550의 0.5 까지 배양하고 1mM 최종 농도에서 IPTG로 유도시킨다. 세포를 원심분리하고 BBS 와충 용액(200mM Na-보레이트, 160mM NaCl, pH 8.0)에 현탁하고 이 현탁액을 프렌치 프레스를 통과시킨다. 이들 실시예에서 포스포릴콜린 결합 미니항체를 사용한다. 미니항체는 상기한 바와 같이 포스포릴콜린 친화성 크로마토그래피를 통과시켜 정제한다(Chesebro ＆ Metzger, 1972, Biochemistry 11, 766-771).
[실시예 6]
대장균으로부터 이특이성 미니항체의 정제
실시예 2 및 3에서와 같이 제조한 플라스미드를 포함하고 2 개의 다른 scFv에 대한 2 시스트론 구조 유전자(제 2 도)를 함유 하는 대장균 JM83을 O.D. 550의 0.5까지 배양하고 1mM 최종 농도에서 IPTG로 유도시킨다. 세포를 원심분리하고 BBS 완충 용액(200mM Na-보레이트, 160mM NaCl, pH 8.0)에 현탁하고 이 현탁액을 프렌치 프레스를 통과시킨다.
이 실시에에서 벤조일-암피실린뿐만아니라 포스포릴콜린에 대한 특이성을 가지는 이특이성 미니항체를 사용한다. 미니항체는 상기한 바와 같이 포스포릴콜린 친화성 크로마토그래피를 통과시켜 정제한다(Chesebro ＆ Metzger, 1972, 상기 문헌).
[실시예 7]
2 가 미니항체의 표면 결합
ELISA-플레이트(Nunc, Macrosorp)를 PBS 완충 용액(20mM 인산염, pH 7.2, 115mM NaCl)에서 400g/ml 포스포콜린-BSA로 피복한다. 니트로페닐 포스포콜린(Sigma)으로부터 합텐 시약을 제조하고 이것을 환원시키고 기술한 바에 따라 디아조화하고(Chesebro ＆ Metzger, 1972, 상기 문헌) 4℃에서 48시간 붕산염 완충액(52.5mM 붕산 나트륨, pH 9, 120mM NaCl)에서 BSA(Sigma)로의 아조-커플링에 의해 반응시킨 다음 PBS에 대해 투석시킨다. PBS 완충액중에서 5% 끓임 우유(Nestle)로 피복되지 않은 플레이트 표면을 적어도 2 시간 차단시킨 후 주변세포질 추출물 또는 정제 단백질을 실온에서 90 분간 플레이트상의 BBS 완충액에서 배양한다. 3 회 세척한 다음 잔류 작용성 항체 단편을 갤라티(Gallati, 1979, Clin, Chem. Clin, Biochem. 17, 1-4)에 따라 과산화효소(Sigma)에 결합된 항-토끼 면역글로블린 및 토끼 항-McPC603 혈청으로 표준 공정(Harlow ＆ Lane, 1988, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 555-592)에 따라 검출한다.
높은 결합 및 그 결과인 감도를 단량체 scFv 단편과 비교하여 모든 미니항체 구조체에 대해서는 관찰한다. 결과는 동일한 표면에 2 또는 그 이상의 결합 부위에의 동시적 결합과 일치한다. 융합 단백질 scHLXc의 친화성을 천연 항체 McPC603과 비교하였으며 단량체 scFv 단편은 단지 100-배 높은 농도로 검출될 수 있는 반면 항원-피복된 ELISA로 검출될 수 있다(제 3a 도 및 제 3b 도). 모든 결하은 단량체 scFv 단편만 제외하고는 거의 전적으로 가용성 합텐으로 역제가능하다. 천연 항체가 가용성 포스포콜린에 대한 열역학적 친화성은 약 1.6 × 105M-1로서 상대적으로 약하며(Metzger et al., 1971, Proceedings of the 1stCongressof Imunology. Academic Press, New York, pp.253-267), 이러한 사실을 단량체 단편-합텐 복합체가 작용성 ELISA의 반복적인 세척 단계에 견디기에 충분하지 않음이 분명하다(Kemeny ＆ Challacombe, 1988, "ELISA and other solid phase immunoassays", Wiley ＆ Sons, New York).
[실시예 8]
이작용성 미니항체의 표면 결합
한 팔로 포스포릴콜린을 인식하고 다른 팔로 라이소자임을 인식하는 동시발현된 이작용성 미니항체를 포스포콜린(PC) 친화성 크로마토그래피로 정제하고 라이소자임 특이성에 대해 시험하였다. ELISA-플레이트를 라이소자임을 피복하고 ELISA를 실시예 7에 기술된 바와 같이 실시하였다. 3개의 다른 제조물은 항원-표면에의 결합을 나타냈으며 이들은 가용성 라이소자임으로 완전하게 억제가능하다 (제 4 도).
[서열 1]
[서열 2]
[서열 3]
[서열 4]
[서열 5]
[서열 6]
[서열 7]

Claims (23)

  1. (a) 반데르 발스 힘, 또는 양친매성 펩티드, 또는 반대 전하를 띠는 아미노산 잔기를 가지는 펩티드 사이에 형성되는 비공유 상호작용에 의해 다른 펩티드와 이량체를 형성할 수 있는 상호작용 펩티드 및 (b) 항체의 Fv-단편으로 이루어진 항체-단편 융합 단량체 단백질.
  2. 제1항에 있어서, Fv-단편이 단일 사슬 단편임을 특징으로 하는 단량체 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상호작용 펩티드가 10 내지 50개, 바람직하게는 10 내지 30개의 아미노산으로 구성됨을 특징으로 하는 단량체 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상호작용 펩티드가 하나 이상의 나선으로 구성됨을 특징으로 하는 단량체 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상호작용 펩티드가 나선, 돌기 및 또는 하나의 나선으로 구성됨을 특징으로 하는 단량체 단백질.
  6. 제4항에 있어서, 상호작용 펩티드가 매 7 번째 아미노산이 류신인 몇개의 반복 아미노산을 가지는 류신 지퍼(zipper) 분자를 포함함을 특징으로 하는 단량체 단백질.
  7. 제4항에 있어서, 상호작용 펩티드가 전하를 띤 잔기를 포함함을 특징으로 하는 단량체 단백질.
  8. 제1항에 있어서, Fv-단편과 상호작용 펩티드 사이에 결합 펩티드가 존재함을 특징으로 하는 단량체 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 결합 펩티드가 항체의 힌지(hinge) 영역 서열 또는 그의 단 편임을 특징으로 하는 단량체 단백질.
  10. 제1항에 정의된 바와 같은 상호작용 펩티드, 항체의 Fv-단편, 및 필요하다면 결합 펩티드를 암호화하는 유전자를 하나의 발현 플라스미드에 클로닝시키고, 이 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환시키고, 이 숙주 세포를 자양액중에서 배양하여, 제1항에서 정의된 바와 같은 항체-단편 융합 단량체 단백질을 세포내에서 발현시키거나 또는 배지로 분비시킴을 특징으로 하는, 상기 항체-단편 융합 단량체 단백질의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 숙주 세포가 대장균임을 특징으로 하는 방법.
  12. 하나 이상의 단량체 단위가 제1항에서 정의된 바와 같은 항체-단편 융합 단백질임을 특징으로 하는, 동일하거나 상이한 상호작용 펩티드의 비공유 상호작용에 의해 단량체 단위가 결합된 두개의 융합 단량체 단백질로 이루어진 융합 이량체 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상호작용 펩티드가 동일한 융합 이량체 단백질.
  14. 제12항에 있어서, 제 2 단량체 단위가 다른 특이성을 가지는 제1항 내지 제9항에서 정의된 바와 같은 향체-단편 융합 단백질을 특징으로 하는 이량체 단백질.
  15. 제12항에 있어서, 제 2 단량체 단위가, 항체-단편(Fv)이 비-항체 단백질 또는 펩티드로 대체된 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 융합 단백질임을 특징으로 하는 이량체 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 비-항체 단백질 또는 펩티드가 독소, 펩티드 킬레이트화제, 금속 결합 단백질 또는 효소이거나, 또는 대응하는 특이적 결합 부위를 가짐을 특징으로 하는 이량체 단백질.
  17. 제15항에 있어서, 비-항체 단백질 또는 펩티드가 T-세포- 또는 T-세포 단편 특이적 결합 부위를 가짐을 특징으로 하는 이량체 단백질.
  18. 제12항에 있어서, 다른 단백질이 개재 펩티드의 하나 또는 둘다의 C-말단에 융합함을 특징으로 하는 이량체 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 융합 단백질이 독소, 펩티드 킬레이트화제, 금속 결합 단백질 또는 효소이거나, 또는 대응하는 특이적 결합 부위를 가지거나, 또는 T-세포(단편) 특이적 결합 부위를 가짐을 특징으로 하는 이량체 단백질.
  20. 완전한 융합 단량체 단백질 또는 그의 일부분을 암호화하는 유전자를 하나 이상의 발현 플라스미드에 클로닝시키고, 이 발현 플라스미드(들)로 숙주 세포를 형질전환시켜 자양액중에서 배양하고, 완전한 융합 이량체 단백질을 세포내에서 발현시키거나 배지로 발현시키거나, 또는 융합 단량체 단백질을 별도로 발현시키고, 두개의 단량체 단위 사이의 비공유 결합을 배지 또는 실험관내에서 실시하고, 융합 단백질의 일부만이 클로닝될 경우에는 단백질 공학 단계를 부가적으로 실시함을 특징으로 하는, 제12항에서 정의된 바와 같은 융합 이량체 단백질의 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 제 1 융합 단량체 단백질을 암호화하는 유전자를 제 1 발현 플라스미드에 클로닝하고, 제 2 융합 단량체 단백질을 암호화하는 유전자를 제 2 발현 플라스미드에 클로닝함을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 융합 이량체 단백질을 형성하느 단량체 단위사이의 비공유 결합을 실험관내에서 실시함을 특징으로 하는 방법.
  23. 제20항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균임을 특징으로 하는 방법.
KR1019940702517A 1992-01-23 1993-01-15 단량체 및 이량체 항체-단편 융합 단백질 KR100254759B1 (ko)

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EP92101069.0 1992-01-23
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RU (1) RU2128709C1 (ko)
WO (1) WO1993015210A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019125059A1 (ko) * 2017-12-22 2019-06-27 한미약품 주식회사 신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도

Families Citing this family (205)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6416738B1 (en) 1973-12-07 2002-07-09 Neorx Corporation Pretargeting methods and compounds
US6075010A (en) * 1992-06-09 2000-06-13 Neorx Corporation Small molecular weight ligand-hexose containing clearing agents
US5576195A (en) * 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5869620A (en) * 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US6027725A (en) * 1991-11-25 2000-02-22 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5911969A (en) 1992-06-09 1999-06-15 Neorx Corporation Pretargeting protocols for enhanced localization of active agents to target sites
US6217869B1 (en) 1992-06-09 2001-04-17 Neorx Corporation Pretargeting methods and compounds
US6358490B2 (en) 1992-06-09 2002-03-19 Neorx Corporation Three-step pretargeting methods and compounds
US6329507B1 (en) * 1992-08-21 2001-12-11 The Dow Chemical Company Dimer and multimer forms of single chain polypeptides
AU5670194A (en) * 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
US6015897A (en) * 1993-12-07 2000-01-18 Neorx Corporation Biotinamido-n-methylglycyl-seryl-o-succinamido-benzyl dota
JPH09506106A (ja) * 1993-12-07 1997-06-17 ネオルクス コーポレーション プレターゲティング方法及び化合物
US20050214309A1 (en) * 1994-03-18 2005-09-29 Hinrichs Steven H Methods and compositions for modulating transcription factor activity
US6660842B1 (en) 1994-04-28 2003-12-09 Tripep Ab Ligand/receptor specificity exchangers that redirect antibodies to receptors on a pathogen
US6933366B2 (en) 1996-12-27 2005-08-23 Tripep Ab Specificity exchangers that redirect antibodies to bacterial adhesion receptors
SE9401460D0 (sv) * 1994-04-28 1994-04-28 Ferring Ab Antigen/antibody specificity exhanger
US6040137A (en) 1995-04-27 2000-03-21 Tripep Ab Antigen/antibody specification exchanger
WO1996013583A2 (en) 1994-10-20 1996-05-09 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Targeted hetero-association of recombinant proteins to multi-functional complexes
US6908903B1 (en) 1994-12-07 2005-06-21 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Cluster clearing agents
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
US7399837B2 (en) * 1995-12-22 2008-07-15 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
US5693323A (en) * 1994-12-23 1997-12-02 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
JPH11508126A (ja) * 1995-05-23 1999-07-21 モルフォシス ゲゼルシャフト ファー プロテインオプティマイルング エムベーハー 多量体タンパク質
US7105307B2 (en) 1997-08-30 2006-09-12 Cyclacel, Ltd. Compositions and methods for screening for modulators of enzymatic activity
GB9718358D0 (en) * 1997-08-30 1997-11-05 Univ Leeds Chemical modification
DK1039931T3 (da) * 1997-12-01 2005-08-08 Fang Fang Multivalente rekombinante antistoffer til at behandle HRV infektioner
US6204537B1 (en) 1998-10-01 2001-03-20 Micron Technology, Inc. ESD protection scheme
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
US20030035798A1 (en) 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
US6432673B1 (en) * 1998-12-07 2002-08-13 Zymogenetics, Inc. Growth factor homolog ZVEGF3
US7550143B2 (en) * 2005-04-06 2009-06-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US20030143234A1 (en) * 1999-08-20 2003-07-31 Wenyuan Shi Anti-microbial targeting chimeric pharmaceutical
US7569542B2 (en) 1999-08-20 2009-08-04 The Regents Of The University Of California Anti-microbial targeting chimeric pharmaceutical
IL159177A0 (en) * 2001-06-20 2004-06-01 Prochon Biotech Ltd Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
US7022323B2 (en) 2001-06-26 2006-04-04 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Uses of DC-SIGN and DC-SIGNR for inhibiting hepatitis C virus infection
DE10133071A1 (de) * 2001-07-07 2003-03-06 Alexander Cherkasky Antigene, Rezeptoren, Liganden oder ihre Regionen kombiniert mit proteolytischer Aktivität
JP2005522192A (ja) 2001-07-19 2005-07-28 パーラン セラピューティクス， インコーポレイテッド マルチマータンパク質およびマルチマータンパク質を作製および使用する方法
US6833441B2 (en) * 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
WO2003018749A2 (en) * 2001-08-22 2003-03-06 Shengfeng Li Compositions and methods for generating antigen-binding units
US7175983B2 (en) * 2001-11-02 2007-02-13 Abmaxis, Inc. Adapter-directed display systems
US20050069549A1 (en) 2002-01-14 2005-03-31 William Herman Targeted ligands
CN1747970A (zh) 2003-02-06 2006-03-15 三肽公司 抗原/抗体或配体/受体糖基化的特异***换剂
US7335359B2 (en) 2003-02-06 2008-02-26 Tripep Ab Glycosylated specificity exchangers
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
EP1624846A2 (en) * 2003-05-06 2006-02-15 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
SI2298347T1 (sl) * 2003-05-06 2016-03-31 Biogen Hemophilia Inc. Himerni proteini s faktorjem strjevanja krvi za zdravljenje hemostatske motnje
US9481878B2 (en) 2004-02-13 2016-11-01 Immunomedics, Inc. Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity
US8551480B2 (en) * 2004-02-13 2013-10-08 Immunomedics, Inc. Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity
US7875598B2 (en) * 2004-03-04 2011-01-25 The Regents Of The University Of California Compositions useful for the treatment of microbial infections
WO2006021954A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Peptide inhibitors for mediating stress responses
JP2008519028A (ja) * 2004-11-04 2008-06-05 フィブロン リミテッド Ｂ細胞悪性腫瘍の治療
US20120276100A1 (en) * 2005-04-06 2012-11-01 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Compositions and Methods of Use of Immunotoxins Comprising Ranpirnase (Rap) Show Potent Cytotoxic Activity
EP1885396A2 (en) 2005-05-04 2008-02-13 Quark Pharmaceuticals, Inc. Recombinant antibodies against cd55 and cd59 and uses thereof
WO2006129843A2 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Canon Kabushiki Kaisha Bispecific capturing molecule
KR100832773B1 (ko) 2005-11-18 2008-05-27 주식회사 아이지세라피 기능성 Ｆｖ 항체 절편 제조 방법
CA2646391A1 (en) 2006-03-22 2007-09-27 Viral Logic Systems Technology Corp. Methods for identifying polypeptide targets and uses thereof for treating immunological diseases
SI2004683T1 (sl) * 2006-03-24 2016-09-30 Biogen Hemophilia Inc. Pc5 kot encim za obdelavo propeptida faktorja ix
CA2652570A1 (en) * 2006-05-15 2007-11-22 Viral Logic Systems Technology Corp. Cd47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
US8377448B2 (en) * 2006-05-15 2013-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
US8101721B2 (en) 2006-06-15 2012-01-24 Fibron Ltd. Antibodies blocking fibroblast growth factor receptor activation and methods of use thereof
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
WO2008030988A2 (en) 2006-09-06 2008-03-13 The Regents Of The University Of California Selectively targeted antimicrobial peptides and the use thereof
EP2072527A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-24 Altonabiotec AG Fusion polypeptides comprising a SHBG dimerization component and uses thereof
EP2274009B1 (en) 2008-03-28 2013-11-13 GlaxoSmithKline LLC Methods of treatment
KR101705911B1 (ko) 2008-09-03 2017-02-10 제넨테크, 인크. 다중특이적 항체
AR079944A1 (es) * 2010-01-20 2012-02-29 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpo neutralizante de la actividad de un anticoagulante
EP2643353A1 (en) 2010-11-24 2013-10-02 Novartis AG Multispecific molecules
MA34978B1 (fr) 2011-03-30 2014-03-01 Boehringer Ingelheim Int Antidotes pour anticoagulants
EP3263127B1 (en) 2011-05-23 2019-08-21 Yeda Research and Development Co. Ltd Use of akt phosphorylation as a biomarker for prognosing neurodegenerative diseases and treating same
WO2013054320A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Antibodies to carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (ceacam)
US10036747B2 (en) * 2011-11-22 2018-07-31 University Of Maryland, Baltimore Lambodies with high affinity and selectivity for glycans and uses therefor
KR20200040893A (ko) 2012-01-13 2020-04-20 율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크 이중 항원-유도된 이분 기능 상보성
ES2702278T3 (es) 2012-04-01 2019-02-28 Technion Res & Dev Foundation Péptidos de inductor de metaloproteinasa de matriz extracelular (emmprin) y anticuerpos de unión
CA2899089C (en) 2013-03-15 2021-10-26 Biogen Ma Inc. Factor ix polypeptide formulations
US10196444B2 (en) * 2013-07-29 2019-02-05 Bluebird Bio, Inc. Multipartite signaling proteins and uses thereof
US9243294B2 (en) 2013-09-30 2016-01-26 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Modulation of NLGn4 expression, NK cell activity in non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)
KR102362803B1 (ko) 2013-11-25 2022-02-14 페임웨이브 리미티드 암 치료를 위한 항-ceacam1 및 항-pd 항체를 포함하는 조성물
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
MX2016009753A (es) 2014-01-28 2017-07-07 Buck Inst For Res On Aging Metodos y composiciones para exterminar celulas senescentes y para tratar enfermedades y trastornos asociados con la senectud.
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
CN106103484B (zh) 2014-03-14 2021-08-20 诺华股份有限公司 针对lag-3的抗体分子及其用途
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
EP3122768A2 (en) 2014-03-27 2017-02-01 Yeda Research and Development Co. Ltd. T-cell receptor cdr3 peptides and antibodies
US11427647B2 (en) 2014-04-27 2022-08-30 Famewave Ltd. Polynucleotides encoding humanized antibodies against CEACAM1
EP3137502B1 (en) 2014-04-27 2020-07-29 FameWave Ltd. Humanized antibodies against ceacam1
JP2016002009A (ja) * 2014-06-13 2016-01-12 国立大学法人名古屋大学 タグ付抗体
CN106687483B (zh) 2014-07-21 2020-12-04 诺华股份有限公司 使用人源化抗-bcma嵌合抗原受体治疗癌症
CN112481283A (zh) 2014-07-21 2021-03-12 诺华股份有限公司 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
US20170209492A1 (en) 2014-07-31 2017-07-27 Novartis Ag Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
WO2016025880A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
MY189028A (en) 2014-08-19 2022-01-20 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
DK3194443T3 (da) 2014-09-17 2021-09-27 Novartis Ag Målretning af cytotoksiske celler med kimære receptorer i forbindelse med adoptiv immunterapi
CU20170052A7 (es) 2014-10-14 2017-11-07 Dana Farber Cancer Inst Inc Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1
WO2016090034A2 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Novartis Ag Methods for b cell preconditioning in car therapy
WO2016157195A1 (en) 2015-04-01 2016-10-06 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Inhibitors of neuroligin 4 - neurexin 1-beta protein-protein interaction for treatment of liver disorders
SI3280729T1 (sl) 2015-04-08 2022-09-30 Novartis Ag Terapije CD20, terapije CD22 in kombinacija terapij s celico, ki izraža himerni antigenski receptor CD19 (CAR)
US20180298068A1 (en) 2015-04-23 2018-10-18 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
SI3317301T1 (sl) 2015-07-29 2021-10-29 Novartis Ag Kombinirane terapije, ki obsegajo molekule protitelesa na LAG-3
EP3316902A1 (en) 2015-07-29 2018-05-09 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
ES2924071T3 (es) 2015-09-02 2022-10-04 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd Anticuerpos específicos para inmunoglobulina de células T humanas y dominio ITIM (TIGIT)
US11161912B2 (en) 2015-10-13 2021-11-02 Technion Research & Development Foundation Limited Heparanase-neutralizing monoclonal antibodies
JP2019502695A (ja) 2015-12-17 2019-01-31 ノバルティス アーゲー ＰＤ−１に対する抗体分子とＣ−Ｍｅｔ阻害剤との組合せおよびその使用
CA3007671A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
EP3851457A1 (en) 2016-01-21 2021-07-21 Novartis AG Multispecific molecules targeting cll-1
WO2017149538A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Antibodies specific to human poliovirus receptor (pvr)
EP3423482A1 (en) 2016-03-04 2019-01-09 Novartis AG Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
MX2018012615A (es) 2016-04-15 2019-05-30 Novartis Ag Composiciones y metodos para la expresion selectiva de proteinas.
GB201609235D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Univ Cape Town Production of a horseradish peroxidase-IGG fusion protein
US20210177896A1 (en) 2016-06-02 2021-06-17 Novartis Ag Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
JP7219376B2 (ja) 2016-07-15 2023-02-08 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体をキナーゼ阻害薬と併用して使用したサイトカイン放出症候群の治療及び予防
AU2017302668B9 (en) 2016-07-28 2023-06-22 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors and PD-1 inhibitors
CA3032581A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
AR110676A1 (es) 2016-10-07 2019-04-24 Novartis Ag Tratamiento del cáncer utilizando receptores de antígenos quiméricos
WO2018140725A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Novartis Ag Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
WO2018201056A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CA3064859A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Glaxosmithkline Llc Biopharmaceutical compositions and methods for pediatric patients
UY37758A (es) 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos
JP7433910B2 (ja) 2017-06-22 2024-02-20 ノバルティス アーゲー Ｃｄ７３に対する抗体分子及びその使用
WO2019006007A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Novartis Ag POSOLOGICAL REGIMES FOR ANTI-TIM3 ANTIBODIES AND USES THEREOF
JP2020527572A (ja) 2017-07-20 2020-09-10 ノバルティス アーゲー 抗ｌａｇ−３抗体の投薬量レジメンおよびその使用
JP2021503478A (ja) 2017-11-16 2021-02-12 ノバルティス アーゲー 組み合わせ治療
CA3084551A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Bluebird Bio, Inc. Daric interleukin receptors
US20210038659A1 (en) 2018-01-31 2021-02-11 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20210130459A1 (en) 2018-05-09 2021-05-06 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Antibodies specific to human nectin4
WO2019226617A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by nk cells
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
AU2019277029C1 (en) 2018-06-01 2024-01-04 Novartis Ag Binding molecules against BCMA and uses thereof
WO2019241426A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
KR20210035173A (ko) 2018-06-19 2021-03-31 아타르가, 엘엘씨 보체 성분 5에 대한 항체분자 및 이의 용도
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
AU2019402189B2 (en) 2018-12-20 2023-04-13 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
JP2022514017A (ja) 2018-12-20 2022-02-09 ノバルティス アーゲー 医薬の組み合わせ
JP2022519341A (ja) 2019-01-13 2022-03-23 イッサム リサーチ デベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシティー オブ エルサレム エルティーディー． ヒトネクチン－２に特異的な抗体
EA202192019A1 (ru) 2019-02-15 2021-11-02 Новартис Аг Производные 3-(1-оксо-5-(пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона и пути их применения
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
AU2020222346B2 (en) 2019-02-15 2021-12-09 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
EP3927371A1 (en) 2019-02-22 2021-12-29 Novartis AG Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
TW202102261A (zh) 2019-03-29 2021-01-16 美商艾特加有限責任公司 Fgf23之抗體分子及其用途
KR20220010743A (ko) 2019-05-21 2022-01-26 노파르티스 아게 Bcma에 대한 삼중특이적 결합 분자 및 이의 용도
TW202100559A (zh) 2019-05-21 2021-01-01 瑞士商諾華公司 Cd19 結合分子及其用途
US20230071196A1 (en) 2019-05-21 2023-03-09 Novartis Ag Variant cd58 domains and uses thereof
MX2022001682A (es) 2019-08-08 2022-05-13 Regeneron Pharma Nuevos formatos de moleculas de union a antigenos.
MX2022004769A (es) 2019-10-21 2022-05-16 Novartis Ag Inhibidores de tim-3 y sus usos.
CN114786679A (zh) 2019-10-21 2022-07-22 诺华股份有限公司 具有维奈托克和tim-3抑制剂的组合疗法
KR20220093363A (ko) 2019-11-05 2022-07-05 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. N-말단 scFv 다중특이적 결합 분자
EP4065158A2 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Chimeric antigen receptors binding bcma and cd19 and uses thereof
WO2021123996A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
CN115023444A (zh) 2019-12-20 2022-09-06 再生元制药公司 新型il2激动剂及其使用方法
EP4090762A1 (en) 2020-01-17 2022-11-23 Becton, Dickinson and Company Methods and compositions for single cell secretomics
CN114980902A (zh) 2020-01-17 2022-08-30 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓增生异常综合征或慢性粒单核细胞白血病的包含tim-3抑制剂和低甲基化药物的组合
EP4110377A2 (en) 2020-02-27 2023-01-04 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2021195513A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 Novartis Ag Bispecific combination therapy for treating proliferative diseases and autoimmune disorders
JP2023520587A (ja) 2020-04-06 2023-05-17 イッサム リサーチ デベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシティー オブ エルサレム エルティーディー． 癌及び感染症の治療のためのＮＫｐ４６に対する抗体及びそのコンストラクト
EP4143236A1 (en) 2020-05-01 2023-03-08 Novartis AG Engineered immunoglobulins
US11673930B2 (en) 2020-05-12 2023-06-13 Regeneran Pharmaceuticals, Inc. IL10 agonists and methods of use thereof
WO2021260528A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
TW202216761A (zh) 2020-07-16 2022-05-01 瑞士商諾華公司 抗β細胞素抗體、其片段及多特異性結合分子
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
CN116134027A (zh) 2020-08-03 2023-05-16 诺华股份有限公司 杂芳基取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
WO2022044010A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Anti-t-cell immunoglobulin and itim domain (tigit) antibodies for the treatment of fungal infections
WO2022043558A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
WO2022043557A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
EP4240494A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Anti-cd19 agent and b cell targeting agent combination therapy for treating b cell malignancies
WO2022097060A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
EP4240765A2 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Antibody fc variants
MX2023005609A (es) 2020-11-13 2023-05-29 Novartis Ag Terapias de combinacion con celulas que expresan receptores quimericos para el antigeno (car).
JP2024505049A (ja) 2021-01-29 2024-02-02 ノバルティス アーゲー 抗ｃｄ７３及び抗ｅｎｔｐｄ２抗体のための投与方式並びにその使用
AU2022219681A1 (en) 2021-02-11 2023-09-21 Nectin Therapeutics Ltd. Antibodies against cd112r and uses thereof
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
CN117597365A (zh) 2021-05-04 2024-02-23 再生元制药公司 多特异性fgf21受体激动剂及其应用
US20220372168A1 (en) 2021-05-04 2022-11-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific fgf21 receptor agonists and their uses
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
JP2023535884A (ja) 2021-06-22 2023-08-22 ノバルティス アーゲー 化膿性汗腺炎の処置における使用のための二特異性抗体
AU2022314734A1 (en) 2021-07-19 2024-02-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il12 receptor agonists and methods of use thereof
WO2023022965A2 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel il27 receptor agonists and methods of use thereof
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023073599A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Novartis Ag Engineered fc variants
US20230279153A1 (en) 2021-11-11 2023-09-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cd20-pd1 binding molecules and methods of use thereof
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2023105528A1 (en) 2021-12-12 2023-06-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Antibodies specific to ceacam1
WO2023148707A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Humanized anti quiescin suefhydrye oxidase 1 (qsox1) antibodies and uses thereof
WO2023150778A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Visterra, Inc. Anti-idiotype antibody molecules and uses thereof
WO2023209568A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 Novartis Ag Multispecific antibodies targeting il-13 and il-18
WO2023220647A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific binding molecule proproteins and uses thereof
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
US20230382969A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interleukin-2 proproteins and uses thereof
US20230391844A1 (en) 2022-06-04 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interleukin-2 proproteins and uses thereof
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier
US20240067691A1 (en) 2022-08-18 2024-02-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon receptor agonists and uses thereof
WO2024040247A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon proproteins and uses thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5132405A (en) * 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
DE3920358A1 (de) * 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
AU675413B2 (en) * 1991-09-30 1997-02-06 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Recombinant immunotoxins
US5932448A (en) * 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Protein Chem 1991 Dec, 10(6) *
Proc Natl Acad Sci U S A 1988 Aug, 85 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019125059A1 (ko) * 2017-12-22 2019-06-27 한미약품 주식회사 신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도
KR20190076909A (ko) * 2017-12-22 2019-07-02 한미약품 주식회사 신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도
KR102588611B1 (ko) 2017-12-22 2023-10-16 한미약품 주식회사 신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CZ175794A3 (en) 1994-12-15
ES2102007T3 (es) 1997-07-16
EP0654085A1 (en) 1995-05-24
DE69309472D1 (de) 1997-05-07
NO942750L (no) 1994-09-13
CA2128511A1 (en) 1993-08-05
DK0654085T3 (da) 1997-09-22
HUT68798A (en) 1995-07-28
KR950700419A (ko) 1995-01-16
RU2128709C1 (ru) 1999-04-10
RU94045249A (ru) 1996-05-27
WO1993015210A1 (en) 1993-08-05
CA2128511C (en) 2006-11-07
AU676150B2 (en) 1997-03-06
ATE151113T1 (de) 1997-04-15
JPH07503366A (ja) 1995-04-13
HU215180B (hu) 1998-10-28
CZ287296B6 (en) 2000-10-11
AU3410093A (en) 1993-09-01
NO942750D0 (no) 1994-07-22
JP3490437B2 (ja) 2004-01-26
EP0654085B1 (en) 1997-04-02
JP2004041221A (ja) 2004-02-12
US5910573A (en) 1999-06-08
GR3023860T3 (en) 1997-09-30
HU9402167D0 (en) 1994-10-28
DE69309472T2 (de) 1997-10-23

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