KR20220093363A

KR20220093363A - N-말단 scFv 다중특이적 결합 분자

Info

Publication number: KR20220093363A
Application number: KR1020227018857A
Authority: KR
Inventors: 양 쉔; 안-희 리; 얀 양; 치아-양 린
Original assignee: 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2019-11-05
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2022-07-05
Also published as: US20210130477A1; US20220251220A1; JP2022553830A; IL292698A; TW202134277A; AU2020379735A1; CA3157075A1; EP4054646A1; MX2022005330A; CN114786730A; BR112022008552A2; WO2021091953A1

Abstract

본 발명은 N-말단 scFv, 제1 Fab 및 제2 Fab를 포함하는 다중특이적 결합 분자(MBM: multispecific binding molecule), MBM 및 세포독성제(cytotoxic agent) 또는 세포증식억제제(cytostatic agent)를 포함하는 MBM 접합체(conjugate), MBM 및 MBM 접합체를 함유하는 약학적 조성물, 암을 치료하기 위해 MBM, MBM 접합체 및 약학적 조성물을 사용하는 방법, MBM을 인코딩하는 핵산, MBM을 발현하도록 조작된 세포, 및 MBM을 생성하는 방법에 관한 것이다.

Description

N-말단 scFv 다중특이적 결합 분자

1. 관련 출원의 교차 참조

본 출원은 2019년 11월 5일에 출원된 미국 임시 출원 62/930,916호의 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 참조로서 본원에 포함된다.

2. 서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하고, 그 전문은 참조로서 본원에 포함된다. 2020년 11월 2일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 RGN-003WO_SL.txt로 명명되고, 크기는 62.3 킬로바이트이다.

3. 배경기술

대부분의 천연 발생 항체 분자는 일반적으로 2개의 소위 경쇄 폴리펩타이드(경쇄) 및 2개의 소위 중쇄 폴리펩타이드(중쇄)를 포함한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는, 항원과 상호작용할 수 있는 결합 영역을 포함하는 가변 도메인(가변 영역)(일반적으로 폴리펩타이드 사슬의 아미노 말단 부분)을 함유한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 불변 영역(일반적으로 카르복실 말단 부분)을 포함한다.

세포 또는 세포주의 단일 클론에 의해 생성되는 재조합 단일클론 항체는 지난 20년 동안 여러 가지 상이한 질환의 치료를 위한 생물학적 약물의 매우 성공적인 부류로서 출현하였다. 항체-기초 치료제는 암 및 자가면역/염증성 장애를 포함한 여러 가지 질환을 치료하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다.

일부 질환의 생물학적 복잡성으로 인해, 하나 초과의 항원 또는 에피토프를 표적화하는 항체가 소정의 병태를 치료하는 데 있어서 단일 항체보다 더 효과적일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Lindzen 등, 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. 107(28): 12550-12563]; 문헌[Nagorsen 및 Baeuerle, 2011, Exp. Cell Res. 317(9): 1255-60]을 참조한다. 이들 항체는 더 큰 치료 제어의 기대를 제공한다. 예를 들어, 특히 항체 기초 면역요법의 경우, 많은 항체 요법과 관련된 표적-외(off-target) 효과를 감소시키기 위해 표적 특이성을 향상시키는 필요성이 존재한다. 이에 더하여, 다중특이적(multispecific) 항체는 새로운 치료 전략, 예컨대 특히 면역요법의 맥락에서 다수의 세포 수용체의 상승작용적 표적화를 제공한다.

4. 발명의 내용

본 개시내용은 적어도 3개의 항원-결합 부위("ABS: antigen-binding site")를 함유하는 다중특이적 결합 분자("MBM: multispecific binding molecule")를 제공하며, 상기 항원-결합 부위 중 2개는 Fab이고 세번째 것은 VH 도메인의 N-말단에서 Fab 중 하나에 부착된 scFv이다. 개시내용의 MBM은 서로 회합된 2개의 중쇄 Fc 도메인으로 이루어진 Fc 도메인을 함유한다. Fc 도메인 및 임의의 회합된 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 각각의 폴리펩타이드 사슬은 본원에서 "반항체(half antibody)"로 지칭된다.

개시내용의 예시적인 MBM은 도 1에 예시되어 있으며, 변화는 도 2 및 도 3에 예시되어 있다.

개시내용의 전형적인 MBM은 이의 Fc 도메인을 통해 회합된 2개의 반항체를 포함한다. 도 1 내지 도 3의 좌측에 예시된 반항체는 N-말단으로부터 C-말단 방향으로,

ㆍ 선택적인 링커(2)에 의해 연결된 VH(1) 및 VL(3)(어떤 순서로)로 이루어진 scFv;

ㆍ 선택적인 링커(4);

ㆍ 제1 Fab("Fab1")로서,

o VH(5) 및 불변 도메인(6)으로서, Fab 헤테로이량체화를 용이하게 하기 위해 도 1의 예에서는 CH1 도메인이지만 도 2a 및 도 2c에서 도시된 바와 같이 상이한 유형의 불변 도메인, 예컨대 CL 또는 CH3이며 VL(10) 및 불변 도메인(11)과 회합되는, VH(5) 및 불변 도메인(6);

o VL(10) 및 불변 도메인(11)으로서, 도 1의 예에서는 CL이지만 도 2a 및 도 3c에 도시된 바와 같이 상이한 유형의 불변 도메인, 예컨대 CH1 또는 CH3일 수 있는, VL(10) 및 불변 도메인(11)으로 이루어진, 제1 Fab("Fab1");

ㆍ 선택적인 힌지 도메인(7);

ㆍ CH2 도메인(8) 및 CH3 도메인(9)으로 이루어진 Fc 도메인으로서, 헤테로이량체화를 용이하게 하기 위해 도 3에 도시된 바와 같이 하나 이상의 돌연변이(예컨대 스타(star) 돌연변이 또는 노브-인-홀(knob-in-hole) 돌연변이)를 함유할 수 있는, Fc 도메인을 포함한다.

좌측 반항체는 2개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어지며, 제1 폴리펩타이드 사슬은 VL(10) 및 불변 도메인(11)을 포함하고, 도 1 내지 도 3에 예시된 바와 같이 배치된 잔여 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬과 회합된다.

도 1의 우측에 예시된 반항체는 N-말단으로부터 C-말단 방향으로,

ㆍ 제2 Fab("Fab2")로서,

o VH(12) 및 불변 도메인(13)으로서, Fab 헤테로이량체화를 용이하게 하기 위해 도 1의 예에서는 CH1 도메인이지만 도 2b 및 도 2d에서 도시된 바와 같이 상이한 유형의 불변 도메인, 예컨대 CL 또는 CH3이며 VL(17) 및 불변 도메인(18)과 회합되는, VH(12) 및 불변 도메인(13);

o VL(17) 및 불변 도메인(18)으로서, 도 1의 예에서는 CL이지만 도 2b 및 도 2d에 도시된 바와 같이 상이한 유형의 불변 도메인, 예컨대 CH1 또는 CH3일 수 있는, VL(17) 및 불변 도메인(18)으로 이루어진, 제2 Fab("Fab2");

ㆍ 선택적인 힌지 도메인(14);

ㆍ CH2 도메인(15) 및 CH3 도메인(16)으로 이루어진 Fc 도메인으로서, 헤테로이량체의 정제 및/또는 조립을 용이하게 하기 위해 도 3에 도시된 바와 같이 하나 이상의 돌연변이(예컨대 스타 돌연변이 또는 노브-인-홀 돌연변이)를 함유할 수 있는, Fc 도메인을 포함한다.

우측 반항체는 2개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어지며, 제1 폴리펩타이드 사슬은 VL(17) 및 불변 도메인(18)을 포함하고, 도 1 내지 도 3에 예시된 바와 같이 배치된 잔여 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬과 회합된다.

완전 MBM은 2개의 Fc 도메인을 통한 2개의 반항체의 회합에 의해 형성되어, Fc 영역을 형성하며, 제1 항원 결합 부위("ABS1")를 갖는 scFv, 제2 항원 결합 부위("ABS2")를 갖는 Fab1을 포함하는 MBM을 이끌며, Fab3은 제3 항원 결합 부위("ABS3")를 갖는다.

도 1 내지 도 3에 도시된 개시내용의 MBM의 변동은 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 개시내용의 MBM은 도 1 내지 도 3 및 다른 것들 중에서도 아래의 섹션 6.2에서 예시된 변형들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 추가로, 제1 또는 제2 폴리펩타이드 사슬 또는 좌측 또는 우측 반항체의 언급은 단지 편의를 위한 것이며, 폴리펩타이드 사슬 또는 반항체는 임의의 특정 순서로 생성되거나 조립됨을 시사하는 것으로 의도되지 않는다.

개시내용의 MBM의 ABS1, ABS2, 및 ABS3은 각각 표적 분자, 예를 들어 세포-표면 발현된 항원에 결합한다. 바람직하게는, MBM의 scFv, Fab1, 및 Fab2는, ABS1, ABS2, 및 ABS3 각각이 이들의 각각의 표적에 동시에 결합할 수 있도록 선택된다. 일부 구현예에서, MBM의 ABS1, ABS2, 및 ABS3은 각각 상이한 표적 분자에 결합할 수 있거나, 대안적으로 ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 2개는 동일한 표적 분자 상의 상이한 영역에 결합할 수 있다.

유리하게는, 적어도 2개 이상의 상이한 표적 분자에 결합하는 MBM은 예를 들어, 이러한 2개 이상의 표적 분자가 발현되는 특정 조직 유형을 우선적으로 표적화하기 위해 사용될 수 있다.

개시내용의 MBM에 사용될 수 있는 scFv는 섹션 6.2.1 및 아래의 구체적인 구현예 1 내지 12, 19 내지 20, 31 내지 35, 및 55 내지 60에 기재되어 있다. 개시내용의 MBM에 사용될 수 있는 Fab는 섹션 6.2.2 및 아래의 구체적인 구현예 1 내지 12, 19 내지 20, 22 내지 23, 28 내지 30, 및 36 내지 54에 기재되어 있다. scFv는 예를 들어, 펩타이드 링커에 의해 Fab1에 연결될 수 있다. scFv를 Fab1에 연결하는 데 사용될 수 있는 링커는 섹션 6.2.3 및 아래의 구체적인 구현예 13 내지 18에 기재되어 있다. 개시내용의 MBM에 사용될 수 있는 Fc 도메인은 섹션 6.2.4 및 아래의 구체적인 구현예 24 내지 26에 기재되어 있다.

나아가, 본 개시내용은 개시내용의 MBM을 포함하는 약물 접합체(본원에서 편의상 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 지칭됨)를 제공한다. ADC의 예시적인 특질은 섹션 6.3 및 아래의 구체적인 구현예 61에 기재되어 있다.

나아가, 개시내용은 개시내용의 MBM을 인코딩하는 핵산을 제공한다. MBM을 인코딩하는 핵산은 단일 핵산(예를 들어, MBM의 모든 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 벡터) 또는 복수의 핵산(예를 들어, MBM의 상이한 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 2개 이상의 벡터)일 수 있다. 나아가, 개시내용은 개시내용의 핵산 및 MBM을 발현하도록 조작되는 숙주 세포 및 세포주를 제공한다. 나아가, 개시내용은 개시내용의 MBM을 생성하는 방법을 제공한다. 예시적인 핵산, 숙주 세포, 세포주, 및 MBM을 생성하는 방법은 섹션 6.5 및 아래의 구체적인 구현예 78 내지 83에 기재되어 있다.

나아가, 개시내용은 개시내용의 MBM 및 ADC를 인코딩하는 약학적 조성물을 제공한다. 예시적인 약학적 조성물은 섹션 6.6 및 아래의 구체적인 구현예62에 기재되어 있다.

나아가, 예를 들어, 암을 치료하기 위한, 개시내용의 MBM, ADC, 및 약학적 조성물을 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 방법은 섹션 6.7 및 아래의 구체적인 구현예 63 내지 77에 기재되어 있다.

5. 도면의 간단한 설명
도 1: 개시내용의 예시적인 MBM의 개략적인 표현이다.
도 2a 내지 도 2e: 적절한 VH 및 VL 쌍형성(pairing)을 촉진하기 위한 변형을 Fab가 함유하는 개시내용의 예시적인 MBM의 개략적인 표현이다. 추가 전략은 아래 섹션 6.2.2에 제시되어 있다.
도 3a 내지 도 3d: 적절하게 쌍형성되는 헤테로이량체의 헤테로이량체화 또는 정제를 촉진하기 위한 변형을 Fc 도메인이 함유하는 개시내용의 예시적인 MBM의 개략적인 표현이다. 도 3a 및 도 3b는 스타 돌연변이(H435R Y436F 변형을 갖는 CH3)를 CH3(*)로서 갖는 CH3을 도시하고, 도 3c 및 도 3d는 (K) 및 (H)로 표기된 노브 및 홀 돌연변이를 각각 도시한다. 도면 어디에서나, 스타 돌연변이는 별표(*)로 도시되어 있고, 노브-인-홀 돌연변이는 삼각형(예를 들어, ▶ 또는 ◀)으로 도시되어 있다. 이들 2개 전략(예를 들어, 스타 돌연변이 및 노브-인-홀 돌연변이)은 단일 MBM에서 조합될 수 있다. 추가 헤테로이량체화 전략은 아래 섹션 6.2.4에 제시되어 있다.
도 4aa 내지 도 4bb: 유전자형-조직 발현(GTEx) 프로젝트(도 4aa 내지 도 4ab) 및 인간 단백질 아틀라스(도 4ba 내지 도 4bb)에 따라, 개시내용의 MBM에 의해 특이적으로 결합되는 예시적인 표적 분자 쌍의 발현 프로파일이다: KLB 및 FGFR1c. 중첩 발현이 존재하는 조직은 볼드 폰트로 제시되어 있다.
도 5: FGF21 신호전달에 의해 조절되는 대사 경로이다.
도 6a 내지 도 6c: FACS 결합 검정 결과(실시예 1). 도 6a: HEK293/Cas90hFGFR1/hKLB 세포; 도6b: HEK293/hFGFR1c 세포; 도 6c: HEK293/hFGFR1c/hKLB 세포. MFI: 평균 형광 강도; APC: 알로피코시아닌.
도 7: FGFR21과 비교하여 HEK293/SRE-luc/hFGFR1c/hKLB 세포에서 이중특이적 결합 분자(BBM) REGN4366, FGFR1c x KLB 이중특이적 대조군 및 비교물질 FGFR1c x KLB 이중특이적 REGN4304에 의한 적당한(modest) 활성화를 예시하는 그래프이다.
도 8: HEK293.SREluc.hFGFR1cHS/ hKLB 세포에서 2가 REGN4366과 비교하여 3가 F1K-scFv6에 의한 증강된 수용체 활성화이다(RLU: 상대 광 단위(relative light unit))(실시예 1).
도 9: scFv6으로 표기된 분자의 6개 링커 길이 변이체를 평가하는 연구의 결과를 도시하는 그래프이다((1) 위치에서 22393 또는 393으로 표기된 KLB 결합제, (2) 위치에서 ADI-19842 또는 842로 표기된 FGFR1 결합제, 및 (3) 위치에서 scFv 형식에서 KLB 결합제 22393의 결합을 차단하지 않는 22532 또는 532로 표기된 KLB 결합제를 함유함). 분자는 비교되는 FGFR1 결합 도메인과 N-말단 532 scFv 도메인 사이에 7개 내지 45개 아미노산의 링커를 함유하였다. 모든 링커 길이의 삼중특이적 결합 분자는 비교물질인 이중특이적 결합 분자 REGN4304보다 더 큰 활성을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b: 도면은, F1K_scFv6 및 scFv6 LK7(7개의 아미노산 링커를 함유함)로 표기된 삼중특이적 결합제가, hFGFR1c 및 hKLB를 안정하게 발현하는 HEK293 세포에서 FGFR1c 신호전달을 강하게 활성화시킴을 실증한다. 도 10a: 16시간 동안의 혈청 고갈, 뒤이어 1 nM 및 10 nM의 농도에서 15분 동안의 약물 처리의 결과, ERK 및 PLCγ 인산화를 통한 약물 농도-의존적 FGFR1c 신호전달을 예시하는 웨스턴 블롯이다. 도 10b: 16시간 동안의 혈청 고갈, 뒤이어 10 nM의 농도에서 15분, 30분 동안의 약물 처리 및 1시간, 2시간, 4시간, 및 6시간 인큐베이션 기간의 결과, ERK 및 PLCγ 인산화를 통한 시간-의존적 FGFR1c 신호전달을 예시하는 웨스턴 블롯이다.
도 11a 내지 도 11c: 단일특이적 결합 분자(항-KLB; REGN4661) 및 이중특이적 결합 분자(항-KLBxFGFR1c; REGN4304)는 삼중특이적 mAb(F1K.scFv6 IgG1 및 F1K-Fab6 IgG1)와 비교하여 상이한 화학양론으로 KLB(탠덤 채워진 원형)/FGFR1c(열린 직사각형)에 결합한다. 도 11a: REGN4661:KLB 복합체(실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS: asymmetric flow field-flow fractionation coupled to multi-angle light scattering)에 의해 분석되었다. REGN4661(파선) 및 KLB(점선)의 개별 시료로부터의 분획도가 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분리된(resolved) 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다. 도 11b: REGN4304:KLB 복합체(굵은 실선) 및 REGN4304:KLB:FGFR1c 복합체(얇은 실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. REGN4304(파선), KLB(점선), 및 FGFR1c(회색 점선)의 개별 시료로부터의 분획도가 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분리된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다. 도 11c: F1K-scFv6 IgG1:KLB 복합체(굵은 실선) 및 F1K-scFv6 IgG1:KLB:FGFR1c 복합체(0.2 μM:0.2 μM:0.2 μM, 얇은 실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분리된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다.
도 12a 및 도 12b: FGFR1c, KLB 및 FGF21의 클러스터가 활성 복합체를 형성하는 방법(도 12a) 및 이중특이적 결합 분자 및 단일특이적 대조군과 비교하여 FGFR1c 수용체 및 KLB 수용체와 2+1 N-scFv 삼중특이적 결합 분자, 예를 들어, F1K-scFv6 사이에서 형성된 잠재적인 화학양론적 복합체(도 12b)의 개략적인 표현이다.
도 13a 및 도 13b: FGFR3 S249C 돌연변이(도 13a) 또는 FGFR3-TACC3 융합 돌연변이(도 13b)를 발현하는 UMUC14 세포를 이용한 증식 검정이다.
도 14: UMUC14 세포에서 FGFR3 수용체 분해 검정의 결과이다.

6. 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용

6.1. 정의

본원에서 사용되는 하기 용어는 하기 의미를 갖는 것으로 의도된다:

항원 결합 부위 또는 ABS : 본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 부위" 또는 "ABS"는, 표적 분자에 특이적이며 비공유적이고 가역적인 결합을 할 수 있는 MBM의 일부를 지칭한다. 개시내용의 MBM은, scFv의 부분인 제1 ABS("ABS1"), Fab의 부분인 제2 ABS("ABS2"), 및 Fab의 부분인 제3 ABS("ABS3")를 포함한다.

회합되는 : MBM의 맥락에서 용어 "회합되는"은 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 특히, 용어 "회합되는"은, 2개 이상의 폴리펩타이드가 예를 들어, 분자 상호작용을 통해 비-공유적으로 또는 하나 이상의 이황화 브릿지 또는 화학적 가교-연결부를 통해 공유적으로 서로 회합되어, ABS1 , ABS2 및 ABS3이 이의 각각의 표적에 결합할 수 있는 기능적 MBM을 생성함을 의미한다. 개시내용의 MBM에 존재할 회합의 예는 Fc 영역에서 호모이량체성 또는 헤테로이량체성 Fc 도메인 사이의 회합, Fab 또는 scFv에서 VH 영역과 VL 영역 사이의 회합, Fab에서 CH1과 CL 사이의 회합, 및 도메인 치환된 Fab에서 CH3과 CH3 사이의 회합을 포함한다(그러나 이들로 제한되지 않음).

상보성 결정 영역 또는 CDR : 본원에서 사용되는 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 항원 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR(CDR-H1, CDR-H2, HCDR-H3) 및 각각의 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR(CDR1-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 존재한다. CDR의 경계를 식별하는 데 사용될 수 있는 예시적인 관례는 예를 들어, 카바트 정의, 초티아 정의, ABS 정의, 및 IMGT 정의를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Kabat, 1991, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md.](카바트 숫자매김 체계); 문헌[Al-Lazikani 등, 1997, J. Mol. Biol. 273:927-948](초티아 숫자매김 체계); 문헌[Martin 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272](ABS 숫자매김 체계); 및 문헌[Lefranc 등, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77](IMGT 숫자매김 체계)을 참조한다. 공개 데이터베이스는 또한, 항체 내의 CDR 서열을 식별하기 위해 이용 가능하다.

~로부터 유래됨 : 본원에서 사용되는 용어 "~로부터 유래되는"은 제1 분자와 제2 분자 사이의 관계를 나타낸다. 이는 일반적으로, 제1 분자와 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하고, 제2 분자로부터 유래되는 제1 분자에 대한 과정 또는 공급원 제한을 나타내거나 포함하지 않는다.

EC50: 용어 "EC50"은 명시된 노출 시간 후 기준선과 최대 사이의 절반의 반응을 유도하는 항체 또는 MBM의 반수 최대 유효 농도(half maximal effective concentration)를 지칭한다. EC50은 본질적으로, 이의 최대 효과의 50%가 관찰되는 항체 또는 MBM의 농도를 나타낸다. 소정의 구현예에서, EC50 값은 예를 들어, FACS 결합 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 항체 또는 MBM에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 표적 분자를 발현하는 세포에의 반수-최대 결합을 제공하는 항체 또는 MBM의 농도와 동등하다. 그러므로, 감소된 또는 더 약한 결합은 증가된 EC50, 또는 반수 최대 유효 농도 값으로 관찰된다. 개시내용의 MBM의 EC50 값은 일부 구현예에서, 약 10^-5 M 이하(예를 들어, 10^-5 M 미만, 10^-6 M 미만, 10^-7 M 미만, 10^-8 M 미만, 또는 10^-9 M 미만)의 EC50 값을 특징으로 할 수 있다.

에피토프 : 에피토프, 또는 항원 결정 부위는 본원에 기재된 바와 같이 항체 또는 다른 항원-결합 모이어티에 의해 인식되는 항원(예를 들어, 표적 분자)의 일부이다. 에피토프는 선형 또는 입체배좌일 수 있다.

Fab : 개시내용의 MBM의 맥락에서 용어 "Fab"는 제1 불변 도메인(본원에서 C1로 지칭됨)에 대해 N-말단에서 항체의 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬, 및 상기 제1 불변 도메인과 쌍을 형성할 수 있는 제2 불변 도메인(본원에서 C2로 지칭됨)에 대해 N-말단에서 항체의 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬의 쌍을 지칭한다. 네이티브 항체에서, VH는 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)에 대해 N-말단이고, VL은 경쇄의 불변 도메인(CL)에 대해 N-말단이다. 개시내용의 Fab는 네이티브 배향에 따라 배열되거나, 올바른 VH 및 VL 쌍형성을 용이하게 하는 도메인 치환 또는 스왑(swap)을 포함할 수 있으며, 특히 개시내용의 MBM은 동일하지 않은 Fab를 포함한다. 예를 들어, Fab 내의 CH1과 CL 도메인 쌍을 CH3-도메인 쌍으로 대체하여, 헤테로이량체성 MBM에서 올바른 변형된 Fab-사슬 쌍형성을 용이하게 하는 것이 가능하다. CH1 및 CL을 역전시키는 것이 또한 가능하며, 따라서 CH1은 VL에 부착되고 CL은 VH에 부착되며, 일반적으로 Crossmab로 알려진 배치이다. 치환된 또는 스와핑된 불변 도메인의 사용에 대해 대안적으로 또는 이에 더하여, 올바른 사슬 쌍형성은 개시내용의 헤테로이량체성 MBM의 가변 영역 둘 다와 쌍을 형성할 수 있는 유니버셜(universal) 경쇄의 사용에 의해 달성될 수 있다.

Fc 도메인 및 Fc 영역 : 용어 "Fc 도메인"은 또 다른 중쇄의 상응하는 부분과 쌍형성하는 중쇄의 부분을 지칭한다. 용어 "Fc 영역"은 2개의 중쇄 Fc 도메인의 회합에 의해 형성되는 항체-기초 결합 분자의 영역을 지칭한다. Fc 영역 내의 2개의 Fc 도메인은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 네이티브 항체에서, Fc 도메인은 전형적으로 동일하지만, 개시내용의 MBM을 생성하는 목적을 위해, 하나의 또는 둘 다의 Fc 도메인은 유리하게는 헤테로이량체화를 가능하게 하도록 변형될 것이다.

반항체 : 용어 "반항체"는 적어도 하나의 ABS 또는 ABS 사슬(예를 들어, Fab의 하나의 사슬)을 포함하며 ABS 또는 ABS 사슬을 포함하는 또 다른 분자와 예를 들어 이황화 브릿지 또는 분자 상호작용(예를 들어, Fc 헤테로이량체 사이의 노브-인-홀 상호작용)을 통해 회합될 수 있는 분자를 지칭한다. 반항체는 하나의 폴리펩타이드 사슬 또는 하나 초과의 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, Fab의 2개의 폴리펩타이드 사슬)로 이루어질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 반항체는 Fc 도메인을 포함한다.

숙주 세포 : 본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 개시내용의 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 소정의 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 뒤이은 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있으나 본원에서 사용되는 용어의 범위 내에 여전히 포함된다. 전형적인 숙주 세포는 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유류 숙주 세포이다. 예시적인 진핵 숙주 세포는 효모 및 포유류 세포, 예를 들어 척추동물 세포, 예컨대 마우스, 래트, 원숭이 또는 인간 세포주, 예를 들어 HKB11 세포, PER.C6 세포, HEK 세포, 또는 CHO 세포를 포함한다.

다중특이적 결합 분자 또는 MBM : 본원에서 사용되는 용어 "다중특이적 결합 분자" 또는 "MBM"은 2개의 반항체를 포함하는 분자(예를 들어, 다수의 폴리펩타이드 사슬의 조립체)를 지칭하고, 이는 적어도 2개의 상이한 에피토프(및 일부 상황에서 3개 이상의 상이한 에피토프)에 특이적으로 결합하고 ABS1, ABS2, 및 ABS3을 포함한다.

작동 가능하게 연결되는 : 본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결되는"은, 2개 이상의 영역이 기능적 폴리펩타이드를 생성하도록 연결된 폴리펩타이드 사슬의 2개 이상의 영역 사이의 기능적 관계를 지칭한다.

모항체 : 용어 "모항체"는, 개시내용의 MBM이 유래되는 항체(해당 용어는 본원에 정의된 바와 같음), 예를 들어, 개시내용의 MBM에 존재하는 N-말단 scFv 도메인이 결여된 모 단일특이적 또는 이중특이적 항체를 의미한다. 개시내용의 MBM은 예를 들어, 이의 ABS 중 하나 이상에서, 결합 서열, 예를 들어, CDR, VH, 및/또는 VL 서열을 "모"항체와 공유할 것이지만, 모항체 또는 이의 코딩 서열을 변형시킴으로써 제조되지 않아야 한다.

단일 사슬 Fv 또는 scFv : 본원에서 사용되는 용어 "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 지칭하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다.

특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다 : 본원에서 사용되는 용어 "특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다"는, MBM 또는 이의 항원 결합 부위("ABS")가 생리학적 조건 하에 상대적으로 안정한 표적 분자와 복합체를 형성함을 의미한다. 특이적인 결합은 약 5x10^-2 M 이하(예를 들어, 5x10^-2 M 미만, 10^-2 M 미만, 5x10^-3 M 미만, 10^-3 M 미만, 5x10^-4 M 미만, 10^-4 M 미만, 5x10^-5 M 미만, 10^-5 M 미만, 5x10^-6 M 미만, 10^-6 M 미만, 5x10^-7 M 미만, 10^-7 M 미만, 5x10^-8 M 미만, 10^-8 M 미만, 5x10^-9 M 미만, 10^-9 M 미만, 또는 10^-10 M 미만)의 KD를 특징으로 할 수 있다. 표적 분자에의 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, MBM 또는 ABS의 결합 친화도를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, Biacore 검정), 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 결합 검정 등을 포함한다. 그러나, 하나의 종으로부터의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 MBM 또는 이의 ABS는 하나 이상의 다른 종으로부터의 표적 분자와 교차-반응성을 갖는다.

표적 분자 : 본원에서 사용되는 용어 "표적 분자"는 MBM의 항원 결합 부위에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 세포 표면 상에서 발현되는 임의의 생물학적 분자(예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지질 또는 이들의 조합)를 지칭한다.

조직 : 본원에서 사용되는 용어 "조직"은 특정 종류의 세포의 수집물(collection) 또는 집합(aggregat)을 지칭한다. 조직은 중배엽(예를 들어, 뼈, 근육, 결합 조직, 신장, 및 관련 구조), 내배엽(예를 들어, 폐, 다른 호흡기 구조, 및 소화 기관) 또는 외배엽(예를 들어, 신경계, 감각 기관, 피부, 및 관련 구조)으로부터 유래될 수 있다. 개시내용의 MBM에 의해 표적화되기에 유용한 조직의 예는 결합 조직(섬유성 결합 조직, 골격 결합 조직, 및 유체 결합 조직, 혈액, 뼈, 힘줄, 인대, 지방조직 및 유륜 조직(areolar tissue) 등을 포함), 근육 조직(내장근 또는 평활근, 골격근, 및 심장근 등을 포함), 신경 또는 뉴런(neural) 조직(중추신경계(뇌, 척수 등), 말초신경계(뇌신경, 척수 신경, 운동 뉴런 등) 포함), 상피 조직(피부, 기도, 생식관, 소화관, 단층 편평 상피(simple squamous epithelium), 중층 편평 상피(stratified squamous epithelium), 단층 입방 상피(simple cuboidal epithelium), 이행 상피(transitional epithelium), 가중층 원주 상피(pseudostratified columnar epithelium), 원주 상피, 선상 상피(glandular epithelium), 섬모 원주 상피(ciliated columnar epithelium) 등), 내피 조직(혈관, 림프관 등), 뿐만 아니라 이들의 임의의 세포 또는 임의의 성분(예를 들어, 세포외 기질)을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 개시내용의 MBM에 의해 표적화되는 조직은 (a) 고형 조직 또는 액형 조직(예를 들어, 혈액 또는 개별적인 혈액 세포 유형)이고/이거나; (b) 정상 조직 또는 질환 조직(예를 들어, 암세포)이고/이거나; (c) 동일한 기관(예를 들어, 신장 또는 간) 또는 다른 신체 구조(예를 들어, 종양)에 존재하거나 상이한 기관 또는 다른 신체 구조에 존재할 수 있다.

조직 발현 프로파일 : 표적 분자를 참조로 하여 본원에서 사용되는 용어 "조직 발현 프로파일"은 예를 들어 인간 단백질 아틀라스(HPA) 및/또는 유전자형-조직 발현(GTEx) 프로젝트에 의해 정의된 바와 같이 인체에서의 표적 분자의 발현 패턴을 지칭한다. 조직 발현 프로파일은 단백질 발현 프로파일 및/또는 mRNA 발현 프로파일일 수 있다.

3가: 본원에서 사용되는 용어 "3가"는 3개의 항원 결합 부위를 갖는 MBM을 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위 중 2개는 동일한 표적의 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 구현예에서, 항원 결합 부위 중 2개는 동일한 표적 분자의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다.

유니버셜 경쇄 : MBM의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "유니버셜 경쇄"는 Fab1의 중쇄 영역과 쌍형성하여 Fab1을 형성할 수 있고 Fab2의 중쇄 영역과 쌍형성하여 Fab2를 형성할 수 있는 경쇄 폴리펩타이드를 지칭한다. 유니버셜 경쇄는 "보편적 경쇄"로도 알려져 있다.

VH : 용어 "VH"는 scFv 또는 Fab의 중쇄를 포함하여 항체의 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다.

VL : 용어 "VL"은 scFv 또는 Fab의 경쇄를 포함하여 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.

6.2. 다중특이적 결합 분자(MBM)

개시내용의 MBM은 2개의 반항체를 포함하며, 이들 반항체 중 하나는 적어도 하나 항원 결합 부위(예를 들어, Fab)를 포함하고 다른 하나는 적어도 2개의 항원 결합 부위(예를 들어, Fab의 VH의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 scFv를 갖는 Fab)를 포함한다.

개시내용의 MBM은 적어도 2개의 상이한 에피토프(및 일부 상황에서 3개 이상의 상이한 에피토프)에 특이적으로 결합한다. 적어도 2개의 상이한 에피토프는 동일한 표적 분자 또는 상이한 표적 분자 상에 존재할 수 있다. 일반적으로, 개시내용의 MBM은 2개 이상의 상이한 표적 분자(이따금 본원에서 "항원"으로 지칭됨)에 특이적으로 결합한다.

6.2.1. scFv

단일 사슬 Fv 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 단일 폴리펩타이드 사슬에 포함하며, 단일 사슬 폴리펩타이드로서 발현될 수 있고, 이것이 유래되는 무손상(intact) 항체의 특이성을 보유한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는, scFv가 표적화 결합에 요망되는 구조를 형성하게 하는 폴리펩타이드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. scFV의 VH 사슬 및 VL 사슬을 연결하는 데 적합한 링커의 예는 섹션 6.2.3에서 식별된 링커이다.

명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 scFv는 예를 들어, 폴리펩타이드의 N-말단 단부 및 C-말단 단부에 대해 어느 순서에서 VL 가변 영역 및 VH 가변 영역을 가질 수 있거나, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL를 포함할 수 있다.

scFv는 임의의 적합한 종으로부터의 VH 및 VL 서열, 예컨대 뮤린, 인간, 또는 인간화 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.

scFv-인코딩 핵산을 생성하기 위해, VH 및 VL-인코딩 DNA 단편은 링커를 인코딩하는, 예를 들어, 섹션 6.2.3에 기재된 임의의 링커를 인코딩하는 또 다른 단편에 작동 가능하게 연결되어(전형적으로 아미노산 글리신 및 세린을 함유하는 서열의 반복, 예컨대 아미노산 서열 (Gly4~Ser)₃(SEQ ID NO: 1)), VH 및 VL 서열은, 가요성 링커에 의해 접합되는 VL 및 VH 영역과 함께 인접(contiguous) 단일-사슬 단백질로서 발현될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bird 등, 1988, Science 242:423-426]; 문헌[Huston 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 문헌[McCafferty 등, 1990, Nature 348:552-554] 참조).

6.2.2. Fab1 및 Fab2

개시내용의 MBM은 각각의 반항체에 적어도 하나의 Fab 도메인을 포함한다. Fab 도메인은 전형적으로, 파파인과 같은 효소를 사용한 면역글로불린 분자의 단백분해성 절단에 의해 생성되었다. 개시내용의 MBM에서, Fab 도메인은 더 큰 분자의 파트로서 재조합적으로 발현된다.

Fab 도메인은 임의의 적합한 종으로부터의 불변 도메인 서열 및 가변 영역 서열을 포함할 수 있고, 뮤린, 키메라, 인간 또는 인간화일 수 있다.

Fab 도메인은 전형적으로, VL 도메인에 부착된 CL 도메인과 쌍형성하는 VH 도메인에 부착된 CH1 도메인을 포함한다. 야생형 면역글로불린에서, VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 형성하여, Fv 영역을 이루고, CH1 도메인은 CL 도메인과 쌍을 형성하여 결합 분자를 추가로 안정화시킨다. 2개의 불변 도메인 사이의 이황화 결합은 Fab 도메인을 추가로 안정화시킬 수 있다.

개시내용의 MBM에 대해, 특히 경쇄가 보편적 또는 유니버셜 경쇄가 아닐 때, 동일한 ABS에 속하는 Fab 도메인의 올바른 회합을 허용하고 상이한 ABS에 속하는 Fab 도메인의 비정상적인 쌍형성을 최소화하기 위해 Fab 헤테로이량체화 전략을 사용하는 것이 유리하다. 예를 들어, 아래 표 1에 나타낸 Fab 헤테로이량체화가 사용될 수 있다:

이에, 소정의 구현예에서, Fab의 2개의 폴리펩타이드 사이의 올바른 회합은 예를 들어, 국제공개 WO 2009/080251호에 기재된 바와 같이 Fab의 VL 도메인 및 VH 도메인을 서로 교환함으로써 또는 CH1 도메인 및 CL 도메인을 서로 교환함으로써 촉진된다.

올바른 Fab 쌍형성은 또한, Fab의 CH1 도메인에 하나 이상의 아미노산 변형 및 CL 도메인에 하나 이상의 아미노산 변형 및/또는 VH 도메인에 하나 이상의 아미노산 변형 및 VL 도메인에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입함으로써 촉진될 수 있다. 변형되는 아미노산은 전형적으로, Fab 성분이 다른 Fab의 성분보다 서로 우선적으로 쌍을 형성하게 되는 VH:VL 및 CH1:CL 계면의 파트이다.

일 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 잔기의 카바트 숫자매김에 의해 지시된 바와 같이, 가변(VH, VL) 및 불변(CH1, CL) 도메인의 보존된 프레임워크 잔기로 제한된다. 문헌[Almagro, 2008, Frontiers In Bioscience 13:1619-1633]은 카바트, 초티아, 및 IMGT 숫자매김 체계에 기초하여 프레임워크 잔기의 정의를 제공한다.

일 구현예에서, VH 및 CH1 및/또는 VL 및 CL 도메인에 도입되는 변형은 서로 상보적이다. 중쇄 및 경쇄 계면에서의 상보성은 입체(steric) 및 소수성 접촉, 정전기/전하 상호작용 또는 여러 가지 상호작용들의 조합에 기초하여 달성될 수 있다. 단백질 계면 사이의 상보성은 자물쇠와 열쇠 맞춤(lock and key fit), 노브 인투 홀(knob into hole), 돌출부 및 공극(protrusion and cavity), 공여기 및 수용기 등의 측면에서 문헌에서 널리 기재되어 있으며, 이들 모두는 2개의 상호작용 계면 사이의 구조적 및 화학적 매치의 성질을 암시한다.

일 구현예에서, 하나 이상의 도입되는 변형은 Fab 성분의 계면을 가로질러 새로운 수소 결합을 도입한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 도입되는 변형은 Fab 성분의 계면을 가로질러 새로운 염 브릿지를 도입한다. 예시적인 치환은 국제공개 WO 2014/150973호 및 WO 2014/082179호에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 참조에 의해 본원에 포함된다.

일부 구현예에서, Fab 도메인은 CH1 도메인에 192E 치환 및 CL 도메인에 114A 및 137K 치환을 포함하며, 이는 CH1 도메인과 CL 도메인 사이에 염-브릿지를 도입한다(예를 들어, 문헌[Golay 등, 2016, J Immunol 196:3199-211] 참조).

일부 구현예에서, Fab 도메인은 CH1 도메인에 143Q 및 188V 치환 및 CL 도메인에 113T 및 176V 치환을 포함하며, 이는 CH1 도메인과 CL 도메인 사이에서 접촉의 소수성 및 극성 영역을 스와핑하는 역할을 한다(예를 들어, 문헌[Golay 등, 2016, J Immunol 196:3199-211] 참조).

일부 구현예에서, Fab 도메인은 VH, CH1, VL, CL 도메인 중 일부 또는 모두에 변형을 포함하여, Fab 도메인의 올바른 조립을 촉진하는 직교 Fab 계면을 도입할 수 있다(문헌[Lewis 등, 2014 Nature Biotechnology 32:191-198]). 일 구현예에서, 39K, 62E 변형은 VH 도메인에 도입되며, H172A, F174G 변형은 CH1 도메인에 도입되고, 1 R, 38D, (36F) 변형은 VL 도메인에 도입되며, L135Y, S176W 변형은 CL 도메인에 도입된다. 또 다른 구현예에서, 39Y 변형은 VH 도메인에 도입되고, 38R 변형은 VL 도메인에 도입된다.

Fab 도메인은 또한, 네이티브 CH1:CL 이황화 결합을 조작된 이황화 결합으로 대체하여, Fab 성분 쌍형성의 효율을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 조작된 이황화 결합은 126C를 CH1 도메인에 그리고 121 C를 CL 도메인에 도입함으로써 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Mazor 등, 2015, MAbs 7:377-89] 참조).

Fab 도메인은 또한, CH1 도메인 및 CL 도메인을, 올바른 조립을 촉진하는 대안적인 도메인으로 대체함으로써 변형될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Wu 등, 2015, MAbs 7:364-76]은 T 세포 수용체의 CH1 도메인을 불변 도메인으로 치환하며 T 세포 수용체의 CL 도메인을 b 도메인으로 치환하고, VL 도메인에 38D 변형 및 VH 도메인에 39K 변형을 도입함으로써 VL 도메인과 VH 도메인 사이에서 추가의 전하-전하 상호작용과 이들 도메인 대체를 쌍형성하는 것을 기재한다.

올바른 VH - VL 쌍형성을 촉진하기 위한 Fab 헤테로이량체화 전략의 사용 대신에 또는 이에 더하여, 보편적 경쇄(유니버셜 경쇄로도 지칭됨)의 VL은 개시내용의 MBM의 각각의 Fab VL 영역에 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 보편적 경쇄를 이용하는 것은 원래의 동족(cognate) VL을 이용하는 것과 비교하여 부적절한 종의 MBM의 수를 감소시킨다. 다양한 구현예에서, MBM의 VL 도메인은 보편적 경쇄를 포함하는 단일특이적 항체로부터 식별된다. 다양한 구현예에서, MBM의 VH 영역은, 인간 중쇄와 동족인 제한된 인간 경쇄 레퍼토리, 또는 단일 인간 경쇄를 발현하도록 이전에 조작된 마우스 B 세포 내에서 생체내에서 재배열되고, 관심 항원에의 노출에 반응하여 하나의 또는 2개의 가능한 인간 VL 중 하나와 동족인 복수의 인간 VH를 함유하는 항체 레퍼토리를 생산하는 인간 중쇄 가변 유전자 분절을 포함하며, 여기서 항체 레퍼토리는 관심 항원에 특이적이다. 보편적 경쇄는 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유래되는 것이고, 체세포적으로 돌연변이화된(예를 들어, 친화도 성숙된) 버전을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제10,412,940호를 참조한다.

6.2.3. 링커

소정의 양태에서, 본 개시내용은, ABS의 2개 이상의 성분(예를 들어, scFv의 VH 및 VL), 2개 이상의 ABS(예를 들어, 반항체의 scFv 및 Fab), 또는 ABS 및 비-ABS 성분(예를 들어, Fc 영역)이 펩타이드 링커에 의해 서로 연결된 MBM을 제공한다. 이러한 링커는 본원에서 예를 들어, 섹션 6.4에 기재된 바와 같이 약물을 MBM에 부착시키는 데 사용되는 ADC 링커와 대조적으로, "ABS 링커"로 지칭된다.

펩타이드 링커는 2개 아미노산 내지 60개 이상의 아미노산 범위일 수 있고, 소정의 양태에서, 펩타이드 링커는 3개 아미노산 내지 50개 아미노산, 4 내지 30개 아미노산, 5 내지 25개 아미노산, 10 내지 25개 아미노산, 10개 아미노산 내지 60개 아미노산, 12개 아미노산 내지 20개 아미노산, 20개 아미노산 내지 50개 아미노산, 또는 25개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이이다.

특정 양태에서, 펩타이드 링커, 예를 들어, scFv 도메인 및 중쇄, 예컨대 ABS1의 scFv 도메인 및 ABS2의 중쇄 가변 영역을 분리하는 펩타이드 링커는 적어도 5개 아미노산, 적어도 6개 아미노산 또는 적어도 7개 아미노산 길이이고, 선택적으로 최대 30개 아미노산, 최대 40개 아미노산, 최대 50 아미노산, 또는 최대 60개 아미노산 길이이다.

전술한 내용의 일부 구현예에서, 링커는 5개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이 범위이며, 예를 들어, 5개 내지 50개, 5개 내지 45개, 5개 내지 40개, 5개 내지 35개, 5개 내지 30개, 5개 내지 25개, 또는 5개 내지 20개 아미노산 길이 범위이다. 전술한 내용의 다른 구현예에서, 링커는 6개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이 범위이며, 예를 들어, 6개 내지 50개, 6개 내지 45개, 6개 내지 40개, 6개 내지 35개, 6개 내지 30개, 6개 내지 25개, 또는 6개 내지 20개 아미노산 길이 범위이다. 전술한 내용의 더욱 다른 구현예에서, 링커는 7개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이 범위이며, 예를 들어, 7개 내지 50개, 7개 내지 45개, 7개 내지 40개, 7개 내지 35개, 7개 내지 30개, 7개 내지 25개, 또는 7개 내지 20개 아미노산 길이 범위이다.

하전된 링커(예를 들어, 하전된 친수성 링커) 및/또는 가요성 링커가 특히 바람직하다.

개시내용의 MBM에 사용될 수 있는 가요성 ABS 링커의 예는 문헌[Chen 등, 2013, Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369] 및 문헌[Klein 등, 2014, Protein Engineering, Design & Selection 27(10): 325-330]에 개시된 것을 포함한다. 특히 유용한 가요성 링커는 글리신 및 세린의 반복, 예를 들어, G_nS(SEQ ID NO: 2) 또는 SG_n(SEQ ID NO: 3)의 단량체 또는 다량체이거나 이를 포함하며, n은 1 내지 10의 정수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 일 구현예에서, 링커는 G₄S(SEQ ID NO: 4)의 반복의 단량체 또는 다량체(GGGGS)_n이거나 이를 포함한다.

폴리글리신 링커는 개시내용의 MBM에 적합하게 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드 링커, 예를 들어, scFv 도메인 및 중쇄, 예컨대 ABS1의 scFv 도메인 및 ABS2의 중쇄 가변 영역을 분리하는 펩타이드 링커는 2개 연속의 글리신(2Gly), 3개 연속의 글리신(3Gly), 4개 연속의 글리신(4Gly(SEQ ID NO: 5)), 5개 연속의 글리신(5Gly(SEQ ID NO: 6)), 6개 연속의 글리신(6Gly(SEQ ID NO: 7)), 7개 연속의 글리신(7Gly(SEQ ID NO: 8)), 8개 연속의 글리신(8Gly(SEQ ID NO: 9)), 또는 9개 연속의 글리신(9Gly(SEQ ID NO: 10))을 포함한다.

특정 구현예에서, ABS 링커, 예를 들어, scFv 도메인 및 중쇄, 예컨대 ABS1의 scFv 도메인 및 ABS2의 중쇄 가변 영역을 분리하는 펩타이드 링커는 G4S(SEQ ID NO: 4) 또는 이의 다량체와 하나 이상의 추가 글리신, 예를 들어, 2Gly, 3Gly 또는 4Gly(SEQ ID NO: 5) 둘 다로 이루어진다. 이러한 링커의 예는 G₄S GG(SEQ ID NO: 63), 4xG₄S GG(SEQ ID NO: 64), 및 7xG₄S GG(SEQ ID NO: 65)를 포함한다.

6.2.4. 힌지 영역

개시내용의 MBM은 또한 예를 들어, ABS 모듈을 Fc 영역에 연결하는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 네이티브 또는 변형된 힌지 영역일 수 있다. 힌지 영역은 전형적으로 Fc 영역의 N-말단에서 발견된다.

네이티브 힌지 영역은, 천연적으로 발생하는 항체에서 Fab 도메인과 Fc 도메인 사이에서 통상적으로 발견될 힌지 영역이다. 변형된 힌지 영역은 네이티브 힌지 영역으로부터 길이 및/또는 조성이 상이한 임의의 힌지이다. 이러한 힌지는 다른 종으로부터의 힌지 영역, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼, 상어, 돼지, 햄스터, 낙타, 리마, 또는 염소 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 변형된 힌지 영역은 중쇄 Fc 영역과 상이한 부류 또는 하위부류의 항체로부터 유래되는 완전 힌지 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 변형된 힌지 영역은, 천연 힌지의 파트, 또는 반복 내의 각각의 단위가 천연 힌지 영역으로부터 유래되는 반복 단위를 포함할 수 있다. 추가 대안에서, 천연 힌지 영역은 하나 이상의 시스테인 또는 다른 잔기를 중성 잔기, 예컨대 세린 또는 알라닌으로 전환시킴으로써, 또는 적합하게 배치된 잔기를 시스테인 잔기로 전환시킴으로써 변경될 수 있다. 이러한 것은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는 증가되거나 저하될 수 있음을 의미한다. 다른 변형된 힌지 영역은 전적으로 합성일 수 있고, 요망되는 특성, 예컨대 길이, 시스테인 조성 및 가요성을 소유하도록 설계될 수 있다.

많은 변형된 힌지 영역은 예를 들어, 미국 특허 제5,677,425호, 국제공개 WO 9915549호, WO 2005003170호, WO 2005003169호, WO 2005003170호, WO 9825971호, 및 WO 2005003171호에 이미 기재되어 있고, 이들은 참조로서 본원에 포함된다.

일 구현예에서, 개시내용의 반항체 중 하나 또는 둘 다의 Fc 영역은 이의 N-말단에 무손상(intact) 힌지 도메인, 예를 들어, 힌지 도메인을 소유한다. 일부 구현예에서, "힌지 도메인"은 인간 IgG1의 약 Glu216 또는 약 Cys226으로부터 약 Pro230까지의 서열(문헌[Burton, 1985 Molec. Immunol. 22:161-206]), 또는 또 다른 항체 부류 또는 이소타입에서의 상응하는 서열을 지칭한다.

다양한 구현예에서, 힌지 도메인 내의 위치 233-236은 G, G, G, 및 비점유(unoccupied); G, G, 비점유, 및 비점유; G, 비점유, 비점유, 및 비점유; 또는 모두 비점유일 수 있고, 위치는 EU 숫자매김에 의해 숫자매김된다.

일부 구현예에서, 개시내용의 MBM은 동일한 이소타입(예를 들어, 인간 IgG1 또는 인간 IgG4)의 야생형 힌지 도메인에 비해 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도를 감소시키는 변형된 힌지 도메인을 포함한다.

일 구현예에서, 개시내용의 MBM의 하나의 사슬 또는 사슬 둘 다의 Fc 영역은 이의 N-말단에 무손상(intact) 힌지 도메인을 소유한다.

일 구현예에서, 개시내용의 MBM의 Fc 영역과 힌지 영역은 둘 다 IgG4로부터 유래되고, 힌지 영역은 변형된 서열 CPPC(SEQ ID NO: 11)를 포함한다. 인간 IgG4의 코어 힌지 영역은, 서열 CPPC(SEQ ID NO: 11)를 함유하는 IgG1과 비교하여 서열 CPSC(SEQ ID NO: 12)를 함유한다. IgG4 서열에 존재하는 세린 잔기는 이 영역에서 증가된 가요성을 유발하고, 따라서, 분자의 일부는, 사슬간 이황화를 형성하기 위해 IgG 분자에서 다른 중쇄에 브릿지하기 보다는 동일한 단백질 사슬 내에서 이황화 결합(사슬내 이황화)을 형성한다(문헌[Angel 등, 1993, Mol Immunol 30(1):105-108]). IgG1과 동일한 코어 서열을 제공하기 위해 세린 잔기를 프롤린으로 바꾸는 것은, IgG4 힌지 영역에서 사슬간 이황화의 완전한 형성을 가능하게 하여, 정제된 생성물에서 불균질성(heterogeneity)을 감소시킨다. 이러한 변경된 이소타입은 IgG4P라고 한다.

6.2.4.1. 키메라 힌지 서열

힌지 영역은 키메라 힌지 영역일 수 있다.

예를 들어, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래되는 "하위(lower) 힌지" 서열과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래되는 "상위(upper) 힌지" 서열을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 키메라 힌지 영역은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO: 13)(국제공개 WO 2014/121087호의 SEQ ID NO: 8로서 이전에 개시되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 포함됨) 또는 ESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO: 14)(WO2014/121087호의 SEQ ID NO: 9로서 이전에 개시됨)를 포함한다. 이러한 키메라 힌지 서열은 IgG4 CH2 영역에 적합하게 연결될 수 있다(예를 들어, 섹션 6.2.5.1에 기재된 바와 같이 이펙터 기능을 감소시키기 위해 CH2 및/또는 CH3 도메인에서 추가로 변형될 수 있는, 예를 들어, IgG4 Fc 도메인, 예를 들어 인간 또는 뮤린 Fc 도메인 내로의 혼입에 의해).

6.2.4.2. 감소된 이펙터 기능을 갖는 힌지 서열

추가 구현예에서, 힌지 영역은 예를 들어 국제공개 WO 2016161010A2호에 기재된 바와 같이 이펙터 기능을 감소시키기 위해 변형될 수 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 다양한 구현예에서, 변형된 힌지 영역의 위치 233-236은 G, G, G 및 비점유(unoccupied); G, G, 비점유, 및 비점유; G, 비점유, 비점유, 및 비점유; 또는 모두 비점유일 수 있고, 위치는 EU 숫자매김에 의해 숫자매김된다(국제공개 WO 2016161010A2호의 도 1에 도시된 바와 같음). 이들 분절은 GGG-, GG--, G---, 또는 ----로 표현될 수 있으며, "-"는 비점유된 위치를 나타낸다.

위치 236은 캐노니컬(canonical) 인간 IgG2에서 비점유되지만, 다른 캐노니컬 인간 IgG 이소타입에 의해 점유된다. 위치 233-235는 모든 4개의 인간 이소타입에서 G 이외의 잔기에 의해 점유된다(국제공개 WO 2016161010A2호의 도 1에 도시된 바와 같음).

위치 233-236 내의 힌지 변형은 P에 의해 점유되는 위치 228과 조합될 수 있다. 위치 228은 인간 IgG1 및 IgG2에서 P에 의해 천연적으로 점유되지만, 인간 IgG4에서 S 및 인간 IgG3에서 R에 의해 점유된다. IgG4 항체에서 S228P 돌연변이는 IgG4 항체를 안정화시키고 외인성 항체와 내인성 항체 사이의 중쇄 경쇄 쌍의 교환을 감소시키는 데 유리하다. 바람직하게는 위치 226 내지 229는 C, P, P 및 C에 의해 각각 점유된다.

예시적인 힌지 영역은 이따금, GGG-(233-236), GG--(233-236), G---(233-236), 및 G 없음(no G)(233-236)으로 표기되는 변형된 힌지 서열에 의해 점유되는 중간(또는 코어) 및 하위 힌지로 지칭되는 잔기 226-236을 포함한다. 선택적으로, 힌지 도메인 아미노산 서열은 CPPCPAPGGG-GPSVF(SEQ ID NO: 15) (국제공개 WO 2016161010A2호의 SEQ ID NO: 1로서 이전에 개시됨), CPPCPAPGG--GPSVF(SEQ ID NO: 16)(국제공개 WO 2016161010A2호의 SEQ ID NO: 2로서 이전에 개시됨), CPPCPAPG---GPSVF(SEQ ID NO: 17)(국제공개 WO2016161010A2호의 SEQ ID NO: 3으로서 이전에 개시됨), 또는 CPPCPAP----GPSVF(SEQ ID NO: 18)(국제공개 WO 2016161010A2호의 SEQ ID NO: 4로서 이전에 개시됨)를 포함한다.

상기 기재된 변형된 힌지 영역은 중쇄 불변 영역 내로 혼입될 수 있으며, 이는 전형적으로 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 표기된 영역을 플랭킹(flanking)하는 추가 힌지 분절(예를 들어, 상위 힌지)을 가질 수 있다. 존재하는 이러한 추가 불변 영역 분절은 전형적으로 동일한 이소타입, 바람직하게는 인간 이소타입의 것이지만, 상이한 이소타입의 하이브리드일 수 있다. 이러한 추가의 인간 불변 영역 분절의 이소타입은 바람직하게는 인간 IgG4일 뿐만 아니라, 도메인이 상이한 이소타입의 것인 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG3 또는 이의 하이브리드일 수 있다. 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4의 예시적인 서열은 국제공개 WO 2016161010A2호의 도 2 내지 도 4에 도시되어 있다.

구체적인 구현예에서, 변형된 힌지 서열은 IgG4 CH2 영역에 연결될 수 있다(예를 들어, 섹션 6.2.5.1에 기재된 바와 같이 이펙터 기능을 감소시키기 위해 CH2 및/또는 CH3 도메인에서 추가로 변형될 수 있는, 예를 들어, IgG4 Fc 도메인, 예를 들어 인간 또는 뮤린 Fc 도메인 내로의 혼입에 의해).

6.2.5. Fc 도메인

개시내용의 MBM은 임의의 적합한 종으로부터 유래된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, Fc 영역은 인간 Fc 도메인으로부터 유래된다.

Fc 도메인은 IgA(하위부류 lgA1 및 lgA2를 포함함), IgD, IgE, IgG(하위부류 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함함), 및 IgM을 포함하여 임의의 적합한 부류의 항체부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래된다. 일 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1로부터 유래된다. 일 구현예에서, Fc 도메인은 IgG4로부터 유래된다.

Fc 영역 내의 2개의 Fc 도메인은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 네이티브 항체에서, Fc 도메인은 전형적으로 동일하지만, 다중특이적 결합 분자, 예를 들어, 개시내용의 MBM을 생성하는 목적을 위해, Fc 도메인은 유리하게는 아래 섹션 6.2.5.2에 기재된 바와 같이 헤테로이량체화를 가능하게 하도록 상이할 것이다.

네이티브 항체에서, IgA, IgD 및 IgG의 중쇄 Fc 도메인은 2개의 중쇄 불변 도메인(CH2 및 CH3)으로 이루어지고, IgE 및 IgM의 중쇄 Fc 도메인은 3개의 중쇄 불변 도메인(CH2, CH3, 및 CH4)으로 이루어진다. 이들은 이량체화되어, Fc 영역을 생성한다.

본 개시내용의 MBM에서, Fc 영역, 및/또는 그 안의 Fc 도메인은 하나 이상의 상이한 부류, 예를 들어 1개, 2개 또는 3개의 상이한 부류의 항체로부터의 중쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, Fc 영역은 IgG1로부터 유래되는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.

일 구현예에서, Fc 영역은 IgG2로부터 유래되는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.

일 구현예에서, Fc 영역은 IgG3으로부터 유래되는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.

일 구현예에서, Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.

일 구현예에서, Fc 영역은 IgM으로부터의 CH4 도메인을 포함한다. IgM CH4 도메인은 전형적으로, CH3 도메인의 C-말단에 위치한다.

일 구현예에서, Fc 영역은 IgG로부터 유래되는 CH2 및 CH3 도메인 및 IgM으로부터 유래되는 CH4 도메인을 포함한다.

본 개시내용의 MBM에 대한 Fc 영역을 생성하는 데 사용하기 위한 중쇄 불변 도메인은 상기 기재된 천연 발생 불변 도메인의 변이체를 포함할 수 있는 것으로 여겨질 것이다. 이러한 변이체는 야생형 불변 도메인과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변이를 포함할 수 있다. 일례에서, 본 개시내용의 Fc 영역은, 야생형 불변 도메인으로부터의 서열에서 다양한 적어도 하나의 불변 도메인을 포함한다. 변이체 불변 도메인은 야생형 불변 도메인보다 더 길거나 더 짧을 수 있는 것으로 이해될 것이다. 바람직하게는 변이체 불변 도메인은 야생형 불변 도메인과 적어도 60% 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 적어도 70% 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 적어도 80% 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 적어도 90% 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 적어도 95% 동일하거나 유사하다.

IgM 및 IgA는 인간에서 보편적 H2L2 항체 단위의 공유 다량체로서 천연적으로 발생한다. IgM은 이것이 J-사슬을 혼입하였 때 오량체로서, 또는 이것이 J-사슬이 결여될 때 육량체로서 발생한다. IgA는 단량체 및 이량체 형태로서 발생한다. IgM 및 IgA의 중쇄는 테일피스(tailpiece)로 알려진 C-말단 불변 도메인에 18개 아미노산 연장부(extension)를 소유한다. 테일피스는 중합체 내 중쇄 사이에서 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하고, 중합에서 중요한 역할을 갖는 것으로 여겨진다. 테일피스는 또한 글리코실화 부위를 함유한다. 소정의 구현예에서, 본 개시내용의 MBM은 테일피스를 포함하지 않는다.

본 개시내용의 MBM 내로 혼입되는 Fc 도메인은, 단백질의 기능적 특성, 예를 들어, Fc-수용체, 예컨대 FcRn 또는 백혈구 수용체에의 결합, 보체에의 결합, 변형된 이황화 결합 구조, 또는 변경된 글리코실화 패턴을 변경시키는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 이펙터 기능을 변경시키는 예시적인 Fc 변형은 섹션 6.2.5.1에 기재되어 있다.

Fc 도메인은 또한, 예를 들어 헤테로이량체화를 가능하게 함으로써 비대칭 MBM의 생산성(manufacturability)을 향상시키는 변형을 포함하도록 변경될 수 있으며, 이는 동일한 Fc 도메인을 능가하는 동일하지 않은 Fc 도메인의 우선적인 쌍형성이다. 헤테로이량체화는, 상이한 ABS가, 서열이 상이한 Fc 도메인을 함유하는 Fc 영역에 의해 서로 연결되는 MBM의 생성을 허용한다. 헤테로이량체화 전략의 예는 섹션 6.2.5.2에 예시되어 있다.

상기 언급된 임의의 변형은, MBM의 요망되는 기능적 특성을 달성하기 위해 임의의 적합한 방식으로 조합되고/거나 특성을 변경시키기 위한 다른 변형과 조합될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

6.2.5.1. 변경된 이펙터 기능을 갖는 Fc 도메인

일부 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에의 결합 및/또는 이펙터 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.

특정 구현예에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일 구현예에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일 구현예에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 구현예에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRlla, 가장 구체적으로 인간 FcγRllla이다. 일 구현예에서, 이펙터 기능 보체 의존적 세포독성(CDC), 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포성 식세포작용(ADCP), 및 사이토카인 분비의 군으로부터 선택되는 하나 이상이다. 특정 구현예에서, 이펙터 기능은 ADCC이다.

일 구현예에서, Fc 영역은 E233, L234, L235, N297, P331, 및 P329(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 구체적인 구현예에서, Fc 영역은 L234, L235, 및 P329(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 아미노산 치환 L234A 및 L235A(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)를 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, Fc 영역은 Igd Fc 영역, 특히 인간 Igd Fc 영역이다. 일 구현예에서, Fc 영역은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 구체적인 구현예에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)이다. 일 구현예에서, Fc 영역은 위치 P329에서 아미노산 치환, 및 E233, L234, L235, N297, 및 P331(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)로부터 선택되는 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 더 구체적인 구현예에서, 추가의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, 또는 P331S이다. 특정 구현예에서, Fc 영역은 위치 P329, L234, 및 L235(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구현예에서, Fc 영역은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A, 및 P329G("P329G LALA", "PGLALA" 또는 "LALAPG")를 포함한다.

전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 치환은 Fc 영역의 2개의 Fc 도메인 각각에 존재한다. 그러므로, 특정 구현예에서, Fc 영역의 각각의 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A, 및 P329G(카바트 EU 지수 숫자매김)를 포함하며, 즉, Fc 영역 내의 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인 각각에서 위치 234에서의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체되며(L234A), 위치 235에서의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체되고(L235A), 위치 329에서의 프롤린 잔기는 글리신 잔기에 의해 대체된다(P329G)(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김).

일 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다.

일 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, IgG1 Fc 도메인은 이펙터 기능을 감소시키기 위해 D265A, N297A 돌연변이(EU 숫자매김)를 포함하는 변이체 IgG1이다.

또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에의 감소된 결합을 갖는 IgG4 Fc 도메인이다. Fc 수용체에의 감소된 결합을 갖는 예시적인 IgG4 Fc 도메인은 아래 표 A로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 아래 제시된 서열의 볼드 부분만 포함한다:

특정 구현예에서, 감소된 이펙터 기능을 갖는 IgG4는, 이따금 본원에서 IgG4s 또는 hIgG4s로 지칭되는 국제공개 WO 2014/121087호의 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열의 볼드체 부분을 포함한다.

헤테로이량체성 MBM에 대해, 상기 제시된 변이체 IgG4 Fc 서열의 조합, 예를 들어 국제공개 WO 2014/121087호의 SEQ ID NO: 30(또는 이의 볼드체 부분)과 국제공개 WO 2014/121087호의 SEQ ID NO: 37(또는 이의 볼드체 부분)의 조합을 포함하는 Fc 영역 또는 국제공개 WO 2014/121087호의 SEQ ID NO: 31(또는 이의 볼드체 부분)과 국제공개 WO 2014/121087호의 SEQ ID NO: 38(또는 이의 볼드체 부분)의 조합을 포함하는 Fc 영역을 혼입하는 것이 가능하다.

6.2.5.2. Fc 헤테로이량체화 변이체

많은 다중특이적 분자 형식은, 네이티브 면역글로불린과는 달리, 동일하지 않은 항원-결합 도메인(또는 이의 부분, 예를 들어, Fab의 VH 또는 VH-CH1)에 작동 가능하게 연결되는 2개의 Fc 도메인 사이에서 이량체화를 수반한다. Fc 도메인을 형성하기 위한 2개의 Fc 영역의 부적절한 헤테로이량체화는 요망되는 다중특이적 분자의 수율을 증가시키는 데 있어서 장애물이 될 수 있고, 정제의 어려움을 나타낸다. 당업계에서 이용 가능한 여러 가지 접근법은 예를 들어 유럽 특허출원공개 EP 1870459A1호; 미국 특허 제5,582,996호; 미국 특허 제5,731,168호; 미국 특허 제5,910,573호; 미국 특허 제5,932,448호; 미국 특허 제6,833,441호; 미국 특허 제7,183,076호; 미국 특허 출원 공보 2006204493A1호; 및 국제공개 WO 2009/089004A1호에 개시된 바와 같은 개시내용의 MBM에 존재할 Fc 도메인의 이량체화를 증강시키기 위해 사용될 수 있다.

본 개시내용은 Fc 헤테로이량체, 즉, 이종성의 동일하지 않은 Fc 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함하는 MBM을 제공한다. 헤테로이량체화 전략은 상이한 ABS(또는 이의 부분, 예를 들어, Fab의 VH 또는 VH-CH1)에 작동 가능하게 연결된 Fc 영역의 이량체화를 증강시키고 동일한 ABS에 작동 가능하게 연결된 Fc 도메인의 이량체화를 감소시키기 위해 사용된다. 전형적으로, Fc 헤테로이량체 내의 각각의 Fc 도메인은 항체의 CH3 도메인을 포함한다. CH3 도메인은 선행 섹션에 기재된 바와 같이 임의의 이소타입, 부류 또는 하위부류, 바람직하게는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4) 부류의 항체의 불변 영역으로부터 유래된다.

CH3 도메인에서 2개의 상이한 중쇄의 헤테로이량체화는 요망되는 MBM을 유도하는 한편, 동일한 중쇄의 호모이량체화는 요망되는 MBM의 수율을 감소시킬 것이다. 그러므로, 바람직한 구현예에서, 회합되어 개시내용의 MBM을 형성하는 2개의 반항체는, 비변형된 사슬에 비해 헤테로이량체성 회합을 선호하는 변형을 갖는 CH3 도메인을 함유할 것이다.

구체적인 구현예에서, Fc 헤테로이량체의 형성을 촉진하는 상기 변형은, Fc 도메인 중 하나에 "노브" 변형 및 다른 Fc 도메인에 "홀" 변형을 포함하는 소위 "노브-인투-홀" 또는 "노브-인-홀" 변형이다. 노브-인투-홀 기술은 예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호; 미국 특허 제7,695,936호; 문헌[Ridgway 등, 1996, Prot Eng 9:617-621], 및 문헌[Carter, 2001, Immunol Meth 248:7-15]에 기재되어 있다. 일반적으로, 방법은 제1 폴리펩타이드의 계면에 융기부(protuberance)("노브") 및 제2 폴리펩타이드의 계면에 상응하는 공극("홀")을 도입하는 것을 수반하며, 따라서 융기부는 공극에 위치하여 헤테로이량체 형성을 촉진하고 호모이량체 형성을 방해할 수 있다. 융기부는 제1 폴리펩타이드의 계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 작제된다. 융기부와 동일한 또는 상이한 크기의 보상적(compensatory) 공극은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩타이드의 계면에서 생성된다.

이에 일부 구현예에서, Fc 도메인의 제1 하위단위의 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제1 하위단위의 CH3 도메인 내에서 융기부를 생산하며, 이러한 융기부는 제2 하위단위의 CH3 도메인 내의 공극(cavity)에 위치할 수 있고, Fc 도메인의 제2 하위단위의 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제2 하위단위의 CH3 도메인 내에서 공극을 생산하며, 이러한 공극 내에서 제1 하위단위의 CH3 도메인 내의 융기부가 위치할 수 있다. 바람직하게는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 및 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 융기부 및 공극은 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 예를 들어 부위-특이적 돌연변이형성에 의해 또는 펩타이드 합성에 의해 변경시킴으로써 만들어질 수 있다. 예시적인 치환은 Y470T이다.

구체적인 이러한 구현예에서, 제1 Fc 도메인에서 위치 366에서의 트레오닌 잔기는 트립토판 잔기로 대체되며(T366W), Fc 도메인에서 위치 407에서의 티로신 잔기는 발린 잔기로 대체되고(Y407V), 선택적으로 위치 366에서의 트레오닌 잔기는 세린 잔기로 대체되며(T366S), 위치 368에서의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체된다(L368A)(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김). 추가 구현예에서, 제1 Fc 도메인에서 추가로 위치 354에서의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 대체되거나(S354C) 위치 356에서의 글루탐산 잔기는 시스테인 잔기로 대체되며(E356C)(특히 위치 354에서의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 대체됨), 제2 Fc 도메인에서 추가로 위치 349에서의 티로신 잔기는 시스테인 잔기로 대체된다(Y349C)(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김). 특정 구현예에서, 제1 Fc 도메인은 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김).

일부 구현예에서, 정전기적 스티어링(electrostatic steering)(예를 들어, 문헌[Gunasekaran 등, 2010, J Biol Chem 285(25): 19637-46]에 기재된 바와 같음)은 Fc 도메인의 제1 하위단위 및 제2 하위단위의 회합을 촉진하는 데 사용될 수 있다.

헤테로이량체화를 촉진하기 위해 변형되는 Fc 도메인의 사용에 대한 대안으로서 또는 이에 더하여, Fc 도메인은 Fc 헤테로이량체의 선택을 가능하게 하는 정제 전략을 가능하게 하도록 변형될 수 있다. 하나의 이러한 구현예에서, 하나의 반항체는, 단백질 A에의 상기 반항체의 결합을 무효화하는 변형된 Fc 도메인을 포함하여, 헤테로이량체성 단백질을 산출하는 정제 방법을 가능하게 한다. 예를 들어, 미국 특허 제8,586,713호를 참조한다. 이와 같이, MBM은 제1 CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 적어도 하나의 아미노산에 의해 서로 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는, 아미노산 차이를 결여하는 상응하는 MBM과 비교하여 단백질 A에의 MBM의 결합을 감소시킨다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 제2 CH3 도메인은 단백질 A 결합을 감소시키거나 무력화시키는 돌연변이/변형, 예컨대 H95R 변형(IMGT 엑손 숫자매김에 의해; EU 숫자매김에 의해 H435R)을 함유한다. 제2 CH3은 Y96F 변형(IMGT에 의해; EU에 의해 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 그러므로, 변형의 부류는 본원에서 "스타(star)" 돌연변이로서 지칭된다.

6.3. 표적 분자

개시내용의 MBM의 ABS1, ABS2, 및 ABS3은 각각 표적 분자, 예를 들어 세포-표면 발현된 항원, 예컨대 단백질, 탄수화물, 또는 지질에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, ABS1, ABS2, 및 ABS3에 의해 결합된 표적 분자는 단백질 분자이다. 예시적인 표적 분자는 인간 클로토 베타("KLB"), 인간 섬유모세포 성장 인자 수용체 1c 이소형("FGFR1c"), 인간 섬유모세포 성장 인자 수용체 3("FGFR3"), 인간 CD63, 및 인간 아밀로이드 전구체-유사 단백질 2(APLP2)를 포함한다.

바람직하게는, scFv, Fab1, 및 Fab2는, ABS1, ABS2, 및 ABS3 각각이 이들의 각각의 표적에 동시에 특이적으로 결합할 수 있도록 선택된다. 일부 구현예에서, ABS1, ABS2, 및 ABS3은 각각 상이한 표적 분자에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 2개는 동일한 표적 분자 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.

ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 2개가 동일한 표적 분자 상의 상이한 에피토프에 결합할 때, 표적 분자에의 결합은 바람직하게는 비-경쟁적이며, 즉, ABS는 표적 분자에의 결합에 대해 경쟁하지 않는다(이는 예를 들어, 에피토프가 중첩된다면 발생할 것임). 항체와 항체 단편 사이에서의 결합 경쟁을 측정하기 위한 검정은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 검정 및 표면 플라즈몬 공명 검정을 포함한다.

표적 분자에의 결합에 대한 경쟁은 예를 들어, Octet HTX 바이오센서 플랫폼(Pall ForteBio Corp.) 상에서 실시간 무표지(label-free) 생물층 간섭 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 검정의 구체적인 구현예에서, 전체 검정은 25℃에서 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 1 mg/mL BSA, 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, pH 7.4의 완충액(HBS-EBT 완충액)에서 1000 rpm의 속도에서 플레이트를 진탕하면서 수행된다. 2개의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 이의 특이적인 표적 항원 상의 이의 각각의 에피토프에의 결합에 대해 서로 경쟁할 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, 펜타-His 태깅된 표적 항원("펜타-His"는 SEQ ID NO: 25로서 개시됨)은 먼저, 펜타-His 태깅된 표적 항원("펜타-His"는 SEQ ID NO: 25로서 개시됨)을 함유하는 웰에 항-펜타-His 항체("펜타-His"는 SEQ ID NO: 25로서 개시됨) 코팅된 Octet 바이오센서 팁(Fortebio Inc, # 18-5122)을 침지시킴으로써 이러한 바이오센서 팁 상에 포착된다. 그 후에, 항원 포착된 바이오센서 팁은, Ab-1의 용액(예를 들어, 50 μg/mL 용액)을 함유하는 웰 내로 딥핑(dipping)시킴으로써 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편(후속적으로 Ab-1로 지칭됨)으로 포화된다. 그 후에, 바이오센서 팁은 후속적으로, 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편(후속적으로 Ab-2로 지칭됨)의 용액(예를 들어, 50 μg/mL 용액)을 함유하는 웰 내로 딥핑된다. 바이오센서 팁은 검정의 모든 단계 사이에서 HBS-EBT 완충액에서 세척된다. 실시간 결합 반응은 검정의 전체 과정 동안 모니터링될 수 있고, 모든 단계의 종료 시 결합 반응은 기록될 수 있다. Ab-1과 예비-복합체화된 표적 항원에 대한 Ab-2 결합의 반응은 비교될 수 있고, 동일한 표적 항원에 대한 상이한 항체/항원-결합 단편의 경쟁적/비-경쟁적 거동이 결정될 수 있다.

적어도 2개 이상의 상이한 표적 분자에 결합하는 MBM은 예를 들어, 결합이 바람직하지 않은 다른 조직 유형에의 결합을 최소화하는 한편 2개 이상의 표적 분자가 발현되는 특정 조직 유형을 우선적으로 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 적어도 하나가 제1 조직 발현 프로파일을 갖는 제1 표적 분자에 결합하고, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 적어도 하나가, 제1 조직 발현 프로파일과 중첩되지만 동일하지 않은 제2 조직 발현 프로파일을 갖는 제2의 상이한 표적 분자에 결합할 때, MBM은 제1 발현 프로파일 및 제2 발현 프로파일의 공통 조직(들)에 표적화될 수 있다.

동일한 표적 분자(동일한 에피토프 상에 있거나 상이한 에피토프 상에 있든지 간에)에 결합하는 하나 초과의 ABS를 갖는 MBM은 세포 표면 수용체를 클러스터링하고 활성화하는 데 유용할 수 있다.

발현 프로파일은 경험적으로 결정되거나 공개 데이터베이스, 예컨대 유전자형-조직 발현(GTEx) 프로젝트 및 인간 단백질 아틀라스로부터 수득될 수 있다. 표적 선택은 단백질 발현 프로파일, mRNA 발현 프로파일, 또는 둘 다에 기초할 수 있다. 바람직하지 않은 조직 부위에서의 MBM 활성을 최소화하기 위해, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 임의의 2개 또는 모든 3개 사이에서의 조직 발현 중첩은 바람직하게는 10개 조직 미만, 예를 들어 9개 조직, 8개 조직, 7개 조직, 6개 조직, 5개 조직, 4개 조직, 3개 조직, 2개 조직, 또는 1개 조직이다. 예시적인 조직 프로파일 분석은 개시내용의 MBM에 의해 결합되는 예시적인 표적 쌍, KLB 및 FGFR1c에 대한 것이며, 도 4a(GTEx 데이터베이스에 기초함) 및 도 4b(HPA 데이터베이스에 기초함)에 도시되어 있다.

다양한 구현예에서:

ㆍ ABS1 및 ABS2는 동일한 표적 분자 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합하고 ABS3은 상이한 표적 분자에 결합하거나;

ㆍ ABS1 및 ABS3은 동일한 표적 분자 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합하고 ABS2는 상이한 표적 분자에 결합하거나;

ㆍ ABS2 및 ABS3은 동일한 표적 분자 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합하고 ABS1은 상이한 표적 분자에 결합하거나;

ㆍ ABS1, ABS2, 및 ABS3은 상이한 표적 분자에 결합하거나;

ㆍ ABS1, ABS2, 및 ABS3은 동일한 표적 분자 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합한다.

ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 2개 이상이 표적 분자 상의 동일한 에피토프에 결합할 때, 이러한 ABS는 동일한 또는 상이한 VH 서열 및/또는 VL 서열을 가질 수 있다.

이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 개시내용의 MBM은 모든 3개의 ABS가 결여된 모(parental) 단일특이적 항체 또는 이중특이적 항체보다 더 큰 친화도로 표적 분자(또는 표적 분자를 발현하는 세포)에 결합하는 이점을 갖는 것으로 여겨진다. 이에, 개시내용의 MBM은 일부 구현예에서, 모든 3개의 ABS가 결여된 모 단일특이적 항체 또는 이중특이적 항체, 예를 들어 ABS1의 scFv가 결여된 이중특이적 항체보다 더 큰 친화도로 하나 이상의 표적 분자 및/또는 하나 이상의 표적 분자를 발현하는 세포에 결합할 수 있다. 예를 들어, MBM은 일부 구현예에서, 상응하는 모 단일특이적 항체 또는 이중특이적 항체(예를 들어, 섹션 7에 기재된 바와 같음)보다 표적 분자에의 결합에 대해 더 낮은 KD를 가질 수 있고/거나 세포 기초 결합 검정에서 더 강력한 EC50 값을 가질 수 있다.

주어진 항체 또는 MBM의 작용제 또는 길항제 활성은 표적 선택, 에피토프 적용 범위(coverage) 및 형식 선택에 의존한다. 작용제성 항체 및 길항제성 항체의 식별은 예를 들어, 기능적 기초 스크리닝을 통해 달성될 수 있다. 개시내용의 N-말단 scFv MBM은 전형적으로, scFv 융합 전 모항체 또는 모 이중특이적 항체가 각각 작용제 또는 길항제 활성을 가질 때, 작용제 또는 길항제 활성을 갖는다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 개시내용의 MBM은 예를 들어, 추가 N-말단 scFv 도메인에 의해 부여되는 신규 결합 화학양론으로 인해 전형적인 이중특이적 분자(예를 들어, 2개의 Fab를 함유하지만 N-말단 scFv 도메인이 결여된 모 이중특이적 분자)와 비교하여 증강된 활성(예를 들어 작용제 또는 길항제 활성)을 특징으로 하는 것으로 여겨진다.

6.3.1. KLB - FGFR1c 결합제

개시내용의 MBM은 일부 구현예에서, 인간 KLB에 결합하는 하나 이상의 ABS 및 인간 FGFR1c(예를 들어, 루프 D2 또는 D3)에 결합하는 하나 이상의 ABS를 함유할 수 있다. KLB와 FGFR1c를 둘 다 발현하는 인간 조직은 지방 조직, 유방 조직, 간, 폐, 췌장, 위, 및 고환을 포함한다(도 4a 내지 도 4b 참조). 그러므로, 인간 KLB에 결합하는 하나 이상의 ABS 및 인간 FGFR1c에 결합하는 하나 이상의 ABS를 갖는 개시내용의 MBM은 이들 조직 유형을 우선적으로 표적화할 수 있다. FGF 계열의 구성원인 FGF21은 FGFR1c 및 KLB로 이루어진 수용체 복합체를 통해 신호를 전달하고 따라서 내분비 호르몬으로서 작용한다. 이러한 표적 쌍의 하나의 예시적인 배치에서, ABS1 및 ABS3은 KLB의 상이한 에피토프에 결합하고, ABS2는 FGFR1c에 결합한다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 배치를 갖는 MBM의 결합은 수용체 복합체를 작용화시키고 도 5에 예시된 대사 이익을 이끄는 것으로 여겨진다.

예시적인 항-KLB 항체는 표 2A에 제공되고, 개시내용의 MBM에 사용될 수 있는 예시적인 항-KLB 항체의 VH 서열 및 VL 서열은 표 2B에 제공된다. 개시내용의 MBM은 예를 들어, 표 2A 또는 표 2B에 제공된 임의의 항-KLB 항체의 CDR 또는 VH 및/또는 VL 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 항-FGFR1c 항체는 표 3A에 제공되고, 개시내용의 MBM에 사용될 수 있는 예시적인 항-FGFR1c 항체의 VH 서열 및 VL 서열은 표 3B에 제공된다. 개시내용의 MBM은 예를 들어, 표 3A 또는 표 3B에 제공된 임의의 항-FGFR1c 항체의 CDR 또는 VH 및/또는 VL 서열을 포함할 수 있다.

6.3.2. FGFR3 - APLP2 결합제

개시내용의 MBM은 일부 구현예에서, 인간 FGFR3에 결합하는 하나 이상의 ABS 및 인간 APLP2에 결합하는 하나 이상의 ABS를 함유할 수 있다. FGFR3은 방광암에서 임상적으로 입증된 종양-유발자(onco-driver)이다. APLP2는 신속한 내재화 및 분해를 겪을 수 있는 세포 표면 수용체로서 식별되어 왔다. FGFR3 차단과 APLP2를 통한 FGFR3의 증강된 하향조절을 둘 다 유도하기 위해, 개시내용의 MBM은 인간 FGFR3에 결합하는 하나 이상의 ABS 및 인간 APLP2에 결합하는 하나 이상의 ABS를 가질 수 있다. 이러한 표적 쌍의 하나의 예시적인 배치에서, ABS2 및 ABS3은 FGFR3의 동일한 에피토프에 결합하고, ABS1은 APLP2에 결합한다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 배치를 갖는 MBM의 결합은 FGFR3 수용체 복합체의 차단 및/또는 분해를 이끄는 것으로 여겨진다.

예시적인 항-FGFR3 항체 서열은 표 4에 제공된다. 개시내용의 MBM은 예를 들어, 표 4에 제공된 임의의 항-FGFR3 항체의 CDR 또는 VH 및/또는 VL 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 항-APLP2 항체는 표 5에 제공된다. 개시내용의 MBM은 예를 들어, 표 5에 제공된 임의의 항-APLP2 항체의 CDR 또는 VH 및/또는 VL 서열을 포함할 수 있다.

6.3.3. FGFR3 - CD63 결합제

개시내용의 MBM은 일부 구현예에서, 인간 FGFR3에 결합하는 하나 이상의 ABS 및 인간 CD63에 결합하는 하나 이상의 ABS를 함유할 수 있다. FGFR3은 방광암에서 임상적으로 입증된 종양-유발자이다. CD63은 회합된 파트너의 트래피킹(trafficking)을 조절할 수 있는 도처에서 발현되는 세포-표면 테트라스패닌(tetraspanin)이다. FGFR3 차단과 CD63을 통한 FGFR3의 증강된 하향조절 또는 표면 보유(retention)를 둘 다 유도하기 위해, 개시내용의 MBM은 인간 FGFR3에 결합하는 하나 이상의 ABS 및 인간 CD63에 결합하는 하나 이상의 ABS를 가질 수 있다. 이러한 표적 쌍의 하나의 예시적인 배치에서, ABS2 및 ABS3은 FGFR3의 동일한 에피토프에 결합하고, ABS1은 CD63에 결합한다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 배치를 갖는 MBM의 결합은 FGFR3 수용체 복합체의 차단 및/또는 분해를 이끄는 것으로 여겨진다.

예시적인 항-FGFR3 항체 서열은 상기 표 4에 제공된다. 개시내용의 MBM은 예를 들어, 표 4에 제공된 임의의 항-FGFR3 항체의 CDR 또는 VH 및/또는 VL 서열을 포함할 수 있다. 개시내용의 MBM에 사용될 수 있는 예시적인 항-CD63 항체의 VH 서열 및 VL 서열은 표 6에 제공된다. 개시내용의 MBM은 예를 들어, 표 6에 제공된 임의의 항-CD3 항체의 CDR 또는 VH 및/또는 VL 서열을 포함할 수 있다.

6.4. 항체 약물 접합체

개시내용의 MBM은, 특히 MBM이 암 치료제로서 사용되는 것으로 의도되는 경우, 예를 들어, 링커를 통해 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 이러한 접합체는 본원에서 편의상 항체-약물 접합체(또는 "ADC")로 지칭된다.

소정의 양태에서, 약물 모이어티는 세포독성 또는 세포증식억제(cytostatic) 활성을 발휘한다. 일 구현예에서, 약물 모이어티는 메이탄시노이드(maytansinoid), 키네신-유사 단백질 KIF11 저해제, V-ATPase(액포-유형 H+ -ATPase) 저해제, 세포자멸사유도제(pro-apoptotic agent), Bcl2(B-세포 림프종 2) 저해제, MCL1(골수 세포 백혈병 1) 저해제, HSP90(열 충격 단백질 90) 저해제, IAP(세포자멸사의 저해제) 저해제, mTOR(라파마이신의 기계적 표적) 저해제, 미세소관 안정화제, 미세소관 탈안정화제, 오리스타틴(auristatin), 돌라스타틴(dolastatin), MetAP(메티오닌 아미노펩티다제), CRM1(염색체 유지 1) 저해제, DPPIV(디펩티딜 펩티다제 IV) 저해제, 프로테아솜 저해제, 미토콘드리아에서 포스포릴 이전 반응의 저해제, 단백질 합성 저해제, 키나제 저해제, CDK2(사이클린-의존적 키나제 2) 저해제, CDK9(사이클린-의존적 키나제 9) 저해제, 키네신 저해제, HDAC(히스톤 탈아세틸라제) 저해제, DNA 손상제, DNA 알킬화제, DNA 인터칼레이터(DNA intercalator), DNA 부홈 결합제(DNA minor groove binder), RNA 폴리머라제 저해제, 토포이소머라제(topoisomerase) 저해제, 또는 DHFR(디하이드로폴레이트 리덕타제(di hydrofolate reductase)) 저해제로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 세포독성제는 하기 구조를 갖는 메이탄시노이드이다:

일부 구현예에서, ADC는 개시내용의 MBM을 포함하고,

여기서,

는 MBM에의 결합이다.

일부 구현예에서, 항체-약물 접합체는 개시내용의 MBM을 포함하고,

여기서,

는 MBM에의 결합이다.

일부 구현예에서, ADC는 개시내용의 MBM을 포함하고,

, 또는

, 또는

이들의 혼합물을 포함하고,

여기서,

는 개시내용의 MBM에의 결합이다.

일부 구현예에서, 결합은 시스테인 잔기의 황 구성원을 통해 MBM에 연결된다.

일부 구현예에서, 결합은 리신 잔기의 질소 구성원을 통해 MBM에 연결된다.

개시내용의 ADC에서, 세포독성제 및/또는 세포증식억제제(cytostatic agent)는 ADC 링커에 의해 MBM에 연결된다. 세포독성제 및/또는 세포증식억제제를 ADC의 MBM에 연결하는 ADC 링커는 짧거나, 길거나, 소수성이거나, 친수성이거나, 가요성이거나 강성(rigid)일 수 있거나, 각각 독립적으로, 링커가 상이한 특성을 갖는 분절을 포함할 수 있도록 하나 이상의 상기 언급된 특성을 갖는 분절로 이루어질 수 있다. 링커는, 이러한 링커가 하나 초과의 제제를 MBM 상의 단일 부위에 공유 연결하도록 다가(polyvalent)일 수 있거나, 이러한 링커가 단일 제제를 MBM 상의 단일 부위에 공유 연결하도록 1가일 수 있다.

소정의 양태에서, 링커는 절단 가능한 링커, 비-절단 가능한 링커, 친수성 링커, 프로하전된(procharged) 링커, 또는 디카르복실산 기초 링커로부터 선택된다.

당업자에 의해 이해될 바와 같이, ADC 링커는 하나의 위치에서 세포독성제 및/또는 세포증식억제제에 공유 연결부 및 또 다른 위치에서 MBM에 공유 연결부를 형성함으로써 세포독성제 및/또는 세포증식억제제를 MBM에 연결한다. 공유 연결부는 ADC 링커 상의 작용기와 제제 및 MBM 상의 작용기 사이에서의 반응에 의해 형성된다.

ADC 링커는 바람직하게는, 세포 외부의 조건에 화학적으로 안정하지만 그럴 필요는 없고, 세포 내부에서 절단되고/거나 희생되고(immolate)/거나 그렇지 않으면 특이적으로 분해되도록 설계될 수 있다. 대안적으로, 세포 내부에서 특이적으로 절단되거나 분해되도록 설계되지 않은 ADC 링커가 사용될 수 있다. 안정한 ADC 링커 대 불안정한 ADC 링커의 선택은 세포독성제 및/또는 세포증식억제제의 독성에 의존할 수 있다. 정상적인 세포에 대해 독성인 제제에 대해서는, 안정한 링커가 바람직하다. 선택적이거나 표적화되고 정상 세포에게 더 낮은 독성을 갖는 제제가 이용될 수 있으며, 세포외 환경에 대한 ADC 링커의 화학적 안정성은 덜 중요하다. ADC의 맥락에서 약물을 MBM에 연결하는 데 유용한 광범위하게 다양한 ADC 링커는 당업계에 알려져 있다. 임의의 이들 ADC 링커, 뿐만 아니라 다른 ADC 링커는 세포독성제 및/또는 세포증식억제제를 개시내용의 ADC의 MBM에 연결시키는 데 사용될 수 있다.

많은 세포독성제 및/또는 세포증식억제제를 단일 MBM 분자에 연결하는 데 사용될 수 있는 예시적인 다가(polyvalent) ADC 링커는 예를 들어, 국제공개 WO 2009/073445호; WO 2010/068795호; WO 2010/138719호; WO 2011/120053호; WO 2011/171020호; WO 2013/096901호; WO 2014/008375호; WO 2014/093379호; WO 2014/093394호; WO 2014/093640호에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 예를 들어, Mersana 등에 의해 개발된 Fleximer 링커 기술은 양호한 물리화학적 특성을 갖는 고(high)-DAR ADC를 가능하게 하는 잠재성을 갖는다. Mersana 기술은 에스테르 결합의 서열을 통해 약물 분자를 가용성 폴리-아세탈 백본 내로 혼입하는 것에 기초한다. 방법은 양호한 물리화학적 특성을 유지시키는 한편 고도로-로딩된 ADC(20까지의 DAR)를 제공한다.

사용될 수 있는 예시적인 1가 ADC 링커는 예를 들어, 문헌[Nolting, 2013, Antibody-Drug Conjugates, Methods in Molecular Biology 1045:71-100]; 문헌[Ducry 등, 2010, Bioconjugate Chem. 21:5-13]; 문헌[Zhao 등, 2011, J. Med. Chem. 54:3606-3623]; 미국 특허 제7,223,837호; 미국 특허 제8,568,728호; 미국 특허 제8,535,678호; 및 국제공개 WO 2004010957호에 기재되어 있으며, 이들은 각각 본원에 참조로서 포함된다.

예로서 그리고 제한 없이, 개시내용의 ADC에 포함될 수 있는 일부 절단 가능한 ADC 링커 및 비절단 가능한 ADC 링커는 아래 기재되어 있다.

소정의 구현예에서, 선택되는 ADC 링커는 생체내에서 절단 가능하다. 절단 가능한 ADC 링커는 화학적으로 또는 효소적으로 불안정한 또는 분해 가능한 연결부를 포함할 수 있다. 절단 가능한 ADC 링커는 일반적으로, 세포 내부에서 약물을 유리시키는 과정, 예컨대 세포질에서의 감소, 리소좀에서 산성 조건에의 노출, 또는 세포 내에서 특정 프로테아제 또는 다른 효소에 의한 절단에 의존한다. 절단 가능한 ADC 링커는 일반적으로, ADC 링커의 나머지가 비절단 가능한 한편, 화학적으로 또는 효소적으로 절단 가능한 하나 이상의 화학적 결합을 혼입한다. 소정의 구현예에서, ADC 링커는 화학적으로 불안정한 이변적(labile) 기, 예컨대 하이드라존 및/또는 이황화 기를 포함한다. 화학적으로 이변적인 기를 포함하는 링커는 혈장과 일부 세포질 구획 사이에서 차별적인 특성을 이용한다. ADC 링커를 함유하는 하이드라존에 대한 약물 방출을 용이하게 하는 세포내 조건은 엔도솜 및 리소좀의 산성 조건인 한편, ADC 링커를 함유하는 디설파이드는 세포기질에서 환원되며, 이는 높은 티올 농도, 예를 들어, 글루타티온을 함유한다. 소정의 구현예에서, 화학적으로 이변적인 기를 포함하는 ADC 링커의 혈장 안정성은 화학적으로 이변적인 기 주변에서 치환기를 사용하여 입체 장해(steric hindrance)를 도입함으로써 증가될 수 있다.

절단 가능한 ADC 링커는 비절단 가능한 부분 또는 분절을 포함할 수 있고/거나 절단 가능한 분절 또는 부분은 그렇지 않으면 비-절단 가능한 ADC 링커에 포함되어 이를 절단 가능하게 만들 수 있다. 단지 예로서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 관련 중합체는 중합체 백본에 절단 가능한 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 중합체 ADC 링커는 하나 이상의 절단 가능한 기, 예컨대 이황화, 하이드라존 또는 디펩타이드를 포함할 수 있다.

ADC 링커에 포함될 수 있는 다른 분해 가능한 연결부는, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산과 생물학적 활성제 상의 알코올기의 반응에 의해 형성되는 에스테르 연결부를 포함하며, 여기서 이러한 에스테르기는 일반적으로 생리학적 조건 하에 가수분해되어 생물학적 활성제를 방출시킨다. 가수분해적으로 분해 가능한 연결부는 탄수화물 연결부; 아민과 알데하이드의 반응으로부터 비롯되는 이민 연결부; 알코올을 포스페이트기와 반응시킴으로써 형성되는 포스페이트 에스테르 연결부; 알데하이드와 알코올의 반응 생성물인 아세탈 연결부; 포르메이트와 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 연결부; 및 중합체의 단부를 포함하지만 이로 제한되지 않는 포스포라미다이트기(phosphoramidite group) 및 올리고뉴클레오타이드의 5' 하이드록실기에 의해 형성되는 올리고뉴클레오타이드 연결부를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.

소정의 구현예에서, ADC 링커는 효소적으로 절단 가능한 펩타이드 모이어티, 예를 들어 트리펩타이드 또는 디펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 디펩타이드는 Val-Cit; Cit-Val; Ala-Ala; Ala-Cit; Cit-Ala; Asn-Cit; Cit-Asn; Cit-Cit; Val-Glu; Glu-Val; Ser-Cit; Cit-Ser; Lys-Cit; Cit-Lys; Asp-Cit; Cit-Asp; Ala-Val; Val-Ala; Phe-Lys; Val-Lys; Ala-Lys; Phe-Cit; Leu-Cit; lle-Cit; Phe-Arg; 및 Trp-Cit로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, 디펩타이드는 Cit-Val; 및 Ala-Val으로부터 선택된다.

상기 또는 본원에서 논의된 ADC의 임의의 다양한 구현예에서, ADC는 1 내지 20, 더 전형적으로 2 내지 10의 범위의 약물:항체 비(또는 이러한 경우 약물:MBM 비)를 가질 수 있다.

6.5. 핵산 및 숙주 세포

또 다른 양태에서, 개시내용은 개시내용의 MBM을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, MBM은 단일 핵산에 의해 인코딩된다. 다른 구현예에서, MBM은 복수의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) 핵산에 의해 인코딩된다.

단일 핵산은, 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 MBM, 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 MBM, 또는 2개 초과의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 MBM의 부분을 인코딩할 수 있다(예를 들어, 단일 핵산은 3개, 4개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 MBM의 2개의 폴리펩타이드 사슬, 또는 4개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 MBM의 3개의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩할 수 있음). 발현의 별도의 제어를 위해, 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 개방 리딩 프레임은 별도의 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)의 제어 하에 있을 수 있다. 2개 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 개방 리딩 프레임은 또한, 별도의 폴리펩타이드로의 번역을 가능하게 하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site) 서열에 의해 분리되는, 동일한 전사 조절 요소에 의해 제어될 수 있다.

일부 구현예에서, 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 MBM은 2개 이상의 핵산에 의해 인코딩된다. MBM을 인코딩하는 핵산의 수는 MBM 내의 폴리펩타이드 사슬의 수와 동일하거나 그보다 적을 수 있다(예를 들어, 하나 초과의 폴리펩타이드 사슬이 단일 핵산에 의해 인코딩될 때).

개시내용의 핵산은 DNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA)일 수 있다.

또 다른 양태에서, 개시내용은 개시내용의 핵산을 함유하는 숙주 세포 및 벡터를 제공한다. 핵산은 본원 아래에서 더 상세히 기재되는 바와 같이, 동일한 숙주 세포 또는 별개의 숙주 세포에 존재하는 단일 벡터 또는 별개의 벡터에 존재할 수 있다.

6.5.1. 벡터

개시내용은 본원에 기재된 MBM 또는 MBM 성분, 예를 들어 반항체의 폴리펩타이드 사슬 중 1개 또는 2개를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 바이러스, 플라스미드, 코스미드, 람다 파지 또는 효모 인공 염색체(YAC: yeast artificial chromosome)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.

수많은 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 부류의 벡터는, 예를 들어, 소 유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스, 백시나 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스(라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus), MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래되는 DNA 요소를 이용한다. 또 다른 부류의 벡터는 RNA 바이러스, 예컨대 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest virus), 동부 말 뇌염 바이러스(Eastern Equine Encephalitis virus) 및 플라비바이러스(Flavivirus)로부터 유래되는 RNA 요소를 이용한다.

추가로, DNA를 세포의 염색체 내로 안정하게 통합시킨 세포는, 형질주입된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 예를 들어, 영양요구성(auxotrophic) 숙주에 대한 양성자이전(prototropy), 살생물제 내성(예를 들어, 항생제), 또는 중금속, 예컨대 구리에 대한 내성 등을 제공할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결되거나, 공동-형질전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. 추가 요소가 또한, mRNA의 최적 합성에 필요할 수 있다. 이들 요소는 스플라이스 신호, 뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서, 및 종결 신호를 포함할 수 있다.

일단, 작제물을 함유하는 발현 벡터 또는 DNA 서열이 발현을 위해 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 형질주입되거나 도입될 수 있다. 이를 달성하기 위해 예를 들어, 원형질체 융합(protoplast fusion), 칼슘 포스페이트 침전, 전기천공, 레트로바이러스 형질도입, 바이러스 형질주입, 유전자 총(gene gun), 지질 기초 형질주입, 또는 다른 종래의 기법과 같은 다양한 기법이 이용될 수 있다. 생성된 형질주입된 세포를 배양하고 발현된 폴리펩타이드를 회수하기 위한 방법 및 조건은 당업자에게 알려져 있고, 본 명세서에 기초하여 이용되는 특정 발현 벡터 및 포유류 숙주 세포에 따라 다양화되거나 최적화될 수 있다.

6.5.2. 세포

개시내용은 또한, 개시내용의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

일 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 하나 이상의 핵산을 포함하도록 유전적으로 조작된다.

일 구현예에서, 숙주 세포는 발현 카세트를 사용하여 유전적으로 조작된다. 어구 "발현 카세트"는 뉴클레오타이드 서열과 융화성(compatible)인 숙주에서 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 이러한 서열을 지칭한다. 이러한 카세트는 프로모터, 인트론과 함께 또는 없이 개방 리딩 프레임, 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유도적 프로모터와 같이 발현에 영향을 미치는 데 필요하거나 유용한 추가 인자가 또한 사용될 수 있다.

개시내용은 또한, 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

세포는 진핵 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 또는 인간 세포일 수 있으나 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 진핵 세포는 Vero 세포, HeLa 세포, COS 세포, CHO 세포, HEK293 세포, BHK 세포, 및 MDCKII 세포를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 곤충 세포는 Sf9 세포를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.

6.6. 약학적 조성물

개시내용의 MBM 및/또는 ADC는 MBM 및/또는 ADC 및 하나 이상의 담체, 부형제, 및/또는 희석제를 포함하는 조성물의 형태로 존재할 수 있다. 조성물은 특정 용도를 위해, 예컨대 수의학 용도 또는 인간에서의 약학적 용도를 위해 제형화될 수 있다. 조성물의 형태(예를 들어, 건조 분말, 액체 제형 등) 및 사용되는 부형제, 희석제, 및/또는 담체는 MBM 및/또는 ADC의 의도된 용도에, 그리고 치료적 용도의 경우 투여 모드에 의존할 것이다.

치료적 용도를 위해, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 멸균 약학적 조성물의 파트로서 공급될 수 있다. 이러한 조성물은 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다(상기 조성물을 환자에게 투여하는 요망되는 방법에 따라). 약학적 조성물은 여러 가지 경로에 의해, 예컨대 경구로, 경피로, 피하로, 비강내로, 정맥내로, 근육내로, 종양내로, 수막공간내로(intrathecally), 국소로(topically), 또는 국재로(locally) 환자에게 투여될 수 있다. 임의의 주어진 사례에서 투여에 가장 적합한 경로는 특정 항체 및/또는 ADC, 대상체, 및 질환의 성질과 중증도 및 대상체의 신체 조건에 의존할 것이다. 전형적으로, 약학적 조성물은 정맥내로 또는 피하로 투여될 것이다.

약학적 조성물은 편리하게는 용량당 예정된 양의 개시내용의 MBM 및/또는 ADC를 함유하는 단위 투약 형태로 제시될 수 있다. 단위 용량에 포함되는 MBM 및/또는 ADC의 양은 치료되는 질환, 뿐만 아니라 당업계에 잘 알려진 바와 같은 다른 인자에 의존할 것이다. 이러한 단위 투약량은 단일 투여에 적합한 양의 MBM 및/또는 ADC를 함유하는 동결건조된 건조 분말의 형태로 또는 액체의 형태로 존재할 수 있다. 건조 분말 단위 투약 형태는 주사기, 적합한 양의 희석제 및/또는 투여에 유용한 다른 성분을 갖는 키트에서 포장될 수 있다. 액체 형태의 단위 투약량은 편리하게는, 단일 투여에 적합한 양의 MBM 및/또는 ADC로 예비-충전된 주사기의 형태로 공급될 수 있다.

약학적 조성물은 또한, 다수의 투여에 적합한 양의 ADC를 함유하는 벌크로 공급될 수 있다.

약학적 조성물은 저장을 위해, 요망되는 순도를 갖는 MBM 및/또는 ADC를 당업계에서 전형적으로 이용되는 선택적인 약학적으로-허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(이들은 모두 본원에서 "담체"로 지칭됨), 즉, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장성제, 비-이온성 세제, 항산화제, 및 다른 여러 가지 첨가제와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액으로서 제조될 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)]을 참조한다. 이러한 첨가제는 이용되는 투약량 및 농도에서 수혜자에게 무독성이어야 한다.

완충제는 생리학적 조건과 근사한 범위에서 pH를 유지시키는 데 도움을 준다. 이들은 광범위하게 다양한 농도에서 존재할 수 있으나, 전형적으로 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재할 것이다. 본 개시내용으로 사용하기에 적합한 완충제는 유기산과 무기산 둘 다 및 이들의 염, 예컨대 시트레이트 완충액(예를 들어, 모노소듐 시트레이트-디소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노소듐 시트레이트 혼합물 등), 숙시네이트 완충액(예를 들어, 숙신산-모노소듐 숙시네이트 혼합물, 숙신산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 숙신산-디소듐 숙시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충액(예를 들어, 타르트산-소듐 타르트레이트 혼합물, 타르트산-포타슘 타르트레이트 혼합물, 타르트산-소듐 하이드록사이드 혼합물 등), 푸마레이트 완충액(예를 들어, 푸마르산-모노소듐 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디소듐 푸마레이트 혼합물, 모노소듐 푸마레이트-디소듐 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충액(예를 들어, 글루콘산-소듐 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 글루콘산-포타슘 글리우코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충액(예를 들어, 옥살산-소듐 옥살레이트 혼합물, 옥살산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 옥살산-포타슘 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충액(예를 들어, 락트산-소듐 락테이트 혼합물, 락트산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 락트산-포타슘 락테이트 혼합물 등) ,및 아세테이트 완충액(예를 들어, 아세트산-소듐 아세테이트 혼합물, 아세트산-소듐 하이드록사이드 혼합물 등)을 포함한다. 추가로, 포스페이트 완충액, 히스티딘 완충액 및 트리메틸아민 염, 예컨대 Tris가 사용될 수 있다.

보존제는 미생물 성장을 지체시키기 위해 첨가될 수 있고, 약 0.2% (w/v) 내지 1% (w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 본 개시내용으로 사용되기에 적합한 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀, 및 3-펜타놀을 포함한다. 이따금 "안정화제"로도 알려진 등장성제는 본 개시내용의 액체 조성물의 등장성을 보장하기 위해 첨가될 수 있고, 다수산기(polyhydric) 당 알코올, 예를 들어 3수산기(trihydric) 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및 만니톨을 포함한다. 안정화제는, 기능이 벌킹제로부터 첨가제까지일 수 있는 넓은 범주의 부형제를 지칭하며, 이는 치료제를 용해시키거나 용기 벽에의 변성 또는 접착을 방지하는 것을 돕는다. 전형적인 안정화제는 다수산기(polyhydric) 당 알코올(상기 열거됨); 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파리긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당 또는 당 알코올, 예컨대 시클리톨(cyclitol), 예컨대 이노시톨을 포함하여 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이노시톨(myoinisitol), 갈락티톨(galactitol), 글리세롤 등; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황 함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥트산(thioctic acid), 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, a-모노티오글리세롤 및 소듐 티오설페이트; 저분자량 폴리펩타이드(예를 들어, 10개 이하의 잔기의 펩타이드); 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 하이드로필릭(hydrophylic) 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈 단당류, 예컨대 자일로스, 만노스, 프룩토스, 포도당; 이당류, 예컨대 락토스, 말토스, 수크로스 및 트레할로스; 및 삼당류, 예컨대 라피노스; 및 다당류, 예컨대 덱스트란일 수 있다. 안정화제는 ADC의 중량당 0.5 내지 10 중량% 범위의 양으로 존재할 수 있다.

비-이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 알려져 있음)는 당단백질을 용해시키는 것을 돕기 위해, 뿐만 아니라 진탕-유도 응집에 대해 당단백질을 보호하기 위해 첨가될 수 있으며, 이는 또한 단백질의 변성을 야기하지 않으면서 응력을 받은(stressed) 전단 표면(shear surface)에 제형이 노출되는 것을 허용한다. 적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 및 플루로닉 폴리올을 포함한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 예를 들어 약 0.07 mg/mL 내지 약 0.2 mg/mL의 범위로 존재할 수 있다.

추가의 여러 가지 부형제는 벌킹제(bulking agent)(예를 들어, 전분), 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 및 공용매를 포함한다.

6.7. 치료 적응증

개시내용의 MBM, ADC, 및 약학적 조성물은 암, 예를 들어 ABS1, ABS2, 및 ABS3이 결합하는 표적 분자의 발현과 관련된 암을 치료하는 데 사용될 수 있다.

그러므로, 일 양태에서, 개시내용은 암을 치료하는 방법을 제공하며, 암을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 개시내용의 MBM, 접합체, 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, FGFR3에 결합하고, 선택적으로 CD63에 결합하거나 APLP2에 결합하는 개시내용의 MBM은 방광암, 교모세포종(glioblastoma), 및 평평 세포 폐암종(squamous cell lung carcinoma)을 치료하는 데 사용될 수 있다.

개시내용의 MBM, ADC, 및 약학적 조성물은 또한, 비(非)-암 적응증에 대해, 예를 들어, 비알코올성 지방간염("NASH: nonalcoholic steatohepatitis")을 치료하기 위해, 대사 질환을 치료하기 위해, 순환형 HDL 콜레스테롤을 감소시키기 위해, 순환형 LDL 콜레스테롤을 증가시키기 위해, 혈액 트리글리세라이드를 감소시키기 위해, 혈액 포도당을 감소시키기 위해, 비만을 치료하기 위해, 그리고 당뇨병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 비-암 적응증에 대해, 일부 구현예에서 MBM은 KLB 및/또는 FGFR1c를 표적화한다.

그러므로, 일 양태에서, 개시내용은 순환형 HDL 콜레스테롤을 감소시키는 방법을 제공하며, 상승된 HDL 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 개시내용의 MBM, 접합체, 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 개시내용은 순환형 LDL 콜레스테롤을 증가시키는 방법을 제공하며, 낮은 LDL 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 개시내용의 MBM, 접합체, 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 개시내용은 혈액 트리글리세라이드를 감소시키는 방법을 제공하며, 상승된 트리글리세라이드 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 개시내용의 MBM, 접합체, 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 개시내용은 혈액 포도당을 감소시키는 방법을 제공하며, 상승된 포도당 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 개시내용의 MBM, 접합체, 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 개시내용은 비만을 치료하는 방법을 제공하며, 비만을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 개시내용의 MBM, 접합체, 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 개시내용은 당뇨병을 치료하는 방법을 제공하며, 당뇨병을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 개시내용의 MBM, 접합체, 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

7. 실시예

7.1. 실시예 1: FGFR1c x KLB x KLB 2+1 N-scFv MBM

7.1.1. 재료 및 방법

7.1.1.1. MBM의 생산

KLB 에피토프 1(ep1) 또는 에피토프 2(ep2)에 결합하는 다양한 KLB scFv를, FGFR1c과 KLB를 둘 다 표적화하는 기존의 IgG-유사 이중특이적 분자, REGN4366으로부터의 FGFR1c VH 도메인의 N-말단에 융합시켰다(도 1 및 표 7).

(i) VL(100C 돌연변이를 가짐, 카바트 숫자매김), 링커(4xG₄S(SEQ ID NO: 57)), 및 VH(44C 돌연변이를 가짐, 카바트 숫자매김)의 배향에서 다양한 KLB scFv, 뒤이어 scFv를 FGFR1c 결합 Fab에 연결하는 다양한 길이의 링커, (ii) FGFR1c 결합 Fab, 및 (iii) 노브-형성 돌연변이(S354C, T366W, EU 숫자매김), 홀-형성 돌연변이(Y349C, T366S, L368A, Y407V, EU 숫자매김) 및 스타 돌연변이(H435R, Y436F, EU 숫자매김)를 갖는 IgG1 Fc 도메인을 인코딩하는 DNA 단편을 Integrated DNA Technologies, Inc.(San Diego, California) 또는 GenScript(Piscataway, NJ)에 의해 합성하였다.

NEBuilder HiFi DNA 조립 키트(New England BioLabs Inc.) 또는 제한효소 분해, 뒤이어 New England BioLabs Inc.에 의해 제공된 표준 분자 클로닝 프로토콜에 따른 리게이션(ligation)에 의해 개별 중쇄에 대한 포유류 발현 벡터를 생성하였다. FGFR1c/KLB/KLB 2+1 N-scFv MBM(F1K-scFv1-9)의 발현을 위해, 중쇄("Hc1-노브" 및 "Hc2-홀*") 및 유니버셜 경쇄 DNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 Expi293 세포(ThermoFisher Scientific) 내로 공동-형질주입하였다. 50 ml의 세포 배양 배지를 수확하고, HiTrap Protein A FF 컬럼(GE Healthcare)을 통한 정제를 위해 가공하였다. 기능적 확인을 위해, 선택된 MBM을 최대 200 ml로 규모확장시키고, 최종 단계로서 크기 배제 크로마토그래피를 포함한 일련의 정제 절차를 받게 하였다. KLB에 결합하는 Fab 및 FGFR1c에 결합하는 Fab를 갖는 REGN4366을 만들고, IgG-유사 이중특이적 대조군 분자로서 역할을 하도록 정제하였다.

7.1.1.2. HEK293.SREluc.hFGFR1cHS/ hKLB 리포터 기초 검정

혈청 반응 요소(SRE: serum responsive element)를 함유하는 프로모터의 제어 하에 인간 FGFR1c 및 KLB, 뿐만 아니라 루시퍼라제를 안정하게 발현한 HEK293.SREluc.hFGFR1cHS / hKLB 세포를 사용하여, MBM을 이의 작용제 활성에 대해 시험하였다. 6xHis 태그를 갖는 재조합 인간 FGF21(SEQ ID NO: 58)을 양성 대조군으로서 사용하였으며, 이때 FGF21로부터 수득된 최대 리포터 활성을 100% 활성으로 정의하였다. 세포를 각각의 MBM 또는 6xHis-FGF21로 6시간 동안 처리한 다음, 루시퍼라제 검정을 받게 하였다. 개별 MBM에 의해 유도된 활성 백분율을 FGF21에 의한 최대 활성에 대해 정규화하였다. 용량-반응 검정을 수행하여, EC50을 결정하였다.

7.1.1.3. hFGFR1c 및 hKLB 결합에 대한 Biacore 분석

F1K-scFv6에 대한 결합 작용의 친화도 및 기전을 Biacore 분석에 의해 결정하였다. KLB에 대한 F1K-scFv6의 명백한(apparent) 친화도를 모 KLB mAb의 1가 친화도와 비교하기 위해, 항체 포착 형식을 사용하였다. 간략하게는, FGFR1c 모 mAb 19842, KLB 모 mAb 22532P2와 22393P2, FGFR1c/KLB 모 이중특이적 항체 REGN4366 및 F1K-scFv6을 항-인간 Fc 항체(REGN2567)와 함께 CM5 칩 상에 고정시켰다. 상이한 농도의 hFGFR1c_V5_6xHis(800-12.5 nM, 4-배 희석) 또는 hKLB.HA.6xHis(100-1.56 nM, 4-배 희석)를 50 μL/분으로 2분 동안 주사하고, 검정을 25℃에서 수행하였다. 결합 동역학 파라미터를, Scrubber 2.0c를 사용하는 1:1 결합 모델을 사용하여 실시간 데이터를 맞춤(fitting)으로써 측정하였다.

7.1.1.4. 유세포분석에 의한 세포 기초 결합

HEK293/Cas9-hFGFR1/hKLB(KLB⁺), HEK293/hFGFR1c(hFGFR1c⁺) 및 HEK293/hFGFR1c/hKLB(hFGFR1c⁺/hKLB⁺) 세포를 완전 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배지(10% 우태혈청(FBS), 1x 펜스트렙(penstrep)-글루타민)에 1×10⁶개 세포/mL로 재현탁시키고, 염색을 1 ×10⁵개 세포에서 수행하였다. MBM을 첨가하고, 세포를 2-8℃에서 30분 동안 염색시켰다. 세포를 FACS 세척 완충액(1% FBS 및 1 mM EDTA를 포함하는 인산염-완충 식염수(PBS))로 2회 세척하고, 4℃, 1800 RPM에서 4분 동안 원심분리하였다. 알로피코시아닌-접합 염소 항-인간 IgG(Jackson Immuno Research, 109-136-098, 1:400)를 첨가하고, 2-8℃에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 이전과 같이 세척하고, 100 μL의 2% 파라포름알데하이드에 재현탁시켰다. 세포를 2℃ 내지 8℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 2회 세척하였다. 염색된 세포를, BD LSRFortessa^TM FACS 기기를 사용하여 분석하였다.

7.1.2. 결과

7.1.2.1. FGFR1c/KLB/KLB 2+1 N-scFv MBM의 생산

표 7에 제시된 특질을 갖는 9개의 FGFR1c/KLB/KLB 2+1 N-scFv MBM을 발현시키고 정제하였다.

7.1.2.2. FGFR1c/KLB/KLB 2+1 N-scFv 삼중특이적 분자의 에피토프-의존적 활성

정제된 FGFR1c/KLB/KLB 2+1 N-scFv MBM의 작용제 활성을 분석하기 위해 HEK293.SREluc.hFGFR1cHS/hKLB를 사용한 세포 기초 리포터 검정의 결과를 표 8에 제시한다. F1K_scFv3, F1K_scFv6 및 F1K_scFv9는 활성 %에 기초하여 상위 활성물질인 것으로 밝혀졌다. 이들은 모두 KLB ep2 영역에 결합하는 동일한 KLB 표적화 scFv를 공유하고, 상기 검정에서 원래의 KLB Fab와 동일한 KLB ep1 영역을 표적화하는 scFv를 갖는 MBM보다 유의하게 더 활성이었다. 주목할 만하게는, 30개 아미노산 길이의 scFv-Fab 링커를 갖는 F1K_scFv6은 54.1%에서 최고의 활성 및 최상의 약효를 갖는 것으로 관찰되었다(EC50 = 9.80E-10 M).

7.1.2.3. 2+1 N-scFv 삼중특이적 F1K-scFv6은 동일한 KLB 상의 2개의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있다

F1K-scFv6 상에서의 Biacore 분석의 결과를 표 9A 내지 표 9B에 제시한다. F1K-scFv6은 hKLB에 대해 1.47E-11 M의 K_D를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이는 모 KLB mAb 22532P2 및 22393P2와 비교하여 친화도에서 각각 55-배 및 1,333-배의 증가를 나타낸다. hKLB에 대한 증강된 친화도는 또한, F1K-scFv6을 REGN4366(hKLB에 대해 22393P2 아암(arm)을 가짐)과 비교하였을 때 관찰되었다. 이러한 관찰은, KLB에 대한 별도의 에피토프-표적화 아암을 소유하는 F1K-scFv6이 동일한 hKLB 분자 상의 결합 부위 둘 다에 동시에 관여할 수 있다는 결론을 강하게 지지한다. hFGFR1c 결합에 대해, F1K-scFv6은 이의 모 FGFR1c mAb 19842 또는 모 이중특이적 항체 REGN4366(hFGFR1c에 대해 19842 아암을 가짐)과 비교하여 hFGFR1c에 대한 친화도에서 약간의 저하(4-배)를 갖는다.

7.1.2.4. 2+1 N-scFv 삼중특이적 F1K-scFv6은 hKLB 및 hFGFR1c/hKLB를 과발현하는 세포에 더 밀착해서 결합한다

세포 기초 설정에서 hKLB에 대한 F1K-scFv6의 증강된 친화도의 관련성을 추가로 확인하기 위해, FACS 결합 검정을 사용하여, 삼중특이적 F1K-scFv6(FGFR1c/KLB/KLB)의 결합을 이중특이적 항체 REGN4366(FGFR1c/KLB 22393 아암)과 REGN6799(FGFR1c/KLB 22532 아암), 모 항체 22393 IgG(KLB), 22532 IgG(KLB), 및 19842 IgG(FGFR1c)와 비교하였다. HEK293/Cas9-hFGFR1/hKLB(hFGFR1 넉아웃 및 hKLB 과발현) 세포와 HEK293/hFGFR1c/hKLB(hFGFR1c 및 hKLB 과발현) 세포 둘 다에서, F1K-scFv6은 결합에서 모든 다른 대조군보다 더 강력한 EC50을 일관되게 실증하였다(도 6a 및 도 6c). HEK293/hFGFR1c 세포에서, hFGFR1c에 대한 2가성(bivalency)을 갖고 있어서, 19842 IgG가 가장 강한 결합을 갖고, 뒤이어 REGN4366 및 F1K-scFv6이 강한 결합을 갖는 것으로 관찰되었다(도 6b). FACS 결합 데이터는 Biacore 분석과 양호하게 일치한다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이 실시예의 데이터는, 2+1 N-scFv 삼중특이적 설계를 통한 hKLB의 이중-에피토프(bi-epitopic) 관여가 항체-매개 KLB/FGFR1c 수용체 복합체 상호작용 및 잠재적인 세포 표면 클러스터링을 향상시킴을 보여주는 것으로 여겨진다.

7.1.2.5. 2+1 N-scFv MBM F1K-scFv6은 이중특이적 REGN4366보다 우수한 작용제 활성을 갖는다

F1K-scFv6의 증강된 친화도가 이중특이적 REGN4366을 능가하는 향상된 효능으로 해석될 수 있는지 평가하기 위해, HEK293.SREluc.hFGFR1cHS/hKLB를 사용한 시험관내 리포터-기초 세포 검정을 수행하였다. F1K-scFv6과 REGN4366을 둘 다 최종 단계로서 크기 배제 크로마토그래피, 뒤이어 친화도 정제를 통해 정제하여, 데이터의 해석을 혼동시킬 만한 임의의 응집을 제거하였다. 가용성 FGF21에 대해 정규화될 때 단지 19%의 활성화를 가진 모 이중특이적 항체 REGN4366과 비교하여, F1K-scFv6은 루시퍼라제 유전자 발현의 약효(EC50)를 4-5배만큼 증강시켰을 뿐만 아니라, 활성화 %를 77%까지 유의하게 부스팅하였다(도 8).

2+1 C-scFv라고 하는, 동일한 22532P2 scFv를 사용하지만 Fc의 C-말단에 융합된 유사한 3가 분자를 또한 만들고 평가하였다. 이러한 상응하는 삼중특이적 분자는 F1K-scFv6보다 훨씬 더 불량한 발현 및 정제 수율과 열등한 기능적 활성을 가졌다(결과는 제시되지 않음).

7.2. 실시예 2: 삼중특이적 활성에 미치는 링커 길이의 평가

7.2.1. 재료 및 방법

HEK293 세포를 SRE-루시퍼라제 리포터, 전장 인간 FGFR1c, 및 전장 인간 KLB 플라스미드로 순차적으로 형질주입함으로써 HEK293.SREluc.hFGFR1c.hKLB 안정한 세포주를 생산하였다.

대조군 이중특이적 분자와 마찬가지로, scFv6으로 지칭되는 삼중특이적 분자의 링커 길이 변이체를 생산하고 루시퍼라제 리포터 검정에서 시험하였다. 링커 변이체는 scFv6 LK7: G₄S GG(SEQ ID NO: 63), scFv6 LK15: 3xG₄S(SEQ ID NO: 1), scFv6 LK22: 4xG₄S GG(SEQ ID NO: 64), scFv6: 6xG₄S(SEQ ID NO: 59), scFv6 LK37: 7xG₄S GG(SEQ ID NO: 65), 및 scFv6 LK45: 9xG₄S(SEQ ID NO: 60)로 지칭된다.

세포를 384-웰 플레이트에 평판배양하고, 10% 우태혈청(FBS)을 함유하는 완전 배지에서 밤새 배양하였다. 배양 배지를 0.1% FBS가 보충된 Opti-MEM 환원 혈청 배지(ThermoFisher, USA)로 교환하였다. 대략 24시간 이후에, 세포를 일련으로 희석된 리간드로 6시간 동안 처리한 다음, ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(Promega, USA)을 제조업체의 설명에 따라 사용하여 루시퍼라제 검정을 받게 하였다.

7.2.2. 결과

하나의 연구에서, REGN4304 및 REGN4366으로 지칭되는 이중특이적 결합 분자(BBM)의 작용제 활성을 hFGF21과 비교하였다. 이러한 검정에서, BBM은 hFGF21의 작용제 활성의 대략 30%를 보여주었다(도 7).

또 다른 연구에서, 링커 길이 변이체(도 9에서 2 및 3으로 표기된 도메인 사이의 펩타이드 링커)의 작용제 활성을 REGN4304로 지칭되는 BBM 및 FGF21과 비교하였다. 결과를 도 9 및 아래 표 10에 제시한다:

모든 링커 길이 변이체는 대조군 이중특이적 결합 분자의 활성의 적어도 대략 2x를 보여주었으며, 가장 짧은 링커 길이(7개 또는 15개 아미노산)를 갖는 변이체는 가장 큰 작용제 활성을 보여주었다.

7.3. 실시예 3: HEK293 세포에서 FGFR1c 신호전달의 활성화

7.3.1. 재료 및 방법

HEK293.SREluc.hFGFR1c.hKLB 안정한 세포주를 실시예 3에 기재된 바와 같이 생산하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, HEK293.SREluc.hFGFR1c.hKLB 세포를 6-웰 플레이트에 평판배양하고, 10% 우태혈청(FBS)을 함유하는 완전 배지에서 밤새 배양하였다. 배양 배지를 0.1% FBS가 보충된 Opti-MEM 환원 혈청 배지(ThermoFisher, USA)로 교환하였다. 대략 24시간 이후에, 희석된 리간드를 세포에 최종 1 nM 또는 10 nM 농도로 첨가하였다. 15분의 처리 후, 세포를 저온 PBS로 세척한 다음, RIPA 용해 완충액(150 mM Tris/HCl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 1% NP-40 및 0.1% Tween 20)에서 용해시켰다. 전체 세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF 막 상으로 이전시켰다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 하기 1차 항체를 사용하였다: 전체 ERK(Cell Signaling, 9102), 포스포-ERK(Cell Signaling, 9101), PLC-감마(Cell Signaling, 5690), 포스포-PLC감마(Cell Signaling, 2821).

7.3.2. 결과

이중특이적 결합 분자 및 삼중특이적 결합 분자의 작용제 활성을, 인간 FGFR1c 및 인간 KLB를 안정하게 발현하는 HEK293.SREluc.hFGFR1c.hKLB 세포에서 음성 대조군으로서 무관한(irrelevant) 항체 REGN1945 및 양성 대조군으로서 FGF21(REGN1438)과 함께 시험하였다. 처리 후, 활성화된 FGFR1c에 의해 유도되는 ERK 및 PLC-감마 인산화를 루시퍼라제 활성과 같이 측정하였다.

F1K_scFv6LK7과 F1K_scFv6L1은 둘 다 1 nM 농도와 10 nM 농도 둘 다에서 ERK 및 PLC-감마 인산화를 강하게 유도하였다. 주목할 만하게는, F1K_scFv6 또는 F1K_scFv6LK7 처리된 세포에서 포스포-ERK 및 포스포-PLC-감마 수준은 상응하는 농도의 모 이중특이적 항체(REGN4366), FGFR1/KLB 작용제 이중특이적 항체(REGN4304), 또는 재조합 인간 FGF21(REGN1438)로 처리된 세포에서의 수준보다 두드러지게 더 높았다(도 10a).

FGFR1c 활성화의 시간 경과를 평가하기 위해, HEK293.SREluc.hFGFR1c.hKLB 세포를 리간드로 다양한 시간 동안 처리하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 수확하였다. 결과를 도 10b에 도시한다. 포스포-ERK 수준에 의해 측정되는 ERK 활성화는 REGN1438, REGN4304, 또는 F1K_scFv6의 처리 후 15분째에 관찰되었고, 이는 최대 6시간 동안 지속되었다. F1K_scFv6은 처리의 시간 경과 전반에 걸쳐 REGN1438 또는 REGN4304와 비교하여 더 높은 포스포-ERK 수준을 보여주었다. F1K_scFv6은 15분 시점에서 포스포-PLC감마를 강하게 유도하였으며, 이는 그 후에 시간 경과에 따라 점차 저하되었다.

7.4. 실시예 4: 다각도 레이저 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALLS)에 의한 KLB, FGFR1c와 결합 분자 사이에서 형성된 시험관내 복합체의 크기 분석

7.4.1. 개요

원칙적으로, 개시내용의 삼중특이적 결합 분자는 FGFR1c 및 KLB와 상이한 유형의 복합체를 형성할 수 있다. 형성된 복합체의 유형을 결정하기 위해, 2+1 N-scFv 및 2+1 N-Fab 삼중특이적 결합 분자 사이에서 형성된 시험관내 복합체의 크기 분석을 다각도 레이저 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)를 사용하여 수행하였다. A4F-MALLS를 또한 사용하여, 대조군 이중특이적 결합 분자(REGN4304) 및 단일특이적 KLB 결합 분자(REGN4661)에 의해 형성된 복합체를 분석하였다.

7.4.2. 재료 및 방법

7.4.2.1. A4F-MALLS 이동상 완충액

1.4 g 소듐 포스페이트 모노베이직(monobasic) 모노하이드레이트, 10.7 g 소듐 포스페이트 디베이직(dibasic) 헵타하이드레이트, 및 500 mL 5 M 소듐 클로라이드를 조합함으로써 이동상 완충액(10 mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드, pH 7.0 ± 0.1)을 제조하고; 그 후에 용액을 HPLC 등급수(grade water)를 이용하여 부피를 5.0 L로 만들었다. 완충액의 최종 측정된 pH는 7.0이었다. 이동상 완충액을 사용 전에 여과하였다(0.2 μm).

7.4.2.2. A4F-MALLS

A4F-MALLS 시스템은 자외선(UV) 다이오드 어레이 검출기, Wyatt Technology Dawn HELEOS® II 레이저 광 산란 기기(LS), 및 Optilab® T-rEX 시차 굴절계(RI) 검출기가 장착된 Agilent 1200 Series HPLC 시스템에 커플링된 Eclipse™ 3+ A4F 분리 시스템으로 이루어졌다. 검출기를 하기 순서대로 일련으로 연결하였다: UV-LS-RI. LS 검출기 및 RI 검출기를 Wyatt Technology에 의해 제공된 설명서에 따라 보정하였다.

정의된 양의 항-KLB 및 항-FGFR1c 다중특이적 결합 분자 후보를 각각 REGN6424(재조합 KLB) 및 REGN6152(재조합 FGFR1c)와 조합하고, 1X DPBS, pH 7.4에서 희석시켜, 등몰비: 0.2 μM 다중특이적 결합 분자: 0.2 μM REGN REGN6424 또는 0.2 μM 다중특이적 결합 분자 : 0.2 μM REGN REGN6424: 0.2 μM REGN REGN6152를 산출하였다. 모든 시료를 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 4℃에서 여과하지 않은 채 유지시킨 후, W350 스페이서 호일(350 μm 스페이서 두께, 2.2 cm 스페이서 폭)이 갖춰지고 10 kDa MWCO 재생된 셀룰로스 막을 사용하여 Eclipse™ 짧은 채널 내로 주입하였다. 채널을 이동상 완충액(10 mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드, pH 7.0 ± 0.1)으로 예비-평형화시킨 후, 각각의 시료를 주입하였다. 소 혈청 알부민(BSA; 2 mg/mL; 10 μg 시료 로드(load))을 별도로 주입하고, 시스템 적합성 대조군으로서 포함시켰다.

분획화 방법은 4개 단계로 구성되었다: 주입, 포커싱, 용리, 및 채널 "세척(wash-out)" 단계. A4F-MALLS 이동상 완충액(10 mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드, pH 7.0 ± 0.1)을 분획화 방법 전과정에 걸쳐 사용하였다. 각각의 시료(7 μg)를 1분 동안 0.2 mL/분의 유속으로 주입하고, 후속적으로 3분 동안 1.0 mL/분의 포커스 유속으로 포커싱하였다. 시료를 15분 동안 일정한 십자류(cross flow) 3.0 mL/분과 함께 1.0 mL/분의 채널 유속으로, 뒤이어 5분에 걸쳐 3.0 mL/분 내지 0 mL/분의 선형 구배 십자류로 용리하였다. 마지막으로, 십자류를 추가 5분 동안 0 mL/분에서 유지시켜, 채널을 세척하였다. 동일한 매개변수 설정을 사용하여 BSA를 분획화하였다.

7.4.2.3. MALLS 데이터 분석

ASTRA V 소프트웨어(버전 5.3.4.14, Wyatt Technology)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 데이터를, 과량의 산란된 광을 용질 농도 및 중량-평균 몰 질량, Mw에 관련짓는 방정식에 맞추었고(문헌[Kendrick 등, 2001, Anal Biochem. 299(2):136-46]; 문헌[Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272(1):1-40]):

여기서, c는 용질 농도이며, R(θ,c)은 산란각 및 농도의 함수로서 용질로부터의 초과 레일리 비(excess Raleigh ratio)이고, Mw는 몰 질량이며, P(θ)는 산란된 광의 각도 의존성(angular dependence)(회전 반경(radius of gyration)이 < 50 nm인 입자에 대해 대략 1)을 기재하고, A2는 삼투압(측정이 희석 용액 상에서 수행되기 때문에 이는 무시될 수 있음)의 확장에서 제2 비리알 계수(virial coefficient)이고,

여기서, n₀는 용매 굴절률을 나타내며, N_A는 아보가르도 수이고, λ0는 진공에서 입사광의 파장이며, dn/dc는 용질에 대한 특정 굴절률 증가분(refractive index increment)을 나타낸다.

BSA 단량체의 몰 질량은 데이터 수집(시스템 적합성 점검) 동안 광 산란 및 시차 굴절률 검출기의 보정 상수(calibration constant)를 평가하는 역할을 하였다. UV 검출기 및 RI 검출기로부터 결정된 BSA의 평균 몰 질량의 상대 표준 편차(%RSD)는 ≤ 5.0%이었다.

이용되는 A4F-MALLS 조건에 대해 수집된 BSA 크로마토그램으로부터 광 산란 검출기에 대한 정규화 계수, 검출기간 지연 시간(inter-detector delay volume), 및 밴드 브로드닝 텀(band broadening term)을 계산하였다. 이들 값을 모든 다른 시료에 대해 수집된 데이터 파일에 적용하여, 이들 텀에 대해 교정하였다.

Astra 소프트웨어에 제공된 단백질 접합체 분석을 사용하여, 215 nm에서 dn/dc 값 및 소광 계수(extinction coefficient)를 실험적으로 결정하였다. 교정된 소광 계수 및 dn/dc 값을 사용하여, 모든 단백질-단백질 복합체 시료를 분석하였다.

7.4.3. 결과

A4F-MALLS를 사용하여, 재조합 KLB(REGN6424), 재조합 FGFR1c(REGN6152), 및 몇몇 단일특이적(REGN4661), 이중특이적(REGN4304), 및 삼중특이적(2+1 N-scFv) 결합 분자 사이에서 형성된 복합체의 상대 크기 분포를 평가하였다. 결과를 도 11a(REGN4661에 대해), 도 11b(REGN4304에 대해), 및 도 11c(2+1 N-scFv 형식에 대해)에 도시한다. 잠재적인 항체:항원 복합체의 이론적 몰질량 및 예측된 화학양론을 표 11a 내지 표 11c에서 삽도로서 제공한다. 예측된 바와 같이, 단일특이적 KLB 결합 분자(REGN4661)는 등몰비로 조합되었을 때 KLB와 캐노니컬(canonical) 1:1(피크 1, 약 280 kDa) 복합체 및 1:2(피크 2, 약 356 kDa) 복합체를 형성하였다(도 11a). 유사하게는, 대조군 이중특이적 결합 분자(항-KLBxFGFR1c; REGN4304)를 등몰량의 KLB와 혼합하였을 때, 약 280 kDa의 계산된 몰질량을 갖는 별개의 균질한 피크(피크 1)가 관찰되었다(도 11b). 개별 성분의 계산된 몰질량에 기초하여, 피크 1은 1:1 이중특이적:KLB 복합체를 나타내는 경향이 있다. 이 혼합물에 FGFR1c를 추가로 첨가하는 것은, 약 305-444 kDa의 계산된 몰질량 범위를 갖는 넓은 피크(피크 2)를 이끌었으며, 이는 일반적으로 1:1:1 이중특이적:KLB:FGFR1c 3원 복합체와 일관된다(도 11b). 피크 2의 트레일링 단부(trailing end)에서 몰질량의 상향 트렌드는, KLB-FGFR1c 상호작용을 통해 약하게 회합된 더 큰 복합체가 또한 용액에 존재할 수 있으나 분획화 시 쉽게 해리될 수 있음을 시사한다.

대조군 단일특이적 결합 분자 및 이중특이적 결합 분자와의 비교에서, 삼중특이적 결합 분자는 KLB 및 FGFR1c에 독특한 더 고차의 화학양론으로 결합하였다. 등몰량의 KLB와 혼합되었을 때, F1K-scFv6 IgG1은 약 579 kDa의 몰질량을 갖는 대체로 별개의 균질한 피크(피크 1)를 형성하였으며, 이는 KLB의 2개 분자에 결합된 F1K-scFv6 IgG1의 2개 분자를 함유하는 복합체(2:2 복합체; 도 11c)를 나타내는 경향이 있다. 다양한 양의 FGFR1c를 이 혼합물에 첨가할 때, 약간 더 넓고 이후에-용리되는 피크(피크 2)가 약 607-644 kDa의 계산된 몰질량 범위로 관찰되었다. 피크 2는 F1K-scFv6 IgG1의 2개 분자, KLB의 2개 분자, 및 FGFR1c의 1-2개 분자를 함유하는 3원 복합체의 혼합물(2:2:1 복합체 및 2:2:2 복합체; 도 11c)을 나타내는 경향이 있다.

도 12a는 FGFR1c 및 KLB와 복합체화된 FGF21의 화학양론을 예시한다. 도 12b는 FGF21-항체 결합의 여러 가지 대안적인 화학양론을 예시한다. 본원에 제시된 데이터는, 개시내용의 삼중특이적 결합 분자가 KLB 및 FGFR1c에 결합하여, 대조군 단일특이적 결합 분자 및 이중특이적 결합 분자와 비교하여 독특한 화학양론을 갖는 3원 복합체를 형성할 수 있으며, 이는 이중특이적 결합 분자와 비교하여 이의 증가된 작용제 활성에 기여할 것임을 드러낸다.

7.5. 실시예 5: FGFR3/APLP2 및 FGFR3/CD63 2+1 N-scFv MBM

7.5.1. 재료 및 방법

7.5.1.1. MBM의 생산

2가 FGFR3 mAb에 융합된 1가 scFv와 함께 2+1 N-scFv MBM을 작제하기 위해, 16개의 APLP2-표적화 scFv 및 3개의 CD63-표적화 scFv를, 이펙터 침묵화 치환, 홀 돌연변이(Y349C, T366S, L368A, Y407V, EU 숫자매김) 및 스타(H435R, Y436F, EU 숫자매김) 돌연변이로 변형된 인간 IgG4 Fc 백본을 갖는 FGFR3 모항체 30108의 중쇄의 N-말단에 개별적으로 융합시켰다(표 11). 제2 중쇄는 동일한 이펙터 침묵화 치환 및 노브(S354C, T366W, EU 숫자매김) 돌연변이로 변형된 IgG4 Fc 및 동일한 30108 Fab를 함유한다(표 11). 2+1 N-scFv MBM의 일반적인 형식은 도 1에 예시되어 있고, FGFR3/APLP2 및 FGFR3/CD63 2+1 N-scFv MBM은 이펙터 침묵화 치환, 노브-인-홀 돌연변이 및 스타 돌연변이를 함유한다. scFv-함유 사슬에 홀 돌연변이 및 scFv 도메인이 결여된 사슬에 노브 돌연변이를 갖는 2+1 N-scFv MBM의 일반적인 형식은 도 3c에 예시되어 있다. scFv-함유 사슬에 스타 돌연변이를 갖는 2+1 N-scFv MBM의 일반적인 형식은 도 3a에 예시되어 있다.

(i) VH(VH-44C를 가짐, 카바트 숫자매김), 링커(4xG₄S(SEQ ID NO: 57)), VL(VL-100C 돌연변이를 가짐, 카바트 숫자매김), scFv를 Fab에 연결하기 위한 링커(G₄S)₃(SEQ ID NO: 1)의 배향에서 다양한 APLP2 또는 CD63 scFv, (ii) 30108의 Fab 영역, 및 (iii) 변형된 인간 IgG4 Fc(표 10)를 인코딩하는 DNA 단편을 Integrated DNA Technologies, Inc.(San Diego, California)에 의해 합성하였다. 개별 중쇄에 대한 포유류 발현 벡터를 NEBuilder HiFi DNA 조립 키트(New England BioLabs Inc.)에 의해 조립하였다. FGFR3/APLP2 또는 CD63 2+1 N-scFv 분자의 발현을 위해, 중쇄 1-홀*, 중쇄 2-노브, 및 ULC 3-20 DNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 Expi293 세포(ThermoFisher Scientific) 내로 공동-형질주입하였다. 50 ml의 세포 배양 배지를 수확하고, HiTrap Protein A FF 컬럼(GE Healthcare)을 통한 정제를 위해 가공하였다. 기능적 확인을 위해, 3ASB-5 및 3CSB-2를 최대 200 ml로 규모확장시키고, 최종 단계로서 크기 배제 크로마토그래피를 포함한 일련의 정제 절차를 받게 하였다. 이전에 만들고 정제한 FGFR3을 표적화하는 30108 IgG를 대조군으로서 사용하였다.

7.5.1.2. 표적 결합에 대한 Biacore 분석

Biacore 동역학 분석을 수행하여, 개별 표적에 대한 2개의 MBM인 3ASB-5 및 3CSB-2의 결합 친화도를 평가하였다.

7.5.1.3. 증식 검정

방광암 세포 증식에 미치는 2+1 N-scFv의 효과를, S249C 돌연변이를 발현하는 UMUC14 세포 및 FGFR3-TACC3 융합 돌연변이를 발현하는 RT4 세포를 이용하여 시험하였다.

7.5.2. 결과

7.5.2.1. FGFR3/APLP2 및 FGFR3/CD63 2+1 N-scFv MBM의 생산

발현되고 정제된 대표적인 FGFR3/APLP2 및 FGFR3/CD63 2+1 N-scFv MBM의 설계 요약을 표 11에 제시한다.

7.5.2.2. FGFR3/APLP2 또는 CD63 2+1 N-scFv는 FGFR3, APLP2, 및 CD63에 결합할 수 있다

개별 표적에 대한 3ASB-5 및 3CSB-2 상에서의 Biacore 동역학 분석 결과를 표 12A 내지 표 12C에 제시한다. 2+1 N-scFv는 둘 다, 공통의 표적 FGFR3에 모 30108 IgG 대조군과 유사하게 K_D = 8 nM로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 3ASB-5의 경우, APLP2에 대한 결합은 K_D = 8.04E-10 M로 하위나노몰 범위에 있는 것으로 밝혀졌다. 3CSB-2의 경우, CD63에 대한 K_D는 모 H4H12450N IgG의 1가 결합 친화도보다 4배 더 약한 5.88E-10 M인 것으로 밝혀졌다. 요약하자면, 3ASB-5와 3CSB-2는 둘 다 이들의 표적, FGFR3, APLP2, 및 CD63에 대해 예상된 결합 능력을 소유한다.

7.5.2.3. FGFR3/APLP2 2+1 N-scFv 3ASB-5 및 FGFR3/CD63 2+1 N-scFv 3CSB-2는 UMUC14(S249C) 세포와 RT4(FGFR3-TACC3) 세포 둘 다에서 상이한 기전을 통해 강력한 증식 차단을 제공할 수 있다

방광암 세포 증식에 미치는 2+1 N-scFv의 효과를, S249C 돌연변이를 발현하는 UMUC14 세포 및 FGFR3-TACC3 융합 돌연변이를 발현하는 RT4 세포를 이용하여 시험하였다. 모항체 H4H30108P2는 RT4 세포에서는 강력한 성장 저해를 실증하였으나, UMUC14 세포에서는 차선의 성장 저해 활성을 실증하였다. 3CSB-2 및 3ASB-5는 UMUC14 세포에서 유의하게 증강된 활성을 보여주었으며, 시험된 최고 용량(100 nM)에서 성장 저해는 약 25% 증가하였다(도 13a). 이에 더하여, 2+1 N-scFvs 3CSB-2 및 3ASB-5의 활성은 RT4 세포에서 높은 수준으로 그리고 모항체 H4H30108P2와 대등하게 유지되었다(도 13b). 모 FGFR3 항체와는 달리, 3CSB-2 및 3ASB-5는, 상이한 돌연변이에 의해 유도되는 방광암 세포의 증식을 차단할 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 13a 및 도 13b).

FGFR3/APLP2 MBM 또는 FGFR3/CD63 MBM의 근본적인 기전을 더 알아보기 위해, 항체-유도 수용체 분해의 효과를 UMUC14 세포에서 시험하였다. 흥미롭게도, FGFR3/APLP2 MBM 대 FGFR3/CD63 MBM에서 상이한 기전이 관찰되었다. FGFR3/APLP2 MBM을 이용한 처리는 처리되지 않은 세포, 또는 이소타입 대조군 항체(REGN1945) 또는 모항체 H4H30108P2로 처리된 세포와 비교하여 증강된 수준의 항체-유도 수용체 분해를 보여주었다(도 14). 대조적으로, FGFR3/CD63 MBM을 이용한 처리는 FGFR3 수용체 수준에 영향을 미치지 않았으며, 이는 이중특이적 3CSB-2 MBM의 증강된 성장 저해 활성이 상이한 기전으로부터 비롯되었음을 시사한다(도 14).

8. 구체적인 구현예

본 개시내용은 아래의 구체적인 구현예에 의해 예시된다.

1. 다중특이적 결합 분자(MBM)로서,

(a) N-말단으로부터 C-말단 배향으로, (i) 하기 (ii)에 작동 가능하게 연결된 제1 항원 결합 부위("ABS1")를 포함하는 scFv, (ii) 하기 (iii)에 작동 가능하게 연결된 제1 Fab("Fab1")의 제1 중쇄 영역, 및 (iii) Fc 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬;

(b) N-말단으로부터 C-말단 배향으로, (i) 하기 (ii)에 작동 가능하게 연결된 제2 Fab("Fab2")의 제2 중쇄 영역 및 (ii) Fc 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬;

(c) 제1 중쇄 영역과 쌍을 이루어 Fab1을 형성하는 제1 경쇄를 포함하는 제3 폴리펩타이드 사슬로서, Fab1은 제2 항원 결합 부위("ABS2")를 포함하는, 제3 폴리펩타이드 사슬; 및

(d) 제2 중쇄 영역과 쌍을 이루어 Fab2를 형성하는 제2 경쇄를 포함하는 제4 폴리펩타이드 사슬로서, Fab2는 제3 항원 결합 부위("ABS3")를 포함하는, 제4 폴리펩타이드 사슬을 포함하는, 다중특이적 결합 분자(MBM).

2. 구현예 1에 있어서, 각각의 항원 결합 부위("ABS")는 상이한 에피토프에 결합하는, MBM.

3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 2개는 동일한 표적 분자의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는, MBM.

4. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, scFv, Fab1, 및 Fab2는 이들의 각각의 표적에 동시에 특이적으로 결합할 수 있는, MBM.

5. 구현예 1 내지 4 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 적어도 하나는 제1 조직 발현 프로파일을 갖는 표적 분자에 특이적으로 결합하고, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 적어도 하나는 제1 조직 발현 프로파일과 중첩되지만 동일하지 않은 제2 조직 발현 프로파일을 갖는 표적 분자에 특이적으로 결합하는, MBM.

6. 구현예 5에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일과 제2 조직 발현 프로파일은 10개 이하의 조직만큼 중첩되는, MBM.

7. 구현예 6에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일과 제2 조직 발현 프로파일은 5개 이하의 조직만큼 중첩되는, MBM.

8. 구현예 7에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일과 제2 조직 발현 프로파일은 3개 이하의 조직만큼 중첩되는, MBM.

9. 구현예 6 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일 및 제2 조직 발현 프로파일은 인간 단백질 아틀라스(HPA: Human Protein Atlas)에 의해 그리고/또는 유전자형-조직 발현(GTEx: Genotype-Tissue Expression) 프로젝트에 의해 정의되는, MBM.

10. 구현예 6 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일 및 제2 조직 발현 프로파일은 단백질 발현 프로파일인, MBM.

11. 구현예 6 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일 및 제2 조직 발현 프로파일은 mRNA 발현 프로파일인, MBM.

12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, Fab1의 표적 분자에 대한 MBM의 친화도는, MBM의 scFv가 결여되어 있지만 MBM과 아미노산 서열이 동일한 Fab1의 표적 분자에 대한 제2 MBM의 친화도보다 작은, MBM.

13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 scFv는 링커를 통해 제1 중쇄 영역에 연결되는, MBM.

14. 구현예 13에 있어서, 상기 링커는 적어도 5개 아미노산, 적어도 6개 아미노산 또는 적어도 7개 아미노산 길이이며, 선택적으로 최대 30개 아미노산, 최대 40개 아미노산, 최대 50개 아미노산, 또는 최대 60개 아미노산 길이이고, 일부 구체적인 구현예에서 링커는

(a) 5개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이;

(b) 5개 아미노산 내지 45개 아미노산 길이;

(c) 5개 아미노산 내지 40개 아미노산 길이;

(d) 5개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이;

(e) 5개 아미노산 내지 30개 아미노산 길이;

(f) 5개 아미노산 내지 25개 아미노산 길이;

(g) 5개 아미노산 내지 20개 아미노산 길이;

(h) 6개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이;

(i) 6개 아미노산 내지 45개 아미노산 길이;

(j) 6개 아미노산 내지 40개 아미노산 길이;

(k) 6개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이;

(l) 6개 아미노산 내지 30개 아미노산 길이;

(m) 6개 아미노산 내지 25개 아미노산 길이;

(n) 6개 아미노산 내지 20개 아미노산 길이;

(o) 7개 아미노산 내지 40개 아미노산 길이;

(p) 7개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이;

(q) 7개 아미노산 내지 30개 아미노산 길이;

(r) 7개 아미노산 내지 25개 아미노산 길이;

(s) 7개 아미노산 내지 20개 아미노산 길이; 또는

(t) 10개 아미노산 내지 60개 아미노산 길이인, MBM.

15. 구현예 14 또는 14(m)에 있어서, 상기 링커는 20개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이이며, 선택적으로 링커는 25 내지 35개 아미노산 길이인, MBM.

16. 구현예 13 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커는 G_nS(SEQ ID NO: 61) 또는 SG_n(SEQ ID NO: 62)의 다량체이거나 이를 포함하며, n은 1 내지 7의 정수이고, 선택적으로 링커는 G₄S(SEQ ID NO: 4)의 다량체이거나 이를 포함하는, MBM.

17. 구현예 13 내지 16 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커는 2개 연속의 글리신(2Gly), 3개 연속의 글리신(3Gly), 4개 연속의 글리신(4Gly(SEQ ID NO: 5)), 5개 연속의 글리신(5Gly(SEQ ID NO: 6)), 6개 연속의 글리신(6Gly(SEQ ID NO: 7)), 7개 연속의 글리신(7Gly(SEQ ID NO: 8)), 8개 연속의 글리신(8Gly(SEQ ID NO: 9)), 또는 9개 연속의 글리신(9Gly(SEQ ID NO: 10))이거나 이를 포함하는, MBM.

18. 구현예 13 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서,

(a) G_nS(SEQ ID NO: 61) 또는 SG_n(SEQ ID NO: 62)의 다량체(예를 들어, G₄S(SEQ ID NO: 4)의 다량체, 여기서 n은 1 내지 7의 정수이며, 예를 들어, 이는 G₄S(SEQ ID NO: 4)의 다량체를 포함함); 및

(b) 하나 이상의 추가 글리신, 예를 들어, 2개 연속의 글리신(2Gly), 3개 연속의 글리신(3Gly), 4개 연속의 글리신(4Gly(SEQ ID NO: 5)), 5개 연속의 글리신(5Gly(SEQ ID NO: 6)), 6개 연속의 글리신(6Gly(SEQ ID NO: 7)), 7개 연속의 글리신(7Gly(SEQ ID NO: 8)), 8개 연속의 글리신(8Gly(SEQ ID NO: 9)) 또는 9개 연속의 글리신(9Gly(SEQ ID NO: 10))을 포함하는, MBM.

19. 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 적어도 하나는 막-결합 항원에 특이적으로 결합하는, MBM.

20. 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS1 및 ABS3은 동일한 세포 상의 막-결합 항원에 특이적으로 결합하는, MBM.

21. 구현예 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서, 삼중특이적 결합 분자("TBM: trispecific binding molecule")인, MBM.

22. 구현예 1 내지 21 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 경쇄 및 제2 경쇄는 유니버셜(universal) 경쇄인, MBM.

23. 구현예 1 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 Fab 또는 제2 Fab의 경쇄 불변 영역 및 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 Crossmab 배열로 존재하는, MBM.

24. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 헤테로이량체를 포함하는 MBM.

25. 구현예 24에 있어서, 상기 Fc 헤테로이량체 내 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 노브-인-홀 돌연변이를 포함하는, MBM.

26. 구현예 24 또는 구현예 25에 있어서, 상기 Fc 헤테로이량체 내 적어도 하나의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 스타 돌연변이를 포함하는, MBM.

27. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 3가 MBM인 MBM.

28. 구현예 1 내지 27 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS3은 인간 클로토 베타("KLB: klotho beta")에 특이적으로 결합하는, MBM.

29. 구현예 28에 있어서, ABS3은 항-KLB 항체의 CDR 서열, 예를 들어, 표 2A 내지 표 2B로 표시된 KLB 결합제 중 임의의 하나의 CDR 서열을 포함하는, MBM.

30. 구현예 29에 있어서, ABS3은 항-KLB 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열, 예를 들어, 표 2A 내지 표 2B로 표시된 KLB 결합제 중 임의의 하나의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.

31. 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS1은 인간 KLB에 특이적으로 결합하는, MBM.

32. 구현예 31에 있어서, ABS1은 항-KLB 항체의 CDR 서열, 예를 들어, 표 2A 내지 표 2B로 표시된 KLB 결합제 중 임의의 하나의 CDR 서열을 포함하는, MBM.

33. 구현예 32에 있어서, ABS1은 항-KLB 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열, 예를 들어, 표 2A 내지 표 2B로 표시된 KLB 결합제 중 임의의 하나의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.

34. 구현예 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS1 및 ABS3은 인간 KLB 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는, MBM.

35. 구현예 34에 있어서, ABS1 및 ABS3은 인간 KLB 상의 이들의 각각의 에피토프에 동시에 특이적으로 결합할 수 있는, MBM.

36. 구현예 1 내지 35 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS2는 인간 섬유모세포 성장 인자 수용체 1c 이소형("FGFR1c: fibroblast growth factor receptor 1c")에 특이적으로 결합하는, MBM.

37. 구현예 36에 있어서, ABS2는 항-FGFR1c 항체의 CDR 서열, 예를 들어, 표 3A 내지 표 3B로 표시된 FGFR1c 결합제 중 임의의 하나의 CDR 서열을 포함하는, MBM.

38. 구현예 37에 있어서, ABS2는 항-FGFR1c 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열, 예를 들어, 표 3A 내지 표 3B로 표시된 FGFR1c 결합제 중 임의의 하나의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.

39. 구현예 36 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS2는 FGFR1c의 루프 D3에 결합하는, MBM.

40. 구현예 36 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS2는 FGFR1c의 루프 D2에 결합하는, MBM.

41. 구현예 1 내지 27 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS2는 인간 섬유모세포 성장 인자 수용체 3("FGFR3")에 특이적으로 결합하는, MBM.

42. 구현예 41에 있어서, ABS2는 항-FGFR3 항체의 CDR 서열, 예를 들어, 표 4로 표시된 FGFR3 결합제 중 임의의 하나의 CDR 서열을 포함하는, MBM.

43. 구현예 42에 있어서, ABS2는 항-FGFR3 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열, 예를 들어, 표 4로 표시된 FGFR3 결합제 중 임의의 하나의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.

44. 구현예 1 내지 27 또는 41 내지 43 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS3은 인간 FGFR3에 특이적으로 결합하는, MBM.

45. 구현예 44에 있어서, ABS3은 항-FGFR3 항체의 CDR 서열, 예를 들어, 표 4로 표시된 FGFR3 결합제 중 임의의 하나의 CDR 서열을 포함하는, MBM.

46. 구현예 45에 있어서, ABS3은 항-FGFR3 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열, 예를 들어, 표 4로 표시된 FGFR3 결합제 중 임의의 하나의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.

47. 구현예 1 내지 27 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS2 및 ABS3은 인간 FGFR3에 특이적으로 결합하는, MBM.

48. 구현예 47에 있어서, ABS2는 항-FGFR3 항체의 CDR 서열, 예를 들어, 표 4로 표시된 FGFR3 결합제 중 임의의 하나의 CDR 서열을 포함하는, MBM.

49. 구현예 48에 있어서, ABS2는 항-FGFR3 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열, 예를 들어, 표 4로 표시된 FGFR3 결합제 중 임의의 하나의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.

50. 구현예 47 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS3은 항-FGFR3 항체의 CDR 서열, 예를 들어, 표 4로 표시된 FGFR3 결합제 중 임의의 하나의 CDR 서열을 포함하는, MBM.

51. 구현예 50에 있어서, ABS3은 항-FGFR3 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열, 예를 들어, 표 4로 표시된 FGFR3 결합제 중 임의의 하나의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.

52. 구현예 47 내지 51 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS2 및 ABS3은 인간 FGFR3 상의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는, MBM.

53. 구현예 52에 있어서, ABS2 및 ABS3은 동일한 CDR 서열을 포함하는, MBM.

54. 구현예 53에 있어서, ABS2 및 ABS3은 동일한 V_H 및 V_L 서열을 포함하는, MBM.

55. 구현예 41 내지 54 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS1은 인간 CD63에 특이적으로 결합하는, MBM.

56. 구현예 55에 있어서, ABS1은 항-CD63 항체의 CDR 서열, 예를 들어, 표 6으로 표시된 CD63 결합제 중 임의의 하나의 CDR 서열을 포함하는, MBM.

57. 구현예 56에 있어서, ABS1은 항-CD63 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열, 예를 들어, 표 6으로 표시된 CD63 결합제 중 임의의 하나의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.

58. 구현예 41 내지 54 중 어느 한 구현예에 있어서, ABS1은 인간 아밀로이드 전구체-유사 단백질 2(APLP2: amyloid precursor-like protein 2)에 특이적으로 결합하는, MBM.

59. 구현예 58에 있어서, ABS1은 항-APLP2 항체의 CDR 서열, 예를 들어, 표 5로 표시된 APLP2 결합제 중 임의의 하나의 CDR 서열을 포함하는, MBM.

60. 구현예 59에 있어서, ABS1은 항-APLP2 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열, 예를 들어, 표 5로 표시된 APLP2 결합제 중 임의의 하나의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.

61. 구현예 1 내지 27 중 어느 한 구현예의 MBM 및 세포독성제(cytotoxic agent) 또는 세포증식억제제(cytostatic agent)를 포함하는 접합체(conjugate).

62. 구현예 1 내지 27 중 어느 한 구현예의 MBM 또는 구현예 61의 접합체 및 부형제를 포함하는 약학적 조성물.

63. 암을 치료하는 방법으로서, 암을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 MBM, 구현예 61의 접합체, 또는 구현예 62의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.

64. 구현예 63에 있어서, 상기 암은, ABS1, ABS2, 및/또는 ABS3이 특이적으로 결합하는 표적 분자의 발현과 관련이 있는, 암을 치료하는 방법.

65. 구현예 63 또는 구현예 64에 있어서, 상기 MBM은 구현예 41 내지 60 중 어느 한 구현예에 따른 MBM이거나, 접합체는 구현예 41 내지 60 중 어느 한 구현예에 따른 MBM을 포함하거나, 약학적 조성물은 구현예 41 내지 60 중 어느 한 구현예에 따른 MBM 또는 구현예 41 내지 60 중 어느 한 구현예에 따른 MBM을 포함하는 접합체를 포함하는, 암을 치료하는 방법.

66. 구현예 63 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 암은 방광암인, 암을 치료하는 방법.

67. 구현예 63 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 암은 교모세포종인, 암을 치료하는 방법.

68. 구현예 63 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 암은 편평 세포 폐암종(squamous cell lung carcinoma)인, 암을 치료하는 방법.

69. 비알코올성 지방간염("NASH: nonalcoholic steatohepatitis")을 치료하는 방법으로서, NASH를 앓고 있는 대상체에게 유효량의 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 MBM, 구현예 61의 접합체, 또는 구현예 62의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간염을 치료하는 방법.

70. 대사 질환(metabolic disease)을 치료하는 방법으로서, 대사 질환을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 MBM, 구현예 61의 접합체, 또는 구현예 62의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대사 질환을 치료하는 방법.

71. 순환형 HDL 콜레스테롤을 감소시키는 방법으로서, 상승된 HDL 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 MBM, 구현예 61의 접합체, 또는 구현예 62의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 순환형 HDL 콜레스테롤을 감소시키는 방법.

72. 순환형 LDL 콜레스테롤을 증가시키는 방법으로서, 낮은 LDL 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 MBM, 구현예 61의 접합체, 또는 구현예 62의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 순환형 LDL 콜레스테롤을 증가시키는 방법.

73. 혈액 트리글리세라이드를 감소시키는 방법으로서, 상승된 트리글리세라이드 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 MBM, 구현예 61의 접합체, 또는 구현예 62의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈액 트리글리세라이드를 감소시키는 방법.

74. 혈액 포도당을 감소시키는 방법으로서, 상승된 포도당 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 MBM, 구현예 61의 접합체, 또는 구현예 62의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈액 포도당을 감소시키는 방법.

75. 비만을 치료하는 방법으로서, 비만을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 MBM, 구현예 61의 접합체, 또는 구현예 62의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 비만을 치료하는 방법.

76. 당뇨병을 치료하는 방법으로서, 당뇨병을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 MBM, 구현예 61의 접합체, 또는 구현예 62의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병을 치료하는 방법.

77. 구현예 69 내지 76 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 MBM은 구현예 28 내지 40 중 어느 한 구현예에 따른 MBM이거나, 접합체는 구현예 28 내지 40 중 어느 한 구현예에 따른 MBM을 포함하거나, 약학적 조성물은 구현예 28 내지 40 중 어느 한 구현예에 따른 MBM 또는 구현예 28 내지 40 중 어느 한 구현예에 따른 MBM을 포함하는 접합체를 포함하는, 방법.

78. 구현예 1 내지 60 중 어느 한 구현예의 MBM을 인코딩하는 하나의 핵산 또는 복수의 핵산.

79. 구현예 1 내지 60 중 어느 한 구현예의 MBM을 발현하도록 조작된 세포.

80. 하나 이상의 프로모터의 제어 하에 구현예 1 내지 60 중 어느 한 구현예에 따른 MBM을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질주입된 세포.

81. MBM을 생성하는 방법으로서,

(a) MBM이 발현되는 조건 하에 구현예 79 또는 구현예 80의 세포를 배양하는 단계; 및

(b) 상기 MBM을 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, MBM을 생성하는 방법.

82. 구현예 81에 있어서, MBM을 농화시키는 단계를 추가로 포함하는, MBM을 생성하는 방법.

83. 구현예 81 또는 구현예 82에 있어서, MBM을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, MBM을 생성하는 방법.

9. 참조문헌의 인용

본 출원에서 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원 및 다른 문헌은, 각각의 개별 공보, 특허, 특허 출원 또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해 참조로서 개별적으로 포함되는 것으로 지시된 것과 동일한 정도까지 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로서 본원에 포함된다. 본원에 포함된 하나 이상의 참조문헌의 교시와 본 개시내용 사이에 불일치가 존재하는 경우에, 본 명세서의 교시가 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> N-TERMINAL SCFV MULTISPECIFIC BINDING MOLECULES <130> RGN-003WO <140> <141> <150> 62/930,916 <151> 2019-11-05 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> SITE <222> (1)..(9) <223> /note="Each of amino acids 1-9 can independently be present or absent" <400> 2 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> SITE <222> (3)..(11) <223> /note="Each of amino acids 3-11 can independently be present or absent" <400> 3 Ser Gly 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Claims

다중특이적 결합 분자(MBM: multispecific binding molecule)로서,
(a) N-말단으로부터 C-말단 배향으로, (i) 하기 (ii)에 작동 가능하게 연결된 제1 항원 결합 부위("ABS1")를 포함하는 scFv, (ii) 하기 (iii)에 작동 가능하게 연결된 제1 Fab("Fab1")의 제1 중쇄 영역, 및 (iii) Fc 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬;
(b) N-말단으로부터 C-말단 배향으로, (i) 하기 (ii)에 작동 가능하게 연결된 제2 Fab("Fab2")의 제2 중쇄 영역 및 (ii) Fc 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬;
(c) 제1 중쇄 영역과 쌍을 이루어 Fab1을 형성하는 제1 경쇄를 포함하는 제3 폴리펩타이드 사슬로서, Fab1은 제2 항원 결합 부위("ABS2")를 포함하는, 제3 폴리펩타이드 사슬; 및
(d) 제2 중쇄 영역과 쌍을 이루어 Fab2를 형성하는 제2 경쇄를 포함하는 제4 폴리펩타이드 사슬로서, Fab2는 제3 항원 결합 부위("ABS3")를 포함하는, 제4 폴리펩타이드 사슬을 포함하는, 다중특이적 결합 분자(MBM).
제1항에 있어서, 각각의 항원 결합 부위("ABS")는 상이한 에피토프에 결합하는, MBM.
제1항 또는 제2항에 있어서, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 2개는 동일한 표적 분자의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는, MBM.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, scFv, Fab1, 및 Fab2는 이들의 각각의 표적에 동시에 특이적으로 결합할 수 있는, MBM.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 적어도 하나는 제1 조직 발현 프로파일을 갖는 표적 분자에 특이적으로 결합하고, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 적어도 하나는, 제1 조직 발현 프로파일과 중첩되지만 동일하지 않은 제2 조직 발현 프로파일을 갖는 표적 분자에 특이적으로 결합하는, MBM.
제5항에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일과 제2 조직 발현 프로파일은 10개 이하의 조직만큼 중첩되는, MBM.
제6항에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일과 제2 조직 발현 프로파일은 5개 이하의 조직만큼 중첩되는, MBM.
제7항에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일과 제2 조직 발현 프로파일은 3개 이하의 조직만큼 중첩되는, MBM.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일 및 제2 조직 발현 프로파일은 인간 단백질 아틀라스(HPA: Human Protein Atlas)에 의해 그리고/또는 유전자형-조직 발현(GTEx: Genotype-Tissue Expression) 프로젝트에 의해 정의되는, MBM.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일 및 제2 조직 발현 프로파일은 단백질 발현 프로파일인, MBM.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조직 발현 프로파일 및 제2 조직 발현 프로파일은 mRNA 발현 프로파일인, MBM.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, Fab1의 표적 분자에 대한 MBM의 친화도는, MBM의 scFv가 결여되어 있지만 MBM과 아미노산 서열이 동일한 Fab1의 표적 분자에 대한 제2 MBM의 친화도보다 작은, MBM.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scFv는 링커를 통해 제1 중쇄 영역에 연결되는, MBM.
제13항에 있어서, 상기 링커는
(a) 적어도 5개 아미노산, 적어도 6개 아미노산 또는 적어도 7개 아미노산 길이; 및 선택적으로
(b) 최대 30개 아미노산, 최대 40개 아미노산, 최대 50개 아미노산 또는 최대 60개 아미노산 길이인, MBM.
제14항에 있어서, 상기 링커는
(a) 5개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이;
(b) 5개 아미노산 내지 45개 아미노산 길이;
(c) 5개 아미노산 내지 40개 아미노산 길이;
(d) 5개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이;
(e) 5개 아미노산 내지 30개 아미노산 길이;
(f) 5개 아미노산 내지 25개 아미노산 길이; 또는
(g) 5개 아미노산 내지 20개 아미노산 길이인, MBM.
제14항에 있어서, 상기 링커는
(a) 6개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이;
(b) 6개 아미노산 내지 45개 아미노산 길이;
(c) 6개 아미노산 내지 40개 아미노산 길이;
(d) 6개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이;
(e) 6개 아미노산 내지 30개 아미노산 길이;
(f) 6개 아미노산 내지 25개 아미노산 길이; 또는
(g) 6개 아미노산 내지 20개 아미노산 길이인, MBM.
제14항에 있어서, 상기 링커는
(a) 7개 아미노산 내지 40개 아미노산 길이;
(b) 7개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이;
(c) 7개 아미노산 내지 30개 아미노산 길이;
(d) 7개 아미노산 내지 25개 아미노산 길이;
(e) 7개 아미노산 내지 20개 아미노산 길이인, MBM.
제14항에 있어서, 상기 링커는 5개 아미노산 내지 25개 아미노산 길이인, MBM.
제14항에 있어서, 상기 링커는 10개 아미노산 내지 60개 아미노산 길이인, MBM.
제19항에 있어서, 상기 링커는 20개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이인, MBM.
제20항에 있어서, 상기 링커는 25개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이인, MBM.
제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 G_nS(SEQ ID NO: 61) 또는 SG_n(SEQ ID NO: 62)의 다량체이거나 이를 포함하고, n은 1 내지 7의 정수인, MBM.
제22항에 있어서, 상기 링커는 G₄S(SEQ ID NO: 4)의 다량체이거나 이를 포함하는, MBM.
제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 2개 연속의 글리신(2Gly), 3개 연속의 글리신(3Gly), 4개 연속의 글리신(4Gly(SEQ ID NO: 5)), 5개 연속의 글리신(5Gly(SEQ ID NO: 6)), 6개 연속의 글리신(6Gly(SEQ ID NO: 7)), 7개 연속의 글리신(7Gly(SEQ ID NO: 8)), 8개 연속의 글리신(8Gly(SEQ ID NO: 9)) 또는 9개 연속의 글리신(9Gly(SEQ ID NO: 10))이거나 이를 포함하는, MBM.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, ABS1, ABS2, 및 ABS3 중 적어도 하나는 막-결합 항원에 특이적으로 결합하는, MBM.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, ABS1 및 ABS3은 동일한 세포 상의 막-결합 항원에 특이적으로 결합하는, MBM.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 삼중특이적 결합 분자("TBM: trispecific binding molecule")인 MBM.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 경쇄 및 제2 경쇄는 유니버셜(universal) 경쇄인, MBM.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 Fab 또는 제2 Fab의 경쇄 불변 영역 및 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 Crossmab 배열로 존재하는, MBM.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 헤테로이량체를 포함하는 MBM.
제30항에 있어서, 상기 Fc 헤테로이량체 내 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 노브-인-홀 돌연변이를 포함하는, MBM.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 Fc 헤테로이량체 내 적어도 하나의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 스타(star) 돌연변이를 포함하는, MBM.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 3가 MBM인 MBM.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, ABS3은 인간 클로토 베타("KLB: klotho beta")에 특이적으로 결합하는, MBM.
제34항에 있어서, ABS3은 항-KLB 항체의 CDR 서열을 포함하는, MBM.
제35항에 있어서, ABS3은 항-KLB 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, ABS1은 인간 KLB에 특이적으로 결합하는, MBM.
제37항에 있어서, ABS1은 항-KLB 항체의 CDR 서열을 포함하는, MBM.
제38항에 있어서, ABS1은 항-KLB 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, ABS1 및 ABS3은 인간 KLB 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는, MBM.
제40항에 있어서, ABS1 및 ABS3은 인간 KLB 상의 이들의 각각의 에피토프에 동시에 특이적으로 결합할 수 있는, MBM.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, ABS2는 인간 섬유모세포 성장 인자 수용체 1c 이소형("FGFR1c: fibroblast growth factor receptor 1c")에 특이적으로 결합하는, MBM.
제42항에 있어서, ABS2는 항-FGFR1c 항체의 CDR 서열을 포함하는, MBM.
제43항에 있어서, ABS2는 항-FGFR1c 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.
제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, ABS2는 FGFR1c의 루프 D3에 결합하는, MBM.
제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, ABS2는 FGFR1c의 루프 D2에 결합하는, MBM.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, ABS2는 인간 섬유모세포 성장 인자 수용체 3("FGFR3")에 특이적으로 결합하는, MBM.
제47항에 있어서, ABS2는 항-FGFR3 항체의 CDR 서열을 포함하는, MBM.
제48항에 있어서, ABS2는 항-FGFR3 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.
제1항 내지 제33항 또는 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, ABS3은 인간 FGFR3에 특이적으로 결합하는, MBM.
제50항에 있어서, ABS3은 항-FGFR3 항체의 CDR 서열을 포함하는, MBM.
제51항에 있어서, ABS3은 항-FGFR3 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, ABS2 및 ABS3은 인간 FGFR3에 특이적으로 결합하는, MBM.
제53항에 있어서, ABS2는 항-FGFR3 항체의 CDR 서열을 포함하는, MBM.
제54항에 있어서, ABS2는 항-FGFR3 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.
제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, ABS3은 항-FGFR3 항체의 CDR 서열을 포함하는, MBM.
제56항에 있어서, ABS3은 항-FGFR3 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.
제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, ABS2 및 ABS3은 인간 FGFR3 상의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는, MBM.
제58항에 있어서, ABS2 및 ABS3은 동일한 CDR 서열을 포함하는, MBM.
제59항에 있어서, ABS2 및 ABS3은 동일한 V_H 및 V_L 서열을 포함하는, MBM.
제47항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, ABS1은 인간 CD63에 특이적으로 결합하는, MBM.
제61항에 있어서, ABS1은 항-CD63 항체의 CDR 서열을 포함하는, MBM.
제62항에 있어서, ABS1은 항-CD63 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.
제47항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, ABS1은 인간 아밀로이드 전구체-유사 단백질 2(APLP2: amyloid precursor-like protein 2)에 특이적으로 결합하는, MBM.
제64항에 있어서, ABS1은 항-APLP2 항체의 CDR 서열을 포함하는, MBM.
제65항에 있어서, ABS1은 항-APLP2 항체의 V_H 및/또는 V_L 서열을 포함하는, MBM.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 MBM 및 세포독성제(cytotoxic agent) 또는 세포증식억제제(cytostatic agent)를 포함하는 접합체(conjugate).
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 MBM 또는 제67항의 접합체 및 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
암을 치료하는 방법으로서, 암을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 MBM, 제67항의 접합체, 또는 제68항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
제69항에 있어서, 상기 암은, ABS1, ABS2, 및/또는 ABS3이 특이적으로 결합하는 표적 분자의 발현과 관련이 있는, 암을 치료하는 방법.
제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 MBM은 제47항 내지 제66항 중 어느 한 항에 따른 MBM이거나, 접합체는 제47항 내지 제66항 중 어느 한 항에 따른 MBM을 포함하거나, 약학적 조성물은 제47항 내지 제66항 중 어느 한 항에 따른 MBM 또는 제47항 내지 제66항 중 어느 한 항에 따른 MBM을 포함하는 접합체를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 방광암인, 암을 치료하는 방법.
제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 교모세포종(glioblastoma)인, 암을 치료하는 방법.
제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 편평 세포 폐암종(squamous cell lung carcinoma)인, 암을 치료하는 방법.
비알코올성 지방간염("NASH: nonalcoholic steatohepatitis")을 치료하는 방법으로서, NASH를 앓고 있는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 MBM, 제67항의 접합체, 또는 제68항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간염을 치료하는 방법.
대사 질환(metabolic disease)을 치료하는 방법으로서, 대사 질환을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 MBM, 제67항의 접합체, 또는 제68항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대사 질환을 치료하는 방법.
순환형 HDL 콜레스테롤을 감소시키는 방법으로서, 상승된 HDL 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 MBM, 제67항의 접합체, 또는 제68항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 순환형 HDL 콜레스테롤을 감소시키는 방법.
순환형 LDL 콜레스테롤을 증가시키는 방법으로서, 낮은 LDL 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 MBM, 제67항의 접합체, 또는 제68항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 순환형 LDL 콜레스테롤을 증가시키는 방법.
혈액 트리글리세라이드를 감소시키는 방법으로서, 상승된 트리글리세라이드 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 MBM, 제67항의 접합체, 또는 제68항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈액 트리글리세라이드를 감소시키는 방법.
혈액 포도당을 감소시키는 방법으로서, 상승된 포도당 수준을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 MBM, 제67항의 접합체, 또는 제68항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈액 포도당을 감소시키는 방법.
비만을 치료하는 방법으로서, 비만을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 MBM, 제67항의 접합체, 또는 제68항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 비만을 치료하는 방법.
당뇨병을 치료하는 방법으로서, 당뇨병을 앓고 있는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 MBM, 제67항의 접합체, 또는 제68항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병을 치료하는 방법.
제75항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBM은 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 MBM이거나, 상기 접합체는 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 MBM을 포함하거나, 상기 약학적 조성물은 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 MBM 또는 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 MBM을 포함하는 접합체를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 MBM을 인코딩하는 하나의 핵산 또는 복수의 핵산.
제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 MBM을 발현하도록 조작된 세포.
하나 이상의 프로모터의 제어 하에 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 따른 MBM을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 하나 이상의 발현 벡터로 형질주입된 세포.
MBM을 생성하는 방법으로서,
(a) MBM이 발현되는 조건 하에 제85항 또는 제86항의 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 MBM을 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, MBM을 생성하는 방법.
제87항에 있어서, MBM을 농화시키는 단계를 추가로 포함하는, MBM을 생성하는 방법.
제87항 또는 제88항에 있어서, MBM을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, MBM을 생성하는 방법.