JPWO2005121794A1 - クロマトグラフィー式検出装置、検査法及びこれを応用したキット - Google Patents

クロマトグラフィー式検出装置、検査法及びこれを応用したキット Download PDF

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Abstract

イムノクロマトグラフィー式検査法における被分析物質と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬が特異的に結合する反応および被分析物質−標識試薬の複合体と捕捉試薬が特異的に結合する反応の条件を固相支持体上において連続的に至適化するように固相支持体を構成し、なおかつ前処理した検体を固相支持体上で上記反応に適した条件にすることにより、簡便且つ感度・特異性の優れたイムノクロマトグラフィー検出装置、検査法及びこれを応用したキット、並びにその製法を提供。シート状の固相支持体上に少なくとも被分析物質を含むと推定される検体または該検体と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬との混合物を供給する検体供給部位および前記被分析物質−前記標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試薬部位を含むクロマトグラフィー式検出装置であって、検体供給部位と捕捉試薬部位の間に以下の機能の一つまたは複数の機能を有する少なくとも一つの機能部位を設けたクロマトグラフィー式検出装置。

Description

本発明は、試料中の被分析物質を特異的に定性及び定量をするクロマトグラフィー式検出装置、検査法及びこれを応用したキットに関するものである。
免疫反応の特異性を利用して試料中の分析対象物を検出又は定量する分析方法として免疫拡散法、酵素測定法、凝集法等種々の方法論が実用化されている。特に近年、イムノクロマトグラフィー式検査（検出）法（ラテラルフロー式、タンジェンシャルフロー式、特公平7-13640号公報、特許第2131938号公報、特許第2890384号公報）による検査法はその簡便性から急速に普及している。
以下にこれらの検査法の原理を簡単に説明する。市販されている多くのイムノクロマトグラフィー検査法は、シート状の固相支持体を有し、固相支持体上の長さ方向に対して、端から順番に１．検体供給部位、２．被分析物質（例：抗原）に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬（例：可視可能な金コロイド粒子または酵素）をメンブレン上において展開可能に保持した標識試薬部位、３．被分析物質（例：抗原）または標識抗体若しくは被分析物質と標識試薬の複合体を捕捉するための捕捉試薬（例：抗体）を固定化した捕捉試薬部位を溶液が毛細管現象により連続的に移動するよう構成されている。まず、被分析物質を含む検体を検体浮遊液に浮遊させた試料を試料添加部位に所定量供すると、試料が固相支持体を展開移動する過程で標識試薬部位に侵入し、被分析物質が標識試薬と結合し被分析物質−標識試薬の複合体が形成される。被分析物質−標識試薬複合体はそのままメンブレン上を展開移動し、メンブレン上の捕捉試薬部位に侵入すると、固相支持体上に固定化された捕捉試薬に捕捉され、捕捉試薬−被分析物質−標識試薬の複合体が捕捉試薬位置に形成される。そして、標識試薬を任意の方法（可視可能な金コロイド粒子の場合はその凝集像、酵素の場合は基質を添加することによる発色反応）で検出することで、被分析物質の存在を判定することができる。図７に従来のイムノクロマトグラフィー式検出装置を示す。
イムノクロマトグラフィー式検出装置はその構成上、検体を固相支持体上に供給し展開させることにより、Ａ．被分析物質と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬が特異的に結合する反応、およびＢ．被分析物質−標識試薬の複合体と捕捉試薬が特異的に結合する反応が連続的に固相支持体上において自動的に実施されることから、簡便性において優れた検査法である。しかし、実際には多くの検査において、被分析物質を含む検体には不純物が多く、それを除去するために検査を行う前に様々な化学的・物理的処理により検体から被分析物質を分離及び抽出する前処理が必要であった。この際、前処理が抗原と抗体との結合反応に不適な条件で行われることが多く、前処理の後に検体を結合反応に適した条件にする必要があった。さらに被分析物質と標識試薬が特異的に結合しやすいように反応系においてpH及び塩濃度等を調節する必要があった。しかし、必ずしも上記ＡおよびＢの各反応のpH・塩濃度等の至適反応条件は一致しない為、ELISA等の複数の反応を分けて反応させる他の検査法と比較して簡便性や感度・特異性が劣る面もあった。
特公平7-13640号公報 特許第2131938号公報 特許第2504923号公報 特許第2890384号公報
本発明は、イムノクロマトグラフィー式検査法における被分析物質と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬が特異的に結合する反応および被分析物質−標識試薬の複合体と捕捉試薬が特異的に結合する反応の条件を固相支持体上において連続的に至適化するように固相支持体を構成し、なおかつ前処理した検体を固相支持体上で上記反応に適した条件にすることにより、簡便且つ感度・特異性の優れたイムノクロマトグラフィー検出装置、検査法及びこれを応用したキット、並びにその製法を提供するものである。さらに、本発明は固相支持体上で検体を前処理し得るイムノクロマトグラフィー検出装置、検査法及びこれを応用したキット、並びにその製法を提供するものである。
本発明者は、イムノクロマトグラフィー式検査装置の固相支持体上で被分析物質と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬が特異的に結合する反応および被分析物質−標識試薬の複合体と捕捉試薬が特異的に結合する反応の条件を固相支持体上において連続的に至適化し、さらに前処理した検体を固相支持体上で上記反応に適した条件にするように固相支持体を構成することにより、迅速、簡便且つ感度・特異性の優れたイムノクロマトグラフィー検出装置を開発すべく鋭意検討を行った。その結果、検体を供給部に添加してから連続的に上記各反応が起こる際に、各反応毎に反応条件を至適化する手段を固相支持体上に含ませることにより、簡便且つ感度・特異性の優れたイムノクロマトグラフィー検査法を実施できることを見出した。本発明者は、反応条件を至適化する手段として固相支持体上に反応条件を至適化する機能を有する部材および／または試薬を含む機能部位を設けることにより本発明を完成させるに至った。さらに、本発明者は、固相支持体に検体処理手段を有する部材および／または試薬を含む機能部位を設け、検体を供給部に添加する前の検体の前処理を必要とすることなく検出を行えることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] シート状の固相支持体上に少なくとも被分析物質を含むと推定される検体または該検体と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬との混合物を供給する検体供給部位および前記被分析物質―前記標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試薬部位を含むクロマトグラフィー式検出装置であって、検体供給部位と捕捉試薬部位の間に以下の機能(a)から(c)の一つまたは複数の機能を有する少なくとも一つの機能部位を設けたクロマトグラフィー式検出装置。
(a) 検体を前処理する機能、
(b) 検体中の被分析物質と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬が特異的に結合する反応の条件を至適化する機能、および
(c) 被分析物質−標識試薬の複合体と捕捉試薬が特異的に結合する反応の条件を至適化する機能
[２] シート状の固相支持体上に少なくとも被分析物質を含むと推定される検体を供給する検体供給部位、被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬を固相支持体上で展開可能に保持した標識試薬部位および前記被分析物質―前記標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試薬部位が含まれる[１]のクロマトグラフィー式検出装置。
[３] 被分析物質と標識試薬が固相支持体と分離した部位で予め接触し、検体供給部位に被分析物質を含むと推定される検体と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬との混合物が供給される[１]のクロマトグラフィー式検出装置。
[４] 検体供給部位と標識試薬部位が空間的に離れて設けられている[１]または[２]のクロマトグラフィー式検出装置。
[５] 検体を前処理する機能が検体から不純物を除去する機能および／または検体から被分析物質を抽出する機能である、[１]から[４]のいずれかのクロマトグラフィー式検出装置。
[６] 検体を前処理する機能が被分析物質を抽出する機能であり、検体を前処理する機能を有する機能部位が検体から被分析物質を抽出するための試薬を含んでいる、[５]のクロマトグラフィー式検出装置。
[７] 検体から被分析物質を抽出するための試薬が、生物マトリックスを含む検体中の生物マトリックスから、アルカリ処理、酸処理または界面活性剤処理により被分析物質を抽出するための、塩基物質、酸性物質または界面活性剤である、[６]のクロマトグラフィー式検出装置。
[８] 検体を前処理する機能が、検体から不純物を除去する機能であり、検体を前処理する機能を有する機能部位が検体中の不純物を濾過、吸着または凝集する機能を有する、[５]から[７]のいずれかのクロマトグラフィー式検出装置。
[９] 検体を前処理する機能を有する機能部位がフィルターからなり、該フィルターにより検体中の不純物が濾過される、[８]のクロマトグラフィー式検出装置。
[１０] 検体を前処理する機能を有する機能部位が、不純物を吸着する試薬または不純物を凝集させる試薬を含む、[８]または[９]のクロマトグラフィー式検出装置。
[１１] 検体を前処理する機能を有する機能部位が、不純物を吸着する試薬または不純物を凝集させる試薬を含み、不純物を吸着する試薬または不純物を凝集させる試薬が固相支持体中に含まれる[１０]のクロマトグラフィー式検出装置。
[１２] 不純物を吸着する試薬または不純物を凝集させる試薬が固相支持体中の検体供給部位と標識試薬部位の間に含まれる[１１]のクロマトグラフィー式検出装置。
[１３] 反応の条件を至適化する機能を有する機能部位が、反応条件を至適化するための試薬を含む、[１]から[１２]のいずれかのクロマトグラフィー式検出装置。
[１４] 反応条件を至適化するための試薬により、反応系のpHが反応に至適な範囲に調整される[１３]のクロマトグラフィー式検出装置。
[１５] 反応条件を至適化するための試薬により、反応系の塩濃度が反応に至適な範囲に調整される[１３]のクロマトグラフィー式検出装置。
[１６] 試薬が、緩衝液、酸性試薬、塩基性試薬および界面活性剤からなる群から選択される[１３]から[１５]のいずれかのクロマトグラフィー式検出装置。
[１７] あらかじめ前処理した検体中の被分析物質がリガンドまたは捕捉物質と結合する反応の条件を至適化するための機能部位を有する、[１３]から[１６]のいずれかのクロマトグラフィー式検出装置。
[１８] 異なる被分析物質を補足し得る複数の捕捉試薬部位を含むクロマトグラフィー式検出装置であって、少なくとも一つの捕捉試薬部位の上流に該捕捉物質と被分析物質との結合反応条件を至適化するための試薬を含む[１３]から[１７]のいずれかのクロマトグラフィー式検出装置。
[１９] 異なる被分析物質とそれぞれの被分析物質に対する捕捉試薬との間でクロス反応が生じ得る被分析物質であって、結合反応の条件を至適化することによりクロス反応を抑制する、[１８]のクロマトグラフィー式検出装置。
[２０] 検体が細菌またはウイルスを含む検体であって、検体を前処理する機能を有する機能部位が細菌またはウイルスから被分析物質を抽出する機能を有する[５]から[１９]のいずれかのクロマトグラフィー式検出装置。
[２１] さらに、前処理した検体中の被分析物質がリガンドまたは捕捉物質と結合する反応の条件を至適化するための機能部位を有する[２０]のクロマトグラフィー式検出装置。
[２２] 検体が鼻腔または咽頭拭い液であって、検体を前処理する機能を有する機能部位が、鼻腔もしくは咽頭拭い液中の多糖類を凝集させる試薬を含み、なおかつ濾過機能により凝集した多糖類を除去するフィルターからなる[５]から[２１]のいずれかのクロマトグラフィー式検出装置。
[２３] 被分析物質がＡ型インフルエンザウイルス抗原およびＢ型インフルエンザウイルス抗原を含み、Ａ型インフルエンザウイルス抗原を捕捉する捕捉試薬部位およびＢ型インフルエンザウイルス抗原を捕捉する捕捉試薬部位を含むクロマトグラフィー式検出装置であって、Ａ型インフルエンザウイルス抗原とＢ型インフルエンザウイルス抗原を捕捉し得る捕捉試薬との結合および／またはＢ型インフルエンザウイルス抗原とＡ型インフルエンザウイルス抗原を捕捉し得る捕捉試薬とのクロス反応による結合を抑制し得る試薬を含む機能部位を含む[５]から[２１]のいずれかのイムノクロマトグラフィー式検出装置。
[２４] 標識試薬が、酵素または不溶性粒状物質により標識されたリガンドである[１]から[２３]のいずれかのクロマトグラフィー式検出装置。
[２５] 被分析物質とリガンドとの結合および被分析物質−リガンド複合体と捕捉試薬との結合が、抗原−抗体反応により生じる、[１]から[２４]のいずれかのクロマトグラフィー式検出装置。
[２６] 固相支持体がニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロンおよびポリエーテルスルホンからなる群から選択される、[１]から[２５]のいずれかのクロマトグラフィー式検出装置。
本発明のイムノクロマトグラフィー装置を用いることにより、イムノクロマトグラフィー式検査装置の固相支持体上で被分析物質と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬が特異的に結合する反応および被分析物質−標識試薬の複合体と捕捉試薬が特異的に結合する反応の条件が固相支持体上において連続的に至適化されるので、迅速、簡便且つ感度・特異性の優れた検出を行うことができる。また、前処理により反応に不適切な条件になった検体も固相支持体上で至適条件にすることができるので、迅速な検出が可能になる。さらに、本発明の装置は検体処理手段および処理した検体を反応に適した条件にする手段を備えており、さらに迅速かつ高感度な検出を行うことができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2004-169200号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明の検出装置の一例を示す図である。 本発明の検出装置の一例を示す図である。 不純物濾過機能を有している部材を用いた検出装置を示す図である。 複数の被分析物質を検出することができる本発明のマルチ検出装置であって、各被分析物質の反応条件を至適に調節しうる検出装置を示す図である。 予め前処理した検体を至適条件にし得る検出装置を示す図である。 予め前処理した検体を至適条件にし得る検出装置を示す図である。 従来のイムノクロマトグラフィー検出装置を示す図である。 不純物吸着物質を固相支持体に設けた検出装置を示す図である。
符号の説明
１、機能部位
２、検体供給部位
３、標識試薬部位
４、捕捉試薬（キャプチャー抗体）部位
５、対照部位（コントロール部位）
６、固相支持体（ニトロセルロース膜）
７、吸収部位（アブソーベントパッド）
８、トップラミネートまたはハウジング
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、検体中の被分析物質を検出する装置であって、イムノクロマトグラフィー式検出装置、検査法及びこれを応用したキットである。本発明の検出装置はシート状の固相支持体上に少なくとも被分析物質を含むと推定される検体または該検体と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬との混合物を供給する検体供給部位および前記被分析物質―前記標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試薬部位を含む。検体供給部位に被分析物質を含むと推定される検体を供給すると、検体は標識試薬部位、捕捉試薬部位の順に通過するよう構成されている。本発明の装置は、さらに被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬を固相支持体上で展開可能に保持した標識試薬部位を含んでいてもよく、この場合、検体と標識試薬との結合は固相支持体上で行われるので、検体供給部位には検体のみを供給すればよい。
さらに、本発明の装置は、固相支持体上で起こる抗原抗体反応等の結合反応を至適化する手段を備えている。具体的には、検体が検体供給部位に供給され固相支持体上を展開して標識試薬部位に移動し、検体中の被分析物質と標識試薬が特異的に結合して被分析物質−標識試薬複合体を形成する過程において、予め固相支持体上の検体供給部位から標識試薬部位までの間に配置した１つ以上の部材または試薬を含む機能部位によって、検体から被分析物質を分離し、かつ被分析物質と標識試薬の特異的に結合しやすい状態に調節される。また、前記複合体が捕捉試薬と特異的に結合して、被分析物質−標識試薬―捕捉試薬複合体を形成する過程において、予め固相支持体上の標識試薬部位から捕捉試薬部位までの間に配置した１つ以上の部材または試薬を含む機能部位と接触することによって、前記複合体が固相支持体上を展開して捕捉試薬部位に移動する過程において、前記複合体と捕捉試薬とが特異的に結合しやすい状態に調節される。さらに、本発明の装置は酸処理やアルカリ処理等の前処理により、pH等の条件が抗原抗体反応等の結合反応に適さない条件になった検体の条件を至適化する手段を備えている。具体的には、検体が検体供給部位に供給され固相支持体上を展開して標識試薬部位に移動し、検体中の被分析物質と標識試薬が特異的に結合して被分析物質−標識試薬複合体を形成する過程において、予め固相支持体上の検体供給部位から標識試薬部位までの間に配置した１つ以上の部材または試薬を含む機能部位によって、至適化される。さらに、本発明の装置は、検体を前処理する手段を備えている。ここで、前処理とは、検体中から被分析物質を抽出あるいは単離すること、および検体中の不純物を除去することをいう。
本発明の装置において、上記の固相支持体上で起こる抗原抗体反応等の結合反応を至適化する手段、検体の条件を至適化する手段および検体を前処理する手段は、それぞれ固相支持体上で起こる抗原抗体反応等の結合反応を至適化する機能、検体の条件を至適化する機能および検体を前処理する機能を有する部材または試薬を含む機能部位からなる。
本発明の装置において、検体供給部位は固相支持体の一端をそのまま使用しても構わないし、固相支持体とは別の部材、例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、ポリスチレン等の天然、合成ポリマー、あるいはこれらの混合物からなる部材で構成し、一旦検体または検体と標識試薬の混合物を吸収し、次いで吸収した検体または混合物を固相支持体に供給するように、固相支持体と毛管流により溶液が展開移動可能となるよう配置する。検体供給部位が前記の反応条件を調節、至適化する試薬を含有していても、すなわち検体供給部位が機能部位を兼ねていても良いが、検体供給部位を直接展開液に浸漬する場合は、検体供給部位に含有した前記試薬が展開液上に放出されるので、望ましくは独立して設けた方が良い。また、標識試薬部位の配置は固相支持体上に標識試薬を塗布して乾燥させても構わないし、固相支持体とは別の上述の部材に含侵させて乾燥した物を固相支持体上または固相支持体と連続的に連結させても構わない。捕捉試薬部位の配置も同様に固相支持体上に捕捉試薬を塗布して乾燥させても構わないし、固相支持体とは別の上述の部材に含侵させて乾燥した物を固相支持体上または固相支持体と連続的に連結させても構わない。（図１、２）
本発明の方法においてはまず、被分析物質を含むと推定される検体を検体供給部位に供給する。本発明の方法において分析しようとする被分析物質は、限定されないが通常は抗原または抗体である。検体も限定されず、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔または咽頭拭い液、汗、糞便等の生体試料の他、肉、植物等の食物の抽出物、汚水、泥水、土壌等の環境由来の試料、菌、ウイルス等の微生物培養液もしくは浮遊液等、菌やウイルス等の抽出物が含まれる。
検体を供給する際は、検体を検体供給部位に希釈等の処理をすることなく直接供給してもよい。また、検体が粘性等により固相支持体上で容易に展開移動できない検体に関しては予め展開液で希釈したり、また検体を採取した綿棒等の採取器具を直接検体供給部位に接触させ、展開液を前記採取器具に供給することにより、綿棒に付着した検体を洗浄しながら、検体供給部位にその洗浄液を供給してもよい。展開液は被分析物質が検出工程上、支障がない程度に固相支持体上を展開できれば、酸性剤、塩基性剤、界面活性剤、変性剤等を含む各種緩衝液でも、いかなる組成の溶液でもよい。
上述の方法で検体供給部位に供給された検体中の被分析物質は、固相支持体上を展開移動して標識試薬を保持した部位（標識試薬部位）で被分析物質―前記標識試薬複合体を形成し、前記複合体は捕捉試薬部位で捕捉試薬に捕捉され、固相支持体上に固定化される。
この際、検体供給部位と標識試薬部位は同一の部位であっても、空間的に離れて存在している異なる部位であってもよい。両部位が異なる部位である場合、検体供給部位と標識部位が部分的に接触して毛管流により連絡していてもよいし、接触しておらず両部位の間に固相支持体または機能部位が存在しており、該固相支持体または機能部位を介して毛管流により連絡していてもよい。ここで、「毛管流により連絡」とは連絡している部位間で検体等の流体が毛管現象により移動し得ることをいう。また、本発明の装置は被分析物質と標識試薬が固相支持体と分離した部位で予め接触するような構成を有していてもよい。「被分析物質と標識試薬が固相支持体と分離した部位で予め接触する」とは、標識試薬が固相支持体に含まれておらず、または固相支持体と接触しており液体が固相支持体と連絡し得る部位、例えば、検体供給部位等にも含まれていないことをいう。この場合、被分析物質と標識試薬は、固相支持体および固相支持体と接触している部位以外で予め接触する。例えば、従来のイムノクロマトグラフィー式検出装置においては、固相支持体と標識試薬を含む多孔質支持体が接触する形で構成されているものがあり、該従来の装置においては、標識試薬を含む多孔質支持体が検体供給部位を兼ね、該検体供給部位に検体を添加することにより、検体と標識試薬が接触し、検体と標識試薬の混合物は直ちに固相支持体に移動する。すなわち、この従来の装置においては、検体と標識試薬の接触は固相支持体と接触した部位で行われるのであり、固相支持体と分離した部位では行われない。本発明においては、検体と標識試薬の接触時間等を調節するために、この従来の装置とは異なり、検体と標識試薬の混合物を固相支持体および固相支持体と接触している部位以外の部位、すなわち固相支持体と分離した部位で接触する。標識試薬と検体との接触は、例えば、検体供給用デバイス中で行ってもよい。検体供給用デバイスは、検出装置外の付属部品であり、採取した検体を入れ特定の処理を行うための容器である。該デバイスには、バイアル、シリンジ、チューブ等が含まれる。また、該デバイスは容器だけでなく、検体を検出装置に添加供給する際に検体を濾過するための濾過手段を含んでいてもよい。検体添加用デバイスは、検体を収容する容器部分と容器内の検体を検出装置に添加供給する部分を含む。後者の検体を添加供給する部分は、検体を容器内から排出するためのノズル（開口部）を有する部分を有し、該部分は容器部分の蓋を兼ねることもできる。後者の検体を検出装置に添加供給する部分は、ノズル部分あるいは蓋部分ともいう。また、検体添加用デバイスが濾過手段を含む場合、検体供給用デバイスは濾過フィルターを含むフィルターハウジングからなるノズル部分と容器部分の２つの部品から構成されていてもよい。この場合のフィルターハウジングは、検体をフィルターに通す開口部とフィルターを通過した検体を排出する開口部を有し、両開口部の間にフィルターが存在する。容器は、例えば、検体をフィルターに圧力をかけて通すことができるシリンジ等を用いればよい。
本発明の装置において、被分析物質が、固相支持体上を展開移動して標識試薬部位で被分析物質―前記標識試薬複合体を形成し、前記複合体は捕捉試薬部位で捕捉試薬に捕捉され、固相支持体上に固定化されるまでの過程において、予め固相支持体上の任意の場所に配置された１つ以上の反応条件を調整、至適化する部材または試薬若しくはその両方を含む機能部位に接触し、あるいは機能部位を通過する。該部材または試薬を含む機能部位はその目的に応じて、検体供給部位と標識試薬部位の間、標識試薬部位と捕捉試薬部位の間に設ければよい。この場合、「検体供給部位と標識試薬部位の間」という場合、検体供給部位または標識試薬部位を含み、この場合検体供給部位または標識試薬部位が前記部材または試薬を含む機能部位を兼ねることになる。具体的には、検体供給部位または標識試薬部位を特定の機能を有する部材を用いて構成するか、あるいは検体供給部位または標識部位に特定の機能を有する試薬を含ませればよい。
予め固相支持体上に配置する機能部位を構成する部材は例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる人工ポリマー等が挙げられる。但し、これらのものには限定されず、例えば機能部位に濾過機能を持たせる場合、フィルターとして作用しうるあらゆる部材を用いることができる。該部材は、固相支持体上を展開する液を濾過するばかりでなく、反応条件を調整する試薬を含み得る。該機能部位は、固相支持体と毛管流により連絡しており、溶液が機能部位を通って固相支持体上を展開移動可能となるよう配置する。また機能部位が含む試薬は、酸性剤、塩基性剤、界面活性剤、変性剤等各種化学薬品や酵素・抗体・ビオチン・アビジン・プロテインA等各種生化学試薬が挙げられる。試薬の配置方法としては、検体が固相支持体上で展開する過程において接触するよう構成するならば、固相支持体上に塗布して乾燥させても構わないし、前記部材に含侵させ乾燥した物を固相支持体上または固相支持体の間に固相支持体が該部材を介して毛管流により連絡するように連続的に連結させても構わない。図１および図２は、本発明の装置の一例を示す図である。図に示すように機能部位として複数の機能部位を設けることができる。機能部位を設ける位置も適宜設定することができる。機能部位の設け方も図１の右の機能部位のように、固相支持体の上に載せるようにして設けてもよいし、図２の右の機能部位のように、固相支持体の間に固相支持体を毛管流により連絡するように設けてもよい。この場合、機能部位の部材となる素材（材料）は固相支持体の素材と同じであっても異なっていてもよい。図２の右の機能部位の場合、展開移動する検体等の流体の全てが機能部位と接触し、機能部位を通過し得るので、より効果を奏することができる。また、機能部位を構成する部材を用いずに、機能部位を固相支持体に直接含ませてもよい。例えば、後述の不純物を吸着除去し得る物質を固相支持体上に塗布したり含浸させたりすることにより含ませればよい。固相支持体上の機能部位を含ませる部位としては、検体供給部位と標識試薬部位の間、標識試薬部位と捕捉試薬部位の間があるが、検体供給部位と標識試薬部位の間が好ましい。
前記機能部位の機能の一つは検体の前処理機能であり、例えば濾過機能または、機能部位の部材を形成する素材による疎水的、静電的等物理的吸着による検体中の不純物の除去である。ここで、不純物とは固相支持体上における検体の展開移動を阻害し、あるいは固相支持体上で被分析物質と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬が特異的に結合する反応および被分析物質−標識試薬の複合体と捕捉試薬が特異的に結合する反応を阻害し得る物質をいう。前述のように、検体としては多種のものを用いることができるが、検体により特有の不純物が含まれることがある。例えば、血液検体には、フィブリンや赤血球が存在し、鼻腔や咽頭ぬぐい液等にはコンドロイチン硫酸等の多糖類が存在し、糞便等には種々の固形物が存在する。機能部位の部材として多孔性の繊維を用いれば該部材はフィルターとして濾過機能を発揮し、検体中の不純物を除去することができる。不純物の除去により被分析物質または被分析物質−標識試薬複合体は単離され、それぞれ標識試薬または捕捉試薬と特異的に結合できる状態になる。また前記機能部位の別の作用として、前記試薬を含侵させた場合は前記試薬の安定した保持が挙げられる。さらに、機能部位と固相支持体の溶液展開速度、溶液吸収量の差による前記機能部位に含まれる試薬の作用効果の時間及び濃度勾配を調節する機能も有する。
前記機能部位の機能の一つである前処理機能は、検体からの被分析物質の抽出も含む。臨床検体中の被分析物質を検出する場合は、被分析物質は微生物や細胞等の細胞膜、細胞壁、細胞内小器官等あるいは細胞間物質等の生体由来マトリックスに存在する場合が多い。例えば、細菌感染症やウイルス感染症を検出する場合、検体中の細菌やウイルスの存在を検出するために、細菌の細胞壁等に存在するタンパク質等の物質を検出する。従来の検出法においては、あらかじめ検体を酸、アルカリ溶液や界面活性剤で前処理し、細胞膜や細胞壁に存在する前記物質を可溶化することにより抽出し抽出物を検体供給部位に供給して検出していた。本発明の装置においては、固相支持体上で被分析物質の抽出も行うことができる。すなわち、固相支持体上に展開移動している検体が、機能部位に含まれる酸・塩基・界面活性剤等各種化学薬品や酵素・抗体・ビオチン・アビジン・プロテインA等各種生化学試薬と接触し、微生物及び細胞マトリックスが破壊され、さらに破壊された不純物が吸着等により検体中から除去され、被分析物質のみが単離され展開移動する。
また機能部位の別の機能として、被分析物質と標識試薬が抗原−抗体反応の場合に、特異的結合反応を生じやすくするようにpH・無機塩類濃度を至適範囲に調整し、かつ特異反応を増強する機能が挙げられる。ここで、至適範囲とは一定の幅を有する範囲であり、反応が進行するのに好適な範囲をいう。このような機能を有する試薬として、界面活性剤、高分子ポリマー、酸性化合物、塩基性化合物等の試薬が挙げられる。例えば、前述のように検体を検出装置に供給する前段階で、あるいは固相支持体上で前処理した場合、前処理に用いた酸、アルカリ、界面活性剤等により抗原−抗体反応が阻害される。この場合、本発明の装置により酸性あるいは塩基性に傾いた検体を中和することができ、あるいは界面活性剤を除去し、反応を至適条件で行わせることが可能になる。また、非特異反応を軽減する作用も挙げられ、この場合は、界面活性剤や高分子ポリマー、塩基性化合物等の試薬が用いられる。さらに、複数の被分析物質を検出するマルチアッセイの場合、固相支持体上に複数の標識試薬部位及び複数の捕捉試薬部位を有し、それぞれの捕捉試薬部位での反応条件を至適化し、あるいは各反応成分のクロス反応を軽減する機能を有する機能部位を設けることができる。この場合は、それぞれの捕捉試薬部位においてpH・無機塩類濃度を調整する界面活性剤、高分子ポリマー、酸性化合物、塩基性化合物等の試薬を機能部位に含ませる。
図１の装置の場合、例えば３つの機能部位のうち、左の機能部位は検体供給部位の上に位置し、検体供給部位と重なっており、中央の機能部位は検体供給部位および標識試薬部位と部分的に接触し毛管流により連絡している。さらに、右の機能部位は、固相支持体上の標識部位と捕捉試薬部位に位置する。例えば、左の機能部位で検体を前処理し、中央の機能部位で前処理した検体のpH等の条件を被分析物質と標識試薬の結合反応が至適になるよう調整し、右の機能部位で被分析物質と捕捉試薬の結合反応が至適になるように調整することができる。図１の装置の場合、検体供給部位と標識試薬部位は、空間的に離れて存在している。
以下、本発明の具体的な態様を図に基づき説明する。
図３は、不純物濾過機能を有している機能部位を用いた本発明の装置を示し、一例として鼻腔また咽頭拭い液からインフルエンザウィルスを検出する場合が挙げられる。この場合、検体供給部位２と標識試薬部位３の間に、鼻腔または咽頭拭い液中に含まれる非特異反応成分であるコンドロイチン硫酸等のムコ多糖類を凝集させるDEAE−Dextran等の試薬を含ませ乾燥させた多孔質で濾過機能を持ち合わせた機能部位１を配置する。検体である咽頭拭い液を任意の浮遊液に浮遊して、浮遊液を検体供給部位に添加または検体供給部位２のみを前記浮遊液に浸漬することで、検体供給部位２に検体を供給する。検体は検体供給部位２から機能部位１に展開移動し、試薬と接触することでコンドロイチン硫酸等のムコ多糖類が凝集し、且つ濾過機能を持ち合わせた機能部位において捕捉され、標識試薬部位３に展開移動できないことで、非特異反応を抑制することができる。図３に示す装置の場合、機能部位が特定の部材からなり、さらに特定の試薬を含むことにより、検体中の不純物を除去する前処理機能を有する。
糞便等の固形物が多く含まれる検体の場合、フィルター等の濾過機能を有する部材を機能部位として用いればよい。フィルターとして作用しうる部材は当業者ならば容易に選択することができる。また特定の不純物が含まれる検体の場合は、該不純物を吸着または凝集し展開移動を阻止し得る部材を用いればよい。検体中の不純物を除去しうるためには、不純物を吸着または凝集させうる物質を機能部位の部材に浸潤させ乾燥させておけばよい。図３においては機能部位として固相支持体とは別の部材を用いているが、図８のように不純物を吸着または凝集させる物質は、固相支持体に吸着等により含ませることもできる。図８に示す装置の場合、検体供給部位２と標識試薬部位３との間の固相支持体に物質を含ませている。このような例として、黄色ブドウ球菌の存在が疑われる菌混合液からの大腸菌、緑濃菌等の細菌の抗原、特に前記菌混合液からの多剤耐性ブドウ球菌（MRSA）細胞壁に存在するペニシリン結合蛋白（PBP2’）の検出の場合が挙げられる。黄色ブドウ球菌の細胞壁中に含まれるプロテインAは免疫グロブリンGのFc部分と特異的に結合するため、標識試薬、あるいは捕獲試薬と非特異反応を起こすことが予想される。
検体中から被分析物質を抽出あるいは単離する等の目的で、採取した検体を検体供給部位に供給する前に前処理液で処理する場合は、非特異反応を回避する為に前処理に用いる前処理液中に不純物吸着物質を添加する方法が考えられる。しかしこの方法では、採取した検体と前処理液を反応させた後の反応液に存在する物質のうち、検体供給部位に供給されず最終的な試験判定に影響を与えない不純物に対しても不純物吸着物質を準備する必要があるため、過剰に不純物吸着物質を必要とするという問題がある。また、不純物吸着物質の添加を原因として、長期保存時の前処理液に塩析効果等による沈殿や濁り、不純物吸着物質の分解、変性による非特異吸着効率の低下等を生じてしまう可能性があるという問題がある。一方、本発明の方法においては、検体供給部位２と標識試薬部位３の間に不純物を吸着する物質を含む部位を機能部位１として設けることで反応液中の試験判定に影響を与える不純物に対してのみ不純物吸着物質を準備すれば良いので、不純物吸着物質の削減を図ることが可能である。従って、長期保存時の前処理液の無用な沈殿や濁り、不純物吸着物質の分解、変性による非特異吸着効率の低下等を避けることができる。
具体的には、上記菌混合液を用いる場合、検体供給部位２と標識試薬部位３の間に、プロテインAと吸着する物質を機能部位１として設けることで上記問題が回避でき、用いる不純物吸着物質を減らすことが可能となる。例えば、前記プロテインAと吸着する物質として免疫グロブリンGが挙げられる。免疫グロブリンGとプロテインAのアフィニティは免疫グロブリンGの由来とサブクラスにより、強弱の差が見られるので、プロテインAとのアフィニティが強いものを用いることが望ましい。一般的にヒト由来の免疫グロブリンGではIgG1、IgG2、IgG4のサブクラスがプロテインAと強いアフィニティを示し、マウス由来の免疫グロブリンGではIgG2a、IgG2b、IgG3のサブクラスがプロテインAと強いアフィニティを示しIgG1のサブクラスは弱いアフィニティを示す。ラット由来の免疫グロブリンGはサブクラスによらず殆ど結合しない。検体である菌懸濁液を検体供給部位に添加、または検体供給部位２のみを前記菌懸濁液に浸漬すことで、検体供給部位２に検体を供給する。前処理が必要な場合は前処理済みの菌懸濁液を検体供給部位に添加、または検体供給部位２のみを前処理済み菌懸濁液に浸漬した後に、検体供給部位２に検体を供給する。検体は検体供給部位２から機能部位１に展開移動し、抗体等の不純物吸着物質と接触することでプロテインAを吸着し、標識部位３および捕獲試薬部位４に展開移動できないことで非特異反応を抑制することができる。グループGの連鎖球菌の細胞壁中に含まれるプロテインGも免疫グロブリンGのFc部分と特異的に結合するため、標識試薬、あるいは捕獲試薬と非特異反応を起こすことが予想され、この非特異反応の回避にも上記方法を同様に用いることができる。また、プロテインAは免疫グロブリンGのFc部分と特異的に結合するので、不純物吸着物質として上記アフィニティの強い抗体のFc部を用い、捕捉試薬及び／又は標識試薬としてFc部を除いた抗体を用いることで、さらに非特異反応を抑えた検出系を組むことができる。また、捕捉抗体及び標識試薬に用いる抗体に対する抗体を含む検体の可能性も考えられるが、この場合、これら捕捉抗体及び標識試薬に用いる抗体に対する抗体と特異的に吸着する物質を不純物吸着物質として用い機能部位１に設けることで非特異反応を抑えることができる。例えば、マウスに対する異好性抗体HAMA(human anti mouse antibody)は数％から数十％の頻度で、ヒト血清中に存在することが示されており、HAMAに対する抗体を不純物吸着物質として用い機能部位１に設けることで非特異反応を抑えることができる。
検体が血液の場合、フィブリンや赤血球が不純物として挙げられ、これらの除去のためには抗フィブリン抗体や抗赤血球抗体を用いればよい。検体が糞便の場合は筋組織、骨片、筋体の死骸、脂肪等が上げられ、これらの除去のためにはカオリン鉱物やベントナイト鉱物等を用いればよい。
図４は、複数の被分析物質を検出することができるマルチ検出装置において、各被分析物質の反応条件を至適に調整しうる装置を示し、一例としてインフルエンザウィルスのＡ型抗原及びＢ型抗原を検出する場合が挙げられる。この場合は、Ａ型標識試薬複合体及びＢ型標識試薬複合体が含まれる標識試薬部位３とＡ型抗原−Ａ型標識試薬複合体を捕捉する捕捉試薬部位４及びＢ型抗原−Ｂ型標識試薬複合体を捕捉する捕捉試薬部位４’を固相支持体上に設け、捕捉試薬部位４と捕捉試薬部位４’の間にＡ型抗原−Ａ型標識試薬複合体と捕捉試薬部位４’との結合を抑制するNaCl等の試薬を含ませ乾燥させた部材を機能部位１として配置する。この場合、試薬を固相支持体に直接含ませてもよい。検体供給部位２には予めＡ型抗原が結合しやすく、Ｂ型抗原が結合しにくいよう構成された浮遊液に浮遊された検体が供給され、Ａ型抗原及びＢ型抗原は展開移動して標識試薬部位３にてＡ型抗原−Ａ型標識試薬複合体及びＢ型抗原−Ｂ型標識試薬複合体が形成される。前記Ａ型抗原−Ａ型標識試薬複合体は捕捉試薬部位４に捕捉されるが、一部の前記Ａ型抗原−Ａ型標識試薬複合体とＢ型抗原−Ｂ型標識試薬複合体が捕捉試薬部位４’に展開移動する際に前記機能部位１を通過することで、展開液にＡ型抗原−Ａ型標識試薬複合体と捕捉試薬部位４’との結合を抑制するNaCl等の試薬が放出され、Ａ型抗原−Ａ型標識試薬複合体と捕捉試薬部位４’のクロス反応が抑制される。クロス反応を抑制する物質としては、NaCl等の塩類の他、イオン性界面活性剤が挙げられる。また、pHを調整してもよく、この場合は、緩衝液、酸性物質、塩基性物質、無機塩、有機塩、アミノ酸等を試薬として機能部位に含ませればよい。機能部位に含ませるこれらの試薬の濃度や塩は、検体の種類や至適条件により適宜決定すればよい。一般的には、反応時に塩濃度が至適範囲である1.5M〜50mMになるように、pHが5.5〜8.5になるように、アミノ酸が５％(w/vol)〜10％(w/vol)になるように設定すればよい。
また、クロス反応が生じ得ない複数の被分析物質を一度に検出する場合も、物質によって抗原−抗体反応の至適条件が異なる場合がある。この場合、それぞれの被分析物質に対する捕捉試薬部位の上流に、反応条件を至適化する試薬を含む機能部位を設ければよい。
図５は、予め前処理した検体を至適条件にし得る本発明の装置を示し、例えば、MRSAの細胞壁に存在するPBP2’を検出する場合が挙げられる。この場合、PBP2’の抽出は塩基性溶液で行われるため、検体は強塩基性であり、そのままでは抗原−抗体反応は阻害される。従って、検体供給部位２と標識試薬部位３の間にアルカリ条件のpHを中性にする酸性試薬を含ませた部材を機能部位１として配置する。部材を用いる代わりに、固相支持体に酸性試薬を含ませ、機能部位を設けてもよい。細胞壁を破壊するため、MRSA菌体を強アルカリ条件下の浮遊液に浮遊した後、検体供給部位２へ供給する。検体は検体供給部位２から機能部位１に展開移動し、試薬と接触することで展開中浮遊液のpHが中性域に調整されることにより、PBP2’は中性条件下において標識試薬部位３に展開移動し、安定した状態で標識試薬と特異的に結合することができる。
さらに、本発明の装置は、検体を前処理する機能を有していてもよい。この場合、検体供給部位２と標識試薬部位３の間に検体を処理するための試薬、例えば塩基性物質、酸性物質、界面活性剤等を含む機能部位１を配置する。この場合、前処理によりpH等の条件の変わった検体を反応に至適な条件にする必要があり、固相支持体上の前処理するための部位の下流に、前記の条件を至適にする他の機能部位を設ければよい。
例えば、大腸菌、サルモネラ等の細菌の抗原、特に加熱処理に弱い鞭毛（H抗原）を検出する場合、検体供給部位２と標識試薬部位３の間に、ホルマリン等の試薬を含ませ乾燥させた多孔質で濾過機能を持ち合わせた機能部位１を配置する。検体である咽頭拭い液を任意の浮遊液に浮遊して、浮遊液を検体供給部位に添加または検体供給部位２のみを前記浮遊液に浸漬すことで、検体供給部位２に検体を供給する。検体は検体供給部位２から機能部位１に展開移動し、試薬と接触することで菌体表面がホルマリンによってH抗原が破壊されることなく安定して不活化されることにより、H抗原を検出することができる。
例えば、大腸菌、溶血レンサ球菌、レジオネラ、カンピロバクター等の糖鎖抗原を検出する場合、糖鎖抗原の抽出は酸性溶液で行われるため、検体は酸性であり、そのままでは抗原−抗体反応は阻害される。従って、検体供給部位２と標識試薬部位３の間に酸性条件のpHを中性にする塩基性試薬を含ませた部材を機能部位１として配置する。部材を用いる代わりに、固相支持体に塩基性試薬を含ませ、機能部位を設けてもよい。菌体から糖鎖抗原を剥離するため、菌体を酸性条件下の浮遊液に浮遊した後、検体供給部位２へ供給する。検体は検体供給部位２から機能部位１に展開移動し、試薬と接触することで展開中浮遊液のpHが中性域に調整されることにより、糖鎖抗原は中性条件下において標識試薬部位３に展開移動し、安定した状態で標識試薬と特異的に結合することができる。
図６はまた、糖鎖抗原の抽出を亜硝酸によって行う場合は亜硝酸自体が酸性が強く危険なため、検体供給部位２と機能部位１との間に亜硝酸ナトリウムを含ませた部材を機能部位１’として配置する。部材を用いる代わりに、固相支持体に亜硝酸ナトリウムを含ませた機能部位を設けてもよい。菌体を酢酸等の浮遊液に浮遊した後、検体供給部位２へ供給する。検体は検体供給部位２から機能部位１’に展開移動し、試薬と接触することで展開中の浮遊液の酢酸と亜硝酸ナトリウムの反応により遊離の亜硝酸が発生し、その亜硝酸の作用によって菌体から糖鎖抗原を剥離することができる。また、亜硝酸により剥離した糖鎖抗原は機能部位１’から機能部位１に展開移動し、中和試薬と接触することで展開中浮遊液のｐHが中性域に調整されることにより、糖鎖抗原は中性条件下において標識試薬部位３に展開移動し、安定した状態で標識試薬と特異的に結合することができる。
イムノクロマトグラフィー装置において、被分析物質と標識試薬および捕捉物質が結合する。被分析物質に結合するリガンドは、典型的には被分析物質が抗原の場合は、該抗原に特異的に結合する抗体、被分析物質が抗体の場合は該抗体が特異的に結合する抗原または抗体であり、被分析物質が核酸の場合は、該核酸に特異的に結合する核酸、抗体または結合タンパクであり、その他、被分析物質−リガンドの組合わせとして、受容体−リガンド、リガンド−受容体等の組合わせが挙げられる。標識試薬とは、前記リガンドと適当な標識物質を結合させたコンジュゲートであり、標識物質として、金コロイド等の金属コロイド、セレニウムコロイド等の非金属コロイド、着色樹脂粒子、染料コロイド及び着色リポソーム等の不溶性粒状物質やアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の発色反応を触媒する酵素、蛍光色素、放射性同位体等が挙げられる。捕捉試薬と標識試薬は同じ物質でもよいが、被分析物質中に該物質と結合する部位が一つしか存在しない場合は、標識試薬−被分析物質−捕捉試薬複合体が形成されない。従って、この場合捕捉試薬と標識試薬はそれぞれ被分析物質の異なる部位に結合する必要がある。固相支持体は毛管現象により試料検体が吸収され流動し得るものであれば、どのようなものであってもよい。例えば、支持体はニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、ポリスチレン等の天然、合成ポリマー、あるいはこれらの混合物からなる群から選択される。固相支持体は好ましくは短冊状のストリップの形状を有する。前記捕捉試薬の固相支持体への固定化は、吸着による方法、アミノ基、カルボキシル基等の官能基を利用して化学的に結合させる方法等、公知の方法で行えばよい。
本発明の方法に用いる検出装置は、さらに、対照用試薬を含んでいてもよく、さらに吸収部を含んでいてもよい。対照用試薬は限定されないが、例えば標識試薬中のリガンドが結合する物質を用いることができる。対照用試薬は、捕捉試薬部位の下流に固定化すればよい。吸収部は、捕捉部を通過した検体を吸収することにより、検体の流れを制御する液体吸収性を有する部位であり、検出装置の最下流に設ければよい。吸収部は例えば紙製のものをアブソーベントパッドとして用いればよい。
さらに、本発明の装置は、試薬を乾燥等の外部環境から保護するために、樹脂製のラミネートで前面または一部が覆われていてもよく、また容器（ハウジング）に収められていてもよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１ Ａ型インフルエンザウイルスの検出におけるコンドロイチン硫酸の非特異反応の除去（図３）
（1）金コロイド抗体の調製
10mLの金コロイドを取り、100mM炭酸カリウムでpHを7.0に調整する。２mMホウ酸溶液で透析、遠心分離し精製した抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を２mMホウ酸溶液で100μg/mLの濃度になるように調製する。調製した抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の最終濃度が10μg/mLとなる量を十分撹拌させながら金コロイドに加える。５分後10%BSAを1mL加え、穏やかに10分間ローテーターで撹拌する。全量を遠心管に移し、14000rpm、30分、４℃で遠心する。遠心後上清を吸引廃棄し、沈殿している金コロイドと抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の感作されたものに、10mMホウ酸緩衝液１mLで浮遊する。
(2)金コロイド抗体の乾燥化
前項で作製した金コロイド抗体を陽圧噴霧装置（BioDot社製、BioJet）を用いて6.0OD520、10μL/cmの速度、及び量で10mm×300mmのポリスチレン不織布に噴霧する。次いで減圧装置内で１時間減圧乾燥し、乾燥金コロイド抗体パッドとした。使用時には４mm間隔で裁断し、標識試薬部位３として用いた。
（３）DEAE-Dextranパッドの作製
ガラス系繊維濾紙を２〜10％DEAE-Dextran溶液に浸漬し、45℃で一晩乾燥させ、10mm×４mmに裁断し、機能部位１として用いた。
（４）固相支持体６及び捕捉試薬部位４及び対照部位５の設定
捕捉試薬として抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を2.0OD280になるよう調製した10mMトリス緩衝液（pH7.5）、及び対照用試薬としてAnti-Mouse IgG(Dako社）を3.8mg/mlになるよう調製した10mMリン酸溶液（pH7.5）をそれぞれ陽圧噴霧装置（BioDot社製、BioJet）を用いて1.04μl/cmで20mm×200mmのMillipore Highflow HF12004(Millipore)に塗布し45℃で60分乾燥させ、20mm×４mmに裁断し、固相支持体６として用いた。
（５）イムノクロマトグラフィー式検出装置の製作
トップラミネート８上に捕捉試薬部位４及び対照部位５を含む固相支持体６を配置し、標識試薬部位３、機能部位１、検体供給部位２としてガラス系繊維濾紙、吸収部位７として厚めの濾紙を用いて任意の場所に配置した。また、従来品として機能部位１がないイムノクロマトグラフィー式検出装置を作製し、比較対照とした（図７）。
（６）検出方法
陽性検体として、Ａ型インフルエンザウイルス抗原をリン酸緩衝液に浮遊させたものを使用した。また、非特異検体としてコンドロイチン硫酸を２％になるようリン酸緩衝液に浮遊したものを使用した。前項で制作した機能部位１を含む発明品と機能部位１を含まない従来品をそれぞれ各検体150μｌに検体供給部位２を浸漬して、コンドロイチン硫酸による非特異反応を比較試験した。
（７）試験結果
従来品は陽性検体に対して陽性反応を示したが、非特異検体に対しても陽性反応を示した。一方、発明品においては陽性検体に対して陽性反応を示し、非特異検体に対しては陰性を示した。
実施例２ MRSAのPBP2’の検出（図５）
（１）金コロイド抗体の調製
10mLの金コロイドを取り、100mM炭酸カリウムでpHを8.0に調製する。２mMホウ酸溶液で透析、遠心分離し精製した抗PBP2’抗体を2mMホウ酸溶液で40μｇ／ｍｌの濃度になるように調製する。調製した抗PBP2’抗体の最終濃度が２μg/mLとなる量を十分撹拌させながら金コロイドに加える。５分後10%BSAを１mL加え、穏やかに10分間ローテーターで撹拌する。全量を遠心管に移し、14000rpm、30分、４℃で遠心する。遠心後上清を吸引廃棄し、沈殿している金コロイドと抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の感作されたものに、10mMホウ酸緩衝溶液1mLで浮遊する。
（２）金コロイド抗体の乾燥化
前項で作製した金コロイド抗体を陽圧噴霧装置（BioDot社製、BioJet）を用いて0.5OD520、10μL/cmの速度、及び量で10mm×300mmのポリスチレン不織布に噴霧する。次いで減圧装置内で１時間減圧乾燥し、乾燥金コロイド抗体パッドとした。使用時には４mm間隔で裁断し、標識試薬部位３として用いた。
（３）中和パッドの作製
濾紙を0.5％非イオン性界面活性剤入りのリン酸緩衝溶液に浸漬し、45℃で一晩乾燥させ、1.8mm×４mmに裁断し、機能部位１として用いた。
（４）固相支持体６及び捕捉試薬部位４及び対照部位５の設定
捕捉試薬として抗PBP2’抗体を7.2μg/mになるよう調整した10mMリン酸緩衝液（pH7.5）、及び対照用試薬としてAnti-Mouse IgG（Dako社）を3.8mg/mlになるよう調製した10mMリン酸溶液（pH7.5）をそれぞれ陽圧噴霧装置（BioDot社製、BioJet）を用いて1.04μl/cmで20mm×200mmのMillipore Highflow HF12004(Millipore)に塗布し45℃で60分乾燥させ、20mm×４mmに裁断し、固相支持体６として用いた。
（５）イムノクロマトグラフィー式検出装置の製作
トップラミネート８上に捕捉試薬部位４及び対照部位５を含む固相支持体６を配置し、標識試薬部位３、機能部位１、検体供給部位２としてガラス系繊維濾紙、吸収部位７として厚めの濾紙を用いて任意の場所に配置した。また、従来品として機能部位１がないイムノクロマトグラフィー式検出装置を作製し、比較対照とした（図７）。
（６）検出方法
陽性検体としてMRSA、陰性検体としてMSSAをそれぞれ２白金耳採取し、0.1N NaOH 150μｌに浮遊し、95℃、３分間加熱した。冷却後、前項で製作した機能部位１を含む発明品と機能部位１を含まない従来品をそれぞれ各検体に検体供給部位２を浸漬して、中和パッドの機能を比較試験した。
（７）試験結果
従来品は陰性検体に対して陰性反応を示したが、陽性検体に対しても陰性反応を示した。一方、発明品においては陰性検体に対して陰性反応を示し、陽性検体に対しては陽性反応を示した。
実施例３ MRSAのPBP2’の検出におけるプロテインAによる非特異反応の回避（図８）
（１）金コロイド抗体の調製
10mLの金コロイドを取り、100mM炭酸カリウムでpHを8.0に調製する。2mMホウ酸溶液で透析、遠心分離し精製した抗PBP2’抗体を2mMホウ酸溶液で40μｇ／ｍｌの濃度になるように調製する。調製した抗PBP2’抗体の最終濃度が２μg/mLとなる量を十分撹拌させながら金コロイドに加える。5分後10%BSAを1mL加え、穏やかに10分間ローテーターで撹拌する。全量を遠心管に移し、14000rpm、30分、4℃で遠心する。遠心後上清を吸引廃棄し、沈殿している金コロイドと抗A型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の感作されたものに、10mMホウ酸緩衝溶液1mLで浮遊する。
（２）金コロイド抗体の乾燥化
前項で作製した金コロイド抗体を陽圧噴霧装置（BioDot社製、BioJet）を用いて０．５OD520、10μL/cmの速度、及び量で10mmx300mmのポリスチレン不織布に噴霧する。次いで減圧装置内で1時間減圧乾燥し、乾燥金コロイド抗体パッドとした。使用時には４mm間隔で裁断し、標識試薬部位３として用いた。
（３）固相支持体６及び機能部位１及び捕捉試薬部位４及び対照部位５の設定
機能部位１としてPBP2’を認識せず、プロテインAとの親和性の高いマウスIgG2aを3.8mg/mlになるように調整した10mM リン酸緩衝液（pH7.5）及び、捕捉試薬として抗PBP2’抗体を7.2μg/mになるよう調整した10mM リン酸緩衝液（pH7.5）、及び対照用試薬としてAnti-Mouse IgG（Dako社）を3.8mg/mlに成るよう調整した10mM リン酸溶液（pH7.5）をそれぞれ陽圧噴霧装置（BioDot社製、BioJet）を用いて1.04μl/cmで20mm×200mmのMillipore Highflow HF12004(Millipore)に塗布し45℃で60分乾燥させ、20mm×４mmに裁断し、固相支持体６として用いた。
（４）イムノクロマトグラフィー式検出装置の製作
トップラミネート８上に機能部位１及び捕捉試薬部位４及び対照部位５を含む固相支持体６を配置し、標識試薬部位３、検体供給部位２としてガラス系繊維濾紙、吸収部位７として厚めの濾紙を用いて任意の場所に配置した。また、従来品として機能部位１がないイムノクロマトグラフィー式検出装置を作製し、比較対照とした。（図８）
（５）検出方法
陽性検体としてMRSA、陰性検体としてMSSAをそれぞれ２白金耳採取し、希アルカリ溶液 150μｌに浮遊し、95℃、３分間加熱した。冷却後、リン酸緩衝液で中和し、前項で制作した機能部位１を含む発明品と機能部位１を含まない従来品をそれぞれ各検体に検体供給部位２を浸漬して、プロテインAによる非特異反応を比較試験した。
（６）試験結果
従来品は陽性検体に対して陽性反応を示したが、陰性検体に対しても陽性反応を示した。一方、発明品においては陽性検体に対して陽性反応を示し、陰性検体に対しては陰性を示した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (26)

  1. シート状の固相支持体上に少なくとも被分析物質を含むと推定される検体または該検体と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬との混合物を供給する検体供給部位および前記被分析物質―前記標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試薬部位を含むクロマトグラフィー式検出装置であって、検体供給部位と捕捉試薬部位の間に以下の機能(a)から(c)の一つまたは複数の機能を有する少なくとも一つの機能部位を設けたクロマトグラフィー式検出装置。
    (a) 検体を前処理する機能、
    (b) 検体中の被分析物質と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬が特異的に結合する反応の条件を至適化する機能、および
    (c) 被分析物質−標識試薬の複合体と捕捉試薬が特異的に結合する反応の条件を至適化する機能
  2. シート状の固相支持体上に少なくとも被分析物質を含むと推定される検体を供給する検体供給部位、被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬を固相支持体上で展開可能に保持した標識試薬部位および前記被分析物質―前記標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試薬部位が含まれる請求項１記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  3. 被分析物質と標識試薬が固相支持体と分離した部位で予め接触し、検体供給部位に被分析物質を含むと推定される検体と被分析物質に特異的に結合するリガンドを含む標識試薬との混合物が供給される請求項１記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  4. 検体供給部位と標識試薬部位が空間的に離れて設けられている請求項１または２記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  5. 検体を前処理する機能が検体から不純物を除去する機能および／または検体から被分析物質を抽出する機能である、請求項１から４のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  6. 検体を前処理する機能が被分析物質を抽出する機能であり、検体を前処理する機能を有する機能部位が検体から被分析物質を抽出するための試薬を含んでいる、請求項５記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  7. 検体から被分析物質を抽出するための試薬が、生物マトリックスを含む検体中の生物マトリックスから、アルカリ処理、酸処理または界面活性剤処理により被分析物質を抽出するための、塩基物質、酸性物質または界面活性剤である、請求項６記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  8. 検体を前処理する機能が、検体から不純物を除去する機能であり、検体を前処理する機能を有する機能部位が検体中の不純物を濾過、吸着または凝集する機能を有する、請求項５から７のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  9. 検体を前処理する機能を有する機能部位がフィルターからなり、該フィルターにより検体中の不純物が濾過される、請求項８記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  10. 検体を前処理する機能を有する機能部位が、不純物を吸着する試薬または不純物を凝集させる試薬を含む、請求項８または９記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  11. 検体を前処理する機能を有する機能部位が、不純物を吸着する試薬または不純物を凝集させる試薬を含み、不純物を吸着する試薬または不純物を凝集させる試薬が固相支持体中に含まれる請求項１０記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  12. 不純物を吸着する試薬または不純物を凝集させる試薬が固相支持体中の検体供給部位と標識試薬部位の間に含まれる請求項１１記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  13. 反応の条件を至適化する機能を有する機能部位が、反応条件を至適化するための試薬を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  14. 反応条件を至適化するための試薬により、反応系のpHが反応に至適な範囲に調整される請求項１３記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  15. 反応条件を至適化するための試薬により、反応系の塩濃度が反応に至適な範囲に調整される請求項１３記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  16. 試薬が、緩衝液、酸性試薬、塩基性試薬および界面活性剤からなる群から選択される請求項１３から１５のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  17. あらかじめ前処理した検体中の被分析物質がリガンドまたは捕捉物質と結合する反応の条件を至適化するための機能部位を有する、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  18. 異なる被分析物質を補足し得る複数の捕捉試薬部位を含むクロマトグラフィー式検出装置であって、少なくとも一つの捕捉試薬部位の上流に該捕捉物質と被分析物質との結合反応条件を至適化するための試薬を含む請求項１３から１７のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  19. 異なる被分析物質とそれぞれの被分析物質に対する捕捉試薬との間でクロス反応が生じ得る被分析物質であって、結合反応の条件を至適化することによりクロス反応を抑制する、請求項１８記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  20. 検体が細菌またはウイルスを含む検体であって、検体を前処理する機能を有する機能部位が細菌またはウイルスから被分析物質を抽出する機能を有する請求項５から１９のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  21. さらに、前処理した検体中の被分析物質がリガンドまたは捕捉物質と結合する反応の条件を至適化するための機能部位を有する請求項２０記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  22. 検体が鼻腔または咽頭拭い液であって、検体を前処理する機能を有する機能部位が、鼻腔もしくは咽頭拭い液中の多糖類を凝集させる試薬を含み、なおかつ濾過機能により凝集した多糖類を除去するフィルターからなる請求項５から２１のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  23. 被分析物質がＡ型インフルエンザウイルス抗原およびＢ型インフルエンザウイルス抗原を含み、Ａ型インフルエンザウイルス抗原を捕捉する捕捉試薬部位およびＢ型インフルエンザウイルス抗原を捕捉する捕捉試薬部位を含むクロマトグラフィー式検出装置であって、Ａ型インフルエンザウイルス抗原とＢ型インフルエンザウイルス抗原を捕捉し得る捕捉試薬との結合および／またはＢ型インフルエンザウイルス抗原とＡ型インフルエンザウイルス抗原を捕捉し得る捕捉試薬とのクロス反応による結合を抑制し得る試薬を含む機能部位を含む請求項５から２１のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー式検出装置。
  24. 標識試薬が、酵素または不溶性粒状物質により標識されたリガンドである請求項１から２３のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  25. 被分析物質とリガンドとの結合および被分析物質−リガンド複合体と捕捉試薬との結合が、抗原−抗体反応により生じる、請求項１から２４のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー式検出装置。
  26. 固相支持体がニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロンおよびポリエーテルスルホンからなる群から選択される、請求項１から２５のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー式検出装置。
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