JPS63157997A - 新規リンホカイン関連ペプチド - Google Patents

新規リンホカイン関連ペプチド

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JPS63157997A
JPS63157997A JP62248168A JP24816887A JPS63157997A JP S63157997 A JPS63157997 A JP S63157997A JP 62248168 A JP62248168 A JP 62248168A JP 24816887 A JP24816887 A JP 24816887A JP S63157997 A JPS63157997 A JP S63157997A
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dna
mrp
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cells
encodes
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JP62248168A
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カレル　ヘリット　オディンク
クラーク ロジャー
ニコ　セルレッティ
ヨーゼフ　ブリューゲン
ラヨス　タルツァイ
クレメンス　ゾルク
バルター　ビーゼンダンガー
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Novartis AG
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトマクロファージ遊走阻止因子に関連する
ポリペプチド、これらの製造方法、該ポリペプチドをコ
ードするｍＲＮＡ、　Ｄ　Ｎ　Ａ及びハイブリドベクタ
ー、この様なハイブリドベクターにより形質転換された
宿主、該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体及び
ポリクローナル抗体、並びに炎症状態及びのう包繊維症
の診断方法に関する。
〔発明の背景〕
ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、抗原、
マイトジェン等により刺激された場合にリンパ球及び単
球又はマクロファージにより分泌される生物学的に活性
な可溶性ポリペプチドを包むいわゆるリンホカイン群に
属する。リンホカインの他の例は免疫インターフェロン
（γ−インターフェロン）、インターロイキン１及び２
、並びにマクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）である。
これらのリンホカインは免疫系の種々の細胞タイプの分
化、活性化及び増殖を調節する。
既知の技術によれば、ヒトＭＩＦはマクロファージの遊
走能力を阻害する一群のポリペプチドから成る。ヒトＭ
ＩＦは活性化されたリンパ球、Ｔ−細胞及びＢ−細胞に
よってのみならず、非−リンパ系細胞１、例ｔａ繊維芽
細胞及び若干の腫瘍細胞によっても分泌される。ＭＩＦ
はＴ−インターフェロン、マクロファージ活性化因子（
ＭＡＦ）及び他のリンホカインから明瞭に区別され得る
。
ヒ）ＭＩＦは炎症反応（“遅延型過敏反応”）の初期に
おいて決定的役割を演する。このものは、単球及び休止
組織マクロファージの成熟、炎症マクロファージへの分
化を誘導する。従って、ヒトＭＩＦ及び関連蛋白質は炎
症状態の重要な指標であり、そして免疫調節疾患及び慢
性炎症疾患の治療に有用である。
コンカナバリンＡにより刺激されたヒト単核細胞からの
分子量８ｋＤのＭＩＦ蛋白質の単離及び精製がヨーロッ
パ特許出願ＥＰ　１６２，８１２に記載されている。こ
の蛋白質はＮ−末端アミノ酸配列（Ｉ６アミノ酸）及び
そのマクロファージ遊走阻止活性、並びに選択されたモ
ノクローナル抗体に対するその免疫反応性により特徴付
けられる。１４ＫＤ、２８ｋＤ及び４５ｋＤの他のＭＩ
Ｆ蛋白質が記載されているが、あまり特徴付けられてい
ない。１４ｋＤのＭＩＦ蛋白質は、８ｋＤＭＩＦ蛋白質
と同じＮ−末端アミノ酸配列（アミノ酸２〜１９）を有
することが見出された。
ＥＰ　１６２，８１２によれば、ヒトＭＩＦ及びその蛋
白質は刺激されたヒト細胞の培養上清又は濾液から得ら
れる。適当なヒト細胞の培養に内在する問題点、新鮮な
ヒ）ＭＩＦ−生産細胞の限定された入手可能性、及び単
一蛋白質のめんどうな単離のため、この方法はヒ）ＭＩ
Ｆの入手可能性を制限する。
近年における組換ＤＮＡ技法の急速な進歩は、この様な
化合物の一次天然源から独立してポリペプチドを多量に
製造するための一般的方法を提供する。所望のポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡの同定がこのアプ
ローチの成功のために必須である。もし、部分的アミノ
酸配列情報が入手可能であれば、化学的に合成された核
酸プローブが、所望のポリペプチドを生産する細胞由来
のｍＲＮＡの混合物又はＤＮＡライブラリーからのそれ
ぞれコードｍＲＮＡ又はＤＮＡの単離を導くであろう。
今まで、所望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又は
ＤＮＡの単離についての多くの例が知られてきており、
そして一般的方法が原理的に記載されているが、個々の
新しい特定の問題点が特定の場合への技術の適合を要求
する。
所望のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ又は相補
的ＤＮＡを一旦手にしたなら、適当な発現ベクターの調
製、これらのベクターによる宿主の形質転換、形質転換
された宿主の発酵及び発現されたポリペプチドの単離は
標準的方法に従う。
やはり、ＤＮＡの安定な導入、選択された宿主生物体に
おける所望のポリペプチドの十分に高い発現、及び純粋
な、生物学的に活性な、単離された蛋白質の許容される
収量を得るためには、前記の方法も特定の問題に適合さ
れなければならない。
さらに、組換ＤＮＡ技法は、宿主生物体に導入されるコ
ードＤＮＡを変異せしめ又は変化せしめることによりポ
リペプチド変形体を製造し、これによって天然に単一ポ
リペプチド構造中に見出される活性成分の潜在的な用途
を拡大することを可能にする。
慢性骨髄性白血病細胞から単離されたのう包繊維症（ｃ
ｙｓｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ）抗原（ＣＦ抗原）につ
いての最近の発表（Ｊ、Ｒ，Ｄｏｒｉｎ等、Ｎａｔｕｒ
ｅ　１９８７゜」胆、　６１４）は、このＣＦ抗原がこ
の発明のＭＩＦ−関連蛋白質ＭＲＰ−８と同一であるか
、又は非常に関連していることを示唆している。しかし
ながら、この発明はＭＲＰ−８かのう包繊維症（ｃｙｓ
ｔｉｃ　ｆｉｂｒｏ−ｓｉｓ）を示すものではないとい
う証拠を提供する。
同時に、他のＭＩＦ−関連蛋白質ＭＲＰ−１４の免疫学
的決定に基き、のう包繊維症の確実な診断法がこの発明
により記載される。
以下余白 〔発明の目的〕 高純度且つ十分な量のヒトマクロファージ遊走阻止因子
（ＭＩＦ）関連ポリペプチド、及びこれらの製造方法を
提供するのがこの発明の１つの目的である。組換ＤＮＡ
技法によって工業的ポリペプチド合成の問題点が解決さ
れ得る。従って、この発明の他の目的は、ＭＩＦ−関連
ペプチドをコードする天然起源のｍＲＮＡ及びＤＮＡと
ハイブリダイズするＤＮＡ５Ｍ１．Ｆ−関連ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ及びハイブリドベクター、並びに
該ベクターにより形質転換された宿主を提供することで
ある。他の目的は、前記ハイブリドベクター、形質転換
された宿主、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の製造方法、さらに
は有効量のＭＩＦ＝関連ポリペプチドを含有する医薬及
びその製造方法、並びに前記ポリペプチドの使用である
。
ＭＩＦ−関連ポリペプチドに向けられたモノクローナル
抗体及びポリクローナル抗体、このようなモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマセルライン、該抗体及
びハイブリドーマセルラインの製造方法、並びにこれら
の抗体の使用がこの発明の他の目的である。特定の目的
は炎症状態及びのう包繊維症の確実な診断方法である。
これらの目的が本発明により達成された。
〔発明の記載〕
この発明は、見かけ分子量約８ｋＤ又は約１４ｋＤのヒ
トマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチド（ＭＲＰ）
、並びにその変異体、断片及び誘導体に関する。
この発明は特に、次の式（Ｉ）： Ｚ、−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−１１ｅ−１１ｅ
−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−
３ｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐ
ｈｅ−Ｈｉｓ−八ｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
Ｔｙｒ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａ
ｌａ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−八ｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ
−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｖａ１４１
ｅ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ
−旧５−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−旧５−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｕ−５ｅｒ−旧５−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ （Ｉ） （式中、ＺＩは水素、アシル又はアミノ酸残基メチオニ
ンである、） で表わされるヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプ
チド（ＭＲＰ−８）並びにその変異体、断片及び誘導体
；並びに次の式（■）： Ａｓｎ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−１１ｅ−八
５ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−■ｓ−Ｐｒｏ−
Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒ
ｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−八ｓｎ−Ｐｈｅ
−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−
Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｈ
ｉｓ−１１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−へ５ｐ−Ｌｅｕ−＾５
ｐ−Ｔｈｒ−八ｓｎ−＾１ａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−
Ｉ　ｌｅ−、。
Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｒｐ−＾１ａ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｈｉ
ｓ−Ｈｉｓ４ｉｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒ。
（ＩＩ） （式中、Ｚ２は水素、アシル、又は１〜５個のアミノ酸
から成る場合によってはアシル化されているペプチド残
基である、） で表わされるヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプ
チド［ＭＲＰ−１４）並びにその変異体、断片及び誘導
体に関する。
アシルＺＩ又はＺ２は、天然有機又は無機酸のアシル基
、例えば蟻酸、アルカンカルボン酸、例えば酢酸、プロ
ピオン酸、バルミチン酸もしくはミリスチン酸、又はリ
ン酸もしくは硫酸、好ましくは酢酸のアシル基である。
ペプチドＺ２は１個、２個、３個、４個又は５個の天然
アミノ酸から成り、そして例えばＭｅｔ−１Ｔｈｒ−Ｃ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−１又はＭｅｔ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ
−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−である。この様なペプチド残基はＮ
−末端アミノ基においてアシル基、例えばＺｌ又はＺ２
のアシルとして定義されたアシル基、例えばアセチルに
より置換されていてもよく、そして例えばアセチル−Ｔ
ｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−である。
この発明の変異体は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化金物の
１個又は複数個、特に１個、２個又は３個の単一のアミ
ノ酸が異るアミノ酸により又は結合により置き換えられ
ているポリペプチドである。
この様な変異体はＤＮＡのレベルにおいて自然に又は化
学的に誘導された変異により、又は化合合成によるアミ
ノ酸の置き換えにより形成され得る。
この発明の断片は２０個以上の連続するアミノ酸を含ん
で成る式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の断片である。こ
の発明の断片はＤＮＡレベルでの自然の又は化学的に誘
導された変異によってアミノ酸をコードするトリプレッ
トを終止コドンに変化せしめることによって、あるいは
ペプチドレベルにおいてペプチド結合を化学的に又は酵
素的に開裂せしめることによって形成することができる
。
式（Ｉ）又は（ｆｆ）のポリペプチドの誘導体、又はそ
の変異体もしくは断片は、例えば、官能基、例えばアミ
ノ、ヒドロキシ、メルカプト又はカルボキシ基が誘導体
化、例えばグリコシル化、アシル化、アミド化又はエス
テル化されているものである。グリコシル化誘導体にお
いて、炭水化物残基又はオリゴサツカライドはアスパラ
ギン、セリン及び／又はトレオニンに連結される。アシ
ル化誘導体は天然有機酸又は無機酸、例えば酢酸、リン
酸又は硫酸により、アミノ基において、特にＮ−末端ア
ミノ基において、又はヒドロキシ基、特にチロシン又は
セリンのヒドロキシ基において置換されている。エステ
ルは天然アルコールの、例えばメタノール又はエタノー
ルのエステルである。
この発明の誘導体はまた、式（Ｉ）の化合物のもしくは
式（ＩＩ）の化合物のダイマー、その変異体又は断片で
あって、システィン残基のメルカプト基が酸化された形
態ジスルフィド形であって分子間Ｓ−Ｓ結合を提供して
いるもの、並びに式（Ｉ）の化合物又はその変異体もし
くは断片と式（ＩＩ）の化合物又はその変異体もしくは
断片との混合二量体（ダイマー）であってシスティン残
基の酸化されたメルカプト基を介して結合しているもの
である。
他の誘導体は塩、特に医薬として許容される塩、例えば
金属塩、例えばアルカリ金属塩及びアルカす土類金属塩
、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、
カルシウム塩もしくは亜鉛塩、又はアンモニアもしくは
適当な有機アミン、例えば低級アルキルアミン、例えば
トリエチルアミン、ヒドロキシ−低級アルキルアミン、
例えば２−ヒドロキシエチルアミンとの塩等である。
Ｚ、がＭｅｔ、すなわちアミノ酸残基メチオニンである
式（Ｉ）の化合物ＭＲＰ−８が好ましい。このポリペプ
チドの有効分子量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕ
−Ｉａｒ　ｗｅｉｇｈｔ）は１０．８ｋＤであるが、ド
デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧｔり上でこのポリペプチドは標準的マ
ーカー蛋白質と比較した場合８ｋＤのペプチドとして泳
動する。
さらに、Ｚ２がＴｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−又は
水素である式（ＩＩ）の化合物ＭＲＰ−１４が好ましい
。後者の化合物はＭＲＰ−１４ｄとも称される。これら
のポリペプチドの有効分子量はそれぞれ１３．１ｋＤ及
び１２．６ｋＤであるが、５Ｏ３−ＰＡＧＥ上で標準的
マーカー蛋白質と比較した場合１４ｋＤのペプチドとし
て泳動する。
好ましい誘導体は、ＺｌがＭｅｔである式（Ｉ）のＭＲ
Ｐ−８のダイマー、Ｚ２がＴｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍ
ｅｔ−である式（ＩＩ）のＭＲＰ−１４のダイマー、及
びＺｌがＭｅｔである弐〇）のＭＲＰ−８とＺ２がＴｈ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−である式（ＩＩ）のＭＲ
Ｐ−１４との混合ダイマーであり、いずれもシスティン
残基の酸化されたメルカプト基を介して結合している。
この発明はさらに、ヒトマクロファージ遊走阻止因子関
連ペプチド並びにその変異体及び誘導体の製造方法に関
し、この方法は、目的化合物を含有する溶液、例えば刺
激された正常ヒト白血球の又は遺伝子操作された微生物
もしくは永久哺乳類セルラインの前精製された抽出液、
細胞上清又は培養濾液をクロマトグラフ法により精製し
、そして該化合物を単離し、そして所望によりこれから
断片又は誘導体を調製することを特徴とする。
式（ＩＩ）の化合物又はその誘導体を含有する、刺激さ
れた正常ヒト白血球の前精製された抽出液、細胞上清及
び培養濾液はＥＰ　１６２，８１２に記載されている様
にして調製される。特に、正常ヒト単核綿胞がマクロフ
ァージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）及び他のリンホカインを
生産するように適当な添加物、例えばコンカナバリンＡ
又はフィトヘマグルチニンにより刺激され、そして通常
の方法に従って培養される。次に、抽出物、細胞上清又
は培養濾液が、ヒトＭＩＦに対して特異的な抗体、例え
ばモノクローナル抗体ＩＣ５が負荷されたカラム上での
イムノアフィニティークロマトグラフィーにより前精製
される。
ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチドを含有す
る遺伝子操作された微生物又は永久哺乳類セルラインの
抽出物、細胞上清及び培養濾液が得られ、そして後で検
討するように前精製される。
目的化合物の調製のために期待されるクロマトグラフ法
はイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマ
トグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシアパタイト上でのクロマトグラフィ
ー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等である。
イオン交換クロマトグラフィー用の適当なキヤリヤー材
料は有機又は無機起源のものであることができ、例えば
架橋アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、
スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー、セルロース等
によるものであることができる。このキャリヤー材料は
塩基性官能基、例えば第三アミノ官能基、第四アンモニ
ウム基、又は酸官能基、例えばカルボン酸基又は硫酸基
を担持する。好ましいイオン交換体の例にはジエチルア
ミノエチル ロキシプロピル−アンモニオエチル官能基ヲ担持するも
の、及びスルホプロピル（Ｓ　Ｐ）又はカルボキシメチ
ル（ＣＭ）官能基を担持するものが挙げられ、官能基は
通常の液体クロマトグラフィー、ファストプロティン（
ｆａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）液体クロマトグラフィー（
ＰＰＬＣ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）のいずれかに適するようにキャリヤーに付加されてい
る。イオン交換クロマトグラフィーによる分離及び精製
は確立された方法に従って、例えば、増加する量の塩、
例えば塩化ナトリウムを含有するｐｌ＋５〜ｐＨ９の水
性緩衝液中で行ねれる。
ゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーのために適
当なキャリヤー材料は架橋デキストラン、アガロース、
適切に修飾されたポリアクリルアミド又はシリカ等を包
含する。場合によってはこれらのキャリヤーはヒドロキ
シ官能基、例えば１−ヒドロキシ又は１．２−ジヒドロ
キシ−低級アルキル基を担持する置換基により修飾され
る。クロマトグラフ材料は、５，０００〜２０，　００
０ダルトン（５ｋＤ〜２０ＫＤ）の分子量の範囲のペプ
チドの最適な分離を示すように選択される。この様なゲ
ル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーは、種々の量
の塩、例えば塩化ナトリウムを含有するおよそ中性の水
性緩衝液を用いて上記の通常液体クロマトグラフィー、
ＦＰＬＣ又はｆｆＰＬｃのために適当なカラム中で行う
ことができる。
逆相クロマトグラフィーは、疎水性基、例えば１〜２０
個の炭素原子、好ましくは４、８、１２又は１８個の炭
素原子を有するアルキル基、あるいはそれぞれ１及び８
又は２及び１８個の炭素原子を有するアルキル基の混合
、あるいはフェニル基を担持するシリカ性キャリヤー上
で行われる。
１２個までの炭素原子のアルキル基及び／又はフェニル
基でコートされたアガロース又は関連材料が使用される
疎水性相互作用クロマトグラフィーがこの方法と関連す
る。これらのクロマトグラフ法はＦＰＬＣ又はｌ（ＰＬ
Ｃを用いて適用される。シリカ性逆相材料上でのこの発
明のポリペプチドの処理のための溶剤は例えば、増加す
る量の極性水混和性有機溶剤、例えばアセトニトリル、
低級アルコール、例えばメタノール、エタノール又はプ
ロパツール、テトラヒドロフラン等、好ましくはアセト
ニトリルを含有する水性酸、例えば水性トリフルオロ酢
酸である。
アフィニティークロマトグラフィーはまた、式（Ｉ）の
化合物、並びにその変異体、断片及び誘導体に対して高
い親和性を有する分子、例えば抗体、特に、この発明の
ペプチドに対して特異的な後で記載するポリクローナル
抗体及びモノクローナル抗体を担持する適当なキャリヤ
ー材料、例えば架橋アガロース、デキストラン又はポリ
アクリルアミドを用いて本発明のペプチドを精製するた
めに期待される。
好ましいクロマトグラフ法は、スルホプロピル基を担持
するキャリヤーを用いるイオン交換クロマトグラフィー
、及び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で
ある。
この発明の化合物は、通常の技法、例えば濾過又は限外
濾過、透析、適当な塩及び／又は緩衝液と溶剤との混合
物中での溶解及び沈澱、溶剤の蒸発、凍結乾燥等により
単離される。
ＭＩＦ−関連ペプチドの断片は、例えばプロテアーゼに
よる処理によって調製される。例えば、パパイン、トリ
プシン、α−キモトリプシン、サーモライシン、ペプシ
ン、ズブチリシン、リソバクター・エンチモケネス（込
胚畑」μ翼耳１埠註岨蛙からのエンドプロテイナーゼＬ
ｙｓーＣ，スタフィロコッカス瘤アウレウス（Ｓｔａ　
ｈ　ｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ）からのｖ８プ
ロテアーゼ、又は関連プロテアーゼを式（Ｉ）又は（Ｉ
Ｔ）の化合物の溶液に加え、そして生ずる断片の混合物
をクロマトグラフ法、例えばゲル濾過及び／又は逆相Ｈ
ＰＬＣにより分離する。
Ｃｙｓ残基を含有する式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の
ダイマーは例えば、空気、酸素、ヨウ素、ジメチルスル
ホキシドとＨＣＩＩ又はＨＢｒ　、あるいは他の化学酸
化剤による穏和な酸化により得られる。
式（Ｉ）の化合物と式（ＩＩ）の化合物との接合体は適
当な混合物の同様の酸化により調製される。
特に、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物、並びにその変異
体、断片及び誘導体は組換ＤＮＡ技法により、例えば、
式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）のペプチド又はその変異体も
しくは誘導体を発現する形質転換された宿主を異種性蛋
白質の発現を許容する条件下で培養し、そして目的化合
物を単離することにより製造することができる。さらに
具体的には、ａ）ヒト細胞のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ
ライブラリーから式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物又
はその断片をコードするＤＮＡを単離しそして場合によ
ってはこれを変異せしめるか、又はこの様なＤＮＡを化
学的に合成し； ｂ）該ＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し；Ｃ）この
得られたハイブリドベクターを受容宿主に移行せしめ； ｄ）例えば形質転換された宿主のみが生存する条件下で
培養することにより未形質転換宿主から形質転換された
宿主を選択し； ｅ）形質転換された宿主を、異種性ポリペプチドの発現
を許容する条件下で培養し；そしてｆ）弐〇）もしくは
（ＩＩ）の化合物又はその変異体、断片もしくは誘導体
を単離し；そして所望により、得られた式日）もしくは
（ＩＩ）の化合物、又はその変異体もしくは断片を誘導
体にする； ことにより目的化合物が製造される。
組換ＤＮＡ技法によるこれらのペプチドの調製に関与す
る段階は後でさらに詳細に検討する。
さらに、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物、並びにその変
異体及び特に断片は、化学的方法により、特にＭ、Ｂｏ
ｄａｎｓｚｋｙ　＋、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐ
ｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　％　Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ　１９８４に記載されている縮合反応
により合成することが可能である。
断片は例えば固相法により合成され、この方法において
はＮ−保護アミノ酸が適当な樹脂に連結され、保護基が
除去され、第二のＮ−保護アミノ酸が第一アミノ酸のア
ミノ基と縮合され、次のＮ−保護アミノ酸を用いる脱保
護／縮合のサイクルが、所望の組成のペプチド残基が完
了するまで反復され、そして最後にこのペプチド残基が
樹脂から切り離され、そして脱保護される。適当な樹脂
、保護基、縮合剤、及び反応条件は当業界において知ら
れている。
この発明はまた、式（Ｉ）もしくは（旧の化合物をコー
ドするＤＮＡ、又はその変異体、例えば１個又は複数個
の、特に１個、２個、３個又は４個のヌクレオチド変異
しているＤＮＡ、及び少なくとも１５ヌクレオチドを含
んで成るこれらのＤＮＡの断片に関する。これらのＤＮ
Ａは単離又は二本鎖であると理解される。
特に、この発明は、次の式（■）： Ｙ、−Ｙ　−Ｙ　−Ｙ　−Ｙ　−Ｙ　−Ｙ　−Ｙ　−Ｙ
　−’ｌ　−Ｙ　−Ｙ　−Ｙ　−Ｙ　−Ｙ　　−’ｌ　
　−Ｙ　　−Ｙ　　−Ｙ　　−’ｌ　　−Ｙ　　−Ｙ　
　−Ｙ　　−Ｙ　　−Ｙ　　−Ｙ　　−Ｙ　　−Ｙ　　
−で表わされるＭＲＰ−８をコードするＤＮＡ、及び次
の式（■）： 　−Ｙ３ （ＩＶ） で表わされるＭＲＰ−１４をコードするＤＮＡ〔式中、 Ｙ、はプロモーターを含有する１２ヌクレオチド以上の
フランキングｌ１ｙｌＡ配列であり；Ｙ２はｙＭ　　ｙ
Ｔ　　ｖｔ、　　ｙＫであるか、又は存在せず； Ｙ、ｌは１ヌクレオチド以上のフランキングＤＮＡ配列
であるか、又は存在せず； ＹＡはアラニン（Ａ又はＡｌａ）をコードし、そしてＧ
ＣＴ、　ＧＣＣ，ＧＣ八又はＧＣＧであり；ＹＣはシス
ティン（Ｃ又はＣｙｓ）をコードし、そしてＴＧＴ又は
ＴＧＣであり； ＹＤはアスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）をコードし、そ
してＧＡＴ又はＧＡＣであり； ＹＥはグルタミン酸（Ｅ又はＧｌｕ）をコードし、そし
てＧＡＡ又はＧＡＧであり； Ｙ′はフェニルアラニン（Ｆ又はＰｈｅ）をコードし、
そしてＴＴＴ又はＴＴＣであり； ＹＧはグリシン（Ｇ又はＧｌｙ）をコードし、そしてＧ
ＧＴ、　ＧＧＣ，ＧＧＡ又はＧＧＧであり；ＹＨはヒス
チジン（Ｈ又は旧Ｓ）をコードし、そしてＣＡＴ又はＣ
ＡＣであり； Ｙｌ　はイソロイシン（Ｉ又はｌ１ｅ）をコードし、そ
してＡＴＴ、　ＡＴＣ又は八Ｔ＾であり；ｙＫはリジン
（Ｋ又はＬｙｓ）をコードし、そしてＡＡＡ又はＡＡＧ
であり； ｙＬはロイシン（Ｌ又はＬｅｕ）をコードし、そしてＴ
ＴＡ、　ＴＴＧ、　ＣＴＴ、　ＣＴＣ，ＣＴ八又はＣＴ
Ｇであり；ｙＭはメチオニン（Ｍ又はＭｅ　ｔ）をコー
ドし、そして＾ＴＧであり； ｙＮはアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）をコードし、そし
てＡＡＴ又はＡＡＣであり； ｙＰはプロリン（Ｐ又はＰｒｏ）をコードし、そしてＣ
ＣＴ、　ＣＣＣ，ＣＣＡ又はＣＣＧであり；ｙＱはグル
タミン（Ｑ又はＧｌｎ）をコードし、そしてＣＡＡ又は
ＣＡＧであり； ｙＲはアルギニン（Ｒ又はＡｒｇ）をコードし、そして
ＣＧＴ、　ＣＧＣ，ＣＧＡ、　ＣＧＧ、　ＡＧ＾又は八
ＧＧであり；ｙＳ　はセリン（Ｓ又は５ｅｔ）をコード
し、そしてＴＣＴ、　ＴＣＣ，ＴＧＡ、　ＴＣＧ、　Ａ
ＧＴ又はＡＧＣであり；ＹＴはトレオニン（Ｔ又はＴｈ
ｒ）をコードし、そしてＡＣＴ、八ＣＣ，ＡＣ八又は＾
ＣＧであり；ｙＶはバリン（Ｖ又はＶａｌ）をコードし
、そしてＧＴＴ、　ＧＴＣ，ＧＴＡ又はＧＴＧであり；
Ｙ′″はトリプトファン（Ｗ又はＴｒｐ）をコードし、
そしてＴＧＧであり； ＹＹはチロシン（Ｙ又はＴｙｒ）をコードし、そしてＴ
ＡＴ又はＴＡＣであり；そして Ｙ”は終止コドンＴＡＡ、　ＴＡＧ又はＴＧＡである〕
、式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）のＤＮＡとこれに対して相
補的なＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ　（ここで、アデ
ニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と結合し、この逆の場合もあ
り、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と結合し、この逆
の場合もある）、この相補的ＤＮＡ自体、１又は複数個
、特に１個又は２個のイントロンが式（ＩＩ［）又は（
ＩＶ）のＤＮＡを中断しているゲノムＤＮＡ、１個又は
複数個、特に１個、２個、３個又は４個のヌクレオチド
が変異しているこれらのＤＮＡの変異体、並びに少なく
とも１５ヌクレオチドを含んで成るこれらのＤＮＡの断
片に関する。
特に、この発明は次の式（■）： （Ｖ） で表わされるＭＲＰ−８をコードするＤＮＡ、及び次の
式（■）： 以下余白 ＭＳＱＬＥＲＮＩＥＴＩＩ ＴＡＡ−Ｙ。
（ＶＩ） で表わされるＭＲＰ−１４をコードするＤＮＡ（式中、
Ｙ、はプロモーター配列を含有する１２ヌクレオチド以
上のフランキングＤＮＡ残基であり、Ｙ２はＡＴＧＡＣ
ＴＴＧＣＡＡＡであるか、又は存在せず、そしてＹ３は
１ヌクレオチド以上のフランキングＤＮＡ残基である、
）、 式（Ｖ）又は（ＶＩ）のＤＮＡとこれに対して相補的な
ＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ、該相補的ＤＮＡ自体、
式（Ｖ）又は（ＶＩ）のＤＮＡを１個又は複数個、特に
１個又は２個のイントロンが中断しているゲノムＤＮＡ
、１個又は複数個、特に１個、２個、３個もしくは４個
のヌクレオチドが変異しているこれらのＤＮＡの変異体
、又は少なくとも１５ヌクレオチドを含んで成るこれら
のＤＮＡの断片に関する。
この発明はまた、式（Ｖ）もしくは（ＶＩ）のＤＮＡと
、又は式（Ｖ）もしくは（ＶＩ）のＤＮＡに対して相補
的なＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡに関する。
ＭＲＰ−８をコードする式（Ｖ）のこの発明のＤＮＡの
例は、例えば次の式（■）： （■） で表わされる、ヒト単核白血球のｍＲＮＡに由来するｃ
ＤＮＡである。
ヒト単核白血球のｍＲＮＡ由来の他の特定のｃＤＮＡは
ＹＩ　　Ｃ式（■）におけるヌクレオチド１〜１２３〕
の意味を異にする。Ｙ、は例えば＾＾ＧＴＣＴＧＴＧＧ
ＧＣＡＴＣ−。
ＡＴＧＴＣＴＣＴＴＧＴＣＡＧＣＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧ
ＡＡＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＧＧＣＡＡＧＴＴＣＣＧＴＧ
ＧＧＣＡＴＣ−、ＴＴＧＴＣＴＣＴＴＧＴＣＡＧＣＴＧ
ＴＣＴＴＴＣＡＧ　−ＡＡＧＡ（：ＣＴＧ八八九九ＴＴ
ＣＴＧＴＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＡＡＧＴＴＣＣ
ＧＴＧＧＧＣＡＴＣ−１又は式（■）のヌクレオチド１
０８〜１２３もしくは８６〜１２３を含んで成り、ヌク
レオチド１１２と１１３の間にＴの挿入を伴う配列であ
る。
ＭＲＰ−８をコードする式（Ｖ）のＤＮＡの他の例は、
ヒトの胎盤から単離されそしてアミノ酸４７と４８との
間〔式（Ｖ）のヌクレオチド１４１　と１４２との間〕
に１５０ヌクレオチドのイントロンを含有し次の式（■
）で表わされるゲノムＤＮＡである。
ＭＲＰ−１４をコードする式（”ＩＩ）のこの発明のＤ
ＮＡの例は、次の式（■）： （ＩＸ） で表わされる、ヒト単核白血球のｍＲＮＡ由来のｃＤＮ
Ａである。
ＭＲＰ−１４をコードする式（ＶＩ）のＤＮＡの他の例
は、ヒト胎盤又は胎児肝細胞から単離されそしてアミノ
酸５０と５１との間〔式（ＶＩ）のヌクレオチド１３８
と１３９との間〕にイントロンを含有する、次の式（Ｘ
）で表わされるゲノムＤＮＡである。
以下余白 さらに、この発明はまた、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合
物をコードするＲＮＡ、その変異体、例えば１個又は複
数のヌクレオチドが変異しているＲＮＡ、及びこの様な
ＲＮＡの断片、特に、Ｙが前記の意味を有するが但しＤ
ＮＡの代りにＲＮＡが存在し、そしてそれ故にデオキシ
チミジン（Ｔ）の代りにウリジン（ＩＩ）が存在する式
（Ｖ）又は（ＶＩ）のＲＮＡ、特にＴがＵで置き換えら
れている式（■）又は（ＩＸ）のＲＮＡに関する。
式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物又はその変異体をコ
ードするＤＮＡ及び該ＤＮＡの断片又は変異体は例えば
、形質転換された宿主を培養しそしてこれから所望のＤ
ＮＡを単離することにより、又はヌクレオチド縮合によ
り化学合成することによって製造することができる。
特に、この様なＤＮＡは ａ）ヒト単核白血球からｍＲＮＡを単離し、目的とする
ｍＲＮＡを例えばＤＮＡプローブを用いるハイブリダイ
ゼーションにより選択し、該ｍＲＮＡに対して相補的な
単離ＤＮＡを調製し、次にそれから二本鎖ＤＮＡ　（ｄ
ｓ　ｃＤＮＡ）を調製し；あるいはｂ）ヒト細胞、例え
ば胎盤又は胎児肝細胞からゲノムＤＮＡを単離し、そし
てＤＮＡプローブを用いて目的のＤＮＡを選択し；そし
て Ｃ）段階ａ）のｃＤＮＡ又は段階ｂ）のｃＤＮＡを適当
な発現ベクターに導入し； ｄ）この所望のハイブリドベクターにより適当な宿主を
形質転換し； ｅ）式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）又はその変異体もしくは
断片をコードするＤＮＡを含有する形質転換された宿主
をコードＤＮＡを含有しない宿主から選択し；そして ｆ）目的ＤＮＡを単離する； ことにより製造することができる。
ポリアデニル化メンセンジャーＲＮＡはヒト単核白血球
から既知の方法により単離される。白血球は新鮮なヒト
の血液から、例えば白血球から成るバフィーコートから
、又は培養において拡大され得る樹立された連続セルラ
インの白血球から誘導することができる。単離方法は例
えば油剤及びリボヌクレアーゼ阻害剤、例えばヘパリン
、グアニジニウムイソチオシアネート及びメルカプトエ
タノールの存在下で刺激された白血球をホモジナイズし
、場合によっては塩及び緩衝液、洗剤及び／又は陽イオ
ンキレート剤の存在下で、ｍＲＮＡを適当なりロロホル
ムーフェノール混合物により抽出し、そして残った水性
の塩含有相からエタノール、イソプロパツール等により
メンセンジャーＲＮＡを沈澱せしめる。単離されたｍＲ
ＮＡは塩化セシウムグラジェント中で遠心し、そして次
にエタノール沈澱及び／又はクロマトグラフィー、例え
ばアフィニティークロマトグラフィー、例えばオリゴ（
ｄＴ）セルロース又はオリゴ（ＩＩ）セファロース上で
のクロマトグラフィーを行うことにより、さらに精製す
ることができる。好ましくは、こうして精製されたｍＲ
ＮＡを、例えばシュークロース直線勾配のごとき勾配遠
心により、又は適当なサイズ画分カラム、例えばアガロ
ースゲル上で、サイズに従って分画する。
目的のｍＲＮＡはＤＮＡプローブを用いるスクリーニン
グにより、又は適当な細胞もしくは無細胞系での翻訳及
び得られるポリペプチドのスクリーニングにより選択さ
れる。
分画されたｍＲＮＡは細胞中で、例えばカエルの卵母細
胞中で、又は無細胞系で、例えば網状赤血球ライセード
又は小麦胚芽抽出物中で翻訳され得る。
得られたポリペプチドは、マクロファージ遊走阻止活性
について、又は天然マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩ
Ｆ）に対して生じた抗体との反応について、例えばイム
ノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノ
アッセイ又は蛍光マーカーを用いるイムノアッセイにお
いてスクリーニングされる。このようなイムノアッセイ
並びにモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の調
製は当業界においてよく知られており、従ってこれが適
用される。ＭＩＦに対するモノクローナル抗体及びこれ
らを用いるイムノアッセイは、例えばコーロソパ特許出
願ＥＰ　１６２，８１２に記載されている。
所望のｍＲＮＡの選択は好ましくはＤＮＡハイブリダイ
ゼーションプローブを用いて達成され、これにより翻訳
の追加の段階が回避される。この様なハイブリダイゼー
ションプローブは少なくとも１７個のヌクレオチドから
成る全合成ＤＮＡ、あるいは天然起源の又は遺伝子操作
された微生物がら単離されたＤＮＡ又はＤＮＡ断片であ
ることができる。
合成ＤＮＡプローブは、天然源から単離されたヒトＭＩ
Ｆ蛋白質、例えばＥＰ　１６２，８１２に記載されてい
るヒトＭＴＦ８ｋＤ、又は約１４ｋＤの分子量を有する
ヒトＭＴＦ−関連蛋白質の部分アミノ酸配列に基いて構
成することができる。好ましくは１７以上のヌクレオチ
ドから成るオリゴヌクレオチドの混合物を調製し、この
場合該混合物の各構成員は式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の
６個以上の連続するトリプレットコドンＹにより定義さ
れる１つの断片に相補的である。この様なＤＮＡプロー
ブもまたこの発明に含まれる。
この発明のＤＮＡプローブの例は、式（Ｉ）のＭＲＰ−
８のアミノ酸１４−１９ニ対応する式ＹＤ　　ｙＶ−Ｙ
Ｙ−ＹＨ−ＹＫ−ＴＡの及び弐〇）のＭＲＰ−８ノアミ
ノ酸５２−５７ニ対応スル式Ｙｌｌｌ−Ｙｖ−Ｙ′″−
Ｙ’−ＹＫ−ＧＡのＤＮＡ断片に相補的な１７−　ｍｅ
ｒオリゴヌクレオチド、並びに式（ＩＩ）のＭＲＰ−１
４のアミノ酸１４−２２に対応する弐ｙ　Ｔ　　ｙ　＋
−Ｙ’−ＹＮ−ＹＴ−Ｙ’−ＹＨ−Ｙ’　−ＴＡのＤＮ
Ａ断片に相補的な２６−ｍａｒオリゴヌクレオチド混合
物である。これらの式中、ｙｌｌ　、ｙＦ。
ＹＨ，Ｙｌ　、ＹＫ、ｙＮ、ＹＱ、ＹＴ、’Ｙｖ。
Ｙ”及びＹＶの意味は式（ＩＶ）において定義した通り
である。２６−ｍａｒオリゴヌクレオチドはトリプレッ
トＹのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの代りに３
個のイノシン残基を有し、従って相補的ヌクレオチド−
ヌクレオチド相互作用の数が２３に減少する。
この様なオリゴヌクレオチドの合成は、後に詳細に記載
する既知の方法に従って、好ましくは、固相ホスホトリ
エステル、ホスファイトトリエステル又はホスホルアミ
ダイト法を用いる段階的縮合により、例えばホスホトリ
エステル法を用いるジヌクレオチドカップリングユニッ
トの縮合により行われる。これらの方法は、Ｙ、Ｉｋｅ
等（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１
９８３、旦、４７７）により記載されているように、保
護された形態の２個、３個又は４個のヌクレオチドｄＡ
、ｄＣ，ｄＧ及び／又はｄＴの混合物を使用することに
より又は適当な縮合段階で対応するジヌクレオチド力・
ノブリングユニットを用いることにより、所望のオリゴ
ヌクレオチドの混合物の合成に適合させることができる
。
所望のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションが検出され
、そしてｍＲＮＡが同定されそして本発明のポリペプチ
ドをコードしない他のｍＲＮＡから分離され得るように
、ＤＮＡプローブはマーカーを含有しなければならない
。例えば、オリゴヌクレオチドの５′−末端リン酸にお
ける放射性標識、例えばｚｚｐ、蛍光マーカー、又は適
当にラベルされたアビジン、例えば蛍光マーカーを担持
しているかもしくは西洋ワサビパーオキシダーゼのごと
き酵素と接合したアビジンにより検出され得るビオチン
を含有する標識が適当である。
マーカーを含有するＤＮＡプローブとサイズ分画された
ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、既知の方法に
従って、すなわち添加剤、例えばカルシウムキレート剤
、粘度調整化合物、蛋白質、無関係のＤＮＡ等を含有す
る緩衝及び塩溶液中で、選択的ハイブリダイゼーション
のために好都合な温度、例えばｌ　７−ｍｅｒオリゴヌ
クレオチドについては２５℃〜４０℃の間そして２５−
ｍｅｒオリゴヌクレオチドについては３０℃〜５０℃の
間、好ましくはハイブリドｄｓ　ＤＮＡの溶融温度より
約２０℃低い温度において行われる。
選択されたｍＲＮＡ鋳型からの単離相補的ＤＮＡの調製
は当業界においてよく知られており、単離ＤＮＡからの
二本鎖ＤＮＡの調製も同様である。
ｍＲＮ＾鋳型をデオキシヌクレオチドトリホスフェート
の混合物、場合によっては放射能標識されたデオキシヌ
クレオチドトリホスフェート（反応の結果をスクリーニ
ングするため）、メンセンジャーＲＮＡのポリ　（Ａ）
テイルとハイブリダイズするオリゴ−ｄＴ残基のごとき
プライマー配列、及び適当な酵素、例えば逆転写酵素と
共にインキュベ−卜する。鋳型ｍＲＮＡの分解の後、相
補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をデオキシヌクレオチドトリホ
スフェートの混合物、及び上記のごとき適当な酵素と共
にインキュベートして二本鎖ＤＮＡを生じさせる。
適当な酵素は逆転写酵素、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼ
■のＫｌｅｎｏｗ断片、又はＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ
である。場合によっては、単離ＤＮＡをまず類似デオキ
シヌクレオチドのテイルにより延長して相補的な類似デ
オキシヌクレオチドのプライマー配列の使用を可能にす
るが、１カルｄｓ　ＤＮＡの形成は通常自然的ヘアピン
形成に基いて開始される。ヘアピン形成の結果として得
られたこのようなｄｓ　ＤＮＡをさらに、該ヘアピンを
切断するＳ１ヌクレアーゼにより処理する。
ｍＲＮＡからｃＤＮへの調製に代り、ゲノムＤＮＡを単
離し、そして所望のポリペプチドをコードするＤＮＡに
ついてスクリーニングすることができる。
ゲノムＤＮＡは適当なヒト組織から、好ましくはヒト胎
盤又はヒト胎児肝細胞から、当業界において知られてい
る方法に従って単離される。これからゲノムＤＮＡライ
ブラリーが、確立された方法に従って、適当な制限エン
ドヌクレアーゼ、例えばＡｌｕ　Ｉ及びＨａｅ　ｍによ
る消化、λシャロンファージ、例えばλシャロン４Ａへ
の導入により調製される。ニトロセルロース膜上にレプ
リカされたゲノムＤＮＡライブラリーがＤＮＡプローブ
、例えば１６以上のヌクレオチドの合成ＤＮＡプローブ
又は前記のように所望のポリペプチドをコードするｍＲ
ＮＡからのｃＤＮＡによりスクリーニングされる。適当
な宿主微生物で増加したｃＤＮＡによりスクリーニング
する場合、このｃＤＮＡをよく知られたニックトランス
レーション法によりラベルし、次に塩及び緩衝剤並びに
前記の他の添加剤を含有する溶液中で、好ましくは４０
℃〜８０℃、例えば約６５℃の温度において標識する。
ｍＲＮＡから調製されたｄｃ　ＤＮＡ又はゲノム由来の
ｄｃ　ＤＮＡの適当なベクターへの導入は当業界におい
てよく知られている。例えば適当なベクターを切断し、
そして類似のデオキシヌクレオチドのテイルを施す。こ
れは対応するデオキシヌクレオチドトリホスフェート及
び酵素、例えば末端デオキシヌクレオチジルトランスフ
エラーゼの存在下でのインキュベーションにより達成さ
れる。別の方法においては、ｄｓ　ＤＮＡはリンカ−オ
リゴデオキシヌクレオチドにより又は平滑末端連結によ
りベクターに導入することができる。
得られたハイブリドベクターによる適当な宿主の形質転
換は当業界においてよく知られている。
例えば、Ｅ、コリを塩化カルシウムを含有する培地中で
のインキュベーションにより形質転換のために条件化し
、次にハイブリドベクターにより処理する。形質転換さ
れた宿主を適当なマーカー、例えば抗生物質耐性マーカ
ー、例えばテトラサイクリン又はアンピシリン耐性マー
カーにより選択する。
この発明のＤＮＡの調製はまた化学合成によっても行う
ことができる。ＤＮＡを合成するための適当な方法はＳ
、Ａ、Ｎａｒａｎｇｓ　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１９
８３、似、３により要約の形で示されている。既知の合
成法は、好収量、高純度でかつ比較的短時間での４０塩
基までのポリヌクレオチドの調製を可能にする。
適切に保護されたヌクレオチドをホスホジエステル法（
Ｋ、Ｌ、八ｇａｒｗａ　１等、Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ
、１９７２、財、４８９　）　、さらに効率的なホスホ
トリエステル法（Ｃ，Ｂ、Ｒｅｅｓｅ　、、Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ　１９７２、旦、３１４３）、ホスファイ
トトリエステル法〔Ｒルルｅｔｓｉｎｇｅｒ等、Ｊ、Ａ
ｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１９７６、餞、３６５５〕、又
はホスホルアミダイト法（Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅ及
びＭ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９８１、
録、１８５９）により相互に連結する。オリゴヌクレオ
チド及びポリヌクレオチドの合成の単純化が固相法によ
り可能になり、この方法においてはヌクレオチド鎖が適
当なポリマーに連結される。Ｈ，Ｒｉｎｋ等（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　１９８４．１２
．６３６９］は個々のヌクレオチドではなくトリヌクレ
オチドを使用し、これらを固相合成においてホスホトリ
エステル法により連結する。こうして、６７塩基までの
ポリヌクレオチドを短時間で、且つ良好な収率で調製す
ることができる。実際の二本鎖ＤＮＡは、両ＤＮＡ鎖か
らの化合的に調製されたオーバーラツプするオリゴヌク
レオチドから酵素的に組み立てられ、この場合前記オリ
ゴヌクレオチドが塩基対合により正しい配置で一緒に保
持され、そして次に酵素ＤＮＡリガーゼにより化学的に
連結される。他の可能性は、２つのＤＮＡ鎖からのオー
バーラツプする単一オリゴヌクレオチドを４種類の必要
とされるデオキシヌクレオチドトリホスフェートの存在
下でＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ１
１ポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片又はＴ４　ＤＮＡ
ポリメラーゼと共に、あるいはＡＭＶ　（鳥類骨髄芽球
症ウィルス）逆転写酵素と共にインキュベートする。こ
れにより２木のオリゴヌクレオチドが塩基対合により正
しい配置に保持され、そして酵素により必要なヌクレオ
チドが補給され完全な二本鎖ＤＮＡが生ずる（Ｓ、Ａ、
Ｎａｒａｎｇ等、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。
１９８２．１２Ｌ　３５６　）。
この発明はさらに、発現制御配列に作用可能に連結され
た、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物をコードするＤ
ＮＡ、その変異体又はそのＤＮＡの断片を含んで成るハ
イブリドベクター、及びその製造方法に関する。
ベクターは、形質転換のために使用される宿主細胞に依
存して選択される。適当な宿主の例として、制限酵素又
は修飾酵素を欠くか又はこれらが少ない微生物、例えば
酵母、例えばサツカロミセス癩セレビシェーｑ匹劇咀仔
」１竺　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、例えばＳ．セレビシ
エーＧＲＦ　１Ｂ、及び細菌の株、特にエシヱリシャ・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ）の株、例
えばＥ、コリＸ　１７７６、Ｅ、コリに１２株２９４、
バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ）、バシルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）
　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ）、ヘ
モフィルス（Ｈａｅｍｏｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッ
カス（Σ駐」柚ｙ氏シ硯搬−及び他のもの、そしてさら
に高等生物の細胞、時に樹立されたヒト又は動物セルラ
イン、例えばヒト胎児肺線維芽細胞Ｌ−１３２、ヒト悪
性黒色腫Ｂｏｉｖｅｓ細胞、Ｈｅ１ａ細胞、アフリカミ
ドリザルのＳＶ　−４０ウイルス形質転換腎細胞ＣＯ３
−７、又はチャイニーズハムスター卯巣（ＣＨＯ）細胞
が挙げられる。Ｅ、コリの上記の細胞、例えばＥ、コリ
ＨＢ１０１　、Ｅ、コリに１２及びＥ、コリＷ３１１０
、並びにサッカロミセス・セレビシエーの株、例えばサ
ッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ　１８が宿主として
好ましく、さらにヒト胎児肺線維芽細胞セルラインＬ−
１３２も好ましい。
原理的には、選択された宿主中で複製し、そしてこの発
明の目的ポリペプチドを発現するすべてのベクターが適
当である。Ｅ、コリ株中での式（Ｎ又は（ＩＩ）の化合
物の発現のために適当なベクターの例として、バクテリ
オファージ、例えばλバクテリオファージの誘導体、又
はプラスミド、例えば特にプラスミドＣｏ１Ｅ１及びそ
の誘導体、例えばｐＭＢ９、ｐｓＦ２１２４　、ｐＢＲ
３１７又はｐＢｌ？３２２が挙げられる。この発明の好
ましいベクターはプラスミドｐＢＲ３２２に由来する。
適当なベクターは完全なレプリコン及びマーカー遺伝子
（発現プラスミドにより形質転換された宿主を表現型形
質に基いて選択しそして同定する）、並びに場合によっ
てはシグナル配列及びエンハンサ−を含有する。適当な
マーカー遺伝子は宿主に、例えば重金属、抗生物質等に
対する耐性を付与する。さらに、この発明の好ましいベ
クターは、レプリコン及びマーカー遺伝子領域の外に制
限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含有し、これ
により外来ＤＮＡ及び適当であれば発現制御配列がこれ
らの部位に挿入され得る。好ましいベクターであるプラ
スミドｐＢＲ３２２及びこれに由来するプラスミド、例
えばｐＵｃ９、ｐＵＣ−ＫＯｌｐｌ（Ｒｉ１４８及びｐ
ＰＬｃ２４は無傷のレプリコン、例えばテトラサイクリ
ン及びアンピシリンに対する耐性を付与するマーカー遺
伝子（ｔｅｔＩ＋及びａｍｐＲ）　、及び制限エンドヌ
クレアーゼのための多数のユニーク認識部位を含有する
。
遺伝子発現の制御のために幾つかの発現制御配列を使用
することができる。特に、形質転換されるべき宿主の高
度に発現される遺伝子の発現制御配列が使用される。ハ
イブリドベクターとしてのｐＢ１１３２２及び宿主微生
物としてのＥ、コリの場合、例えば、ラクトースオペロ
ン、トリプトファンオペロン、アラビノースオペロン等
の発現制御配列（これは特にプロモーター及びリボゾー
ム結合部位を含む）、β−ラクタマーゼ遺伝子、ファー
ジλＮ遺伝子の対応する配列、特にｐｔプロモーターを
含有するそれ、又はファージｆｄ−コート蛋白質遺伝子
等が好ましい。プラスミドｐＢＲ３２２はβ−ラクタマ
ーゼ遺伝子をすでに含有するが、このプラスミドには他
の発現制御配列が導入されなければならない。
酵母における複製及び発現のために適当なベクターは酵
母複製開始点及び酵母用選択遺伝子マーカーを含有する
。酵母複製開始点、例えば染色体自律複製セグメント（
ａｒｓ）を含有するハイブリドベクターは形質転換の後
酵母細胞内で染色体外に残り、そして自律複製される。
さらに、酵母２μプラスミドＤＮＡと相同な配列を含有
するハイブリドベクターを使用することができる。この
様なハイブリドベクターは細胞内にすでに存在する２μ
プラスミドに組換により取り込まれるか、又は自律複製
するであろう。２μ配列は高形質転換頻度を有するプラ
スミドのために特に適当であり、そして高コピー数を可
能にするであろう。この発明の好ましい酵母ベクターは
ｐＪＤＢ２０７である。
酵母のための適当なマーカー遺伝子は特に、宿主に抗生
物質耐性を付与するもの、又は栄養要求酵母変異株の場
合には宿主の欠陥を補完する遺伝子である。対応する遺
伝子は、例えば抗生物質シクロへキシミドに対する耐性
を付与し、又は栄養要求変異株において原栄養性を提供
し、例えばＵＲＡ３、ＬＥＵ２、…図、又は特にη」２
遺伝子である。
酵母ハイブリドベクターは好ましくはさらに、細菌宿主
、特にＥ、コリのための複製開始点及びマーカー遺伝子
を含有し、これによりハイブリドベクター及びそれらの
中間体の造成及びクローニングを細菌宿主中で行うこと
ができる。
酵母における発現のために適当な発現制御配列は例えば
高度に発現される酵母遺伝子のそれである。すなわち、
ＴＲＰＩ遺伝子、ＡＤＨＩ又はＡＤＤ　ＩＩ、酸性ホス
ファターゼ（朋又は皿）遺伝子又はイソチトクローム遺
伝子の各プロモーター、あるいは解糖系に関与するプロ
モーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（皿皿敗、３−ホスホ
グリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピ
ルベートデヒドロゲナーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、
グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホス
ホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオ
ースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソ
メラーゼ及びグルコキナーゼの遺伝子のプロモーターを
使用することができる。
この発明の好ましいベクターは転写調節を伴うプロモー
ター、例えば増殖条件の変化によりターンオン又はター
ンオフされ得る贋、ＡＤＨＩＩ及びＧＡＰＤ）ｌ遺伝子
のプロモーターを含有する。例えば、ＰＨ０５プロモー
ターは培地中の無機リン酸塩の濃度を上昇又は低下せし
めるのみで抑制又は抑制解除され得る。
哺乳類細胞での複製及び発現のために適当なベクターは
、好ましくは、ウィルス由来の、例えばシミアンウィル
ス４０　　（ＳＶ４０）　、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ３
Ｖ）、アデノウィルス２、ウシパビロ−マウイルス（Ｂ
ＰＶ）、パポバウイルスＢＫｉ異株（ＢＫＶ）、又はマ
ウスもしくはヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）由来
のＤＮＡを存する。
好ましくは、これらのベクターは真核性転写制御配列と
共にＥ、コリ中での増殖のための複製開始点及び抗生物
質耐性を含有する。特に、このようないわゆるシャトル
ベクターはｐＢＲ３２２Ｅ　、コリ用プラスミド並びに
ＳＶ４０及び／又はＣＭＶエンハンサ−及びプロモータ
ー領域から造成することができる。例えば、マウスもし
くはヒトのサイトメガロウィルス主要中間−初期遺伝子
のエンハンサ−ユニット、ヒトα−グロビンプロモータ
ーと組合わされたＳＶ４０エンハンサ−１及び／又はさ
らに誘導性プロモーター、例えばヒートショック遺伝子
又はメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターを含有
することができる。さらに、目的の遺伝子配列に天然に
関連するプロモーター又は制御配列を使用することも可
能である。複製開始点は、例えばＳＶ４０又は他のウィ
ルス源由来の外来開始点を含有するようにベクターを造
成することにより、あるいは宿主細胞染色体複製機構に
より提供することができる。ベクターが宿主細胞染色体
に組み込まれる場合、後者の方法がしばしば一層効率的
である。
好ましい態様において、この発明は宿主株中で複製及び
表現型選択が可能なハイブリドベクターに関し、このベ
クターはプロモーター、及び式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）
又はその変異体もしくは断片をコードするＤＮＡを含ん
で成り、このＤＮＡは該ハイブリドベクター中に、形質
転換された宿主中でそれが発現されポリペプチドが生産
される様に前記プロモーターの制御のもとに、転写開始
及び終止シグナル並びに翻訳開始及び終止シグナルと共
に配置される。
この発明はまた、形質転換された宿主の製造方法に関し
、この方法は発現制御配列により制御されるこの発明の
ＤＮＡを含有する発現ベクターにより宿主を形質転換（
トランスフオーム又はトランスフェクト）することを含
んで成り、さらにこの発明はトランスフオーム又はトラ
ンスフェクトされた宿主自体に関する。
適当な宿主の例として、上記の微生物、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　、バシルス・ズブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｔｔｉｓ）及びエツジエリシャ’
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ並旦）の株が挙げられ装
置この発明の発現プラスミドによる形質転換は、例えば
文献に記載されている様にして、すなわちＳ．セレビシ
エーについてはＡ、旧ｎｎｅｎ％　Ｊ、Ｂ、Ｈｉｃｋｓ
及びＧ、Ｒ，Ｆｉｎｋ、　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＩＩｓ＾、１９７８、
■、１９２９、Ｂ、ズブチリスについてはＡｎａｇｎｏ
ｓｔｏｐｏｕｌｏｓ等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１９６１、■、７４１、Ｅ、コリについてはＭ、Ｍａｎ
ｄｅｌ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１９７０、皿、１５
９に記載されている様にして行われる。
すなわち、Ｅ、コリの形質転換方法はＤＮＡの取り込み
を可能にするための細胞のＣａ”前処理、及びハイブリ
ドベクターとのインキュベーションを含む。細胞を、形
質転換された細胞の親細胞からの分離を許容する選択増
殖培地に移行せしめる。
ベクターを含有しない細胞はこの様な培地中で生存しな
いであろう。酵母の形質転換は、例えば（Ｉ）グルコシ
ダーゼによる酵母細胞壁の酵素的除去、（２）ポリエチ
レングリコール及びＣａ”イオンの存在下でのベクター
による、得られたスフェロプラストの処理、及び（３）
スフェロプラストを寒天に包埋することによる細胞壁の
再生の段階を含んで成る。好ましくは、再生寒天は再生
と形質転換された細胞の選択とを同時に可能にするよう
に調製する。
適当な宿主の他の例は前記の哺乳類細胞、例えばＣＯ３
−７細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は好ましくは胎児肺細胞Ｌ−
１３２である。ベクターは、レルパー化合物、例えばジ
エチルアミノエチルデキストラン、ジエチルスルホキシ
ド、グリセロール、ポリエチレングリコール等の存在下
でのトランスフェクションにより、あるいはベクターＤ
ＮＡとリン酸カルシウムとの同時沈澱として哺乳類細胞
中に導入される。他の適当な方法は細胞核へのベクター
ＤＮＡの直接マイクロインジェクション及び工レフトロ
ポレーション、すなわち細胞膜の透過性を増加せしめる
短い電気パルスによるＤＮＡの導入を包含する。これに
続（形質転換された細胞の選択は、発現ベクター中に共
有結合的に組み込まれた選択マーカー又は別個の存在と
して加えられた選択マーカーを用いて行うことができる
。選択マーカーは、抗生物質、例えば（、−４１８（ネ
オマイシン）又はハイグロマイシンに対する耐性を付与
する遺伝子、又は宿主細胞の遺伝的欠陥、例えばチミジ
ンキナーゼ又はヒボキサンチンホスホリボシルトランス
フェラーゼの不存在を補完する遺伝子を包含する。
好ましい選択系は、外来ＤＨＰＲ遺伝子が供給されない
限り増殖のためにチミジン、グリシン及びプリンを絶対
的に要求する、ジヒドロフオレートレダクターゼを欠＜
　　（ＤＩ（ＰＲ−）細胞、例えばＣＨ○細胞を使用す
る。この発明のポリペプチドをコードする遺伝子に連結
されたＤＨＦＲ遺伝子を含有するベクターを適当なりＨ
ＰＲ−細胞、例えばＣＨＯ細胞に導入した後、形質転換
された細胞を、培地中の抗−葉酸剤メトトレキセー）　
（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）の濃度を増加せしめるこ
とにより選択する。この様な処理はさらに、目的ポリペ
プチドをコードする遺伝子を含有する実質的フランキン
グ染色体領域と一緒になったＤＨＰＲ遺伝子の増幅を介
して目的ポリペプチドの生産を増加せしめる。
哺乳類細胞、例えばヒト胎児肺細胞Ｌ−１３２を式（Ｉ
）又は（ＩＩ）の化合物をコードする遺伝子を含有する
ベクターＤＮＡ、抗生物質耐性、例えばＧ−４１８に対
する耐性をコードする遺伝子を含有するプラスミドＤＮ
Ａ、及びリン酸カルシウムの同時沈澱物により処理する
ことによる選択方法が好ましい。形質転換された細胞は
、対応する抗生物質、例えばＧ−４，１８の存在下で培
養することにより、及び目的ポリペプチドの発現につい
てスクリーニングすることにより選択される。
形質転換された宿主細胞は、当業界において既知の方法
により、資化性の炭素源、窒素源及び無機塩を含有する
液体培地中で培養される。
この発明の形質転換された宿主の培養のために種々の炭
素源を使用することができる。好ましい炭素源の例とし
て資化性炭水化物、例えばグルコース、マルトース、マ
ンニトールもしくはラクトース、又は酢酸塩が使用され
、これらはそれ自体として、又は適当な混合物として使
用することができる。適当な窒素源の例としてアミノ酸
、例えばカザミノ酸、ペプチド及び蛋白質、並びにこれ
らの分解生成物、例えばトリプトン、ペプトン、又は肉
エキス、酵母エキス、マルトエキス、及びさらにアンモ
ニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
又は硝酸アンモニウムが挙げられ、これらはそれ自体と
して又は適当な混合物として使用することができる。使
用することができ　　　　　　　□る無機塩は、例えば
ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの
リン酸塩及び炭酸塩である。
培地はさらに、例えば増殖促進物質、例えば微量元素、
例えば鉄、亜鉛、マンガン等、及び好ましくは選択圧を
提供しそして発現プラスミドを失った細胞の増殖を防止
する物質を含有する。すなわち、例えば、発現ベクター
がａ　ｍ　ｐ　Ｒ遺伝子を含有する場合、アンピシリン
を培地に添加する。
抗生物質のこの様な添加はまた、抗生物質感受性の汚染
微生物を殺すという効果を有する。例えば必須アミノ酸
について栄養要求性である酵母株が宿主微生物として使
用される場合、プラスミドは好ましくは宿主の欠損を補
完する酵素をコードする遺伝子を含有する。酵母株の培
養は前記アミノ酸を欠く最少培地において行われる。
を推動物細胞は、場合によっては増殖促進物質及び／又
は哺乳類血清が補充された商業的に入手可能な培地を用
いて、組織培養条件下で増殖せしめる。この細胞は固体
支持体、例えばミクロキャリヤーもしくは多孔質ガラス
繊維に付着して、又は適当な培養容器中で自由浮遊しな
がら増殖する。
培養は当業界において知られている方法により行われる
。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ値、及び発酵時間
は、この発明のポリペプチドの最大力価が得られるよう
に選択される。すなわち、Ｅ。
コリ又は酵母株は好ましくは好気的条件下で、振とう又
は攪拌を伴う液中培養により、約２０〜４０’ｃ、好ま
しくは３０℃の温度において、そして４〜８のｐＨ１好
ましくはおよそｐＨ７において、約４〜３０時間、好ま
しくはこの発明のポリペプチドの最大収量が達成される
まで培養する。
細胞密度が十分な値に達した時、培養を中断しそしてポ
リペプチドを単離する。ポリペプチドが適切なシグナル
ペプチド配列と融合している場合、このものは細胞によ
り直接に上清に分泌される。
そうでない場合には、細胞は例えば、洗剤、例えばＳＤ
Ｓ　ＮＰ−４０、トリトン又はデオキシコール酸で処理
することにより破壊されなければならず、又はリゾチー
ム、同様に作用する酵素又は超音波により溶解されなけ
ればならない。酵母が宿主微生物として使用される場合
、細胞壁をグルコシダーゼによる酵素的分解によって除
去することができる。この方法に代えて、又はこれに加
えて、機械的力、例えば剪断力（例えばＸ−プレス、フ
レンチプレス、ダイノミル）、又はガラスピーズもしく
は酸化アルミニウムとの振とう、あるいは例えば液体窒
素中での凍結と例えば３０°Ｃ〜４０’Ｃでの解凍の繰
返し、並びに超音波を用いて細胞を破壊することができ
る。
細胞を破壊した後に得られる混合物の遠心の後に得られ
る細胞上清又は溶液は蛋白質、核酸及び他の細胞成分を
含有し、これをそれ自体既知の方法でこの発明のポリペ
プチドを含む蛋白質について濃縮する。すなわち、例え
ば、非蛋白質成分のほとんどがポリエチレンイミン処理
により除去し、この発明のポリペプチドを含む生白質を
、例えば硫酸アンモニウム又は他の塩による溶液の飽和
によって沈澱せしめる。他の方法として、細胞上清又は
細胞溶解物をクロマトグラフィーにより前精製する。
遺伝子操作された微生物により生産されたポリペプチド
は、クロマトグラフ法の組合わせにより、好ましくは前
記の塩基性官能基及び酸性官能基によるイオン交換クロ
マトグラフィーと逆相高速液体クロマトグラフィーの組
み合わせにより精製される。精製法に他の分離法、例え
ば分子量カットオフ膜を用いる濾過又は限外濾過、ゲル
濾過、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト上での
クロマトグラフィー、クロマトフオーカシング、並びに
透析、溶解、及び適当な塩及び／又は緩衝液及び溶剤の
混合物中での再沈澱を含めることができる。
粗細胞上清又は細胞溶解物を第四アミノ官能基を担持す
るイオン交換カラム上、スルホン酸残基を担持するイオ
ン交換カラム上、及び逆相液体クロマトグラフィーカラ
ム上で逐次クロマトグラフ処理する精製方式が好ましい
。他の好ましい方式は、スルホン酸残基を含有する１つ
のキャリヤー上でのみイオン交換クロマトグラフィーを
行う方式、及び／又はゲル濾過、すなわちサイズ排除ク
ロマトグラフィーを精製法に含める方式である。
この発明はさらに、この発明の方法によって製造された
すべての場合の、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物、並び
にその変異体、断片及び誘導体に関する。
この発明は特に、例に記載されているような、ＤＮＡ、
ハイブリドベクター、形質転換された細胞、式（Ｉ）及
び（ＩＩ）の化合物、並びにその製造方法に関する。
ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチド、並びに
その変異体、断片又は誘導体は免疫調節疾患及び慢性炎
症疾患の治療のため、並びに感染に対する保護のために
有用であり、好ましくは療法的有効量の活性成分を場合
によっては無機又は有機の固体又は液体の医薬として許
容されるキャリヤーと共に又はこれと混合して含有する
医薬製剤の形で使用される。
この発明の医薬製剤は、温血動物、例えばヒトに対する
経腸投与、例えば直腸投与又は経口投与のためのもの、
及び好ましくは非経腸投与、例えば鼻内投与、筋肉内投
与、皮下投与又は静脈内投与のためのものである。意図
される適用方法に依存して、医薬製剤は単位投与形、例
えばアンプル、バイアル、生薬、丸剤、錠剤、カプセル
、又は固体もしくは液体形の鼻内スプレーの形態である
ことができる。
投与されるべき療法的に有効な化合物の量は、溢血動物
、例えばヒトの状態、例えば体重、疾患の性質及び重症
度、及び−膜状態、そしてさらに投与方法に依存し、そ
して治療を行う医師の評価に行って決められる。式（Ｉ
）もしくは（ＩＩ）の化合物又はその変異体もしくは断
片の有効量は体重当り１日当り０．００１〜Ｌｔｔｇの
オーダーである。
この発明の医薬製剤は常用の無機又は有機の固体又は液
体の医薬として許容されるキャリヤーを、場合によって
は他の療法的に活性な化合物及び／又はアジュバントと
共に含んで成る。好ましくは、活性成分の溶液又は懸濁
液、特に等張水性溶液又は懸濁液が、あるいはまた使用
直前に水に溶解される凍結乾燥調製物が使用される。医
薬製剤は無菌化され、そして／又は防腐剤、安定剤、湿
潤剤、乳化剤、可溶化剤、増粘剤、浸透圧調整塩及び／
又は緩衝剤、そしてさらに他の蛋白質、例えばヒト血清
アルブミン又はヒト血清調製物を含有することができる
。
ＭＩＦ−関連ペプチド又はその変異体、断片もしくは誘
導体を含有する水性分散体のりボゾームの形の医薬製剤
が好ましい。特に、この発明のＭＩＦ−関連ペプチドを
含有する水性内容物を収容する脂質成分、例えば両親媒
性脂質、例えばホスホリピド、例えばレシチン、ケファ
リン又はホスファチジン酸、及び場合によっては中性脂
質、例えばコレステロールの単層又は複層から成る約２
、　ＯＸｌ０−”〜５．　ＯＸｌ０−’ｍの直径及び可
及的に均一なサイズの集団を有するリポゾームが好まし
い。
合成ホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンの
混合物から成るリポゾームが好ましい。
この発明はさらに、ヒトマクロファージ遊走阻止因子関
連ペプチド、特に式（Ｉ）のＭＲＰ−８及び式（ＩＩ）
のＭＲＰ４４並びにこれらの誘導体に対して特異的なポ
リクローナル抗体及びモノクローナル抗体に関する。
ＭＩＦ−関連ペプチドに対するポリクローナル抗体は哺
乳類由来、例えばマウス、ラット、ラビット、ヤギ、ヒ
ツジ、ウマ、ブタ、チンパンジー又はヒト由来のもので
ある。マウス、ラット、ラビット、ヤギ又はヒツジの抗
体が好ましく、ラビットの抗体が特に好ましい。これら
のポリクローナル抗体は、それぞれ式（Ｉ）の化合物及
び式（ＩＩ）の化合物に対する抗体以外の抗体を含有す
ることができる。特に、ポリクローナル抗体は、ＭＩＦ
−関連ペプチドに対する異る親和性及び選択性を有する
抗体の集まりである。好ましいポリクローナル抗体はそ
れぞれＭＲＰ−８に対して特異的でありそしてＭＲＰ−
１４に対して特異的である。
この発明の好ましいモノクローナル抗体はＭＩＦ−関連
ペプチドに対するモノクローナル抗体である。モノクロ
ーナル抗体もまた哺乳類由来、例えばマウス、ラット又
はヒト由来のものであり、好ましくはマウス抗体である
。
８−５Ｃ２及び８−１００７と称するＭＲＰ−８に対す
るモノクローナル抗体並びに１４−６Ｂ２及び１４４９
Ｃ９と称するＭＲＰ−１４に対するモノクローナル抗体
、並びにこれらの誘導体が好ましい。これらのモノクロ
ーナル抗体は、それぞれ８−５Ｃ２，８−１０Ｄ７．１
４−６Ｂ２及び１４−１９Ｃ９と称する対応するハイブ
リドーマセルラインにより分泌される。
この発明の抗体の誘導体は、例えば抗体断片、放射性標
識された抗体、及び抗体と例えば酵素、例外的結合性を
有する化合物、例えばアビジン又はビオチン、蛍光マー
カー、化学ルミネッセンスマーカー又は常磁性粒子との
接合体である。
この発明の抗体の断片は例えばＦａｂ、　Ｆａｂ’又は
Ｆ（ａｂ’）ｚ断片であって、抗原決定基に対するそれ
らの特異性を保持しているもの、すなわちＭＴＦ−関連
蛋白質に対する親抗体の特徴的結合パターンを保持して
いるものである。
放射性標識された抗体は、例えば放射性ヨウ素（＋２Ｊ
、＋２Ｊ％３１Ｊ）　、炭素（”Ｃ）　、硫黄（３５Ｓ
）、トリチウム（３Ｈ）等を含有する。放射性ヨウ素に
より標識された抗体、例えば＋２Ｊにより標識されたモ
ノクローナル抗体が好ましい。
この発明の抗体接合体は、例えば酵素、例えば西洋ワサ
ビパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−オキシダーゼ、グ
ルコアミラーゼ、カルボアンヒドラーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナー
ゼ又はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
との接合体、アビジン又はビオチンとの接合体、並びに
蛍光マーカー、例えばフルオレソセイン又はローダミン
Ｂとの接合体、化学ルミネッセンスマーカー例えばアク
リジニウムエステルとの接合体、あるいは固体常磁性粒
子との接合体である。このような接合体において、抗体
は接合の相手方に直接結合し、又はスペーサーもしくは
リンカ−基により結合する。モノクローナル抗体と酵素
西洋ワサビパーオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファタ
ーゼとの接合体、並びにポリクローナル抗体及びモノク
ローナル抗体とビオチンとの接合体が好ましい。
ＭＩＦ−関連蛋白質に対する抗体の選択性は酵素−イム
ノアッセイにおいて定性的に検出することができ、この
方法においてはミクロタイタープレートのウェルを蒼白
質でコートし、次に試験されるべき抗体で処理し、そし
て結合した抗体を該抗体に対する標識された抗血清によ
り検出する。
例えば、この発明のマウスモノクローナル抗体の選択性
はサンドインチタイプの酵素−イムノアッセイにより決
定され、この方法においてはミクロタイタープレートを
ＭＩＦ−関連蛋白質に対するラビットポリクローナル抗
体によりコートし、次に該蛍白質それ自体によりコート
し、次に試験されるべき抗体で処理し、そして結合した
モノクローナル抗体をマウス抗体の定常部分に対する標
識された抗血清により検出する。
モノクローナル抗体はさらに、その免疫グロブリンクラ
ス及びサブクラスに関して、例えばクラス特異的第二抗
体を用いる免疫拡散オークテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒ
ｌｏｎｙ）法により分析することができる。
この発明の抗体及びその誘導体はそれ自体既知の方法に
より得られる。この発明のポリクローナル抗体及びその
誘導体は、適当な哺乳類を免疫応答エンハンサ−の存在
下での式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の２回又は３回の
注射により免疫感作し、免疫感作された哺乳類の血清を
集め、そして抗体を単離しそして精製し、そして所望に
より、得られた抗体をその誘導体に転換する方法により
得られる。
ポリクローナル抗体を製造するための適当な哺乳類は例
えばマウス、ラット、ラビット、ヤギ、ヒツジ、ブタ又
はウマである。好ましくはマウス又はラビットが使用さ
れる。これらは、数日間、例えば３〜７日の間隔で数ケ
月以下、例えば４週間、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物
を皮肉に、皮下に、静脈内に又は腹腔内に２回、３回、
４回又はさらに多く注射することにより免疫感作される
。
免疫応答エンハンサ−はリンパ球の生産を刺激するアジ
ュバント、例えば完全又は不完全フロインドアジュバン
トである。
哺乳類の免疫応答は適当な抗体アッセイ、例えば前記の
酵素イムノアッセイによりモニターするのが好ましい。
最終追加免疫の数日後、例えば２〜５日後に哺乳類の血
液を集める。抗体を既知の方法、例えば沈澱、遠心及び
／又はクロマトグラフィーにより単離する。粗免疫グロ
ブリン画分は硫酸アンモニウム等を用いる沈澱によって
血清から得られる。これらの免疫グロブリン画分は、ゲ
ル濾過又はモレキュラーシーブクロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロース上で
のクロマトグラフィー又は免疫アフィニティークロマト
グラフィー、例えばスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロティンＡもしくは好ましくは対
応するＭＩＦ−関連蛋白質を担持するキャリヤー材料上
でのクロマトグラフィーによりさらに精製することがで
きる。
抗原決定基に対する特異性を維持している抗体断片、例
えばＦａｂ、　Ｆａｂ’又はｌ”（ａｂ’）２断片は、
それ自体既知の方法により、例えば酵素、例えばペプシ
ンもしくはパパインにより抗体を消化するか、そして／
又は化学還元によりジスルフィド結合を開裂せしめるこ
とにより得ることができる。
放射性ヨウ素により標識された抗体は当業界において知
られているヨウ素化法により、例えば放射性ヨウ化ナト
リウム又はヨウ化カリウム及び化学酸化剤、例えば次亜
塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ等、又は酵素化酸化剤
、例えばラクトパーオキシダーゼ又はグルコースオキシ
ダーゼ及びグルコースを用いて抗体を標識することによ
り調製される。
この発明の抗体の接合体は、当業界において知られてい
る方法により、例えば前記の様にして調製された抗体又
はその断片をカンプリング剤、例えばグルタルアルデヒ
ド、過ヨウ素酸塩、Ｎ、Ｎ’−〇−フェニレンジマレイ
ミド、Ｎ　−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−サ
クシンイミド、Ｎ−（３−（２’−ピリジルジチオ〕−
プロピオノキシ）−サクシニミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−
（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド等の
存在下で酵素と反応せしめることにより製造される。ア
ビジンとの接合体は同様にして製造される。ビオチンと
の接合体は例えば抗体をビオチンの活性化エステル、例
えばビオチンＮ−ヒドロキシサクシニミドエステルと反
応せしめることにより製造される。蛍光マーカー又は化
学ルミネッセンスマーカーとの接合体はカップリング剤
、例えば前記のカップリング剤の存在下で、又はイソチ
オシアネート、好ましくはフルオレソセインーイソチオ
シアネートとの反応により製造される。常磁性粒子との
接合体は、前活性化された粒子を用いて、又はグルタル
アルデヒド又は過コウ素酸塩の存在下でのカップリング
により得られる。
この発明のモノクローナル抗体及びその誘導体はそれ自
体既知の方法により得られ、この方法は、該モノクロー
ナル抗体を含泌するハイブリドーマ細胞を ａ）インビトロで培養し、そして培養上清からモノクロ
ーナル抗体を単離するか；あるいはｂ）適当な動物中で
インビボ増殖せしめ、そして該動物の体液からモノクロ
ーナル抗体を回収し；そして所望により、得られたモノ
クローナル抗体をその誘導体に転換する； ことを特徴とする。
方法ａ）に従うインビトロ培養のための適当な培地は標
準的培地、例えば、場合によっては哺乳類血清、例えば
ウシ胎児血清、又は他の増殖促進補填剤、例えば２−ア
ミノエタノール、インシュリン、トランスフェリン、低
密度リボプロティン、オレイン酸等、及び微量元素が補
充されているダルベコ改変イーグル培地又はＲＰＭ１１
６４０培地である。
モノクローナル抗体の単離は、培養上清中に含有される
蛋白質を硫酸アンモニウム等によって沈澱せしめ、次に
標準的クロマトグラフ法、例えばゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロース上でのクロマ
トグラフィー又は免疫アフィニティークロマトグラフィ
ーにより達成される。
インビトロ製造は、所望の抗体の大量製造のためのスケ
ールアンプを可能にする。大規模なハイブリドーマ培養
のための技法は当業界において知られており、そして均
一懸濁培養、例えばエアーリフト反応器又は連続キャリ
ヤー反応器中での培養、あるいは例えば中空繊維、マイ
クロカプセル中、カガロースマイクロビーズ上又はセラ
ミックカートリッジ上での固定化又は捕捉された培養を
含む。
多量の目的モノクローナル抗体はまた、方法ｂ）に従っ
てハイブリドーマ細胞を増殖せしめることによっても得
られる。細胞クローンを同系哺乳類に注射し、抗体産生
腫瘍を増殖せしめる。１〜３週間後、前記哺乳類の体液
から目的モノクローナル抗体を回収する。例えば、Ｂａ
１ｂ／ｃマウス由来のハイブリドーマ細胞を、場合によ
ってはブリスタンのごとき炭化水素により前処理された
Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに腹腔内注射し、そして１〜２週間
後これらのマウスの腹水を集める。所望のモノクローナ
ル抗体を既知の方法により、例えば硫酸アンモニウム等
による蛋白質の沈澱により体液から集め、次に標準的ク
ロマトグラフ法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマト
グラフィー、ＤＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフ
ィー、又は免疫アフィニティークロマトグラフィーによ
り精製する。
モノクローナル抗体の断片、放射性ラベルされた誘導体
及び接合体は前記の様にして調製される。
放射性標識されたモノクローナル抗体はまた、段階ａ）
のインビトロ培養の培地に放射性標識された栄養を添加
することによっても調製される。この様な標識された栄
養は例えば放射性炭素（”Ｃ）を含有する。
この発明はさらに、ＭＩＦ−関連ペプチド、特に式（Ｉ
）のＭＲＰ−８及び式（ＩＩ）のＭＲＰ−１４に対する
モノクローナル抗体を分泌することを特徴とするハイブ
リドーマセルラインに関する。
特にこの発明は、骨髄腫細胞と式（Ｉ）又は（ＩＩ）の
化合物により免疫感作された哺乳類のＢリンパ球とのハ
イブリドであるセルラインに関する。好ましくは、これ
らのセルラインはマウス骨髄腫細胞と式（Ｉ）又は（Ｉ
Ｉ）の精製された化合物によって免疫感作された同系マ
ウスのＢリンパ球とのハイブリドーマである。
名称８−５Ｇ２．８−１００７．１４−６Ｂ２及び１４
−１９Ｃ９を有するハイブリドーマセルラインが好まし
い。これらのセルラインはマウス骨髄腫セルラインＰ３
　Ｘ　６３−Ａｇ３．６５３と、それぞれＭＲＰ−８及
びＭＲＰ−１４で免疫感作したＢａ１ｂ／ｃマウスの肺
臓のＢリンパ球とのハイブリドである。これらは安定な
セルラインであり、対応する名称のモノクローナル抗体
を分泌し、そして深冷凍結培養物として維持されそして
解凍及び場合によっては再クローニングにより再活性化
される。
前記の好ましいハイブリドーマセルラインは１９８７年
９月９日に、ブダペスト条約の規定のもとに、パスツー
ル研究所“Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ
　ｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｅｓ　、　　（パリ）に寄託された。
セルライン　　　　　一番−Ｍ− １４−１９Ｃ９１−６Ｂ７ １４−６Ｂ２Ｉ　−６Ｂ８ ８−１００７ｌ−６Ｂ９ ８−５Ｃ２１−６９０ この発明はまた、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物に結合
するモノクローナル抗体を分泌するハイプリドーマセル
ラインの製造方法に関し、この方法は適当な哺乳類を式
（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物により免疫感作し、この哺
乳類の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、この融
合により得られたハイブリドーマ細胞をクローン化し、
そして所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択する。
この発明の方法における哺乳類の免疫感作のために適当
な抗原は、それぞれ式（Ｉ）及び（ＩＩ）の好ましい化
合物、すなわち前記のＭＲＰ−８及びＭＲＰ−１４であ
る。免疫感作のための好ましい哺乳類はマウス、特にＢ
ａ１ｂ／ｃマウスである。免疫感作は、例えばポリクロ
ーナル抗体の調製について前記したようにして行われる
。
最終追加免疫の後２〜５日に採取された、免疫感作され
た動物の抗体産生細胞、好ましくは肺細胞を融合促進剤
の存在下で適当なセルラインの骨髄腫細胞と融合せしめ
る。幾つかの適当な骨髄腫セルラインが当業界において
知られている。酸素ヒホキサンチングアニンホスホリポ
シルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は酵素チミジ
ンキナーゼ（ＴＫ）を欠き、それ故にヒボキサンチン、
アミノプテリン及びチミジンを含有する選択培地（ＴＡ
Ｔ培地）中で生存しない骨髄腫細胞が好ましい。ＨＡＴ
培地中で生存せず、そして免疫グロブリン又はその断片
を分泌しない骨髄腫セルライン及び誘導されたセルライ
ン、例えばセルラインＰ３ｘ６３−Ａｇ　８．６５３、
又はＳｐ　２　／　０−Ａｇ１４が好ましい。考えられ
る融合促進剤は例えば場合によっては不活性化された形
態のセンダイウィルス又は他のバラミキソウイルス、カ
ルシウムイオン、表面活性脂質、例えばリゾレシチン、
又はポリエチレングリコールである。好ましくは骨髄腫
細胞が３〜２０倍過剰の免疫感作された動物からの牌細
胞と、１０００〜４０００の分子量の約３０％〜約６０
％のポリエチレングリコール及び約１０％〜約２０％の
ジメチルスルホキシドを含有する溶液中で融合する。
融合の後、細胞を再懸濁し、そして選択ＨＡＴ培地中で
培養する。これによりハイブリドーマ細胞のみが生存す
るであろう。これらは骨髄腫細胞に由来するインビトロ
で増殖しそして複製する能力、及び免疫感作された哺乳
類の抗体産生肺細胞に由来するＨＡＨ培地中での生存に
必須な１（ＧＰＲＫ又はＴＫ遺伝子・の欠失の両者をあ
わせ持つからである。
ハイブリドーマ細胞を拡大するための適当な培地は標準
的培地、例えばダルベコの改変イーグル培地、最少必須
培地、ＲＰＭ１１６４０培地等であり、場合によっては
血清、例えば１０〜１５％のウシ胎児血清が補給されて
いるものである。場合によっては、細胞増殖の初期にフ
ィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔滲出細胞、牌細胞
、骨髄マクロファージ等が添加される。ハイプリドーマ
細胞を正常骨髄腫細胞が圧刻しないように、培地に選択
ＨＡＴ培地を補充し、最終段階でヒボキサンチン／チミ
ジン（ＨＴ）培地を補充する。
ハイブリドーマ細胞培養上清を所望のモノクローナル抗
体について、好ましくは酵素イムノアッセイ又はラジオ
イムノアッセイによりスクリーニングする。陽性のハイ
ブリドーマ細胞を例えば限界稀釈法によりクローン化す
る。クローン化されたセルラインは常法に従って凍結す
ることができる。
この発明のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
、及び／又はその誘導体はＭＩＦ−関連蛋白質、特に式
（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の定量又は定性のために有
用である。
例えば、抗体及びその誘導体、例えば酵素接合体又は放
射性誘導体は、ＭＩＦ＝関連蛋白質の抗原決定基と抗体
との間の結合相互作用に基く既知のイムノアッセイのい
ずれかにおいて使用することができる。この様なアッセ
イの例としてラジオイムノアッセイ　（ＲＩＡ）、酵素
イムノアッセイ、例えばエンザイムーリンクドイムノソ
ルベントアソセイ　（ＥＬＩＳＡ）、イムノフロウレッ
センス、免疫沈澱、ラテックス凝集、及び血球凝集が挙
げられる。この様なイムノアッセイは、例えば炎症状態
を有する患者、のう包繊維症の素因を有する患者又は健
常者の生物学的流体又は組織中のＭＩＦ−関連蛋白質の
定量又は定性において有用である。
この発明の抗体はそれ自体として、又は放射性標識され
た誘導体の形でラジオイムノアッセイにおいて使用する
ことができる。ＲＩＡの既知の変法のいずれか、例えば
均一相でのＲＩＡ、固相ＲＩＡ又は不拘−ＲＩＡ、シン
グルＲＩＡ又はダブル（サンドインチ）ＲＩＡをこの発
明の蛋白質の直接又は間接（競争的）測定のために使用
することができる。サンドイッチＲＩＡが好ましく、こ
の方法においては適当なキャリヤー、例えばポリスチレ
ン、ポリプロピレン又はポリ塩化ビニルのミクロタイタ
ープレートの又は試験管のプラスチック表面、ガラス又
はプラスチックビーズ、濾紙、又はデキストラン、酢酸
セルロース又はニトロセルロースシート等を単純な吸着
により又は場合によっては例えばグルタルアルデヒド又
は臭化シアンによる活性化の後にこの発明のモノクロー
ナル抗体又はポリクローナル抗体でコートし、そして試
験溶液及び＋２Ｊにより放射性標識されたモノクローナ
ル抗体の溶液（もし使用されたならキャリヤー結合モノ
クローナル抗体とは異るこの発明の蛋白質の他のエピト
ープを認識する溶解したモノクローナル抗体）と共にイ
ンキュベートし、そしてこの発明の蛋白質の量を、キャ
リヤーに結合した放射能の測定により決定する。
前記のサンドインチラジオイムノアッセイが特に好まし
く、この方法においては、この発明のモノクローナル抗
体をビーズ、例えばポリスチレンビーズに結合せしめ、
このコートされたビーズをＭＩＦ＝関連蛋白質を含有す
る試験溶液又は標準溶液中でインキュベートし、そして
最後に異るエピトープを認識する放射性ラベルされたモ
ノクローナル抗体により顕在化せしめる。
この発明の抗体はそのままで、又は酵素接合誘導体又は
ビオチン接合誘導体の形で、酵素イムノアッセイ　（Ｅ
　Ｉ　Ａ）において使用することができる。この様なイ
ムノアッセイは、この発明の酵素標識されたモノクロー
ナル抗体誘導体、この発明の抗体のエピトープを認識し
そして結合するそれ自体既知の酵素標識された抗体、又
は酵素−アビジン接合体を使用する試験方法を包含する
。ＥＩへの既知の変法のいずれか、例えば均一相におけ
るＥＩＡ、固相ＥＩＡ又は不拘−ＥＩＡ、シングルＥＩ
Ａ又はダブル（サンイッ１−）ＥＩＡを使用してＭＩＦ
−関連蛋白質の直接又は間接（競争的）測定を行うこと
ができる。
ＥＬＩＳＡ（エンザイムーリンクドイムノソルベントア
ッセイ）が好ましく、この方法においてはＲＩＡについ
て前記したキャリヤーをこの発明のポリクローナル抗体
又はモノクローナル抗体でコートし、ＭＩＦ−関連蛍白
質を含有する試験溶液と共にインキュベートし、そして
次にビオチンに接合したポリクローナル抗体又は異るモ
ノクローナル抗体と共にインキュベートし、そして最後
に、結合した抗体−ビオチン接合体を酵素−アビジン接
合体によって顕在化せしめ、そして結合した蛋白質の量
を酵素基質反応により決定する。
さらに、この発明のポリクローナル抗体又はモノクロー
ナル抗体でコートされたキャリヤーを試験溶液と共に、
及び酵素と接合したモノクローナル溶液（使用されたな
ら、キャリヤー結合モノクローナル抗体認識するのとは
異るＭＩＦ−関連蛋白質のエピトープを認識する溶解し
たモノクローナル抗体）とインキュベートするＥＬＩＳ
Ａが好ましい。例えば目で観察することができるか又は
光学測定装置で測定することができる色の変化をもたら
す酵素基質反応により試験溶液中の蛋白質が測定される
。
さらに、この発明のポリクローナル抗体又はモノクロー
ナル抗体によりコートされたキャリヤーを試験溶液と共
に、キャリヤー結合抗体とは異る種のモノクローナル又
はポリクローナル抗体の溶液と共に、そして次に溶解し
た抗体の種特異的部分を認識しそして結合する酵素標識
された第二酵体とインキュベートするＥＬＩＳ＾が好ま
しい。結合した酵素の量は試験溶液中の蛋白質の量に比
例し、そして酵素基質反応により決定することができる
。
この発明のモノクローナル抗体はそのままで、又は蛍光
マーカーと接合した形態でイムノフルオレッセンス試験
において使用することができる。
この様なイムノフルオレッセンス試験は、この発明のモ
ノクローナル抗体誘導体、例えばフルオレ・７セインと
接合した誘導体、又はこの発明のモノクローナル抗体の
エピトープを認識しそして結合するそれ自体既知のフル
オレッセンスマーカー標識抗体を使用する方法を包含す
る。
ＲＩＡについて前記、したキャリヤーを標準的方法に従
ってこの発明の蛋白質の存在について試験されるべき細
胞によりコートし、細胞を固定し、そして細胞内の蛋白
質性材料と適用される溶液との相互作用が可能なように
透過性にし、次にフルオレッセンスマーカーと接合した
この発明のポリクローナル又はモノクローナル抗体誘導
体と共にインキュベートし、又はこの発明のポリクロー
ナル又はモノクローナル抗体とインキュベートし次にこ
の発明の該抗体を認識しそして結合するフルオレッセン
スマーカー標識第二抗体、例えばフルオレッセイン標識
うビット抗−マウス免疫グロブリンと共にインキュベー
トすることによるイムノフルオレッセンス試験が好まし
い。次に、この発明の蛋白質の存在を検出し、そして蛋
白質を標準的蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーによ
り位置決定する。
ＭＩＦ−関連蛋白質の定性又は定量のための前記のモノ
クローナル抗体及びその誘導体のこの発明による使用は
また、それ自体既知の他のイムノアッセイ、例えばイム
ノドツト分析、放射性標識された抗体又は放射性標識さ
れたＭＩＦ＝関連蛋白質を用いる免疫沈澱試験、抗体−
コート又は抗原コートラテックス粒子を用いるラテンシ
ス凝集、あるいは抗体−コート又は抗原コート赤血球を
用いる血球凝集等を包含する。
この発明はまた、ＭＩＦ−関連蛋白質、特に式（Ｉ）又
は（ＩＴ）の化合物の定性及び定量のためのキットに関
し、このキットはこの発明のポリクローナル抗体及び／
又はモノクローナル抗体及び／又はそれらの誘導体、並
びに場合によっては他のポリクローナル抗体又はモノク
ローナル抗体及び／又は付属物を含んで成る。
ラジオイムノアッセイのためのこの発明の試験キットは
例えばこの発明のポリクローナル抗体又はモノクローナ
ル抗体によりコートされているか又はコートされていな
い適当なキャリヤー、式（Ｉ）もしくは（Ｉｔ、）の化
合物に対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナ
ル抗体及び／又は放射性標識されたそれらの誘導体の場
合によっては凍結乾燥又は濃縮された溶液、式（Ｉ）又
は（ＩＩ）の対応する化合物の標準溶液、緩衝液、場合
によっては、非特異的吸着及び凝集の形成を防止するた
めのポリペプチド及び洗剤、ピペット、反応容器、換算
曲線、説明書等を包含する。
酵素イムノアッセイのためのこの発明の試験キットは例
えば適切なキャリヤー、例えばミクロタイタープレート
又はニトロセルロースシート、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の
化合物に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル
抗体の、及びこの蛋白質に対する酵素標識され又はビオ
チン標識されたモノクローナル又はポリクローナル抗体
の場合によっては凍結乾燥され又は濃縮された溶液、ビ
オチン標識抗体が使用される場合には酵素−アビジン接
合体の溶液、固体又は溶解した形の酵素基質、この発明
の蛋白質の標準溶液、緩衝液、及び場合によっては、ポ
リペプチド及び洗剤、ピペット、反応容器、換算曲線、
色度表、説明書等を含む。
この発明のモノクローナル抗体及び抗体誘導体はＭＩＦ
−関連蛋白質、特に式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物、例
えばそれぞれＭＲＰ−８及び？ＩＲＰ−１４の定性及び
定量のため、好ましくは酵素イムノアッセイにおいて使
用される。生物学的流体、組織切片、及び細胞中のＭＲ
Ｐ−８及びＭＲＰ−１４の量の確実な決定は、炎症状態
及び／又はのう包繊維症の遺伝的素因の単節な決定を可
能にする。さらに、モノクローナル抗体及び抗体誘導体
は天然源からの又は組換宿主細胞からのこの発明のＭＩ
Ｆ−関連蛋白質のイムノアフィニティークロマトグラフ
ィーによる単離及び精製において使用することができる
。
この発明のＭＩＦ−関連ペプチドＭＲＰ−８及びＭＲＰ
−１４は供与体に依存して異る量の正常顆粒球及び単球
中に存在する。顆粒球及び単球の培養の後、ＭＲＰ−８
及びＭＲＰ−１４陽性細胞の数は培養の３日目まで増加
し、そして次に１００日目らＯレベルに達するように低
下する。ＭＴｌＰ−８及びＭＲＰ−１４は血管内単球中
以外の正常ヒト組織、例えば肝臓中には存在しない様で
あり、ＭＲＰ−１４はまた肺中の単球中皮び胎盤中にも
存在する。
しかしながら、慢性炎症病変においてＭＲＰ−８−陽性
マクロファージが検出される。皮膚サルコイド−シスの
場合、内皮細胞もＭＲＰ−８を含有する。
ＭＲＰ−１４−陽性マクロファージはリウマチ様関節炎
組織中にかなりの散見られる。ＭＲＰ−８及びＭＲＰ−
１４は、−次慢性多発関節炎及び他の慢性炎症において
組織マクロファージのサブセットにより、歯肉炎のごと
き他の慢性炎症とは異るパターンで発現される。
従ってこの発明は慢性炎症状態の診断方法に関し、この
方法は前記のＭＲＰ−８及びＭＲＰ−１４に対する抗体
を使用して組織におけるＭＲＰ−８及びＭＲＰ−１４の
発現の量及びパターンを決定することを特徴とする。
のう色性繊維症（Ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ；Ｃ
Ｆ）は常染色体性劣性疾患であって、その病因はまだ知
られていない。対象者が正常であるか、ＣＦへテロ接合
性であるか、又はＣＦホモ接合性でを迅速且つ確実に決
定することを可能にする簡単な方法が必要とされている
。ＣＦテトロ接合体は臨床的には影響ないが、しかし疾
患を次の世代に伝達する。
健常者、ＣＦへテロ接合体、ＣＦホモ接合体並びに異る
炎症性及びアレルギー性状態及び他の疾患を有する患者
の血症サンプルのスクリーニングプログラムはのう包繊
維症のマーカーとしてのＭＲＰ−１４の有用性を示して
いる（表）。
以下余白 表 健康な提供者　　　　３９　　　０．０４３　０．００
３−０．１３２ＣＦホモ接合体　　　１１　　　１．０
７６　０．２０４−５．７８ＣＦへテロ接合体　　７　
　　０．６１１　　（Ｉ，１６１−１，０２０リウマチ
様関節炎　　１３　　　０．６１８　０．０９３−１．
４８ぜん息　　　　　　　２　　　０．５９５　０．３
５７−０．４７６Ｔ−細胞リンパ腫　　２　　　１．３
２　　０．２４０−２．０４神経皮膚炎　　　　　１　
　　１．８４０　　　−乾盲　　　６　０．０２７０．
０１４−０．０３６その他”　　　　　　　７　　　　
−＜０．０３０ａ）例４２のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ
　、サンプル当り２個の独立した実験（標準偏差１０％
以内）ｂ）菌状息肉症、サルコイド−シス、癩、接触皮
膚炎。
Ｃ）得られた最高値及び最低値。
健康な提供者に見出されるＭＲＰ−１４の平均量は０．
０４３ａｇ／ｍｌであり、最高値は０．１３２１　ｐｇ
　／　ｍｅである。ＣＦに罹患している患者は０．２０
４〜５，７８μｇ／ｍｌの血漿中濃度を示し、平均値は
１．０７６ａｇ　／　ｍｅである。ＣＦへテロ接合体、
すなわちＣＦ患者の親であるがそれら自体に臨床的に影
響を与えない血漿提供者は０．６１１ａｇ／＋ｎｆの平
均ＭＲＰ４４？Ｍ度を示し、最小値は０．１６１ａｇ　
／　ｍｌである。従って、±１０％の標準アッセイの再
現性を考慮して、他の点では健康な対象がＣＦについて
ヘテロ接合性であるか否かを約０．１５μｇ　／　ｍｌ
の限界をもって決定することができよう。
リウマチ性関節炎、ぜん息、Ｔ−細胞リンパ腫及び神経
皮膚炎を有する患者も上昇したＭＲＰ−１４レベルを示
し、他方、乾唐を含む他の幾つかの疾患を有する患者は
正常範囲のＭＲＰ−１４ｆＡ、度を有する。
健康な提供者、ＣＦホモ接合体及びＣＦへテロ接合体の
血漿サンプル中に見出されるＭＲＰ−８の量は通常０．
０１μｇ　／　ｍ１未満であり、そしてのう色性繊維症
を示すものではない。
従ってこの発明は、のう色性繊維症の確実な診断法に関
し、この方法は前記のＭＲＰ−１４に対する抗体を使用
して、のう色性繊維症についてホモ接合性又はヘテロ接
合性であると予想される他の点では健康な患者の血漿サ
ンプル中のＭＲＰ−１４の量を測定することを特徴とす
る。
次に、例によりこの発明をさらに具体的に記載する。但
し、これによりこの発明の範囲を限定するものではない
。
以下の例においては次の略号を使用する。
八ＴＰ　　　アデノシントリホスフェートｂｐ　　　　
塩基対 ＢＳＡ　　　ウシ血清アルブミン ｃＤＮＡ　　　相補的ＤＮＡ ｃｐｌＩｌ　　　力ろント／分（放射性崩壊）ｄ八　　
　２′−デオキシアデノシン ｄＡＴＰ　　　２’−デオキシアデノシントリホスフェ
ート ｄＣ２’−デオキシシチジン 以下余白 ｄＣＴＰ　　　２’−デオキシシチジントリホスフェー
ト ＤＥＡＥ　　　’；エチルアミノエチルｄＧ　　　　２
’−デオキシグアノシンｄＧＴＰ　　　２’−デオキシ
グアノシントリホスフェート ＤＭＥＭ　　　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地Ｄ
ＭＳＯ　　　ジメチルスルホキシド ＤＮＡ　　　デオキシリボ核酸 ｄＮＴＰ　　　ｄＡＴＰ，ｄｃＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴ
ＴＰの混合物ｄｐｍ　　　分散７分（放射性崩壊） ｄｓ　　ＤＮＡ　　　二本鎖ＤＮＡ ｄＴ　　　　（２’−デオキシ）チミジンＤＴＴ　　　
　１４−ジチオスレイトールｄＴＴＰ　　　チミジント
リホスフェートＥＤＴＡ　　　エチレンジアミン四酢酸
ＦＡＢ−ＭＳ　　ファストアトムボンバートメント　（
ｆａｓｔａｔｏｍ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）マススペ
クトルＦＣＳ　　　ウシ胎児血清 以下余′白 ＦＰＬＣ　　　ファストプロティン・ポリペプチド・ポ
リヌクレオチド液体クロマトグラフィーＨＡＴ　　　　
ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン ＨＢＳ　　　Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水Ｈｅｐｅｓ　
　Ｎ　　２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−
エタンスルホン酸 ＨＰＬＣ　　　高速液体クロマトグラフィーＩｇＧ　　
　免疫グロブリンＧ ｋｂ　　　　キロベース ｋＤ　　　　キロ・ダルトン（分子量）ＭＥＭ　　　最
少必須Ｅａｇｌｅ培地 ＭＩＦ　　　マクロファージ遊走阻害因子ｍＲＮＡ　　
　メッセンジ＋　−ＲＮＡＭＲＰ　　　ＭＩＦ関連ペプ
チド ＯＤ　　　　光学濃度 ＰＡ（、Ｅ　　　ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＰＢ
Ｓ　　　リン酸緩衝化生理食塩水 ＰＭＳＦ　　　フェリルメチルスルホニルフルオリドＲ
Ｎへ　　　リボ核酸 ｒｐｍ　　　回転数７分 ＳＯＳ　　　　ドデシル硫酸ナトリウムＴＦへ　　　ト
リフルオロ酢酸 Ｔｒｉｓ　　　ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ
）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ　　）リス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン ｔＲＮＡ　　　トランスファーＲＮＡ 次の緩衝液及び培地を使用する。
デンハート　０．　１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ
−溶液　　　　３６０　、Ｓｉｇｍａ）、０．　１％Ｆ
ｉｃｏｌ１４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　　、、　　
０．１　　％ＢＳＡ　　。
溶出緩衝液　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　、　ｐＨ
７．　５、１ｍＭＥＤＴＡ，　０．　２％ＳＤＳ　０ ＧｕＳＣＮ　　　　　４　Ｍグアニジウムイソチオシア
ネー緩衝液　　　ト、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ／！　
、ｐＨ７．　５、１０ｍＭＥＤＴ八、２％ナトリウムＮ
ーラウロイイルサルコシネート　（サルコシル）、１４
０ｍＭ　β−メルカプトエタノール。
ＬＢ培地　　　１％バタトトリブトン（ディフコ）、（
Ｌブロス）０．５％バクト酵母エキス（ディフコ）、１
７０ｍＭ’　Ｎａ（Ｊ！　、ＮａＯＨによりｐＨ７．５
に調整。
ＰＢＳ　　　　　　　１３６ｍＭ　　Ｎａ（Ｊ！　、　
　２ｍＭ　　ＫＧ７！　、８ｍＭＮａＪＰＯｎ　　、１
．４ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４　　。
ＲＶＴ緩衝液　２００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｎ　、　
４２℃にてｐＨ８．３、２０ｍＭ　ＭｇＣｊ２　ｔ　　
、２８０ｍＭ　ＫＣ７！　、２０ｍＭＴＴ　　０ ＳＯＣ培地　　２％トリプトン（ギブコ）、０．５％酵
母エキス（ギブコ）　、１０ｍＭ　ＮａＣρ、２、５ｍ
Ｍ　　ＫＣＪ！　、　１０ｍＭ　ＭｇＣ７！ｚ　、５ｍ
ＭＭｇＳＯ４、２０ｍＭグルコース。
ＳＳＣ緩衝液　１５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍ
ＭＮａ（Ｊ！　ＸＮａＯＨにてｐＨ７．０に８周製。
ＴＢＥ緩衝液　８９ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ＴＲＩＺＭＡ”ベ
ース）　、８９ｍＭ硼酸、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　。
ＴＮＲ緩衝液　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ，　ｐＨ
８．　０、１ｍＭＥＤＴＡ、　０．Ｉ　　Ｍ　　ＮａＣ
Ａ　　。
洗浄緩衝液　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！　、ｐＨ７
．　５、１ｍＭＥＤＴＡ，　０．　５　Ｍ　ＮａＣＡ　
、０．　２％ＳＤＳ。
以下余白 開玉　　然ＬＬＩ！［ｊペプチ゛の“び゛　リヒト単核
細胞を刺激しそして培養し、そして得られる細胞培養上
清を濃縮し、そしてヨーロッパ特許出願Ｎｏ、１６２，
８１２に記載されているモノクローナル抗体ＩＣ５を担
持する免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精
製する。蛋白質を含有する両分をＴＦＡ中１％にし、そ
してウォーターズ社製のＨＰＬＣ装置を用いてＶｙｄａ
ｃ　２１４　ＴＰ　５４１５逆相ＨＰＬｃカラム（ザ・
セパレーション・グループ、ヘスパリ力、ＣＡ、米国）
上で１．ｌ　ｍｌ、の画分に分離する。カラムを水中１
％ＴＦＡを６５％とアセトニトリル中０．０７％ＴＦＡ
を３５％との混合物中で平衡化し、そして生成物を、水
中０．１％ＴＦＡを４５％とアセトニトリル中０．０７
％ＴＦＡを５５％との混合物で終る直線グラジェントに
より１滅／分の流速で溶出する。溶出液を、クラトス・
スペクトロフロラ７７３　ＨＰＬＣＵＶディテクターに
より２２０ｎｍでの吸収によりモニターする。保持時間
１１．８分（Ｉ）、１２．６分（ＩＩ）　、１３．４分
（Ｉ）、１４．４分（ＩＶ）　、１５．２分（Ｖ）　、
１６．０分（■）、及び１６．６分（■）を有する７個
の個々の両分を、ＵＶ吸収に従って手動により集める。
↓２．　３ＤＳ−ＰＡＧＥによる＼ 両分（Ｉ）〜（■）のアリコートを、還元条件下及び非
還元条件下での５Ｏ３−ＰＡＧＥ（Ｖ、に、Ｌａｅｍｍ
ｌ　ｉ。
Ｎａｔｕｒｅ　１９７０．２２７．６Ｂ０）により分析
し、そしてクマッシーブルーＲ−２５０により染色する
（第１図）。ＨＰＬＣ画分のアリコート（Ｉ〜５％）を
真空乾燥し、ＤＴＴ　（Ｉ％）を伴う又は伴わない（還
元）２０μｌの解離緩衝液中に溶解し、９６℃にて２分
間加熱し、そして１５％ポリアクリルアミドゲルに適用
する。
両分（Ｉ）の蛋白質は、ＨＰ　１６２．８１２に記載さ
れている見かけ分子量８ｋＤの既知のヒトＭＩＦ蛋白質
と同一である。両分（ＩＩ）はＭＩＦ蛋白質８ｋＤのダ
イマーを含有し、このものは非還元条件下では１６．５
ｋＤに二重バンドとして現われ、そして還元条件下では
わずかに速く移動するかすかなバンドを伴って８ｋＤに
おける強いバンドとして現われる。
両分（ＩＩＩ）の蛋白質は還元条件下及び非還元条件下
で１４ｋＤに現われ、そしてｌ’１ＲＰ−１４と命名さ
れる。
両分（ＩＶ）の蛋白質は１３ｋＤに二重バンドを示し、
そしてＭＲＰ−１４’と称される。見かけ分子量２０ｋ
Ｄを有する両分（Ｖ）の蛋白質は還元条件下で示される
８ｋｂＭＩＦ蛋白質とＭＲＰ−１４とのジスルフィド結
合したヘテロダイマーから成る。１７．５ｋＤの両分（
ＶＩ）の蛋白質は８ｋＤ蛋白質の他のジスルフィド結合
へテロダイマーであり、そして２３．５ｋＤに現われる
両分（■）の蛋白質はＭＲＰ−１４のジスルフィド結合
したダイマーである。
ヨーロッパ特許出ｌＴｈ１６２，８１２の培養されたヒ
ト単核細胞の濃縮された上清１７０ｍ１を５０ｍＭ酢酸
ナトリウム（ＮａＯＡｃ）緩衝液（ｐＨ４）に対して十
分に透析し、そしてＳＰ　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍ（Ｌ
ＫＢ）　イオン交換カラム（２，６Ｘ１０ｃｍ）にポン
プ輸送する。ＵＶ２５４ｎｍの吸収がベースラインに達
するまでカラムを洗浄する。カラムに結合した蛋白質を
、５０ｍＭＮａＯΔｃ（ｐＨ４，０）中０．０　Ｍ　〜
１．０　Ｍ　ＮａＣｌ２の直線グラジェント（３０Ｍ）
を用いて１．８ｍｆｆ／分の流速で溶出する。１８−ず
つの個々の両分を集め、そして５Ｏ５−ＰＡＧＥにより
分析する。
ＭＲＰ−８、ＭＨＩ’−１４及びＭＲＰ−１４’は、約
０．８　Ｍ〜０、９　Ｍ　ＮａＣｊ＋に相当する２５０
艷〜２８０ＷＩＲの合計グラジェント容量の間の同じ画
分に一緒に溶出される。ＭＲＰ含有画分のプールをＹＭ
−１０膜（アミコン）上での限外濾過により濃縮し、そ
してＴＦＡ中１％にする。それぞれ純粋なＭＲＰ〜８、
ＭＲＰ−１４及びＭＲＰ−１４’の単離はＶｙｄａｃ　
２１４　ＴＰ　５１０逆相ＨＰＬＣカラム（ザ・セパレ
ーションズ・グループ、米国）上で達成される。カラム
を、水中０．１％ＴＦＡを７５％とアセトニトリル中０
．０７％ＴＦＡを２５％との混合物中で平衡化し、そし
て水中０．１％ＴＦＡを４５％とアセトニトリル中０．
０７％ＴＦＡを５５％との混合物で終る４５分間にわた
る直線グラジェントにより３ｍ２／分の流速で蛋白質を
溶出する。溶出液を２３５ｎｍでの吸収によりモニター
する。個々のピークを吸収の読みに従って手動で集める
。例１．１．に従って単離されたペプチドとの比較によ
りＭＲＰ−８、ＭＲＰ−１４及びＭＲＰ−１４’が同定
される。
汎τ　担たル４４３１田孔裂 ＭＲＰ４４と称する両分（■）（例１）の蛋白質２５硝
を室温にて６時間、１００μＺの５０　ｍＭ　Ｎ）１４
ＨｃＯ＋中０．５μｇのスタフィロコッカス・アウレウ
ス（鉦鉦鯉圏並西町　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ　８７’ロチ
アーゼ（クーパー・バイオケミカルス）と共にインキュ
ベートする。インキュベーション混合物の小アリコート
（２％）をＶｙｄａｃ　２１４　ＴＰ　５４１５逆相Ｈ
ＰＬＣカラム（ザ・セパレーションズ・グループ）上で
分析することにより消化の進行をモニターする。同じカ
ラム上で、水中０．１％ＴＦＡ１００％からアセトニト
リル中０．０７％ＴＦＡ１００％まで６０分間にわたり
、１＋＋＋ｊ！／分の流速で溶出することにより、ペプ
チド断片の調製分離を達成する。３個の両分を、２０．
７分（Ａ）　、２２．７分（Ｂ）及び２４．８分（Ｃ）
の保持時間において２２０ｎｍでのＵＶ吸収に従って手
動的に集める。
［ｉ　　ＭＲＰ−１４のス　　　ロコ・カス・ア　し　
ス画分Ａ、Ｂ及びＣ（例２）を真空蒸発せしめ、それぞ
れを２５ｕの０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解し、そしてア
プライド・バイオシステムス製の気相蛋白質シーケンサ
−モデル４７０によるアミノ酸配列分析にかける。
Ｎ−末端アミノ酸配列は次の通りである。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−（Ａ）＾１ａ−３ｅ
ｒ−Ｘ＋ｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−（Ｂ）Ｘｚ＋−
Ｘｚｚ−１１ｅ−（Ｃ） 上記の配列中ＸｎはＮ−末端からｎ番目にある未決定の
アミノ酸を示す。
以下余白 ！！ｌｊ、’：）−、単玄血ゞ白　　からのメツセンジ
ャー１．６Ｘ１０１０個の単核ヒト血液白血球をバフィ
ーコートから単離し、そしてヨーロッパ特許出願１ｋ１
６２，８１２に記載されている様にしてコンカナバリン
Ａにより２時間処理する。スピンナーカルチュアー中Ｒ
ＰＭＴ１６４０培地中（５％ＣＯ□）３７℃にて１６時
間のインキュベーションの後、３５０Ｘｇにて１５分間
の遠心により細胞を集める。約１０−のふわふわした細
胞ペレットを５ＱｍＲのＧｕＳＣＮ緩衝液に溶解し、そ
してツルバルーオムニミキサー（Ｉ００ｍｆ）中で最高
速度で９０秒間ホモジナイズする。次に、溶液を、１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐ）１７．５）、１０
０ｍＭ　　ＮａＣｊ！及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有す
る溶液ニヨりあらかじめ平衡化されたフェノール６０−
と混合する。６０ｍ１のクロロホルムを加え、混合し、
そして卓上遠心分離機中で３００Ｏｒｐｍにて遠心する
ことにより相分離を達成する。非粘性中間相のいくらか
を含む水相を集め、そして６０−の平衡化されたフェノ
ール及びクロロホルムを次々と加える。この混合物を遠
心し、そして水相及び非粘性中間相を回収する。すべて
の中間相が実質的に消失するまで、これらの段階を３〜
４回反復する。
２容量のエタノール（ＩＯＭ）を添加することにより核
酸を一２０℃にて沈澱せしめる。次の様にしてＲＮＡを
汚染ＤＮＡからさらに精製する。核酸を６艷の水に溶解
する。１．５ｍＮの０．５ＭＥＤＴ＾（ｐＨ７，５）、
次に７．５ｇの乾熱したＣｓＣｌ！及び２１５μＺのｌ
ＮＨＣｌ１の混合物を添加する。この溶液を、２本のＴ
ＳＴ４１チューブ（コントロン）中０．１ＭＥＤＴＡ　
（ｐＨ７，５）（最終）中５．７　Ｍ　Ｃ５Ｃｊ！のク
ッション２−上に重相する。チューブを水で満たし、そ
してＴＳＴ４１０−ター中で２０℃にて１６時間遠心す
る。操作の終りにほとんどの上滑を除去し、そしてチュ
ーブを手早く逆転させて排液した。ガラス状ＲＮＡペレ
ットを、渦動攪拌及び３７℃での加温（２分間）により
４滅の溶出緩衝液に溶解する。１０−のエタノールを添
加し、そしてＨＢ４０−ター（ツルパル）中で１０分間
遠心分離することによりＲＮＡを沈澱せしめる。このＲ
ＮＡ（９，５ｍ１ｒ）を短時間乾燥し、そしてＱ、　４
　ｍｌの溶出緩衝液中に溶解する。６Ｂ℃で２分間加熱
しそして氷上で冷却した後、ｏ、４４ｍｇの５　Ｍ　Ｎ
ａＣｌ１を加え、そしてこの溶液を、洗浄溶液で平衡化
した０、５ｇのオリゴ−ｄＴセルロース（タイプ７、フ
ァルマシア）を同容したカラムに適用する。サンプルを
次々の３回適用した後、カラムを１５艷の洗浄緩衝液で
洗浄し、そして結合したＲＮＡを４−の溶出緩衝液で溶
出する。溶出した材料を６Ｂ°Ｃにて２分間加熱し、冷
却し、そして０．４４ｍ１の５　Ｍ　ＮａＣＡを添加す
る。溶液を前平衡化したオリゴ−ｄＴセルロースカラム
に適用（３回）する。１５ｍＥの洗浄緩衝液で洗浄した
後、結合したＲＮＡを４＋ｎｆの溶出緩衝液で溶出する
。０．２５ｍｆの３　Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　（ｐＨ５，５）
及び１０−のエタノールを添加することによりＲＮＡを
一２０°Ｃにて一夜沈澱せしめる。沈澱（Ｉ１０ｐｇ）
を遠心分離（Ｉ６，０ＯＯｘ　ｇにて１５分）により集
め、０．４　ＷＦの水に溶解し、そして２５μｌの３　
Ｍ　Ｎａ０Ａｃ及びｌ　ｍｌのエタノールの添加によっ
て再沈澱せしめる。ドライアイス中で１０分間冷却した
後、エッペンドルス遠心機中で５分間遠心分離すること
によりＲＮＡを集める。ペレットを空気乾燥し、そして
１１０μｌの水に熔解する。
ｌ　　ポリアデニル化ＲＮＡのサイズ＼百９０■のポリ
アデニル化ＲＮＡ　（例４）を２００パの５０％ＤＭＳ
Ｏ，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣ６（ｐＨ７，５）、１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳ中で８０°Ｃにて２
分間変性せしめる。冷却及び３００Ｉｊ１の水の添加の
後、この溶液を、ＴＳＴ４１　ローター（コントロン）
中の１００ｍＭ　　ＮａＣｌ２　、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＩＣ４（ｐＨ７，５）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．
５％ＳＤＳ中５〜１５Ｗ／ｖ％のシュークロースの直線
グラジエン日１．５　ｍｌ上に重層する。４Ｌ　ＯＯＯ
ｒｐｍ、２５℃にて４．５時間遠心した後、３０個の０
．４−画分を集め、個々のＵＶスペクトルを記録する。
個々の両分からのＲＮＡを１５μ！の０．３　Ｍ　Ｎａ
０Ａｃ　（ｐＨ５，５）及びｌ　ｍｌのエタノールの添
加によって沈澱せしめる。−２０℃にて一夜インキユベ
ートした後、前記の様にして遠心によってＲＮＡを集め
、溶解し、そして再沈澱せしめる。最後にＲＮＡを２０
ｍの水に溶解する。
ＭＲＰ−８の既知の部分アミノ酸配列に基いて混合オリ
ゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチド混合物
１は５　’　−ＴＡＹＴＴＲＴＧＲＴＡＮＡＣＲＴＣ−
３’の組成を有し、ここでＡ、Ｔ、Ｇ及びＣはそれぞれ
アデノシン、チミジン、グアノシン及びシトシンであり
、Ｙ及びＲはそれぞれピリミジン（Ｔ、Ｃ）及びプリン
（Ａ、Ｇ）であり、そしてＮは４種類のデオキシヌクレ
オチドの内のいずれかである。
オリゴデオキシヌクレオチド混合物２は５　’　−ＴＣ
ＹＴＴＲＡＡＣＣＡＮＡＣＲＴＣ−３’から成り、ここ
でコードは上記と同じ意味を有する。それぞれ６４種類
及び３２種類の異る１　７−ｎ＋ｅｒから成るこれら２
個の混合物は、ＭＲＰ−８のアミノ酸１４−１９及び５
２−５７に相補的である可能性のあるＤＮＡ鎖である。
これらのオリゴデオキシヌクレオチドをＹ、Ｉｋｅ等、
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ　１９８３
　、■、４７７の方法に従って合成する。これらのオリ
ゴデオキシヌクレオチドの５′−末端を、標準的方法（
Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ。
Ｅ、Ｆ、Ｐｒ１ｔｓｃｈ及びＪ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　
”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ＋ａ　１ａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ″ｌＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２）
に従ってｒ　−”Ｐ　−ｄＡＴＰ（５０００Ｃｉ／　ｍ
ｍｏＡ　）及びポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシ
ア）を用いて放射性（Ｉ〜２×１１０９ｄｐ／■）にす
る。
２　ｐｉずつ２個の例５のサイズ分画されたＲＮＡを２
枚のフィルター（Ｐａｌ　Ｉ−Ｂｉｏｄｙｎｅ）にスポ
ットし、真空オーブン中で８０℃にて２時間加熱する。
このフィルターを３２℃にて３時間、０．９　Ｍ　Ｎａ
ＣＡ、１８０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ８
，０）　、６ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．５％ＳＤＳ及び
５０ｔｒｇ／ｍｌの剪断された単離ウシ胸腺ＤＮＡを含
有するデンハート溶液５〇−中でプレハイブリダイズせ
しめる。プレハイブリダイゼーション溶液を除去した後
、１枚のフィルターを２９℃にて３６時間、さらに５　
Ｘ　１０　’ｄｐｍのオリゴデオキシヌクレオチド混合
物１を含有するプレハイブリダイゼーション？容液１．
５　ｍｌ中でハイブリダイズせしめる。第二のフィルタ
ーを３２℃にて、５　Ｘ　１０７ｄｐｍのオリゴデオキ
シヌクレオチド混合物２を含有する同じ溶液中でハイブ
リダイズせしめる。ハイブリダイゼーションの終りにお
いて、フィルターを２５°Ｃ（フィルター１）又は２９
℃（フィルター２）にて、２５０ｍｊ！の０．６　Ｍ　
ＮａＣｊｌ！、０．１２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（
ｐＨ８，０）　、４ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳ
により、及び２５０ｍ１の０．３　Ｍ　ＮａＣ４，０，
０６Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｎ　　（ｐｌ＋８．０　）　、
０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳにより１５分
間ずつ４回、洗浄する。
フィルターを乾燥した後、フィルターをイルフォルト・
ファスト・タングステート・スクリーン（Ｔｌｆｏｒｄ
　Ｆａｓｔ　Ｔｕｎｇｓｔａｔｅ　５ｃｒｅｅｎ）を用
いて一８０°Ｃにて３日間Ｘ−線フィルムに暴露する。
２枚のフィルターを比較することにより、両分２３　（
９Ｓ）がほとんどのＭＲＰ−８ｍＲＮＡを含有すると推
定される。
次の組成：　　５’−ＴＡＹＴＧＲＴＧＲＡＡＩＧＴＲ
ＴＴＩＡＴＩＡＴＮＧＴ−３′　（式中、■はイノシン
である）のオリゴデオキシヌクレオチド混合物３、すな
わち例３のペプチド断片Ａのアミノ酸１−９をコードす
るｍＲＮＡに対して相補的である可能性のあるＤＮＡ鎖
である６４種類の異る２　６−ｍｅｒを、例６に記載し
たようにして合成し、そして放射性（Ｉ〜２Ｘ１０９ｄ
ｐｍ／１１ｇ）にする。
サイズ分画されたＲＮＡを例５に記載した様にして調製
する。但し、Ｑ、３　ｍｌずつの４０個の両分を集め、
そして沈澱したＲＮＡを４０μ！の水に溶解する。
２ｐｌずつ２個のこのＲＮＡを２枚のフィルター上にス
ポットし、８０℃にて乾燥する。フィルターをプレハイ
ブリダイズせしめ、そして５Ｘ１０７ｄｐｍの上記のオ
リゴデオキシヌクレオチド混合物３の存在下でハイブリ
ダイズせしめ、そして洗浄する。これらの操作は例６に
記載したようにして行うが、但しハイブリダイゼーショ
ン温度を３７℃とする。Ｘ−線フィルム上のレプリカを
比較することにより、画分１２及び１３がほとんどのＭ
ＲＰ−１４ｍＲＮＡを含有すると推定される。
以下余白 ３１　　ＭＲＰ−８のｃＤＮＡクローニング８．１．坦
」坦肪コ引敷裂 画分２３　（例６を参照のこと）からのＭＲＰ−８をコ
ードする３Ｈの９３ｍＲＮＡを４２℃にて９０分間、１
００ｎ＋Ｍ　　Ｔｒｉｓ−１（Ｃｊ！　　（４０℃にて
測定したｐ）ｌ　８．３　）、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ２ｚ
　、１４０ｍＭ　ＫＣｊ２．１０ｎ＋Ｍ　ＤＴＴ、　１
ｍＭの各ｄＮＴＰ、１００ｇ／ｍｆオリゴーｄＴＩ２−
１１１（ファルマシア）、９０ユニツトのＲＮａｓｉｎ
　（ゲノフィト）、４０ユニツトのＡＭＶ逆転写酵素（
ゲノフィト）及び３０ｐｃｉの’！　　”Ｐ　　ｄＣＴ
Ｐ　（３０００Ｃｉ／　ｍｍｏｊりを含有する反応混合
物５０μ！中でインキュベートする。２Ｉの０．５　Ｍ
　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）を添加することにより反応を
停止せしめる。０．１５　Ｎ　ＮａＯＨと共に６５℃に
て１時間インキュベートすることによりＲＮＡを分解す
る。２５１のＴｒｉｓ−ＨＣ４（ｐＨ８，０）及び６μ
ｌのＩＮＨ（Ｊ！の添加により溶液を中和する。ＳＤＳ
を０．５％に添加した後、ＴＮＥ緩衝液で平衡化された
フェノール／クロロホルム（Ｉ：　１）１００μｌによ
り溶液を抽出する。ＴＨＥ緩衝液中セファデックスＧ−
５０（ファルマシア）を収容する２−のカラムに前記の
水性相を通す。２Ｘ　１０６ｄｐｍ”　Ｐ　（Ｉ，６ｇ
＞の単離ｃＤＮＡを流過画分（０，４ｄ）から回収し、
そしてｌ　ｍｌのエタノールにより沈澱せしめる。沈澱
を遠心分離により集め、そして１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ
（ｐＨ６，９）　、１０　ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ！　。
２、５ｍＭ　ＤＴＴ、　７０ｍＭ　　Ｋ（Ｊ！　、　０
．５ｍＭの各ｄＮＴＰ及び４０ユニツトのＤＮＡポリメ
ラーゼ“大断片”（ベーリンガー）を含有する５０パの
反応混合物中で１５℃にて一夜、二本鎖化する。Ｓ１ヌ
クレアーゼによる消化のため、反応混合物を水３０μ！
、及びＩ　Ｍ　ＮａＣ７！　、２５０ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ
（ｐＨ４，５）　、５　ｍＭＺｎＳＯ４及び２，５％グ
リセリンを含有する溶液２０μ！、及び１μｌのＩＮＨ
Ｃ７！で稀釈する。２ユニツトの８１ヌクレアーゼ（フ
ァルマシア）を添加した後、混合物を３０℃にて３０分
間インキュベートする。５μｌの０．５ＭＥＤＴ八（ｐ
Ｈ７，５）　、５μｌのＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨｆＪ！　
　（ｐＨ８，３）及び５１ｄの２０％ＳＤＳを添加する
ことにより反応を停止せしめ、フェノール−クロロホル
ムにより抽出し、そして上記の様にしてセファデックス
Ｇ−５０上でクロマドグラフ処理する。２ｎｇの二本鎖
ｃＤＮＡを回収し、そしてエタノールで沈澱せしめる。
８．２．　　Ｅ、　　コリ　のｃＤＮＡライフ゛−リー
例８．１．のｄｓ　ｃＤＮＡをホモポリマーｄＣ−テイ
ルにより、２００ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ６，９
，１ｍＭ　ＣｏＣｊｉ！ｚ　、１ｍＭ　ＤＴＴ及び０．
７５岸ｄＣＴＰを含有する反応混合物２００　ｍ中で延
長する。３０℃にて１０分間予備加混した後、１２０ユ
ニツトのターミナル・デオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼ（ファルマシア）を加え、そして混合物を３
０°Ｃにて１５分間インキュベートする。４Ｉｌｌの０
，５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）及び２ｕｌの２０％Ｓ
ＤＳを添加し、そして前記のようにしてＤＮＡを抽出し
、クロマトグラフ処理しそして沈澱せしめる。４０ｎｇ
（２０ｍ）のこのｄＣ−テイルｃＤＮＡを８１　（Ｉ０
０ｎｇ）のオリゴ−ｄ　Ｇ　＋。−２゜テイルｐＵＣ９
ＤＮＡ　（ファルマシア）及び１７２〃のＴＮＥ緩衝液
と混合し、そして６５℃にて１０分間、４６℃にて１時
間、３７°Ｃにて１時間、及び室温にて１時間、次々と
インキュベートする。アニールされたｃＤＮＡを用いて
、Ｄ、Ｈａｎａｈａｎ、　ＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、＋　
１９８３、皿、５５７により記載されている様にして形
質転換のために調製されたコンビテン）　Ｅ　、　コＩ
Ｊ　ＨＢ１０１（ＬＭ１０３５株）細胞を形質転換する
。１μｌのアニールされたＤＮＡを２００ｐｌのコンピ
テント細胞に加え、そして３０分間氷上に置く。この方
法を６０回行う。９０秒間のヒートシュンク及び水中で
の２分間の冷却の後、チューブ当り０．８　ｍｌのＳＯ
Ｃ培地を加え、これを次に３７℃にて６０分間インキュ
ベートする。
インキュベーションの後、すべてのチューブを一緒にし
、そして２５ｔｔｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３
枚のマンコンキー寒天プレート（Ｉ２ｃ＋ｎ）上にプレ
ートする。これらのプレートを３７℃にて一夜インキユ
ベートする。プレート当り２５００個の生ずる組換体を
ナイロン膜（Ｐａｌｌ−Ｂｉｏｄｙｎｅ）上に拾い上げ
、そして２枚のレプリカを作る。マスターフィルターを
寒天プレート上で４℃にて貯蔵し、そしてＭａｎ３ａｔ
３ｓのハンドブックに記載されている様にしてコロニー
ハイブリダイゼーションのためにレプリカを処理する。
８．３．ｆｌｌスフ−ニング 例８．２．のレプリカフィルターを３２℃にて２時間、
０．９　Ｍ　ＮａＣｊｉ！　、０．１８Ｍ　Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ！　　（ｐＨ８，０）、６ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　
０．２％ＳＤＳ及び５０■／−の変性されたウシ胸腺Ｄ
ＮＡを含有する２×デンハート溶液１００艷中でプレハ
イブリダイズせしめる。密封されたプラスチックバッグ
中で、２　Ｘ　１０７ｄｐｍのオリゴヌクレオチド混合
物２　（例６）を含有する同じ溶液１−中で３６時間ハ
イブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション
の後、フィルターを洗浄し、そしてＸ−線フィルムに一
夜暴露する。両レプリカフィルター上に陽性が現われる
。６個の陽性クローンを増殖せしめ、そしてこれらのプ
ラスミドＤＮＡを制限分析のために分析する。
これらの６個のクローンからの最長のｃＤＮＡ挿入部（
約５００塩基対、クローン３）を選択して同じｃＤＮＡ
ライブラリー及び第二のｃＤＮＡライブラリーを再スク
リーニングする。この第二のｃＤＮＡライブラリーは、
全長ｃＤＮＡクローンを得るため次の様にしく１５１） て調製する。
８．４．　　　二ｃＤＮへ−イフ゛ラリ−ＭＲＰ−８を
コードする９Ｓ　ｍＲＮＡ　（例６の画分２３）１０Ｉ
ｌｌ（Ｉ■／艷）を２５パのＲＶＴ緩衝液、２．５４の
２０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物、５Ｉ１１のｌａｗ／ｍ＃オ
リゴ−”ｒ’＋ｚ−＋ｓ（ファルマシア）、１μｌのα
−”Ｐ　−ｄＣＴＰ　（Ｉ０μＣｉ、　３０００Ｃｉ／
　ｍｍｏｌ　）　、３ｐｌＲＮａｓｉｎ　（６０ユニツ
ト、バイオチック）、３ＩのＡＭＶ逆転写酵素（６６ユ
ニツト、ゲノフィト）及び２Ｉの水を含有する溶解中で
インキュベートする。この混合物を４２℃にて１．５時
間インキュベートし、次に２Ｉｌ！の０．５　Ｍ　Ｂ［
１ＴＡ（ｐＨ７，５）を添加することにより反応を停止
する。ＲＮＡを変性せしめ、そしてｃＤＮＡを例８．１
．のようにして集める。
このｃＤＮ八をオリゴ−ｄＣテイルにより、３２Ｊのｃ
ＤＮＡ　（２，８Ｉｇ）　、１０ｔｈｌの１Ｍカコジル
酸ナトリウム（ｐＨ７，０）　、５Ｉｌｌの１０ｍＭ　
ＣｏＣＡ２．５　ｐｌの１ｍＭＤＴＴ、及び１０μｃｆ
の３Ｈ−ｄＣＴＰ　（２０Ｃｉ／ｍｍｏｊ！、１０バ凍
結乾燥）を含有する反応混合物中で延長する。３７℃に
て５分間のプレインキュベーションの後、３μｌのター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（８
１ユニツト、ファルマシア）を加え、そして１０分間イ
ンキュベートする。５０ｐｌのＴＮＥ緩衝液を加え、そ
して溶液を０．１　ｍｆｆのフェノール／クロロホルム
混合液で抽出する。０．２　ｍｉのエタノールの添加及
びドライアイス上での冷却によりｃＤＮＡを沈澱せしめ
る。
遠心分離の後、ペレットを７０％エタノールにより洗浄
し、空気乾燥し、そして１３ｕ１の水に溶解する。
１３ｔｒｌの水、２５μｌのＲＶＴ緩衝液、２．５４の
２０　ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物、５　ｐＩの０．２＊／ｍ
ｌオリゴーｄ　Ｇ　＋□−７８（ファルマシア）、３μ
！のα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ　（Ｉ０ｍＣｉ／　ｍｌ、３
０００Ｃｉ／　ｍｍｏｌ　）及び３Ｉの逆転写酵素（６
６ユニソト、ゲノフィト）中上記ｃＤＮＡの溶液を４２
°Ｃにて１．５時間インキュベートする。２Ｉの０．５
　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）及び５０パのＴＮＥ緩衝
液の添加により反応を停止せしめ、そして混合物を０．
１５＋ｎｆｆ１のフェノール／クロロホルム混合物で抽
出する。水相をセファデックスＧ−５０カラム（ＴＮＥ
緩衝液中２．５ｍ）に適用し、そして１．３　ｔｔｇの
ｄｓ　ｃＤＮＡを含有する流通両分を集める。１ｍｌの
エタノールの添加及びドライアイス上での冷却によりＤ
ＮＡを沈澱せしめる。得られるベレットを３２〃の水に
溶解し、そして単離ｃＤＮＡについて前記したようにし
てオリゴ−ｄＣにより延長する。１μ！の０．５　Ｍ　
ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）の添加により反応を停止せしめ
、そしてサンプルを０．５ｍ幅のスロットを用いてＴＢ
Ｅ緩衝液中水平１％アガロースゲルに負荷する。５　Ｖ
　／　ｃｍにて１時間電気泳動した後、０．３５〜０．
７ｋｂの適当なサイズのｃＤＮＡを含有する領域を切り
出し、そして２個のマイクロ−コロジオンバッグ（サル
トリウム）に入れ、そして水に浸漬する。０．３−の水
を加え、そしてバッグを半濃度のＴＢＥ緩衝液を収容す
る電気泳動装置に入れる。ＤＮＡを５　Ｖ　／　ｃｍの
電極距離で２０分間電気泳動し、そして激しいピペット
操作によりバッグから回収する。０．６−のフェノール
／クロロホルム混合物により抽出した後、４０ＩＪ１の
３ＭＮａ０八ｃ（ｐＨ５，５）及び１．２ｍｌのエタノ
ールを加え、そして溶解を１０分間ドライアイス中で冷
却する。遠心分離（エッペンドルフ遠心機、５分間）の
後、１６４ｎｇのｄｓ　ｃＤＮＡを回収し、そして１８
ｐノの１０１１１Ｍ　Ｔｒ＋５−Ｈ（Ｊ　　（ｐ）１８
．０　）及びｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中に溶解する。
２０　ｐｉ　（２７ｎｇ）の上記ｃＤＮＡを８　ｔｔｌ
　（Ｉ００ｎｇ）のオリゴ−ｄＣｙｌｏ−２ｏテイＪし
ｐＵＣ９ＤＮＡ　（ファルマシア）とアニールし、そし
て得られたＤＮＡを用いて前記（例８．１）のようにし
てコンピテントＥ。
コリＨＢ１０１　（ＬＭ１０３５株）細胞を形質転換す
る。プレート当り２６００個の得られる組換体をナイロ
ン膜（Ｐａｉｌ−Ｂｉｏｄｙｎｅ）上に拾い上げ、そし
て２株のレプリカを作る。マスターフィルターを寒天プ
レート上４℃にて貯蔵し、そしてレプリカをコロニーハ
イブリダイゼーションのためにＭａｎｉａｔｉｓのハン
ドブックに記載されているようにして処理する。
８．５．久り匹二三ヱ久 クローン３（例８．３）の１Ｉｇのプラスミドからのｃ
ＤＮＡ挿入部を旧ｎｄｌＩ［及びＥｃｏＲＩ制限エンド
ヌクレアーゼにより消化し、そしてアガロースゲル電気
泳動により単離しそしてゲル溶出する。純粋なｃＤＮＡ
挿入部（Ｉ００ｎｇ）をアメルシャムの二ツクトランス
レーションキット（Ｎ、　５０００）を用いて、供給者
の指示に従って放射性にする。この放射性ｃＤＮＡプロ
ーブは５　ｘ　１０　”ｄｐｍ／μｇの比活性を有する
。
例８．４のレプリカフィルターを、０．９　Ｍ　ＮａＣ
７！、０．１８Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！　　（ｐＨ８
，０）　、６ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２％ＳＤＳ及び５０
■／　ｍｌの変性されたウシ胸腺ＤＮＡを含有する２メ
デシハート溶液１００−中で２時間プレハイブリダイズ
せしめる。密封されたプラスチックバック中熱変性され
たニックトランスレーションｃＤＮＡプローブ（６０Ｘ
　１０６ｄｐｉ）を含有する同じ溶液１−中で一夜ハイ
プリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションの
後、フィルターを０．９　Ｍ　ＮａＣ４、０，１８Ｍ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ　　（ｐＨ８，０）、６ｍＭＥＤＴ
Ａ及び０．２％ＳＤＳを含有する２００ｍｆの溶液中で
６５℃にて２回洗浄し、次に０．４５Ｍ　ＮａＣｌ１．
０．０９Ｍ　Ｔｒｉｓ’Ｈ（ＩＪ！　　（ｐｌ＋８．０
）　、３ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳを含有する
２００−の溶液中で６５℃にて２回、及び０．１５Ｍ　
ＮａＣｊ！　、０．０３Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ！（ｐＨ
８，０）　、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳを
含有する溶液２００ｍｆで２回洗浄する。フィルターを
Ｘ−線フィルムに一夜暴露し、そして両レプリカフィル
ター上に陽性が現われる。
ｌ　　ＭＲＰ−１４のｃＤＮＡクローニング９．１．ム
」皿Ｖ■星製 画分１２及び１３　（例７）からのＭＲＰ−１４をコー
ドするｍＲＮＡ各２０　ｍ（０，１２５＋ｎｇ／ｍＥ）
ずつを４２℃にて６０分間、７０ｍのＲＶＴ緩衝液、７
μ！の２０ｎ＋Ｍ　ｄＮＴＰ混合物、１０μｌの１■／
艷オリゴ−ｄＴ＋ｚ−＋Ｉｌ（ファルマシア）、３ｐｌ
のＲＮａｓｉｎ　（６０ユニツト、バイオチック）、２
ＩＪ１のＡＭＶ逆転写酵素（６６ユニソト、ゲノフィト
）及び７μｌのα−３２Ｐ　−ｄＣＴＰ　（Ｉ、ｃ＋ｃ
＋、　３０００Ｃｉ／　ｍｍｏ７１りを含有する溶液中
でインキュベートする。６μｌの０．５ＭＥＤＴＡ　（
ｐＨ７，５）の添加により反応を停止せしめる。
３．７５ｐｌのＩ　Ｎ　ＮａＯＨとの６５℃にて１時間
のインキュベーションによりＲＮＡを分解する。溶液を
２５ｐｌのＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　　（ｐＨ８，０）及び
６　ｐｌのＩＮＨｃｌの添加により中和する。ＳＤＳを
０．５％に添加した後、ＴＨＥ緩衝液で平衡化された１
００μｌのフェノール／クロロホルム（Ｉ：　１）によ
り溶液を抽出する。水相を、ＴＮＥ緩衝液中セファデッ
クスＧ−５０を含有する２　ｍ１ｌＯカラムに通す６２
×１０５ｄｐｍ３２Ｐ　（Ｉ，Ｏｐｇ）　　の−末鎖ｃ
ＤＮＡを流過両分（０，４ｍｇ）から回収し、そしてｌ
　ｍｌのエタノールの添加により沈澱せしめる。遠沈を
遠心分離により集める。
ｃＤＮ八をオリゴ−ｄＣティルにより、例８，４におい
てＭＲＰ−８ｃＤＮＡについて記載したようにして延長
し、次にＲＶＴ緩衝液中ｄＮＴＰ混合物、オリゴ−ｄ　
Ｇ＋ｚ−＋ｅ　（Ｉ’　　”Ｐ　　ｄｃＴＰ及ヒ３　ｔ
ｄ（７）逆転写ＩＭ素により３７℃にて６０分間処理す
る。フェノール／クロロホルム抽出の後、水相をセファ
デックスＧ−５０カラム（ＴＨＥ緩衝液中２．５ｍＥ）
に適用し、そして０．５３Ｍｇのｄｓ　ｃＤＮＡを含有
する流過両分（０，４ｍ＃）を集める。ＤＮＡをオリゴ
−ｄＣティルにより延長し、次に０．５　ｃｍ幅のスロ
ットを用いてＴＢＥ緩衝液中水平１％アガロースゲルに
適用する。５　Ｖ　／　ｃｍにて１時間の電気泳動の後
、０．５〜０．７５ｋｂの適当なサイズを有するｃＤＮ
Ａを含有する領域を切り取り、そして例８．４において
記載した様にして電気泳動する。１１００ｎのｄｓ　ｃ
ＤＮＡを回収し、そして２００μ／の１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−Ｈ（Ｊ！　　（ｐＨ８，０）及び１　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａに溶解する。
９．２．　　Ｅ、　　コリ　ｃＤＮＡライフ゛ラリ−例
９．１のｄＣ−テイルｄｓ　ｃＤＮＡを２０ｎｇ（２０
μＺ）　　３０ｔｉｌ　（６０ｎｇ）のオリゴ−ｄＧ＋
ｏ−ｚＯテイルｐＵｃ−ＫＯＤＮＡ及び２０ＩＩＩの１
０倍濃度のＴＮＦ緩衝液と混合し、そして６゛５℃にて
１０分間、４６℃にて１時間、３７℃にて１時間及び室
温にて１時間、次々とインキュベートする。ｐＵＣ−Ｋ
ＯプラスミドはｐＵｃ９の誘導体（ファルマシアから得
られる）であり、このプラスミドにおいてはＩａｃ　Ｚ
遺伝子のプロモーター／オペレーター領域がプロモータ
ー配列のすく外側のＨａｅ　Ｕ制限部位とポリリンカー
内の旧ｎｄｌｌＴ制限部位間で除去されており、ｐＵＣ
９プラスミドの他の配列は変化しないままである。
アニールされたｃＤＮＡプラスミドＤＮＡを用いて、Ｍ
ＲＰ−８ｃＤＮＡについて例８．２に記載したよ゛うに
してコンピテントＥ、コリ１（Ｂ１０１　（ＬＭ１０３
５株）細胞を形質転換する。それぞれ２５００個の組換
体を含む６枚のマツコンキー寒天プレートから２枚のレ
プリカを作る。ナイロン膜上のマスターフィルターを寒
天プレート上で４℃にて貯蔵し、そしてレプリカをコロ
ニーハイブリダイゼーションのために処理する。
９．３．ｆｆｉ死決定 例８．３において前スクリーニングについて記載したよ
うにして、密封されたプラスチックバッグ中で例７のオ
リゴヌクレオチド混合物３を含有する溶液中で３７℃に
てハイブリダイズせしめる。
陽性コロニーが増殖し、そしてそれらのプラスミドＤＮ
Ａを制限分析のために単離する。
約５００ヌクレオチドの挿入部を有するｐＭＲＰ−１４
−１０と称する組換プラスミドを選択して同じｃＤＮＡ
ライブラリーを再スクリーニングする。このクローンｐ
ＭＲＰ−１４−１０のプラスミド１ｎからのｃＤＮＡ挿
入部を旧ｎｄｌｌＩ及びＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア
ーゼで消化することにより取り出し、そしてニックトラ
ンスレーションキットを用いて放射性５　Ｘ　１０８ｄ
ｐｍ／μｇの比活性）にする。このプローブを用いて例
８．５に記載したようにして例９．２のレプリカフィル
ターを再度スクリーニングする。両レプリカフィルター
上に陽性が現われる。
例１０．　　ＭＲＰ−８をコード　るＤＮＡ配置クロー
ン３　（例８．３）のｃＤＮＡ挿入部及び例８．５の陽
性クローンからの多数のｃＤＮＡ挿入部を選択して、よ
く知られているＳａｎｇｅｒの方法、並びにＭａｘａｖ
ｌ及びＧ１１ｂｅｒｔの方法を用いて完全なヌクレオチ
ド配列を決定する。コード領域の配列を両鎖にらいて決
定し、オーバーラツプする断片について決定された配列
決定方策において制限部位を使用する。
この方策を第２図（パートＣ）中に要約し、そして制限
部位を示す（パー）Ｅ）。クローン３のコードｃＤＮＡ
配列（及びそれがコードするアミノ酸配列）を式（■）
に示す。第２図のバー）ＡはこのｃＤＮＡの全配列を示
す。特別の特徴及びクローン３のこのｃＤＮＡと他のク
ローンとの間の相違を番号で示し、そして下記する。
１．１位：クローン３の末端、６Ｂ位までの配列はクロ
ーン３にのみ存在し、そして該 遺伝子中に見出されない。
２、　６９位：クローン８及び１５の末端；クローン３
及び８ではＡであり、そしてクロー ン１５ではＴである。
３．７２位：クローン３中ＧＧＣＡＡＡからクローン８
及び１５中ＴＣＴＣＴＴに６塩基が変化している。
４．８６位：クローン７の末端。
５、　１０２位：クローン１５において１７塩基ＡＡＧ
ＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣＡＧが挿入されている。
６、　１０８位：クローン１４の末端。
７、　１０９位：クローン２及び１１０　（７）末端。
８、　１１３位：クローン７，８．１４及び１５におい
てＴが挿入されている。
９、　１１５位：クローン２及び１１０において塩基が
Ｔに変化している。
１０、１２４位：コード領域の開始。
１１、３７８位：該遺伝子中に見出されないＡＡがクロ
ーン２に挿入されている。
１２、４０３位：コード領域の末端。
１３、４７５位：ポリＡ−ティルの開始。
劃」」エ　ＭＲＰ−１４をコード　るＤＮＡ配置２個の
クローン（例９．３　、ｐＭＲＰ−１４−１０及びｐＭ
ＲＰ−１４−１６）のｃＤＮＡ挿入部を選択し全ヌクレ
オチド配列を決定する。この方法を第３図に示す。これ
らのクローンのコードｃＤＮＡ配列（及びそれがコード
するアミノ酸配列）は同じであり、そして式（ＩＸ）で
与えられる。
他の３個のクローン（ｐＭＲＰ−１４−１５，１８及び
１９）を３′−末端について分析する。すべてが式（Ｉ
Ｘ）において示されるものと同一の配列を示し、ｍＲＮ
Ａの天然３′−末端を欠く。
ｔｒｐプロモーター及びＭＲＰ−８をコードするＤＮＡ
挿入部を含有するＥ、コリのための発現ベクターを、ヨ
ーロッパ特許出願ＥＰ　１４６，７８５中に対応ずるニ
グリンＣ発現ベクターについて記載されているのと実質
的に同じ方法により調製する。
１２．１．５久え二■慮製 ２０■のプラスミドｐＨＲ４１４８（ＥＰ　１４６，７
８５）を、ＢａｍＨＩを用いて完全消化する。３ユニツ
トのウシ小腸アルカリホスファターゼを用いて末端を脱
リン酸化する。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム混合
物で抽出し、次にＥｃｏＲＩにより完全消化する。
ベクターＤＮＡを例８．４においてｃＤＮＡについて記
載したアガロースゲル電気泳動及び電気溶出にまり単離
する。ベクターＤＮＡを水に０．５μｇ　／　ｍｌの濃
度で溶解する。
１２．２．ユノ左二夏皿製 ５　　’　　−ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＧＡＧＣ
−３’　　及び　５　　’　　−ＴＣＡＧＴＣＡＧＣＡ
ＴＧ−３’を標準的方法（Ｈ，Ｒ４ｎｋ等、Ｎｕｃｌｅ
ｉｒＡｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　１９８４、耳、
６３６９）を用いて合成する。２■の短い方のオリゴヌ
クレオチドをＡＴＰ及びヌクレオチドキナーゼを用いて
リン酸化し、ソシて２ｔｔｇの脱リン酸化された大きい
方のオリゴデオキシヌクレオチドにＤＮＡリガーゼによ
り連結する。連結に続き、ｄｓ　ＤＮＡをＡｌｕｌによ
り完全消化する。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム混
合物により抽出し、エタノールにより沈澱せしめ、そし
て１０ΔＨ２０に？容解する。
１２．３．腫λ」」ウソｉ」装 ２０ｐｇのクローン３のｃＤＮＡ　（例８．３）をＢａ
ｍＨ１及びＰｖｕ　Ｕにより完全消化し、そして約４ｓ
ｏｂｐのｃＤＮＡ挿入部をアガロースゲル電気泳動及び
ゲル溶出により単離する。３μｇのこのＤＮＡ断片をＡ
ｌｕＩにより部分消化し、そして約３４０ｂｐの断片を
上記の様にして単離する。７０℃１ｇのこのＤＮＡを８
μ！の水中例１２．２のリンカ−ＤＮＡ溶液８Ｉに連結
する。得られるＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによ
り完全消化し、そして約４４０ｂｐの得られる断片をＰ
ＥＧＥ及び電気溶出により単離する。
１２．４．ベクターと　　会の゛′士 引例１２．１ベクター０．５硝及び例１２．３の挿入部
−リンカ−ＤＮＡ５０ｎｇを連結する。得られるＤＮＡ
を使用して上記（例８．２）の様にしてコンピテントＥ
、コリＨＢ１０１　（ＬＭ１０３５株）細胞を形質転換
する。予想通りの制限酵素パターン及び挿入部のＤＮＡ
配列を示す組換体ｐＭＲＰ−８−ｔｒｐをＭＲＰ−８の
発現のために選択する。
１２．５．　ｕ ｐＭＲＰ−８−ｔｒｐ　（例１２．４）を含有するＥ、
コリを、１１当り７ｇのＮａ２ＨＰＯ４，３ｇのＫＨ２
ＰＯ，，０，５ｇのＮａＣＪ！、１ｇのＮＨ４ＣＪ！　
、５　ｇのグルコース、０．０２ｇのＣａＣＡｚ　、０
．２５ｇのＭｇＳＯ４，２５ｇのカザミノ酸、０．１ｇ
のチアミン及び５０■のアンピシリンを含有する培地２
００ｍＮ中で３７℃にて一夜増殖せしめる。培養物を、
１２．５Ｉｇ　／　ｍｅのβ−インドール酢酸が補充さ
れた、あらかじめ加温された上記と同じ培地で稀釈する
。４．５時間後、光学濃度０Ｄ６５ｏが１．３に達する
。細胞を遠心により集める。ｐＨＲ１１４８を含有する
Ｅ、コリを用いて対照培養物を同様にして調製する。
１２．６．−史ｔテ：りＩ１日 細菌ペレットを５Ｑｍｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１
１！　　（ｐＨ８、０）　、３０ｍＭ　ＮａＣｌ１及び
１　ｍｇ　／　ｍｌ卵白リゾチーム中に両懸濁する。こ
の懸濁液を水中に１時間保持する。０．１　ｍＭ　ＰＭ
ＳＦを添加し、そして液体窒素中での凍結及び３７℃で
の解凍のサイクルにより細胞を破壊する。５Ｓ３４０−
ター（ツルパル）中４℃、１７０００ｒｐｍでの３０分
間の遠心により細胞溶解物を透明にする。
１２．７．　　、　、−”几　　　　　５ｏｎｉｆｉｅ
ｄ）例１２．５の細菌ペレットから調製された５０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８，０）　、３０　ｍＭ　ＮａＣＪ！
及び０．１％エタノールアミン中細胞懸濁液（ｏ　Ｄ６
５．　＝　２０　）　２２．５ｍ２を１８ｇの尿素と混
合する。懸濁液を、９．５　ｍプローブ及び２４ミクロ
ン強度を用いるＭＳＥソニプレプ１５０により３０分間
隔で３×３０秒間音波処理する。ツルパル５Ｓ３４０−
ター中２０℃、１７０００ｒｐｍにて３０分間遠心する
ことにより細胞溶解物を透明にする。上滑を０．１ｍＭ
のＣａＣｊ２ｚ。
ＭｇＣＮｚ　、　　ＣｏＣｊｌ！ｚ　、　　ＺｎＣＡｚ
　、　　ＭｎＣｊ！２　、　ＣＬＩＳＯ４及びＦｅＳＯ
４とし、そして１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７，５）
、１３０ｍＭ　　ＮａＣｌ及び０．１　ｍＭの上記と同
じ塩の溶液を３回交換して透析する。透析物を、例１２
゜６に記載したような遠心分離により透明にする。
■上表　ｔｒ　　プロモー　−〇　′の　とでのＥ。
ｔｒｐプロモーター及びＭＲＰ−１４をコードするＤＮ
Ａ挿入部を含有するＥ、コリのための発現ベクターを、
例１２に記載したのと実質的に同じ方法により調製する
。
１３．１．ユツ功コが引」翳 標準的方法（Ｈ，Ｒｉｎｋ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１９８４、■、６３６９）を用い
て次のオリゴデオキシヌクレオチド：　　（Ｉ）５　’
　−ＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧ
ＣＡＧ−３’、（２）５　’　−ＣＴＧＣＧＡＣＡＴＴ
ＴＴＧＣＡＡＧＴＣＡＴＧ−３′、（３）　　５　’　
−ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＣＡＧ−３’　ａｎｄ（４）
５　’　−ＣＴＧＣＧＡＣＡＴＧ−３’を合成する。オ
リゴデオキシヌクレオチド１及び３を、ＡＴＰ及びポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて標準的方法によりリン酸
化する。リン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド１
と未リン酸化オリゴデオキシヌクレオチドの等モル混合
物、及びリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド３
と未リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド４の等モル混
合物を調製する。混合物１−２を用いてＭＲＰ−１４を
発現するプラスミドを造成し、そして混合物３−４を使
用してＭＲＰ−１４の最初の４ヌクレオチドが欠失した
ＭＲＰ−１４ｄを発現するプラスミドを造成する。
１３．２．会久久二■■裂 例１２．１において調製したプラスミドｐＨＲ１１４８
からのベクターＤＮＡ１■ずつを、それぞれ例１３．１
のリンカ−混合物１−２、及び３　４（５０ｐｍｏＡ）
と連結する。アガロースゲル電気泳動及びゲル溶出によ
り遊離リンカ−からベクターＤＮＡを分離する。１０ｐ
ｇのクローンｐＭＲＰ−１４−１０ｃＤＮＡ（例９．３
）をＢａｍＨＩ及びＰｖｕ　Ｈで完全消化し、そして約
４３０ｂｐのｃＤＮＡ挿入部をアガロースゲル電気泳動
及びゲル溶出により単離する。２５■ｇずつのこのｃＤ
ＮＡ挿入部を０．２　ｎのベクター−リンカ−１−２（
ＭＲＰ−１４）及び０．２μｇのベクター−リンカ−３
−４（ＭＲＰ−１４ｄ）に連結する。生ずるＤＮＡを用
いて前記の様にしてコンピテントＥ、コリＨＢＩ吋細胞
（ＬＭ１０３５株）を形質転換する。予想通りの制限酵
素パターン及び挿入部のＤＮＡ配列を示す組換体ｐＭＲ
Ｐ−１４−ｔｒｐ及びｐＭＲＰ−１４ｄ−ｔｒｌ）を、
それぞれＭＲＰ４４及びＭＲＰ−１４ｄの発現のために
選択する。
ｐＭＲＰ−１４−ｔｒｐ又はｐＭＲＰ−１４ｄ−ｔｒｐ
　（例１３．２）を含有するＥ、コリを例１２．３に記
載したようにして増殖せしめそして処理する。
細胞をリゾチームで処理するか、又は尿素溶液中での音
波処理によって破壊し、そして細胞溶解物を例１２．６
及び１２．７に記載したようにして処理する。
１４．１．さ久叉二少遣双 プラスミドｐＰＬｃ２４　（Ｅ、Ｒｅｍａｕｔ、　Ｐ、
５ｔａｎｓｓｅｎｓ及びＷ、Ｆｉｅｒｓ、　Ｇｅｎｅ　
１９８１、■、８１）をＥｃｏＲＩにより消化し、次に
Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ及びｄＮＴＰで処理して平滑
末端化する。ＤＮＡをＢａｍ）Ｉ　Ｉで処理し、そして
生ずるベクターＤＮＡをアガロースゲル電気泳動及び電
気溶出により単離する。ｐＭＲＰ−８−ｔｒｐＤＮＡ　
（例１２．４）をＢａｍＨＩにより完全消化し、そして
Ｈｐａ　Ｉにより部分消化する。約４４０ｂｐの断片を
アガロースゲル電気泳動及び電気溶出により単離する。
この断片をｐＰＬｃ２４由来のベクターＤＮＡに連結し
、そして生ずるＤＮＡを使用して野性型Ｅ。
コリに１２を形質転換する。形質転換体を４０■のアン
ピシリンを含有するし一プレートにプレートする。組換
体の標準的配列分析を行って造成の正しさを確認する。
正しい配列のＤＮＡを使用してＥ、コリＷ３１１０及び
）１８１０１株（いずれもλｃＩ８５７を有する）（Ｒ
ｅｍａｕｔ等前に引用）を形質転換する。
形質転換体を４０ｎ／−のカナマイシン及びアンピシリ
ンを含有するし一プレート上にプレートする。得られる
組換体１１ＭＲＰ−８−ＰＬを発酵のために使用する。
１４．２．企−酵 組換体ｐ）ＩＲＰ−８−Ｐ＋−を、４０ｔｎｒ／ｍｌの
アンピシリン及びカナマイシンを含有するＬＢ培地中で
３０°Ｃにて一夜増殖せしめる。培養物を同じ培地によ
り１：５で稀釈し、そして４２℃にて２．５時間インキ
ュベートする。例Ｉ２，６又は１２．７に記載したよう
にして細胞を溶解せしめる。
ｐＭＲＰ４４−ｔｒｉ）及びｐＭＲＰ−１４６−ｔｒｐ
のそれぞれとプラスミドｐＰＬｃ２４とからベクターを
造成し、そしてこれを用いて例１４．１に記載したよう
にしてＥ、コリに１２、Ｗ３１１０及びＨＢ１０１を形
質転換する。生ずる組換体１）ＭＲＰ−１４−ＰＬ及び
ｐＭＲＰ−１４ｄ−ＰＬを例１４．２に記載したように
してＬＢ培地中で増殖せしめ、そして溶解する。
６１１ｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／　ＰＨ０−Ｔ
ＰＡ１２−２　（ヨーロッパ特許出願ＥＰ　１４３，０
８１）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩにより完全
消化する。６．８　ｋｂ及び２．４ｋｂのサイズの生ず
るＤＮＡ断片をエタノールで沈澱せしめ、そして４００
ｔｒｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ４（ｐＨ８，０）中
に再懸濁する。４．５ユニツトのウシ腸アルカリ性ホス
ファターゼ（ベーリンガー・マンハイム）を加える。混
合物を３７℃にて１時間インキユヘートする。６５°Ｃ
にて１．５時間のインキュベーションによりホスファタ
ーゼを不活性化する。溶液を１５０ｍＭ　　ＮａＣＪ！
に調整する。１５０ｍＭＮａＣｊ２及び１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡを含有する１　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ
７，５）で平衡化された１００μ！のベッドのＤＢ５２
（ワットマン）陰イオン交換体に適用する。同じ緩衝液
で洗浄した後、ＤＮＡを４００μｌの１．５ＭＮａＣｊ
！　、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，
５）及び１ｍＭＥＤＴＡで溶出し、そしてエタノールに
より沈澱せしめる。大６．８５ｋｂＢａｍＨＩ断片を、
ＴＢＥ緩衝液中１％アガロースゲル上で小断片から分離
する。ＤＮＡ断片をゲルから電気溶出し、ＤＥ５２陰イ
オン交換クロマトグラフィー（前記参照のこと）により
精製し、エタノールにより沈澱せしめ、そして水中に０
．１　ｐ　ｍｏρ／Δの濃度で再懸濁する。
出願ＥＰ、１００．５６１）をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ
Ｉで消化する。
生ずる３個の断片をＴＨＥ緩衝液中１．２％アガロース
ゲル上で分離する。５３４ｂｐ　ＢａｍＨＩ　−Ｅｃｏ
ＲＴ断片がＰＨ０５プロモーターを含んで成る。ＤＮＡ
断片をゲルから電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグラフィ
ーにより精製し、エタノール沈澱せしめ、そして０．１
ｐｍｏβ／ｌｒｉの濃度に再懸濁する。
１６．３．　ＭＲＰ−８をコードする０、　４　ｋｂ　
ＤＮＡ　　　の゛Ｊ胛１１０１Ｉのプラスミドｆ１ＭＲ
Ｐ−８−ｔｒｐ　（例１２．４）をＢａｍＨＩ及びＥｃ
ｏＲＩで消化する。生ずる２種類のＤＮＡ断片を１．２
％アガロースゲル上で分離する。
０．４ｋｂの断片を上記のようにして単離し、そして水
に０．１　ｐｍｏｊ！　／ｌｒｌの濃度で再懸濁する。
１６．４．旦凡人肌片■迷猪 ０、１　ｐ　ｍｏｂ　　（０，４５μｇ）の６．８　ｋ
ｂＢａｍＨＴベクター断片、０．２　ｐｍｏｊ！　　（
７０ｐｇ＞の５３４ｂｐ　ＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩ　
ＰＨ０５プロモ一ター断片及び０．２　ｐ　ｍｏ７！（
５２ｎｇ）のｐＭＲＰ−８−ｔｒｉｐの０．４　ｋｂＥ
ｃｏＲＴ　−ＢａｍＨ■断片を、１５ｐｌの６０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＧ
＃２．　１０ｍＭ　ＤＴＴ　、　１ｍＭ　ＡＴＰ及び６
００ユニツトの７４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）
中で１５℃にて６時冊連結する。連結混合物の１１１１
のアリコートをカルシウム処理された形質転換コンピテ
ントＥ、コリＨＢ１０１細胞１００μｌに添加する。
１２個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーヲ１
００μｇ　／　ｍｅのアンピシリンを含有するＬＢ培地
中で個別に増殖せしめる。Ｈｏｌｍｅｓ等の方法（Ａｎ
ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９８１．１１４．１９３
）に従ってプラスミドＤＮＡを調製し、そしてＢａｍＨ
Ｉ及び旧ｎｄｌｌ［／ＥｃｏＲ１消化により分析する。
７８０ｂｐ　ＢｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌＩ断片の出現
がＰＨ０５プロモーター−ＭＲＰ−８ＤＮＡ挿入部の正
しい方向を示す。このようなりローンを単離し、そして
ｐＪＤＢ２０７Ｒ／皿卯、ＭＲＰ−８と命名する。
サッカロミセス・セレビシエー中でのＭＲＰ−１４及び
ＭＲＰ−１４６のためのプラスミドを、プラスミドｐＪ
ＤＢ２０７Ｒ／　ＰＨ０５−ＴＰ＾１２−２、並びにｐ
ＭＲＰ−１４−ｔｒｐ及びｐＭＲＰ−１４６−ｔｒｉ）
の０．４　ｋｂＢｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ断片から、例
１６に記載されているようにして調製する。
Ｅ、コリＨＢ１０１細胞の形質転換されたアンピシリン
耐性コロニーを１１００ｐ／ｍｅのアンピシリンを含有
するＬＢ培地に個別に増殖せしめる。プラスミドＤＮＡ
を調製しそしてＢａｍＨＩ及び旧ｎｄ］ＩＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ消化により分析する。７８０ｂｐのＥｃｏＲｌ−Ｈｌ
ｎｄｎｌ［断片の出現がＰＨ０５プロモーター−ＭＲＰ
４４又は−ＭＩＩＰ−１４６ＤＮＡ挿入部の正しい方向
を示す。この様なりローンを単離し、そしてそれぞれｐ
ＪＤＢ２０７Ｒ／皿−ηＲＰ−１４、及びｐＪＤＢ２０
７Ｒ／　ｐＨ０５−ＭＲＰ−１４ｄと命名する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／貫曵ト１’１ＲＰ−８、
ｐＪＤＢ２０７！１／皿−ＭＩＩＰ−１４、及びｐＪＤ
Ｂ２０７Ｒ／　ＰＨ剥−肝Ｐ−１４ｄを、）１ｉｎｎｅ
ｎ等（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＪＳ
Ａ　１９７８、頚、１９２９）により記載されている形
質転換法を用いて、サッカロミセス・セレビシエーＧＲ
Ｆ−１８（α、」亘３−１１、ｈｉｓ　３−１５　、ｌ
ｅｕ　２−３、ｌｅｕ　２−１１２、Ｋａｎｌ＋）に導
入する。形質転換された酵母細胞をロイシンを欠く酵母
最少培地上で選択する。単独の形質転換された酵母コロ
ニーを単離し、そしてサッカロミセス・セレビシエーＧ
ＲＦ１Ｂ／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／町匹−ＭＩ’１Ｐ−８、
ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／贋−ＭＲＰ−１４及び
ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ部−ＭＲＰ−１４
ｄと命名する。
炎上ｌ　ン　−された　　−　の 前記形質転換された酵母株サッカロミセス・セレビシエ
ーＧＩ？Ｆ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／力川ト肝Ｐ−８、
ＧＲＦ１Ｂ／　ｐＪＤＢ２０７Ｒ／　ＰＨ邸−鼎Ｐ−１
４、及びＧＲＰ１８／　ｐＪＤＢ２０７Ｒ／鷹−ＭＲＰ
−１４６を、５０滅の酵母最少培地（アミノ酸を含有し
ないディフコ・イースト・ナイトロジエン・ベースに２
％のグルコース及び２０■／ｌのＬ−ヒスチジンを添加
したもの）中で３０℃にて２５時間、３Ｘ１０７細胞／
−の濃度まで振とうする。細胞を０．９％ＮａＣ１で洗
浄し、そして０．０３ｇ／ｊ！のに１１２ＰＯ４，１ｇ
／βのＫＣｌ、１０ｇ／βのＬ−アスパラギン（（ＮＨ
ｔ）　２ＳＯ４の代りに）、２％グルコース及び１　ｇ
／ｘのし一ヒスチジンヲ含有するディフコ・イースト・
ナイトロジエン・ベース培地（アミノ酸を含有しない）
の配合に従って調製する。培地に出発ＯＤ、。。が０９
２５になるように接種する。細胞を３０℃にて２４時間
増殖せしめ、そして０Ｄ６ｏｏがこの時点で収得する。
３５ｄの低Ｐｉ培地の細胞を遠心分離により集め、そし
て全４ｍβの冷６６ｍＭリンサンナトリウム（ｐＨ７，
４）及び０．１ｖ／ｖ％トリトンＸ−１００の緩衝液中
に再懸濁する。細胞懸濁液を３０ｍ２のコレツクスチュ
ーブに移し、８ｇのガラスピーズ（直径０．４ｇｍ）を
添加し、そして懸濁液をポルテックスミキサー（サイエ
ンティフィックインスッルトンッ社、ＵＳＡ）上で全速
で４分間振とうし、そして次に水浴中で冷却する。この
方法によって９０％以上の細胞が破壊される。細胞破片
及びガラスピーズを、ツルパルＨＢ−４０−ター中４℃
、８０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離により沈澱せ
しめる。上清をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、液
体窒素で凍結し、そして−６０℃にて貯蔵する。
１（Ｃｌ、０．０１％ＤＴＴ　（ｐｌ＋８．５　）に対
して透析（スペクトラボール膜１１ｈ３．３．５　ｋＤ
カットオフ、スペクトラム・メディカル・インダストリ
ーズ）する。
透析された溶液を透析緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥト
リスアクリルＭ　（ＬＫＢ）イオン交換カラム（２，６
Ｘ１０ｃｍ）上にポンプ輸送する。サンプルを負荷した
後、ＵＶ２５４ｎｍの吸収がベースラインレベルに対す
るまで（ユビコード、Ｓ　、ＬＫＢ）、’＋ラムを透析
緩衝液で洗浄する。カラムに結合した蛋白質を、透析緩
衝液中０．０Ｍから０．２Ｍに上昇するＮａＣｌ１の直
線グラジェントにより、次に透析緩衝液／　０．２　Ｍ
　ＮａＣＡ　　（８０ｍｌ＞及び透析緩衝液／　１．　
ＯＭ　ＮａＣｊ２　（２００ｍｆ）で１．８ｍｌ／分の
流速にて溶出する（ペリスタポンプＰ−ｒ、ファルマシ
ア）。
個々の９　ｍｌの両分（ウルトロラック■、ＬＫＢによ
り集める）を１５％ポリアクリルアミドスラブゲル上５
ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ＩＩ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａ
ｔｕｒｅ　１９７０、■、６Ｂ０〕により分析し、そし
てそれらのＭＲＰ−８含量に従ってプールする。１８０
〜３８０μＳの間で溶出する両分のプール（ビオラド導
電モニター）を限外濾過により（ＹＭ−１０膜、アミコ
ン＞　ｔＳ縮して５．５艷の容量にする。
ＭＲＰ−８を含有する例１２．７．１４．２及び１９の
粗細胞溶解物のサンプルを同様にして処理する。
２０．２．サイズ　、クロマトグーフィー例２０．１か
らの濃縮されたプールを、ＨＰＬＣポンプ２１５０、Ｌ
ＫＢからの２チヤンネルレコーダー２２１０及びＫｒａ
　ｔｏｓからのＨＰＬＣＵＶ検出機スペクトロフロー７
５７から成る）ＩＰＬＣ系で、３０ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ及
び１５０ｍＭ　ＮａＣｊ！　　（ｐＨ６，５）中で平衡
化されたＧ３０００ＳＷＧ高速ゲル濾過カラム（ＬＫＢ
）により分離する。適用された最大サンプル容量は２　
ｒｄであり、流速は３−７分であり、そして両分は１分
間ごとに自動的に集める（フラクションコレクター・ス
ーパーラック、２２１１、ＬＫＢ）。５ＤＳ−ＰＡＧＥ
による分析に基いて、溶出容量１６３ｍ１〜１８２ｄの
間で溶出する両分をプールし、そして上記のようにして
限外濾過により６艷の容量に濃縮する。
以下余白 ２０．３．モノＱカームにお番る８　　イオン六　り例
２０．２の濃縮されたプール０．８　ｍｌを３　ｍｌの
水で稀釈し、そして希アンモニアによりｐＨ８，５に調
整する。この溶液を２０ｍＭジェタノールアミン−ＨＣ
ｌ　（ｐｌ（８，５）中で平衡化されたモノＱＨＲ５１
５カラム（ＦＰＬＣ、ファストプロティン、ポリペプチ
ド、ポリヌクレオチド液体クロマトグラフィー系、ファ
ルマシア）に適用する。このカラムを１２ｍ１のジェタ
ノールアミン緩衝液で洗浄し、そして同じ緩衝液中０．
０５〜０．１２５Ｍ　ＮａＣｊ！の直線ＮａＣ７！グラ
ジエントにより、２１分間にわたり１．５ｍ／分の流速
で溶出する。個々のピークの両分をＵＶ２８０ｎｍ溶出
パターンに従って手動で集める。
２０．４．スルホプロピルイオン六　クロマドブーツ工
二 サイズ排除クロマトグラフィー及びモノＱイオン交換ク
ロマトグラフィー（例２０．２及び２０．３）に代る方
法として、例２０．１からの濃縮されたプール（約２５
０■の蛋白質を含有する５２−）を５０ｍＭＮａ０Ａｃ
／　０．０１％ＤＴＴ　（ｐＨ５，５）　（出発緩衝液
）に対して透析し、そして同じ緩衝液で平衡化されたＳ
ＰトリスアクリルＭ　（ＬＫＢ）イオン交換カラム（２
，５Ｘ１０ｃｍ）にポンプ輸送する。ＵＶ２５４ｎｍの
吸収がベースラインレベルに達するまでカラムを緩衝液
により洗浄する。カラムに結合した蛋白質を出発緩衝液
中０．０Ｍ〜０．５　Ｍ　ＮａＣｊ！の直線グラジェン
ト、次に出発緩衝液／　０．５　Ｍ　ＮａＣ７！　（Ｉ
００ｍｆ）及び出発緩衝液／　１．０　Ｍ　ＮａＣｊｌ
！　（Ｉ００ｍＪりにより２．０−７分の流速で溶出す
る。ＭＲＰ−８は０．２５Ｍ〜０．３５Ｍ　ＮａＣ／！
の間で溶出する。５Ｏ５−ＰＡＧＥにより判定した純度
は、この段階で９０％より高い。
２０．５．　！柑屁成 例２０．３又は２０．４の蛋白質画分を、バリアン５０
００液体クロマトグラフを用いて、Ｖｙｄａｃ　２１８
　ＴＰ　５４１５逆相ＨＰＬＣカラム（ザ・セイレーシ
ョンズ・グループ、ヘスバリア、ＣＡ、米国）によりさ
らに精製する。カラムを、水中０．１％ＴＦＡを６５％
とアセトニトリル中０．０７％ＴＦＡを３５％との混合
物中で平衡化する。サンプルを注入して５分間後、１２
分間の直線グラジェントを開始し、水中０．１％ＴＦＡ
を４５％とアセトニトリル中０．０７％ＴＦＡを５５％
の混合物で終り、流速は１−７分とする。溶出液は２１
５ｎｍにおけるＵＶ吸収によりモニターする。
ＭＲＰ−８は、それぞれ保持時間が１４．５分と１５．
８分の２つの別個のピーク中に溶出する。還元条件下又
は非還元条件下での５Ｏ３−ＰＡＧＥにより示されるよ
うに、早い溶出物はＭＲＰ−８の千ツマー形（見かけ分
子量８　ｋＤ）であり、第二のピークはＭＲＰ−８の二
量体ジスルフィド結合誘導体（見かけ分子量１６ｋＤ）
から成る。
ｍ　　畑貫■Ｊｌ魁友匝枕 ２１．１．ヱ」ソ」Ｕおす土掘 例２０の精製されたＭＲＰ−８を、Ｍ、Ｗ、Ｈｕｎｋａ
ｐｉｌｌａｒ及びり、Ｅ、Ｈｏｏｄ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１９８３、■、３９９
の方法に従って、気相蛋白質シーケンサ−モデル４７０
（アプライドバイオシステムス）を用いてＮ−末端アミ
ノ酸配列分析にかける。アニリノ−チアゾリノン誘導体
を５０℃にて２５％水性ＴＦＡで処理することによりフ
ェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸に転換する
。ＰＴＨアミノ酸をＺｏｒｂａｘ　ＣＮ　ＨＰＬＣカラ
ム（デュポン、２００×４、６　ｍ）　　（Ｒ，Ｋｎｅ
ｃｈｔ等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、１９８３、」
則、６５〕上で分析する。次のＮ−末端アミノ酸配列が
見出される。
Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−八ｓｎ−Ｓｅｒ−１１ｅ−１１
ｅ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ｔｙｒ−Ｘ　＋　７−Ｌｙｓ−
Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅ−Ｘｚ７−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘｌ
ｌ−へｓｐ−へ５ｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｘ＊ｚ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｘ４７−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙ
ｓ−Ｘ＋ｙ　、　Ｘ２７　、　Ｘ３＋　、　Ｘ４□及び
Ｘ４．は未決定アミノ酸である。この配列はｃＤＮＡ分
析（例１０）により決定された式（Ｉ）又は（ＩＩ）の
配列と一致する。
以下余白 ２１．２．狸」坤遍」 分析逆相ＨＰＬＣを、Ｖｙｄａｃ　２１８　ＴＰ−Ｂ５
−５μ（４，０×１２０１）上で、ＥＰ　１６２，８１
２のヒトＭＩＦ　８ｋＤ　、例２０のＭＲＰ−８、及び
これらの混合物について、水中０．１％ＴＦＡを６５％
とアセトニトリル中０．０８％ＴＦＡを３５％の混合物
から水中０．１％ＴＦＡを４５％とアセトニトリル中０
．０８％ＴＦＡを５５％の混合物まで、３０分間の直線
グラジェントを用いて行う。ヒトＭＩＦ　８ｋＤとＭＲ
Ｐ−８はこれらの条件下で識別されず、そして１１．２
分間の保持時間（２１５ｎｍでのＵＶ吸収）で溶出する
。
２１．３　　サイズ　　クロマトグーフィーＭＲＰ−８
及び例２０の二量体ジスルフィド結合ＭＲＰ−８誘導体
を３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！及び１５０ｍＭ　Ｎａ
Ｃ＃（ｐＨ７，０）中Ｓｈｉｍｐａｃｋ　Ｄｉｏｌ　１
５０高速サイズ排除クロマトグラフイーカラム（シマズ
、？、９Ｘ５００ｍｍ）中で１−７分の流速でクロマト
グラフ分析する。ＵＶ吸収を２１５ｎｍで測定する。標
準分子量マーカーであるチトクロームＣ（Ｉ２ｋＤ）　
、ミオグロビン（Ｉ７ｋＤ）、カルボニックアンヒドラ
ーゼ（３０ｋＤ）、オバルブミン（４５ｋＤ）及びＢＳ
Ａ（６６，２ｋＤ）と比較した場合、モノマーＭＲＰ−
８は見かけ分子量３０ｋＤをもって１６．４分間の後に
溶出し、そして二量体ＭＲＰ−８誘導体は見かけ分子量
４２ｋＤをもって１５．１分間後に溶出する。
２１．４　　マススペクトル ＭＲＰ−８の分子量を、ファスト・アトム・ボンバード
メント（ＦＡＢ−ＭＳ）法により、Ｍ、Ｂａｒｂｅｒ等
（Ｎａｔｕｒｅ１９８１、ｌａ、２７０）に従って、Ｚ
ＡＢ−５ｔ！７！、　ヘクトロメーター（ＶＧアナリテ
ィカル社、マンチェスター、ＧＢ）を用いて８ｋＶにて
決定する。３５ｋＶのセシウムガンによりイオン化を行
う。０．１％ＴＦＡを含有するチオグリセロールをマト
リクスとして使用する。
Ｍ（計算値）　　：　１０　’　８２３．５３Ｍ（測定
値）：　１０　’　８３３．６±２．１（４個の測定値
の平均） ＭＲＰ〜８のアリコートを１／１０量のトリプシン、キ
モトリプシン、又はスタフィロコッカス・アウレウスか
らの■８蛋白質（５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３中）により
消化する。Ｖ８８断はメトノール中１．２５　ＮＨＣ７
！により室温にて１時間メチルエステルに転換する。ト
リプシン断片（５０Ｍｇ）は５０ＩＪ！の過蟻酸（Ｉ部
の３０％Ｈ２０□及び２９部のＨＣＯＯＩ（）により室
温にて２時間酸化する。誘導体化されておらず、エステ
ル化されておりそして酸化された断片のＰＡＢ−ＭＳは
それぞれアミノ酸１−１６　、１９−４１　、５７−７
０、及び７２−７７を含んで成るＭＲＰ−８断片の明白
な同定を可能にする。
ｐＭＲＰ−１４−ｔｒｐを含有するＥ、コリからの例１
３．３からの粗細胞溶解物９０−を透析し、そして例２
０．１に記載されている様にしてＤＥＡＥ　）リスアク
リルＭ　（ＬＫＢ）イオン交換カラム（５Ｘ１０ｃｍ）
上で精製する。ＭＲＰ−１４は、２部ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊ！　、。
０．０１％ＤＴＴ　（ｐＨ８，５）（透析緩衝液）中０
．１２〜０．１５Ｍ　ＮａＣｊ！の濃度において溶出す
る。例１５及び例１９のＭＲＰ−１４を含有する粗細胞
溶解物のサンプルを同様にして処理する。
２２．２．スルホプロピルイオン六　クロ７トブーツ工
二 例２２．１からの両分を含む組換ＭＲＰ−１４のプール
（６Ｂｍｆｆｉ）を１０％酢酸によりｐＨ５，５に酸性
化し、そして５０　ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ／　０．０１％Ｄ
ＴＴ　（ｐＨ５，５）（出発緩衝液）により平衡化され
たＳＰ）リスアクリルＭ　（ＬＫＢ）イオン交換カラム
（２，５Ｘ１０ｃｍ）にポンプ輸送する。ＵＶ２５４ｒ
＋ｍの吸収がベースラインレベルに達するまでカラムを
出発緩衝液により洗浄する。カラムに結合した蛋白質を
、出発緩衝液中０．０　Ｍ　〜０．５　Ｍ　ＮａＣＪ！
の直線グラジェント、次に出発緩衝液／　０．５　Ｍ　
Ｎａ（Ｊ　　（８０−）及び出発緩衝液／　１．０　Ｍ
　ＮａＣｊ！　（２００ｍ）を用いて１．７−７分の流
速において溶出する。個々の１７−の両分を集め、そし
て５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。プールされた画分
からの組換ＭＲＰ−１４は、５Ｏ５−ＰＡＧＥによれば
この段階で９０％より高純度であると判断される。
２２．３　　漣ｍ工 例２２．２の組換ＭＲＰ−１４を、２１８７Ｐ−８５−
５μ（ザ・セ（Ｉ８Ｂ） バレーションズ・グループ）を充填したＨＰＬＣカラム
（０，４Ｘ１２ｃｍ）上でさらに精製する。例１．１の
装置及び条件を使用する。すなわち、水中０．１％ＴＦ
Ａ６５％から４５％とアセトニトリル中０．０７％ＴＦ
Ａ３５％から５５％の３０分間の直線グラジェントにお
いて、ＭＲＰ−１４は１３．８分間後に溶出する。二量
体のジスルフィド結合ＭＲＰ−１４は１６．２分間の後
に溶出する。この二量体は０．２％ＤＴＴで室温にて１
５分間処理することによりモノマーＭＲＰ−１４に転換
され得る。
２２．４．’ｙ、ノ１［お弗泉捉 例２２．３の精製されたＭＲＰ−１４を例２１．１に記
載した様にしてＮ−末端アミノ酸分析にかける。次のＮ
−末端アミノ酸配列が見出される。
Ｔｈｒ−Ｘ２−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｘｇ−Ｘ＋　ｏ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｉ　ｌｅ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ
−Ｘｚｏ−Ｔｙｒ−Ｘｚｚ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ｘｚｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｘｓｏ−Ｌｕｅ−八
５ｎ− Ｘ２１　Ｘ９１　ＸＩＯ＋　Ｘｚｏ　＋　Ｘ＋ｚ　＋　
Ｘ２？及びＸ、。は未決定アミノ酸を示す。ＭＲＰ−１
４のＮ−末端に予想されるアミノ酸メチオニンはｐＭＲ
Ｐ−１４−ｔｒｐを有するＥ、コリ宿主により明らかに
開裂されている。
２２．５．マススペクトル 例２１．４に記載したようにしてＦＡＢ−ＭＳを行う。
Ｍ（計算値、第一アミノ酸Ｔｈｒ）　：　１３　’　１
１０．９４Ｍ（測定値）　　：　１３　’　１１２．８
（３回の別個の分析の貯積値） トリプシン、キモトリプシン及び■８消化物のＦＡＢ−
ＭＳは、アノミ酸１０−１９　、２３−５２　、５８−
７７、及び７９−９３を含んで成るＭＲＰ−１４の明白
な同定を可能にする。
１）ＭＲＰ−１４６−ｔｒｐを含有するＥ、コリからの
例１３．３の粗細胞溶解物３２０ｒｄを、例２０．１に
おいて記載したように、透析し、そしてＤＥＡＥ　）リ
スアクリルＭイオン交換カラム（２，６Ｘ１０ｃｍ）に
負荷する。
カラムを透析緩衝液ＢＯｍｌで洗浄し、次に透析緩衝液
中０．０Ｍ〜０．２　Ｍ　ＮａＣＪ！の直線グラジェン
トを用いて溶出する。ＭＲＰ−１４６は０．０８〜０．
１９Ｍ　Ｎａ（Ｊ！の間で溶出する。
２３．２．スルホプロピルイオン六　クロマトグーフヱ
ニニ 例２３．１からの組換ＭＲＰ−１４６を含有する一緒に
した両分をｐＨ５，５に酸性化し、そして例２２．２に
記載した様にしてＳＰトリスアクリルＭイオン交換カラ
ムに付加する。前記の出発緩衝液中０．０Ｍ〜０．５Ｍ
の直線グラジェント、次に０．５Ｍ及び１．０Ｍ　Ｎａ
（Ｊ！によりＭＲＰ−１４ｄを溶出し、そして５Ｏ５−
ＰＡＧＥによれば９５％より高純度であると判断される
。
２３．３．　７逮シＪ１列４１足 例２３．２の精製されたＭＲＰ−１４６を例２１．１に
記載したようにしてＮ−末端アミノ酸配列分析にかける
。
次のＮ−末端アミノ酸配列が得られる。
Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍ
ＲＰ−１４６のＮ−末端に予想されるアミノ酸メチオニ
ンが欠けている。
ヒト胎盤の組繊細片を液体窒素中で凍結し、そして乳鉢
中で粉砕することにより細切する。この微細組織粉末の
２ｍｌずつの幾つかのアリコートを３０艷の０．１　Ｍ
　ＩＩ！ＤＴＡ　、　０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｉ
！　　（ｐＨ７，５）、１％サルコシル、０．３Ｍβ−
メルカプトエタノール及び１１００ｐ／ｍＲのプロテイ
ナーゼに中で、ロータリーディスク上で穏和に溶解せし
めることによりＤＮＡを単離する。塊の形成を防止する
ため、溶解緩衝液に加える前に粉末を微細シフターに通
す。２８ｇのＣ５Ｃｊ２及び１０■の臭化エチジウムを
加え、そしてＶＴ５０ペックマンローター中で４９００
Ｏｒｐｍにて３６時間の平衡遠心によりＤＮＡをバンド
にする。このバンドを分離し、そしてイソアミルアルコ
ールにより臭化エチジウムを３四抽出する。ＤＮＡを１
０００容量の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＢＣＪ！　　（ｐｉ
（７，５）及び０．５　ｍＭ　ＥＤＴＡに対して４℃に
て２日間にわたり十分に透析する。
２４．２．皿皿清化 １０〜１５μｇのヒト胎盤ＤＮＡ　（例２４．１）を、
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ　、旧ｎｄＩＩＩ、
ＥｃｏＲＩ又はＰｓｔｌ（ヘーリンガー）により、製造
者の処方に従って３７℃にて２時間完全消化する。制限
消化−物を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−アセテート（ｐＨ
８，０）及びｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中０．６％アガロース
ゲル上の別々のスロットに負荷しくスロット当り１０μ
ｇ）、そしてこの緩衝液中で４℃、１００■にて６時間
泳動せしめる。電気泳動の後、ゲルを臭化エチジウム（
５ｔｒｇ　／　ｍｌ水）により１０分間染色し、そして
ＵＶ２６０ｎｍトランスイルミネーターを用いて写真に
とる。
２４．３．サザンブロソト 例２４．２の染色されたゲルを２６０ｎｍのＵＶ照射に
５分間暴露して高分子量ＤＮＡ分子の効率的な移行を可
能にする。次に、ゲルを、変性のために０、４　Ｎ　Ｎ
ａＯＨ及びＯ，、６Ｍ　Ｎａ（Ｊ！中で３０分間インキ
ュベートし、そして中和のために０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＪ！　　（ｐＨ７，５）及び１．５　Ｍ　ＮａＣ
Ａ中で３０分間インキュベートする。ゲルをガラス板上
に置いた後３ＭＭワットマン紙にパックしそして２０　
Ｘ　ＳＳＣ緩衝液（３ＭＮａＣＡ及び０．３　Ｍ珪酸ナ
トリウム）に浸漬する。２ＸＳＳＣによりあらかじめ湿
した”ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　ｐｌｕｓ”膜にューイン
グランドニュクレア）及び３ＭＭワットマン祇の５　ｃ
ｍパイルをゲル上に置き、室温にて１８時間にわたり２
０　Ｘ　ＳＳＣへの核酸の流動移行を許容する。
２４．４．　ＭＲＰ−８ｃＤＮＡブローフ゛とのハイフ
゛１　゛イゼーション 全ヒト胎盤ＤＮＡのＢａｍＨＩ　、、ＥｃｏＲＩ　、旧
ｎｄｌｌｌ及びＰｓｔＩ制限消化物を、ヒ−）ＭＲＰ−
８ｃＤＮＡ　（例８．３のクローン３）に相同な及び部
分的に関連する配列を含有する断片について試験する。
”ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎｐｌｕｓ”上の胎盤ＤＮＡ断片
を低ストリンジエンシー及び高ストリンジエンシーにお
いてＭＲＰ−８ｃＤＮＡの３２ｐ標識化プローブ（Ｉ，
２Ｘ　１０　’ｃｐｍ／　ｐｇ”）とハイブリダイズせ
しめる。このプローブはクローン３　（例８．３）から
、３６９ｂｐの断片を開裂せしめるＰｖｕ　ＩＩ　／　
Ｐｓｔ　Ｉ消化、及び例８．５に記載した二ツクトラン
スレーションにより調製される。ＤＮＡ断片を伴う膜を
６５℃にて５ｘＳＳＣ緩衝液、５×デンハート液、０．
１％ＳＤＳ及び１００ｇ／ｍｆのウシ胸腺音波処理キャ
リヤーＤＮＡ中で１２時間、５〜１０　Ｘ　１１０６ｃ
ｐ　／　ｍｌのＭＲＰ−８ｃＤＮＡプローブとハイブリ
ダイズせしめる。膜を６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含
有する６　ｘＳＳＣ、４ｘＳＳＣ、２ｘＳＳＣ。
１ｘｓｓｃ及び０．　Ｉ　Ｘ５ＳＣ中で次々と洗浄し、
乾燥し、そしてオートラジオグラフィーに暴露する。
低ストリンジエンシーハイブリダイゼーションを同様に
して行うが、しかし６５℃にて０．１％ＳＤＳを含有す
る６ＸＳＳＣ中でのみ洗浄を行う。
高ストリンジエンシー及び低ストリンジエンシーにおい
て強くハイブリダイズするＤＮＡ断片のみが観察される
。ＢａｍＨＩ消化はハイブリダイズする１８ｋｂ断片を
もたらし、旧ｎｄＩ［Ｉは２２ｋｂ断片を、ＥｃｏＲＩ
は２１ｋｂ断片を、そしてＰｓｔＩは５ｋｂ断片をもた
らす。この結果は、ＭＲＰ−８遺伝子がヒトゲノム中に
単一コピーとして存在することを強（示唆する。ゲノム
ＤＮＡが本当に完全消化されたか否かをチェックするた
め、対照サザンブロソトをヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子ｃＤＮＡプローブ（Ｓ、Ｐｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄ
ｅｇｅｎ、　Ｂ、Ｒａｊｐｕｔ及びＥ、Ｒｅ１ｃｈ。
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１９８６、」旦、６９７２
）　とハイブリダイズせしめる。Ｂａｍ１ｌ　Ｔ　、Ｅ
ｃｏＲＩ　、旧ｎｄｌ［Ｉ及びＰｓｔｌ断片との公表さ
れたバンドパターンが確認される。
２４．５．　ＭＲＰ−８゛　　−を４　　るゲノムクロ
ーンの見難 ヒトλシャロン４Ａゲノムライブラリーをヒト胎児肝Ｄ
ＮＡから制限エンドヌクレアーゼＨａｅｌｌ［及びＡｌ
ｕＩにより限定された消化により造成する（Ｒ，Ｍ、Ｌ
ａｗｎ、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ＋　Ｒ，Ｃ，Ｐａｒ
ｋｅｒ、　Ｇ、ＢＩａｋｅ及びＴ、Ｍａｎｉａｔｉｓ＋
　Ｃｅ１ｌ、１９７８、■、１１５７−１１７４）。
このライブラリーを例２４．４に記載したＭＲＰ−８ｃ
ＤＮＡプローブによりスクリーニングする。６００，０
００個の独立したファージスプラークをナイロン膜（Ｐ
ａｌｌ−Ｂｉｏｄｙｎｅ）に移行せしめ、そして標準的
方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ハンドブック）に従って膜島
たり８Ｘ　１０６ｃｐｍ３２Ｄ　Ｎ　Ａと二重にハイブ
リダイズせしめる。マスタープレートは４℃にて数ケ月
間維持される。６個の陽性プラークを拾い上げ、精製し
、そしてλＤＮＡを単離してさらに分析する。ＤＮＡの
サザンブロソト分析は、６個すべての組換体ファージが
ファージヒトＤＮＡ挿入部上に完全な遺伝子を含有する
ことを示した。完全なＭＲＰ−８コード領域を含有する
５ｋｂの長さのＨｐａ　Ｉ［ＤＮＡ断片をファージスク
ローン３からＣ１ａ　Ｉにより線状化された野性型ｐＢ
Ｒ３２２にサブクローニングしプラスミドｐＢＲＭＲＰ
−８／　３Ａ−Ｈｐａ　Ｈを生じさせる。
ｍ　　ブースミドＢＲＭＲＰ−８／３Ａ−ＨａＩ［の配
置へ捉 配列決定方法を第４図に示し、そして配列決定された領
域をＤＮＡ配列決定方向を示す線と黒丸で示す。ＤＮＡ
配列決定は、製造者（アメルシャム）の処方に従ってバ
クテリオファージＭ１３単離鋳型上で行う。ＭＲＰ−８
遺伝子の完全なＤＮＡ配列を両鎖上で読み取る。
ＭＲＰ−８遺伝子は２個のイントロン（イントロン１及
び２）並びに３個のエクソン（エクソン１〜３）を含有
する。イントロン１はＡＴＧ開始コドンから２３ヌクレ
オチド上流の５′非翻訳領域を中断し、他方１５０ｂｐ
の長さのイントロン２はコード領域をアミノ部位Ｗ４７
において中断する。非コードエクソン１は３３ｂｐの長
さを有する。エクソン２は１６４ｂｐの長さを有し、ア
ミノ酸１〜４７のＭＲＰ−８蛋白質をコードし、他方エ
クソン３は２１１ｂｐの長さを有し、そしてアミノ酸４
８〜９３（Ｃ−末端）をコードする。５６ｂｐの長さの
ｍＲＮＡリーダー配列はＣＡＰ部位の３３ｂｐ下流で４
８４ｂｐの長さのイントロン１により中断されている。
ポリ（Ａ）付加部位までのｍＲＮＡ　）レーラーはクロ
ヌクレオチドの長さを有する。ポリ　（Ａ）付加部位は
全長ＭＲＰ−８ｃＤＮＡ　（例１０）の３′末端ＤＮＡ
配列から推定される。
ＭＲＰ−８をコードする完全ＤＮＡ配列及びフランキン
グＤＮＡ制御領域は式（■）に示される。制御ＤＮＡ配
列及びイントロン−エクソン連結部を式（■）に要約す
る。遺伝子の５′末端において、主要ＭＲＰ−８ｍＲＮ
Ａ　ＣＡＰ部位の２９ｂｐ上流に５　’　−ＴＡＴＡＡ
ＡＡ−３’プロモーター要素が見出される。３′末端に
おいて、アンバーコドンの５３ｂρ下流にポリ（Ａ）付
加シグナル５　’　−ＡＡＴＡＡＡ−３’が見出される
。確立されたＧＴ／ＡＧ規則（Ｒ，Ｂｒｅａｔｈｎａｃ
ｈ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＩＪｓＡ
　　、　１９７８、ヱ旦、　４８５３−４８５７）に一
致する保存されたスプライシング部位のほかに、イント
ロンはポリピリミジンストレッチ及びラリアト（Ｉａｒ
ｉａｔ）構造形成のための共通ＤＮＡ配列を含有する。
例２４．２の全ヒト胎盤ＤＮＡのＢａｍ）ｌ　Ｉ　％　
ＥｃｏＲＩ　％ＨｉｎｄＩｎ及びＰｓｔｌ制限消化物を
、ヒトＭＲＰ−１４ｃＤＮＡ（例９．３のクローンｐＭ
ＲＰ−１４−１０）と相同であり且つ部分的に関連する
配列を含有する断片について試験する。”　ＧｅｎｅＳ
ｃｒｅｅｎ”上の胎盤ＤＮＡを低ストリンジエンシー及
び高ストリンジエンシーにおいてＭＲＰ−１４ｃＤＮＡ
の３２ｐ標識化プローブ（Ｉ，２Ｘ１０７ｃｐｍ／　Ｉ
ｌｇ）とハイブリダイズせしめる。このプローブはクロ
ーンｐＭＲＰ−１４−１０（例９．３）のプラスミドか
ら、３６４ｂｐの断片を開裂せしめるＢｒａ　ｍ／Ａｖ
ａＩ消化、及び例９．３に記載されているニックトラン
スレーションにより調製する。ＤＮＡ断片を有する膜を
６５℃において６ＸＳＳＣ緩衝液、５×デンハート溶液
、０．１％ＳＤＳ及び１１００ｐ／−の音波処理された
ウシ胸腺キャリヤーＤＮＡ中で１２時間にわたり５〜１
１０Ｘ１０６ｃｐ／ｍｊ！の？ＩＲＰ−１４ｃＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズせしめる。膜を６５℃にて０．
１％ＳＤＳを含有する６　Ｘ５ＳＣ。
４　ｘＳＳＣ、２ｘＳＳＣ、１ｘＳＳＣ、及び０．２　
Ｘ５ＳＣ中で次々と洗浄し、乾燥し、そしてオートラジ
オグラフィーのために暴露する。低ストリンジェンシー
ハイプリダイジェーションを同様にして行う。
但し、６５℃にて０．１％ＳＤＳを含有する４ＸＳＳＣ
のみで洗浄する。
高ストリンジエンシー及び低ストリンジエンシーにおい
て、強くハイブリダイズするＤＮＡ断片のみが観察され
る。ＢａｍＨＩ消化はハイブリダイズする１１．６ｋｂ
断片をもたらし、Ｐｓｔｌ消化は６ｋｂ断片をもたらす
。旧ｎｄｌｌＩ消化及びＥｃｏＲＩ消化はいずれも２種
類の断片、すなわち旧ｎｄＩＩ［は５．７　ｋｂ及び３
．６ｋｂの断片を、そしてＢｃｏＲＩは５．４ｋｂ及び
２．７ｋｂの断片をもたらす。この結果は、ＭＲＰ−１
４遺伝子がヒトゲノム中に単一コピーとして存在するこ
とを強く示唆している。
２６．２．　ＭＲＰ−１４゛　　云　を４　　る゛ツム
クローンの単産 ヒトλシャロン４Ａゲノムライブラリーをヒト胎児肝Ｄ
ＮＡから造成し、そして例２４．５に記載したようにし
てＭＲＰ−１４ｃＤＮＡプローブによりスクリーニング
する。６００，０００個の独立したファージスプラーク
を２０枚のナイロン膜に移行せしめ、そして標準的方法
に従ってハイブリダイズせしめる。
５個の陽性プラークを拾い上げ、精製し、そしてλＤＮ
Ａを単離してさらに分析する。ＤＮＡのサザンブロソト
分析は４種類すべての組換ファージがファージヒトＤＮ
Ａ挿入部上に完全な遺伝子を含有することを示した。完
全なＭＲＰ−１４コード領域を含有する６ｋｂ長のＰｓ
ｔ　Ｉ　　ＤＮＡ断片をファージスシャロン２からＰｓ
ｔＩにより線状化された野性型ｐＵＣ９ベクターに挿入
し、プラスミドｐＵｃＭＲＰ−１４／Ｐｓｔ６を生じさ
せる。
劃２７．　　ブースミド　ＵＣＭＲＰ−１４Ｐｓｔ　６
の　１翫 配列決定方法を第５図に示し、そして配列決定された領
域をＤＮＡ配列決定方向を示す線及び黒目で示す。ＤＮ
Ａ配列決定はバクテリオファージＭ１３単離鋳型上での
及び二本鎖スーパーコイルＤＮＡ鋳型上でのジデオキシ
チェインターミネーション法によりＭａｎｉａ’ｓのハ
ンドブックに従って行われる。ＭＲＰ−１４遺伝子のコ
ード領域は２個のイントロン、すなわちイントロン１及
びイントロン２により中断されている。イントロン１は
３８７ｂｐの長さを有し、そしてＡＴＧ開始コドンから
１５ｂｐ上流の５′非翻訳領域を中断している。イント
ロン２は約２２２７ｂｐの長さを有し、そしてアミノ酸
位置５０においてコード領域を中断する。非コードエク
ソン１は２８ｂｐの長さを有する。エクソン２は１６５
ｂｐの長さを有し、そしてＭＲＰ−１４蛋白質のアミノ
酸１〜５０をコードし、他方エクソン３は３８９ｂｐの
長さを有し、そしてアミノ酸５ｌ−１１５（ＣＯＯ）ｌ
末端）をコードする。
ＭＲＰ−１４をコードする遺伝子の配列及びフランキン
グＤＮＡ制御領域を式（Ｘ）に示す。位置１７３７及び
２０９８の間で配列は知られていない。制御ＤＮＡ配列
、及びイントロン−エクソン連結部は式（Ｘ）中に示さ
れている。遺伝子の５′末端において、５　’　−ＴＡ
ＴＡＡＡＴ−３’プロモーター要素力鉗ＲＰ−１４　ｍ
ＲＮＡ　ＣＡＰ部位から２９ｂｐ上流に見出される。
３′末端に、ポリ　（Ａ）付加シグナル５　’　−ＡＡ
ＡＴ八八八九九へがオクラ（ｏｃｈｒｅ）コドンの１６
４ｂｐ下流に見出される。確立されたＧＴ／ＡＣ規則（
Ｒ，Ｂｒｅａ　ｔｈｎａｃｈ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、　１９７８、■、４８５３
−４８５７）　と一致する保存されたスプライシング部
位のほかに、イントロンはポリピリミジンストレッチ及
びラリアト（ｌａｒｉａｔ）構造の形成のための共通Ｄ
ＮＡ配列を含有する。
ｍ　　　　　　　　でのＭＲＰ−８の　　のための発現
ベクターｐＣＭＶｅ／　ＭＲＰ−８を標準的ＤＮＡ操作
によって造成し、そして第６図に示す。このプラスミド
はＥ、コリ中での増幅のためのｐＢＲ３２２の複製開始
点及びアンピシリン耐性遺伝子を有する。
このプラスミドは、例２４．５のプラスミドｐＢＲＭＲ
Ｐ−８／３Ａ−ＨｐａｌＩからの４３２０ｂｐのＢａｍ
ＨＴ　／ＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡ断片を含有し、この断片
はＭＲＰ−８コード領域、並びに５′及び３　’　ＤＮ
Ａ制御要素を含有し、該プラスミドはさらに、ＤＮＡ断
片からのＡｃｃ　Ｉ部位（ｐＢＲ３２２中の２２４６位
）と前記４３２０ｂｐの長さのＢａｍＨＩ　／　Ｅｃｏ
ＲＩからのＢａｍＨＩとの間に位置する３００ｂｐの長
さのＤＮＡ断片上に非常に強力な構成的エンハンサ−の
形で真核性転写制御配列を含有する。
主要ＩＥＩ遺伝子プロモーター９Ｍ＋ｊ！Ｕ（Ｍ　、　
Ｂ　ｕ　ｓ　ｈ　ａ　ｒ　ｔ　。
ｐ　、Ｔｄｅｂｅｌ、　に、ＪａＩＢ１　、　Ｋ、１）
ＯＦ２（、ｈ−Ｈａｅｓ　Ｉｅｒ　、　Ｂ、　Ｆ　１ｅ
ｃｈｅｎｓ　ｔｅ　ｉｎ及びＷ、５ｃｈａｆｆｎｅｒ、
　Ｃｅ１ｌ　、１９８５、幻２．５２１−５３０）から
のこのヒト−サイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）は、標
準的ＤＮＡ操作（Ｍａｎｉａｔｉｓのハンドブック）に
よりプラスミドｐＢＲ３２２Ａｃｃ　Ｉから導びかれる
。プラスミドｐＢＲ３２２Ａｃｅ　Ｉは、ｐＢＲ３２２
（Ｊ、Ｇ、５ｕｔｃｌｉｆｆｅ。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ　　、
　１９７８、ヱ５、３７３７−３７４１）からの２１４
４ｂｐの長さのＡｃｃ　Ｉ　／Ｈ４ｎｄｌｌＩ　ＤＮＡ
断片をＸｂａ　Ｔリンカ−（バイオラプス社）を用いて
、ｐＳＶ４０−ＨＣＭＶ　（組換体Ｃ４）をＮＣＯ■ニ
より切断することにより単離される３００ｂｐのｌ（Ｃ
ＭＶエンハンサ−含有ＤＮＡ断片に連結することにより
作られる。
３００ｂｐのＮｃｏ　Ｉエンハンサ−ＤＮＡ断片は、）
ＩＣＭＶ主要ＩＥＩ遺伝子プ転子−ター中のヌクレオチ
ド−２６２と−５２４の間の開始部位の上流の領域をカ
バーする。
発現ベクターｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−１４は標準的ＤＮＡ
操作により造成され、そして第７図に示される。このプ
ラスミドは次の点を除き例２８のプラスミドｐＣＭＶｅ
／　ＭＲＰ−８と同一である。すなわち、このプラスミ
ドは例２６．２のプラスミドｐＵＣＭＲＰ−１４／　Ｐ
ｓｔ６に由来する６０００ｂｐのＰｓｔ　Ｉ　ＤＮＡ断
片を含有し、このものはＭＲＰ−１４コード領域並びに
５′及び３′ＤＮＡ制御要素を担持する。
ＭＲＰ−８遺伝子及びＭＲＰ−１４遺伝子を、ＤＥＡＥ
−デキストラン技法の変法（Ｊ、Ｈ，Ｃｕｔｃｈａｎ及
びＪ、Ｐａｇａｎｏ。
Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　１９６Ｂ．
４Ｌ　　３５１−３５７　；　Ｊ。
Ｂａｎｅｒｊｉ、Ｌ、０１ｓｏｎ及びＷ、５ｃｈａｆｆ
ｎｅｒ、Ｃｅ１１．１９８３、益、７２９−７４０）に
より哺乳類細胞にトランスフェクトする。
３０．１．　ＣＭＶｅＭＲＰ−８の 例２８のプラスミドＤＮＡをＣ３ＣＩ！／臭化工チジウ
ム密度勾配上で２同次々と精製し、そして１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５
）中に再懸濁し、次に１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ギブコ
）を含有するＤＭＥＭ　（ギフ゛コ）中ＤＥＡＥ−デキ
ストラン（０，５ｍｇ／ｍｌ、ファルマシア、分子量５
Ｘ１０５）と混合して１　ｒｉｇ　／　ｍＲのプラスミ
ドＤＮＡの最高濃度にする。
この溶液を室温にて１０分間インキュベートする。
遺伝子を有しないプラスミドを含有しない模擬対照を同
様に処理する。
ＣＯ３−７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１．５Ｖ−４
０ウイルスで形質転換されたアフリカ緑ザルの腎細胞、
Ｙ。
Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１ｌ、　１９８１．２３．１７
５−１８２）、Ｂｏｗｅｓ細胞（ＲＰＭＩ　７２７２、
ヒト悪性黒色腫、Ｄ、Ｃ，Ｒｉｊｋｅｎ及びり、Ｃｏ１
１ｅｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　１９８１、韮
、７０３５−７０４１）　、及びＬ−１３２細胞（ＡＴ
ＣＣＣＣｌ２、ヒト胎児肺線維芽細胞、Ｃ，Ｄａｖｉｓ
等、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、１９６０、■、３８６）を、９
６ウエルミクロタイタープレート又は１０ｃ＋ｎペトリ
皿（ファルコン）中で、５〜１０％のＦｅ２　（ギブコ
）を含有するＭＥＭ中にプレートする。２４時間後に、
細胞密度が６０〜８０％コンフルエンシーに達する。細
胞単層をＤＭＥＨにより２回すすぐ。プラスミドＤＮＡ
／ＤＩ！ＡＥ−デキストラン混合物を加える（ミクロタ
イタープレートのウェル当り５０ｍ、１０ｃｍペトリ皿
当り１．２ｍｆｆ１）。
細胞を３７℃１５％ＣＯ□にて３０分間インキュベート
し、次に細胞のタイプに依存して３７℃／７．５％ＣＯ
□にて９０〜１２０分間インキュベートする。
細胞をＤＭＥＭ中１５ｖ／ｖ％ＤＭＳＯ（メルク）と共
にさらに９０秒間インキュベートし、ＤＭＥＭで２回す
すぎ、次に５　ｖ　／　ｖ％のＦｅ２及び５ｍＭ酪酸ナ
トリウム（シグマ）を含有するＬｏｏｍ　（ミクロタイ
ターウェル当り）又は１０．（ｌｄ　（ベトリ皿当り）
ＭＥＭ中で３７℃１５％ＣＯ□にて１２時間インキュベ
ートする。培地を５　ｖ　／　ｖ％のＦｅ２を含有する
ＭＥＭに変える。４８〜７２時間後、トランスフェクト
された細胞をＭＲＰ−８の発現についてチェックする。
３０．２．　　ＣＭＶｅ　　ＭＲＰ−１４の例２９のプ
ラスミドＤＮＡを精製し、ＤＥＡＥ−デキストランと混
合し、そして上記（例３０．１）のようにしてＬ−１３
２細胞に加える。Ｌ−１３２細胞を３７℃／７．５％Ｃ
Ｏ，にて３０分間インキュベートし、さらに上記の様に
して処理する。形質転換された細胞を４８〜７２時間後
ＭＲＰ−１４の発現についてチェックする。
以下余白 ３１ＬＬＸ、■１月１１沖で　　　れた門ＲＰ−８の付
す ７Ｘ１０’個のＬ−１３２細胞を含有するペレットを、
トランスフェクション（例３０．１）の４８時間後、５
００μｌのＧｕＳＣＮ緩衝液に再懸濁する。このＧｕＳ
ＣＮ溶液を無菌のディスポーザブル１−ピペットチップ
に数回通すことにより細胞をホモジナイズする。溶解し
た細胞をフェノールで処理し、そして標準的方法（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓのハンドブック）に従って核酸を沈澱せし
める。核酸を遠心し、７．５艷の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ！　　（ｐＨ７，０）及びＩ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中
に再溶解し、そして７．５ｇのＣｓＣβ　（メルク）に
加える。　　Ｃ５Ｃｊ２溶液を、ＴＳＴ４１　（Ｉ５ｍ
ｌ　）超遠心ポリアロマ−チューブ中２ｍ１．の５．７
　Ｍ　Ｃ５（ｊ２のクッション上に置く。コントロンＴ
ＳＴ４１０−ター中で２９０Ｏｒｐｍ、　２０℃にて１
６時間の後、ＲＮＡ分子がペレット化される。Ｃ５（ｊ
！クッションの上部に残るＤＮＡを除去する。ＲＮＡペ
レットを２　ｍｌの溶出緩衝液中に再溶解し、エタノー
ルで沈澱せしめ、１００Ｉｌ！の０．１％ＳＤＳ中に再
懸濁し、そしてプライマー発現実験に使用する。濃度を
分光光度計により決定する。１６６個の細胞当り３０〜
５０μｇのＤＮＡである。
３１．２．　　　・　プライマーの８゜す式（■）のＭ
ＲＰ−８ｃＤＮＡの１３１位〜１５０位に対して相補的
な５００ｎｇの合成ＤＮＡオリゴマー５′−ＧＧＣＴＣ
ＧＡＣＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣ−３’と完全ＭＲＰ−
８ｃＤＮＡ配列（例１０）を含有するＭ１３単離鋳型１
　ｐｇとの６０分間にわたる６０°Ｃでのアニーリング
により放射性プライマーを調製する。５ユニツトのＫｌ
ｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー）及び６０
μＣｉの４種類の放射性標識されたα−”Ｐ−ｄＮＴＰ
を含有する溶液５ＯＩＪＩ中で室温にて３０分間インキ
ュベートすることによりオリゴマーを延長する。５バの
追跡（ｃｈａｓｅ）混合物（０，２ｍＭ　ｄＮＴＰ）に
より１５分間反応を追跡し、そして６５℃に５分間置く
ことにより反応を停止せしめる。新しく合成されたＤＮ
ＡをＰｖｕ　ＩＩにより開裂せしめ、そして反応混合物
を変性用８Ｍ尿素８％ＰＡＧＥにより分離する。延長生
成物、すなわち６Ｂヌクレオチドの長さのＤＮＡ断片を
切り出し、そしてポリアクリルアミドゲルから溶出する
。合成されたプライマーの比活性は０．５　ｘ　１０７
ｃｐｍ／ｊ１ｇである。
３１．３．　ＭＲＰ−８ｍＲＮＡの５′」Ｉ７）　？−
ｅ　７１’トランスフエクトされたヒトＩ、−１３２細
胞（例３１．１）からの１０鱈の全ＲＮＡを例３１．２
の１×１１０６ｃｐの合成プライマーと共に、エタノー
ルにより同時沈澱せしめる。核酸を、２７パの無菌水及
び３μｌの２．５　Ｍ　　ＫＣｎ中に、３００分間置う
することにより再懸濁する。ＲＮＡ及びプライマーを９
９℃にて３分間変性せしめ、そして６０℃にて１時間ア
ニールせしめる。３濃度度の逆転写酵素緩衝液（６０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　、　ｐＨ８，８，３０ｍＭＭ
ｇＣｆｆｚ　、３０ｍＭ　ＤＴＴ）　　３０ｐｌを加え
、そして反応混合物を９０μｌ中３ｍＭ　ｄＮＴＰ混合
物に調整する。
１０ユニツトの逆転写酵素（Ｂ　ＲＬ）を加え、そして
反応混合物を３７℃にて３０分間インキユベートシ、次
に４１１１の０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）によ
り停止せしめる。ＲＮＡを５０ｍＭ　ＮａＯＨによるア
ルカリ処理により６５℃にて１時間加水分解する。
核酸を中和し、次にキャリヤーｔＲＮＡの存在下でエタ
ノールにより沈澱せしめる。核酸をホルムアミドサンプ
ル緩衝液（８０％ホルムアミド、１０ｍＭＮａＯＨ，１
ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．１％キシレンシアツール、０
．１％ブロモフェノールブルー）中に再懸濁し、そして
延長されたプライマーをＴＢＥ緩衝液中ＤＮＡ配列決定
８Ｍ尿素８％ＰＡＧＥ上で可視化する。
９０％の延長されたＲＮＡ分子は５　’　−ＴＡＴＡＡ
Ａ八−３′制御因子の３０ｂｐ下流に位置するデオキシ
アデノシンと共に同時泳動する。ヒト血液単核細胞から
単離されたポリ　（Ａ）ＲＮＡを上記と同じプライマー
を用いてアッセイする場合同じ結果が得られる。模擬ト
ランスフェクトされた細胞ＲＮＡをｐＣＭＶｅ／　ＭＲ
Ｐ−８で形質転換された細胞と同一の条件下でアッセイ
する場合、この様な延長された生成物は前者からは検出
されない。
細胞を確立された方法（Ｊ、　Ｂｒｉｉｇｇｅｎ等、Ｃ
ａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　
１９８３、■、２００−２０５）を用いてグルタルアル
デヒドにより固定する。細胞単層をＰＢＳで２回すすぎ
、そしてＰＢＳ中０．０５Ｖ／Ｖ％のグルタルアルデヒ
ドと共に室温にて５分間インキュベートし、次にＰＢＳ
により２回すすぐ。
固定された細胞を、イムノパーオキシダーゼ法（Ｊ、　
Ｂｒｕｅｇｇｅｎ等、１９８３、前掲；　　５ｕｔｅｒ
等、ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅ
ｒ、　１９８３、■、５３−３８）の変法を用いて次の
様にしてＭＲＰ−８の発現について試験する。ＩＯＶ／
Ｖ％の正常豚（ギブコ）により非特異的結合をブロック
した後、細胞を単一特異的ラビット抗−ＭＲＰ−８血清
（例３４．１）と共に３７℃にて３０分間インキュベー
トする。細胞に結合した特異的抗体を西洋ワサビパーオ
キシダーゼ（ＤＡＫＯ）に接合されたブタ抗−ラビット
ＩｇＧと共に３７℃にて３０分間インキュベートする。
結合したパーオキシダーゼを、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，２）中０．１０Ｖ／Ｖ％のＨ２Ｏ２（メルク）及
び０．２６Ｗ／Ｖ％の３−アミノ−９−エチルカルバゾ
ール（ＡＥＣ１シグマ）と室温にて７分間反応せしめる
。
５００個の細胞について顕微鏡観察により評価を行う。
ＭＲＰ−８陽性細胞は赤く着色した沈澱を示す。
第１表は試験された細胞中の発現の％を示す。
ＭＲＰ−８はヒト胎児肺細胞Ｌ−１３２中で高い％で発
現する。ＳＶ　−４０で形質転換されたサル腎細胞ＣＯ
５−７及びヒト悪性黒色腫細胞（Ｂｏｗｅｓ）中で発現
は一層低い。模擬処理対照及び陰性対照は陰性である。
ＣＯ５−７サル　　腎　　　　　　　　１％Ｂｏ貨ｅｓ
　　　　ヒト　　悪性黒色腫　　　〈１％３１．５．］
ｉ　　　　　　テ　　　　　たＭＲＰ−８（Ｄつｘスタ
ンプロフト 例３０．１において記載したようにしてＭＲＰ−８によ
りトランスフェクトされた胎児肺細胞Ｌ−１３２を０．
０５Ｗ／Ｖ％のトリプシン及び０．０２Ｗ／Ｖ％のＥＤ
ＴＡ　（ギブコ）により脱着せしめ、８０×ｇでぺＬ／
　ット化し、そして２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　、
　１２０ｍＭＮａＣｊ！　、　５＋ｎＭ　　ＫＣＪ　、
　１．４ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）ｚ　、３．６ｍＭＣａＣ
ｌ２．６．０ｍＭβ−メルカプトエタノール及ヒ１　ｍ
Ｍ　ＰＭＳＦ（すべての試薬はビオラド製）を含有する
緩衝液中Ｑ、５ｖ／ｖ％のＮＰ　−４０又は０．ＩＷ／
Ｖ％のＳＤＳにより氷上で１５分間細胞溶解する。
細胞溶解物を４８，０００Ｘｇにて６０分間遠心し、そ
して上滑を５Ｏ３−ＰＡＧＥ　（Ｉ５ｗ／　Ｖ％；　Ｖ
、に、Ｌａｅｎ＋ｍｌｉ＋Ｎａｔｕｒｅ　１９７０．２
２７．６Ｂ０−６Ｂ５）により処理する。
スロット当り尋人される蛋白質の量は５Ｘ１０５個の細
胞に相当する。分離された蛋白質をニトロセルロース上
に電気的に移行せしめる（ミリホＰ；Ｔｏｗｂｉｎ等、
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳΔ　、　
１９７９、７６．４３５０）。テトロセルロースシート
に移行した蛋白質を４５ｖ／ｖ％メタノール及びｉ　０
　Ｖ／Ｖ％酢酸中Ｑ、１ｗ／ｖ％のアミドブランク（メ
ルク）により染色する。ニトロセルロースの未処理シー
トを、ラビット抗−ＭＲＰ−８血清（例３４．１）によ
り４℃にて１４時間処理し、次に西洋ワサビパーオキシ
ダーゼに接合したブタ抗ラビットＩ　ｇ　Ｇ　（ＤＡＫ
Ｏ）により処理する。結合したパーオキシダーゼをＰＢ
Ｓ中に稀釈された０、　１％ｏｚｏｚ及び０．３Ｗ／Ｖ
％クロロナフトール（メルク）により７分間可視化する
。ラビット抗−ＭＲＰ−８血清は、８ｋｇ／ｍｏｊ！の
分子量を示しそしてＥ、コリ又は酵母（例２１）中で発
現された組換ＭＲＰ−８蛋白質と同じ特徴を示す細胞溶
解物中の蛋白質バンドを認識する。
■↓１　　　　　　　で　　されたＭＲＰ−１４の肘鉄 例３０．２の形質転換されたり、−１３２細胞を、例３
１．４の方法を用いて、グルタルアルデヒドで同定しそ
してＭＲＰ−１４の発現について試験する。細胞を例３
５．１の単一特異的ラビット抗−ＭＲＰ−１４血清と共
にインキュベートする。５００個の細胞について顕微鏡
観察により評価を行う。ＭＲＰ−１４陽性細胞は赤に着
色した沈澱を示す。ＭＲＰ−１４は、トランスフェクト
されたヒト胎児肺細胞Ｌ−１３２の７５％において発現
される。模擬処理された対照及び陰性対照血清は陰性で
ある。
例３０．２に記載したようにしてｐＣＭＶｅ／　ＭＲＰ
−１４によりトランスフェクトされた胎児肺細胞Ｌ−１
３２を例３１．５に記載したようにして細胞溶解し、そ
して細胞溶解物を５Ｏ３−ＰＡＧＥにより処理する。分
離された蛋白質をニトロセルロース上に電気泳動的に移
行せしめ、そしてラビット抗−ＭＲＰ−１４抗体（例３
５．１）で４℃にて１４時間処理し、次に西洋ワサビパ
ーオキシダーゼに接合したブタ抗−ラビットＩ　ｇ　Ｇ
　（ＤＡＫＯ）により処理する。ラビット抗−ＭＲＰ−
１４血清は、１４　ｋｇ／ｍｏｂの分子量を示しそして
Ｅ、コリ又は酵母（例２２）中で発現される組換ＭＲＰ
−１４蛋白質と同じ特徴を示す細胞溶解物内の蛋白質バ
ンドを認識する。
組換ＭＲＰ−８又はＭＲＰ−１４を生産する永久ヒトセ
ルラインの単離を行うため、Ｇ−４１８に対する耐性を
付与する優性選択マーカーＴｎ５ネオマイシンを含むプ
ラスミドを、ＭＲＰ−８遺伝子を含有するプラスミド又
はＭＲＰ−１４遺伝子を含有するプラスミドと共に、ヒ
ト胎児肺細胞Ｌ−１３２上に、リン酸カルシウム法（Ｆ
、Ｌ、Ｇｒａｈａｍ及びＡ、Ｊ、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ
。
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１９７３．５２．４５６−４６７　
　；Ｄ、Ｐｉｃａｒｄ及びＷ、５ｃｈａｆｆｎｅｒ、　
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＬＩｓＡ、
１９８３、旦Ω、４１７−４２１）を用いて同時沈澱せ
しめる。
プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｐ、５ｏｕｔｈｅｒｎ及び
Ｐ、Ｂｅｒｙ、＋Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐ１．Ｇｅｎｅｔ、
　、　１９８２、上、３２７−３４１）と、ｐＣＭＶｅ
／ＭＲＰ−８（例２８）又はｐＣＭＶｅ／　ＭＲＰ−１
４（例２９）とを１＝５の比率で、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ！、／１　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）中で
混合する。０．１　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ（ギブコ）を含有す
る等容量の０．５　Ｍ　ＣａＣＡ　、を添加し、そして
この混合物を２２℃にて５分間インキュベートする。そ
の容量の２ｘＨＢＳ（０，０５Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、　０．
２８Ｍ　ＮａＣｌ！、　０．７５ｎ＋Ｍ　ＮａｚＨＰＯ
ｎ及び０．７５ｍＭ　ＮａｚＨＰＯｉ）を２回添加して
４ｔｔｇ／ｍｌのｐＳＶ、ｎｅｏ及び２０ｎ／ｍｌのｐ
ＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８又はｐＣＭＶｅ／　ＭＲＰ−１４
の最終濃度とし、そしてこの混合物を３０分間氷上に置
く。１０ｍのこの混合物を、９６ウエルミクロタイター
プレート中１００ｊ１１中に増殖したサブコンフルエン
トのＬ−１３２細胞（例３０）に加える。細胞を３７℃
１５％ＣＯ□にて１６時間インキュベートし、１５　ｖ
／ｖ％ＤＭＳＯにより１０秒間処理し、５　ｖ　／　ｖ
％ＦＣ３及び５ｍＭ酪酸ナトリウムを含有するＭＥＭを
再フィードし、３７℃１５％ＣＯｚにて６時間インキュ
ベートし、ＭＥＭを再フィードし、そして３７℃１５％
Ｃｏ２にて２４時間インキュベートする。選択剤Ｇ−４
１８（ギブコ）を１■／−の最終濃度に加える。
細胞を５日間培養し、トリプシン処理し、ＭＥＭ１５％
ＦＣ３中１：５の比率で９６ウエルミクロタイタープレ
ートに分け、そして３７°ｃ１５％ＣＯ□にてＧ−４１
８と共にインキュベートする。
１０日後、単一細胞コロニーを単離し、そして標準的方
法に従って増殖せしめて多量細胞培養物にする。例３１
及び３２に記載したようにしてＭＲＰ−８又はＭＲＰ−
１４の発現について細胞を試験し、そして陽性クローン
を選択する。
ＪＬＬ４ＬＭＲＰ−８に・　るポｌクロー　ル３４．１
．−ビ・　　−ＭＲＰ−８パ サイズ排除クロマトグラフィー（例２０．２）により精
製されたＥ、コリからの組換ＭＲＰ−８（例１２）によ
りラビットを免疫感作することによりラビット抗−ＭＲ
Ｐ−８血清を生じさせる。完全ソロインドアジュバント
（ギブコ）中０．５■の蛋白質を注射し、次に２０日後
後不完全フロインドアジュバント中、５■の蛋白質を追
加免疫注射する。ラビット血清の力価を、確立された方
法に従って組換ＭＲＰ−８によりコードされたマイクロ
タイタープレート中でエンザイム・リンクド・イムノソ
ルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりモニターする
。ウェスタンプロット試験によれば、未形質転換Ｅ、コ
リの細胞溶解物による消耗吸収（ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ
　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）の後、抗血清中残留する唯一
の反応性はＭＲＰ−８に対して向けられる。
４〜５■の精製された組換ＭＲＰ−８（例２０）を１−
のアフィーゲル１０に製造者（ビオ−ラド、リソチモン
ド、カリホルニア）の方法を用いて連結することにより
ＭＲＰ−８−チフィ−ゲル１０イムノフドゾルベントカ
ラムを調製する。単一特異的ラビット抗−ＭＲＰ−８血
清（例３４）からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を５０
％飽和の硫酸アンモニウムにより沈澱せしめる。沈澱を
ＰＢＳ中に溶解し、そしてＰＢＳに対して透析する。約
１００ｍｇのＩｇＧを含有する透析された溶液１５ｍｆ
ｉを１０〜１２ｍｅ　／　時の流速でイムノアフィニテ
ィーカラムにポンプを用いて通す。カラムをＰＢＳｌｏ
、４Ｍ塩化ナトリウムで洗浄することにより非特異的に
結合した物質を除去する。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ２
　　（ｐＨ２，５）を用いて特異的に結合したｒｇＧを
溶出せしめる。抗体を含有する両分をプールし、ＩＭＴ
ｒｉｓを加えて中和し、そしてＰＢＳに対して透析する
。ＭＲＰ−８に対して特異的なｒｇｃが約４ｎｗ得られ
る。
Ｍ主ｉＭＲＰ−１４に文するポリクローナル　−３５．
１．　−ビ・・ト　−ＭＲＰ−１４血−Ｅ、コリからの
精製された組換ＭＲＰ−１４（例２２）によりラビット
を免疫感作することによりラビット抗−ＭＲＰ−１４血
清を生じさせる。完全フロインドアジュバント（ギブコ
）中０．５　Ｎの蛋白質を注射し、次に２０日後に不完
全フロインドアジュバント中０．５■の蛋白質を追加免
疫注射する。ラビット血清の力価を、確立された方法に
従って組換ＭＲＰ−１４でコートされたミクロタイター
プレート中でエンザイム・リンクド・イムノソルベント
・ア・ソセイ（ＥＬＩＳＡ）によりモニターする。ウェ
スタンプロットの試験によれば、未形質転換Ｅ、コリの
細胞溶解物による消耗吸収の後、清血清中に残る唯一の
活性はＭＲＰ−１４に対して向けられる。
３５．２．押ム月ぶ）巳Ｊ３　　・なラビット　　のイ
例３４．２に記載したのと同様にして、組換ＭＲＰ−１
４＝アフィーゲル１０イムノアトゾルベントカラムを調
製し、そして単一特異的ラビット抗−ＭＲＰ−１４血清
からのラビット抗−ＭＲＰ−１４ＩｇＧの単離に使用す
る。ＭＲＰ−１４に対して特異的なＩｇＧ約３．２■が
得られる。
３６．１．免覗勲りＹ汰 ３匹の雌性Ｂａ１ｂ／ｃマウスに、完全フロインドアジ
ュバント中０．１　ｍｇＯ組換ＭＲＰ−８（例１２；例
２０．２と同様にして精製したもの）を腹腔内注射し、
次に１４日間隔で２回、不完全フロインドアジュバント
中０．０５■のＭＲＰ−８を追免疫注射する。６週間後
、生理食塩水中０．０５ｎｗのＭＲＰ−８を注射し、そ
して４日後にマウスを殺す。
以下余白 ３６．２．　　　助人　びハイブリ【−１９亀離すべて
の融合実験を確立された方法（Ｇ　、　Ｋｏｅｈ　Ｉ　
ｅｒ及びＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、　１
９７６、」固、４９５）に従って非水泌性骨髄腫細胞系
Ｐ３　Ｘ　６３−八ｇ８．６５３（ＡＴＣＣＩｔＣＲＬ
　１５８０）を用いて行う。１０°個の肺細胞を、３５
Ｗ／Ｖ％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、
メルク）及び１５％のジメチルスルホキシド（メルク）
の存在下で１０７個の骨髄腫細胞と融合せしめる。融合
混合物を、フィーダー細胞としてマウス腹腔滲出細胞を
収容するミクロクイタープレート（ファルコン）の１２
００個のウェル中の標準ＨＡＴ選択培地（２０％ＦＣ３
，ギブコ）中に分配する。１０〜１４日後、増殖中のハ
イブリドーマの上清をサンドイッチＥＬＩＳＡ（例４０
．２）によりＭＲＰ−８への結合について試験する。試
験した６３３個のハイブリドーマ上清の内４８個がこの
アッセイにおいて強く陽性であった。適当なハイブリド
ーマを、限界稀釈法により少なくとも２回再クローニン
グする。
以下余白 ＪＬＬＬ　　門ＲＰ−８に・　るモノクロ−ル　　の″
３７．１．華離及Ｕ猜製 ８〜１０週令のＢａ１ｂ／ｃマウスを０．３艷のブリス
タン（アルドリッチ）により腹腔内（ｉ、ｐ、）前処理
する。２〜３週間後、５〜１０　Ｘ　１０６のクローン
化ハイブリドーマ細胞及び０．２　ｍのプリスタンをｉ
、ｐ、注射する。８〜１０週間後に腹水を集め、８００
Ｘｇで遠心分離し、そして−８０°Ｃにて貯蔵する。
他の方法として、ハイブリドーマをハイブリドーマ培地
（ギブコ）を用いて大規模にインビトロ増殖せしめる。
上清を８００Ｘｇにて遠心し、０．４５陣ナルゲン（Ｎ
ａｌｇｅｎｅ）により濾過し、そして−８０°Ｃにて貯
蔵する。
０．９容量の飽和硫酸アンモニウムを０℃にて滴加する
ことにより粗免疫グロブリンを沈澱せしめ、次に２０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ吐、５０ｍＭ　ＮａＣ７！　　（ｐＨ
７，９）中に溶Ｈする。ビオ−ラドのアフィゲル・プロ
ティンＡ　ＭＡＰＳキットを用いてＩｇＧ画分を得る。
溶出したＩｇＧ画分を硫酸アンモニウムにより再度沈澱
せしめ、そして１０■／−の濃度でＰＢＳ中に溶解し、
そして同じ緩衝液に対して透析する。
３７．２．豊敗仕仇 選択されたハイブリドーマ８−５Ｃ２及び８−１０Ｄ７
により生産された抗体をその特異性について、ラビット
抗−ＭＲＰ−８及び抗−ＭＲＰ−１４を用いるサンドイ
ッチ型ＥＬＩＳＡ（例４０及び４２　）　、ＭＲＰ−８
及びＭＲＰ−１４についてのウェスタンプロット（例３
１．５及び３２．２）　、並びにＭＲＰ−８及びＭＲＰ
−１４についての単一細胞アッセイ　（例３１．４及び
３２．１）において試験する。モノクローナル抗体８−
５Ｃ２及び８−１０Ｄ７は、ＥＰ　１６２，８１２のＭ
ＩＦ　８ｋＤ、及びＥ。
コリ（例１２）、酵母（例１９）及びトランスフェクト
された胎児肺細胞Ｌ〜１３２において発現された組換Ｍ
ＲＰ−８を選択的に認識するが、しかし天然のもしくは
組換？ＩＲＰ−１４又は他の蛋白質とは交叉反応しない
。認識されるエピトープは５ＤＳ−安定である。
モノクローナル抗体のサブクラスは標準的方法（Ｊ、Ｂ
ｒｕｇｇｅｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｔｈｏｒ、１９８３、■、２００）に従って決
定され、そして８−５Ｃ２及び８−１０Ｄ７の両者とも
Ｉｇｃ＋であることが見出された。
Ｂａ１ｂ／ｃマウスを完全フロインドアジュバント中０
．１　ｍｇのＥ、コリ由来組換ＭＲＰ−１４（例１３；
例２２に従って精製したもの）により免疫感作し、次に
１４日の間隔で２回、不完全フロインドアジュバント中
０．０５■のＭＲＰ−１４の追加免疫注射する。
６週間後、生理食塩水中０．０５■のＭＲＰ−１４を注
射する。４日後、免疫感作されたマウスの肺細胞を集め
、そしてマウス骨髄腫細胞Ｐ３　Ｘ　６３−　Ａｇ８．
６５３（ＡＴＣＣ隘ＣＲＬ　１５８０）と融合せしめ、
そして生ずるハイブリドーマ細胞を例３６に記載したよ
うにしてスクリーニングする。試験した４２０個のハイ
ブリドーマ上清の内、例４２のサンドイッチ型エリサに
おいて２７が陽性であった。適当なハイブリドーマを限
界稀釈性により少なくとも２回再クロ−ニングする。
例３８の選択されたハイブリドーマ細胞を、例３７．１
において記載したインビボ増殖又はインビトロ培養する
。沈澱したＩｇＧ画分をアフィゲル−プロティンＡ　Ｍ
ＡＰＳキットを用いて精製し、硫酸アンモニウムで再び
沈澱せしめ、ＰＢＳ中に１０■／−の濃度に溶解し、Ｐ
ＢＳに対して透析し、そして−８０℃にて貯蔵する。
選択されたハイブリドーマ１４−６Ｂ２及び１４−１９
Ｃ９により生産された抗体をその特異性について、例３
７．２において記載したようにサンドインチ型ＥＬＩＳ
Ａ　、ウェスタンプロット及び単一細胞アッセイにおい
て試験する。モノクローナル抗体１４−６Ｂ２及び１４
−１９Ｃ９は天然ＭＲＰ−１４、ＦＩＲＰ−１４’、組
換ＭＲＰ−１４及びＭＲＰ−１４ｄを選択的に認識する
が、しかしＦＩＲＰ−８又は他の蛋白質と交叉反応しな
い。
モノクローナル抗体１４−６　Ｂ　２及び１４−１９Ｃ
９のサブクラスはＩｇＧｔ　と決定される。
（２２Ｂ） 捌４０．ｆｆＪ−イムノア・セイ（ＥＬＩＳＡ　　によ
る１■のポリクローナル−ラビット抗−ＭＲＰ−８抗体
（例３４　）又はモノクローナル抗体８−５Ｃ２（例３
７）と０．１■のビオチン−Ｘ−ＮＨ３（カルビオケム
）を、■−の０．　Ｉ　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８
，０）中で４℃にて４時間、Ｌｅｒｎｅｒ等（Ｊ　、　
Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。
１９８０、」、１０８５）の方法の変法に従って反応せ
しめる。ビオチン化された抗体を４℃にてＰＢＳに対し
て透析し、そして−８０℃にて貯蔵する。
ミクロタイタープレート（ＮＵＮＣＦｌ）を０．０５Ｍ
炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）中側３４．２のアフィニテ
ィー精製されたラビット抗−ＭＲＰ−８抗体（５ｐｇ　
／　ｍｌ　）を５０μｌ／ウエルでコートし、そして４
℃にて一夜インキユヘートする。コートされたプレート
は２週間貯蔵することができる。非特異的部位を０．２
％のゼラチン及び１％のＢＳＡ　（セルバ）を含有する
ＰＢＳにより３７℃にて１時間ブロックした後、５０Ｉ
ｌｌ／ウエルの稀釈シリーズのＭＲＰ−８（例２０．２
．０．１〜５０ｎｇ／ｍｊり及び５０μｇ／ウェルの稀
釈シリーズの試験サンプル〔０，２％ゼラチン、１％Ｂ
ＳＡ及び０．０５％トウィーン２０　（ビオ−ラド）を
含有するＰＢＳ中〕を加え、そして４℃にて一夜インキ
ユベートする。０．０５％のトウィーン２０を含有する
ＰＢＳですすいだ後、ＰＢＳ中例中側、１のビオチン化
うビット抗−ＭＲＰ−８（Ｉｇｇ／ｍｌ）、０．２％ゼ
ラチン及び０．０５％トウィーン２０を３７℃にて１時
間インキュベートし、次にストレプトアビジン−パーオ
キシダーゼ（Ｂ　ＲＬ）により３７℃にて３０分間処理
する。ＰＢＳ及び０．０５％トウィーン２０すすいだ後
、０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，０）中に溶解し
た０、０６４　ｖ　／　ｖ％の８２０２　（メルク）及
び２．２′−アジノービス−（３−エチルベンズチアゾ
リンスルホン酸）〔＾ＢＴＳ、０．５４ｍｇ／ｍ１（Ｗ
／　ｖ）　、ヘーリンカーマンハイム〕を用いて、結合
したパーオキシダーゼを発色せしめる。３７°Ｃにて３
０分間の後、８チャンネル光度計（フロラ）を用いて４
１５ｎｍにて光学濃度を測定する。
このアッセイは、ヒト単球の細胞溶解物中、ＭＲＰ−８
でトランスフェクトされた胎児肺細胞Ｌ−１３２（例３
１）中、並びにヒト患者及び正常対照者の血漿サンプル
中、５０ｐｇ７ｍ１以上のＭＲＰ−８を検出する。
ビオチン化うビット抗−ＭＲＰ−８の代りにビオチン化
マウスモノクローナル抗体８−５Ｃ２（ｌｘ／−）を用
いることができる。
アッセイ方法は例４０．２と同様であるが、ただし、ミ
クロタイタープレートをまずモノクローナル抗体８−１
０Ｄ　７　　（Ｉ０ｐｇ／ｍｌ＞でコートする。非特異
的部位をブロックした後、被験サンプル及びＭＲＰ−８
の標準液を加え、そして次にビオチン化抗体８　”　５
　Ｃ２（Ｉｔｔｇ／ｍｌ＞　と反応せしめる。他の操作
は前記の通りである。
ビオチン化モノクローナル抗体８−５Ｃ２の代りにビオ
チン化うビット抗−ＭＲＰ−８を用いることができる。
アッセイ方法は例４０．２に記載した通りである。
捕捉抗体として８−１０Ｄ７（又は８−５Ｃ２）（Ｉ０
■／−）をミクロタイタープレート上にコートする。非
特異的部位をブロックした後、被験サンプル及びＭＲＰ
−８を含有する標準溶液を添加し、そして次にラビット
抗−ＭＲＰ−８と反応せしめる。
結合したラビット抗体を種特異的ヤギ抗−ラピッ）１ｇ
−パーオキシダーゼ接合体（ＤＩＡＮＯＶへ）により検
出し、さらに例４０．２のようにして処理する。
同様のアッセイにおいては、コートするためにポリクロ
ーナル−ラビット抗−ＭＲＰ−８を使用し、次に被験サ
ンプルで処理し、次にモノクローナル抗体８−５Ｃ２又
は８−１０Ｄ？で処理する。結合したマウス抗体を種特
異的ヤギ抗−マウスＩｇ−パーオキシダーゼ接合体（Ｄ
ＩＡＮＯＶＡ）と反応せしめる。
■↓１．　　ＭＲＰ−８のためにサンドイッチＥＬＩＳ
Ａ　　キＪ上 例４０．２のサンドイッチＥＬＩＳへのためのキットは
次のものを含む。
１）ミクロタイタープレート（ＮＵＮＣＦＩ）２）０．
０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）中アフィニティー精
製されたラビット抗＝ ＭＲＰ−８ポリクローナル抗体（５■／−；例３４．２
）　　　　　　　　　　　　　１０ｄ３）０．０５％の
トウィーン２０を含有するＰＢＳ中組換ＭＲＰ−８標準
溶液（Ｉ■／ｄ）１．０ｍ１ ４　ａ）　ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）　、０．２％ゼラチ
ン、１％ＢＳＡ、０．０５％トウィーン２０中ビオチン
化ラビット−抗− ＭＲＰ−８（Ｉｔｔｇ／　ｒｄ　；例４０．１）　　　
　　　　１０＋ｄ又は ４ｂ）　ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）　、０．２％ゼラチン
、１％ＢＳＡ、０．０５％トウィーン２０中ビオチン化
モノクローナル抗 体８　５　Ｃ２（Ｉｔｔｇ／ｍｌ）　　　　　ＬＯｍ１
５）ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）　、２％ゼラチン、１％Ｂ
ＳＡ、０．０５％トウィーン２０中ストレプトアビジン
−パーオキシ ダーゼ（Ｂ　ＲＬ）　１　：　２０００　　　　１０ｍ
１６）ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０　　　２００
艷７）　ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）　、０．２％ゼラチン
、１％ＢＳＡＳ０．０５％トウィーン２０　　　　　　
　　　　　　　　２００ｙｎ１８）０．０５Ｍクエン酸
緩衝液（ｐＨ４，０）中ＡＢＴＳ　（０，５４ｍｇ’／
　ｍｌ）及び０．０６４％Ｈ２Ｏ２４０ｍ１ ９）換算曲線 １０）説明書。
例４０．３のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡのための試験キ
ットは前記の要素を含むが次の点で異る。
２）モノクローナル抗体８−１０Ｄ７ （Ｉ０ｔｔｇ／　ｍｌ）１０ｍ１ ４ａ）ビオチン化モノクローナル抗 体８　５Ｃ２（Ｉｇ／ｍｌり　　　　　１０＋ｄ又は ４ｂ）ビオチン化ポリクローナル− ラビット抗＝ＭＲＰ−８抗体（ＩＩ！ｇ／ｍｌ）　　’
　　　　　　　　　　　　　　１０−例４０．４のサン
ドイッチ型ＥＬＩＳＡのための試験キットは前記と同じ
要素を含むが、次の点で異る。
２ａ）モノクローナル抗体８−１０Ｄ ７又は８　５Ｃ２（Ｉ０ｇ／＋＋＋Ｆり　　　１０ｍ１
又は ２ｂ）アフィニティー精製されたポ リクローナル−ラビット抗− ＭＲＰ−８抗体（５ｐｇ／　ｍｅ）　　　　　　　１０
＋ｄ４ａ）ポリクローナル−ラビット 抗＝ＭＲＰ−８抗体（Ｉｔｎｒ／　ｍｌり　　　　　１
０ｍ１及び 以下余白 ５ａ）ヤギ抗−ラビットｒｇ−パ ーオキシダーゼ接合体１　：　５０００　　　　ＬＭ又
は ４ｂ）モノクローナル抗Ｅｌ−５Ｃ２ （Ｉ■／ｍｌ）１０ｍｌ 及び ５ｂ）ヤギ抗−マウスＩｇ−パーオ キシダーゼ接合体１　：　５０００　　　　　１０ｄポ
リクローナル−ラビット抗−ＭＲＰ−１４抗体（例３５
）、又はモノクローナル抗体１４−６Ｂ２もしくは１４
−１９Ｃ９（例３９）を例４０．１に記載したようにし
てビオチン化する。
例４０．２又は４０．４に記載したようにしてＭＲＰ−
１４の検出のためのサンドイッチ型ＥＬｒＳＡを行う。
ただし、ポリクローナル抗体抗−？ＩＲＰ−８の代りに
ポリクローナル抗体抗ＭＲＰ−１４を使用し、そしてモ
ノクローナル抗体８−１０Ｄ７又は８−５Ｃ２の代りに
モノクローナル抗体１４−６Ｂ２又は１．４−１’９　
Ｃ９を使用する。標準溶液は例２２のＭＲＰ−１４から
調製する（０．１〜１１００ｎ／　ｍｌ　）。
血漿中のＭＲＰ−１４の測定のため、ヘパリンと共に採
取した血漿サンプルをすぐに１ｍＭフェニルメタンスル
ホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、フル力）にし、そして−
８０℃にて貯蔵する。分析のため、サンプルを１：５〜
１　：　１０，０００に稀釈し、そして前記のサンドイ
ッチアッセイにおいて試験する。
ポリクローナル抗−ＭＲＰ−１４抗体、及びビオチン化
抗−ＭＲＰ−１４又はビオチン化モノクローナル抗体１
４−６Ｂ２を用いる例４２のサンドイッチＥＬＩＳＡの
ための試験キットは次のものを含む。
■）ミクロタイタープレート（ＮＵＮＣＦＩ）２）０．
０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）中アフィニティー精
製されたラビット抗 −ＭＲＰ−１４ポリクローナル抗体（５μｇ／−１例３
５．２）　　　　　　　　　　　　１０ｄ以下余白 ３）０．０５％トウィーン２０を含有するＰＢＳ中組換
ＭＲＰ−１４標準溶液（Ｉ■／ｍＲ＞　　　　　　　　
　　　　　　１．０ｍＲ４ａ）ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）
　、０．２％ゼラチン、１％ＢＳＡ、０．０５％トウィ
ーン中ビオチン化ラビット−抗−ＭＲＰ−１４（Ｉｐｇ
／　ｍｊ）　　　　　　　　　　　　　１０ｍ１又は ４　ｂ）　ＰＢＳ　（ｐ）１７．４）　、０．２％ゼラ
チン、１％ＢＳＡ、０．０５％トウィーン２０中ビオチ
ン化モノクローナル抗 体１４　６　Ｂ　２　（Ｉ　Ｎ／　＋＋ｄ！＞　　　　
　　１０ｍＲ５）ＰＢＳ　　（ｐｌ（７，４）　、２％
ゼラチン、１％ＢＳＡ、０．０５％トウィーン２０中ス
トレプトアビジン−パーオキシ ダーゼ（Ｂ　ＲＬ）　１　：　２０００　　　　１０ｍ
Ｒ６）ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０　　　２００
ｍｅ７）ＰＢＳ　　（ｐＨ７，４）　、０．２％ゼラチ
ン、１％ＢＳＡ、０．０５％トウィーン２０２００ｍε ８）０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，０）中ＡＢＴ
Ｓ　（０，５４■／−）及び０．０６４％Ｈ２Ｏ２４０
艷 ９）換算曲線 １０）説明書。
ビオチン化ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体
、及びストレプトアビジン−パーオキシダーゼ接合体（
４及び５）の代りに、ポリクローナル抗体又はモノクロ
ーナル抗体それ自体、及び種特異的抗−１ｇ血清−バー
オキシダーゼ接合体（例４１のごとく）を使用すること
ができる。
！ＷＬＬ４．ＭＵ　　　　のた、めの　″す２０ＯＮの
例２０．５のＭＲＰ−８又は例２２．３のＭＲＰ−１４
を３　ｍｌの５Ｎヒト血清アルブミンに溶解する。生ず
る溶液を細菌学的フィルターに通し、そして濾過された
溶液を無菌条件下で１０本のバイアルに分ける。これら
のバイアルは、例えば−２０℃において冷所に貯蔵する
のが好ましい。
【図面の簡単な説明】
及び非還元条件Ｆ（’Ｆ３）？’吻５ＤＳ−ＰＡＧＥの
ポリアクリルアシドゲルを示す。レーン１及び２二分子
量マーカー；レーン３：例１．１．のＩＣ５アフイニテ
イーカラムから溶出した全蛋白質；レーン４〜１０：１
ｆＰＬＣ画分１〜■。 第２図は、クローン３から単離された式（■）のＭＲＰ
−８のｃＤＮＡを模式的に示す。パートＡにはコード領
域が示されている。丸で囲んだ数字はクローン３のｃＤ
ＮＡと他のクローンから単離されたｃＤＮＡで異る塩基
の位置、及び例１０において検討した他の特定の特徴を
示す。レーンＢは配列決定のために使用された制限部位
の位置を示す。パートＣは配列決定の方策を要約したも
のであり、制限部位における配列の開始（垂直の線）及
び終止（矢じり）、明瞭な配列の終止（点）及び各クロ
ーンのＤＮＡの終点（クロス印）を示す。数値は異るク
ローンの番号を示し、文字は配列決定法（Ｓ：Ｓａｎｇ
ｅｒ法、ＭＧ　：　Ｍａｘａｍ　Ｇ１１ｂｅｒｔ法）を
示す。 第３図は、式（ＩＸ）のＭＲＰ−１４のｃＤＮＡを模式
的に示し、コード領域（レーンＡ）、配列決定に使用さ
れた制限部位の位置（レーンＢ）、並びにクローン肝Ｐ
−１４−１０、クローンＭＲＰ−１４−１６及びクロー
ンＭＲＰ〜１４−１５．１８及び１９に適用された配列
決定法（レーンＣ）を示す（例１１）。 第４図は、式（■）　（ＭＲＰ−３）のゲノムＤＮＡを
模式的に示す。下方のレーンは配列決定に使用した制限
部位の位置、エクソン１．２及び３の位置（箱）並びに
トリプレットＡＴＢ及びＴＡＧ間のコード配列（黒Ｎ）
を示す。上方のレーンは配列決定法を要約するものであ
り、制限部位における配列の開始及び読取可能配列の終
止又は制限部位における配列の終止を示す。配列決定法
はＳａｎｇｅｒ及びＣｏｕｌｓｏｎに従った。 第５図は、式（Ｘ　）　（ＭＲＰ−１４）のゲノムＤＮ
Ａを模式的に示す。エクソン１．２及び３（箱）の、並
びにトリプレットＡＴＧ及びＴＡＡ間のコード配列（黒
箱）の制限部位の位置を示す。配列決定法は矢印から演
鐸することができる。配列は制限部位（矢印の始め）か
ら次の制限部位又は読み取り可能な配列の終点まで読み
取られた。Ｓａｎｇｅｒ及びＣｏｕｌｓｏｎの配列決定
法が使用された。 第６図は、プラスミドｐＣＭＶｅ　／　ＭＲＰ−８の制
限地図を、複製開始点Ｏｒ＋、アンピシリン耐性遺伝子
Ａｍｐ”　、ヒトＣＭＶエンハンサ−及びＭＲＰ−８を
コードする遺伝子の３個のエクソンの相対的の位置と共
に示す。 第７図は、プラスミドＩ）ＣＭＶｅ／　ＭＲＰ−１４の
制限地図を、複製開始点Ｏｒｉ、アンピシリン耐性遺伝
子（Ａｍｐ”　）　、ヒトＣＭＶエンハンサー１ＭＲＰ
−１４プロモーター領域及びＭＲＰ−１４の３個のエク
ソンの相対位置と共に示す。 第８図は、３９人の正常な健康な捉供者（Ａ）、及び合
計１８人ののう包性繊維症（ＣＦ）（白丸はホモ接合体
、黒丸はへテロ接合体）（Ｂ）のＭＲＰ−１４の血漿中
濃度を示す。ＭＲＰ−１４の濃度ｎ　ｇ　／　ｍＲの対
数スケールで示す。ヘパリンと共に採取した血漿サンプ
ルを１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドに調整
し、そして例３５のＭＲＰ−１４に対するポリクローナ
ル抗体を用いる例４２のサンドイッチＥＬＩＳＡにより
二連で試験した。 ニＥＥｉｉ：ＩＡ ＩＡ） ｊ阿１Ｂ 二ＴＩ５１ 手続補正書く方式） 昭和６３年１月６　日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第２４８１６Ｂ号 ２、発明の名称 新規リンホカイン関連ペプチド ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　チバーガイギー　アクチェンゲゼルシャフト４、
代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、
補正命令の日付 昭和６２年１２月２２日（発送日） ７く；〉、 ６、補正の対象 明細書の「図面の簡単な説明」の欄 ７、補正の内容 明細書第２３９頁第２０行目「第１図（Ａ）。 （Ｂ）は、」を「第１Ａ図、及び第１Ｂ図は、」に補正
する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、見かけ分子量約８ｋＤ又は約１４ｋＤのヒトマクロ
    ファージ遊走阻止因子関連ペプチド（ＭＲＰ）、又はそ
    の変異体、断片もしくは誘導体。 ２、次の式（ I ）： 【アミノ酸配列があります】（ I ） （式中、Ｚ＿１は水素、アシル又はアミノ酸残基メチオ
    ニンである、） で表わされる特許請求の範囲第１項に記載のヒトマクロ
    ファージ遊走阻止因子関連ペプチド、又はその変異体、
    断片もしくは誘導体。 ３、次の式（II）： 【アミノ酸配列があります】（II） （式中、Ｚ＿２は水素、アシル、又は１〜５個のアミノ
    酸から成る場合によってはアシル化されているペプチド
    残基である、） で表わされる特許請求の範囲第１項に記載のヒトマクロ
    ファージ遊走阻止因子関連ペプチド、又はその変異体、
    断片もしくは誘導体。 ４、Ｚ＿１が水素、アセチル、又はアミノ酸残基メチオ
    ニン（Ｍｅｔ）である特許請求の範囲第２項に記載の式
    （ I ）のヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチ
    ドＭＲＰ−８。 ５、Ｚ＿１がＭｅｔである特許請求の範囲第２項に記載
    の式（ I ）のヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペ
    プチドＭＲＰ−８。 ６、Ｚ＿２が水素、アセチル、Ｍｅｔ−、Ｔｈｒ−Ｃｙ
    ｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−、Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙ
    ｓ−Ｍｅｔ−又はアセチル−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−
    Ｍｅｔ−である特許請求の範囲第３項に記載の式（II）
    のヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチドＭＲＰ
    −１４。 ７、Ｚ＿２が水素、又はＴｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅ
    ｔ−である特許請求の範囲第３項に記載の式（II）のヒ
    トマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチドＭＲＰ−１
    ４。 ８、式（ I ）の化合物の１個、２個又は３個の単一の
    アミノ酸が異るアミノ酸又は結合により置き換えられて
    いる、特許請求の範囲第２項に記載の式（ I ）のＭＲ
    Ｐ−８の変異体。 ９、２０個以上の連続するアミノ酸を含んで成る特許請
    求の範囲第２項に記載の式（ I ）のＭＲＰ−８の断片
    。 １０、アミノ及び／又はヒドロキシ官能基がグリコシル
    化されている特許請求の範囲第２項に記載の式（ I ）
    のＭＲＰ−８の誘導体。 １１、Ｚ＿１がＭｅｔであり、そしてシステイン残基の
    メルカプト基が酸化された形態にあって分子間Ｓ−Ｓ橋
    を提供している特許請求の範囲第２項に記載の式（ I
    ）のＭＲＰ−８のダイマー。 １２、式（II）の化合物の１個、２個又は３個の単一の
    アミノ酸が異るアミノ酸又は結合により置き換えられて
    いる、特許請求の範囲第３項に記載の式（II）のＭＲＰ
    −１４の変異体。 １３、２０個以上の連続するアミノ酸を含んで成る特許
    請求の範囲第３項に記載の式（II）のＭＲＰ−１４の断
    片。 １４、アミノ及び／又はヒドロキシ官能基がグリコシル
    化されている特許請求の範囲第３項に記載の式（II）の
    ＭＲＰ−１４の誘導体。 １５、Ｚ＿２がＴｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−であ
    り、そしてシステイン残基が酸化された形態にあって分
    子間Ｓ−Ｓ橋を提供している特許請求の範囲第３項に記
    載の式（II）のＭＲＰ−１４のダイマー。 １６、システイン残基のメルカプト基が酸化された形態
    にあって分子間Ｓ−Ｓ橋を形成している、Ｚ＿１がＭｅ
    ｔである式（ I ）のＭＲＰ−８とＺ＿２がＴｈｒ−Ｃ
    ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−である式（II）のＭＲＰ−１４
    との、特許請求の範囲第１項に記載のダイマー。 １７、見かけ分子量約８ｋＤ又は約１４ｋＤのヒトマク
    ロファージ遊走阻止因子関連ペプチド、又はその変異体
    、断片もしくは誘導体の製造方法であって、目的の化合
    物を含有する溶液をクロマトグラフ法により精製し、そ
    して該化合物を単離し、そして所望によりそれから断片
    又は誘導体を調製することを特徴とする方法。 １８、前記目的化合物を含有する溶液が、刺激された正
    常ヒトリンパ球の又は遺伝子操作された微生物もしくは
    永久哺乳類セルラインの前精製された抽出物、細胞上清
    又は培養濾液である、特許請求の範囲第１７項に記載の
    方法。 １９、前記クロマトグラフ精製法がイオン交換クロマト
    グラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、ゲル濾
    過、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシア
    パタイト上でのクロマトグラフィー、疎水性相互作用ク
    ロマトグラフィー又はこれらの組合わせから選択される
    、特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 ２０、目的化合物を含有する溶液を、異種性ポリペプチ
    ドの発現を許容する条件下で、式（ I ）又は（II）の
    ペプチド、又はその変異体もしくは誘導体を発現する形
    質転換された宿主を培養することにより得る、特許請求
    の範囲第１７項に記載の方法。 ２１、次の段階： ａ）式（ I ）もしくは（II）の化合物又はその断片を
    コードするＤＮＡをヒト細胞のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮ
    Ａライブラリーから単離しそして場合によってはそれを
    変異せしめるか、又はそのようなＤＮＡを化学的に合成
    し； ｂ）該ＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し； ｃ）該得られたハイブリドベクターを受容宿主に移行せ
    しめ； ｄ）形質転換された宿主のみが生存する条件下で培養す
    ることにより未形質転換宿主から形質転換された宿主を
    選択し； ｅ）異種性ポリペプチドの発現を許容する条件下で、形
    質転換された宿主を培養し；そして ｆ）式（ I ）もしくは（II）の化合物又はその変異体
    、断片もしくは誘導体を単離し； そして所望により、式（ I ）もしくは（II）の化合物
    又はその変異体もしくは断片を誘導体にする；を含んで
    成る特許請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２、式（ I ）もしくは（II）の化合物又はその変異
    体もしくは断片をコードし、少なくとも１５ヌクレオチ
    ドを含んで成るＤＮＡ。 ２３、次の式（III）： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） 〔式中、 Ｙ＿１はプロモーター配列を含有する１２ヌクレオチド
    以上のフランキングＤＮＡ残基であり； Ｙ＿２はＹ＾Ｍ−Ｙ＾Ｔ−Ｙ＾Ｃ−Ｙ＾Ｘであるか、又
    は存在せず； Ｙ＿３は１ヌクレオチド以上のフランキングＤＮＡ残基
    であるか、又は存在せず； Ｙ＾Ａはアラニン（Ａ又はＡｌａ）をコードし、そして
    ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ又はＧＣＧであり； Ｙ＾Ｃはシステイン（Ｃ又はＣｙｓ）をコードし、そし
    てＴＧＴ又はＴＧＣであり； Ｙ＾Ｄはアスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）をコードし、
    そしてＧＡＴ又はＧＡＣであり； Ｙ＾Ｅはグルタミン酸（Ｅ又はＧｌｕ）をコードし、そ
    してＧＡＡ又はＧＡＧであり； Ｙ＾Ｆはフェニルアラニン（Ｆ又はＰｈｅ）をコードし
    、そしてＴＴＴ又はＴＴＣであり； Ｙ＾Ｇはグリシン（Ｇ又はＧｌｙ）をコードし、そして
    ＧＧΥ、ＧＧＣ、ＧＧＡ又はＧＧＧであり； Ｙ＾Ｈはヒスチジン（Ｈ又はＨｉｓ）をコードし、そし
    てＣＡＴ又はＣＡＣであり； Ｙ＾Ｉはイソロイシン（Ｉ又はＩｌｅ）をコードし、そ
    してＡＴＴ、ＡＴＣ又はＡＴＡであり； Ｙ＾Ｋはリジン（Ｋ又はＬｙｓ）をコードし、そしてＡ
    ＡＡ又はＡＡＧであり； Ｙ＾Ｌはロイシン（Ｌ又はＬｅｕ）をコードし、そして
    ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ又はＣＴＧで
    あり； Ｙ＾Ｍはメチオニン（Ｍ又はＭｅｔ）をコードし、そし
    てＡＴＧであり； Ｙ＾Ｎはアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）をコードし、そ
    してＡＡＴ又はＡＡＣであり； Ｙ＾Ｐはプロリン（Ｐ又はＰｒｏ）をコードし、そして
    ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ又はＣＣＧであり； Ｙ＾Ｑはグルタミン（Ｑ又はＧｌｎ）をコードし、そし
    てＣＡＡ又はＣＡＧであり； Ｙ＾Ｒはアルギニン（Ｒ又はＡｒｇ）をコードし、そし
    てＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧ
    であり； Ｙ＾Ｓはセリン（Ｓ又はＳｅｒ）をコードし、そしてＴ
    ＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ΥＣＧ、ＡＧＴ又はＡＧＣであ
    り； Ｙ＾Ｔはトレオニン（Ｔ又はＴｈｒ）をコードし、そし
    てＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ又はＡＣＧであり； Ｙ＾Ｖはバリン（Ｖ又はＶａｌ）をコードし、そしてＧ
    ＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧであり； Ｙ＾Ｗはトリプトファン（Ｗ又はＴｒｐ）をコードし、
    そしてＴＧＧであり； Ｙ＾Ｙはチロシン（Ｙ又はＴｙｒ）をコードし、そして
    ＴＡＴ又はＴＡＣであり；そして Ｙ＾＊は終止コドンＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡである、
    〕 で表わされるＭＲＰ−８をコードする特許請求の範囲第
    ２２項に記載のＤＮＡ、式（III）のＤＮＡとこれに対
    して相補的なＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ、該相補的
    ＤＮＡ自体、式（III）のＤＮＡを１個又は２個のイン
    トロンが中断しているゲノムＤＮＡ、１個、２個、３個
    もしくは４個のヌクレオチドが変異しているこれらのＤ
    ＮＡの変異体、又は少なくとも１５ヌクレオチドを含ん
    で成るこれらのＤＮＡの断片。 ２４、次の式（IV）： ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） 〔式中、 Ｙ＿１はプロモーターを含有する１２ヌクレオチド以上
    のフランキングＤＮＡ配列であり； Ｙ＿２はＹ＾Ｍ−Ｙ＾Ｔ−Ｙ＾Ｃ−Ｙ＾Ｋであるか、又
    は存在せず； Ｙ＿３は１ヌクレオチド以上のフランキングＤＮＡ配列
    であるか、又は存在せず； Ｙ＾Ａはアラニン（Ａ又はＡｌａ）をコードし、そして
    ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ又はＧＣＧであり； Ｙ＾Ｃはシステイン（Ｃ又はＣｙｓ）をコードし、そし
    てＴＧＴ又はＴＧＣであり； Ｙ＾Ｄはアスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）をコードし、
    そしてＧＡＴ又はＧＡＣであり； Ｙ＾Ｅはグルタミン酸（Ｅ又はＧｌｕ）をコードし、そ
    してＧＡＡ又はＧＡＧであり； Ｙ＾Ｆはフェニルアラニン（Ｆ又はＰｈｅ）をコードし
    、そしてＴＴＴ又はＴＴＣであり； Ｙ＾Ｇはグリシン（Ｇ又はＧｌｙ）をコードし、そして
    ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ又はＧＧＧであり； Ｙ＾Ｈはヒスチジン（Ｈ又はＨｉｓ）をコードし、そし
    てＣＡＴ又はＣＡＣであり； Ｙ＾Ｉはイソロイシン（Ｉ又はＩｌｅ）をコードし、そ
    してＡＴＴ、ＡＴＣ又はＡＴＡであり； Ｙ＾Ｋはリジン（Ｋ又はＬｙｓ）をコードし、そしてＡ
    ＡＡ又はＡＡＧであり； Ｙ＾Ｌはロイシン（Ｌ又はＬｅｕ）をコードし、そして
    ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ又はＣＴＧで
    あり； Ｙ＾Ｍはメチオニン（Ｍ又はＭｅｔ）をコードし、そし
    てＡＴＧであり； Ｙ＾Ｎはアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）をコードし、そ
    してＡＡＴ又はＡＡＣであり； Ｙ＾Ｐはプロリン（Ｐ又はＰｒｏ）をコードし、そして
    ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ又はＣＣＧであり； Ｙ＾Ｑはグルタミン（Ｑ又はＧｌｎ）をコードし、そし
    てＣＡＡ又はＣＡＧであり； Ｙ＾Ｒはアルギニン（Ｒ又はＡｒｇ）をコードし、そし
    てＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧ
    であり； Ｙ＾Ｓはセリン（Ｓ又はＳｅｒ）をコードし、そしてＴ
    ＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ又はＡＧＣであ
    り； Ｙ＾Ｔはトレオニン（Ｔ又はＴｈｒ）をコードし、そし
    てＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ又はＡＣＧであり； Ｙ＾Ｖはバリン（Ｖ又はＶａｌ）をコードし、そしてＧ
    ＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧであり； Ｙ＾Ｗはトリプトファン（Ｗ又はＴｒｐ）をコードし、
    そしてＴＧＧであり； Ｙ＾Ｙはチロシン（Ｙ又はＴｙｒ）をコードし、そして
    ＴＡＴ又はＴＡＣであり；そして Ｙ＾＊は終止コドンＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡである〕 で表わされるＭＲＰ−１４をコードする特許請求の範囲
    第２２項に記載のＤＮＡ、式（IV）のＤＮＡとこれに対
    して相補的なＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ、該相補的
    ＤＮＡ自体、式（IV）のＤＮＡを１個又は２個のイント
    ロンが中断しているゲノムＤＮＡ、１個、２個、３個も
    しくは４個のヌクレオチドが変異しているこれらのＤＮ
    Ａの変異体、又は少なくとも１５ヌクレオチドを含んで
    成るこれらのＤＮＡの断片。 ２５、次の式（Ｖ）： 【遺伝子配列があります】（Ｖ） （式中、Ｙ＿１はプロモーター配列を含有する１２ヌク
    レオチド以上のフランキングＤＮＡ残基であり、そして
    Ｙ＿３は１ヌクレオチド以上のフランキングＤＮＡ残基
    であるか、又は存在しない）で表わされる特許請求の範
    囲第２３項に記載のＤＮＡ、式（Ｖ）のＤＮＡとこれに
    対して相補的なＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ、該相補
    的ＤＮＡ自体、式（Ｖ）のＤＮＡを１個又は２個のイン
    トロンが中断しているゲノムＤＮＡ、１個、２個、３個
    又は４個のヌクレオチドが変異しているこれらのＤＮＡ
    の変異体、及び少なくとも１５ヌクレオチドを含んで成
    るこれらのＤＮＡの断片。 ２６、次の式（VI）： 【遺伝子配列があります】（VI） （式中、Ｙ＿１はプロモーター配列を含有する１２ヌク
    レオチド以上のフランキングＤＮＡ残基であり、Ｙ＿２
    はＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＡＡであるか、又は存在せず、
    そしてＹ＿３は１ヌクレオチド以上のフランキングＤＮ
    Ａ残基である、） で表わされる特許請求の範囲第２４項記載のＤＮＡ、式
    （VI）のＤＮＡとこれに対して相補的なＤＮＡとから成
    る二本鎖ＤＮＡ、該相補的ＤＮＡ自体、式（VI）のＤＮ
    Ａを１個又は２個のイントロンが中断しているゲノムＤ
    ＮＡ、１個、２個、３個もしくは４個のヌクレオチドが
    変異しているこれらのＤＮＡの変異体、又は少なくとも
    １５ヌクレオチドを含んで成るこれらのＤＮＡの断片。 ２７、次の式（VII）： 【遺伝子配列があります】（VII） で表わされる特許請求の範囲第２５項に記載のＤＮＡ。 ２８、式（VIII）の特許請求の範囲第２５項に記載のＤ
    ＮＡ。 ２９、次の式（IX）： 【遺伝子配列があります】（IX） で表わされる特許請求の範囲第２６項に記載のＤＮＡ。 ３０、式（Ｘ）の特許請求の範囲第２６項に記載のＤＮ
    Ａ。 ３１、式（Ｖ）もしくは（VI）のＤＮＡと、又は式（Ｖ
    ）もしくは（VI）のＤＮＡに対して相補的なＤＮＡとハ
    イブリダイズする、特許請求の範囲第２２項に記載のＤ
    ＮＡ。 ３２、式（ I ）又は（II）の化合物をコードするＤＮ
    Ａ、その変異体及びこれらのＤＮＡの断片の製造方法で
    あって、形質転換された宿主を培養しそしてこれから所
    望のＤＮＡを単離するか、又はヌクレオチドの縮合によ
    りそれを合成することを含んで成る方法。 ３３、次の段階： ａ）ヒト単核白血球からｍＲＮＡを単離し、目的のｍＲ
    ＮＡを選択し、該ｍＲＮＡに対して相補的な単離ＤＮＡ
    を調製し、次にこれから二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ　ｃＤＮＡ
    ）を調製するか、又は ｂ）ヒト細胞からゲノムＤＮＡを単離しそしてＤＮＡプ
    ローブを用いて目的のＤＮＡを選択し；そして ｃ）段階ａ）のｄｓ　ｃＤＮＡ又は段階ｂ）のｄｓ　Ｄ
    ＮＡを適当な発現ベクターに導入し； ｄ）適当な宿主微生物を前記の得られたハイブリドベク
    ターにより形質転換し； ｅ）式（ I ）もしくは（II）の化合物をコードするＤ
    ＮＡ又はその変異体もしくは断片を含有する形質転換さ
    れた宿主をコードＤＮＡを含有しない宿主から選択し；
    そして ｆ）目的のＤＮＡを単離する； を含んで成る特許請求の範囲第３２項に記載の方法。 ３４、発現制御配列に作用可能に連結された、式（ I
    ）もしくは（II）の化合物をコードするＤＮＡ、その変
    異体又はこれらのＤＮＡの断片を含んで成るハイブリド
    ベクター。 ３５、プラスミドｐＢＲ３２２由来の特許請求の範囲第
    ３４項に記載のハイブリドベクター。 ３６、ｔｒｐプロモーターを含有する特許請求の範囲第
    ３４項に記載のハイブリドベクター。 ３７、ファージλのプロモーターＰ＿Ｌを含有する特許
    請求の範囲第３４項に記載のハイブリドベクター。 ３８、酵母染色体自律複製セグメント（ａｒｓ）及び￥
    ＰＨ０５￥プロモーターを含有する特許請求の範囲第３
    ４項に記載のハイブリドベクター。 ３９、ベクターｐＪＤＢ２０７Ｒ／￥ＰＨ０５￥−ＭＲ
    Ｐ−８、ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−１４、
    又はｐＪＤＢ２０７Ｒ／￥ＰＨ０５￥−ＭＲＰ−１４ｄ
    である特許請求の範囲第３８項に記載のハイブリドベク
    ター。 ４０、ヒトサイトメガロウイルス主要中間−初期遺伝子
    のエンハンサーユニットを含有する特許請求の範囲第３
    ４項に記載のハイブリドベクター。 ４１、ベクターｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８、又はｐＣＭＶ
    ｅ／ＭＲＰ−１４である特許請求の範囲第４０項に記載
    のハイブリドベクター。 ４２、特許請求の範囲第３４項〜第４１項のいずれか１
    項に記載のハイブリドベクターにより形質転換された宿
    主細胞。 ４３、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
    ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第４２項に記載の宿主
    細胞。 ４４、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１／ＬＭ１０
    ３５、Ｋ１２又はＷ３１１０株である特許請求の範囲第
    ４３項に記載の宿主細胞。 ４５、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒ
    ｏ−ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である特許請
    求の範囲第４２項に記載の宿主細胞。 ４６、Ｓ．セレビシエー（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
    ＧＲＦ１８株である特許請求の範囲第４５項に記載の宿
    主細胞。 ４７、胎児肺細胞Ｌ−１３２である特許請求の範囲第４
    ２項に記載の宿主細胞。 ４８、ｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８又はｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ
    −１４及びｐＳＶ＿２ｎｅｏで安定に形質転換された胎
    児肺細胞Ｌ−１３２である特許請求の範囲第４７項に記
    載の宿主細胞。 ４９、療法的に有効な量のヒトマクロファージ遊走阻止
    因子関連ペプチド、又はその変異体、断片もしくは誘導
    体を含有する医薬。 ５０、ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチド及
    びその誘導体に対して特異的なポリクローナル抗体及び
    モノクローナル抗体。 ５１、ＭＲＰ−８及びその誘導体に対して特異的な特許
    請求の範囲第５０項に記載のポリクローナル抗体。 ５２、ＭＲＰ−１４及びその誘導体に対して特異的な特
    許請求の範囲第５０項に記載のポリクローナル抗体。 ５３、ＭＲＰ−８及びその誘導体に対して特異的な特許
    請求の範囲第５０項に記載のモノクローナル抗体。 ５４、ＭＲＰ−１４及びその誘導体に対して特異的な特
    許請求の範囲第５０項に記載のモノクローナル抗体。 ５５、８−５Ｃ２、８１０Ｄ７、１４−６Ｂ２及び１４
    −１９Ｃ９の名称を有する特許請求の範囲第５０項に記
    載のモノクローナル抗体及びそれらの誘導体。 ５６、ビオチンとの接合体である特許請求の範囲第５０
    項に記載のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
    。 ５７、特許請求の範囲第５０項に記載のポリクローナル
    抗体及びその誘導体の製造方法であって、免疫応答増強
    剤の存在下で式（ I ）又は（II）の化合物の２回以上
    の注射により適当な哺乳類を免疫感作し、該免疫感作さ
    れた哺乳類の血清を集め、そして抗体を単離しそして精
    製し、そして所望により得られた抗体をその誘導体に転
    換することを特徴とする方法。 ５８、特許請求の範囲第５０項に記載のモノクローナル
    抗体及びその誘導体の製造方法であって、該モノクロー
    ナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を ａ）インビトロで培養し、そして培養上清からモノクロ
    ーナル抗体を単離するか；又は ｂ）適当な哺乳類中でインビボ増殖せしめ、そして哺乳
    類の体液からモノクローナル抗体を回収し、そして所望
    により、得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転
    換する； ことを特徴とする方法。 ５９、ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチドに
    対して特異的なモノクローナル抗体を分泌することを特
    徴とするハイブリドーマセルライン。 ６０、８−５Ｃ２、８−１０Ｄ７、１４−６Ｂ２及び１
    ４−１９Ｃ９の名称を有する特許請求の範囲第５９項に
    記載のハイブリドーマセルライン。 ６１、特許請求の範囲第５９項記載のハイブリドーマセ
    ルラインの製造方法であって、式（ I ）又は（II）の
    化合物により適当な哺乳類を免疫感作し、この哺乳類の
    抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、この融合にお
    いて得られたハイブリド細胞をクローン化し、そして目
    的の抗体を分泌する細胞クローンを選択することを特徴
    とする方法。 ６２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチドの
    定性及び定量のための特許請求の範囲第５０項に記載の
    ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体並びにこれ
    らの誘導体の使用。 ６３、ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチドの
    免疫測定法であって、固体キャリヤーを特許請求の範囲
    第５０項記載のポリクローナル又はモノクローナル抗体
    でコートし、測定されるべきペプチドを含有する溶液と
    共にインキュベートし、次に特許請求の範囲第５０項に
    記載のポリクローナル抗体もしくは異るモノクローナル
    抗体又はこれらの誘導体を含有する溶液と共にインキュ
    ベートし、そしてキャリヤーに結合した前記第２抗体の
    量を酵素−基質反応により決定することを特徴とする方
    法。 ６４、ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチドの
    免疫測定のための試験キットであって、特許請求の範囲
    第５０項記載のポリクローナル及び／又はモノクローナ
    ル抗体及び／又はこれらの誘導体、並びに場合によって
    は他のモノクローナル又はポリクローナル抗体及び／又
    は付属物を含むキット。 ６５、慢性炎症状態の診断方法であって、特許請求の範
    囲第５０項に記載のポリクローナルもしくはモノクロー
    ナル抗体又はこれらの誘導体を用いて、組織におけるＭ
    ＲＰ−８及びＭＲＰ−１４の発現の量及びパターンを決
    定することを特徴とする方法。 ６６、のう包繊維症（ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ
    ）の診断方法であって、特許請求の範囲第５２項又は第
    ５４項に記載のＭＲＰ−１４又はその誘導体に対して特
    異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いて
    、のう包繊維症についてホモ接合的又はヘテロ接合的で
    あると予想される他の点では健康な対象の血清サンプル
    中のＭＲＰ−１４の量を決定することを特徴とする方法
    。
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