JPS625998A - 膵腺からのグルカゴンの回収法 - Google Patents
膵腺からのグルカゴンの回収法Info
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- JPS625998A JPS625998A JP15258986A JP15258986A JPS625998A JP S625998 A JPS625998 A JP S625998A JP 15258986 A JP15258986 A JP 15258986A JP 15258986 A JP15258986 A JP 15258986A JP S625998 A JPS625998 A JP S625998A
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- carrier
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
グルカゴンは、２９個のアミノ酸からなる小さいポリペ
プチドホルモンである。このホルモンは膵島で合成され
、インシュリンと逆の生物活性を示し、したがって、グ
リコゲンの分解および新生の両者によって血中のグルコ
ース濃度がコントロールされている。
プチドホルモンである。このホルモンは膵島で合成され
、インシュリンと逆の生物活性を示し、したがって、グ
リコゲンの分解および新生の両者によって血中のグルコ
ース濃度がコントロールされている。
豚のグルカゴンのアミノ酸配列はブローマー（Ｂｒｏｍ
ｅｒ 、 Ｗ、Ｗ、 ）、シン（５ｉｎｎ、Ｌ、 ）
オよびべ一１ｉン７． （１’３ｅｈｒｅｎｓ 、０
、Ｋ 、） ９こよって決定された〔ジャーナル・オブ
・アメリカン・ケミカル・ンサエテ４ （Ｊ 、 Ａｍ
、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ ）、７９２８０１−２８０５、
（１，９５７） ］。その後の研究Ｑこより、他の哺乳
動物から分間１されたグルカゴンも、豚のグルカゴンと
同一であることがわかった。
ｅｒ 、 Ｗ、Ｗ、 ）、シン（５ｉｎｎ、Ｌ、 ）
オよびべ一１ｉン７． （１’３ｅｈｒｅｎｓ 、０
、Ｋ 、） ９こよって決定された〔ジャーナル・オブ
・アメリカン・ケミカル・ンサエテ４ （Ｊ 、 Ａｍ
、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ ）、７９２８０１−２８０５、
（１，９５７） ］。その後の研究Ｑこより、他の哺乳
動物から分間１されたグルカゴンも、豚のグルカゴンと
同一であることがわかった。
グルカゴン（分子ｉ：３４８５ダルトン）；ま、膵島の
Ａ細胞に於いて、分子量約１８．０００〜１９．０００
ダルトンと推定される前駆体分子から合成される。この
プレプロホルモンは一連のタンパク分解によってグルカ
ゴンに変換される。
Ａ細胞に於いて、分子量約１８．０００〜１９．０００
ダルトンと推定される前駆体分子から合成される。この
プレプロホルモンは一連のタンパク分解によってグルカ
ゴンに変換される。
市販のグルカゴンは、インシュリン抽出の際の副産物と
して、牛または豚の膵臓から分離されたものである。膵
臓インシュリンの抽出の際、膵臓起源のグルカゴンに豊
んた塩ケーキを回収することができる。この塩ケーキ（
グルカゴン塩ケーキという）が、本発明方法の出発物質
となる。
して、牛または豚の膵臓から分離されたものである。膵
臓インシュリンの抽出の際、膵臓起源のグルカゴンに豊
んた塩ケーキを回収することができる。この塩ケーキ（
グルカゴン塩ケーキという）が、本発明方法の出発物質
となる。
発明の要約
即ち、本発明は、膵臓起源のグルカゴンを含有している
グルカゴン塩ケーキからグルカゴンを純化する方法であ
って、 （１）水混和性の溶媒を含有している水性媒質中に該グ
ルカゴン塩ケーキを溶解し、 （２）コ１７） クルカゴン塩ケーキ溶液を、グルカゴ
ンが疎水性吸着担体に吸着される条件下、約４以下のｐ
Ｈまたは約７．５以上のｐＨで、該疎水性吸着担体Ｏこ
接触させ、 （３）水混和性有機溶媒を含んでいる水性溶液で該疎水
性吸着担体からグルカゴンを溶離して第１番目のグルカ
ゴン含有溶液を得、 （４）該疎水性吸着担体から溶離したｐＨ約７．５〜約
１．０．５のグルカゴン含有溶液を、グルカゴンがアニ
オン交換担体に吸着される条件下で該アニオン交換担体
と接触させ、 （５）該アニオン交換担体からグルカゴンを溶離して第
２番目のグルカゴン含有溶液を得、そして（６）高めら
れた純度のグルカゴンを回収する、ことからなる方法を
提供するものである。
グルカゴン塩ケーキからグルカゴンを純化する方法であ
って、 （１）水混和性の溶媒を含有している水性媒質中に該グ
ルカゴン塩ケーキを溶解し、 （２）コ１７） クルカゴン塩ケーキ溶液を、グルカゴ
ンが疎水性吸着担体に吸着される条件下、約４以下のｐ
Ｈまたは約７．５以上のｐＨで、該疎水性吸着担体Ｏこ
接触させ、 （３）水混和性有機溶媒を含んでいる水性溶液で該疎水
性吸着担体からグルカゴンを溶離して第１番目のグルカ
ゴン含有溶液を得、 （４）該疎水性吸着担体から溶離したｐＨ約７．５〜約
１．０．５のグルカゴン含有溶液を、グルカゴンがアニ
オン交換担体に吸着される条件下で該アニオン交換担体
と接触させ、 （５）該アニオン交換担体からグルカゴンを溶離して第
２番目のグルカゴン含有溶液を得、そして（６）高めら
れた純度のグルカゴンを回収する、ことからなる方法を
提供するものである。
詳細な説明
本発明方法により、グルカゴン塩ケーキから高純度の膵
臓起源のグルカゴンを得ることができる。
臓起源のグルカゴンを得ることができる。
本発明方法は、独立し、連続した３つの工程からなり、
それらは（１）疎水性吸着クロマトグラフィー、に）ア
ニオン交換クロマトグラフィー、および（３）グルカゴ
ン結晶化の順に行なわれる。
それらは（１）疎水性吸着クロマトグラフィー、に）ア
ニオン交換クロマトグラフィー、および（３）グルカゴ
ン結晶化の順に行なわれる。
勿論、疎水性吸着工程は２段階、即ち疎水性吸着担体へ
のグルカゴンの適用段階、および担体からのグルカゴン
の溶離段階を含んでいる。絶対に必要であるということ
ではないが、この疎水性吸着工程の各段階は、異なった
条件で行なうのが好ましい。
のグルカゴンの適用段階、および担体からのグルカゴン
の溶離段階を含んでいる。絶対に必要であるということ
ではないが、この疎水性吸着工程の各段階は、異なった
条件で行なうのが好ましい。
本発明方法で使用される、出発物質としてのグルカゴン
含有物質は、膵臓抽出で得られるグルカゴン塩ケーキで
あるか、類似の処理で得られるグルカゴン含有物質であ
る。本発明に於いては、「グルカゴン塩ケーキ」という
用語は、上記のいずれをも含む広い意味で使用されてい
る。
含有物質は、膵臓抽出で得られるグルカゴン塩ケーキで
あるか、類似の処理で得られるグルカゴン含有物質であ
る。本発明に於いては、「グルカゴン塩ケーキ」という
用語は、上記のいずれをも含む広い意味で使用されてい
る。
疎水性吸着担体は、通常ポリスチレンコポリマー樹脂で
あり、より具体的に言うと、ポリスチレン−ジビニルベ
ンゼン・コポリマー樹脂でアル。
あり、より具体的に言うと、ポリスチレン−ジビニルベ
ンゼン・コポリマー樹脂でアル。
この疎水性吸着担体の例として、ＨＰ２Ｑ、ＨＰ２０−
ＳＳ、ＸＡＤ樹脂の全て、例えばＸＡＤ−２、ＸＡＤ
−４、Ｘ Ａ、 Ｄ −７、およびＸＡＤ−８が挙げら
れる。
ＳＳ、ＸＡＤ樹脂の全て、例えばＸＡＤ−２、ＸＡＤ
−４、Ｘ Ａ、 Ｄ −７、およびＸＡＤ−８が挙げら
れる。
特に重要な、そして好ましいのはＨＰ２ＱおよびＩ（Ｐ
２Ｏ−８Ｓであり、後者が特に好ましい。
２Ｏ−８Ｓであり、後者が特に好ましい。
グルカゴン塩ケーキを水性媒質に溶解し、得られた溶液
のｐＨが約４．０以下、または約７．５以上になる様に
調節して疎水性吸着担体に適用する。
のｐＨが約４．０以下、または約７．５以上になる様に
調節して疎水性吸着担体に適用する。
必ずしも絶対に必要ではないが、この様なｐＴ（に維持
する緩衝能力のある塩を添加して、選択したｐＨＫ保持
してもよい。この様な緩衝剤の例として、グリシン、ト
リス、酢酸ナトリウムなどを挙げることができる。緩衝
剤を使用する場合、その非常Ｑこ好ましいものはグリシ
ンである。
する緩衝能力のある塩を添加して、選択したｐＨＫ保持
してもよい。この様な緩衝剤の例として、グリシン、ト
リス、酢酸ナトリウムなどを挙げることができる。緩衝
剤を使用する場合、その非常Ｑこ好ましいものはグリシ
ンである。
既述した様に、グルカゴン塩ケーキ溶液のｐＨは約７．
５以−ヒ、または約４．０以下Ｑこ維持する。酸性ｐＩ
ｌが好ましく、この範囲内０こ於いては、約２．０〜約
３．６のｐＨが最も好ましい。
５以−ヒ、または約４．０以下Ｑこ維持する。酸性ｐＩ
ｌが好ましく、この範囲内０こ於いては、約２．０〜約
３．６のｐＨが最も好ましい。
グルカコン塩ケーキヲ溶解する目的にのみ使用され、従
って必ずしも必要ではないが、水混和性の有機溶媒をグ
ルカゴン塩ケーキー水性混合物に添加してもよい。この
水混和性有機溶媒として使用し得るものの例は、例えば
ニトリル類（アセトニトリルなど）、アルコール類（メ
タノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イン
プロピルアルコールなど）、ケトン類（アセトンなど）
、エーテル類（テトラヒドロフラン、ジオキサンなト）
、アミド類（例えばＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド）な
どである。グルカゴン塩ケーキを溶解するのに十分な計
ではあるが、グルカゴンの担体への有効な吸着を減少さ
せる程多くない量の水混和性有機溶媒を、水性媒質に添
加する。非常に好ましい有機溶媒はアセトニトリルとエ
タノールテアリ、その内最も好ましいのはアセトニトリ
ルである。アセトニトリルを使用する場合は、吸着され
たグルカゴンを連続的に脱着させることなく、グルカゴ
ン塩ケーキを溶解させるに十分な様に、通常約２０容量
％を越えない量のアセトニ） ＩＪルを水性媒質に添加
する。エタノールを使用する場合、通常その量は、グル
カゴンの連続的な脱着をひき起すことなく、約３５容量
％才で増加させることができる。
って必ずしも必要ではないが、水混和性の有機溶媒をグ
ルカゴン塩ケーキー水性混合物に添加してもよい。この
水混和性有機溶媒として使用し得るものの例は、例えば
ニトリル類（アセトニトリルなど）、アルコール類（メ
タノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イン
プロピルアルコールなど）、ケトン類（アセトンなど）
、エーテル類（テトラヒドロフラン、ジオキサンなト）
、アミド類（例えばＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド）な
どである。グルカゴン塩ケーキを溶解するのに十分な計
ではあるが、グルカゴンの担体への有効な吸着を減少さ
せる程多くない量の水混和性有機溶媒を、水性媒質に添
加する。非常に好ましい有機溶媒はアセトニトリルとエ
タノールテアリ、その内最も好ましいのはアセトニトリ
ルである。アセトニトリルを使用する場合は、吸着され
たグルカゴンを連続的に脱着させることなく、グルカゴ
ン塩ケーキを溶解させるに十分な様に、通常約２０容量
％を越えない量のアセトニ） ＩＪルを水性媒質に添加
する。エタノールを使用する場合、通常その量は、グル
カゴンの連続的な脱着をひき起すことなく、約３５容量
％才で増加させることができる。
グルカゴン塩ケーキに含まれるグルカゴンが疎水性担体
に吸着されたら、グルカゴンを担体上に残しながら非グ
ルカゴン物質を溶離させる条件下で担体を洗浄してもよ
い。この洗浄用媒質は、水混和性の有機溶媒の量を増加
させるという点で、適用に用いた媒質と異なるのが普通
である。この増加する量は、非グルカゴン物質を溶離す
るには十分であるが、グルカゴンを溶離することはでき
ない量である。例えば、水混和性有機溶媒としてアセト
ンを使用する場合、先ず１０％のアセトニトリルを含ん
でいる洗浄用媒質を使用し、次いで２０チのアセトニト
リルを含んでいるものを使用する。この順序で行なうと
、２番目の洗浄で、例えば副生成物としての膵臓性ポリ
ペプチドが溶離される。
に吸着されたら、グルカゴンを担体上に残しながら非グ
ルカゴン物質を溶離させる条件下で担体を洗浄してもよ
い。この洗浄用媒質は、水混和性の有機溶媒の量を増加
させるという点で、適用に用いた媒質と異なるのが普通
である。この増加する量は、非グルカゴン物質を溶離す
るには十分であるが、グルカゴンを溶離することはでき
ない量である。例えば、水混和性有機溶媒としてアセト
ンを使用する場合、先ず１０％のアセトニトリルを含ん
でいる洗浄用媒質を使用し、次いで２０チのアセトニト
リルを含んでいるものを使用する。この順序で行なうと
、２番目の洗浄で、例えば副生成物としての膵臓性ポリ
ペプチドが溶離される。
洗浄を行なった場合、これが終了したら、段階的、直線
的、あるいは段階的および直線的グラジェント（勾配）
クロマトグラフィーによりグルカゴンを溶離する。グル
カゴンを溶離する際、段階的であれ連続的であれ、溶離
が完了するまで、水性のｐＨを調節した媒質中の水混和
性有機溶媒の量が増加していく様に、この溶離液の組成
を変える。例えば、アセトニ） ＩＪルが選択した有機
溶媒の場合、グルカゴンの溶離は、その溶離液の容量組
成が約３５％アセトニトリルに達した時に完了する。水
混和性の有機溶媒が、例えばエタノールの場合、有機溶
媒の量はもつと必要になり、通常約５５％になるであろ
う。
的、あるいは段階的および直線的グラジェント（勾配）
クロマトグラフィーによりグルカゴンを溶離する。グル
カゴンを溶離する際、段階的であれ連続的であれ、溶離
が完了するまで、水性のｐＨを調節した媒質中の水混和
性有機溶媒の量が増加していく様に、この溶離液の組成
を変える。例えば、アセトニ） ＩＪルが選択した有機
溶媒の場合、グルカゴンの溶離は、その溶離液の容量組
成が約３５％アセトニトリルに達した時に完了する。水
混和性の有機溶媒が、例えばエタノールの場合、有機溶
媒の量はもつと必要になり、通常約５５％になるであろ
う。
本発明の疎水性吸着工程から得たグルカゴン含有溶出液
を、直接または非直接的に第２工程、即ちアニオン交換
クロマトグラフィ一工程で処理する。
を、直接または非直接的に第２工程、即ちアニオン交換
クロマトグラフィ一工程で処理する。
本発明の第２工程で使用されるアニオン交換クロマトグ
ラフィーの担体は、広範囲の材料から選ばれる。通常、
この担体はＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、ＱＡＥ
（ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル
）などの官能基ヲ含んでいるものである。この様な官能
性アニオン交換基を含んでいる代表的な担体としては、
セファデックス（交差結合したデキストランビーズ）、
セファロース（アガロースビーズ）、セファセル（セル
ロースピース）、セルロファイン（セルロースピース）
、ワットマン（セルロース）、 ＩＲＡ（スチレン−ジ
ビニルベンゼン）、モノビーズ（スチレン−ジビニルベ
ンゼン）、フラクトゲル（ビニルエーテル結合ポリマー
）、トリサクリル（アクリル性トリスポリマー）などが
挙げられる。好ましいアニオン交換担体はＤＥＡＥ−セ
ファデックス、通常ＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５で
ある。
ラフィーの担体は、広範囲の材料から選ばれる。通常、
この担体はＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、ＱＡＥ
（ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル
）などの官能基ヲ含んでいるものである。この様な官能
性アニオン交換基を含んでいる代表的な担体としては、
セファデックス（交差結合したデキストランビーズ）、
セファロース（アガロースビーズ）、セファセル（セル
ロースピース）、セルロファイン（セルロースピース）
、ワットマン（セルロース）、 ＩＲＡ（スチレン−ジ
ビニルベンゼン）、モノビーズ（スチレン−ジビニルベ
ンゼン）、フラクトゲル（ビニルエーテル結合ポリマー
）、トリサクリル（アクリル性トリスポリマー）などが
挙げられる。好ましいアニオン交換担体はＤＥＡＥ−セ
ファデックス、通常ＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５で
ある。
疎水性吸着工程から直接、または非＋［接的に得られた
グルカゴン含有物質を、そのｐＨを約７．５〜約１０．
５の範囲に調節した後、アニオン交換クロマトグラフィ
ー担体に適用する。このグルカゴン含有混合物の好まし
いｐＨは約８．０〜約９．０であり、最も好ましくは約
８．０〜約８．４である。通常、この混合物のｐＨは、
緩衝剤を使用して所望のレベルに維持する。広範囲の種
類の一般に認められている緩衝剤を使用することができ
る。好ましい緩衝剤はトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン（Ｔｒｉｓ）である。
グルカゴン含有物質を、そのｐＨを約７．５〜約１０．
５の範囲に調節した後、アニオン交換クロマトグラフィ
ー担体に適用する。このグルカゴン含有混合物の好まし
いｐＨは約８．０〜約９．０であり、最も好ましくは約
８．０〜約８．４である。通常、この混合物のｐＨは、
緩衝剤を使用して所望のレベルに維持する。広範囲の種
類の一般に認められている緩衝剤を使用することができ
る。好ましい緩衝剤はトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン（Ｔｒｉｓ）である。
工程２に適用されるグルカゴン含有溶液は、溶解を可能
ならしめる量の水混和性有機溶媒、通常は疎水性吸着工
程からグルカゴンを溶離するのに使用した溶離液中に存
在しているものと同じ溶媒、を含んでいる。従って、ア
ニオン交換カラムに適用するグルカゴン溶液は、約１５
％〜約５０％の水混和性有機溶媒、通常はグルカゴン塩
ケーキを溶解するのに使用される溶媒として先に挙げた
もののいずれか、を陰んでいる。好ましい水混和性有機
溶媒はアセトニトリルおよびエタノールであり、最も好
ましいのはアセトニトリルである。
ならしめる量の水混和性有機溶媒、通常は疎水性吸着工
程からグルカゴンを溶離するのに使用した溶離液中に存
在しているものと同じ溶媒、を含んでいる。従って、ア
ニオン交換カラムに適用するグルカゴン溶液は、約１５
％〜約５０％の水混和性有機溶媒、通常はグルカゴン塩
ケーキを溶解するのに使用される溶媒として先に挙げた
もののいずれか、を陰んでいる。好ましい水混和性有機
溶媒はアセトニトリルおよびエタノールであり、最も好
ましいのはアセトニトリルである。
アニオン交換カラム【こ適用した後、有機−水性塩含有
溶離液を用いてグルカゴンを溶離する。代表的な塩はト
リスであり、インクラティック（同一組成）溶離を行な
ってもグラジェント溶ｒａヲ行なってもよい。塩濃度は
、ｐＨを含む多くの因子によって変わる。例えば、塩濃
度はアニオン交換担体からグルカゴンを溶離させるに十
分な高い濃度でなければならず、また、強く結合してい
る不純物がグルカゴンと共Ｑこ溶離してこない程十分低
濃度でなければならない。一般に、塩濃度は約０．０２
Ｍ〜約ＩＭの範囲に維持する。グルカゴン含有画分のプ
ールはタンパクを検出する常法によって行なう。
溶離液を用いてグルカゴンを溶離する。代表的な塩はト
リスであり、インクラティック（同一組成）溶離を行な
ってもグラジェント溶ｒａヲ行なってもよい。塩濃度は
、ｐＨを含む多くの因子によって変わる。例えば、塩濃
度はアニオン交換担体からグルカゴンを溶離させるに十
分な高い濃度でなければならず、また、強く結合してい
る不純物がグルカゴンと共Ｑこ溶離してこない程十分低
濃度でなければならない。一般に、塩濃度は約０．０２
Ｍ〜約ＩＭの範囲に維持する。グルカゴン含有画分のプ
ールはタンパクを検出する常法によって行なう。
本発明方法の第３工程は、高められた純度のグルカゴン
を回収することである。一般に回収は結晶化により行な
い、通常、第２工程から得た溶出液のプールから１■接
結晶化させる。グルカゴンの結晶は、単に溶出液を通常
約り℃〜約５℃に冷却することによって得ることができ
る。しかし、冷却【こ加えて、ｐＨの選択および溶媒組
成により結晶化を促進させることができる。即ち、ダル
カゴン混合物のｐＨｆ約７．０〜約８，０、好ましくは
約７．２に変え、水混和性有機溶媒の含量を通常約１５
容量％以下に減らすことが好ましい。水混和性有機溶媒
の濃度は、例えば蒸発、希釈、サイズ・エクスクル−ジ
ョン・カラムを使った溶媒交換、カチオン交換樹脂から
のバッチ式吸着および脱着、などによって下げることが
できる。結晶は遠心、デカンテーションまたは沖過など
の常法により集めることができる。通常、得られた結晶
を水、希ＮａＣ１、またはエタノールで洗浄し、凍結乾
燥する。
を回収することである。一般に回収は結晶化により行な
い、通常、第２工程から得た溶出液のプールから１■接
結晶化させる。グルカゴンの結晶は、単に溶出液を通常
約り℃〜約５℃に冷却することによって得ることができ
る。しかし、冷却【こ加えて、ｐＨの選択および溶媒組
成により結晶化を促進させることができる。即ち、ダル
カゴン混合物のｐＨｆ約７．０〜約８，０、好ましくは
約７．２に変え、水混和性有機溶媒の含量を通常約１５
容量％以下に減らすことが好ましい。水混和性有機溶媒
の濃度は、例えば蒸発、希釈、サイズ・エクスクル−ジ
ョン・カラムを使った溶媒交換、カチオン交換樹脂から
のバッチ式吸着および脱着、などによって下げることが
できる。結晶は遠心、デカンテーションまたは沖過など
の常法により集めることができる。通常、得られた結晶
を水、希ＮａＣ１、またはエタノールで洗浄し、凍結乾
燥する。
この様にして得られたグルカゴンは高純度（即ち５０％
以上）であり、そのま＼使用できる。
以上）であり、そのま＼使用できる。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例
Ａ、工程１ 疎水性吸着による純化
ＨＰ−２Ｑ Ｓ Ｓ樹脂を、１５×１００Ｃ１ｎのガラ
スカラム【こ、床高さ９０１まで充填する。全樹脂容量
は１６４であった。このカラムをアセトニトリル：００
２Ｍグリシン（１：９）で平衡化し、ＨＣ； ｌチル）
−Ｉ ’ｆ、２２．８ ｆｒこ調節した。グルカゴン塩
ケーキ（グルカゴン２１．ｒＪ８ｇを含む３．２ ｋｇ
）を、室温で２時間、アセトニトリル：０．０２Ｍグ
リシン（１： ９ ） （ｐＨ２，８）３２１１！１ｍ
ｆｔ拌シナカラ溶解シた。パルストン（Ｂａ１ｓｔｏｎ
）フィルターを通し、４００ｍ１１分の流速でカラム
に入れた。全負荷量は３４ｅであった。溶出液からサン
プリングし、グルカゴンが含まれていないことを確認し
た後捨てた。アセトニトリルニゲリシン（１：９）（Ｐ
Ｈ２，８）１８ｇ１次いでアセトニトリルニゲリシン（
２：８）（ｐＨ２，８）３１ｇｇ−用い、約４０’ Ｏ
ｙｎｌ１分の流速でカラムラ坏浄した。この最初の洗液
は捨てた。２番目の洗液は膵臓ポリペプチドを含んでい
たので貯蔵した。いずれの洗液０こもグルカゴンは含ま
れていなかった。次いでアセトニトリルニゲリシン（２
０：８０）からなる混合用緩衝液３２１とアセトニトリ
ルニゲリシン（３５：６５）からなる制限的緩衝液３２
ｒ（いずれもｐＩＩ２．８）のグラジェント混合緩衝液
を用いて溶離した。バルクフラクション２４ｅ”５集め
、次いで３分間フラクション（３００ｍｌ／流速（分）
）を３０個集めた（各９４０ｍ１）。１つおきのフラク
ションをＨＰＬＣで分析し、フラクション１Ｏ−２６ｉ
主要フラクシヨンとしてプールし、フラクション１−９
を副フラクションとしてプールした。アセトニトリル：
０．２Ｎ水酸化ナトリウム（５０：５０）７０ｇ１次イ
テアセトニトリル：■Ｉ２０（３０ニア０）４、ｏｉ；
ｅ使ってカラムを再生した。グルカゴンのカラム１■量
は、主プールで１４．８ｇ（７０，２％）、副プールで
４．１％であった（分析用ＨＰ Ｌ にで測定）。
スカラム【こ、床高さ９０１まで充填する。全樹脂容量
は１６４であった。このカラムをアセトニトリル：００
２Ｍグリシン（１：９）で平衡化し、ＨＣ； ｌチル）
−Ｉ ’ｆ、２２．８ ｆｒこ調節した。グルカゴン塩
ケーキ（グルカゴン２１．ｒＪ８ｇを含む３．２ ｋｇ
）を、室温で２時間、アセトニトリル：０．０２Ｍグ
リシン（１： ９ ） （ｐＨ２，８）３２１１！１ｍ
ｆｔ拌シナカラ溶解シた。パルストン（Ｂａ１ｓｔｏｎ
）フィルターを通し、４００ｍ１１分の流速でカラム
に入れた。全負荷量は３４ｅであった。溶出液からサン
プリングし、グルカゴンが含まれていないことを確認し
た後捨てた。アセトニトリルニゲリシン（１：９）（Ｐ
Ｈ２，８）１８ｇ１次いでアセトニトリルニゲリシン（
２：８）（ｐＨ２，８）３１ｇｇ−用い、約４０’ Ｏ
ｙｎｌ１分の流速でカラムラ坏浄した。この最初の洗液
は捨てた。２番目の洗液は膵臓ポリペプチドを含んでい
たので貯蔵した。いずれの洗液０こもグルカゴンは含ま
れていなかった。次いでアセトニトリルニゲリシン（２
０：８０）からなる混合用緩衝液３２１とアセトニトリ
ルニゲリシン（３５：６５）からなる制限的緩衝液３２
ｒ（いずれもｐＩＩ２．８）のグラジェント混合緩衝液
を用いて溶離した。バルクフラクション２４ｅ”５集め
、次いで３分間フラクション（３００ｍｌ／流速（分）
）を３０個集めた（各９４０ｍ１）。１つおきのフラク
ションをＨＰＬＣで分析し、フラクション１Ｏ−２６ｉ
主要フラクシヨンとしてプールし、フラクション１−９
を副フラクションとしてプールした。アセトニトリル：
０．２Ｎ水酸化ナトリウム（５０：５０）７０ｇ１次イ
テアセトニトリル：■Ｉ２０（３０ニア０）４、ｏｉ；
ｅ使ってカラムを再生した。グルカゴンのカラム１■量
は、主プールで１４．８ｇ（７０，２％）、副プールで
４．１％であった（分析用ＨＰ Ｌ にで測定）。
分析用ＨＰ Ｌ Ｃ系では、アセトニトリル：Ｏ，１Ｍ
燐酸塩（３０ニア０）（ｐ）（２，１）を使い、ンルバ
ックスＣ８１５０Ａカラム（４，］、Ｘ２５０ｆｆｉ）
ｉ使用した。検出は２１４ ｎｍで行ない、流速は０．
７ ｍ１７分であった。
燐酸塩（３０ニア０）（ｐ）（２，１）を使い、ンルバ
ックスＣ８１５０Ａカラム（４，］、Ｘ２５０ｆｆｉ）
ｉ使用した。検出は２１４ ｎｍで行ない、流速は０．
７ ｍ１７分であった。
ＢＪ程２ アニオン交換による純化０
．０８Ｍトリス−アセトニトリル（７０：３０）中で平
衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を１７．１
． Ｘ ４０αのガラスカラムに２８（７）まで（６、
ＦＭ）充填し、ｎＣｅテｐＩｌ ｆ ８．０ Ｇこ調節
した。
衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を１７．１
． Ｘ ４０αのガラスカラムに２８（７）まで（６、
ＦＭ）充填し、ｎＣｅテｐＩｌ ｆ ８．０ Ｇこ調節
した。
直径５０門の、ねじ山をつけたテフロン製の栓と、溶媒
に耐えるＯ−リングでカラムに栓をし、同じ緩衝液を用
い、Ｎ２圧を使って０．７１７時間の割合で一夜平衡化
した。
に耐えるＯ−リングでカラムに栓をし、同じ緩衝液を用
い、Ｎ２圧を使って０．７１７時間の割合で一夜平衡化
した。
）（Ｐ−２ＱＳＳからの主要プール（１４，８７？）に
１、 Ｏ％ ＮａＯＨ（１００ｍ１） ヲ加えてｐＨを
８．２５に調節し、流速４６ｍ１１分でＤＥＡＥカラム
に適用した。負荷後カラムをとめ、０．０８Ｍ）リス−
アセ）＝Ｉ−’Ｊル（７０：３０）（ｐ）（８，０）緩
衝液のバッファーヘット（１１１りを入し、次いでカラ
ムにシールをし、４２−４２−５Ｏ分の流速で溶＃を行
なった。フラクション（各々２２ 分間＝ １．、Ｏ〜
１．１４）と集め、溶出液を波長２８０ ｎｍの紫外線
検出器Ｉ Ｓ ＣｏモデルＵＡ−７でモニターした（チ
ャー ）スピーＦ： １．５Ｇ／時間、感度：２．０）
。ＵＶプロフィルからフラクションを選び、分光光度計
を使って２７６ｎｍでの光学密度をより正確に測定し、
主要フラクション１３−２４％プールシタ（１２，６ｅ
）。このプールから全量１３．２３ｇｏ）グルカゴンを
得た（カラムＱこ適用したグルカゴン１４．９ｇの８８
．８％）。
１、 Ｏ％ ＮａＯＨ（１００ｍ１） ヲ加えてｐＨを
８．２５に調節し、流速４６ｍ１１分でＤＥＡＥカラム
に適用した。負荷後カラムをとめ、０．０８Ｍ）リス−
アセ）＝Ｉ−’Ｊル（７０：３０）（ｐ）（８，０）緩
衝液のバッファーヘット（１１１りを入し、次いでカラ
ムにシールをし、４２−４２−５Ｏ分の流速で溶＃を行
なった。フラクション（各々２２ 分間＝ １．、Ｏ〜
１．１４）と集め、溶出液を波長２８０ ｎｍの紫外線
検出器Ｉ Ｓ ＣｏモデルＵＡ−７でモニターした（チ
ャー ）スピーＦ： １．５Ｇ／時間、感度：２．０）
。ＵＶプロフィルからフラクションを選び、分光光度計
を使って２７６ｎｍでの光学密度をより正確に測定し、
主要フラクション１３−２４％プールシタ（１２，６ｅ
）。このプールから全量１３．２３ｇｏ）グルカゴンを
得た（カラムＱこ適用したグルカゴン１４．９ｇの８８
．８％）。
Ｃ０王程３ グルカゴンの結晶化
ＤＥＡＥ （７）主要プールにＩＮ’ ＮａＯＨ４３
（Ｊｕｌヲ加えてｐＨ１，Ｏ，Ｏに調節し、ロータリー
エバポレーターを使って１０．９６１？まで濃縮した。
（Ｊｕｌヲ加えてｐＨ１，Ｏ，Ｏに調節し、ロータリー
エバポレーターを使って１０．９６１？まで濃縮した。
この濃縮したプールを、ＨＥ Ｐ Ａ−沖過冷蔵室中Ｃ
ＵＮＯフィルター（９０ＳＰ）を通して沖過し、ＩＮ燐
酸２．３２１を使ってｐ）（７，２０に調節した。この
溶液を３日間４℃に保持すると、その間に結晶化した。
ＵＮＯフィルター（９０ＳＰ）を通して沖過し、ＩＮ燐
酸２．３２１を使ってｐ）（７，２０に調節した。この
溶液を３日間４℃に保持すると、その間に結晶化した。
上清をデカントし、結晶スラリーを、 ３０００ｒｐｍ
で３０分間５℃で通むした。遠心Ｇこより得た結晶を水
冷した精製水で２回洗浄し、精製水に懸濁し、冷凍し、
３６時間凍結乾燥した。グルカゴン９．４０ｇを含んで
いる凍結乾燥粉末９．８９ｇ％得り。ＤＥＡＥ主要プー
ルからのグルカゴンの回収率は７３．１％であった。グ
ルカゴン塩ケーキから通算回収率は４４．６％であった
。
で３０分間５℃で通むした。遠心Ｇこより得た結晶を水
冷した精製水で２回洗浄し、精製水に懸濁し、冷凍し、
３６時間凍結乾燥した。グルカゴン９．４０ｇを含んで
いる凍結乾燥粉末９．８９ｇ％得り。ＤＥＡＥ主要プー
ルからのグルカゴンの回収率は７３．１％であった。グ
ルカゴン塩ケーキから通算回収率は４４．６％であった
。
特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニー
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、膵腺起源のグルカゴンを含んでいるグルカゴン塩ケ
ーキからグルカゴンを純化する方法であつて、 （１）水混和性の溶媒を含有している水性媒質中に該グ
ルカゴン塩ケーキを溶解し、 （２）このグルカゴン塩ケーキ溶液を、グルカゴンが疎
水性吸着担体に吸着される条件下、約４以下のｐＨまた
は約７．５以上のｐＨで、該疎水性吸着担体に接触させ
、 （３）水混和性有機溶媒を含んでいる水性溶液で該疎水
性吸着担体からグルカゴンを溶離して第１番目のグルカ
ゴン含有溶液を得、 （４）該疎水性吸着担体から溶離したｐＨ約７．５〜約
１０．５のグルカゴン含有溶液を、グルカゴンがアニオ
ン交換担体に吸着される条件下で該アニオン交換担体と
接触させ、 （５）該アニオン交換担体からグルカゴンを溶離して第
２番目のグルカゴン含有溶液を得、そして（６）高めら
れた純度のグルカゴンを回収する、ことからなる方法。 ２、疎水性吸着担体がポリスチレンコポリマー樹脂であ
る第１項に記載の方法。 ３、グルカゴン塩ケーキを溶解する為の水性媒質中にグ
リシンを使用する第２項に記載の方法。 ４、グルカゴン塩ケーキ溶液のｐＨが約２．０〜約３．
６である第３項に記載の方法。 ５、グルカゴン塩ケーキ含有水性媒質中の水混和性有機
溶媒が約２０容量％を越えない量のアセトニトリルであ
る第２項に記載の方法。 ６、グルカゴン塩ケーキ含有水性媒質中の水混和性有機
溶媒が約３５容量％を越えない量のエタノールである第
２項に記載の方法。 ７、アニオン交換担体と接触させるグルカゴン含有溶液
のｐＨが約８．０〜約８．４である第１項に記載の方法
。 ８、アニオン交換担体と接触させるグルカゴン含有溶液
のｐＨを、緩衝剤としてトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンの添加により維持する第１項に記載の方法。 ９、第２番目のグルカゴン含有溶液から結晶化によりグ
ルカゴンを回収する第１項に記載の方法。 １０、第２番目のグルカゴン含有溶液のｐＨを約７．０
〜約８．０にすることにより、該溶液からグルカゴンを
結晶化させる第９項に記載の方法。 １１、第１項〜第１０項のいずれかに記載の方法で純化
されたグルカゴン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75063685A | 1985-07-01 | 1985-07-01 | |
| US750636 | 1985-07-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS625998A true JPS625998A (ja) | 1987-01-12 |
| JPH0720998B2 JPH0720998B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=25018652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61152589A Expired - Lifetime JPH0720998B2 (ja) | 1985-07-01 | 1986-06-27 | 膵腺からのグルカゴンの回収法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0207727A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0720998B2 (ja) |
| AU (1) | AU587835B2 (ja) |
| CA (1) | CA1284000C (ja) |
| DK (1) | DK301786A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002539219A (ja) * | 1999-03-15 | 2002-11-19 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Ｇｌｐ−１及び近縁ペプチドのイオン交換クロマトグラフィー分離 |
| JP2003500633A (ja) * | 1999-03-15 | 2003-01-07 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 溶出ステップにおける有機モディファイアでのタンパク質及びペプチドのイオン交換クロマトグラフィー |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6444788B1 (en) | 1999-03-15 | 2002-09-03 | Novo Nordisk A/S | Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof |
| EP1664108B1 (en) | 2003-08-21 | 2009-10-14 | Novo Nordisk A/S | Separation of polypeptides comprising a racemized amino acid |
| CN111269308B (zh) * | 2018-12-04 | 2022-09-09 | 联邦生物科技(珠海横琴)有限公司 | 一种利拉鲁肽的纯化方法及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS51100071A (en) * | 1975-02-07 | 1976-09-03 | Lilly Co Eli | Gurukagonno kaishuhoho |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4033941A (en) * | 1975-12-17 | 1977-07-05 | Eli Lilly And Company | Process for purifying glucagon |
-
1986
- 1986-06-23 CA CA000512164A patent/CA1284000C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-25 EP EP86304908A patent/EP0207727A3/en not_active Withdrawn
- 1986-06-26 DK DK301786A patent/DK301786A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-06-27 AU AU59342/86A patent/AU587835B2/en not_active Ceased
- 1986-06-27 JP JP61152589A patent/JPH0720998B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS51100071A (en) * | 1975-02-07 | 1976-09-03 | Lilly Co Eli | Gurukagonno kaishuhoho |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002539219A (ja) * | 1999-03-15 | 2002-11-19 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Ｇｌｐ−１及び近縁ペプチドのイオン交換クロマトグラフィー分離 |
| JP2003500633A (ja) * | 1999-03-15 | 2003-01-07 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 溶出ステップにおける有機モディファイアでのタンパク質及びペプチドのイオン交換クロマトグラフィー |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0720998B2 (ja) | 1995-03-08 |
| EP0207727A2 (en) | 1987-01-07 |
| DK301786A (da) | 1987-01-02 |
| AU5934286A (en) | 1987-01-08 |
| CA1284000C (en) | 1991-05-07 |
| EP0207727A3 (en) | 1988-09-07 |
| AU587835B2 (en) | 1989-08-31 |
| DK301786D0 (da) | 1986-06-26 |
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