JPH0260316B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0260316B2 JPH0260316B2 JP57218115A JP21811582A JPH0260316B2 JP H0260316 B2 JPH0260316 B2 JP H0260316B2 JP 57218115 A JP57218115 A JP 57218115A JP 21811582 A JP21811582 A JP 21811582A JP H0260316 B2 JPH0260316 B2 JP H0260316B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- kallikrein
- sodium chloride
- column
- acid
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 claims description 58
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 6
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical compound NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MFLYTCSVJYYAOR-UHFFFAOYSA-N (carbamimidoylazaniumyl)formate Chemical compound NC(=N)NC(O)=O MFLYTCSVJYYAOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PWGJDPKCLMLPJW-UHFFFAOYSA-N 1,8-diaminooctane Chemical compound NCCCCCCCCN PWGJDPKCLMLPJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- YQLZOAVZWJBZSY-UHFFFAOYSA-N decane-1,10-diamine Chemical compound NCCCCCCCCCCN YQLZOAVZWJBZSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical group NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 52
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 26
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- BPMFZUMJYQTVII-UHFFFAOYSA-N guanidinoacetic acid Chemical compound NC(=N)NCC(O)=O BPMFZUMJYQTVII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- FCEQRBOTYXIORK-UHFFFAOYSA-N 2-(diaminomethylideneamino)benzoic acid Chemical compound NC(=N)NC1=CC=CC=C1C(O)=O FCEQRBOTYXIORK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010093008 Kinins Proteins 0.000 description 4
- 102000002397 Kinins Human genes 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- GSPZXGHHFDORDC-UHFFFAOYSA-N 2-(diaminomethylideneamino)butanoic acid Chemical compound CCC(C(O)=O)N=C(N)N GSPZXGHHFDORDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- TUHVEAJXIMEOSA-UHFFFAOYSA-N gamma-guanidinobutyric acid Natural products NC(=[NH2+])NCCCC([O-])=O TUHVEAJXIMEOSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RSYYQCDERUOEFI-UHFFFAOYSA-N 2-benzamido-5-(diaminomethylideneazaniumyl)pentanoate Chemical compound NC(N)=NCCCC(C(O)=O)NC(=O)C1=CC=CC=C1 RSYYQCDERUOEFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- -1 aminohexyl Chemical group 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001483 arginine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940062190 pancreas extract Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000000304 vasodilatating effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明はカリクレインの精製法に関するもので
あり、更に詳しくは、哺乳動物の膵臓中に存在す
るカリクレインを簡単な操作での工業的規模にお
いて大量かつ高純度に精製する方法に関するもの
である。 カリクレインは哺乳動物の各種組織で生産され
る蛋白分解酵素の一種であり、またキニン遊離酵
素の一種として知られている。遊離キニンには末
梢血管拡張作用があり、従つてカリクレインは循
環器系疾患の治療用に使用されている。カリクレ
インは通常、哺乳動物臓器から抽出されるので、
その粗抽出物には多くの異種蛋白質が含まれてい
る。なかでもキニン産生あるいはキニン分解に関
連したトリプシン及びキモトリプシンの混在は治
療の際の副作用を惹起させるおそれがあるため、
抽出物の医薬品として使用するには、更に十分な
精製を行つて高純度のものとすることが必要であ
る。 従来、粗カリクレインから異種蛋白質及び類似
酵素を除去するための方法としては、塩析法、ゲ
ル過法、イオン交換クロマトグラフ法(特開昭
53−62893)、等電点分別法(特開昭49−41583)、
溶媒沈殿法(特開昭52−102495)などの手段を組
み合せた方法や、また阻害剤を利用したアフイニ
テイークロマトグラフ法(特開昭54−62312)ア
ルギニン誘導体結合担体を用いたクロマトグラフ
法(特開昭56−117791、特開昭57−50924)など
が知られている。しかし、これらの方法は操作が
繁雑であつたり、収率が低い又は試薬が高価であ
るなどの点でいずれも工業的製法として満足し得
るものではなかつた。 本発明者らは、より簡単で効率的なカリクレイ
ンの精製法を提供すべく鋭意研究を行つた結果、
カリクレインがグアニジノ基に対して特異的に親
和性を有すること、およびグアニジノ基を有する
物質をリガンドとしてアフイニテイークロマトグ
ラフイーを行うことにより、簡単に、且つ高収率
で高純度のカリクレインが得られることを見い出
し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、カリクレイン含有液を次
の式() 〔式中、Rは(−CH2)−o(ここでnは1〜5の数
を示す)又は−C6H4−を示す〕 で表わされるグアニジノカルボン酸をスペーサー
を介して水不溶性担体に結合させて得た吸着体に
接触させてカリクレインを吸着せしめ、次いで吸
着したカリクレインを溶離せしめることを特徴と
するカリクレインの精製法を提供するものであ
る。 本発明で使用される吸着体は、アガロース、デ
キストリン、セルロース等の水不溶性担体に、一
個以上のアミノ基を有するスペーサーを結合さ
せ、次いで、このスペーサーのアミノ基と化合物
()のカルボキシル基とを常法によりペプチド
結合させることにより調製される。スペーサーと
して使用される化合物としては、水不溶性担体ま
たは活性化した水不溶性担体と結合し得る官能基
を有し、かつこれと結合した後、遊離のアミノ基
が残存する化合物であればよく、この様な化合物
としては、α,ω−ジアミノアルキレン例えば
1,6−ジアミノヘキサン、1,5−ジアミノペ
ンタン、1,8−ジアミノオクタン、1,10−ジ
アミノデカン等が挙げられる。また、スペーサー
とアガロースを結合させたアミノヘキシルアガロ
ースがフアルマシア・フアインケミカル社より
「AH−セフアロース」の商品名で市販されてお
り、本発明ではこれを使用し、吸着体を調製する
こともできる。 リガンドである式()のグアニジノカルボン
酸としては、グアニジノ酢酸、グアニジノ酪酸、
グアニジノ安息香酸等が挙げられる。 本発明を実施するには、上述の如くして調製し
た吸着体をカラムに充填し、これにカリクレイン
含有液を通液してカリクレインを吸着させ、次い
でこれに溶出液を注加してカリクレインを溶出さ
せる。 カリクレイン含有液の通液は、カリクレインの
濃度、吸着体の種類によつても異なるが、一般に
は流速30〜50ml/hrとするのが好ましい。また溶
出液としては塩化ナトリウムを含むPH4.5〜9.0
(特に好ましくはPH7.4)の緩衝液を用いるのが好
ましい。溶出にあたつては、最初に塩化ナトリウ
ム濃度の低い溶出液(塩化ナトリウム濃度:約
0.1〜0.3M)を通して、不純物のトリプシン、キ
モトリプシン等の酵素及び蛋白質を溶出させ、次
いでこれに塩化ナトリウム濃度の高い溶出液(塩
化ナトリウム濃度:0.4〜1.0M)を通してカリク
レインを溶出させるのが好ましい。この場合塩化
ナトリウム濃度が漸次増大するグラジエント方式
(例えば塩化ナトリウム0.2〜1.0M)によりカリ
クレインを溶出させてもよい。尚本発明で使用さ
れる緩衝液は特に限定されないが、精製物を凍結
乾燥する前にアセトンを加えて脱塩濃縮する場合
は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン・
塩酸緩衝液が好ましい。また使用した吸着体は緩
衝液で洗浄するだけで再使用が可能であり、特別
な再生操作を必要としない。 叙上の本発明方法は、1回の吸脱着操作をおこ
なうだけで、トリプシン、キモトリプシン等の不
純物をほとんど含まない高純度のカリクレインを
高収率で得ることのできる優れたものである。 次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明す
る。 実施例 1 (i) 豚膵臓抽出原末25gに0.2%塩化ナトリウム
水溶液250mlを加え充分に撹拌して懸濁させ、
2N塩酸でPH4.5として遠心分離する。得られた
上清アンモニア水を用いてPH7.4とした後、ア
セトン40〜55%の分画沈降を行い、得られた沈
殿を水100mlに溶かし、1N−水酸化ナトリウム
でPH7.4とし、カリクレイン含有液を得る。 (ii) 一方AHセフアロース4B(フアルマシア・フ
アインケミカル社製)15gを0.5M塩化ナトリ
ウム水溶液に入れて膨潤させた後、吸引過
し、0.5M塩化ナトリウム水溶液、次いで脱イ
オン水で洗浄する。得られた膨潤ゲル約60mlに
脱イオン水100mlを加えた懸濁する。これにグ
アニジノ酢酸70mg(0.6mmole)を脱イオン水
25mlに溶かした溶液を加え1N−塩酸又は1N−
水酸化ナトリウムでPH4.5とする。これに1−
エチル−3−(3′−ジメチルアミノプロピル)
カルボジイミド3.4gを脱イオン水5mlに溶か
した溶液を加え、PH5.0に保ちながら室温で一
夜撹拌する。反応混合物を吸引過し、0.1M
酢酸緩衝液(PH4.0;1M−塩化ナトリウム)お
よび0.1Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノ
メタン塩酸緩衝液(PH8.0:1M塩化ナトリウ
ム)で交互に洗浄した後、吸引過するとグア
ニジノ酢酸結合AH・セフアノース4Bが得られ
る。 (iii) (ii)で得られたグアニジノ酢酸結合AH・セフ
アロース4Bをカラム(2φ×30cm)に充填し、
(i)で得たカリクレイン含有液をこのカラムに通
液し、50mMトリス(ヒドロキシメチル)アミ
ノメタン・塩酸緩衝液(PH7.4)次いで0.2M塩
化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。
次に0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液(250ml−
250ml)でグラジエント溶出を行う。集めたカ
リクレイン分画にアセトンを加えて脱塩濃縮
し、凍結乾燥して精製カリクレイン24mg(総活
性8160K.U*)を得た。 *K.U:カリクレインユニツト 実施例 2 実施例1(ii)におけるグアニジノ酢酸70mgをグア
ニジノ安息香酸129mgに変える以外は全く同様に
して得たグアニジノ安息香酸結合AH・セフアロ
ース4Bをカラム(2×30cm)に充填し、実施例
1(i)と同様にして得たカリクレイン含有液をこの
カラムに通液し、50mMトリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン・塩酸緩衝液(PH7.4)、次いで
0.2M塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを
洗浄した。次に0.4M塩化ナトリウムを含む同緩
衝液でカリクレインを溶出し、集めたカリクレイ
ン分画にアセトンを加えて脱塩濃縮後、凍結乾燥
して精製カリクレイン164mg(総活性9676K.U)
を得た。 実施例 3 実施例1(ii)におけるグアニジノ酢酸70mgをグア
ニジノ酪酸87mgに変える以外は全く同様にして得
たグアニジノ酪酸結合AH・セフアロース4Bをカ
ラム(2×30cm)に充填する。次いで実施例1(i)
でアセトン40〜55%を33〜67%に変える以外は全
く同様にして得たカリクレイン含有液を上記のカ
ラムに通液し、10mMトリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン−塩酸緩衝液(PH7.4)、次いで
0.25M塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを
洗浄した。更に0.5M塩化ナトリウムを含む同緩
衝液でカリクレインを溶出後、集めたカリクレイ
ン分画でアセトンを加えて脱塩濃縮し、精製カリ
クレイン72mg(総活性9360K.U)を得た。 実施例 4 豚膵臓原末25gに0.2%塩化ナトリウム水溶液
250mlを加えて充分に撹拌して懸濁させ、2N塩酸
でPH4.5として遠心分離する。得られた上清をア
ンモニア水を用いPH7.4とした後、硫酸アンモニ
ウムを加えて硫安分画を行う。得られた沈殿を水
に溶かし、DEAE.セルロースを加えてカリクレ
インをDEAE.セルロースに吸着させ、2%塩化
ナトリウム水溶液でDEAE.セルロースからカリ
クレインを脱着させる。次いでこのカリクレイン
含有液をアセトン33〜67%の分画沈殿を行い、得
られる沈殿を水25mlに溶かし、PH7.4とする。こ
の溶液を実施例1(ii)と同様にして得たグアニジノ
酢酸結合AH・セフアロース4Bを充填したカラム
(2φ×30cm)に通液し、このカラムを10mMトリ
ス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝
液(PH7.4)、次いで0.25M塩化ナトリウムを含む
同緩衝液で洗浄する。0.5M塩化ナトリウムを含
む同緩衝液でカリクレインを溶出し、集めたカリ
クレイン分画にアセトンを加え、脱塩濃縮し、凍
結乾燥して精製カリクレイン4mg(総活性
4120K.U)を得た。このものはトリプキン、キモ
トリプシンを全く含まず純度の高いものであつ
た。 実施例 5 実施例1〜4で得た精製カリクレインについて
そのカリクレイン活性、トリプシン活性及びキモ
トリプシン活性を測定した。更に、カリクレイン
活性の測定結果から、その比活性、回収率、精製
倍率を計算した。その結果を第1表に示す。 〔測定方法〕 (1) カリクレインの生理活性 守屋等の方法〔ザ・ジヤーナル・オブ・バイ
オケミストリー(J.Biochem.)58巻、201頁、
1956年〕に従つて行なつた。 (2) トリプシン活性 高見の方法〔生化学、41巻、777頁、1969年)
に従つて行つた(ベンゾイル−DL−アルギニ
ン・P・ニトロアニリド・HClを基質とし、37
℃で15分間反応させた)。 (3) キモトリプシン活性 佐々木等の方法〔アナリテイカルバイオケミ
ストリイ(Anal.Biochem.)86巻159頁、1978
年〕に従つて行なつた(N−ベンゾイル−L−
シロシル−P−ニトロアニリドを基質とし37℃
で30分間反応させた)。 〔結果〕
あり、更に詳しくは、哺乳動物の膵臓中に存在す
るカリクレインを簡単な操作での工業的規模にお
いて大量かつ高純度に精製する方法に関するもの
である。 カリクレインは哺乳動物の各種組織で生産され
る蛋白分解酵素の一種であり、またキニン遊離酵
素の一種として知られている。遊離キニンには末
梢血管拡張作用があり、従つてカリクレインは循
環器系疾患の治療用に使用されている。カリクレ
インは通常、哺乳動物臓器から抽出されるので、
その粗抽出物には多くの異種蛋白質が含まれてい
る。なかでもキニン産生あるいはキニン分解に関
連したトリプシン及びキモトリプシンの混在は治
療の際の副作用を惹起させるおそれがあるため、
抽出物の医薬品として使用するには、更に十分な
精製を行つて高純度のものとすることが必要であ
る。 従来、粗カリクレインから異種蛋白質及び類似
酵素を除去するための方法としては、塩析法、ゲ
ル過法、イオン交換クロマトグラフ法(特開昭
53−62893)、等電点分別法(特開昭49−41583)、
溶媒沈殿法(特開昭52−102495)などの手段を組
み合せた方法や、また阻害剤を利用したアフイニ
テイークロマトグラフ法(特開昭54−62312)ア
ルギニン誘導体結合担体を用いたクロマトグラフ
法(特開昭56−117791、特開昭57−50924)など
が知られている。しかし、これらの方法は操作が
繁雑であつたり、収率が低い又は試薬が高価であ
るなどの点でいずれも工業的製法として満足し得
るものではなかつた。 本発明者らは、より簡単で効率的なカリクレイ
ンの精製法を提供すべく鋭意研究を行つた結果、
カリクレインがグアニジノ基に対して特異的に親
和性を有すること、およびグアニジノ基を有する
物質をリガンドとしてアフイニテイークロマトグ
ラフイーを行うことにより、簡単に、且つ高収率
で高純度のカリクレインが得られることを見い出
し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、カリクレイン含有液を次
の式() 〔式中、Rは(−CH2)−o(ここでnは1〜5の数
を示す)又は−C6H4−を示す〕 で表わされるグアニジノカルボン酸をスペーサー
を介して水不溶性担体に結合させて得た吸着体に
接触させてカリクレインを吸着せしめ、次いで吸
着したカリクレインを溶離せしめることを特徴と
するカリクレインの精製法を提供するものであ
る。 本発明で使用される吸着体は、アガロース、デ
キストリン、セルロース等の水不溶性担体に、一
個以上のアミノ基を有するスペーサーを結合さ
せ、次いで、このスペーサーのアミノ基と化合物
()のカルボキシル基とを常法によりペプチド
結合させることにより調製される。スペーサーと
して使用される化合物としては、水不溶性担体ま
たは活性化した水不溶性担体と結合し得る官能基
を有し、かつこれと結合した後、遊離のアミノ基
が残存する化合物であればよく、この様な化合物
としては、α,ω−ジアミノアルキレン例えば
1,6−ジアミノヘキサン、1,5−ジアミノペ
ンタン、1,8−ジアミノオクタン、1,10−ジ
アミノデカン等が挙げられる。また、スペーサー
とアガロースを結合させたアミノヘキシルアガロ
ースがフアルマシア・フアインケミカル社より
「AH−セフアロース」の商品名で市販されてお
り、本発明ではこれを使用し、吸着体を調製する
こともできる。 リガンドである式()のグアニジノカルボン
酸としては、グアニジノ酢酸、グアニジノ酪酸、
グアニジノ安息香酸等が挙げられる。 本発明を実施するには、上述の如くして調製し
た吸着体をカラムに充填し、これにカリクレイン
含有液を通液してカリクレインを吸着させ、次い
でこれに溶出液を注加してカリクレインを溶出さ
せる。 カリクレイン含有液の通液は、カリクレインの
濃度、吸着体の種類によつても異なるが、一般に
は流速30〜50ml/hrとするのが好ましい。また溶
出液としては塩化ナトリウムを含むPH4.5〜9.0
(特に好ましくはPH7.4)の緩衝液を用いるのが好
ましい。溶出にあたつては、最初に塩化ナトリウ
ム濃度の低い溶出液(塩化ナトリウム濃度:約
0.1〜0.3M)を通して、不純物のトリプシン、キ
モトリプシン等の酵素及び蛋白質を溶出させ、次
いでこれに塩化ナトリウム濃度の高い溶出液(塩
化ナトリウム濃度:0.4〜1.0M)を通してカリク
レインを溶出させるのが好ましい。この場合塩化
ナトリウム濃度が漸次増大するグラジエント方式
(例えば塩化ナトリウム0.2〜1.0M)によりカリ
クレインを溶出させてもよい。尚本発明で使用さ
れる緩衝液は特に限定されないが、精製物を凍結
乾燥する前にアセトンを加えて脱塩濃縮する場合
は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン・
塩酸緩衝液が好ましい。また使用した吸着体は緩
衝液で洗浄するだけで再使用が可能であり、特別
な再生操作を必要としない。 叙上の本発明方法は、1回の吸脱着操作をおこ
なうだけで、トリプシン、キモトリプシン等の不
純物をほとんど含まない高純度のカリクレインを
高収率で得ることのできる優れたものである。 次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明す
る。 実施例 1 (i) 豚膵臓抽出原末25gに0.2%塩化ナトリウム
水溶液250mlを加え充分に撹拌して懸濁させ、
2N塩酸でPH4.5として遠心分離する。得られた
上清アンモニア水を用いてPH7.4とした後、ア
セトン40〜55%の分画沈降を行い、得られた沈
殿を水100mlに溶かし、1N−水酸化ナトリウム
でPH7.4とし、カリクレイン含有液を得る。 (ii) 一方AHセフアロース4B(フアルマシア・フ
アインケミカル社製)15gを0.5M塩化ナトリ
ウム水溶液に入れて膨潤させた後、吸引過
し、0.5M塩化ナトリウム水溶液、次いで脱イ
オン水で洗浄する。得られた膨潤ゲル約60mlに
脱イオン水100mlを加えた懸濁する。これにグ
アニジノ酢酸70mg(0.6mmole)を脱イオン水
25mlに溶かした溶液を加え1N−塩酸又は1N−
水酸化ナトリウムでPH4.5とする。これに1−
エチル−3−(3′−ジメチルアミノプロピル)
カルボジイミド3.4gを脱イオン水5mlに溶か
した溶液を加え、PH5.0に保ちながら室温で一
夜撹拌する。反応混合物を吸引過し、0.1M
酢酸緩衝液(PH4.0;1M−塩化ナトリウム)お
よび0.1Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノ
メタン塩酸緩衝液(PH8.0:1M塩化ナトリウ
ム)で交互に洗浄した後、吸引過するとグア
ニジノ酢酸結合AH・セフアノース4Bが得られ
る。 (iii) (ii)で得られたグアニジノ酢酸結合AH・セフ
アロース4Bをカラム(2φ×30cm)に充填し、
(i)で得たカリクレイン含有液をこのカラムに通
液し、50mMトリス(ヒドロキシメチル)アミ
ノメタン・塩酸緩衝液(PH7.4)次いで0.2M塩
化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。
次に0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液(250ml−
250ml)でグラジエント溶出を行う。集めたカ
リクレイン分画にアセトンを加えて脱塩濃縮
し、凍結乾燥して精製カリクレイン24mg(総活
性8160K.U*)を得た。 *K.U:カリクレインユニツト 実施例 2 実施例1(ii)におけるグアニジノ酢酸70mgをグア
ニジノ安息香酸129mgに変える以外は全く同様に
して得たグアニジノ安息香酸結合AH・セフアロ
ース4Bをカラム(2×30cm)に充填し、実施例
1(i)と同様にして得たカリクレイン含有液をこの
カラムに通液し、50mMトリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン・塩酸緩衝液(PH7.4)、次いで
0.2M塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを
洗浄した。次に0.4M塩化ナトリウムを含む同緩
衝液でカリクレインを溶出し、集めたカリクレイ
ン分画にアセトンを加えて脱塩濃縮後、凍結乾燥
して精製カリクレイン164mg(総活性9676K.U)
を得た。 実施例 3 実施例1(ii)におけるグアニジノ酢酸70mgをグア
ニジノ酪酸87mgに変える以外は全く同様にして得
たグアニジノ酪酸結合AH・セフアロース4Bをカ
ラム(2×30cm)に充填する。次いで実施例1(i)
でアセトン40〜55%を33〜67%に変える以外は全
く同様にして得たカリクレイン含有液を上記のカ
ラムに通液し、10mMトリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン−塩酸緩衝液(PH7.4)、次いで
0.25M塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを
洗浄した。更に0.5M塩化ナトリウムを含む同緩
衝液でカリクレインを溶出後、集めたカリクレイ
ン分画でアセトンを加えて脱塩濃縮し、精製カリ
クレイン72mg(総活性9360K.U)を得た。 実施例 4 豚膵臓原末25gに0.2%塩化ナトリウム水溶液
250mlを加えて充分に撹拌して懸濁させ、2N塩酸
でPH4.5として遠心分離する。得られた上清をア
ンモニア水を用いPH7.4とした後、硫酸アンモニ
ウムを加えて硫安分画を行う。得られた沈殿を水
に溶かし、DEAE.セルロースを加えてカリクレ
インをDEAE.セルロースに吸着させ、2%塩化
ナトリウム水溶液でDEAE.セルロースからカリ
クレインを脱着させる。次いでこのカリクレイン
含有液をアセトン33〜67%の分画沈殿を行い、得
られる沈殿を水25mlに溶かし、PH7.4とする。こ
の溶液を実施例1(ii)と同様にして得たグアニジノ
酢酸結合AH・セフアロース4Bを充填したカラム
(2φ×30cm)に通液し、このカラムを10mMトリ
ス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝
液(PH7.4)、次いで0.25M塩化ナトリウムを含む
同緩衝液で洗浄する。0.5M塩化ナトリウムを含
む同緩衝液でカリクレインを溶出し、集めたカリ
クレイン分画にアセトンを加え、脱塩濃縮し、凍
結乾燥して精製カリクレイン4mg(総活性
4120K.U)を得た。このものはトリプキン、キモ
トリプシンを全く含まず純度の高いものであつ
た。 実施例 5 実施例1〜4で得た精製カリクレインについて
そのカリクレイン活性、トリプシン活性及びキモ
トリプシン活性を測定した。更に、カリクレイン
活性の測定結果から、その比活性、回収率、精製
倍率を計算した。その結果を第1表に示す。 〔測定方法〕 (1) カリクレインの生理活性 守屋等の方法〔ザ・ジヤーナル・オブ・バイ
オケミストリー(J.Biochem.)58巻、201頁、
1956年〕に従つて行なつた。 (2) トリプシン活性 高見の方法〔生化学、41巻、777頁、1969年)
に従つて行つた(ベンゾイル−DL−アルギニ
ン・P・ニトロアニリド・HClを基質とし、37
℃で15分間反応させた)。 (3) キモトリプシン活性 佐々木等の方法〔アナリテイカルバイオケミ
ストリイ(Anal.Biochem.)86巻159頁、1978
年〕に従つて行なつた(N−ベンゾイル−L−
シロシル−P−ニトロアニリドを基質とし37℃
で30分間反応させた)。 〔結果〕
【表】
実施例 6
グアニジノ酢酸の代わりにグアニジノ安息香酸
を用いる以外は、同様を操作を行い、精製カリク
レイン35mg(総活性8610K.U)を得た。 比較例 1 特開昭55−92355号の実施例1で得られた吸着
体をカラム(2φ×30cm)に充填し、前記実施例
1(i)で得られたカリクレイン含有液をカラムに通
液し、50mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノ
メタン・塩酸緩衝液(PH7.4)次いで0.2M塩化ナ
トリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。次に
0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液(250ml−250ml)
でグラジエント溶出を行う。集めたカリクレイン
分画にアセトンを加えて脱塩濃縮し、凍結乾燥し
て精製カリクレイン137mg(総活性7646K.U)を
得た。 比較例 2 特開昭55−92355号の実施例2で得られた吸着
体をカラム(2φ×30cm)に充填し、前記実施例
1(i)で得られたカリクレイン含有液をカラムに通
液し、50mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノ
メタン・塩酸緩衝液(PH7.4)次いで0.2M塩化ナ
トリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。次に
0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液(250ml−250ml)
でグラジエント溶出を行う。集めたカリクレイン
分画にアセトンを加えて脱塩濃縮し、凍結乾燥し
て精製カリクレイン144mg(総活性8928K.U)を
得た。 実施例1、実施例6、比較例1及び比較例2で
得られたカリクレイン精製物について、その比活
性、回収率、精製倍率を計算した。この結果を第
2表に示す。
を用いる以外は、同様を操作を行い、精製カリク
レイン35mg(総活性8610K.U)を得た。 比較例 1 特開昭55−92355号の実施例1で得られた吸着
体をカラム(2φ×30cm)に充填し、前記実施例
1(i)で得られたカリクレイン含有液をカラムに通
液し、50mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノ
メタン・塩酸緩衝液(PH7.4)次いで0.2M塩化ナ
トリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。次に
0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液(250ml−250ml)
でグラジエント溶出を行う。集めたカリクレイン
分画にアセトンを加えて脱塩濃縮し、凍結乾燥し
て精製カリクレイン137mg(総活性7646K.U)を
得た。 比較例 2 特開昭55−92355号の実施例2で得られた吸着
体をカラム(2φ×30cm)に充填し、前記実施例
1(i)で得られたカリクレイン含有液をカラムに通
液し、50mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノ
メタン・塩酸緩衝液(PH7.4)次いで0.2M塩化ナ
トリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。次に
0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液(250ml−250ml)
でグラジエント溶出を行う。集めたカリクレイン
分画にアセトンを加えて脱塩濃縮し、凍結乾燥し
て精製カリクレイン144mg(総活性8928K.U)を
得た。 実施例1、実施例6、比較例1及び比較例2で
得られたカリクレイン精製物について、その比活
性、回収率、精製倍率を計算した。この結果を第
2表に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 カリクレイン含有液を、次の一般式() 〔式中、Rは(−CH2)−o(ここでnは1〜5の数
を示す)又は−C6H4−を示す〕 で表わされるグアニジノカルボン酸をスペーサー
を介して水不溶性担体に結合させて得た吸着体に
接触させてカリクレインを吸着せしめ、次いで吸
着したカリクレインを溶離せしめることを特徴と
するカリクレインの精製法。 2 スペーサーがα,ω−ジアミノアルキレンよ
り導かれたものである特許請求の範囲第1項記載
の方法。 3 スペーサーが1,6−ジアミノヘキサン、
1,5−ジアミノペンタン、1,8−ジアミノオ
クタン、1,10−ジアミノデカンのいずれかから
導かれたものである特許請求の範囲第1項又は第
2項記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21811582A JPS59109172A (ja) | 1982-12-13 | 1982-12-13 | カリクレインの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21811582A JPS59109172A (ja) | 1982-12-13 | 1982-12-13 | カリクレインの精製法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59109172A JPS59109172A (ja) | 1984-06-23 |
JPH0260316B2 true JPH0260316B2 (ja) | 1990-12-14 |
Family
ID=16714854
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP21811582A Granted JPS59109172A (ja) | 1982-12-13 | 1982-12-13 | カリクレインの精製法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59109172A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05121958A (ja) * | 1991-10-29 | 1993-05-18 | Saitama Nippon Denki Kk | 直線増幅装置の歪補償制御方式 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ216094A (en) * | 1985-05-15 | 1989-06-28 | Commw Serum Lab Commission | Method for purification of an immunoglobulin |
AU6549186A (en) * | 1985-10-24 | 1987-05-19 | Biotechnology Research Partners Limited | Blood tests diagnostic for hypertension |
JP4869856B2 (ja) * | 2006-10-04 | 2012-02-08 | オリンパス株式会社 | 電気回路装置及びその製造方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS504227A (ja) * | 1972-12-19 | 1975-01-17 | ||
JPS5276481A (en) * | 1975-12-18 | 1977-06-27 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | Production of high purity urokinase |
JPS5592355A (en) * | 1978-12-22 | 1980-07-12 | Nippon Soda Co Ltd | Enzyme-adsorbing substance and purification of enzyme using the same |
-
1982
- 1982-12-13 JP JP21811582A patent/JPS59109172A/ja active Granted
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS504227A (ja) * | 1972-12-19 | 1975-01-17 | ||
JPS5276481A (en) * | 1975-12-18 | 1977-06-27 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | Production of high purity urokinase |
JPS5592355A (en) * | 1978-12-22 | 1980-07-12 | Nippon Soda Co Ltd | Enzyme-adsorbing substance and purification of enzyme using the same |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05121958A (ja) * | 1991-10-29 | 1993-05-18 | Saitama Nippon Denki Kk | 直線増幅装置の歪補償制御方式 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS59109172A (ja) | 1984-06-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hixson Jr et al. | Affinity chromatograpy: Purification of bovine trypsin and thrombin | |
JPS5832591B2 (ja) | ウロキナ−ゼの精製法 | |
Funk et al. | Affinity Chromatographic Purification of Papain a Reinvestigation | |
JP2573467B2 (ja) | 第ix因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物 | |
JPH0260316B2 (ja) | ||
US4708944A (en) | Protease adsorbent and process for purifying TPA utilizing the same | |
JPS59110625A (ja) | プラスミノ−ゲン活性化因子、その製造法およびその製造用生産物 | |
JPS62259596A (ja) | ハイブリツドタンパク質の精製方法 | |
US3926730A (en) | Separation and purification of alpha-amylase | |
JPH0147997B2 (ja) | ||
JPS5838151B2 (ja) | カリクレインの精製法 | |
JP2882828B2 (ja) | 人尿トリプシンインヒビターの精製方法 | |
JPS5820592B2 (ja) | カリクレインノセイセイホウホウ | |
JPS5830034B2 (ja) | カリクレインの精製法 | |
JPS61224996A (ja) | マウスインタ−フエロンの精製法 | |
JPS5838150B2 (ja) | カリクレインの精製法 | |
JPS6023646B2 (ja) | 高純度カリクレインの精製方法 | |
JPS5813390A (ja) | 高純度ウロキナ−ゼの分離精製法 | |
JPH0723397B2 (ja) | 人尿トリプシンインヒビターおよび人尿カリクレインの濃縮分離方法 | |
JPS6032717A (ja) | カリクレインの精製法 | |
DK147946B (da) | Fremgangsmaade til rensning af en urokinaseoploesning | |
JPH028710B2 (ja) | ||
JPS5810522A (ja) | 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン3の精製法 | |
JPS6092220A (ja) | カリクレインの精製法 | |
JPS58144354A (ja) | 高純度ウロキナーゼの製造法及び樹脂 |