JPH0260316B2 - - Google Patents
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明はカリクレインの精製法に関するもので
あり、更に詳しくは、哺乳動物の膵臓中に存在す
るカリクレインを簡単な操作での工業的規模にお
いて大量かつ高純度に精製する方法に関するもの
である。 カリクレインは哺乳動物の各種組織で生産され
る蛋白分解酵素の一種であり、またキニン遊離酵
素の一種として知られている。遊離キニンには末
梢血管拡張作用があり、従つてカリクレインは循
環器系疾患の治療用に使用されている。カリクレ
インは通常、哺乳動物臓器から抽出されるので、
その粗抽出物には多くの異種蛋白質が含まれてい
る。なかでもキニン産生あるいはキニン分解に関
連したトリプシン及びキモトリプシンの混在は治
療の際の副作用を惹起させるおそれがあるため、
抽出物の医薬品として使用するには、更に十分な
精製を行つて高純度のものとすることが必要であ
る。 従来、粗カリクレインから異種蛋白質及び類似
酵素を除去するための方法としては、塩析法、ゲ
ル過法、イオン交換クロマトグラフ法（特開昭
53−62893）、等電点分別法（特開昭49−41583）、
溶媒沈殿法（特開昭52−102495）などの手段を組
み合せた方法や、また阻害剤を利用したアフイニ
テイークロマトグラフ法（特開昭54−62312）ア
ルギニン誘導体結合担体を用いたクロマトグラフ
法（特開昭56−117791、特開昭57−50924）など
が知られている。しかし、これらの方法は操作が
繁雑であつたり、収率が低い又は試薬が高価であ
るなどの点でいずれも工業的製法として満足し得
るものではなかつた。 本発明者らは、より簡単で効率的なカリクレイ
ンの精製法を提供すべく鋭意研究を行つた結果、
カリクレインがグアニジノ基に対して特異的に親
和性を有すること、およびグアニジノ基を有する
物質をリガンドとしてアフイニテイークロマトグ
ラフイーを行うことにより、簡単に、且つ高収率
で高純度のカリクレインが得られることを見い出
し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、カリクレイン含有液を次
の式（） 〔式中、Ｒは（−CH2）−o（ここでｎは１〜５の数
を示す）又は−C6H4−を示す〕 で表わされるグアニジノカルボン酸をスペーサー
を介して水不溶性担体に結合させて得た吸着体に
接触させてカリクレインを吸着せしめ、次いで吸
着したカリクレインを溶離せしめることを特徴と
するカリクレインの精製法を提供するものであ
る。 本発明で使用される吸着体は、アガロース、デ
キストリン、セルロース等の水不溶性担体に、一
個以上のアミノ基を有するスペーサーを結合さ
せ、次いで、このスペーサーのアミノ基と化合物
（）のカルボキシル基とを常法によりペプチド
結合させることにより調製される。スペーサーと
して使用される化合物としては、水不溶性担体ま
たは活性化した水不溶性担体と結合し得る官能基
を有し、かつこれと結合した後、遊離のアミノ基
が残存する化合物であればよく、この様な化合物
としては、α，ω−ジアミノアルキレン例えば
１，６−ジアミノヘキサン、１，５−ジアミノペ
ンタン、１，８−ジアミノオクタン、１，10−ジ
アミノデカン等が挙げられる。また、スペーサー
とアガロースを結合させたアミノヘキシルアガロ
ースがフアルマシア・フアインケミカル社より
「AH−セフアロース」の商品名で市販されてお
り、本発明ではこれを使用し、吸着体を調製する
こともできる。 リガンドである式（）のグアニジノカルボン
酸としては、グアニジノ酢酸、グアニジノ酪酸、
グアニジノ安息香酸等が挙げられる。 本発明を実施するには、上述の如くして調製し
た吸着体をカラムに充填し、これにカリクレイン
含有液を通液してカリクレインを吸着させ、次い
でこれに溶出液を注加してカリクレインを溶出さ
せる。 カリクレイン含有液の通液は、カリクレインの
濃度、吸着体の種類によつても異なるが、一般に
は流速30〜50ml／hrとするのが好ましい。また溶
出液としては塩化ナトリウムを含むPH4.5〜9.0
（特に好ましくはPH7.4）の緩衝液を用いるのが好
ましい。溶出にあたつては、最初に塩化ナトリウ
ム濃度の低い溶出液（塩化ナトリウム濃度：約
0.1〜0.3M）を通して、不純物のトリプシン、キ
モトリプシン等の酵素及び蛋白質を溶出させ、次
いでこれに塩化ナトリウム濃度の高い溶出液（塩
化ナトリウム濃度：0.4〜1.0M）を通してカリク
レインを溶出させるのが好ましい。この場合塩化
ナトリウム濃度が漸次増大するグラジエント方式
（例えば塩化ナトリウム0.2〜1.0M）によりカリ
クレインを溶出させてもよい。尚本発明で使用さ
れる緩衝液は特に限定されないが、精製物を凍結
乾燥する前にアセトンを加えて脱塩濃縮する場合
は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・
塩酸緩衝液が好ましい。また使用した吸着体は緩
衝液で洗浄するだけで再使用が可能であり、特別
な再生操作を必要としない。 叙上の本発明方法は、１回の吸脱着操作をおこ
なうだけで、トリプシン、キモトリプシン等の不
純物をほとんど含まない高純度のカリクレインを
高収率で得ることのできる優れたものである。 次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明す
る。 実施例 １ (i) 豚膵臓抽出原末25ｇに0.2％塩化ナトリウム
水溶液250mlを加え充分に撹拌して懸濁させ、
2N塩酸でPH4.5として遠心分離する。得られた
上清アンモニア水を用いてPH7.4とした後、ア
セトン40〜55％の分画沈降を行い、得られた沈
殿を水100mlに溶かし、1N−水酸化ナトリウム
でPH7.4とし、カリクレイン含有液を得る。 (ii) 一方AHセフアロース4B（フアルマシア・フ
アインケミカル社製）15ｇを0.5M塩化ナトリ
ウム水溶液に入れて膨潤させた後、吸引過
し、0.5M塩化ナトリウム水溶液、次いで脱イ
オン水で洗浄する。得られた膨潤ゲル約60mlに
脱イオン水100mlを加えた懸濁する。これにグ
アニジノ酢酸70mg（0.6ｍmole）を脱イオン水
25mlに溶かした溶液を加え1N−塩酸又は1N−
水酸化ナトリウムでPH4.5とする。これに１−
エチル−３−（3′−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド3.4ｇを脱イオン水５mlに溶か
した溶液を加え、PH5.0に保ちながら室温で一
夜撹拌する。反応混合物を吸引過し、0.1M
酢酸緩衝液（PH4.0；1M−塩化ナトリウム）お
よび0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン塩酸緩衝液（PH8.0：1M塩化ナトリウ
ム）で交互に洗浄した後、吸引過するとグア
ニジノ酢酸結合AH・セフアノース4Bが得られ
る。 (iii) (ii)で得られたグアニジノ酢酸結合AH・セフ
アロース4Bをカラム（2φ×30cm）に充填し、
(i)で得たカリクレイン含有液をこのカラムに通
液し、50ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン・塩酸緩衝液（PH7.4）次いで0.2M塩
化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。
次に0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液（250ml−
250ml）でグラジエント溶出を行う。集めたカ
リクレイン分画にアセトンを加えて脱塩濃縮
し、凍結乾燥して精製カリクレイン24mg（総活
性8160K.U*）を得た。 ＊K.U：カリクレインユニツト 実施例 ２ 実施例１(ii)におけるグアニジノ酢酸70mgをグア
ニジノ安息香酸129mgに変える以外は全く同様に
して得たグアニジノ安息香酸結合AH・セフアロ
ース4Bをカラム（２×30cm）に充填し、実施例
１(i)と同様にして得たカリクレイン含有液をこの
カラムに通液し、50ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン・塩酸緩衝液（PH7.4）、次いで
0.2M塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを
洗浄した。次に0.4M塩化ナトリウムを含む同緩
衝液でカリクレインを溶出し、集めたカリクレイ
ン分画にアセトンを加えて脱塩濃縮後、凍結乾燥
して精製カリクレイン164mg（総活性9676K.U）
を得た。 実施例 ３ 実施例１(ii)におけるグアニジノ酢酸70mgをグア
ニジノ酪酸87mgに変える以外は全く同様にして得
たグアニジノ酪酸結合AH・セフアロース4Bをカ
ラム（２×30cm）に充填する。次いで実施例１(i)
でアセトン40〜55％を33〜67％に変える以外は全
く同様にして得たカリクレイン含有液を上記のカ
ラムに通液し、10ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン−塩酸緩衝液（PH7.4）、次いで
0.25M塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを
洗浄した。更に0.5M塩化ナトリウムを含む同緩
衝液でカリクレインを溶出後、集めたカリクレイ
ン分画でアセトンを加えて脱塩濃縮し、精製カリ
クレイン72mg（総活性9360K.U）を得た。 実施例 ４ 豚膵臓原末25ｇに0.2％塩化ナトリウム水溶液
250mlを加えて充分に撹拌して懸濁させ、2N塩酸
でPH4.5として遠心分離する。得られた上清をア
ンモニア水を用いPH7.4とした後、硫酸アンモニ
ウムを加えて硫安分画を行う。得られた沈殿を水
に溶かし、DEAE.セルロースを加えてカリクレ
インをDEAE.セルロースに吸着させ、２％塩化
ナトリウム水溶液でDEAE.セルロースからカリ
クレインを脱着させる。次いでこのカリクレイン
含有液をアセトン33〜67％の分画沈殿を行い、得
られる沈殿を水25mlに溶かし、PH7.4とする。こ
の溶液を実施例１(ii)と同様にして得たグアニジノ
酢酸結合AH・セフアロース4Bを充填したカラム
（2φ×30cm）に通液し、このカラムを10ｍＭトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝
液（PH7.4）、次いで0.25M塩化ナトリウムを含む
同緩衝液で洗浄する。0.5M塩化ナトリウムを含
む同緩衝液でカリクレインを溶出し、集めたカリ
クレイン分画にアセトンを加え、脱塩濃縮し、凍
結乾燥して精製カリクレイン４mg（総活性
4120K.U）を得た。このものはトリプキン、キモ
トリプシンを全く含まず純度の高いものであつ
た。 実施例 ５ 実施例１〜４で得た精製カリクレインについて
そのカリクレイン活性、トリプシン活性及びキモ
トリプシン活性を測定した。更に、カリクレイン
活性の測定結果から、その比活性、回収率、精製
倍率を計算した。その結果を第１表に示す。 〔測定方法〕 (1) カリクレインの生理活性 守屋等の方法〔ザ・ジヤーナル・オブ・バイ
オケミストリー（J.Biochem.）58巻、201頁、
1956年〕に従つて行なつた。 (2) トリプシン活性 高見の方法〔生化学、41巻、777頁、1969年）
に従つて行つた（ベンゾイル−DL−アルギニ
ン・Ｐ・ニトロアニリド・HClを基質とし、37
℃で15分間反応させた）。 (3) キモトリプシン活性 佐々木等の方法〔アナリテイカルバイオケミ
ストリイ（Anal.Biochem.）86巻159頁、1978
年〕に従つて行なつた（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−
シロシル−Ｐ−ニトロアニリドを基質とし37℃
で30分間反応させた）。 〔結果〕
あり、更に詳しくは、哺乳動物の膵臓中に存在す
るカリクレインを簡単な操作での工業的規模にお
いて大量かつ高純度に精製する方法に関するもの
である。 カリクレインは哺乳動物の各種組織で生産され
る蛋白分解酵素の一種であり、またキニン遊離酵
素の一種として知られている。遊離キニンには末
梢血管拡張作用があり、従つてカリクレインは循
環器系疾患の治療用に使用されている。カリクレ
インは通常、哺乳動物臓器から抽出されるので、
その粗抽出物には多くの異種蛋白質が含まれてい
る。なかでもキニン産生あるいはキニン分解に関
連したトリプシン及びキモトリプシンの混在は治
療の際の副作用を惹起させるおそれがあるため、
抽出物の医薬品として使用するには、更に十分な
精製を行つて高純度のものとすることが必要であ
る。 従来、粗カリクレインから異種蛋白質及び類似
酵素を除去するための方法としては、塩析法、ゲ
ル過法、イオン交換クロマトグラフ法（特開昭
53−62893）、等電点分別法（特開昭49−41583）、
溶媒沈殿法（特開昭52−102495）などの手段を組
み合せた方法や、また阻害剤を利用したアフイニ
テイークロマトグラフ法（特開昭54−62312）ア
ルギニン誘導体結合担体を用いたクロマトグラフ
法（特開昭56−117791、特開昭57−50924）など
が知られている。しかし、これらの方法は操作が
繁雑であつたり、収率が低い又は試薬が高価であ
るなどの点でいずれも工業的製法として満足し得
るものではなかつた。 本発明者らは、より簡単で効率的なカリクレイ
ンの精製法を提供すべく鋭意研究を行つた結果、
カリクレインがグアニジノ基に対して特異的に親
和性を有すること、およびグアニジノ基を有する
物質をリガンドとしてアフイニテイークロマトグ
ラフイーを行うことにより、簡単に、且つ高収率
で高純度のカリクレインが得られることを見い出
し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、カリクレイン含有液を次
の式（） 〔式中、Ｒは（−CH2）−o（ここでｎは１〜５の数
を示す）又は−C6H4−を示す〕 で表わされるグアニジノカルボン酸をスペーサー
を介して水不溶性担体に結合させて得た吸着体に
接触させてカリクレインを吸着せしめ、次いで吸
着したカリクレインを溶離せしめることを特徴と
するカリクレインの精製法を提供するものであ
る。 本発明で使用される吸着体は、アガロース、デ
キストリン、セルロース等の水不溶性担体に、一
個以上のアミノ基を有するスペーサーを結合さ
せ、次いで、このスペーサーのアミノ基と化合物
（）のカルボキシル基とを常法によりペプチド
結合させることにより調製される。スペーサーと
して使用される化合物としては、水不溶性担体ま
たは活性化した水不溶性担体と結合し得る官能基
を有し、かつこれと結合した後、遊離のアミノ基
が残存する化合物であればよく、この様な化合物
としては、α，ω−ジアミノアルキレン例えば
１，６−ジアミノヘキサン、１，５−ジアミノペ
ンタン、１，８−ジアミノオクタン、１，10−ジ
アミノデカン等が挙げられる。また、スペーサー
とアガロースを結合させたアミノヘキシルアガロ
ースがフアルマシア・フアインケミカル社より
「AH−セフアロース」の商品名で市販されてお
り、本発明ではこれを使用し、吸着体を調製する
こともできる。 リガンドである式（）のグアニジノカルボン
酸としては、グアニジノ酢酸、グアニジノ酪酸、
グアニジノ安息香酸等が挙げられる。 本発明を実施するには、上述の如くして調製し
た吸着体をカラムに充填し、これにカリクレイン
含有液を通液してカリクレインを吸着させ、次い
でこれに溶出液を注加してカリクレインを溶出さ
せる。 カリクレイン含有液の通液は、カリクレインの
濃度、吸着体の種類によつても異なるが、一般に
は流速30〜50ml／hrとするのが好ましい。また溶
出液としては塩化ナトリウムを含むPH4.5〜9.0
（特に好ましくはPH7.4）の緩衝液を用いるのが好
ましい。溶出にあたつては、最初に塩化ナトリウ
ム濃度の低い溶出液（塩化ナトリウム濃度：約
0.1〜0.3M）を通して、不純物のトリプシン、キ
モトリプシン等の酵素及び蛋白質を溶出させ、次
いでこれに塩化ナトリウム濃度の高い溶出液（塩
化ナトリウム濃度：0.4〜1.0M）を通してカリク
レインを溶出させるのが好ましい。この場合塩化
ナトリウム濃度が漸次増大するグラジエント方式
（例えば塩化ナトリウム0.2〜1.0M）によりカリ
クレインを溶出させてもよい。尚本発明で使用さ
れる緩衝液は特に限定されないが、精製物を凍結
乾燥する前にアセトンを加えて脱塩濃縮する場合
は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・
塩酸緩衝液が好ましい。また使用した吸着体は緩
衝液で洗浄するだけで再使用が可能であり、特別
な再生操作を必要としない。 叙上の本発明方法は、１回の吸脱着操作をおこ
なうだけで、トリプシン、キモトリプシン等の不
純物をほとんど含まない高純度のカリクレインを
高収率で得ることのできる優れたものである。 次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明す
る。 実施例 １ (i) 豚膵臓抽出原末25ｇに0.2％塩化ナトリウム
水溶液250mlを加え充分に撹拌して懸濁させ、
2N塩酸でPH4.5として遠心分離する。得られた
上清アンモニア水を用いてPH7.4とした後、ア
セトン40〜55％の分画沈降を行い、得られた沈
殿を水100mlに溶かし、1N−水酸化ナトリウム
でPH7.4とし、カリクレイン含有液を得る。 (ii) 一方AHセフアロース4B（フアルマシア・フ
アインケミカル社製）15ｇを0.5M塩化ナトリ
ウム水溶液に入れて膨潤させた後、吸引過
し、0.5M塩化ナトリウム水溶液、次いで脱イ
オン水で洗浄する。得られた膨潤ゲル約60mlに
脱イオン水100mlを加えた懸濁する。これにグ
アニジノ酢酸70mg（0.6ｍmole）を脱イオン水
25mlに溶かした溶液を加え1N−塩酸又は1N−
水酸化ナトリウムでPH4.5とする。これに１−
エチル−３−（3′−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド3.4ｇを脱イオン水５mlに溶か
した溶液を加え、PH5.0に保ちながら室温で一
夜撹拌する。反応混合物を吸引過し、0.1M
酢酸緩衝液（PH4.0；1M−塩化ナトリウム）お
よび0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン塩酸緩衝液（PH8.0：1M塩化ナトリウ
ム）で交互に洗浄した後、吸引過するとグア
ニジノ酢酸結合AH・セフアノース4Bが得られ
る。 (iii) (ii)で得られたグアニジノ酢酸結合AH・セフ
アロース4Bをカラム（2φ×30cm）に充填し、
(i)で得たカリクレイン含有液をこのカラムに通
液し、50ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン・塩酸緩衝液（PH7.4）次いで0.2M塩
化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。
次に0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液（250ml−
250ml）でグラジエント溶出を行う。集めたカ
リクレイン分画にアセトンを加えて脱塩濃縮
し、凍結乾燥して精製カリクレイン24mg（総活
性8160K.U*）を得た。 ＊K.U：カリクレインユニツト 実施例 ２ 実施例１(ii)におけるグアニジノ酢酸70mgをグア
ニジノ安息香酸129mgに変える以外は全く同様に
して得たグアニジノ安息香酸結合AH・セフアロ
ース4Bをカラム（２×30cm）に充填し、実施例
１(i)と同様にして得たカリクレイン含有液をこの
カラムに通液し、50ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン・塩酸緩衝液（PH7.4）、次いで
0.2M塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを
洗浄した。次に0.4M塩化ナトリウムを含む同緩
衝液でカリクレインを溶出し、集めたカリクレイ
ン分画にアセトンを加えて脱塩濃縮後、凍結乾燥
して精製カリクレイン164mg（総活性9676K.U）
を得た。 実施例 ３ 実施例１(ii)におけるグアニジノ酢酸70mgをグア
ニジノ酪酸87mgに変える以外は全く同様にして得
たグアニジノ酪酸結合AH・セフアロース4Bをカ
ラム（２×30cm）に充填する。次いで実施例１(i)
でアセトン40〜55％を33〜67％に変える以外は全
く同様にして得たカリクレイン含有液を上記のカ
ラムに通液し、10ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン−塩酸緩衝液（PH7.4）、次いで
0.25M塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを
洗浄した。更に0.5M塩化ナトリウムを含む同緩
衝液でカリクレインを溶出後、集めたカリクレイ
ン分画でアセトンを加えて脱塩濃縮し、精製カリ
クレイン72mg（総活性9360K.U）を得た。 実施例 ４ 豚膵臓原末25ｇに0.2％塩化ナトリウム水溶液
250mlを加えて充分に撹拌して懸濁させ、2N塩酸
でPH4.5として遠心分離する。得られた上清をア
ンモニア水を用いPH7.4とした後、硫酸アンモニ
ウムを加えて硫安分画を行う。得られた沈殿を水
に溶かし、DEAE.セルロースを加えてカリクレ
インをDEAE.セルロースに吸着させ、２％塩化
ナトリウム水溶液でDEAE.セルロースからカリ
クレインを脱着させる。次いでこのカリクレイン
含有液をアセトン33〜67％の分画沈殿を行い、得
られる沈殿を水25mlに溶かし、PH7.4とする。こ
の溶液を実施例１(ii)と同様にして得たグアニジノ
酢酸結合AH・セフアロース4Bを充填したカラム
（2φ×30cm）に通液し、このカラムを10ｍＭトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝
液（PH7.4）、次いで0.25M塩化ナトリウムを含む
同緩衝液で洗浄する。0.5M塩化ナトリウムを含
む同緩衝液でカリクレインを溶出し、集めたカリ
クレイン分画にアセトンを加え、脱塩濃縮し、凍
結乾燥して精製カリクレイン４mg（総活性
4120K.U）を得た。このものはトリプキン、キモ
トリプシンを全く含まず純度の高いものであつ
た。 実施例 ５ 実施例１〜４で得た精製カリクレインについて
そのカリクレイン活性、トリプシン活性及びキモ
トリプシン活性を測定した。更に、カリクレイン
活性の測定結果から、その比活性、回収率、精製
倍率を計算した。その結果を第１表に示す。 〔測定方法〕 (1) カリクレインの生理活性 守屋等の方法〔ザ・ジヤーナル・オブ・バイ
オケミストリー（J.Biochem.）58巻、201頁、
1956年〕に従つて行なつた。 (2) トリプシン活性 高見の方法〔生化学、41巻、777頁、1969年）
に従つて行つた（ベンゾイル−DL−アルギニ
ン・Ｐ・ニトロアニリド・HClを基質とし、37
℃で15分間反応させた）。 (3) キモトリプシン活性 佐々木等の方法〔アナリテイカルバイオケミ
ストリイ（Anal.Biochem.）86巻159頁、1978
年〕に従つて行なつた（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−
シロシル−Ｐ−ニトロアニリドを基質とし37℃
で30分間反応させた）。 〔結果〕
【表】
実施例 ６
グアニジノ酢酸の代わりにグアニジノ安息香酸
を用いる以外は、同様を操作を行い、精製カリク
レイン35mg（総活性8610K.U）を得た。 比較例 １ 特開昭55−92355号の実施例１で得られた吸着
体をカラム（2φ×30cm）に充填し、前記実施例
１(i)で得られたカリクレイン含有液をカラムに通
液し、50ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン・塩酸緩衝液（PH7.4）次いで0.2M塩化ナ
トリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。次に
0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液（250ml−250ml）
でグラジエント溶出を行う。集めたカリクレイン
分画にアセトンを加えて脱塩濃縮し、凍結乾燥し
て精製カリクレイン137mg（総活性7646K.U）を
得た。 比較例 ２ 特開昭55−92355号の実施例２で得られた吸着
体をカラム（2φ×30cm）に充填し、前記実施例
１(i)で得られたカリクレイン含有液をカラムに通
液し、50ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン・塩酸緩衝液（PH7.4）次いで0.2M塩化ナ
トリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。次に
0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液（250ml−250ml）
でグラジエント溶出を行う。集めたカリクレイン
分画にアセトンを加えて脱塩濃縮し、凍結乾燥し
て精製カリクレイン144mg（総活性8928K.U）を
得た。 実施例１、実施例６、比較例１及び比較例２で
得られたカリクレイン精製物について、その比活
性、回収率、精製倍率を計算した。この結果を第
２表に示す。
を用いる以外は、同様を操作を行い、精製カリク
レイン35mg（総活性8610K.U）を得た。 比較例 １ 特開昭55−92355号の実施例１で得られた吸着
体をカラム（2φ×30cm）に充填し、前記実施例
１(i)で得られたカリクレイン含有液をカラムに通
液し、50ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン・塩酸緩衝液（PH7.4）次いで0.2M塩化ナ
トリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。次に
0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液（250ml−250ml）
でグラジエント溶出を行う。集めたカリクレイン
分画にアセトンを加えて脱塩濃縮し、凍結乾燥し
て精製カリクレイン137mg（総活性7646K.U）を
得た。 比較例 ２ 特開昭55−92355号の実施例２で得られた吸着
体をカラム（2φ×30cm）に充填し、前記実施例
１(i)で得られたカリクレイン含有液をカラムに通
液し、50ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン・塩酸緩衝液（PH7.4）次いで0.2M塩化ナ
トリウムを含む同緩衝液でカラムを洗う。次に
0.2〜1.0M塩化ナトリウム溶液（250ml−250ml）
でグラジエント溶出を行う。集めたカリクレイン
分画にアセトンを加えて脱塩濃縮し、凍結乾燥し
て精製カリクレイン144mg（総活性8928K.U）を
得た。 実施例１、実施例６、比較例１及び比較例２で
得られたカリクレイン精製物について、その比活
性、回収率、精製倍率を計算した。この結果を第
２表に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ カリクレイン含有液を、次の一般式（） 〔式中、Ｒは（−CH2）−o（ここでｎは１〜５の数
を示す）又は−C6H4−を示す〕 で表わされるグアニジノカルボン酸をスペーサー
を介して水不溶性担体に結合させて得た吸着体に
接触させてカリクレインを吸着せしめ、次いで吸
着したカリクレインを溶離せしめることを特徴と
するカリクレインの精製法。 ２ スペーサーがα，ω−ジアミノアルキレンよ
り導かれたものである特許請求の範囲第１項記載
の方法。 ３ スペーサーが１，６−ジアミノヘキサン、
１，５−ジアミノペンタン、１，８−ジアミノオ
クタン、１，10−ジアミノデカンのいずれかから
導かれたものである特許請求の範囲第１項又は第
２項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21811582A JPS59109172A (ja) | 1982-12-13 | 1982-12-13 | カリクレインの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21811582A JPS59109172A (ja) | 1982-12-13 | 1982-12-13 | カリクレインの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59109172A JPS59109172A (ja) | 1984-06-23 |
| JPH0260316B2 true JPH0260316B2 (ja) | 1990-12-14 |
Family
ID=16714854
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21811582A Granted JPS59109172A (ja) | 1982-12-13 | 1982-12-13 | カリクレインの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59109172A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05121958A (ja) * | 1991-10-29 | 1993-05-18 | Saitama Nippon Denki Kk | 直線増幅装置の歪補償制御方式 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ216094A (en) * | 1985-05-15 | 1989-06-28 | Commw Serum Lab Commission | Method for purification of an immunoglobulin |
| AU6549186A (en) * | 1985-10-24 | 1987-05-19 | Biotechnology Research Partners Limited | Blood tests diagnostic for hypertension |
| JP4869856B2 (ja) * | 2006-10-04 | 2012-02-08 | オリンパス株式会社 | 電気回路装置及びその製造方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS504227A (ja) * | 1972-12-19 | 1975-01-17 | ||
| JPS5276481A (en) * | 1975-12-18 | 1977-06-27 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | Production of high purity urokinase |
| JPS5592355A (en) * | 1978-12-22 | 1980-07-12 | Nippon Soda Co Ltd | Enzyme-adsorbing substance and purification of enzyme using the same |
-
1982
- 1982-12-13 JP JP21811582A patent/JPS59109172A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS504227A (ja) * | 1972-12-19 | 1975-01-17 | ||
| JPS5276481A (en) * | 1975-12-18 | 1977-06-27 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | Production of high purity urokinase |
| JPS5592355A (en) * | 1978-12-22 | 1980-07-12 | Nippon Soda Co Ltd | Enzyme-adsorbing substance and purification of enzyme using the same |
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|---|---|---|---|---|
| JPH05121958A (ja) * | 1991-10-29 | 1993-05-18 | Saitama Nippon Denki Kk | 直線増幅装置の歪補償制御方式 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59109172A (ja) | 1984-06-23 |
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