CN111269308B - 一种利拉鲁肽的纯化方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利拉鲁肽的纯化方法及其应用。本发明利用中低压反相色谱层析***对含有利拉鲁肽的混合物进行分离,获得利拉鲁肽;其中,固定相为有机聚合物反相色谱材料,用于洗脱的流动相包含至少一种能与水混溶的有机溶剂和至少一种pH缓冲物质,pH值为6~9。本发明采用中低压反相色谱层析即可获得高纯度的利拉鲁肽,并且其采用更加方便及价格更加低廉的有机聚合物反相填料,相对于其他纯化手段有着很大的成本优势,适合于工业制备利拉鲁肽。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别涉及一种利拉鲁肽的纯化方法及其应用。
背景技术
利拉鲁肽[Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1(7-37)]为GLP-1(胰高血糖素样肽-1)类似物,在治疗2型糖尿病具有优良的效果。目前,基因工程生产利拉鲁肽主要采用大肠杆菌进行表达,其方法普遍是将Arg34-GLP-1(7-37)片段融合分子伴侣和连接肽进行表达,然后将分子伴侣及连接肽用特异性工具酶切除,得到中间体肽Arg34-GLP-1(7-37)后再对其进行脂肪酸修饰得到利拉鲁肽。如中国专利CN106434717A所公开的通过加入HIS标签亲和层析纯化得到Arg34-GLP-1(7-37)的可溶性融合蛋白,再用肠激酶进行切割获得Arg34-GLP-1(7-37);又如中国专利CN104592381A所公开的利用大肠杆菌发酵诱导表达获得hI-GLP-1融合蛋白,然后经复性、酶切、分离等操作获得(Arg34-GLP-1(7-37))。两种方法均需要通过多个工序步骤(如复性、融合蛋白纯化等)获得中间体肽(Arg34-GLP-1(7-37))后再进行脂肪酸修饰而得到利拉鲁肽,其工艺步骤繁琐,需要经过多步工序,容易造成目标蛋白的丢失而产量降低,增加下游的经济成本。本发明申请人在前期的研究中,直接利用大肠杆菌表达含有分子伴侣、连接肽及Arg34-GLP-1(7-37)片段的融合蛋白包涵体直接修饰酶切转化为利拉鲁肽的制备方法(一步法),具体可见中国发明专利申请CN107881187A,其公开了在Arg34-GLP-1(7-37)片段融合分子伴侣和连接肽的包涵体变性液中加入有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物直接修饰、酶切直接获得利拉鲁肽的制备方法。该方法大大缩短了利拉鲁肽的制备过程,解决了前面所述方法的工艺繁琐,制备成本高的问题。但由于包涵体中通常会附带大量的细胞碎片、宿主细胞蛋白、核酸以及多糖等大分子杂质,并且制备过程中加入了高浓度的变性剂、有机溶剂及有机碱等物质,其中物质混杂,料液粘度大,这样势必会给下游的分离纯化较大的压力,目标蛋白利拉鲁肽的纯化是该方法大规模工业化生产的关键所在。因此,开发一种适用于一步法制备利拉鲁肽的纯化方法显得尤其重要。
包涵体蛋白的纯化普遍性地倾向于采用条件较为温和的方法,常用的方法有凝胶过滤、离子交换色谱以及疏水层析色谱等。凝胶过滤(排阻色谱)是根据蛋白分子大小或结构不同进行分离的色谱技术,其对待分离纯化的样品一般要求无沉淀、黏度小等,在进行柱层析之前,样品需进行繁琐的预处理,工业化生产较难实现。离子交换色谱是通过不同蛋白之间的电荷差异进行分离,其特征是“低盐浓度上样,高盐浓度洗脱”,利拉鲁肽的一步法制备过程中含有高浓度的变性剂、有机溶剂等,若采用离子交换层析需要将料液大体积稀释或者更换溶剂体系,并不利于工业化生产。疏水层析色谱是根据蛋白分子的疏水性质差异进行分离的层析技术,通常主要用于疏水性质较弱的蛋白分子之间的分离纯化,由于利拉鲁肽是经过长链脂肪酸修饰后的GLP-1类似物,由于长脂肪酸链的作用,其疏水性质远远强于常规的蛋白分子,在疏水层析介质中的吸附能力极强,导致蛋白质无法从层析介质中洗脱,因此疏水层析并不适用于利拉鲁肽混合物纯化。
反相层析在所有层析技术中具有最高的分辨率,因此在层析技术领域中被广泛应用。但其用于包涵体蛋白纯化时,通常需要在之前加用其它色谱层析技术进行初纯。中国专利CN104592381A公开了一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法,其是一种采用融合蛋白包涵体制备利拉鲁肽中间体肽的方法,披露了采用Q-FF阴离子交换进行粗纯化,然后再用C8反相填料进行纯化获得利拉鲁肽中间体肽的方法,该方法采用离子交换层析进行纯化,包涵体变性溶解后必须加入大量的复性缓冲液进行复性处理,上样体积大,不便于工业化生产;C8为反相硅胶填料,相对一般的层析色谱材料价格昂贵,成本高。
因此,利用反相层析技术在更低的成本下纯化利拉鲁肽,仍是有待解决的技术问题。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种利拉鲁肽的纯化方法。
本发明的另一目的在于提供上述利拉鲁肽的纯化方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种利拉鲁肽的纯化方法,包括如下步骤:利用中低压反相色谱层析***对含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液进行初纯和精纯,获得目的蛋白利拉鲁肽;其中,固定相为有机聚合物反相色谱材料,用于洗脱的流动相包含至少一种能与水混溶的有机溶剂和至少一种pH缓冲物质,pH值为6~9;
所述的含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液为利拉鲁肽融合蛋白包涵体经溶解变性,修饰酶切后的溶液;具体是大肠杆菌表达得到的利拉鲁肽融合蛋白包涵体,在变性溶液充分溶解变性,并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物后直接修饰酶切得到;优选为依据公开号为CN 107881187 A、发明名称为“将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用”的国家发明专利申请制备得到,具体是通过包括如下步骤的方法制备得到:
(1)将具有利拉鲁肽融合基因的大肠杆菌工程菌株进行发酵,诱导,提取含有利拉鲁肽融合蛋白的包涵体;其中,利拉鲁肽融合基因具有形如A-B-C结构的基因序列,其中A为分子伴侣蛋白编码基因,B为连接肽编码基因,C为Arg34-GLP-1(7-37)片段编码基因;
(2)将步骤(1)中获得的含有利拉鲁肽融合蛋白的包涵体在变性溶液充分溶解变性,并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物,得到反应体系,反应,使融合蛋白与脂肪酸活化物酰化连接;
(3)待步骤(2)反应完成后加入工具酶,得到酶切体系;酶切,得到含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液。
所述的利拉鲁肽融合蛋白是从N端到C端,分子伴侣蛋白、连接肽及Arg34-GLP-1(7-37)片段依次连接得到的蛋白;优选为依据公开号为CN 107881187 A、发明名称为“将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用”的国家发明专利申请设计得到。
所述的分子伴侣蛋白优选为KSI、PagP或TrxA蛋白。
所述的连接肽优选为如X1…XnK所示的肽序列,X为D或者E,n表示氨基酸X的数目,为2至4的整数,优选为3~4;更优选为EEEEK、EDK或DDDDK。
所述的分子伴侣蛋白、连接肽及Arg34-GLP-1(7-37)各片段之间通过酰胺键相连。
步骤(1)中所述的提取是粗蛋白提取,可通过常规的提取步骤进行提取:
当融合蛋白为包涵体表达形式时,例如PagP-EEEEK-Arg34GLP-1(7-37)融合蛋白或KSI-DDDDK-Arg34GLP-1(7-37)融合蛋白,包涵体提取优选包含如下步骤:将具有融合基因的大肠杆菌工程菌株发酵液进行固液分离,将获得的菌体用碱性缓冲液重悬,破碎菌体,再用洗涤液洗涤;接着离心得到包涵体。
所述的固液分离的方式优选为离心。
所述的碱性缓冲液优选为50mM、pH8.5的Tris-HCl缓冲液。
所述的洗涤液为50mM Tris-HCl、1%tritonX-100、50mM NaCl、pH8.5的缓冲液。
步骤(1)中所述的融合蛋白的包涵体为混悬液或半固体状态,而融合蛋白为蛋白沉淀。
步骤(2)中所述的变性溶液选自本领域技术人员所熟知的变性剂,如尿素、盐酸胍及SDS等。更进一步地,优选的变性剂为尿素及盐酸胍。
步骤(2)中所述的变性溶液的用量以使得蛋白充分溶解变性为准,变性溶液的浓度越高,体积用量就较小,变性溶液的浓度越低,体积用量就相对大。
所述的变性溶液的浓度为4~8M。
步骤(2)中所述的有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或至少两种。
所述的有机溶剂的用量按其在反应体系中的浓度为体积百分比为5~50%计算。
步骤(2)中所述的缚酸剂选自本领域技术人员所熟知的有机碱,如三乙胺,N,N-二异丙基乙胺和吡啶等中的一种;更进一步地,优选的缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺。
所述的缚酸剂的加入量应能够使反应体系的pH值达到8.0~12.0计算;优选为8.5~11.5。
步骤(2)中所述的脂肪酸活化物选自Nα-十六酰基-Glu(ONSu)-OBut或Nα-十六酰基-Glu(ONSu)-OH,其用量按融合蛋白量进行计算,蛋白:脂肪酸活化物的摩尔比例为1:1~10,优选1:3~5。
步骤(2)中所述的脂肪酸活化物应在有机溶剂溶解的前提条件下加入,并且有机溶剂的选择与前面所述的一致。更进一步地,脂肪酸活化物在有机溶剂中的浓度为10~100g/L,优选30~50g/L。
所述的Nα-十六酰基-Glu(ONSu)-OBut和Nα-十六酰基-Glu(ONSu)-OH的结构如下:
步骤(2)中所述的反应的条件优选为搅拌状态下反应3小时。
步骤(3)中所述的工具酶为具有切割连接肽中赖氨酸残基功能的酶,优选为赖氨酰内切酶。
所述的赖氨酰特异性内切酶的加入按包涵体中融合蛋白总量计算,1g融合蛋白加入2.5~20IU赖氨酰特异性内切酶,优选10~20IU。
步骤(3)中所述的酶切的条件为pH8.0~10.5,优选pH8.5~9.5,其pH值调节选自盐酸或氢氧化钠。
步骤(3)中所述的酶切的时间优选为8h。
步骤(3)中所述的酶切体系还可包含缓冲物质,这有利于酶切过程中pH的稳定。
所述的缓冲物质优选为三羟甲基氨基甲烷溶液。
所述的中低压反相色谱层析***的工作压力为5~20bar。
所述的有机聚合物反相色谱材料为具有取代基团的聚合物或共聚物。
所述的取代基团为苯基、酯基和杂环基团中的一种或至少两种。
所述的有机聚合物反相色谱材料为苯乙烯、二乙烯基苯和甲基丙烯酸酯中的一种的聚合物或其中至少两种形成的共聚物;优选为聚甲基丙烯酸酯(PMA)或聚苯乙烯(PS)-二乙烯基苯(DVB)。
所述的有机聚合物反相色谱材料优选为Uni NM、Uni PS和Uni PMM中的一种或两种。
所述的有机聚合物反相色谱材料优选粒度为5~300μm的有机聚合物反相色谱材料。
所述的洗脱的方式可以采用流动相的组成比例和流速恒定不变的洗脱方式进行,或按一定程序不断改变流动相的浓度配比进行,即等度洗脱或梯度洗脱。
所述的能与水混溶的有机溶剂为乙腈、酮和C1~C4的醇类中的至少一种。
所述的C1~C4的醇类优选为异丙醇。
所述的有机溶剂在所述的流动相中的浓度为体积百分比20~80%。
所述的pH缓冲物质为磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和三羟甲基氨基甲烷中的一种或至少两种;优选为磷酸盐和三羟基甲基氨基甲烷,更加优选的为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三羟甲基氨基甲烷,缓冲物质的浓度为0.01~0.1mol/L,优选0.02~0.05mol/L。
所述的pH可以选用常见的酸碱物质进行调节,如醋酸、磷酸、盐酸、氢氧化钠、氨水等,pH值为6~9。
所述的利用中低压反相色谱层析***对含有利拉鲁肽的混合物进行分离,具体包括如下步骤:
(A)利用中低压反相色谱层析***,固定相采用粒径为100~300μm的有机聚合物反相色谱材料进行粗纯化;
(B)利用中低压反相色谱层析***,固定相采用粒径为5~50μm的有机聚合物反相色谱材料进行高度纯化。
步骤(A)中所述的有机聚合物反相色谱材料优选粒径为100~200μm的有机聚合物反相色谱材料。
步骤(B)中所述的有机聚合物反相色谱材料优选粒径为30~50μm的有机聚合物反相色谱材料。
所述的利拉鲁肽的纯化方法在工业化制备利拉鲁肽中的应用,特别适合于与公开号为CN 107881187 A、发明名称为“将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用”的国家发明专利申请联用。
本发明相对于现有技术的优点和效果为:
(1)本发明创造性地采用粒径较大价格低廉的有机聚合物反相色谱材料在中低压时对包涵体蛋白进行了初纯,接下来又采用较小粒径价格低廉的有机聚合物反相色谱材料在中低压时进行了再次纯化,即获得了高纯度的蛋白样品。发明人发现,采用不同粒径的有机聚合物反相色谱材料的组合方式能够大大提高色谱材料的使用寿命,降低经济成本;采用粒径较小的色谱材料进行纯化,色谱材料容易发生结块,以致不能够达到预定的纯化目标,并且由于色谱材料粒径较小,不易于清洗,不利于重复再生利用,使用寿命大大缩短;先采用大粒径色谱材料以粗纯捕获的作用形式,能够除去大部分细胞碎片、宿主细胞蛋白、核酸以及多糖等大分子杂质,使料液的粘度得到很大程度的改善,大大降低高度纯化的压力;并且粒径大的色谱材料易于清洗,与小粒径色谱材料形成互补,延长色谱材料的使用寿命。
(2)本发明可以直接用于大肠杆菌表达的融合蛋白包涵体一步法制备利拉鲁肽的纯化,并且料液无需要其他手段的处理,采用两步反相层析既可以获得高纯度的利拉鲁肽,工艺简便,能够很好地与上游工艺衔接,很大程度上缩短了包涵体制备利拉鲁肽的工艺周期,降低经济成本,适用于大规模的工业化生产;
(3)本发明采用中低压反相色谱层析即可获得高纯度的利拉鲁肽,并且其采用更加方便及价格更加低廉的有机聚合物反相填料,相对于其他纯化手段(如HPLC制备用的反相硅胶)有着很大的成本优势。
附图说明
图1是利拉鲁肽混合物HPLC图谱。
图2是实施例2纯化过程的色谱图。
图3是实施例2利拉鲁肽收集组分的HPLC图谱。
图4是实施例2利拉鲁肽收集液pH9.0的HPLC图谱。
图5是实施例2利拉鲁肽收集液pH10.0的HPLC图谱。
图6是实施例2利拉鲁肽收集液pH10.5的HPLC图谱。
图7是实施例3纯化过程的色谱图。
图8是实施例3利拉鲁肽收集组分的HPLC图谱。
图9是实施例4利拉鲁肽收集组分的HPLC图谱。
图10是实施例5利拉鲁肽收集组分4~10混合的HPLC图谱。
图11是利拉鲁肽注射液(商品名:诺和力)HPLC的图谱图(纯度97.32%)。
图12是实施例6实验序号1收集得到的产物的HPLC图谱图。
图13是实施例6实验序号2收集得到的产物的HPLC图谱图。
图14是实施例6实验序号3收集得到的产物的HPLC图谱图。
图15是实施例6实验序号4收集得到的产物的HPLC图谱图。
图16是实施例6实验序号5收集得到的产物的HPLC图谱图。
图17是实施例7实验序号7-1-1收集得到的产物的HPLC图谱图。
图18是实施例7实验序号7-1-2收集得到的产物的HPLC图谱图。
图19是实施例7实验序号7-1-3收集得到的产物的HPLC图谱图。
图20是实施例7实验序号7-1-4收集得到的产物的HPLC图谱图。
图21是实施例7实验序号7-1-5收集得到的产物的HPLC图谱图。
图22是实施例7实验序号7-2-1收集得到的产物的HPLC图谱图。
图23是实施例7实验序号7-2-2收集得到的产物的HPLC图谱图。
图24是实施例7实验序号7-2-3收集得到的产物的HPLC图谱图。
图25是实施例7实验序号7-2-4收集得到的产物的HPLC图谱图。
图26是实施例7实验序号7-2-5收集得到的产物的HPLC图谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。层析填料如表1所示:
表1:色谱层析填料
进一步说明,本发明实施例选用纳微的层析填料进行试验,本领域的专业人员均能够熟知,其他制造商所提供的与权利要求所述的相同基质和配基的层析材料同样能够达到相同或者相当的纯化效果。因此,本发明所采用的层析填料制造商也不局限于以上所述,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
缩写:
DMSO:二甲基亚砜;
DIEA:N’N-二异丙基乙胺;
TFA:三氟乙酸;
Tris:三羟甲基氨基甲烷;
HPLC:高效液相分析色谱仪。
HPLC检测方法:
液相方法参照中国专利CN107881187A所公开的方法进行(下同)。液相方法如下:
仪器,Agilent 1260;柱子,Kromasil C4 4.6×250mm 5μm 100埃。流速,1.0ml/min;柱温35℃;检测波长,210nm。
A相:含0.1%(v/v)TFA的水溶液;B相:含0.1%(v/v)TFA的乙腈溶液。
表2.梯度方法:
利拉鲁肽混合物料液的制备:
参照中国专利CN107881187A所披露的实施例6,将利拉鲁肽融合蛋白包涵体2000g溶于15L浓度为6mol/L的盐酸胍溶液中,加入0.8L DMSO和150ml DIEA,混合均匀,pH为11.37;再加入含有50mg/ml Nα-十六酰基-Glu(ONSu)-OH(利拉鲁肽侧链,CAS号:294855-91-7)的DMSO溶液1.1L,搅拌反应3小时;之后往其中加入17L浓度为20mmol/L的Tris溶液,并加入9000IU赖氨酰特异性内切酶,稀盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值为9.30,反应8小时后取样进行HPLC检测,共获得利拉鲁肽18.85g。HPLC检测图谱如图1所示,利拉鲁肽纯度为30.14%。
实施例1
利拉鲁肽混合物料液pH值实验:用盐酸将利拉鲁肽混合物料液的pH值调节为2.0、3.0、4.0、6.0,实验现象如表3所示:
表3
pH2.0 | pH3.0 | pH4.0 | pH5.0 | pH6.0 |
沉淀 | 大量沉淀 | 大量沉淀 | 大量沉淀 | 澄清液 |
利拉鲁肽理论等电点在pH5.0左右,由包涵体融合蛋白制备所得的利拉鲁肽混合物料液在pH2.0~5.0均以沉淀状态存在,无法进行层析纯化;当pH值达到6.0时为澄清溶液。
实施例2
(1)层析纯化
纯化***:QuickSep中压层析***;
层析柱:100mm×500mm,填料体积2L。
取制备的利拉鲁肽混合物料液17L,加入4.25L异丙醇,用盐酸(6mol/L)调节pH值7.0,将其上样至用5L平衡溶剂(其含有20mmol/L Tris、20%v/v异丙醇,pH7.0)平衡的层析柱中,用3L平衡溶剂平衡层析柱,用洗脱溶剂(含有20mmol/L Tris、40%v/v异丙醇、pH7.0)进行洗脱,洗脱流速为40cm/h,压力为10bar,在紫外280nm条件下,当UV值上升时开始收集含利拉鲁肽的组分,收集体积为2.5L。图2为纯化过程的色谱图,图3为收集组分的HPLC检测图谱,利拉鲁肽纯度为73.28%,收集组分澄清度和粘度明显改善,大部分的亲水性杂质和疏水性杂质被分离,利拉鲁肽的回收率为82.87%。
(2)pH值实验
取步骤(1)中的Uni NM100收集液,用NaOH溶液调节pH值为9.0、10.0、10.5,并在2~8℃下保存48小时后进行HPLC检测,检测结果如表4所示:
表4
可见当pH值在10.0以上时,利拉鲁肽发生降解,疏水性杂质明显增长。因此,层析pH值控制在9.0以下可避免利拉鲁肽的降解。
实施例3
纯化***:QuickSep中压层析***;
层析柱:100mm×500mm,填料体积2L。
取制备的利拉鲁肽混合物料液17L,加入4.25L异丙醇,用盐酸调节pH值为7.5,将其上样至用5L平衡溶剂(其含有20mmol/L Tris、20%v/v异丙醇,pH7.5)平衡的层析柱中,用3L平衡溶剂平衡层析柱,用洗脱溶剂(含有20mmol/L Tris、60%v/v异丙醇、pH7.5)进行洗脱,洗脱流速为50cm/h,压力为5bar,在紫外280nm条件下,当UV值上升时开始收集含利拉鲁肽的组分,收集体积为4L。图7为纯化过程的色谱图,图8为收集组分的HPLC检测图谱,利拉鲁肽纯度为66.30%。纯化上样过程中有较大的穿透峰为混合中的大分子物质,收集组分溶液澄清度和粘度明显改善,大部分的亲水性杂质和疏水性杂质明显减少,收集组分中利拉鲁肽的回收率为95.87%。
实施例4
纯化***:QuickSep中压层析***;
层析柱:100mm×500mm,填料体积2L;
取实施例3中的收集液3L,加入6L纯化水稀释后,直接上样至用5L平衡溶剂(其含有20mmol/L Tris、20%v/v异丙醇,pH7.5)平衡的层析柱中,用3L平衡溶剂平衡层析柱,用洗脱溶剂(含20mM Tris、40%异丙醇,pH7.5)洗脱,洗脱流速为50cm/h,洗脱压力为20bar,在紫外280nm条件下,当UV值上升时开始收集含利拉鲁肽的组分,当吸收值下降至半峰高时停止收集。该步骤采用较小粒径的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(PS-DVB)色谱材料进行高度纯化,图9为收集组分的HPLC检测图谱,利拉鲁肽的纯度为98.47%,纯度优于利拉鲁肽注射液(诺和力),该步骤利拉鲁肽的收率为91.62%。
实施例5
纯化***:QuickSep中压层析***;
层析柱:100mm×500mm,填料体积2L。
取实施例2中的收集液2.5L,加入2.5L纯化水稀释,用磷酸调节pH至6.0,上样至用5L A液(含50mmol/L磷酸氢二钠、20%v/v异丙醇,pH6.0)平衡的层析柱中,用3L A液平衡层析柱,用各10L A液和B液(含50mmol/L磷酸氢二钠、30%v/v异丙醇,pH6.0)以线性梯度方式,从0~100%B进行梯度洗脱,洗脱流速为50cm/h,工作压力为15bar,大约梯度至5cv(10L)时,在紫外280nm条件下,当UV值上升时开始分段收集含利拉鲁肽的组分,每段400ml,当UV吸收值下降至半峰高时停止收集,各组分的纯度检测结果如表5所示:
表5
组分 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
纯度(%) | 93.75 | 95.63 | 97.12 | 97.56 | 97.66 | 97.84 |
组分 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
纯度(%) | 97.93 | 98.00 | 98.05 | 97.76 | 93.18 | 77.64 |
该步骤采用较小粒径的甲基丙烯酸酯(PMMA)色谱材料进行高度纯化,图10为收集组分4~10混合的HPLC检测图谱,利拉鲁肽的纯度为97.89%,纯度优于利拉鲁肽注射液(诺和力,见图11),该步骤利拉鲁肽的收率为88.92%。
实施例6
纯化***:QuickSep中压层析***;
层析柱:25mm×200mm。
将纳微UniPS30填料填装至层析柱,填装体积为50ml。
柱效测试方法:用2CV(柱体积)20%v/v异丙醇平衡层析柱,往0.5ml 20%v/v异丙醇中加入5μl丙酮,混匀后注入层析中,在紫外280nm条件下,用20%v/v异丙醇冲洗至吸收峰出峰完全,测试初始柱效为5274。
取制备的利拉鲁肽混合物料液350ml(制备方法参照中国专利CN107881187A实施例6),加入100ml异丙醇,用盐酸(6mol/L)调节pH值7.5,将其上样至用200ml平衡溶剂(其含有20mmol/L Tris、20%v/v异丙醇,pH7.5)平衡的层析柱中,用100ml平衡溶剂平衡层析柱,用洗脱溶剂(含有20mmol/L Tris、40%v/v异丙醇、pH7.5)进行洗脱,洗脱流速为30cm/h,压力为15bar,在紫外280nm条件下,当UV值上升时开始收集含利拉鲁肽的组分,收集完成后用80%异丙醇进行层析柱再生,再用甲苯进行柱效测试并记录柱效;按照此方法重复5批次实验,实验结果如表6所示:
表6
实验次序 | 收集组分纯度(%) | 收率(%) | 柱效 | 附图 |
1 | 97.14 | 72.68 | 2376 | 图12 |
2 | 95.81 | 62.80 | 2048 | 图13 |
3 | 95.46 | 55.36 | 1853 | 图14 |
4 | 94.85 | 47.52 | 1539 | 图15 |
5 | 95.05 | 40.96 | 1284 | 图16 |
可见,直接采用小粒径的层析填料进行利拉鲁肽混合物料液的纯化,层析柱柱效下降明显,从而导致收率大幅度降低,纯化效果较差。
实施例7
纯化***:QuickSep中压层析***;
层析柱:25mm×200mm。
(1)将层析填料纳微Uni NM200填装至层析柱,填装体积为50ml。
柱效测试方法:参照实施例6进行,初始柱效为4859。
取制备的利拉鲁肽混合物料液350ml(制备方法参照中国专利CN107881187A实施例6),加入100ml异丙醇,用盐酸(6mol/L)调节pH值7.5,将其上样至用200ml平衡溶剂(其含有20mmol/L Tris、20%v/v异丙醇,pH7.5)平衡的层析柱中,用100ml平衡溶剂平衡层析柱,用洗脱溶剂(含有20mmol/L Tris、60%v/v异丙醇、pH7.5)进行洗脱,洗脱流速为30cm/h,压力为10bar,在紫外280nm条件下,当UV值上升时开始收集含利拉鲁肽的组分,收集完成后用80%异丙醇进行层析柱再生,再用甲苯进行柱效测试并记录柱效;按照此方法重复5批次实验,实验结果如表7所示:
表7
实验序号 | 收集组分纯度(%) | 收率(%) | 柱效 | 附图 |
7-1-1 | 70.85 | 95.32 | 4768 | 图17 |
7-1-2 | 72.34 | 94.08 | 4700 | 图18 |
7-1-3 | 71.88 | 94.26 | 4725 | 图19 |
7-1-4 | 69.96 | 93.57 | 4679 | 图20 |
7-1-5 | 70.36 | 94.09 | 4650 | 图21 |
(2)将纳微UniPS30填料填装至层析柱,填装体积为50ml。
柱效测试方法:参照实施例6进行,初始柱效为5305。
取(1)中的收集液加入2倍体积纯化水稀释,将其上样至用200ml平衡溶剂(其含有20mmol/L Tris、20%v/v异丙醇,pH7.5)平衡的层析柱中,用100ml平衡溶剂平衡层析柱,用洗脱溶剂(含有20mmol/L Tris、40%v/v异丙醇、pH7.5)进行洗脱,洗脱流速为30cm/h,压力为15bar,在紫外280nm条件下,当UV值上升时开始收集含利拉鲁肽的组分,收集完成后用80%异丙醇进行层析柱再生,再用甲苯进行柱效测试并记录柱效;按照此方法重复5批次实验,实验结果如表8所示:
表8
实验次序 | 收集组分纯度(%) | 收率(%) | 柱效 | 附图 |
7-2-1 | 98.25 | 91.86 | 5189 | 图22 |
7-2-2 | 98.37 | 92.31 | 5109 | 图23 |
7-2-3 | 97.84 | 90.64 | 5143 | 图24 |
7-2-4 | 97.80 | 90.28 | 4972 | 图25 |
7-2-5 | 98.40 | 90.57 | 5061 | 图26 |
可见,先采用大粒径的层析填料进行目标蛋白捕获,除去利拉鲁肽混合物料液中的细胞碎片、宿主细胞蛋白、核酸以及多糖等大分子杂质,料液的粘度和澄清度得到大幅度改善;然后采用小粒径填料进行高度纯化,这样的组合方式能够获得很好的纯化效果,并且大幅度延长了层析填料的使用寿命。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种利拉鲁肽的纯化方法,其特征在于步骤如下:利用中低压反相色谱层析***对含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液进行初纯和精纯,获得目的蛋白利拉鲁肽;其中,固定相为有机聚合物反相色谱材料,用于洗脱的流动相包含至少一种能与水混溶的有机溶剂和至少一种pH缓冲物质,pH值为6~9;
所述的含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液是大肠杆菌表达得到的利拉鲁肽融合蛋白包涵体,在变性溶液充分溶解变性,并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物后直接修饰酶切得到;
所述的利用中低压反相色谱层析***对含有利拉鲁肽的混合物进行分离,具体包括如下步骤:
(A)利用中低压反相色谱层析***,固定相采用粒径为100~200μm的有机聚合物反相色谱材料进行粗纯化;
(B)利用中低压反相色谱层析***,固定相采用粒径为30~50μm的有机聚合物反相色谱材料进行高度纯化;
所述的中低压反相色谱层析***的工作压力为5~20bar;
所述的能与水混溶的有机溶剂为异丙醇;
所述的能与水混溶的有机溶剂在所述的流动相中的浓度为体积百分比30~60%;
所述的pH缓冲物质为磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和三羟甲基氨基甲烷中的一种或至少两种;
所述的洗脱的流速为30~50cm/h;
所述的有机聚合物反相色谱材料为苯乙烯、二乙烯基苯和甲基丙烯酸酯中的一种的聚合物或其中至少两种形成的共聚物。
2.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的纯化方法,其特征在于:所述的含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液通过包括如下步骤的方法制备得到:
(1)将具有利拉鲁肽融合基因的大肠杆菌工程菌株进行发酵,诱导,提取含有利拉鲁肽融合蛋白的包涵体;其中,利拉鲁肽融合基因具有形如A-B-C结构的基因序列,其中A为分子伴侣蛋白编码基因,B为连接肽编码基因,C为Arg34-GLP-1(7-37)片段编码基因;
(2)将步骤(1)中获得的含有利拉鲁肽融合蛋白的包涵体在变性溶液充分溶解变性,并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物,得到反应体系,反应,使融合蛋白与脂肪酸活化物酰化连接;
(3)待步骤(2)反应完成后加入工具酶,得到酶切体系;酶切,得到含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液。
3.根据权利要求2所述的利拉鲁肽的纯化方法,其特征在于:
所述的利拉鲁肽融合蛋白是从N端到C端,分子伴侣蛋白、连接肽及Arg34-GLP-1(7-37)片段依次连接得到的蛋白;
所述的分子伴侣蛋白为KSI、PagP或TrxA蛋白;
所述的连接肽为如X1…XnK所示的肽序列,X为D或者E,n表示氨基酸X的数目,为2至4的整数;
所述的分子伴侣蛋白、连接肽及 Arg34-GLP-1(7-37)各片段之间通过酰胺键相连;
步骤(2)中所述的变性溶液为尿素、盐酸胍和SDS中的至少一种;
所述的变性溶液的浓度为4~8M;
步骤(2)中所述的有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或至少两种;
所述的有机溶剂的用量按其在反应体系中的浓度为体积百分比为5~50%计算;
步骤(2)中所述的缚酸剂选自三乙胺,N,N-二异丙基乙胺和吡啶中的至少一种;
所述的缚酸剂的加入量应能够使反应体系的pH值达到8.0~12.0计算;
步骤(2)中所述的脂肪酸活化物选自Nα-十六酰基-Glu(ONSu)-OBut或Nα-十六酰基-Glu(ONSu)-OH,其用量按融合蛋白量进行计算,蛋白:脂肪酸活化物的摩尔比例为1:1~10;
步骤(3)中所述的工具酶为赖氨酰特异性内切酶;
所述的赖氨酰特异性内切酶的加入按包涵体中融合蛋白总量计算,1g融合蛋白加入2.5~20IU赖氨酰特异性内切酶;
步骤(3)中所述的酶切的条件为pH8.0~10.5。
4.权利要求1~3任一项所述的利拉鲁肽的纯化方法在工业化制备利拉鲁肽中的应用。
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