JP2003500633A - 溶出ステップにおける有機モディファイアでのタンパク質及びペプチドのイオン交換クロマトグラフィー - Google Patents
溶出ステップにおける有機モディファイアでのタンパク質及びペプチドのイオン交換クロマトグラフィーInfo
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Abstract
Description
ためのイオン交換クロマトグラフィー法、及びこのようなイオン交換クロマトグ
ラフィー法を含む工業的方法に関する。 背景 タンパク質及びペプチドの精製及び分析のために、クロマトグラフィーは公知
であり、広く用いられる方法である。いくつかの異なるクロマトグラフィー原理
が適用されており、これらの中に、イオン交換クロマトグラフィー(IEC)が
ある。IECの原理には、2つの異なるアプローチ:イオン交換樹脂上のリガン
ドの電荷によりアニオン交換及びカチオン交換がある。慣用的なIEC精製法は
、通常、1又は複数のもの:平衡化セクション、適用又はローディングセクショ
ン、洗浄セクション、溶出セクション、及び再生セクションがある(cf. Reming
ton's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton
, PA, 1990又はRemington : The Science and Practice of Pharmacy 19th Edit
ion (1995))。
配としての、一定pHでの水性緩衝溶液中の塩成分勾配である(cf. S. Biorn and
L. Thim, Activation of Coagulation Factor VII to VIIa, Res. Discl. No.
269, 564〜565, 1986)。無勾配溶出が可能であるが、めったに用いられない。要
求される形態に又は溶液中にタンパク質又はペプチドを維持するために、その溶
液に有機溶媒又はモディファイアが時折、添加されている(cf. K.H. Jorgensen
, Process for Purifying Insulin, US Patent No. 3,907,676, Sept. 23, 1975
; and J. Brange, O. Hallund and E. Sorensen, Chemical Stability of Insul
in 5. Isolation, Characterisation and Identification of Insulin Transfor
mation Products, Acta Pharm. Nord. 4(4), 223-232, 1992) 。また、標的タン
パク質を溶出するためpHの変化を時折、用いることができる(cf. J. Lamy, J.
Lamy, J. Weill, Arch. Biochem. Biophys. 193, 140-149, 1979)。 発明の記載 1又は複数の平衡化ステップ、適用又はローディングステップ、洗浄ステップ
、溶出ステップ、及び再生ステップからなるいずれかのタンパク質又はペプチド
の精製のための上述のIEC技術と対照的に、本発明は、有機モディファイアを
含む溶液中の溶出の、次の同じ又は異なるpHでの水溶液中での溶出、任意に次の
再生ステップの組合せである新規溶出技術に関する。平衡化溶液及び適用のため
のサンプルは、有機モディファイアを含んでも含まなくてもよい。ペプチドの溶
出は(有機モディファイアを含まない溶液中の)非変性条件で行う。更に、ペプ
チドの溶出は単一ピークで行う。
合物からペプチドを精製するためのカチオン交換クロマトグラフィー法であって
、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中
で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の
局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実
効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意
に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出するこ
と を含む方法に関する。
からペプチドを精製するためのカチオン交換クロマトグラフィー法であって、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又
は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプ
チドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチ
ドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩
衝液で任意に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出するこ
と を含む方法に関する。
からペプチドを精製するためのアニオン交換クロマトグラフィー法であって、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中
で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の
局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実
効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意
に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出するこ
と を含む方法に関する。
からペプチドを精製するためのアニオン交換クロマトグラフィー法であって、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又
は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプ
チドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチ
ドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩
衝液で任意に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出するこ
と を含む方法に関する。
ステップも考慮することができる。
)非変性条件で行う。これにより、そのペプチドは、水及び任意に塩成分、酸又
は塩基、及び/又は緩衝液を含むが、有機モディファイアの存在しない水溶液に
溶出される。
トベースで、1:99〜99:1、例えば1:99〜80:20、20:80〜
80:20、30:70〜70:30、35:50〜50:35、又は40:5
0〜50:40である。これらの範囲の各々が本発明の別の実施形態を構成する
。
ール、C1-6 −アルケノール又はC1-6 −アルキノール、尿素、グアニジン、又
はC1-6 −アルカン酸(alkanoic acid)、例えば酢酸、C2-6 −グリコール、C 3-7 −ポリアルコール含有糖、好ましくは、C1-6 −アルカノール及びC2-6 −
グリコール、より好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール及びブタノ
ール及びヘキシルグリコール最も好ましくはエタノール及び2−プロパノールか
ら選択される。これらの有機モディファイアの各々は本発明の別の実施形態を構
成する。
は無機塩及びそれらの混合物、好ましくはNaCl,KCl,NH4 Cl,Ca
Cl2 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウ
ム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム
、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はそれらの混合物、最も好ましくは酢酸
ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、NaCl,NH4 Cl,KCl
から選択される。これらの塩成分の各々は、本発明の別の実施形態を構成する。
成分のステップ勾配である。
〜3000mmol/kg、好ましくは1mmol/kg〜1000mmol/kg、より好ましく
は5mmol/kg〜500mmol/kg、最も好ましくは20mmol/kg〜300mmol/kg
の範囲から選択されるステップ濃度で存在する。これらの範囲の各々が本発明の
別の実施形態を構成する。
勾配である。
〜3000mmol/kg、好ましくは1mmol/kg〜1000mmol/kg、より好ましく
は5mmol/kg〜500mmol/kg、最も好ましくは20mmol/kg〜300mmol/kg
から選択される直線濃度で存在する。これらの直線濃度の各々は本発明の別の実
施形態を構成する。
又は無機塩、好ましくはNaCl,KCl,NH4 Cl,CaCl2 、酢酸ナト
リウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリ
ウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウ
ム、酢酸カルシウム又はそれらの混合物、最も好ましくは酢酸ナトリウム、酢酸
カリウム、酢酸アンモニウム、NaCl,NH4 Cl,KClから選択される。
これらの塩成分の各々が本発明の別の実施形態を構成する。
〜3000mmol/kg、好ましくは1mmol/kg〜1000mmol/kg、より好ましく
は5mmol/kg〜500mmol/kg、最も好ましくは20mmol/kg〜300mmol/kg
の範囲から選択される濃度で存在する。これらの範囲の各々が本発明の別の実施
形態を構成する。
て、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、乳酸緩衝液
、グリシルグリシン緩衝液、アルギニン緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、グル
タミン酸緩衝液、アンモニウム緩衝液、グリシン緩衝液、アルキルアミン緩衝液
、アミノエチルアルコール緩衝液、エチレンジアミン緩衝液、トリエタノールア
ミン、イミダゾール緩衝液、ピリジン緩衝液及びバルビツール酸緩衝液並びにそ
れらの混合物、好ましくはクエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、
リン酸、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、炭酸ナトリウム、
クエン酸カリウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、炭酸カリウム、
トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン及びホウ酸並びにそれらの混合物から選
択される。これらの緩衝液の各々が本発明の別の実施形態を構成する。
〜500mmol/kg、好ましくは1mmol/kg〜200mmol/kg、より好ましくは5
mmol/kg〜100mmol/kg、最も好ましくは10mmol/kg〜50mmol/kgの範囲
から選択される濃度で存在する。これらの範囲の各々が本発明の別の実施形態を
構成する。
〜1000mmol/kg、好ましくは1mmol/kg〜400mmol/kg、最も好ましくは
50mmol/kg〜200mmol/kgの範囲から選択される濃度で存在する。これらの
範囲の各々が本発明の別の実施形態を構成する。
リゴペプチド、タンパク質、レセプター、vira、並びにそれらの相同体、ア
ナログ及び誘導体、好ましくはグルカゴン、hGH、インスリン、アプロチニン
、第VII 因子、TPA、第 VIIa因子、FFR−第VII 因子、ヘパリナーゼ、A
CTH、ヘパリン結合タンパク質、コルチコトロピン放出因子、アンギオテンシ
ン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン様ペプチド−1、グルカゴン様ペプ
チド−2、インスリン様成長因子−1、インスリン様成長因子−2、繊維芽細胞
成長因子、胃抑制ペプチド、成長ホルモン放出因子、下垂体アデニル酸シクラー
ゼ活性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマト
トロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリトロポエ
チン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン
、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド、DPPIV、
インターロイキン、イムノグロブリン、補体インヒビター、セルピンプロテアー
ゼインヒビター、サイトカイン、サイトカインレセプター、PDGF、腫瘍壊死
因子、腫瘍壊死因子レセプター、成長因子並びにそれらのアナログ及び誘導体、
より好ましくはグルカゴン、hGH、インスリン、アプロチニン、第VII 因子、
第 VIIa因子、FFR−第 VIIa因子、ヘパリナーゼ、グルカゴン様ペプチド−
1、グルカゴン様ペプチド−2並びにそれらのアナログ及び誘導体、例えばVa
l8 GLP−1(7−37),Thr8 GLP−1(7−37),Met8 GL
P−1(7−37),Gly8 GLP−1(7−37),Val8 GLP−1(
7−36)アミド、Thr8 GLP−1(7−36)アミド、Met8 GLP−
1(7−36)アミド、Gly8 GLP−1(7−36)アミド、Arg34GL
P−1(7-37)、ヒトインスリン、及びB28IsoAspインスリンから選択さ
れる。これらのペプチドの各々が本発明の別の実施形態を構成する。
電荷を有し、これにより、カチオン交換について、有機溶媒又はモディファイア
での洗浄又は溶出セクションをpH6.5未満で行って、ヒスチジンを失ったトラ
ンケートされた形態を除去することができ、そして次に水性溶媒中の標的タンパ
ク質又はペプチドの溶出をpH6.5超で行うことができる。第2の例として、C
末端アミノ酸のカルボキシル基はpH約3.1超や支配的な負の実効電荷を有し、
これにより、アニオン交換について、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、
pH3.1超で行ってアミドに伸びた形態を除去することができ、そして次に、水
性溶媒中の標的タンパク質又はペプチドの溶出はpH3.1超又はそれ未満の両方
で行うことができる。第3の例として、アスパラギン酸はpH約4.4超で支配的
な負の実効電荷を有し、これにより、アニオン交換のために、有機溶媒での洗浄
又は溶出は、pH4.4超で行って、アスパラギン酸を失ったトランケートされた
形態を除去することができ、そして次に、水性溶媒中の標的タンパク質又はペプ
チドの溶出はpH4.4未満で行うことができる。第4の例として、グルタミン酸
はpH約4.4超で支配的な負の実効電荷を有し、これにより、アニオン交換のた
めに、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH4.4超で行って、グルタミ
ン酸を失ったトランケートされた形態を除去することができ、そして次に、水性
溶媒中の標的タンパク質又はペプチドの溶出はpH4.4未満で行うことができる
。第5の例として、γ−カルボキシグルタミン酸はpH約4.4超で支配的な負の
実効電荷を有し、アニオン交換のために、有機溶媒での洗浄又は溶出セクション
は、pH4.4超で行って特定のグルタミン酸残基の1又は複数のγ−カルボキシ
ル基を失った形態を除去して、そして次に水性溶媒中の標的タンパク質又はペプ
チドの溶出をpH4.4未満で行うことができる。第6の例として、N末端アミノ
酸のアミノ基はpH約8.0未満で支配的な正の実効電荷を有し、これにより、カ
チオン交換について、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH8.0未満で
行って、アシル基が伸びた形態を除去し、そして次に水性溶媒での標的タンパク
質又はペプチドの溶出は、pH8.0超又はそれ未満の両方で行うことができる。
第7の例として、システインはpH約8.5超で支配的な負の実効電荷を有し、こ
れにより、アニオン交換について、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH
8.5超で行って、遊離システイン残基を生ずるほとんど折りたたまれていない
形態を除去することができ、そして次に、水性溶媒中の標的タンパク質又はペプ
チドの溶出は、pH8.5未満で行うことができる。第8の例として、チロシンは
pH約10.0超で支配的な負の実効電荷を有し、これにより、アニオン交換につ
いて、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH10.0超で行って、チロシ
ン残基を失ったトランケート化形態を除去することができ、そして次に、水性溶
媒中の標的タンパク質又はペプチド溶出はpH10.0未満で行うことができる。
第9の例として、リシンはpH約10.0未満で支配的な正の実効電荷を有し、こ
れにより、カチオン交換について、有機溶媒での洗浄又は溶出セクションは、pH
10.0未満で行って、リシン残基の側鎖中がアシル化された形態を除去し、そ
して次に水性溶媒中の標的タンパク質又はペプチドの溶出はpH10.0超又はそ
れ未満で行うことができる。第10の例として、アルギニンはpH約12.0未満
で支配的な正の実効電荷を有し、これにより、アニオン交換について、有機溶媒
での洗浄又は溶出セクションは、pH12.0未満で行って、アルギニン残基を失
ったトランケート化形態を除去することができ、そして次に水性溶媒中の標的タ
ンパク質又はペプチドの溶出は、pH12.0超で行うことができる(これらの例
に用いるpKA 値は、L. Stryer. Biochemistry, 3rd edition, W.H. Freeman a
nd Company, New York, Table 2-1, page 21からのものである)。
Arg34GLP−1(7-37)及びArg34GLP−1(9-37)、アニオン交換クロマ
トグラフィーによるヒトインスリン及びB30ヒトインスリンエチルエステル、
アニオン交換クロマトグラフィーによるB28IsoAspインスリン及びDe
sB23−30インスリン、アニオン交換クロマトグラフィーによるプロトロン
ビン及びdes−γ−カルボキシ−Glyプロトロンビン、アニオン交換クロマ
トグラフィーによるArg34GLP−1(7-37)及びArg34GLP−1(10-37)
、カチオン交換クロマトグラフィーによるLysB29 −(N−ε(α−テトラデ
カノイル))−desB30インスリン及びDesB30インスリン、カチオン
交換クロマトグラフィーによるLysB29 −(N−ε(α−テトラデカノイル)
)−desB30インスリン及びLysB29 −(N−ε(α−テトラデカノイル
))−Al−(N−ε−(α−テトラデカノイル))−desB30インスリン
、カチオン交換クロマトグラフィーによるアプロチニン及びDes−Arg−P
ro−アプロチニン、並びにアニオン交換クロマトグラフィーによるグルカゴン (1−29) 及びグルカゴン(6-29)の分離である。
プチドの発現を許容する条件下で好適な栄養培地中でそのペプチドを発現するこ
とができる宿主細胞を培養し又は発酵させることを含む方法により生産すること
ができ、その後、得られたペプチドはその培養又は発酵ブロスから回収される。
以後、培養は、培養及び発酵等;両方を含むものとして用いられよう。
の慣用的な培地、例えば好適なサプリメントを含む最小又は複合培地であってよ
い。好適な培地は、商業的供給元から利用でき、又は公開されている方法(例え
ばAmerican Type Culture Collectionのカタログ)に従って調製することができ
る。細胞により生産されたペプチドは、次に、任意に細胞を溶解し、遠心又はろ
過により培地から宿主細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムを用いて上清
又はろ液のタンパク質成分を沈殿させ、慣用的な精製技術、例えばクロマトグラ
フィー技術により精製し、必要に応じて本発明によるイオン交換クロマトグラフ
ィーにより精製し、そして次に、分析テスト、例えばPAGE,IEFにかけ、
必要に応じて更なる精製にかけ、そして必要に応じて純粋なペプチドを単離する
ことを含む慣用的な手順により培養培地から回収することができる。
トグラフィーによる精製の前に、ペプチド及び関連する不純物を含む混合物は、
任意に、慣用的な技術により、例えばアルキル化、アシル化、エステル形成又は
アミド形成等により化学的に修飾することができる。
もの、例えばゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、標準的技術に従って合
成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによりペプチド
の全部又は一部をコードするDNA配列についてスクリーニングすることにより
得られるものであり得る(例えば、Sambrook, J. Fritsch, EF and Maniatis, T
. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York, 1989を参照のこと)。そのペプチドをコードするDNA配列
は、確立された標準的な方法、例えばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Le
tters 22 (1981), 1859〜1869 により記載されるホスホアミジト法、又はMatthe
s et al., EMBO Journal 3 (1984), 801〜805 により記載される方法により合成
により調製することもできる。そのDNA配列は、例えばUS4,683,20
2又はSaiki et al., Science 239 (1988), 487〜491に記載されるように、特定
のプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応により調製することもできる。
には、組換えDNA法にかけられ、そしてベクターの選択は、しばしば、導入す
べき宿主細胞に依存するであろう。これにより、本ベクターは、自己複製ベクタ
ー、即ち染色体外存在物として存在するベクターであって、その複製が染色体複
製と独立しているもの、例えばプラスミドであり得る。あるいは、ベクターは、
宿主細胞に導入した時に、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染
色体と一緒に複製するものであってもよい。
ために要求される更なるセグメント、例えばプロモーターに作用可能にリンクし
ている発現ベクターである。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写
活性を示すいずれのDNA配列であってもよく、宿主細胞に対して同種又は異種
のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から得ることができる。種々の宿主
細胞において本発明のペプチドをコードするDNAの転写を指示するための好適
なプロモーターの例は当業界、例えばSambrook et al.,前掲において公知である
。
リアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、及び翻訳エンハンサー配列に作
用可能に接続される。本発明の組換えベクターは、ベクターが問題の宿主細胞内
で複製するのを可能にするDNA配列を更に含み得る。
子又は薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラン
フェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートに対する耐
性を与えるものも含み得る。
ロ配列又はプレ配列としても知られる)分泌シグナル配列を組換えベクターに供
することができる。分泌シグナル配列は正確な読み枠内でペプチドをコードする
DNA配列に連結される。分泌シグナル配列はそのペプチドをコードするDNA
配列の5′に共通して位置する。分泌シグナル配列は、そのペプチドに通常、関
連するものであっても、別の分泌されるタンパク質をコードする遺伝子からのも
のであってもよい。
ー及び/又は分泌シグナル配列各々を連結するため、並びに複製のために必要な
情報を含む好適なベクターにそれらを挿入するために用いる手順は当業者に公知
である(例えばSambrook et al.,前掲)。
ことができるいずれの宿主細胞であってもよく、細菌、vira、例えばバキュ
ロウィルス、イースト、真菌、昆虫細胞及び高等真核細胞がある。公知であり、
当業界で用いられている好適な宿主細胞の例は、これらに限らないが、大腸菌、
サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae) 、又は哺乳動物
BHK又はCHO細胞系である。
に従って生産することができる。次に、得られた合成混合物は、例えばアルキル
化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等により、化学的に修飾して精製し
、又はそれ自体として精製してから上述の通り化学的に修飾することができる。
gen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2412〜2416に記載されるような
、又は欧州特許第200.421号(Zymo Genetics)に記載されるような、DN
A組換え技術によって作られる。組換え技術により生産された第 VIIa因子は、
真の第 VIIa因子又は多少改変された第 VIIa因子であり得る。但し、このよう
な第 VIIa因子は、真の第 VIIa因子と実質的に同じ血液凝固についての生物活
性を有する。このような改変された第 VIIa因子は、既知の手段により、例えば
部位特異的変異誘発により天然のFVII をコードする核酸内のアミノ酸コドンを
変化させることにより、又はアミノ酸コドンのいくつかの除去により、第VII 因
子をコードする核酸配列を改変することにより生産することができる。
80及びHedner and Kisiel, J. Clin. Invest 71 : 1836〜1841, 1983に記載され
る方法によっても生産することができる。これらの方法は、検出可能な量の他の
血液凝固因子なしに第VII 因子を作り出す。なお更に精製された第VII 因子調製
物は、最終精製ステップとして更なるゲルろ過を含めることにより得ることがで
きる。次に、第VII 因子は、既知の手段により、例えばいくつかの異なる血漿タ
ンパク質、例えば第XIIa,IXa又はXa因子により活性化FVIIa に変換さ
れる。あるいは、Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 September 1986,
pp. 564〜565)に記載されるように、第VII 因子は、それを、イオン交換クロマ
トグラフィーカラム、例えばMono Q(登録商標)(Pharmacia fine Chemica
ls)等に流すことにより活性化することができる。
産のためのポリ核酸及び哺乳動物細胞系、並びに血液凝固を阻害するための改変
第 VIIa因子を含む組成物に関する。
glaドメイン、並びにglaドメインのない第VII 因子タンパク質を各々コー
ドする2つの作用可能にリンクした配列コーティング領域を含むポリヌクレオチ
ド分子によりコードされ得る。発現に基づき、そのポリヌクレオチドは血漿第X
又はIX因子を有意に活性化せず、組織因子に結合することができない改変第VI
I 因子をコードする。
ることができる。誘導化は、第VII 因子を、不可逆的インヒビター、例えば有機
リン化合物、スルホニルフルオライド、ペプチドハロメチルケトンもしくはアザ
ペプチドと反応させることにより、又は例えばアシル化により行うことができる
。好ましいペプチドハロメチルケトンには、PPACKCD−Phe−Pro−
Argクロロメチル−ケトン;引用により本明細書に組み込まれる米国特許第4
,318,904号を参照のこと)、D−Phe−Phe−Arg及びPhe−
Phe−Argクロロメチルケトン(FFR−cmk);及びDEGRck(ダ
ンシル−Glu−Gly−Argクロロメチルケトン)がある。
も阻害することができる。好ましい実施形態において、アミノ酸置換は、第 VII
a因子触媒部位に寄与するアミノ酸を含む領域として本明細書で定義される第VI
I 因子触媒3つ組のアミノ酸配列内に行われる。触媒3つ組内の置換、挿入又は
欠失は、一般に、触媒部位を形成するアミノ酸で、又はそれに隣接する。ヒト及
びウシ第VII 因子において、触媒“3つ組”を形成するアミノ酸は、Ser344
,Asp242 、及びHis193 (添字のナンバリングは配列中の位置を示す)。
他の哺乳動物種からの第VII 因子中の触媒部位は、とりわけ、タンパク質単離及
びアミノ酸分析を含む現在利用できる技術を用いて決定することができる。触媒
部位は、配列を他のセリンプロテアーゼ、特にその活性部位が先に決定されてい
る引用により本明細書に組み込まれるSigler et al., J. Mol. Biol., 35 : 143
〜164 (1968)キモトリプシンの配列とアラインすることによって決定することも
でき、そのアラインメントから類似活性部位残基を決定することからも決定する
ことができる。
る。このような置換は、別個に、又はHis193 及びAsp242 を含む触媒3つ
組内の他の部位の置換と組み合わせて行うことができよう。
内のSer344 ,Asp242 、及びHis193 は、置換されても削除されてもよ
い。本発明において、単一のアミノ酸のみを変化させ、これにより分子の抗原性
を増加させ又は組織因子に結合する能力を阻害する可能性を最小にすることが好
ましいが、2又はそれ超のアミノ酸変換(置換、付加又は欠失)を行うことがで
き、そして置換、付加及び削除の組合せも行うことができる。ヒト及びウシ第VI
I 因子のための好ましい実子形態において、Ser344 は、好ましくはAlaで
置換されるが、Gly,Met,Thr又は他のアミノ酸を置換することもでき
る。AspをGluで置換し、そしてHisをLys又はArgで置換すること
が好ましい。一般に、置換は、出来る限りタンパク質3次構造を破壊しないよう
選択される。引用により本明細書に組み込まれるDayhoff et al.のモデル(Atla
s of Protein Structure 1978, Nat'l Biomed. Res. Found., Washington, D.C.
)は、他のアミノ酸置換を選択することにおいてガイドとして用いることができ
る。ヒト、ウシ又は他の種の好適な第VII 因子配列の触媒部位に上述の残基変化
を導入し、得られたタンパク質を、触媒活性の阻害の要求されるレベル及び本明
細書に記載されるような生ずる抗凝固活性についてテストすることができる。改
変された第VII 因子について、その触媒活性は、一般に、対応する種の野生型第
VII 因子の触媒活性の約5%未満、より好ましくは約1%未満、実質的に阻害さ
れよう。
きる。
は、部位特異的変異誘発によるものであってよい。部位特異的変異誘発のための
技術は当業界で公知であり、例えばZoller and Smith (DNA 3 : 479〜488, 1984
)に記載される。これにより、第VII 因子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を用
いて、選択された変化を導入することができる。改変された第FVIIa 因子は、
化学的方法によって生産することもできる。 FFR−FVIIa(即ちD−Phe−Phe−Arg−FVIIa)FFRクロロメチルケトンの例 FFRクロロメチルケトンでのFVIIa の活性部位の遮断 クロロメチルケトンでの活性部位セリン及びヒスチジンの遮断は、セリンプロ
テアーゼの不可逆的不活性化のための公知の方法である。所定のプロテアーゼの
遮断を最適化するために、その活性部位と迅速なオン・レートで特異的に反応す
るクロロメチルケトン誘導体を選択することが重要である。このような誘導体は
、問題の特定のセリンプロテアーゼの基質結合ポケットと相互作用するオリゴペ
プチドのクロロメチルケトン基への結合により開発することができる。
のダンシル誘導体、DEGK−ck)(S. Higashi, H. Nishimura, S. Fujii, K
Takada, S. Iwanaga, (1992) J. Biol. Chem. 267, 17990)又はプロリル−フェ
ニル−アルギニンクロロメチルケトン(PFR−ck)(J.H. Lawson, S. Buten
as, K. Mann, (1992), J. Biol. Chem. 267, 4834; J. Contrino, G.A. Hair, M
.A. Schmeizl, F.R. Rickles, D.L. Kreutzer (1994) Am. J. Pathol. 745, 131
5)がFVIIa の活性部位インヒビターとして適用されている。これらのクロロメ
チルケトンと比べてFFRckの適用は10〜70倍の比率の増加を示す。
及びペプチドマッピングにより検査した。それは、FVIIa がFFR−クロロメ
チルケトンと、1:1の比で、ヒスチジン193で誘導化された予想産物として
98%超を回収することができたことを示した。
s HCl、100mM NaCl、5mM CaCl2 、0.01% Tween
−80、pH7.4中でインキュベートした。サンプルを、示されるように種々の
時間間隔で採取し、1mM Ile−Pro−Arg−pNAを含む50mM Tr
is HCl、100mM NaCl、5mM CaCl2 、0.01% Twee
n−80、pH7.4中での活性測定のために20倍に希釈した。残存FVIIa 活
性を、405nmの吸光度の増加により測定した。
及び関連する不純物を含む混合物は、アミノ酸、小ペプチド、大ペプチド、未関
連タンパク質、反応物、細胞デブリス、HCP、エンドトキシン、及び/又はv
iraも、組換えDNA法及び/又は化学修飾法が用いられたか否か、又は有機
ペプチド合成化学法が用いられたか否かに依存して含むであろう。
、工業的方法のようないずれの方法も、本願の一態様である。
混合物からペプチドを精製するためのカチオン交換クロマトグラフィー法を含む
、純粋なペプチドを生産するための工業的方法であって、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又
は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプ
チドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチ
ドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩
衝液で任意に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出するこ
と を含む方法に関する。
任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で又は塩成分中で定組
成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的
又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷
より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持
したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出するこ
と を含むカチオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する
不純物を含む混合物からペプチドを精製し、 そして次に、必要に応じて、分析テスト及び/又は更なる精製にかけ、そして
慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること を含む方法に関する。
任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で又は塩成
分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが
正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正
の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で
任意に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出するこ
と を含むカチオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する
不純物を含む混合物からペプチドを精製し、 そして次に、必要に応じて、分析テスト及び/又は更なる精製にかけ、そして
慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること を含む方法に関する。
らペプチドを精製するためのアニオン交換クロマトグラフィー法を含む、純粋な
ペプチドを生産するための工業的方法であって、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又
は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプ
チドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチ
ドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩
衝液で任意に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出するこ
と を含む方法に関する。
、 a)混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び
任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で又は塩成分中で定組
成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的
又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷
より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持
したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出するこ
と を含むアニオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する
不純物を含む混合物からペプチドを精製し、 そして次に、必要に応じて、分析テスト及び/又は更なる精製にかけ、そして
慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること を含む方法に関する。
、 a)混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び
任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で又は塩成
分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが
負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負
の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で
任意に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出するこ
と を含むアニオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する
不純物を含む混合物からペプチドを精製し、 そして次に、必要に応じて、分析テスト及び/又は更なる精製にかけ、そして
慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること を含む方法に関する。
明の範囲に含まれる。
性である有機化合物又はそれらの混合物を含むことを意図し、そのモディファイ
アは、1又は複数の不要な関連する不純物及びペプチド並びにイオン交換体の間
の有利な及び変化した選択性を誘導する。選択されたモディファイアがこの選択
性を誘導するか否かは、通常、1又は複数の不純物に依存するであろうし、試行
錯誤によりテストすることができる。有機モディファイアには、これらに限らな
いが、C1-6 −アルカノール、C1-6 −アルケノール又はC1-6 −アルキノール
、尿素、グアニジン・HCl、又はC1-6 −アルカン酸(alkanoic acid)、例え
ば酢酸、C2-6 −グリコール、C3-7 −ポリアルコール含有糖、又はそれらの混
合物がある。
C1-6 −アルケノール”又は“C1-6 −アルキノール”は、ヒドロキシル(−O
H)が連結した直鎖、分枝鎖又は環形態の示される長さのC1-6 −アルカン、C 1-6 −アルケン又はC1-6 −アルキンを含むことを意図する(cf. Morrison & B
oyd, Organic Chemistry, 4th ed)。直鎖アルコールの例は、メタノール、エタ
ノール、n−プロパノール、アリルアルコール、n−ブタノール、n−ペンタノ
ール及びn−ヘキサノールである。分枝鎖アルコールの例は2−プロパノール及
びtert−ブチルアルコールである。環式アルコールの例はシクロプロピルア
ルコール及び2−シクロヘキセン−1−オールである。
R′は、H又はC1-5 アルキルである)の基、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸
、メチル酪酸又は吉草酸を含むことを意図する(cf. Morrison & Boyd, Organic
Chemistry, 4th ed.)。
枝鎖又は直鎖アルキル基を含むことを意図する。典型的なC1-5 −アルキル基に
は、これらに限らないが、メチル、エチル、n−プロピル、イソ−プロピル、ブ
チル、iso−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、iso
−ペンチル等がある(cf. Morrison & Boyd, Organic Chemistry, 4th ed.)。
異なる炭素原子上に2つのヒドロキシル基を含むC2-6 −アルカンを含むことを
意図する。典型的なC2-6 −グリコールには、これらに限らないが、1,2−エ
タンジオール、1,2−プロパンジオール、又は2−メチル−2,4−ペンタン
ジオールがある(cf. Morrison & Boyd, Organic Chemistry, 4th ed.)。
枝鎖又は直鎖アルカン基を含むことを意図する。典型的なC2-6 −アルカン基に
は、これらに限らないが、エタン、プロパン、iso−プロパン、ブタン、is
o−ブタン、ペンタン、ヘキサン等がある(cf. Morrison & Boyd, Organic Che
mistry, 4th ed.)。
(CHOH)n CH2 OH(式中、nは1〜5の整数である)の基、及びモノサ
ッカライド、例えばマンノース、グルコースを含むことを意図する(cf. Morris
on & Boyd, Organic Chemistry, 4th ed.)。
パク質、並びにそれらの相同体、アナログ及び誘導体を含むことを意図し、これ
らは、慣用的な組換えDNA技術及び慣用的な合成法により生産することができ
る。このようなペプチドには、これらに限らないが、グルカゴン、hGH、イン
スリン、アプロチニン、第VII 因子、TPA、第 VIIa因子(Novo Seven(登録
商標)、Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmarkから市販)、第 VIIai因子、
FFR−第 VIIa因子、ヘパリナーゼ、ACTH、コルチコトロピン放出因子、
アンギオテンシン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン様ペプチド−1、グ
ルカゴン様ペプチド−2、インスリン様成長因子−1、インスリン様成長因子−
2、胃抑制ペプチド、成長ホルモン放出因子、下垂体アデニレートシクラーゼ活
性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロ
ピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリトロポエチン
、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エ
ンケフェリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド、GIP、エキセン
ジン(exendins)、ペプチドヒスチジン−メチオニンアミド、ヘロスペクチン(
helospectins)、ヘロデルミン(helodermin)、下垂体アデニレートシクラーゼ
活性化ペプチド関連ペプチド、血管作用性小腸ペプチド及びそれらのアナログが
ある。ここで、アナログは、親ペプチドの1又は複数のアミノ酸残基が、別のア
ミノ酸残基により置換されているペプチド、及び/又は親ペプチドの1又は複数
のアミノ酸残基が付加されているペプチドを示すのに用いる。このような付加は
、親ペプチドのN末端もしくはC末端又は両方で行うことができる。誘導体は、
本明細書において、親ペプチドの1又は複数のアミノ酸残基が、例えばアルキル
化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等により、化学的に修飾されている
ペプチドを示すのに用いる。
らに限らないが、NaCl,KCl,NH4 Cl,CaCl2 、酢酸ナトリウム
、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、
クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢
酸カルシウム又はそれらの混合物を含むことを意図する(cf. Remington's Phar
maceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton. PA, 1990
、又はRemington : The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (19
95)、又はAmersham-Pharmacia Biotech からのハンドブック)。
ないが、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、乳酸
緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、アルギニン緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液
、グルタミン酸緩衝液、アンモニウム緩衝液、グリシン緩衝液、アルキルアミン
緩衝液、アミノエチルアルコール緩衝液、エチレンジアミン緩衝液、トリエタノ
ールアミン、イミダゾール緩衝液、ピリジン緩衝液及びバルビツール酸緩衝液、
並びにそれらの混合物を含むことを意図する(cf. Remington's Pharmaceutical
Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990、又はRemi
ngton : The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995)、又はA
mersham-Pharmacia Biotechからのハンドブック)。
チューブ法、例えばAmersham-Pharmacia Biotechからのハンドブックに従って行
われる。クロマトグラフィーのイオン交換樹脂は、精製すべき特定のペプチド及
び用いる条件、例えばpH、緩衝液、イオン強度等に依存して選択されるが、それ
らは、当業者に知られており(即ち典型的にはカチオン交換樹脂についてペプチ
ドの等電点(pI)未満のpH、アニオン交換樹脂についてペプチドのpI超のpH、要
求されるpHを維持するのに十分な緩衝液強度、及び塩濃度により誘導され得るの
に十分に低いイオン強度)、これらに限らないが、Amersham−Phar
macia BiotechからのSepharose樹脂、Sephadex
樹脂、Streamline樹脂、及びSource樹脂、BioSepraか
らのHyperD樹脂、Trisacryl樹脂、及びSpherosil樹脂
、TosoHaasからのTSKgel樹脂及びToyopearl樹脂、Me
rckからのFractogel EMD樹脂、Perseptive Bio
systemsからのPoros樹脂、BioRADからのMacro−Pre
p樹脂、WhatmanからのExpression樹脂等がある。
緩衝液から本質的になる溶液”は、1又は複数の有機モディファイア、水を含み
、1又は複数の塩成分を含むか又は塩成分を含まず、1又は複数の緩衝液を含む
か又は緩衝液を含まず、そして任意に、当業者が慣用的なイオン交換クロマトグ
ラフィー法に従って添加を考えるであろう1又は複数の更なる慣用的な成分を含
む溶液を意味することを意図する。
体的実効電荷を有する1又は複数の不純物、例えばそれらがペプチドの前に溶出
する限り、トランケートされた形態、全ての種類の伸長した形態(余分のアミノ
酸、エステルを含む、種々の誘導体等)、脱アミド化形態、不正確にホールディ
ングした形態、シアリル化を含む不要なグリコシル化を伴う形態、“γ−カルボ
キシグルタミン酸の欠如”等を意味することを意図する。
とあわせて本明細書で用いられる用語“pH値”は、ステップa)のpH値が一定で
あっても、又は典型的には3pH単位内で変化し得、そして次にステップb)のpH
値がステップa)と同じく一定であるかもしくはpH値を変化させ得、又は一定で
あるかもしくは典型的には3pH単位内で変化し得る異なるpH値であり得ることを
意味することを意図する。このようなpH値は、典型的には、緩衝液及び/又は無
機もしくは有機酸又は塩基、例えばHCl,NaOH,H2 O、酢酸、NH3 ,
KOH,H2 SO4 、クエン酸の添加により維持され又は変化され得る。
正の)実効電荷を有する関連する不純物と合わせて本明細書に用いられる用語“
より低い”は、関連する不純物の局所的又は全体的な実効電荷の数値が前記ペプ
チドの局所的又は全体的な実効電荷の数値より低いことを意味することを意図す
る。
めのカチオン交換クロマトグラフィー法であって、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又
は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプ
チドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチ
ドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩
衝液で任意に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出するこ
と を含む方法。
めのアニオン交換クロマトグラフィー法であって、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又
は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプ
チドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチ
ドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩
衝液で任意に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出するこ
と を含む方法。
る態様1又は2に記載の方法。
ノール又はC1-6 −アルキノール、尿素、グアニジン、又はC1-6 −アルカン酸
、C2-6 −グリコール、又はC3-7 −ポリアルコール含有糖から選択される態様
1〜3のいずれかに記載の方法。
aCl,KCl,NH4 Cl,CaCl2 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢
酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はそ
れらの混合物から選択される態様1〜4のいずれか一に記載の方法。
方法。
1〜5のいずれか一に記載の方法。
る濃度で存在する態様7に記載の方法。
aCl,KCl,NH4 Cl,CaCl2 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢
酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はそ
れらの混合物から選択される態様1〜8のいずれか一に記載の方法。
ol/kgの範囲から選択される濃度で存在する態様1〜9のいずれかに記載の方法
。
の方法。
ン酸緩衝液、tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、グリシルグリシン緩
衝液、アルギニン緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液、アン
モニウム緩衝液、グリシン緩衝液、アルキルアミン緩衝液、アミノエチルアルコ
ール緩衝液、エチレンジアミン緩衝液、トリエタノールアミン、イミダゾール緩
衝液、ピリジン緩衝液及びバルビツール酸緩衝液及びそれらの混合物から選択さ
れる態様1〜11のいずれか一に記載の方法。
から選択される濃度で存在する態様1〜12のいずれか一に記載の方法。
から選択される濃度で存在する態様1〜13のいずれか一に記載の方法。
載の方法。
載の方法。
任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ塩成分勾配的又
は定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の
局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実
効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意
に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出するこ
と を含むカチオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する
不純物を含む混合物からペプチドを精製し、 そして次に、必要に応じて、分析テスト及び/又は更なる精製にかけ、そして
慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること を含む方法。
任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ塩成分勾配的又
は定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の
局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実
効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意
に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出するこ
と を含むアニオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する
不純物を含む混合物からペプチドを精製し、 そして次に、必要に応じて、分析テスト及び/又は更なる精製にかけ、そして
慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること を含む方法。
質、レセプター、vira、並びにそれらの相同体、アナログ及び誘導体、好ま
しくはグルカゴン、hGH、インスリン、アプロチニン、FVII ,TPA,FVI
Ia ,FFR−FVIIa 、ヘパリナーゼ、ACTH、ヘパリン結合タンパク質、
コルチコトロピン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、インスリン、グ
ルカゴン様ペプチド−1、グルカゴン様ペプチド−2、インスリン様成長因子−
1、インスリン様成長因子−2、繊維芽細胞成長因子、胃抑制ペプチド、成長ホ
ルモン放出因子、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、セクレチン、エ
ンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺
ホルモン、トロンボポエチン、エリトロポエチン、視床下部放出因子、プロラク
チン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン
、オキシトシン、オピオイド、DPPIV、インターロイキン、イムノグロブリ
ン、補体インヒビター、セルピンプロテアーゼインヒビター、サイトカイン、サ
イトカインレセプター、PDGF、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子レセプター、成
長因子GIP、エキセンジン、ペプチドヒスチジン−メチオニンアミド、ヘロス
ペクチン、ヘロデルミン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド関連ペプ
チド、血管作用性小腸ポリペプチド並びにそれらのアナログ及び誘導体、より好
ましくはグルカゴン、hGH、インスリン、アプロチニン、FVII ,FVIIa ,
FFR−FVIIa 、ヘパリナーゼ、グルカゴン様ペプチド−1、グルカゴン様ペ
プチド−2並びにそれらのアナログ及び誘導体例えばArg34GLP−1(7-37) 、ヒトインスリン、及びB28IsoAspインスリンから選択される態様1〜
18のいずれか一に記載の方法。 実施例 本発明は、以下の例により更に説明されるが、それらは、保護の範囲を限定す
るものとして解釈すべきでない。先の記載及び以下の例において開示される特徴
は、別個に、及びいずれかの組合せにおいてその多様な形態で本発明を認識する
ための材料となり得る。
に、慣用的な組換えDNA技術によりイースト(Sacch. cerevisiae)で発現させ
た。Arg34GLP−1(7-37)発酵ブロスを、慣用的な逆相クロマトグラフィー
捕獲ステップにより精製し、次に、Arg34GLP−1(7-37)のpI(等電点)で
沈殿させた。そのArg34GLP−1(7-37)及びいくつかの不純物の1つとして
ヒスチジン及びアラニン残基を失ったトランケートされた形態、Arg34GLP
−1(9-37)を含む沈殿2gを100mLの水に懸濁し、pHを8.2に調節すること
により溶解させた。得られた混合物をpH3.4に調節し、ろ過した。そのろ液2
1mLを、100mLの20mmol/kgクエン酸、75mmol/kg KCl、45%w/
wエタノール、pH3.5で平衡化した20mL Source 30S(Amersham
Pharmacia Biotech)カラムに適用した。そのトランケートされた形態を、60
mLの20mmol/kgクエン酸、87.5mmol/kg KCl、45%w/wエタノー
ル、pH3.5により溶出/洗い落とした。標的ペプチドArg34GLP−1(7-3 7) を、100mLの200mmol/kgトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、pH8
.5のステップ勾配により単一ピークで溶出した。クロマトグラムを図1に示す
。
伴うC18−置換化120Åシリカ(YMC)4.0×250mmカラムで行った。
緩衝液Aは7.8%アセトニトリル、pH2.5中0.15M(NH4 )2 SO4
からなり、緩衝液Bは63.4%アセトニトリルを含む。12分の37〜41%
のB、次に15分の41〜100%のBの直線勾配を、1mL/分の流速で行った
。クロマトグラフィー温度は60℃に維持し、UV検出は、214nmで行った。
分析結果は以下の通りであった:
り精製し、実施例に記載されるように沈殿させた。
形態、Arg34GLP−1(9-37)を含む沈殿2gを懸濁し、100mLの20mmol
/kgグリシン、pH9.0に溶かして8.4の最終pHとした。得られた混合物をpH
3.5に調節し、ろ過した。そのろ液52mLを、60mLの20mmol/kgクエン酸
、75mmol/kg KCl、45%w/wエタノール、pH3.5で平衡化した20
mL Source 30S(Amersham Pharmacia Biotech)カラムに適用した。
そのトランケートされた形態を、60mLの20mmol/kgクエン酸、87.5mmol
/kg KCl、45%w/wエタノール、pH3.5のステップ勾配により溶出/
洗い落とした。標的ペプチドArg34GLP−1(7-37)を、100mLの200mm
ol/kgグリシン、pH9.0のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。
収集されたピークの同定/確認のためのRP−HPLC分析を実施例1に記載さ
れるように行った。その分析結果は、エタノールを含む洗浄ステップによるトラ
ンケートされた形態の選択的除去、及びカチオン交換クロマトグラフィー法を用
いることによる水性溶出液中のトランケートされた形態の高い削減を示す。
フィー捕獲ステップ、次に慣用的なRP−HPLC精製ステップにより精製した
。Arg34GLP−1(7-37)及び不純物としてトランケート化形態、Arg34G
LP−1(9-37)を含むRP−HPLCプールに4容量の水を加えた。得られた溶
液175mLをpH3.5に調節し、100mLの20mmol/kgクエン酸、75mmol/
kg KCl、45%w/wエタノール、pH3.5で平衡化した20mL Sour
ce 30S(Amersham Pharmacia Biotech)カラムに適用した。そのカラムを
20mLの平衡化溶液で洗い、そのトランケートされた形態を、75から100mm
ol/kgのKCl(20mmol/kgクエン酸、45%w/wエタノール、pH3.5)
の直線勾配により溶出/洗い落とした。標的ペプチドArg34GLP−1(7-37) を、100mLの100mmol/kg Na2 CO3 、pH9.5のステップ勾配により
単一ピークにおいて溶出した。クロマトグラムを図4に示す。
施例3に記載されるようにRP−HPLCにより精製した。
溶液86mLをpH3.5に調節し、100mLの20mmol/kgクエン酸、75mmol/
kg KCl、45%w/wエタノール、pH3.5で平衡化した20mL Sour
ce 30S(Amersham Pharmacia Biotech)カラムに適用した。そのカラムを
20mLの平衡化溶液で洗い、そのトランケートされた形態を、75から100mm
ol/kgのKCl(20mmol/kgクエン酸、45%w/wエタノール、pH3.5)
の直線勾配により溶出/洗い落とした。標的ペプチドArg34GLP−1(7-37) を、100mLの100mmol/kg H3 BO3 、100mmol/kg NaCl、pH9
.5のステップ勾配により溶出した。
ロスから単離し、そして実施例1に記載されるように沈殿させた。
れた形態、Arg34GLP−1(9-37)を含む沈殿10gを500mLの水に懸濁し
、8.3にpH調節することにより溶解して、約1.6mg/mLのArg34GLP−
1(7-37)濃度にした。得られた溶液5mLをpH3.5に調節し、60mLの0.42
%w/wクエン酸、34%w/wエタノール、pH3.5で平衡化した20mL S
ource 30S(Amersham Pharmacia Biotech)カラムに適用した。そのト
ランケートされた形態を、0から1.29%w/wのKCl(0.42%w/w
クエン酸、34%w/wエタノール、pH3.5)の直線勾配により溶出/洗い落
とした。標的ペプチドArg34GLP−1(7-37)を、100mLの200mmol/kg
グリシン、pH9.5のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。クロマ
トグラムを図5に示す。
ロスから単離し、実施例1に記載される通り沈殿させた。
れた形態、Arg34GLP−1(9-37)を含む沈殿10gを500mLの水に懸濁し
、8.3へのpH調節により溶解して約1.6mg/mLのArg34GLP−1(7-37) 濃度にした。得られた溶液5mLをpH3.2に調節し、60mLの0.42%w/w
クエン酸、29%w/wエタノール、pH3.5で平衡化した20mL Sourc
e 30S(Amersham Pharmacia Biotech)カラムに適用した。そのトランケー
トされた形態を、0から1.96%w/w KCl(0.42%w/wクエン酸
、29%w/wエタノール、pH3.5)の直線勾配により溶出/洗い落とした。
標的ペプチドArg34GLP−1(7-37)を、100mLの200mmol/kgグリシン
、pH9.5のステップ勾配により溶出した。
ロスから単離し、実施例1に記載される通り沈殿させた。
れた形態、Arg34GLP−1(9-37)を含む沈殿10gを500mLの水に懸濁し
、8.3へのpH調節により溶解して約1.6mg/mLのArg34GLP−1(7-37) 濃度にした。得られた溶液5mLをpH3.5に調節し、60mLの0.42%w/w
クエン酸、51%w/wエタノール、pH3.5で平衡化した20mL Sourc
e 30S(Amersham Pharmacia Biotech)カラムに適用した。そのトランケー
トされた形態を、0から1.00%w/w KCl(0.42%w/wクエン酸
、51%w/wエタノール、pH3.5)の直線勾配により溶出/洗い落とした。
標的ペプチドArg34GLP−1(7-37)を、100mLの200mmol/kgグリシン
、pH9.5のステップ勾配により溶出した。
ロスから単離し、実施例1に記載される通り沈殿させた。
れた形態、Arg34GLP−1(9-37)を含む沈殿10gを500mLの水に懸濁し
、8.3へのpH調節により溶解して約1.6mg/mLのArg34GLP−1(7-37) 濃度にした。得られた溶液5mLをpH3.5に調節し、60mLの0.42%w/w
クエン酸、71%w/wエタノール、pH3.5で平衡化した20mL Sourc
e 30S(Amersham Pharmacia Biotech)カラムに適用した。そのトランケー
トされた形態を、0から0.48%w/w KCl(0.42%w/wクエン酸
、71%w/wエタノール、pH3.5)の直線勾配により溶出/洗い落とした。
標的ペプチドArg34GLP−1(7-37)を、100mLの200mmol/kgグリシン
、pH9.5のステップ勾配により溶出した。
ロスから単離し、実施例1に記載される通り沈殿させた。
れた形態、Arg34GLP−1(9-37)を含む沈殿10gを500mLの水に懸濁し
、8.3へのpH調節により溶解して約1.6mg/mLのArg34GLP−1(7-37) 濃度にした。得られた溶液5mLをpH3.5に調節し、60mLの0.42%w/w
クエン酸、40%w/w 2−プロパノール、pH3.5で平衡化した20mL S
ource 30S(Amersham Pharmacia Biotech)カラムに適用した。そのト
ランケートされた形態を、0から0.61%w/w KCl(0.42%w/w
クエン酸、40%w/w 2−プロパノール、pH3.5)の直線勾配により溶出
/洗い落とした。標的ペプチドArg34GLP−1(7-37)を、100mLの200
mmol/kgグリシン、pH9.5のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した
。クロマトグラムを図6に示す。
ロスから単離し、実施例1に記載される通り沈殿させた。
れた形態、Arg34GLP−1(9-37)を含む沈殿10gを500mLの水に懸濁し
、8.3へのpH調節により溶解して約1.6mg/mLのArg34GLP−1(7-37) 濃度にした。得られた溶液5mLをpH3.5に調節し、24mLの0.42%w/w
クエン酸、51%w/wエタノール、pH3.5で平衡化した8mL Poros
50 HS(PE Biosystems)カラムに適用した。そのトランケートされた形態を
、0から1.34%w/w KCl(0.42%w/wクエン酸、51%w/w
エタノール、pH3.5)の直線勾配により溶出/洗い落とした。標的ペプチドA
rg34GLP−1(7-37)を、40mLの200mmol/kgグリシン、pH9.5のステ
ップ勾配により溶出した。クロマトグラムを図7に示す。
ロスから単離し、実施例1に記載される通り沈殿させた。
れた形態、Arg34GLP−1(9-37)を含む沈殿10gを500mLの水に懸濁し
、8.3へのpH調節により溶解して約1.6mg/mLのArg34GLP−1(7-37) 濃度にした。得られた溶液5mLをpH3.5に調節し、24mLの0.42%w/w
クエン酸、40%w/w 2−プロパノール、pH3.5で平衡化した80mL P
oros 50 HS(PE Biosystems)カラムに適用した。そのトランケートさ
れた形態を、0から1.34%w/w KCl(0.42%w/wクエン酸、4
0%w/w 2−プロパノール、pH3.5)の直線勾配により溶出/洗い落とし
た。標的ペプチドArg34GLP−1(7-37)を、40mLの200mmol/kgグリシ
ン、pH9.5のステップ勾配により溶出した。
ロスから単離し、実施例1に記載される通り沈殿させた。
れた形態、Arg34GLP−1(9-37)を含む沈殿10gを500mLの水に懸濁し
、8.3へのpH調節により溶解して約1.6mg/mLのArg34GLP−1(7-37) 濃度にした。得られた溶液5mLをpH3.5に調節し、60mLの0.42%w/w
クエン酸、40%w/w 2−メチル−2,4−ペンタンジオール、pH3.5で
平衡化した20mL Source 30S(Amersham Pharmacia Biotech)カラ
ムに適用した。そのトランケートされた形態を、0から0.60%w/w KC
l(0.42%w/wクエン酸、40%w/w 2−メチル−2,4−ペンタン
ジオール、pH3.5)の直線勾配により溶出/洗い落とした。標的ペプチドAr
g34GLP−1(7-37)を、100mLの200mmol/kgグリシン、pH9.5のステ
ップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。クロマトグラムを図9に示す。
(B30)の混合物を、他所に記載(cf. I. Mollerup, S.W. Jensen, P. Larse
n, O. Schou, L. Snel : Insulin, Purification, in M.C. Flickinger, S.W. D
rew : Encyclopedia of Bioprocess Technology : Fermentation, Biocatalysis
, and Bioseparation, John Wiley & Sons, 1999)されるように慣用的な方法に
より得た。その混合物は、4mmol/L EDTA、16%w/wエタノール、pH
7.5を含んだ。その混合物2mLを、40mLの0.15%w/wトリエタノール
アミン、42.5%w/wエタノール、pH7.5で平衡化した20mL TSK−
Gel Q−5PW(TosoHaas)カラムに適用した。ヒトインスリンエ
チルエステル不純物を、0から1.14%w/wのクエン酸ナトリウム3水和物
(0.15%w/wトリエタノールアミン、42.5%w/wエタノール、pH7
.5)の直線勾配により溶出/洗い落とした。標的タンパク質、ヒトインスリン
を、60mLの2.72%w/wクエン酸ナトリウム3水和物、0.15%w/w
トリエタノールアミン、pH7.5のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出
した。クロマトグラムを図10に示す。
例13に記載される通り得た。その混合物2mLを、40mLの0.15%w/wト
リエタノールアミン、42.5%w/wエタノール、pH7.5で平衡化した20
mL TSK−Gel Q−5PW(Toso−Haas)カラムに適用した。ヒ
トインスリンエチルエステル不純物を、0から0.90%w/wのクエン酸ナト
リウム3水和物(0.15%w/wトリエタノールアミン、42.5%w/wエ
タノール、pH7.5)の直線勾配により溶出/洗い落とした。標的タンパク質、
ヒトインスリンを、60mLの100mmol/Lクエン酸、pH3のステップ勾配によ
り単一ピークにおいて溶出した。クロマトグラムを図11に示す。
例13に記載される通り得た。その混合物2mLを、40mLの0.15%w/wト
リエタノールアミン、71%w/wエタノール、pH7.5で平衡化した20mL
TSK−Gel Q−5PW(Toso−Haas)カラムに適用した。ヒトイ
ンスリンエチルエステル不純物を、0から1.63%w/wのクエン酸ナトリウ
ム3水和物(0.15%w/wトリエタノールアミン、71%w/wエタノール
、pH7.5)の直線勾配により溶出/洗い落とした。標的タンパク質、ヒトイン
スリンを、60mLの2.72%w/wクエン酸ナトリウム3水和物、0.15%
w/wトリエタノールアミン、pH7.5のステップ勾配により単一ピークにおい
て溶出した。
(B30)の混合物を実施例13に記載される通り得た。その混合物は、9mg/
mLのヒトインスリン濃度で、4mmol/LのEDTA、pH7.5を含んだ。その混
合物2mLを、40mLの0.15%w/wトリエタノールアミン、81%w/wエ
タノール、pH7.5で平衡化した20mL TSK−Gel Q−5PW(Tos
o−Haas)カラムに適用した。ヒトインスリンエチルエステル不純物を、0
から2.18%w/wのクエン酸ナトリウム3水和物(0.15%w/wトリエ
タノールアミン、81%w/wエタノール、pH7.5)の直線勾配により溶出/
洗い落とした。標的タンパク質、ヒトインスリンを、60mLの2.72%w/w
クエン酸ナトリウム3水和物、0.15%w/wトリエタノールアミン、pH7.
5のステップ勾配により単一ピークにおいて溶出した。クロマトグラムを図12
に示す。
例16に記載される通り得た。その混合物2mLを、40mLの0.15%w/wト
リエタノールアミン、51%w/wエタノール、pH7.5で平衡化した20mL
TSK−Gel Q−5PW(Toso−Haas)カラムに適用した。ヒトイ
ンスリンエチルエステル不純物を、0から1.09%w/wのクエン酸ナトリウ
ム3水和物(0.15%w/wトリエタノールアミン、51%w/wエタノール
、pH7.5)の直線勾配により溶出/洗い落とした。標的タンパク質、ヒトイン
スリンを、60mLの2.72%w/wクエン酸ナトリウム3水和物、0.15%
w/wトリエタノールアミン、pH7.5のステップ勾配により単一ピークにおい
て溶出した。
Claims (10)
- 【請求項1】 ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精
製するためのカチオン交換クロマトグラフィー法であって、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中
で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の
局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実
効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意
に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出するこ
と を含む方法。 - 【請求項2】 ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精
製するためのアニオン交換クロマトグラフィー法であって、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又は塩成分中
で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の
局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実
効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意
に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出するこ
と を含む方法。 - 【請求項3】 ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精
製するためのカチオン交換クロマトグラフィー法を含む、純粋なペプチドを生産
するための工業的方法であって、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又
は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプ
チドが正の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチ
ドの正の実効電荷より低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩
衝液で任意に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出するこ
と を含む方法。 - 【請求項4】 ペプチド及び関連する不純物を含む混合物からペプチドを精
製するためのアニオン交換クロマトグラフィー法を含む、純粋なペプチドを生産
するための工業的方法であって、 a)前記混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分
及び任意に緩衝液から本質的になる溶液中で、直線もしくはステップ勾配で、又
は塩成分中で定組成的に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプ
チドが負の局所的又は全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチ
ドの負の実効電荷より低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩
衝液で任意に維持したpH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出するこ
と を含む方法。 - 【請求項5】 ペプチドを単離するための方法であって、 a)混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び
任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ塩成分勾配的又は定組成的
に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが正の局所的又は
全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの正の実効電荷より
低い局所的又は全体的な正の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持した
pH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより高いpH値で溶出するこ
と を含むカチオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する
不純物を含む混合物からペプチドを精製し、 そして次に、必要に応じて、分析テスト及び/又は更なる精製にかけ、そして
慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること を含む方法。 - 【請求項6】 ペプチドを単離するための方法であって、 a)混合物の関連する不純物を、有機モディファイア、水、任意に塩成分及び
任意に緩衝液を含む溶液中で、直線もしくはステップ塩成分勾配的又は定組成的
に、及び前記関連する不純物を除去するように、前記ペプチドが負の局所的又は
全体的実効電荷を有し、前記関連する不純物が前記ペプチドの負の実効電荷より
低い局所的又は全体的な負の実効電荷を有するような、緩衝液で任意に維持した
pH値で溶出し、 b)次に、前記ペプチドを、塩成分を任意に伴う水性溶媒へのステップ的又は
直線的変化により、緩衝液で任意に維持した同じ又はより低いpH値で溶出するこ
と を含むアニオン交換クロマトグラフィー法を介して前記ペプチド及び関連する
不純物を含む混合物からペプチドを精製し、 そして次に、必要に応じて、分析テスト及び/又は更なる精製にかけ、そして
慣用的な方法で前記ペプチドを単離すること を含む方法。 - 【請求項7】 前記精製すべきペプチドが、ポリペプチド、オリゴペプチド
、タンパク質、レセプター、vira、並びにそれらの相同体、アナログ及び誘
導体から選択される請求項1〜6のいずれか一に記載の方法。 - 【請求項8】 前記精製すべきペプチドがグルカゴン、hGH、インスリン
、第VII 因子、第 VIIa因子、第 VIIai因子、FFR−第 VIIa因子、グルカ
ゴン様ペプチド−1、グルカゴン様ペプチド−2並びにそれらのアナログ及び誘
導体から選択される請求項1〜7のいずれか一に記載の方法。 - 【請求項9】 重量パーセントに基づく有機モディファイア:水の比が1:
99〜99:1である請求項1〜8のいずれか一に記載の方法。 - 【請求項10】 前記有機モディファイアが、C1-6 −アルカノール、C1- 6 −アルケノール又はC1-6 −アルキノール、尿素、グアニジン、又はC1-6 −
アルカン酸(alkanoic acid)、C2-6 −グリコール、又はC3-7 −ポリアルコー
ル含有糖から選択される請求項1〜9のいずれか一に記載の方法。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA199900360 | 1999-03-15 | ||
DKPA199900360 | 1999-03-15 | ||
DK199900360 | 1999-03-15 | ||
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