JPS58131918A - 因子8親凝集性活性蛋白質の調整方法およびその方法に使用する免疫吸着剤 - Google Patents
因子8親凝集性活性蛋白質の調整方法およびその方法に使用する免疫吸着剤Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は一般に、因子■の親凝結剤活性蛋白質の分離
と精製に関している。さらにとくに、高純度因子■親凝
結剤活性蛋白質が、血漿または濃縮血液からの2段階の
ノロマドグラフ吸着および濃縮法によって、ウィルレブ
ランド因子から分離される。
と精製に関している。さらにとくに、高純度因子■親凝
結剤活性蛋白質が、血漿または濃縮血液からの2段階の
ノロマドグラフ吸着および濃縮法によって、ウィルレブ
ランド因子から分離される。
血漿からの抗血友病因子の分離については、文献に発表
されている。抗血友病因子、すなわち、因子■の精密な
構造は、一部には、十分饅の純物質かえられず、より深
い研究が不可能なために、いまだに確認されていない。
されている。抗血友病因子、すなわち、因子■の精密な
構造は、一部には、十分饅の純物質かえられず、より深
い研究が不可能なために、いまだに確認されていない。
純物質の入手に411約があり、しかもこの因子が稀薄
状態で存在するために、この因子の治療上の利用が妨げ
られていた。
状態で存在するために、この因子の治療上の利用が妨げ
られていた。
因子■親凝結剤活性蛋白質は、血友病血漿中の凝固傾向
を正すよう機能する。これは、ウイルレブランド因子蛋
白賀と複合して、血漿中を循環する。ウイルレブランド
因子蛋白質は、血小板凝血因子欠陥を、ウイルシブラン
ド病に変化させることがある。因子■の、ウイルレブラ
ンド因子銘化合物の部分が凝集活性を有していて、これ
が、因子■−凝固活性、または単に■:Cと呼ばれる(
“■:C′′の名称は、以後、因子1分子の部分を上記
の凝固活性と識別するために用いられる)。
を正すよう機能する。これは、ウイルレブランド因子蛋
白賀と複合して、血漿中を循環する。ウイルレブランド
因子蛋白質は、血小板凝血因子欠陥を、ウイルシブラン
ド病に変化させることがある。因子■の、ウイルレブラ
ンド因子銘化合物の部分が凝集活性を有していて、これ
が、因子■−凝固活性、または単に■:Cと呼ばれる(
“■:C′′の名称は、以後、因子1分子の部分を上記
の凝固活性と識別するために用いられる)。
因子■のウィルシブランド病の血小板凝血因子欠陥を正
す能力をもつウイルレブランド因子錯化合物のもう一つ
の部分は、ウイルレブランド因子、抗原、■R:A(1
、■:RP因子と関連した一因子■と呼ばれる(表示゛
■: RP ”は、因子1分子の血小板補正機能を識別
するために用いられる)。これまでに実証されているわ
けではないが、■:Cが、非共有結晶錯塩として、■:
RPと複合する小分子の特性と挙動を示すという結論を
裏付ける徴候がある。また■:(および■:RPの双方
にともなう特性も、適当な条件のもとでは璧解して、2
部分の小片を生ずる単一分子でもありうるという主張に
ついての根拠もある。
す能力をもつウイルレブランド因子錯化合物のもう一つ
の部分は、ウイルレブランド因子、抗原、■R:A(1
、■:RP因子と関連した一因子■と呼ばれる(表示゛
■: RP ”は、因子1分子の血小板補正機能を識別
するために用いられる)。これまでに実証されているわ
けではないが、■:Cが、非共有結晶錯塩として、■:
RPと複合する小分子の特性と挙動を示すという結論を
裏付ける徴候がある。また■:(および■:RPの双方
にともなう特性も、適当な条件のもとでは璧解して、2
部分の小片を生ずる単一分子でもありうるという主張に
ついての根拠もある。
因子■/ウィルQプランジ因子!1塩、■:C1および
■:RPの構造と、■二Cに帰せられる凝集剤活性の重
要な薬剤指数を識別する必要上、因子■をm製し、かつ
■:Cと■:RPを分離し、かつ濃縮する多くの試みが
行なわれた。使用する技法は、一般に免疫吸着またはイ
オン交換クロマトグラフィのいずれかに基いていた。こ
のために使用される技法は、蛋白質から荷電イオン物質
を、損傷のない状態で除いたり、または上記物質を、適
切量で回収ることが困難なために、成功には制約があっ
た。
■:RPの構造と、■二Cに帰せられる凝集剤活性の重
要な薬剤指数を識別する必要上、因子■をm製し、かつ
■:Cと■:RPを分離し、かつ濃縮する多くの試みが
行なわれた。使用する技法は、一般に免疫吸着またはイ
オン交換クロマトグラフィのいずれかに基いていた。こ
のために使用される技法は、蛋白質から荷電イオン物質
を、損傷のない状態で除いたり、または上記物質を、適
切量で回収ることが困難なために、成功には制約があっ
た。
免疫吸着クロマトグラフィを利用する■:Cを■:RP
から分離する上記方法の1つが、E、G。
から分離する上記方法の1つが、E、G。
D 、 T uddenhan+らのJOURNA
L OF 1−ABORATORY CLIN
ICAL MFDICINF、Vol、93.D 4
0 (1979)゛免疫吸着クロマトグラフィによって
調製した因子■凝集剤活性の特性”によって発表されて
いる。
L OF 1−ABORATORY CLIN
ICAL MFDICINF、Vol、93.D 4
0 (1979)゛免疫吸着クロマトグラフィによって
調製した因子■凝集剤活性の特性”によって発表されて
いる。
報告された方法は、■:Cを、多クローン抗血清が■:
RP(抗−■: RP)に組合わされているアガローゼ
・ビーズを充填したクロマトグラフィ・カラムを用いる
、はとんどすべての■:RP。
RP(抗−■: RP)に組合わされているアガローゼ
・ビーズを充填したクロマトグラフィ・カラムを用いる
、はとんどすべての■:RP。
およびほとんどのその他の血漿蛋白質から分離する1段
法である。血漿を含む因子■1ウイルレブランド因子は
、■二Cと、■:RPの双方を吸着するカラムを通過す
る。その他の不都合は血漿蛋白質は、緩衝塩水溶液で洗
浄することによってカラムから除去され、そして所望の
■:Cが、その後のカルシウム・イオン勾配による溶離
によってえられる。この方法は、従来の既知の方法と比
較して、■二Cの純度と収率の双方においての改善であ
る旨主張されているが、生じた生成物もまた■:RP、
およびその伯の血漿蛋白質をも含むと述べている。この
ような汚染物質は、アガローゼ・ビーズと結合した多ク
ローン抗血清に原因するものと考えられる。抗血清が構
成される免疫グロブリンの大多数は、■:RPに対して
特異でないから、■:RPに特異な抗体がアガローゼに
拘束される有効点数は、アガローゼ上の特定数の拘束点
を求める抗血清の間の競合により、比較的に少ない。
法である。血漿を含む因子■1ウイルレブランド因子は
、■二Cと、■:RPの双方を吸着するカラムを通過す
る。その他の不都合は血漿蛋白質は、緩衝塩水溶液で洗
浄することによってカラムから除去され、そして所望の
■:Cが、その後のカルシウム・イオン勾配による溶離
によってえられる。この方法は、従来の既知の方法と比
較して、■二Cの純度と収率の双方においての改善であ
る旨主張されているが、生じた生成物もまた■:RP、
およびその伯の血漿蛋白質をも含むと述べている。この
ような汚染物質は、アガローゼ・ビーズと結合した多ク
ローン抗血清に原因するものと考えられる。抗血清が構
成される免疫グロブリンの大多数は、■:RPに対して
特異でないから、■:RPに特異な抗体がアガローゼに
拘束される有効点数は、アガローゼ上の特定数の拘束点
を求める抗血清の間の競合により、比較的に少ない。
アミノヘキシル置換アガ0−ゼを用いるクロマトグラフ
ィ・技法による■:Cを、■:RPとリストセチン共因
子から分離するもう一つの方法が、D、E、G、Au5
tenの、BRTTISHJOURNAL OF
HA、EMATOLOGY、Vof、43.069 (
1979)’“因子■のアミノヘキシル・セファローゼ
からのクロマトグラフィによる分離″により報告されて
いる。記述の方法は、人間と豚の双方の因子■/ウイル
レブランド因子の成分部分についての改善法であると述
べられている。しかしながら、この方法もまた、汚染物
質が生ずる生成物中に存在するという欠点を示す。T
uddenhamら、およびA ustenによる両方
法において、汚染物質は通常希望されるよりさらに稀薄
な状態で形成される。
ィ・技法による■:Cを、■:RPとリストセチン共因
子から分離するもう一つの方法が、D、E、G、Au5
tenの、BRTTISHJOURNAL OF
HA、EMATOLOGY、Vof、43.069 (
1979)’“因子■のアミノヘキシル・セファローゼ
からのクロマトグラフィによる分離″により報告されて
いる。記述の方法は、人間と豚の双方の因子■/ウイル
レブランド因子の成分部分についての改善法であると述
べられている。しかしながら、この方法もまた、汚染物
質が生ずる生成物中に存在するという欠点を示す。T
uddenhamら、およびA ustenによる両方
法において、汚染物質は通常希望されるよりさらに稀薄
な状態で形成される。
したがって、血漿または濃縮血液を用いて、■−Cを、
■:RPから分離して、精製するための改義方法の必要
性があることは明らかである。したがって、この発明の
目的は、このような必要性を満すことにある。
■:RPから分離して、精製するための改義方法の必要
性があることは明らかである。したがって、この発明の
目的は、このような必要性を満すことにある。
この発明は、因子■/ウイルレブランド囚丁子錯塩■:
C1および■:RPの成分分子の分離法および親凝結剤
活性蛋白質■:Cの精製と濃縮に関している。この方法
は、2段法を用いて高純度の■:Cを生成する目的を達
成する。
C1および■:RPの成分分子の分離法および親凝結剤
活性蛋白質■:Cの精製と濃縮に関している。この方法
は、2段法を用いて高純度の■:Cを生成する目的を達
成する。
第1段は、血漿または市販濃縮白液からの因子■の免疫
吸着である。使用の吸着剤は、例えばアガO−ゼ・ビー
ズのような適当な基質に結合される■:RPに特異な申
クローン抗体からなっている。■:C/■:RPが最初
に吸着されてから、基質粒子を緩衛溶液により十分に洗
浄して、非吸着蛋白質を除去する。つぎに吸着物質を、
吸着■:Cを溶離する溶液を含むカルシウム・イオンで
処理する。■:RP蛋白質は、抗■:RPと結合した物
質に吸着されたままである。この点では、最初に吸着さ
れた■:Cの約40〜60%が、高純度状態で回収され
る。ただし、回収された親凝結剤活性蛋白質は、きわめ
て純度は高いが、すなわち、はとんど汚染物質を含んで
いないが、きわめて稀薄なたIめ、有効な療法指数に達
していない。
吸着である。使用の吸着剤は、例えばアガO−ゼ・ビー
ズのような適当な基質に結合される■:RPに特異な申
クローン抗体からなっている。■:C/■:RPが最初
に吸着されてから、基質粒子を緩衛溶液により十分に洗
浄して、非吸着蛋白質を除去する。つぎに吸着物質を、
吸着■:Cを溶離する溶液を含むカルシウム・イオンで
処理する。■:RP蛋白質は、抗■:RPと結合した物
質に吸着されたままである。この点では、最初に吸着さ
れた■:Cの約40〜60%が、高純度状態で回収され
る。ただし、回収された親凝結剤活性蛋白質は、きわめ
て純度は高いが、すなわち、はとんど汚染物質を含んで
いないが、きわめて稀薄なたIめ、有効な療法指数に達
していない。
この方法の第2段階は、アフイニイテイ・クロマトグラ
フィとして特性化される技法を用いて、主として回収し
た高純度■:Cを濃縮することに向けられている。
フィとして特性化される技法を用いて、主として回収し
た高純度■:Cを濃縮することに向けられている。
この方法の第1段階か′らえられた■:C溶液は、約1
0〜20回除重位(以下“単位”と称呼する)の効力を
もっており、アミノヘキシル置換アガローゼを含むカラ
ム中で処理される。つぎにカラムを緩衛溶液で洗浄し、
そして■二Cをカルシウム・イオン含有溶液で溶離させ
て、1000単位/1を超え、かつ血漿から160.0
00倍以ト純化されている■;C濃縮液をつる。かくて
、この方法によって、予期しない高純度の親凝縮剤活竹
蛋白質が、高度に濃縮され、かつ治療上有用な状態でえ
られた。これまでに使用された方法では、いくつかの理
由から、上記の顕著な結果を達成できない。前述したT
ufldenhalらの方法は、この発明に使用された
■:RPに特異で、かつ高度に選択的な単クローン抗血
清の代りに、結合多クローン抗血清を使用している。そ
の結果、■:RPに特異な抗体が、少数しか、一定重量
のアガローゼと結合しない。この発明による方法では、
単クローン抗体が、もっばら比較的不活性な基質と結合
される。T uddenhamらの方法を使用するとき
は、免疫アガローゼ・ビーズ1当りに■:RP2.6〜
6.4単位(カラムに充填した量の53.1〜82.9
%に相当)のみが除去される。これは、この発明の単ク
ローン抗体免疫吸着剤を使用する場合に回収されるビー
ズ−1当り1000単位(すなわち、カラムに充填され
る■:RPの90〜100%)以上に匹敵する。したが
って、ビーズ−1当りに■:C/■:RP(因子■/ウ
ィルレブランド因子)以上を吸着する、この能力が、引
続き免疫吸着剤から溶離されると、より高度の濃縮■:
Cを生ずる。かくて、T uddenhallらの方法
による溶離液−1当り0.5〜1.25単位と対比して
、この発明では、溶離液1当りに■:C10〜20単位
かえられる。
0〜20回除重位(以下“単位”と称呼する)の効力を
もっており、アミノヘキシル置換アガローゼを含むカラ
ム中で処理される。つぎにカラムを緩衛溶液で洗浄し、
そして■二Cをカルシウム・イオン含有溶液で溶離させ
て、1000単位/1を超え、かつ血漿から160.0
00倍以ト純化されている■;C濃縮液をつる。かくて
、この方法によって、予期しない高純度の親凝縮剤活竹
蛋白質が、高度に濃縮され、かつ治療上有用な状態でえ
られた。これまでに使用された方法では、いくつかの理
由から、上記の顕著な結果を達成できない。前述したT
ufldenhalらの方法は、この発明に使用された
■:RPに特異で、かつ高度に選択的な単クローン抗血
清の代りに、結合多クローン抗血清を使用している。そ
の結果、■:RPに特異な抗体が、少数しか、一定重量
のアガローゼと結合しない。この発明による方法では、
単クローン抗体が、もっばら比較的不活性な基質と結合
される。T uddenhamらの方法を使用するとき
は、免疫アガローゼ・ビーズ1当りに■:RP2.6〜
6.4単位(カラムに充填した量の53.1〜82.9
%に相当)のみが除去される。これは、この発明の単ク
ローン抗体免疫吸着剤を使用する場合に回収されるビー
ズ−1当り1000単位(すなわち、カラムに充填され
る■:RPの90〜100%)以上に匹敵する。したが
って、ビーズ−1当りに■:C/■:RP(因子■/ウ
ィルレブランド因子)以上を吸着する、この能力が、引
続き免疫吸着剤から溶離されると、より高度の濃縮■:
Cを生ずる。かくて、T uddenhallらの方法
による溶離液−1当り0.5〜1.25単位と対比して
、この発明では、溶離液1当りに■:C10〜20単位
かえられる。
この方法によると、■:RPに対して高親和力を示す単
りO−ン抗体も選択できる。ただし、多クローン抗体を
使用すると親和力に変化をもたらす。■:RPの結合抗
体の親和性と、■:RPの溶離の間には、間接的な関係
があることを認めなければならない。かくて、抗体の■
:RPに対する親和性が高くなるほど、溶離物中の■:
Cとともに、■:RPの存在饋が減する。この発明によ
って、特異中クローン抗体を無制限にうろこともでき、
したがってまた種々のバッチの間の変種を排除できる。
りO−ン抗体も選択できる。ただし、多クローン抗体を
使用すると親和力に変化をもたらす。■:RPの結合抗
体の親和性と、■:RPの溶離の間には、間接的な関係
があることを認めなければならない。かくて、抗体の■
:RPに対する親和性が高くなるほど、溶離物中の■:
Cとともに、■:RPの存在饋が減する。この発明によ
って、特異中クローン抗体を無制限にうろこともでき、
したがってまた種々のバッチの間の変種を排除できる。
前述したように、■:Cを■:RPから分離するために
アミノヘキシル・アガローゼを使用したことを報告した
が、分離および精製段階に続いて、■:Cを濃縮するた
めに、このような物質が使用されたことはなかった。こ
れまでに、クロマトグラフィにアミノヘキシル・アガO
−ゼを用いて達成された最高の■:C濃度は、人間の蛋
白質について溶離液1当りに0.53単位、豚の■:C
について溶離液1当りに2.38単位であった。この発
明によれば、これより数桁大きな濃度をうることができ
る。おそらくは、さらに重要と考えられるのは、この発
明によって、これまでに報告されたより高い純度の人間
の■:Cがえられるという事実である(血漿の164.
000対17.000倍)。以後に、さらに詳細に述べ
る、この方法によって、市販の濃縮液を使用すると、2
.300単位/−9の特異度活性を有する■:Cがえら
れる。これは血漿からの純度の164.000倍に相当
する。■:Cと、■:RPの比は、血漿中の比と比較す
ると105以上である。
アミノヘキシル・アガローゼを使用したことを報告した
が、分離および精製段階に続いて、■:Cを濃縮するた
めに、このような物質が使用されたことはなかった。こ
れまでに、クロマトグラフィにアミノヘキシル・アガO
−ゼを用いて達成された最高の■:C濃度は、人間の蛋
白質について溶離液1当りに0.53単位、豚の■:C
について溶離液1当りに2.38単位であった。この発
明によれば、これより数桁大きな濃度をうることができ
る。おそらくは、さらに重要と考えられるのは、この発
明によって、これまでに報告されたより高い純度の人間
の■:Cがえられるという事実である(血漿の164.
000対17.000倍)。以後に、さらに詳細に述べ
る、この方法によって、市販の濃縮液を使用すると、2
.300単位/−9の特異度活性を有する■:Cがえら
れる。これは血漿からの純度の164.000倍に相当
する。■:Cと、■:RPの比は、血漿中の比と比較す
ると105以上である。
以′下の記述によって、■:Cの分離、精製、および濃
縮が、従来知られなかった程度の純度と濃縮度に達成さ
れるために、この発明の実施態様が実施され、かつ用い
られる方法の詳細が示される。
縮が、従来知られなかった程度の純度と濃縮度に達成さ
れるために、この発明の実施態様が実施され、かつ用い
られる方法の詳細が示される。
この記述は、この発明を例示するものではあるが、とく
にこの発明を限定するものと解されるべきではなく、ま
た、この技術にたけた人の知識範囲内にあると考えられ
る変化は、この発明の範囲内に入るとみなすものとする
。
にこの発明を限定するものと解されるべきではなく、ま
た、この技術にたけた人の知識範囲内にあると考えられ
る変化は、この発明の範囲内に入るとみなすものとする
。
A、 ■:RPに対する クローン の−整引続き分
S基賀に結合される■:RPに対する単クローン抗体は
、高度に精製した因子■/ウイルレブランド因子(■:
C/■:Rpat==)の調製に始まる段階的な手順に
よってII製できる。精製は、血漿源からえられた物質
により行なうが、またはさらに純度の低い物質が、FA
CTORATEにューヨーク州T uchahoe市A
ra+our Pharllaceutical
CO社製品の商標名)またはHemophil (カ
リホルニア州Costa M esa市Hyland
L aboratOries社製品の商標名)とし
て市販されている商業抽出剤のような、さらに高濃度の
濃縮液中、で使用される。精製は、IMMUNOASS
AYS:CLINICAL LABORATORY
TECトINIQLJFs FORT
HF 1980=s、R,M、Nakagiuras
、出版元、Alan R,Li5s 、 Tnc、
、 New York 、 pp339〜349
(1980)に発表されたZ immermanおよび
Robertsによる6°因子■関連抗涼″で記述され
ている標準低温析出物アガロ−ゼーゲル濾過によって行
なわれる。マイスには、以下の手順にしたがって血漿に
よってえられた高純度因子■/ウィルレブランド因子が
注射された。ゼロ日には、マイスには、蛋白質1011
1(lを。、0.05Mのトライス、0.15Mの塩化
ナトリウム、0.02%のアジ化ナトリウム、1mMの
フェニル鳴メチル弗化スルフォニル、pH7,3で10
単位/−1のトラジブルを含む0.illの緩衝溶液中
の溶解(または懸濁)させ、かつ等量の完全70インド
補助液により振盪して調製された組成液が、イントウペ
リトニアルに注射すれた。14日目に、マイスには再び
、完全フロイント補助液が、不完全70インド補助液に
替っただけで、同一物質が注射された。21日目には、
14日目の注射が繰返される。38日目には、マイスに
は、精製■:C/■:RPのみが注射される。42日目
には、マイスの牌が切除されそしてJOURNAL
OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
、Vol、225.DEl、4980〜4983 (1
980)所載のJ、 P、 Brownらによる“単り
0−ン抗体による免疫析出法により識別した標準および
悪性人間細胞の蛋白質抗原″で発表された型式の標準法
にしたがって溶解される。標準法は、35%ポリエチレ
ン・グリコール1000が、50%ポリエチレン・グリ
コールに代っている点だけが変っている。”V”字型底
を備えるフレキシブル型のポリビニール板は、−り記の
手順にしたがって市販抽■液から精製され、かつ蛋白質
濃喰0.125++ (J /mlの因゛子■0,11
+ によ−)でコーティングされている。ポリビニール
板は、アルブミンで閉塞され、緩衡液で洗浄され、そし
て試験対象クローンからの培養液により培養される。つ
ぎにポリビニール板を洗浄して、ラビット抗マウスIo
G抗血清と反応させ、もう一度洗浄し、そして125
■標識の山羊抗うビットIoG抗血清をウェルに添加し
て、培養する。ポリビニール板を再び洗浄して、つぎに
乾燥し、そしてウェルを切除して計数する。陽性のクロ
ーンを求めてから、これらを少なくとも2回クローン分
けして、つぎに■:RPに対する抗体を生ずるクローン
を小空洞注射前少なくとも4日前にプリスチン0.5g
1lによりイントラペリトニアリに前処置しである3a
lb/Cマイスの腹膜腔に注射する。ハイバードマセル
がマウス当り約5x10Bセルの濃度で、胎児牛血清の
ない0.5m lのDe I becco改良Eagl
e培養基に注入される。マイスは、[111すると切開
され、そして腹水液が約10単位/1でヘパリンに集め
られる。複数のマイスからの腹水液がプールされて、そ
の後の単クローンI(IGの分離用の従来量となる。ヘ
パリン化した腹水液をただちに使用しないときは、この
腹水液は、−70℃で保存され、そして使用直前に解凍
される。腹水液からのI(IGの最終収量は100m1
腹水液当りでI(IG約10である。
S基賀に結合される■:RPに対する単クローン抗体は
、高度に精製した因子■/ウイルレブランド因子(■:
C/■:Rpat==)の調製に始まる段階的な手順に
よってII製できる。精製は、血漿源からえられた物質
により行なうが、またはさらに純度の低い物質が、FA
CTORATEにューヨーク州T uchahoe市A
ra+our Pharllaceutical
CO社製品の商標名)またはHemophil (カ
リホルニア州Costa M esa市Hyland
L aboratOries社製品の商標名)とし
て市販されている商業抽出剤のような、さらに高濃度の
濃縮液中、で使用される。精製は、IMMUNOASS
AYS:CLINICAL LABORATORY
TECトINIQLJFs FORT
HF 1980=s、R,M、Nakagiuras
、出版元、Alan R,Li5s 、 Tnc、
、 New York 、 pp339〜349
(1980)に発表されたZ immermanおよび
Robertsによる6°因子■関連抗涼″で記述され
ている標準低温析出物アガロ−ゼーゲル濾過によって行
なわれる。マイスには、以下の手順にしたがって血漿に
よってえられた高純度因子■/ウィルレブランド因子が
注射された。ゼロ日には、マイスには、蛋白質1011
1(lを。、0.05Mのトライス、0.15Mの塩化
ナトリウム、0.02%のアジ化ナトリウム、1mMの
フェニル鳴メチル弗化スルフォニル、pH7,3で10
単位/−1のトラジブルを含む0.illの緩衝溶液中
の溶解(または懸濁)させ、かつ等量の完全70インド
補助液により振盪して調製された組成液が、イントウペ
リトニアルに注射すれた。14日目に、マイスには再び
、完全フロイント補助液が、不完全70インド補助液に
替っただけで、同一物質が注射された。21日目には、
14日目の注射が繰返される。38日目には、マイスに
は、精製■:C/■:RPのみが注射される。42日目
には、マイスの牌が切除されそしてJOURNAL
OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
、Vol、225.DEl、4980〜4983 (1
980)所載のJ、 P、 Brownらによる“単り
0−ン抗体による免疫析出法により識別した標準および
悪性人間細胞の蛋白質抗原″で発表された型式の標準法
にしたがって溶解される。標準法は、35%ポリエチレ
ン・グリコール1000が、50%ポリエチレン・グリ
コールに代っている点だけが変っている。”V”字型底
を備えるフレキシブル型のポリビニール板は、−り記の
手順にしたがって市販抽■液から精製され、かつ蛋白質
濃喰0.125++ (J /mlの因゛子■0,11
+ によ−)でコーティングされている。ポリビニール
板は、アルブミンで閉塞され、緩衡液で洗浄され、そし
て試験対象クローンからの培養液により培養される。つ
ぎにポリビニール板を洗浄して、ラビット抗マウスIo
G抗血清と反応させ、もう一度洗浄し、そして125
■標識の山羊抗うビットIoG抗血清をウェルに添加し
て、培養する。ポリビニール板を再び洗浄して、つぎに
乾燥し、そしてウェルを切除して計数する。陽性のクロ
ーンを求めてから、これらを少なくとも2回クローン分
けして、つぎに■:RPに対する抗体を生ずるクローン
を小空洞注射前少なくとも4日前にプリスチン0.5g
1lによりイントラペリトニアリに前処置しである3a
lb/Cマイスの腹膜腔に注射する。ハイバードマセル
がマウス当り約5x10Bセルの濃度で、胎児牛血清の
ない0.5m lのDe I becco改良Eagl
e培養基に注入される。マイスは、[111すると切開
され、そして腹水液が約10単位/1でヘパリンに集め
られる。複数のマイスからの腹水液がプールされて、そ
の後の単クローンI(IGの分離用の従来量となる。ヘ
パリン化した腹水液をただちに使用しないときは、この
腹水液は、−70℃で保存され、そして使用直前に解凍
される。腹水液からのI(IGの最終収量は100m1
腹水液当りでI(IG約10である。
■:CII製目的の単クローンIgGの特異性は、以後
に述べる方法で、IOGを分離基質培養基と組合せ、そ
して結合1(IGが、血漿から■:RPおよび■:Cを
ともに除去し、かつ一方で■:RPが、固体状態のN質
と結合される単りローン■lJG、!:!l化合物を形
成したままであるのに対して、■:Cが引続いて、カル
シウム・イオンを含む溶液で溶離できることを示すこと
によって査定できる。
に述べる方法で、IOGを分離基質培養基と組合せ、そ
して結合1(IGが、血漿から■:RPおよび■:Cを
ともに除去し、かつ一方で■:RPが、固体状態のN質
と結合される単りローン■lJG、!:!l化合物を形
成したままであるのに対して、■:Cが引続いて、カル
シウム・イオンを含む溶液で溶離できることを示すこと
によって査定できる。
続いて免疫吸着剤を調製するために使用される単クロー
ン1(IGは、保存溶液の凍結部分を収集して解凍の直
後に、ヘパリン化してプールした腹水液から分離できる
。新鮮物質または凍結物質のいずれを使用するかに関わ
りなく、溶液は4℃にもたらされ、そして等量の、その
組成を下記に示すプロスフェート緩衝塩水溶液(PBS
)によって処理される。稀薄腹水は、等量の飽和硫酸ア
ンモニウム(SAS)を4℃で攪拌しながら、渦状で添
加すると析出してくる。SASは、過剰の硫酸アンモニ
ウムを水中で沸騰させ、4℃に冷却し、不溶解結晶を濾
別し、そして水酸化アンモニウムによって、l)Hを7
.0に調整して、調製する。
ン1(IGは、保存溶液の凍結部分を収集して解凍の直
後に、ヘパリン化してプールした腹水液から分離できる
。新鮮物質または凍結物質のいずれを使用するかに関わ
りなく、溶液は4℃にもたらされ、そして等量の、その
組成を下記に示すプロスフェート緩衝塩水溶液(PBS
)によって処理される。稀薄腹水は、等量の飽和硫酸ア
ンモニウム(SAS)を4℃で攪拌しながら、渦状で添
加すると析出してくる。SASは、過剰の硫酸アンモニ
ウムを水中で沸騰させ、4℃に冷却し、不溶解結晶を濾
別し、そして水酸化アンモニウムによって、l)Hを7
.0に調整して、調製する。
析出物とその上澄み液を少なくとも2時間攪拌して、4
℃で遠心分離する。遠心分離操作は、できれば14.O
OOrpmで、60分間行なうとよい(30,0OOX
(] )。腹水の上澄み液は、もう2回SASで沈析さ
れ、そして析出物と上澄み液の混合物を攪拌して、第1
サイクルと同様な方法で遠心分離する。第3析出操作か
らえられるベレットは、稀薄腹水液と等量のPBS中に
再懸濁され、イしてつぎにPBSに対して広範に透析さ
れる。透析バッグ中に現われる凝固物質は、20℃で遠
心分離により除去される。透析したIgGは、これを常
温で、水酸化アルミニウムの5%水溶液で攪拌すること
によって吸着される。吸着処理は、第1回の処理後の各
処理ごとに、2.5%水酸化アルミニウム溶液を用いて
少なくとも3回以上繰返される。吸着されたIOGは、
4℃にして、1回1.[配のようにSASで再析出する
。析出ベレットは、使用まで一20℃で保存するとよい
。
℃で遠心分離する。遠心分離操作は、できれば14.O
OOrpmで、60分間行なうとよい(30,0OOX
(] )。腹水の上澄み液は、もう2回SASで沈析さ
れ、そして析出物と上澄み液の混合物を攪拌して、第1
サイクルと同様な方法で遠心分離する。第3析出操作か
らえられるベレットは、稀薄腹水液と等量のPBS中に
再懸濁され、イしてつぎにPBSに対して広範に透析さ
れる。透析バッグ中に現われる凝固物質は、20℃で遠
心分離により除去される。透析したIgGは、これを常
温で、水酸化アルミニウムの5%水溶液で攪拌すること
によって吸着される。吸着処理は、第1回の処理後の各
処理ごとに、2.5%水酸化アルミニウム溶液を用いて
少なくとも3回以上繰返される。吸着されたIOGは、
4℃にして、1回1.[配のようにSASで再析出する
。析出ベレットは、使用まで一20℃で保存するとよい
。
B、 免疫吸看剤のII製
免疫@着剤は、組合わせて、組合わせ用の固体基質を調
製し、そして前者が後者と結合するよう両成分を反応さ
せる単クローンI(IGを適当に調製することによって
調製される。
製し、そして前者が後者と結合するよう両成分を反応さ
せる単クローンI(IGを適当に調製することによって
調製される。
(i ) 組合せ用IgGの調製
新たに析出したIoGを使用することができれば、ある
いはまた、予め凍結した析出物を@凍して使用してもよ
い。析出物はつぎにPBSに対して透析され、そしてな
おPBS中にある間に、容積とI(IG濃度(A2 s
o / 1.4=lIl(1/III(IG)が求め
られる。I(JGは、つぎに、I(IG溶液50+nl
当りに、10〜30マイクロリツトルの間、できれば2
0マイクロリツトルの弗化燐酸ジイソプロピルにより処
理される。生ずる溶液を常温で30分間、フード内で攪
拌し、そして処理したI(IGを、使用直前に、組合せ
緩衝液に対して一晩中透析する。最適と認められる組合
せ緩衝液は、できれば水酸化ナトリウムにより、pH9
に調整した0、25M炭酸ナトリウム溶液である。
いはまた、予め凍結した析出物を@凍して使用してもよ
い。析出物はつぎにPBSに対して透析され、そしてな
おPBS中にある間に、容積とI(IG濃度(A2 s
o / 1.4=lIl(1/III(IG)が求め
られる。I(JGは、つぎに、I(IG溶液50+nl
当りに、10〜30マイクロリツトルの間、できれば2
0マイクロリツトルの弗化燐酸ジイソプロピルにより処
理される。生ずる溶液を常温で30分間、フード内で攪
拌し、そして処理したI(IGを、使用直前に、組合せ
緩衝液に対して一晩中透析する。最適と認められる組合
せ緩衝液は、できれば水酸化ナトリウムにより、pH9
に調整した0、25M炭酸ナトリウム溶液である。
に1) 合せ用固体基質の調製
単クローン抗体は、蛋白質、とくに因子■自体に対して
高度の親和性をもたない物質に結合できるが、ガラス・
ビーズ、アゲローゼ、およびその誘導体のような物質が
好ましい。もっとも好ましい物質は、3epharos
e Cu2Sにュージャージー州P iscatwa
y市P harmacia F ine Chem
iCa!S 社製品の商標名)として知られるゲルと
して市販されている交叉結合アゲローゼである。
高度の親和性をもたない物質に結合できるが、ガラス・
ビーズ、アゲローゼ、およびその誘導体のような物質が
好ましい。もっとも好ましい物質は、3epharos
e Cu2Sにュージャージー州P iscatwa
y市P harmacia F ine Chem
iCa!S 社製品の商標名)として知られるゲルと
して市販されている交叉結合アゲローゼである。
好ましい免疫吸着樹脂調製の方法は、一般に、J、 p
orathら、JOURNAL OF CHROM
ATOGRAPHY、Vol、86.tlp53〜56
(1973)の方法のような、文献に発表されたと同
一の方法である。最適と認められる方法は、つぎのとう
りである。すなわち、約2fL容量のS epharo
se CL 2 Bが、酸で洗浄した2髪容鏝の焼結
ガラス・フィルタ漏斗中に置かれる。樹脂は、水で洗浄
され、ぞして湿潤ケーキに濾過される。洗浄した樹脂を
、磁気撹拌棒を備える大きな(約4σ)ガラス・ビー力
中に置く。つぎに5Mの第2燐酸カリ溶液の1部を、5
Mの第3燐酸カリ溶液の2部を混合して調製した冷燐酸
カリ緩衡溶液750+lllを樹脂に添加する。十分な
冷水を加えて、最終容量を31とする。つぎに混合物を
4℃に冷却し、磁気攪拌板上に置いた氷−水浴中、4〜
10℃の間で保持する。フード内では、臭化シアンが、
磁気撹拌棒を含むストッパ付きガラスびん内の水300
111+に添加される。溶液を生ずるまで、混合物を迅
速に攪拌する。つぎに臭化シアン溶液が、2分間にわた
って攪拌しながら、冷S epharo3e混合液に添
加される。攪拌をさらに8分間続けて、つぎに41容慢
の真空ノラス]に支持される冷した2髪容穆の焼結ガラ
ス・フィルタに移される。臭化シアンで処理した樹脂は
、つぎに約20Mの冷水によるか、または濾液のEIH
が中性となるまで洗浄される。洗浄した樹脂をつぎに速
やかに、6組合せ緩衝液で、均衡化させで、つぎに大型
の磁気撹拌棒を備える4■■のプラスチック・ビー力に
移す。
orathら、JOURNAL OF CHROM
ATOGRAPHY、Vol、86.tlp53〜56
(1973)の方法のような、文献に発表されたと同
一の方法である。最適と認められる方法は、つぎのとう
りである。すなわち、約2fL容量のS epharo
se CL 2 Bが、酸で洗浄した2髪容鏝の焼結
ガラス・フィルタ漏斗中に置かれる。樹脂は、水で洗浄
され、ぞして湿潤ケーキに濾過される。洗浄した樹脂を
、磁気撹拌棒を備える大きな(約4σ)ガラス・ビー力
中に置く。つぎに5Mの第2燐酸カリ溶液の1部を、5
Mの第3燐酸カリ溶液の2部を混合して調製した冷燐酸
カリ緩衡溶液750+lllを樹脂に添加する。十分な
冷水を加えて、最終容量を31とする。つぎに混合物を
4℃に冷却し、磁気攪拌板上に置いた氷−水浴中、4〜
10℃の間で保持する。フード内では、臭化シアンが、
磁気撹拌棒を含むストッパ付きガラスびん内の水300
111+に添加される。溶液を生ずるまで、混合物を迅
速に攪拌する。つぎに臭化シアン溶液が、2分間にわた
って攪拌しながら、冷S epharo3e混合液に添
加される。攪拌をさらに8分間続けて、つぎに41容慢
の真空ノラス]に支持される冷した2髪容穆の焼結ガラ
ス・フィルタに移される。臭化シアンで処理した樹脂は
、つぎに約20Mの冷水によるか、または濾液のEIH
が中性となるまで洗浄される。洗浄した樹脂をつぎに速
やかに、6組合せ緩衝液で、均衡化させで、つぎに大型
の磁気撹拌棒を備える4■■のプラスチック・ビー力に
移す。
(iii ) 単クローン抗体の固体基質への組合せ
上記にしたがって調製した固体基質樹脂は、組合せ緩衝
液で均衡化されると、使用するばかりの状態になってる
から、その後に保存してはならない。したがって、樹脂
混合物は、先に一晩中組合せ緩衝液に対して透析された
IgGと組合わされる。組合わせた樹脂/IOG懸濁混
合液は、約24時間か藝ノで、4℃で攪拌される。上澄
み組合せ液の稀釈しない試料のA2 s oが、標準と
して牛型面清アルブミン(BSA)、または標準として
BSAを使用するバイオレイド プロティン アセイ(
ブラッドフォード リージェント)を開いて求めること
ができる。次に組合わされる配位子の%を計算できる。
上記にしたがって調製した固体基質樹脂は、組合せ緩衝
液で均衡化されると、使用するばかりの状態になってる
から、その後に保存してはならない。したがって、樹脂
混合物は、先に一晩中組合せ緩衝液に対して透析された
IgGと組合わされる。組合わせた樹脂/IOG懸濁混
合液は、約24時間か藝ノで、4℃で攪拌される。上澄
み組合せ液の稀釈しない試料のA2 s oが、標準と
して牛型面清アルブミン(BSA)、または標準として
BSAを使用するバイオレイド プロティン アセイ(
ブラッドフォード リージェント)を開いて求めること
ができる。次に組合わされる配位子の%を計算できる。
上記の手順にしたがうと、この%は通常約95%である
。抗体に組合わされない1M脂の残留活性点は、樹脂を
、焼結ガラス・フィルタ漏斗上で、0.1Mグリシンを
含有する6組合せm衡液で洗浄することによって閉塞で
きる。
。抗体に組合わされない1M脂の残留活性点は、樹脂を
、焼結ガラス・フィルタ漏斗上で、0.1Mグリシンを
含有する6組合せm衡液で洗浄することによって閉塞で
きる。
つぎに樹脂を再び、それぞれの組合せ緩衛液中の樹脂と
抗体が組合わされた容積に等しい最終容積の溶液中に懸
濁される。懸濁液を4℃で一晩中、ゆっくりと攪拌する
。つぎに樹脂を、以下に示す組成の■:C緩衡緩衝十分
に洗浄する。つぎに組合わせ、閉塞した樹脂を、できけ
ば塩化カルシウムとしての0.5Mカルシウム・イオン
を含む■:Cl1vki液でさらに予i溶離する。樹脂
を再び■:C緩衡緩衝けで洗浄し、使用するまで、4℃
で、または常温で連続的にポンプ送りされるカラム中に
保存する。IQGの5EP)IARO3Eに対する組合
せ密度は、5EPHARO3F 1当りに2〜5(1
,できれば3〜4qroGとする。
抗体が組合わされた容積に等しい最終容積の溶液中に懸
濁される。懸濁液を4℃で一晩中、ゆっくりと攪拌する
。つぎに樹脂を、以下に示す組成の■:C緩衡緩衝十分
に洗浄する。つぎに組合わせ、閉塞した樹脂を、できけ
ば塩化カルシウムとしての0.5Mカルシウム・イオン
を含む■:Cl1vki液でさらに予i溶離する。樹脂
を再び■:C緩衡緩衝けで洗浄し、使用するまで、4℃
で、または常温で連続的にポンプ送りされるカラム中に
保存する。IQGの5EP)IARO3Eに対する組合
せ密度は、5EPHARO3F 1当りに2〜5(1
,できれば3〜4qroGとする。
C0■二Cの分離と精製
因子■の人間および動物血漿、および市販の濃縮血液の
ような因子■の試料調製は、この発明で用いることがで
き、かつその方法は、特定型の物質に限られるものでは
ない。好ましい物質、および良好な結果を示した物質は
、豚および人間の自消、および市販されている人間の因
子■の濃縮液例えば、A rmour P harm
acentica1社から発売されているFACTOR
ATEである。以下の記述は、豚の血漿、または例えば
FACTORATEのような市販の人間の濃縮血を用い
るについての詳細を示すものである。すなわち、 FACTORATEは、■二C緩衡WI25+a1部を
、そぞれ20本(25m l /本)の内容物に加える
ことによって再構成される。混合液は、最終容−■:C
!!衡液1αに調整される。0.5−1倍の試料を分析
のため除くことができ、そして残余の物質を、免疫吸糖
カラムに終液、約60m1/時の割合で加えることがで
きる。
ような因子■の試料調製は、この発明で用いることがで
き、かつその方法は、特定型の物質に限られるものでは
ない。好ましい物質、および良好な結果を示した物質は
、豚および人間の自消、および市販されている人間の因
子■の濃縮液例えば、A rmour P harm
acentica1社から発売されているFACTOR
ATEである。以下の記述は、豚の血漿、または例えば
FACTORATEのような市販の人間の濃縮血を用い
るについての詳細を示すものである。すなわち、 FACTORATEは、■二C緩衡WI25+a1部を
、そぞれ20本(25m l /本)の内容物に加える
ことによって再構成される。混合液は、最終容−■:C
!!衡液1αに調整される。0.5−1倍の試料を分析
のため除くことができ、そして残余の物質を、免疫吸糖
カラムに終液、約60m1/時の割合で加えることがで
きる。
新鮮な状態で引出せない場合、豚の血漿は、従来の方法
でくえん酸処理して、凍結保存される。
でくえん酸処理して、凍結保存される。
使用する場合はに、これは35〜40℃の闇、できれば
37℃の温度で解凍して、直接601 ) /時の割合
でカラムに加えられる。
37℃の温度で解凍して、直接601 ) /時の割合
でカラムに加えられる。
この発明の記述は、クロマトグラフィ・カラム中の免疫
吸着液に組合された粒子の使用に関連し、つ本来的にこ
れらの使用を指向しているが、抗体結合樹脂粒子を、適
当な容器に入れ、そして上記にしたがって、また下記に
さらに詳述する■:Cの再構成濃縮血液、または血漿を
加えてから、バッチ方式で分離を行なうことは、この発
明の範囲内であることに注目すべきである。
吸着液に組合された粒子の使用に関連し、つ本来的にこ
れらの使用を指向しているが、抗体結合樹脂粒子を、適
当な容器に入れ、そして上記にしたがって、また下記に
さらに詳述する■:Cの再構成濃縮血液、または血漿を
加えてから、バッチ方式で分離を行なうことは、この発
明の範囲内であることに注目すべきである。
クロマトグラフィ法により、この方法を実施する場合に
は、以下の実施態様が好ましい。すなわち、 樹脂を、Am1con 86001 (マサチコセット
州しキシントン市Am1con社製品商標名)のような
、螺動ポンプを備え、かつ流れヘッドの高いカラム中に
入れる。因子■源として濃縮血液を使用する場合には、
20本の希釈濃縮血液に対して、上記にしたがって調製
した樹脂的1.5愛が用いられる。豚の血漿を使用する
ときは、面漿吏ごとに150m1の樹脂が使用される。
は、以下の実施態様が好ましい。すなわち、 樹脂を、Am1con 86001 (マサチコセット
州しキシントン市Am1con社製品商標名)のような
、螺動ポンプを備え、かつ流れヘッドの高いカラム中に
入れる。因子■源として濃縮血液を使用する場合には、
20本の希釈濃縮血液に対して、上記にしたがって調製
した樹脂的1.5愛が用いられる。豚の血漿を使用する
ときは、面漿吏ごとに150m1の樹脂が使用される。
試料をカラムに施してから、試料は1愛の■:C緩衡緩
衝洗浄され、続いて、さらに0.5MのNaclを含む
■:cm衡液により第2洗浄される。
衝洗浄され、続いて、さらに0.5MのNaclを含む
■:cm衡液により第2洗浄される。
因子■が濃縮血液として加えられるときは、約20nの
塩水緩衝液が、豚の血漿が用いられるときは、20床容
積が用いられる。11/hrの流速で最適の結果かえら
れる。
塩水緩衝液が、豚の血漿が用いられるときは、20床容
積が用いられる。11/hrの流速で最適の結果かえら
れる。
精製■:Cの溶離は、カルシウム・イオンを含む■:C
緩衡緩衝行なわれる。上記のTuddenbramらに
よって示されるように、線型勾配が効率的ではあるが、
この点は、この発明の目的を達成するためには必要ない
。一定濃度のカルシウム・イオンを有する溶液が、きわ
めて適切である。かくて、濃縮血液からえられる■:C
が溶離されているときは、塩化カルシウムに関して0.
25〜0゜5M、できれば0.35Mの■:C緩衡緩衝
、流速450〜750m+/時、できれば6(10ml
/時として有利に使用される。■二〇が、豚の血漿から
えられるときは、溶離は、塩化カルシウム濃度0.35
〜0.7Mの間、できれば0.5Mの■:C緩衡溶液で
、かつ流速10〜30a+1/時の間、できれば20m
1/時で行なわれる。12霞1および3nIlの溜升が
、それぞれ濃縮血液および豚の血漿からえられる■:C
用に集められる。これらの少なくとも1.0単位/1の
■:C濃度を含む溜升がプールされ、そしてプールの総
容積とプールの1度を求める。
緩衡緩衝行なわれる。上記のTuddenbramらに
よって示されるように、線型勾配が効率的ではあるが、
この点は、この発明の目的を達成するためには必要ない
。一定濃度のカルシウム・イオンを有する溶液が、きわ
めて適切である。かくて、濃縮血液からえられる■:C
が溶離されているときは、塩化カルシウムに関して0.
25〜0゜5M、できれば0.35Mの■:C緩衡緩衝
、流速450〜750m+/時、できれば6(10ml
/時として有利に使用される。■二〇が、豚の血漿から
えられるときは、溶離は、塩化カルシウム濃度0.35
〜0.7Mの間、できれば0.5Mの■:C緩衡溶液で
、かつ流速10〜30a+1/時の間、できれば20m
1/時で行なわれる。12霞1および3nIlの溜升が
、それぞれ濃縮血液および豚の血漿からえられる■:C
用に集められる。これらの少なくとも1.0単位/1の
■:C濃度を含む溜升がプールされ、そしてプールの総
容積とプールの1度を求める。
■:Cブールは、最初に超精密圧力濾過のような標準法
によって10〜20m1に濃縮される。
によって10〜20m1に濃縮される。
この目的のためには、セルは、窒業圧5C1siのもと
てのYM−10メンブレンから効率的と認められたAm
1conによって攪拌された。窒業圧を解放してから、
30分間ゆっくりと攪拌を続け、そして濃縮プールの容
積と濃度を求める。プールは、温度が4℃に維持される
かぎり、短期間、例えば、−晩生保存できる。
てのYM−10メンブレンから効率的と認められたAm
1conによって攪拌された。窒業圧を解放してから、
30分間ゆっくりと攪拌を続け、そして濃縮プールの容
積と濃度を求める。プールは、温度が4℃に維持される
かぎり、短期間、例えば、−晩生保存できる。
上記した・免疫吸着液カラムは、カラムを、■:RPを
溶離するため、流速的0.5〜11/′時により、3M
のチオシアン酸ナトリウム溶液2床容饅で処理すると再
生できることに注目してよい。
溶離するため、流速的0.5〜11/′時により、3M
のチオシアン酸ナトリウム溶液2床容饅で処理すると再
生できることに注目してよい。
D、 製■:Cの濃縮
免疫吸着液カラムによる■:RPからの分離によって回
収された■:Cは、^度に精製されるが、治療上に利用
するためには、なお著しく稀薄Cある。これ以上の濃縮
は、以下の方法で調製され、かつ使用されるアミノヘキ
シル・アガローゼ・カラムを用いて行なわれる。
収された■:Cは、^度に精製されるが、治療上に利用
するためには、なお著しく稀薄Cある。これ以上の濃縮
は、以下の方法で調製され、かつ使用されるアミノヘキ
シル・アガローゼ・カラムを用いて行なわれる。
アミノヘキシル・アガO−ゼは、1.6−ジアミツヘキ
サンと反応したツガ0−ゼであって、そのそれぞれに端
末アミ、)基をもつ多数の6#A素原子鎖をもつアガロ
ーゼ樹脂を生ずる。このアガローゼ樹脂は、上&! A
ustenによって記述された方法にしたがって調製
でき、または供給業者から入手できる。この発明で、使
用に成功した上記物質の1つは、AH−,5EPHAR
O3E4B にュージャージ州p iscataway
市P harlacia F 1neChelica
ls社製品の商標名)の名称のもとて入手できる。
サンと反応したツガ0−ゼであって、そのそれぞれに端
末アミ、)基をもつ多数の6#A素原子鎖をもつアガロ
ーゼ樹脂を生ずる。このアガローゼ樹脂は、上&! A
ustenによって記述された方法にしたがって調製
でき、または供給業者から入手できる。この発明で、使
用に成功した上記物質の1つは、AH−,5EPHAR
O3E4B にュージャージ州p iscataway
市P harlacia F 1neChelica
ls社製品の商標名)の名称のもとて入手できる。
調製したものであれ、購入したものであれ、樹脂は、使
用前に調整しなければならない。これは以下のようにし
て行なわれる。容積、量、および寸法は、濃縮対象物質
の量に比例して調整される。
用前に調整しなければならない。これは以下のようにし
て行なわれる。容積、量、および寸法は、濃縮対象物質
の量に比例して調整される。
約1oのアミノヘキシル・アガローゼ(AH−8EPI
−IARO8E4B>を、焼結ガラス・フィルタ漏斗に
入れ、攪拌しながら、少なくとも20Qilの0.5M
塩化ナトリウムで洗浄する。つぎに樹脂を■:C緩衡緩
衝均衡させて、約0.9cm径のカラムに充填する。こ
こで考察される使用形式としては、流れアダプタ付きの
3io−RadF conoカラムが最適であると実証
されている。充填カラムの床容鯖は約4mlである。
−IARO8E4B>を、焼結ガラス・フィルタ漏斗に
入れ、攪拌しながら、少なくとも20Qilの0.5M
塩化ナトリウムで洗浄する。つぎに樹脂を■:C緩衡緩
衝均衡させて、約0.9cm径のカラムに充填する。こ
こで考察される使用形式としては、流れアダプタ付きの
3io−RadF conoカラムが最適であると実証
されている。充填カラムの床容鯖は約4mlである。
上記にしたがって調製した濃縮プールを、前節で述べた
樹脂齢およびカラム寸法を使用する場合、最終濃度10
0〜200■1まで、■:C!!衛液中で1:10に希
釈する。希釈プールを、流速200+el/時でカラム
に送る。
樹脂齢およびカラム寸法を使用する場合、最終濃度10
0〜200■1まで、■:C!!衛液中で1:10に希
釈する。希釈プールを、流速200+el/時でカラム
に送る。
つぎにカラムを、できれば塩化カルシウムからなるカル
シウム・イオンを含む■:C緩衡緩衝洗浄する。溶液は
、カルシウム・イオンに関して、0.01M〜0.03
Mの間、できけば0.025Mとする。
シウム・イオンを含む■:C緩衡緩衝洗浄する。溶液は
、カルシウム・イオンに関して、0.01M〜0.03
Mの間、できけば0.025Mとする。
濃縮■:Cの溶離は、先の洗浄段階で用いたより高濃度
のカルシウム・イオンを含む■:C!1衡溶液により、
流速5〜20el/時、できれば10il + /時で
行なう。この場合もまた、塩化カルシウムは、0.25
10.5M(7)lffi、r キレハ0 。
のカルシウム・イオンを含む■:C!1衡溶液により、
流速5〜20el/時、できれば10il + /時で
行なう。この場合もまた、塩化カルシウムは、0.25
10.5M(7)lffi、r キレハ0 。
3M濃度の好ましいカルシウム・イオン源である。
11III容積の溜升が、集められ、そして下記にした
がって分析される。集めた溜升は、4℃または凍結して
保存できる。豚の面漿源からえられた■:Cの調製は、
貯蔵前に1%の人間自消アルブミンにより安定化される
。
がって分析される。集めた溜升は、4℃または凍結して
保存できる。豚の面漿源からえられた■:Cの調製は、
貯蔵前に1%の人間自消アルブミンにより安定化される
。
分析は、溜升を、必要に応じて■:C緩衡緩衝希釈し、
そしてさらに基質へ添加する前に、溜升を分析緩衝液中
で1:100に希釈して行なう。
そしてさらに基質へ添加する前に、溜升を分析緩衝液中
で1:100に希釈して行なう。
標準部分トロンボプラスチン時間分析法が用いられる。
M衡液の組成は以下のとうりである。
塩 衡塩水溶液
燐酸ナトリウム160 −塩基性一水和物燐酸ナトリウ
ム8.4〇 二塩基性無水和物塩化ナトリウム61.4 水 7銃まで 緩衝液のpHは7.2である。
ム8.4〇 二塩基性無水和物塩化ナトリウム61.4 水 7銃まで 緩衝液のpHは7.2である。
■土511m3劃
slo、02M イミダゾール
蒙10.15M 塩化ナトリウム
ml 0.10M リジン
mlo、02% アジ化ナトリウム
緩衝液のpHは、濃塩酸で6.8に調整される。
表Iおよび表■に挙げるデータは、上記にしたがう、こ
の発明にしたがってえられた代表的なデータである。
の発明にしたがってえられた代表的なデータである。
以下空白
優先的な実施態様のみが、この明細書にとくに例示され
、かつ記述されているが、この発明の多数の改良法およ
び変化法が、上記の教示に照して、またこの発明の精神
と意図の範囲から離れることなく、付記のクレームの範
囲内で、可能であることが認められるであろう。
、かつ記述されているが、この発明の多数の改良法およ
び変化法が、上記の教示に照して、またこの発明の精神
と意図の範囲から離れることなく、付記のクレームの範
囲内で、可能であることが認められるであろう。
特許出願人
スクリップス クリニック アンド
リサーチ ファンデーション
代理人 弁理士 三 好 保 男代理人 弁理
士 三 好 秀 和第1頁の続き 0発 明 者 カーフル・アン・フルチャーアメリカ合
衆国カリフォルニア 州92037う・ベヨラ・う・ジヨ ウ・ポールエバード7543
士 三 好 秀 和第1頁の続き 0発 明 者 カーフル・アン・フルチャーアメリカ合
衆国カリフォルニア 州92037う・ベヨラ・う・ジヨ ウ・ポールエバード7543
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1) 以下の段階からなる因子■親凝集性活性蛋白
質を調製する改良法。 (a) ■:C/■:RP錯化合物を自漿または市販
の濃縮血液源から、■:RPに特異な単クローン抗体と
結合した粒子に結合させる。 (b) ■:Cを溶離させる。 (C)ステップ(b)でえられた■:Cを、■二Cを濃
縮する別の吸着体に吸着させる。 (d ) 吸着された■:Cを溶離させ、そして(e
)十分に精製して濃縮した■:Cを回収する。 (2)請求の範囲(1)にしたがう方法であって、ステ
ップ(b )および(d )のそれぞれに使用した溶離
剤が塩水溶液である方法。 (3)請求の範囲(2)にしたがう方法であって、塩水
溶液が、塩化カルシウムである方法。 (4)請求の範囲(3)にしたがう方法であって、ステ
ップ(b )および(d )で使用した上記塩化カルシ
ウム溶液の濃度が、約0.25Mから約0.5Mまでの
範囲である方法。 (5) !I求の範囲(1)にしたがう方法であって
、ステップ(a)における上記吸着剤粒子がアガローゼ
である方法。 (6)請求の範囲(1)にしたがう方法であって、吸着
剤として、ステップ(C)で、アミノヘキシル・アゴ0
−ゼを用いる方法。 (7) 請求の範囲(6)にしたがう方法であって、
ステップ(b)および((1)における溶離剤として塩
化カルシウム溶液を用い、上記塩化カルシウム溶液の濃
度が、ステップ(b )では、約0.25Mから約0.
5Mまで、またステップ(d )では、約0.25Mか
ら約0.5Mまでの範囲である方法。 (8) ■:Cを、固体粒子に結合された■:RPに
特異な単クローン抗体からなる■:c/■:RPから分
離して精製するための改良免疫吸着剤。 (9)請求の範囲(8)にしたがう改良免疫吸着剤であ
って、上記固体粒子がリジンからなる吸着剤。 ■)請求の範囲(9)にしたがう改良免疫吸着剤であっ
て、上記リジンがアガO−ゼからなる吸着剤。 01) 請求の範囲(10)にしたがう改良免疫吸着
剤であって、上記アガローゼが交叉結合アガローゼであ
る吸着剤。 ■ 請求の範囲(11)にしたがう改良免疫吸着剤であ
って、上記免疫吸着剤が、アガO−ゼa当りに、単クロ
ーン抗体3〜4gの結合密度を有する吸着剤。 ■ 請求の範囲(1)の方法にしたがって調製した十分
に精製した濃縮■:00 (至) 請求の範囲(6)の方法にしたがって調製した
十分に精製した濃縮■:00 (15) 因子■親凝集活性蛋白質を、血漿または濃
縮血液から精製する方法において、上記血漿まちは濃縮
血液が、■:RPに特異な単クローン抗体に結合れてい
る吸着剤を有し、かつそれから■:Cを溶離させるクロ
マトグラフィ型カラムを通過する段階からなる改良。 (16) 請求の範囲(15)にしたがう方法であっ
て、上記吸着剤がアガローゼであり、かつ上記溶離剤が
、塩水溶液である方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/330,105 US4361509A (en) | 1981-12-14 | 1981-12-14 | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
US330105 | 1981-12-14 |
Related Child Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3202313A Division JPH0784480B2 (ja) | 1981-12-14 | 1991-07-18 | 改良免疫吸着剤 |
JP6242965A Division JP2554848B2 (ja) | 1981-12-14 | 1994-10-06 | Viii:c製剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS58131918A true JPS58131918A (ja) | 1983-08-06 |
JPH0723321B2 JPH0723321B2 (ja) | 1995-03-15 |
Family
ID=23288328
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP57217928A Expired - Lifetime JPH0723321B2 (ja) | 1981-12-14 | 1982-12-14 | 因子viii凝固活性蛋白質の調製 |
JP3202313A Expired - Lifetime JPH0784480B2 (ja) | 1981-12-14 | 1991-07-18 | 改良免疫吸着剤 |
JP6242965A Expired - Lifetime JP2554848B2 (ja) | 1981-12-14 | 1994-10-06 | Viii:c製剤 |
JP8112373A Pending JPH08301787A (ja) | 1981-12-14 | 1996-05-07 | Viii:c製剤 |
Family Applications After (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3202313A Expired - Lifetime JPH0784480B2 (ja) | 1981-12-14 | 1991-07-18 | 改良免疫吸着剤 |
JP6242965A Expired - Lifetime JP2554848B2 (ja) | 1981-12-14 | 1994-10-06 | Viii:c製剤 |
JP8112373A Pending JPH08301787A (ja) | 1981-12-14 | 1996-05-07 | Viii:c製剤 |
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Country | Link |
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EP (1) | EP0083483B2 (ja) |
JP (4) | JPH0723321B2 (ja) |
AR (1) | AR230954A1 (ja) |
AU (1) | AU545770B2 (ja) |
CA (1) | CA1208130A (ja) |
DE (3) | DE3278402D1 (ja) |
LU (1) | LU88333I2 (ja) |
NL (1) | NL930118I2 (ja) |
WO (1) | WO1983002114A1 (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPS6413099A (en) * | 1987-03-31 | 1989-01-17 | Baxter Int | Ultra-purification for polypeptide |
JPH01301625A (ja) * | 1987-12-21 | 1989-12-05 | Miles Inc | 因子8のゲル濾過法 |
JPH03501974A (ja) * | 1988-06-07 | 1991-05-09 | サントル レジョナル ド トランスヒュジオン サンギーヌ ド リル | 血漿蛋白質のクロマトグラフィーによる分離 |
JPH07106156B2 (ja) * | 1983-10-28 | 1995-11-15 | ジェネティックス、インスティチュ−ト | ファクタ−▲viii▼および関連生産物の製造 |
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---|---|---|---|---|
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US4614795A (en) * | 1982-08-05 | 1986-09-30 | University Of Rochester | Deglycosylated Human Factor VIII:C |
US4558005A (en) * | 1982-09-13 | 1985-12-10 | University Patents, Inc. | Monoclonal anti-erythropoietin |
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EP0118256B1 (en) * | 1983-03-04 | 1992-05-13 | Scripps Clinic And Research Foundation | Immunoadsorbent, and method of recovering vitamin-k dependent protein therewith |
EP0148843B2 (en) | 1983-03-21 | 1994-05-04 | Novo Nordisk A/S | A concentrate of the antihemophilic factor viii and a process for producing it |
US4649132A (en) * | 1983-03-31 | 1987-03-10 | Scripps Clinic And Research Foundation | Treatment of Factor VIII inhibitors |
US4657894A (en) * | 1983-03-31 | 1987-04-14 | Scripps Clinic & Research Foundation | New factor VIII coagulant polypeptides |
IE80638B1 (en) * | 1983-03-31 | 1998-10-21 | Scripps Research Inst | Monoclonal antibodies to new factor VIII coagulant polypeptides |
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MX9203641A (es) * | 1983-12-16 | 1992-07-01 | Genentech Inc | Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion. |
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