JPS58131918A - 因子８親凝集性活性蛋白質の調整方法およびその方法に使用する免疫吸着剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は一般に、因子■の親凝結剤活性蛋白質の分離
と精製に関している。さらにとくに、高純度因子■親凝
結剤活性蛋白質が、血漿または濃縮血液からの２段階の
ノロマドグラフ吸着および濃縮法によって、ウィルレブ
ランド因子から分離される。

血漿からの抗血友病因子の分離については、文献に発表
されている。抗血友病因子、すなわち、因子■の精密な
構造は、一部には、十分饅の純物質かえられず、より深
い研究が不可能なために、いまだに確認されていない。

純物質の入手に４１１約があり、しかもこの因子が稀薄
状態で存在するために、この因子の治療上の利用が妨げ
られていた。

因子■親凝結剤活性蛋白質は、血友病血漿中の凝固傾向
を正すよう機能する。これは、ウイルレブランド因子蛋
白賀と複合して、血漿中を循環する。ウイルレブランド
因子蛋白質は、血小板凝血因子欠陥を、ウイルシブラン
ド病に変化させることがある。因子■の、ウイルレブラ
ンド因子銘化合物の部分が凝集活性を有していて、これ
が、因子■−凝固活性、または単に■：Ｃと呼ばれる（
“■：Ｃ′′の名称は、以後、因子１分子の部分を上記
の凝固活性と識別するために用いられる）。

因子■のウィルシブランド病の血小板凝血因子欠陥を正
す能力をもつウイルレブランド因子錯化合物のもう一つ
の部分は、ウイルレブランド因子、抗原、■Ｒ：Ａ（１
、■：ＲＰ因子と関連した一因子■と呼ばれる（表示゛
■：　ＲＰ　”は、因子１分子の血小板補正機能を識別
するために用いられる）。これまでに実証されているわ
けではないが、■：Ｃが、非共有結晶錯塩として、■：
ＲＰと複合する小分子の特性と挙動を示すという結論を
裏付ける徴候がある。また■：（および■：ＲＰの双方
にともなう特性も、適当な条件のもとでは璧解して、２
部分の小片を生ずる単一分子でもありうるという主張に
ついての根拠もある。

因子■／ウィルＱプランジ因子！１塩、■：Ｃ１および
■：ＲＰの構造と、■二Ｃに帰せられる凝集剤活性の重
要な薬剤指数を識別する必要上、因子■をｍ製し、かつ
■：Ｃと■：ＲＰを分離し、かつ濃縮する多くの試みが
行なわれた。使用する技法は、一般に免疫吸着またはイ
オン交換クロマトグラフィのいずれかに基いていた。こ
のために使用される技法は、蛋白質から荷電イオン物質
を、損傷のない状態で除いたり、または上記物質を、適
切量で回収ることが困難なために、成功には制約があっ
た。

免疫吸着クロマトグラフィを利用する■：Ｃを■：ＲＰ
から分離する上記方法の１つが、Ｅ、Ｇ。

Ｄ　、　　　Ｔ　ｕｄｄｅｎｈａｎ＋らのＪＯＵＲＮＡ
Ｌ　　ＯＦ　　　１−ＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　　ＣＬＩＮ
ＩＣＡＬ　　ＭＦＤＩＣＩＮＦ、Ｖｏｌ、９３．Ｄ　４
０　（１９７９）゛免疫吸着クロマトグラフィによって
調製した因子■凝集剤活性の特性”によって発表されて
いる。

報告された方法は、■：Ｃを、多クローン抗血清が■：
ＲＰ（抗−■：　ＲＰ）に組合わされているアガローゼ
・ビーズを充填したクロマトグラフィ・カラムを用いる
、はとんどすべての■：ＲＰ。

およびほとんどのその他の血漿蛋白質から分離する１段
法である。血漿を含む因子■１ウイルレブランド因子は
、■二Ｃと、■：ＲＰの双方を吸着するカラムを通過す
る。その他の不都合は血漿蛋白質は、緩衝塩水溶液で洗
浄することによってカラムから除去され、そして所望の
■：Ｃが、その後のカルシウム・イオン勾配による溶離
によってえられる。この方法は、従来の既知の方法と比
較して、■二Ｃの純度と収率の双方においての改善であ
る旨主張されているが、生じた生成物もまた■：ＲＰ、
およびその伯の血漿蛋白質をも含むと述べている。この
ような汚染物質は、アガローゼ・ビーズと結合した多ク
ローン抗血清に原因するものと考えられる。抗血清が構
成される免疫グロブリンの大多数は、■：ＲＰに対して
特異でないから、■：ＲＰに特異な抗体がアガローゼに
拘束される有効点数は、アガローゼ上の特定数の拘束点
を求める抗血清の間の競合により、比較的に少ない。

アミノヘキシル置換アガ０−ゼを用いるクロマトグラフ
ィ・技法による■：Ｃを、■：ＲＰとリストセチン共因
子から分離するもう一つの方法が、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ａｕ５
ｔｅｎの、ＢＲＴＴＩＳＨＪＯＵＲＮＡＬ　　ＯＦ　　
ＨＡ、ＥＭＡＴＯＬＯＧＹ、Ｖｏｆ、４３．０６９　（
１９７９）’“因子■のアミノヘキシル・セファローゼ
からのクロマトグラフィによる分離″により報告されて
いる。記述の方法は、人間と豚の双方の因子■／ウイル
レブランド因子の成分部分についての改善法であると述
べられている。しかしながら、この方法もまた、汚染物
質が生ずる生成物中に存在するという欠点を示す。Ｔ　
ｕｄｄｅｎｈａｍら、およびＡ　ｕｓｔｅｎによる両方
法において、汚染物質は通常希望されるよりさらに稀薄
な状態で形成される。

したがって、血漿または濃縮血液を用いて、■−Ｃを、
■：ＲＰから分離して、精製するための改義方法の必要
性があることは明らかである。したがって、この発明の
目的は、このような必要性を満すことにある。

この発明は、因子■／ウイルレブランド囚丁子錯塩■：
Ｃ１および■：ＲＰの成分分子の分離法および親凝結剤
活性蛋白質■：Ｃの精製と濃縮に関している。この方法
は、２段法を用いて高純度の■：Ｃを生成する目的を達
成する。

第１段は、血漿または市販濃縮白液からの因子■の免疫
吸着である。使用の吸着剤は、例えばアガＯ−ゼ・ビー
ズのような適当な基質に結合される■：ＲＰに特異な申
クローン抗体からなっている。■：Ｃ／■：ＲＰが最初
に吸着されてから、基質粒子を緩衛溶液により十分に洗
浄して、非吸着蛋白質を除去する。つぎに吸着物質を、
吸着■：Ｃを溶離する溶液を含むカルシウム・イオンで
処理する。■：ＲＰ蛋白質は、抗■：ＲＰと結合した物
質に吸着されたままである。この点では、最初に吸着さ
れた■：Ｃの約４０〜６０％が、高純度状態で回収され
る。ただし、回収された親凝結剤活性蛋白質は、きわめ
て純度は高いが、すなわち、はとんど汚染物質を含んで
いないが、きわめて稀薄なたＩめ、有効な療法指数に達
していない。

この方法の第２段階は、アフイニイテイ・クロマトグラ
フィとして特性化される技法を用いて、主として回収し
た高純度■：Ｃを濃縮することに向けられている。

この方法の第１段階か′らえられた■：Ｃ溶液は、約１
０〜２０回除重位（以下“単位”と称呼する）の効力を
もっており、アミノヘキシル置換アガローゼを含むカラ
ム中で処理される。つぎにカラムを緩衛溶液で洗浄し、
そして■二Ｃをカルシウム・イオン含有溶液で溶離させ
て、１０００単位／１を超え、かつ血漿から１６０．０
００倍以ト純化されている■；Ｃ濃縮液をつる。かくて
、この方法によって、予期しない高純度の親凝縮剤活竹
蛋白質が、高度に濃縮され、かつ治療上有用な状態でえ
られた。これまでに使用された方法では、いくつかの理
由から、上記の顕著な結果を達成できない。前述したＴ
ｕｆｌｄｅｎｈａｌらの方法は、この発明に使用された
■：ＲＰに特異で、かつ高度に選択的な単クローン抗血
清の代りに、結合多クローン抗血清を使用している。そ
の結果、■：ＲＰに特異な抗体が、少数しか、一定重量
のアガローゼと結合しない。この発明による方法では、
単クローン抗体が、もっばら比較的不活性な基質と結合
される。Ｔ　ｕｄｄｅｎｈａｍらの方法を使用するとき
は、免疫アガローゼ・ビーズ１当りに■：ＲＰ２．６〜
６．４単位（カラムに充填した量の５３．１〜８２．９
％に相当）のみが除去される。これは、この発明の単ク
ローン抗体免疫吸着剤を使用する場合に回収されるビー
ズ−１当り１０００単位（すなわち、カラムに充填され
る■：ＲＰの９０〜１００％）以上に匹敵する。したが
って、ビーズ−１当りに■：Ｃ／■：ＲＰ（因子■／ウ
ィルレブランド因子）以上を吸着する、この能力が、引
続き免疫吸着剤から溶離されると、より高度の濃縮■：
Ｃを生ずる。かくて、Ｔ　ｕｄｄｅｎｈａｌｌらの方法
による溶離液−１当り０．５〜１．２５単位と対比して
、この発明では、溶離液１当りに■：Ｃ１０〜２０単位
かえられる。

この方法によると、■：ＲＰに対して高親和力を示す単
りＯ−ン抗体も選択できる。ただし、多クローン抗体を
使用すると親和力に変化をもたらす。■：ＲＰの結合抗
体の親和性と、■：ＲＰの溶離の間には、間接的な関係
があることを認めなければならない。かくて、抗体の■
：ＲＰに対する親和性が高くなるほど、溶離物中の■：
Ｃとともに、■：ＲＰの存在饋が減する。この発明によ
って、特異中クローン抗体を無制限にうろこともでき、
したがってまた種々のバッチの間の変種を排除できる。

前述したように、■：Ｃを■：ＲＰから分離するために
アミノヘキシル・アガローゼを使用したことを報告した
が、分離および精製段階に続いて、■：Ｃを濃縮するた
めに、このような物質が使用されたことはなかった。こ
れまでに、クロマトグラフィにアミノヘキシル・アガＯ
−ゼを用いて達成された最高の■：Ｃ濃度は、人間の蛋
白質について溶離液１当りに０．５３単位、豚の■：Ｃ
について溶離液１当りに２．３８単位であった。この発
明によれば、これより数桁大きな濃度をうることができ
る。おそらくは、さらに重要と考えられるのは、この発
明によって、これまでに報告されたより高い純度の人間
の■：Ｃがえられるという事実である（血漿の１６４．
０００対１７．０００倍）。以後に、さらに詳細に述べ
る、この方法によって、市販の濃縮液を使用すると、２
．３００単位／−９の特異度活性を有する■：Ｃがえら
れる。これは血漿からの純度の１６４．０００倍に相当
する。■：Ｃと、■：ＲＰの比は、血漿中の比と比較す
ると１０５以上である。

以′下の記述によって、■：Ｃの分離、精製、および濃
縮が、従来知られなかった程度の純度と濃縮度に達成さ
れるために、この発明の実施態様が実施され、かつ用い
られる方法の詳細が示される。

この記述は、この発明を例示するものではあるが、とく
にこの発明を限定するものと解されるべきではなく、ま
た、この技術にたけた人の知識範囲内にあると考えられ
る変化は、この発明の範囲内に入るとみなすものとする
。

Ａ、　■：ＲＰに対する　クローン　　の−整引続き分
Ｓ基賀に結合される■：ＲＰに対する単クローン抗体は
、高度に精製した因子■／ウイルレブランド因子（■：
Ｃ／■：Ｒｐａｔ＝＝）の調製に始まる段階的な手順に
よってＩＩ製できる。精製は、血漿源からえられた物質
により行なうが、またはさらに純度の低い物質が、ＦＡ
ＣＴＯＲＡＴＥにューヨーク州Ｔ　ｕｃｈａｈｏｅ市Ａ
ｒａ＋ｏｕｒ　　Ｐｈａｒｌｌａｃｅｕｔｉｃａｌ　　
ＣＯ社製品の商標名）またはＨｅｍｏｐｈｉｌ　　（カ
リホルニア州Ｃｏｓｔａ　　Ｍ　ｅｓａ市Ｈｙｌａｎｄ
　　Ｌ　ａｂｏｒａｔＯｒｉｅｓ社製品の商標名）とし
て市販されている商業抽出剤のような、さらに高濃度の
濃縮液中、で使用される。精製は、ＩＭＭＵＮＯＡＳＳ
ＡＹＳ：ＣＬＩＮＩＣＡＬ　　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　
　　　　ＴＥＣトＩＮＩＱＬＪＦｓ　　　　　ＦＯＲＴ
ＨＦ　　１９８０＝ｓ、Ｒ，Ｍ、Ｎａｋａｇｉｕｒａｓ
、出版元、Ａｌａｎ　　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　、　　Ｔｎｃ、
　、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　、　ｐｐ３３９〜３４９　
（１９８０）に発表されたＺ　ｉｍｍｅｒｍａｎおよび
Ｒｏｂｅｒｔｓによる６°因子■関連抗涼″で記述され
ている標準低温析出物アガロ−ゼーゲル濾過によって行
なわれる。マイスには、以下の手順にしたがって血漿に
よってえられた高純度因子■／ウィルレブランド因子が
注射された。ゼロ日には、マイスには、蛋白質１０１１
１（ｌを。、０．０５Ｍのトライス、０．１５Ｍの塩化
ナトリウム、０．０２％のアジ化ナトリウム、１ｍＭの
フェニル鳴メチル弗化スルフォニル、ｐＨ７，３で１０
単位／−１のトラジブルを含む０．ｉｌｌの緩衝溶液中
の溶解（または懸濁）させ、かつ等量の完全７０インド
補助液により振盪して調製された組成液が、イントウペ
リトニアルに注射すれた。１４日目に、マイスには再び
、完全フロイント補助液が、不完全７０インド補助液に
替っただけで、同一物質が注射された。２１日目には、
１４日目の注射が繰返される。３８日目には、マイスに
は、精製■：Ｃ／■：ＲＰのみが注射される。４２日目
には、マイスの牌が切除されそしてＪＯＵＲＮＡＬ　　
ＯＦ　　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
、Ｖｏｌ、２２５．ＤＥｌ、４９８０〜４９８３　（１
９８０）所載のＪ、　Ｐ、　Ｂｒｏｗｎらによる“単り
０−ン抗体による免疫析出法により識別した標準および
悪性人間細胞の蛋白質抗原″で発表された型式の標準法
にしたがって溶解される。標準法は、３５％ポリエチレ
ン・グリコール１０００が、５０％ポリエチレン・グリ
コールに代っている点だけが変っている。”Ｖ”字型底
を備えるフレキシブル型のポリビニール板は、−り記の
手順にしたがって市販抽■液から精製され、かつ蛋白質
濃喰０．１２５＋＋　（Ｊ　／ｍｌの因゛子■０，１１
＋　によ−）でコーティングされている。ポリビニール
板は、アルブミンで閉塞され、緩衡液で洗浄され、そし
て試験対象クローンからの培養液により培養される。つ
ぎにポリビニール板を洗浄して、ラビット抗マウスＩｏ
Ｇ抗血清と反応させ、もう一度洗浄し、そして１２５　
■標識の山羊抗うビットＩｏＧ抗血清をウェルに添加し
て、培養する。ポリビニール板を再び洗浄して、つぎに
乾燥し、そしてウェルを切除して計数する。陽性のクロ
ーンを求めてから、これらを少なくとも２回クローン分
けして、つぎに■：ＲＰに対する抗体を生ずるクローン
を小空洞注射前少なくとも４日前にプリスチン０．５ｇ
１ｌによりイントラペリトニアリに前処置しである３ａ
ｌｂ／Ｃマイスの腹膜腔に注射する。ハイバードマセル
がマウス当り約５ｘ１０Ｂセルの濃度で、胎児牛血清の
ない０．５ｍ　ｌのＤｅ　Ｉ　ｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌ
ｅ培養基に注入される。マイスは、［１１１すると切開
され、そして腹水液が約１０単位／１でヘパリンに集め
られる。複数のマイスからの腹水液がプールされて、そ
の後の単クローンＩ（ＩＧの分離用の従来量となる。ヘ
パリン化した腹水液をただちに使用しないときは、この
腹水液は、−７０℃で保存され、そして使用直前に解凍
される。腹水液からのＩ（ＩＧの最終収量は１００ｍ１
腹水液当りでＩ（ＩＧ約１０である。

■：ＣＩＩ製目的の単クローンＩｇＧの特異性は、以後
に述べる方法で、ＩＯＧを分離基質培養基と組合せ、そ
して結合１（ＩＧが、血漿から■：ＲＰおよび■：Ｃを
ともに除去し、かつ一方で■：ＲＰが、固体状態のＮ質
と結合される単りローン■ｌＪＧ、！：！ｌ化合物を形
成したままであるのに対して、■：Ｃが引続いて、カル
シウム・イオンを含む溶液で溶離できることを示すこと
によって査定できる。

続いて免疫吸着剤を調製するために使用される単クロー
ン１（ＩＧは、保存溶液の凍結部分を収集して解凍の直
後に、ヘパリン化してプールした腹水液から分離できる
。新鮮物質または凍結物質のいずれを使用するかに関わ
りなく、溶液は４℃にもたらされ、そして等量の、その
組成を下記に示すプロスフェート緩衝塩水溶液（ＰＢＳ
）によって処理される。稀薄腹水は、等量の飽和硫酸ア
ンモニウム（ＳＡＳ）を４℃で攪拌しながら、渦状で添
加すると析出してくる。ＳＡＳは、過剰の硫酸アンモニ
ウムを水中で沸騰させ、４℃に冷却し、不溶解結晶を濾
別し、そして水酸化アンモニウムによって、ｌ）Ｈを７
．０に調整して、調製する。

析出物とその上澄み液を少なくとも２時間攪拌して、４
℃で遠心分離する。遠心分離操作は、できれば１４．Ｏ
ＯＯｒｐｍで、６０分間行なうとよい（３０，０ＯＯＸ
（］　）。腹水の上澄み液は、もう２回ＳＡＳで沈析さ
れ、そして析出物と上澄み液の混合物を攪拌して、第１
サイクルと同様な方法で遠心分離する。第３析出操作か
らえられるベレットは、稀薄腹水液と等量のＰＢＳ中に
再懸濁され、イしてつぎにＰＢＳに対して広範に透析さ
れる。透析バッグ中に現われる凝固物質は、２０℃で遠
心分離により除去される。透析したＩｇＧは、これを常
温で、水酸化アルミニウムの５％水溶液で攪拌すること
によって吸着される。吸着処理は、第１回の処理後の各
処理ごとに、２．５％水酸化アルミニウム溶液を用いて
少なくとも３回以上繰返される。吸着されたＩＯＧは、
４℃にして、１回１．［配のようにＳＡＳで再析出する
。析出ベレットは、使用まで一２０℃で保存するとよい
。

Ｂ、　免疫吸看剤のＩＩ製 免疫＠着剤は、組合わせて、組合わせ用の固体基質を調
製し、そして前者が後者と結合するよう両成分を反応さ
せる単クローンＩ（ＩＧを適当に調製することによって
調製される。

（ｉ　）　　組合せ用ＩｇＧの調製 新たに析出したＩｏＧを使用することができれば、ある
いはまた、予め凍結した析出物を＠凍して使用してもよ
い。析出物はつぎにＰＢＳに対して透析され、そしてな
おＰＢＳ中にある間に、容積とＩ（ＩＧ濃度（Ａ２　ｓ
　ｏ　／　１．４＝ｌＩｌ（１／ＩＩＩ（ＩＧ）が求め
られる。Ｉ（ＪＧは、つぎに、Ｉ（ＩＧ溶液５０＋ｎｌ
当りに、１０〜３０マイクロリツトルの間、できれば２
０マイクロリツトルの弗化燐酸ジイソプロピルにより処
理される。生ずる溶液を常温で３０分間、フード内で攪
拌し、そして処理したＩ（ＩＧを、使用直前に、組合せ
緩衝液に対して一晩中透析する。最適と認められる組合
せ緩衝液は、できれば水酸化ナトリウムにより、ｐＨ９
に調整した０、２５Ｍ炭酸ナトリウム溶液である。

に１）　　　合せ用固体基質の調製 単クローン抗体は、蛋白質、とくに因子■自体に対して
高度の親和性をもたない物質に結合できるが、ガラス・
ビーズ、アゲローゼ、およびその誘導体のような物質が
好ましい。もっとも好ましい物質は、３ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　　Ｃｕ２Ｓにュージャージー州Ｐ　ｉｓｃａｔｗａ
ｙ市Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ　　Ｆ　ｉｎｅ　　Ｃｈｅｍ
ｉＣａ！Ｓ　　社製品の商標名）として知られるゲルと
して市販されている交叉結合アゲローゼである。

好ましい免疫吸着樹脂調製の方法は、一般に、Ｊ、　ｐ
ｏｒａｔｈら、ＪＯＵＲＮＡＬ　　ＯＦ　　ＣＨＲＯＭ
ＡＴＯＧＲＡＰＨＹ、Ｖｏｌ、８６．ｔｌｐ５３〜５６
　（１９７３）の方法のような、文献に発表されたと同
一の方法である。最適と認められる方法は、つぎのとう
りである。すなわち、約２ｆＬ容量のＳ　ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　　ＣＬ　２　Ｂが、酸で洗浄した２髪容鏝の焼結
ガラス・フィルタ漏斗中に置かれる。樹脂は、水で洗浄
され、ぞして湿潤ケーキに濾過される。洗浄した樹脂を
、磁気撹拌棒を備える大きな（約４σ）ガラス・ビー力
中に置く。つぎに５Ｍの第２燐酸カリ溶液の１部を、５
Ｍの第３燐酸カリ溶液の２部を混合して調製した冷燐酸
カリ緩衡溶液７５０＋ｌｌｌを樹脂に添加する。十分な
冷水を加えて、最終容量を３１とする。つぎに混合物を
４℃に冷却し、磁気攪拌板上に置いた氷−水浴中、４〜
１０℃の間で保持する。フード内では、臭化シアンが、
磁気撹拌棒を含むストッパ付きガラスびん内の水３００
１１１＋に添加される。溶液を生ずるまで、混合物を迅
速に攪拌する。つぎに臭化シアン溶液が、２分間にわた
って攪拌しながら、冷Ｓ　ｅｐｈａｒｏ３ｅ混合液に添
加される。攪拌をさらに８分間続けて、つぎに４１容慢
の真空ノラス］に支持される冷した２髪容穆の焼結ガラ
ス・フィルタに移される。臭化シアンで処理した樹脂は
、つぎに約２０Ｍの冷水によるか、または濾液のＥＩＨ
が中性となるまで洗浄される。洗浄した樹脂をつぎに速
やかに、６組合せ緩衝液で、均衡化させで、つぎに大型
の磁気撹拌棒を備える４■■のプラスチック・ビー力に
移す。

（ｉｉｉ　）　　単クローン抗体の固体基質への組合せ
上記にしたがって調製した固体基質樹脂は、組合せ緩衝
液で均衡化されると、使用するばかりの状態になってる
から、その後に保存してはならない。したがって、樹脂
混合物は、先に一晩中組合せ緩衝液に対して透析された
ＩｇＧと組合わされる。組合わせた樹脂／ＩＯＧ懸濁混
合液は、約２４時間か藝ノで、４℃で攪拌される。上澄
み組合せ液の稀釈しない試料のＡ２　ｓ　ｏが、標準と
して牛型面清アルブミン（ＢＳＡ）、または標準として
ＢＳＡを使用するバイオレイド　プロティン　アセイ（
ブラッドフォード　リージェント）を開いて求めること
ができる。次に組合わされる配位子の％を計算できる。

上記の手順にしたがうと、この％は通常約９５％である
。抗体に組合わされない１Ｍ脂の残留活性点は、樹脂を
、焼結ガラス・フィルタ漏斗上で、０．１Ｍグリシンを
含有する６組合せｍ衡液で洗浄することによって閉塞で
きる。

つぎに樹脂を再び、それぞれの組合せ緩衛液中の樹脂と
抗体が組合わされた容積に等しい最終容積の溶液中に懸
濁される。懸濁液を４℃で一晩中、ゆっくりと攪拌する
。つぎに樹脂を、以下に示す組成の■：Ｃ緩衡緩衝十分
に洗浄する。つぎに組合わせ、閉塞した樹脂を、できけ
ば塩化カルシウムとしての０．５Ｍカルシウム・イオン
を含む■：Ｃｌ１ｖｋｉ液でさらに予ｉ溶離する。樹脂
を再び■：Ｃ緩衡緩衝けで洗浄し、使用するまで、４℃
で、または常温で連続的にポンプ送りされるカラム中に
保存する。ＩＱＧの５ＥＰ）ＩＡＲＯ３Ｅに対する組合
せ密度は、５ＥＰＨＡＲＯ３Ｆ　　１当りに２〜５（１
，できれば３〜４ｑｒｏＧとする。

Ｃ０■二Ｃの分離と精製 因子■の人間および動物血漿、および市販の濃縮血液の
ような因子■の試料調製は、この発明で用いることがで
き、かつその方法は、特定型の物質に限られるものでは
ない。好ましい物質、および良好な結果を示した物質は
、豚および人間の自消、および市販されている人間の因
子■の濃縮液例えば、Ａ　ｒｍｏｕｒ　　Ｐ　ｈａｒｍ
ａｃｅｎｔｉｃａ１社から発売されているＦＡＣＴＯＲ
ＡＴＥである。以下の記述は、豚の血漿、または例えば
ＦＡＣＴＯＲＡＴＥのような市販の人間の濃縮血を用い
るについての詳細を示すものである。すなわち、 ＦＡＣＴＯＲＡＴＥは、■二Ｃ緩衡ＷＩ２５＋ａ１部を
、そぞれ２０本（２５ｍ　ｌ　／本）の内容物に加える
ことによって再構成される。混合液は、最終容−■：Ｃ
！！衡液１αに調整される。０．５−１倍の試料を分析
のため除くことができ、そして残余の物質を、免疫吸糖
カラムに終液、約６０ｍ１／時の割合で加えることがで
きる。

新鮮な状態で引出せない場合、豚の血漿は、従来の方法
でくえん酸処理して、凍結保存される。

使用する場合はに、これは３５〜４０℃の闇、できれば
３７℃の温度で解凍して、直接６０１　）　／時の割合
でカラムに加えられる。

この発明の記述は、クロマトグラフィ・カラム中の免疫
吸着液に組合された粒子の使用に関連し、つ本来的にこ
れらの使用を指向しているが、抗体結合樹脂粒子を、適
当な容器に入れ、そして上記にしたがって、また下記に
さらに詳述する■：Ｃの再構成濃縮血液、または血漿を
加えてから、バッチ方式で分離を行なうことは、この発
明の範囲内であることに注目すべきである。

クロマトグラフィ法により、この方法を実施する場合に
は、以下の実施態様が好ましい。すなわち、 樹脂を、Ａｍ１ｃｏｎ　８６００１　（マサチコセット
州しキシントン市Ａｍ１ｃｏｎ社製品商標名）のような
、螺動ポンプを備え、かつ流れヘッドの高いカラム中に
入れる。因子■源として濃縮血液を使用する場合には、
２０本の希釈濃縮血液に対して、上記にしたがって調製
した樹脂的１．５愛が用いられる。豚の血漿を使用する
ときは、面漿吏ごとに１５０ｍ１の樹脂が使用される。

試料をカラムに施してから、試料は１愛の■：Ｃ緩衡緩
衝洗浄され、続いて、さらに０．５ＭのＮａｃｌを含む
■：ｃｍ衡液により第２洗浄される。

因子■が濃縮血液として加えられるときは、約２０ｎの
塩水緩衝液が、豚の血漿が用いられるときは、２０床容
積が用いられる。１１／ｈｒの流速で最適の結果かえら
れる。

精製■：Ｃの溶離は、カルシウム・イオンを含む■：Ｃ
緩衡緩衝行なわれる。上記のＴｕｄｄｅｎｂｒａｍらに
よって示されるように、線型勾配が効率的ではあるが、
この点は、この発明の目的を達成するためには必要ない
。一定濃度のカルシウム・イオンを有する溶液が、きわ
めて適切である。かくて、濃縮血液からえられる■：Ｃ
が溶離されているときは、塩化カルシウムに関して０．
２５〜０゜５Ｍ、できれば０．３５Ｍの■：Ｃ緩衡緩衝
、流速４５０〜７５０ｍ＋／時、できれば６（１０ｍｌ
／時として有利に使用される。■二〇が、豚の血漿から
えられるときは、溶離は、塩化カルシウム濃度０．３５
〜０．７Ｍの間、できれば０．５Ｍの■：Ｃ緩衡溶液で
、かつ流速１０〜３０ａ＋１／時の間、できれば２０ｍ
１／時で行なわれる。１２霞１および３ｎＩｌの溜升が
、それぞれ濃縮血液および豚の血漿からえられる■：Ｃ
用に集められる。これらの少なくとも１．０単位／１の
■：Ｃ濃度を含む溜升がプールされ、そしてプールの総
容積とプールの１度を求める。

■：Ｃブールは、最初に超精密圧力濾過のような標準法
によって１０〜２０ｍ１に濃縮される。

この目的のためには、セルは、窒業圧５Ｃ１ｓｉのもと
てのＹＭ−１０メンブレンから効率的と認められたＡｍ
１ｃｏｎによって攪拌された。窒業圧を解放してから、
３０分間ゆっくりと攪拌を続け、そして濃縮プールの容
積と濃度を求める。プールは、温度が４℃に維持される
かぎり、短期間、例えば、−晩生保存できる。

上記した・免疫吸着液カラムは、カラムを、■：ＲＰを
溶離するため、流速的０．５〜１１／′時により、３Ｍ
のチオシアン酸ナトリウム溶液２床容饅で処理すると再
生できることに注目してよい。

Ｄ、　　製■：Ｃの濃縮 免疫吸着液カラムによる■：ＲＰからの分離によって回
収された■：Ｃは、＾度に精製されるが、治療上に利用
するためには、なお著しく稀薄Ｃある。これ以上の濃縮
は、以下の方法で調製され、かつ使用されるアミノヘキ
シル・アガローゼ・カラムを用いて行なわれる。

アミノヘキシル・アガＯ−ゼは、１．６−ジアミツヘキ
サンと反応したツガ０−ゼであって、そのそれぞれに端
末アミ、）基をもつ多数の６＃Ａ素原子鎖をもつアガロ
ーゼ樹脂を生ずる。このアガローゼ樹脂は、上＆！　Ａ
　ｕｓｔｅｎによって記述された方法にしたがって調製
でき、または供給業者から入手できる。この発明で、使
用に成功した上記物質の１つは、ＡＨ−，５ＥＰＨＡＲ
Ｏ３Ｅ４Ｂ　にュージャージ州ｐ　ｉｓｃａｔａｗａｙ
市Ｐ　ｈａｒｌａｃｉａ　　Ｆ　１ｎｅＣｈｅｌｉｃａ
ｌｓ社製品の商標名）の名称のもとて入手できる。

調製したものであれ、購入したものであれ、樹脂は、使
用前に調整しなければならない。これは以下のようにし
て行なわれる。容積、量、および寸法は、濃縮対象物質
の量に比例して調整される。

約１ｏのアミノヘキシル・アガローゼ（ＡＨ−８ＥＰＩ
−ＩＡＲＯ８Ｅ４Ｂ＞を、焼結ガラス・フィルタ漏斗に
入れ、攪拌しながら、少なくとも２０Ｑｉｌの０．５Ｍ
塩化ナトリウムで洗浄する。つぎに樹脂を■：Ｃ緩衡緩
衝均衡させて、約０．９ｃｍ径のカラムに充填する。こ
こで考察される使用形式としては、流れアダプタ付きの
３ｉｏ−ＲａｄＦ　ｃｏｎｏカラムが最適であると実証
されている。充填カラムの床容鯖は約４ｍｌである。

上記にしたがって調製した濃縮プールを、前節で述べた
樹脂齢およびカラム寸法を使用する場合、最終濃度１０
０〜２００■１まで、■：Ｃ！！衛液中で１：１０に希
釈する。希釈プールを、流速２００＋ｅｌ／時でカラム
に送る。

つぎにカラムを、できれば塩化カルシウムからなるカル
シウム・イオンを含む■：Ｃ緩衡緩衝洗浄する。溶液は
、カルシウム・イオンに関して、０．０１Ｍ〜０．０３
Ｍの間、できけば０．０２５Ｍとする。

濃縮■：Ｃの溶離は、先の洗浄段階で用いたより高濃度
のカルシウム・イオンを含む■：Ｃ！１衡溶液により、
流速５〜２０ｅｌ／時、できれば１０ｉｌ　＋　／時で
行なう。この場合もまた、塩化カルシウムは、０．２５
１０．５Ｍ（７）ｌｆｆｉ、ｒ　キレハ０　。

３Ｍ濃度の好ましいカルシウム・イオン源である。

１１ＩＩＩ容積の溜升が、集められ、そして下記にした
がって分析される。集めた溜升は、４℃または凍結して
保存できる。豚の面漿源からえられた■：Ｃの調製は、
貯蔵前に１％の人間自消アルブミンにより安定化される
。

分析は、溜升を、必要に応じて■：Ｃ緩衡緩衝希釈し、
そしてさらに基質へ添加する前に、溜升を分析緩衝液中
で１：１００に希釈して行なう。

標準部分トロンボプラスチン時間分析法が用いられる。

Ｍ衡液の組成は以下のとうりである。

塩　衡塩水溶液 燐酸ナトリウム１６０　−塩基性一水和物燐酸ナトリウ
ム８．４〇　二塩基性無水和物塩化ナトリウム６１．４ 水　　７銃まで 緩衝液のｐＨは７．２である。

■土５１１ｍ３劃 ｓｌｏ、０２Ｍ　　　イミダゾール 蒙１０．１５Ｍ　　　塩化ナトリウム ｍｌ　　０．１０Ｍ　　　リジン ｍｌｏ、０２％　　アジ化ナトリウム 緩衝液のｐＨは、濃塩酸で６．８に調整される。

表Ｉおよび表■に挙げるデータは、上記にしたがう、こ
の発明にしたがってえられた代表的なデータである。

以下空白 優先的な実施態様のみが、この明細書にとくに例示され
、かつ記述されているが、この発明の多数の改良法およ
び変化法が、上記の教示に照して、またこの発明の精神
と意図の範囲から離れることなく、付記のクレームの範
囲内で、可能であることが認められるであろう。

特許出願人 スクリップス　クリニック　アンド リサーチ　ファンデーション 代理人　　弁理士　　三　好　　保　男代理人　　弁理
士　　三　好　　秀　和第１頁の続き ０発　明　者　カーフル・アン・フルチャーアメリカ合
衆国カリフォルニア 州９２０３７う・ベヨラ・う・ジヨ ウ・ポールエバード７５４３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　以下の段階からなる因子■親凝集性活性蛋白
   質を調製する改良法。 （ａ）　　■：Ｃ／■：ＲＰ錯化合物を自漿または市販
   の濃縮血液源から、■：ＲＰに特異な単クローン抗体と
   結合した粒子に結合させる。 （ｂ）　　■：Ｃを溶離させる。 （Ｃ）ステップ（ｂ）でえられた■：Ｃを、■二Ｃを濃
   縮する別の吸着体に吸着させる。 （ｄ　）　　吸着された■：Ｃを溶離させ、そして（ｅ
   　）十分に精製して濃縮した■：Ｃを回収する。 （２）請求の範囲（１）にしたがう方法であって、ステ
   ップ（ｂ　）および（ｄ　）のそれぞれに使用した溶離
   剤が塩水溶液である方法。 （３）請求の範囲（２）にしたがう方法であって、塩水
   溶液が、塩化カルシウムである方法。 （４）請求の範囲（３）にしたがう方法であって、ステ
   ップ（ｂ　）および（ｄ　）で使用した上記塩化カルシ
   ウム溶液の濃度が、約０．２５Ｍから約０．５Ｍまでの
   範囲である方法。 （５）　　！Ｉ求の範囲（１）にしたがう方法であって
   、ステップ（ａ）における上記吸着剤粒子がアガローゼ
   である方法。 （６）請求の範囲（１）にしたがう方法であって、吸着
   剤として、ステップ（Ｃ）で、アミノヘキシル・アゴ０
   −ゼを用いる方法。 （７）　　請求の範囲（６）にしたがう方法であって、
   ステップ（ｂ）および（（１）における溶離剤として塩
   化カルシウム溶液を用い、上記塩化カルシウム溶液の濃
   度が、ステップ（ｂ　）では、約０．２５Ｍから約０．
   ５Ｍまで、またステップ（ｄ　）では、約０．２５Ｍか
   ら約０．５Ｍまでの範囲である方法。 （８）　　■：Ｃを、固体粒子に結合された■：ＲＰに
   特異な単クローン抗体からなる■：ｃ／■：ＲＰから分
   離して精製するための改良免疫吸着剤。 （９）請求の範囲（８）にしたがう改良免疫吸着剤であ
   って、上記固体粒子がリジンからなる吸着剤。 ■）請求の範囲（９）にしたがう改良免疫吸着剤であっ
   て、上記リジンがアガＯ−ゼからなる吸着剤。 ０１）　　請求の範囲（１０）にしたがう改良免疫吸着
   剤であって、上記アガローゼが交叉結合アガローゼであ
   る吸着剤。 ■　請求の範囲（１１）にしたがう改良免疫吸着剤であ
   って、上記免疫吸着剤が、アガＯ−ゼａ当りに、単クロ
   ーン抗体３〜４ｇの結合密度を有する吸着剤。 ■　請求の範囲（１）の方法にしたがって調製した十分
   に精製した濃縮■：００ （至）　請求の範囲（６）の方法にしたがって調製した
   十分に精製した濃縮■：００ （１５）　　因子■親凝集活性蛋白質を、血漿または濃
   縮血液から精製する方法において、上記血漿まちは濃縮
   血液が、■：ＲＰに特異な単クローン抗体に結合れてい
   る吸着剤を有し、かつそれから■：Ｃを溶離させるクロ
   マトグラフィ型カラムを通過する段階からなる改良。 （１６）　　請求の範囲（１５）にしたがう方法であっ
   て、上記吸着剤がアガローゼであり、かつ上記溶離剤が
   、塩水溶液である方法。