JP2573467B2 - 第ix因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物 - Google Patents
第ix因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物Info
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、第IX因子および他の
ビタミンK依存性タンパク質である第II因子、第VI
I因子、第X因子、プロトロンビン、プロテインC並び
にプロテインSの分離および精製により得られる治療用
途に適した薬剤的組成物に関する。特には、高純度タン
パク質を血漿または濃縮物からクロマトグラフ吸着およ
び濃縮技術により分離して得られる治療用途に適した薬
剤的組成物に関する。
ビタミンK依存性タンパク質である第II因子、第VI
I因子、第X因子、プロトロンビン、プロテインC並び
にプロテインSの分離および精製により得られる治療用
途に適した薬剤的組成物に関する。特には、高純度タン
パク質を血漿または濃縮物からクロマトグラフ吸着およ
び濃縮技術により分離して得られる治療用途に適した薬
剤的組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】血液凝固因子は正常な凝固機構におい
て、生命の維持に必要な役割を果たしている。例えば、
第IX因子欠乏症の患者は重大な出血問題を示している
(血友病B)。従って、科学研究用だけでなく、治療に
用いる量の第IX因子および他のビタミンK依存性タンパ
ク質の単離を可能にすることが望まれていた。この目的
に対して種々の方法が文献に記載されている。本発明に
係る薬剤的組成物ないしタンパク質は、高純度でかつ高
収率で得られ、特に他の血漿因子による汚染の比較的低
い点において従来技術より優れているものである。さら
に、多くの工程を必要とする従来技術では、時間がかか
るのと全工程でのタンパク質の損失が避けられない。
て、生命の維持に必要な役割を果たしている。例えば、
第IX因子欠乏症の患者は重大な出血問題を示している
(血友病B)。従って、科学研究用だけでなく、治療に
用いる量の第IX因子および他のビタミンK依存性タンパ
ク質の単離を可能にすることが望まれていた。この目的
に対して種々の方法が文献に記載されている。本発明に
係る薬剤的組成物ないしタンパク質は、高純度でかつ高
収率で得られ、特に他の血漿因子による汚染の比較的低
い点において従来技術より優れているものである。さら
に、多くの工程を必要とする従来技術では、時間がかか
るのと全工程でのタンパク質の損失が避けられない。
【0003】従来方法のーつとして、S. P. Ba
jaj等による「人間のプロトロンビン、第IX因子お
よび第X因子の精製のための簡単化した処理方法」、P
reparative Biochemisty, 1
1(4), 397〜412(1981年)がある。こ
の方法では、血漿をクエン酸バリウムへの吸着およびそ
れからの溶離、硫酸アンモニウム分画、DEAE−セフ
アデックスクロマトグラフィー、そして、pH7. 5
のクエン酸ナトリウム緩衝液の中でのヘパリンーアガロ
ースクロマトグラフィーによってプロトロンビン、第x
因子および第IX因子を分離するものである。第IX因
子の報告された収率は、80〜220ユニット/mgの
比活性で約35%であった。他の方法として、J.
P. Miletich等による「硫酸塩化したデキス
トラン球体を用いての人間の血液凝固因子の第II、第
IXおよび第Xの精製」、Methods in En
zymology,第80巻、頁221〜228に記載
のものがある。この方法では、新鮮な冷凍血漿を解凍
し、クエン酸バリウムにより沈澱、ジイソプロピルフル
オロリン酸とトリス−塩酸中での再懸濁、硫酸アンモニ
ウムによる沈澱、DE−52セルロースへのクロマトグ
ラフィー、そして得られた分画の選択的な硫酸塩化した
デキストラン球体への適用の手順で行うものである。第
IX因子を含む分画の濃度は第V因子lwt%と同じ程
度に不純物が混じっているとされている。B.Oste
rud等による「人間の血液凝固因子IX」、J. B
iological Chemistry、253巻、
No.17、頁5946〜5951(1978年)、で
は、第IX因子の精製を以下の手順、硫酸バリウムへの
吸着およびそれからの溶離、DEAE−セルロースバツ
チクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、そしてヘパリン−アガロースのアフイニテイークロ
マトグラフで行っている。第IX因子活性は、207ユ
ニット/mgであり、収率は記載されていない。
jaj等による「人間のプロトロンビン、第IX因子お
よび第X因子の精製のための簡単化した処理方法」、P
reparative Biochemisty, 1
1(4), 397〜412(1981年)がある。こ
の方法では、血漿をクエン酸バリウムへの吸着およびそ
れからの溶離、硫酸アンモニウム分画、DEAE−セフ
アデックスクロマトグラフィー、そして、pH7. 5
のクエン酸ナトリウム緩衝液の中でのヘパリンーアガロ
ースクロマトグラフィーによってプロトロンビン、第x
因子および第IX因子を分離するものである。第IX因
子の報告された収率は、80〜220ユニット/mgの
比活性で約35%であった。他の方法として、J.
P. Miletich等による「硫酸塩化したデキス
トラン球体を用いての人間の血液凝固因子の第II、第
IXおよび第Xの精製」、Methods in En
zymology,第80巻、頁221〜228に記載
のものがある。この方法では、新鮮な冷凍血漿を解凍
し、クエン酸バリウムにより沈澱、ジイソプロピルフル
オロリン酸とトリス−塩酸中での再懸濁、硫酸アンモニ
ウムによる沈澱、DE−52セルロースへのクロマトグ
ラフィー、そして得られた分画の選択的な硫酸塩化した
デキストラン球体への適用の手順で行うものである。第
IX因子を含む分画の濃度は第V因子lwt%と同じ程
度に不純物が混じっているとされている。B.Oste
rud等による「人間の血液凝固因子IX」、J. B
iological Chemistry、253巻、
No.17、頁5946〜5951(1978年)、で
は、第IX因子の精製を以下の手順、硫酸バリウムへの
吸着およびそれからの溶離、DEAE−セルロースバツ
チクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、そしてヘパリン−アガロースのアフイニテイークロ
マトグラフで行っている。第IX因子活性は、207ユ
ニット/mgであり、収率は記載されていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】以上のことから、改良
された方法で得られる活性で高い純度で精製され濃縮さ
れたかたちのタンパク質を含有する治療用途に適した薬
剤的組成物を提供することを目的としている。
された方法で得られる活性で高い純度で精製され濃縮さ
れたかたちのタンパク質を含有する治療用途に適した薬
剤的組成物を提供することを目的としている。
【0005】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明に係る活性で高い純度で精製され濃縮されたか
たちのビタミンK依存性タンパク質を含有する治療用途
に適した薬剤的組成物は、(a).ビタミンK依存性タ
ンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を結合し
た粒子上に、前記ビタミンK依存性タンパク質と1種ま
たはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物
質から前記ビタミンK依存性タンパク質を吸着し、
(b).カオトロピック試薬を含む緩衝水溶液を用い
て、前記粒子から前記ビタミンK依存性タンパク質を欠
いた源物質を除去し、さらに、(c).溶離液を用いて
前記粒子から吸着したビタミンK依存性タンパク質を溶
離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮さ
れたかたちの活性なビタミンK依存性タンパク質の組成
物を回収する、各ステップを具備し、プロテアーゼイン
ヒビターを添加することなしに実行される方法により得
ることができるものであることを特徴とする。
に本発明に係る活性で高い純度で精製され濃縮されたか
たちのビタミンK依存性タンパク質を含有する治療用途
に適した薬剤的組成物は、(a).ビタミンK依存性タ
ンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を結合し
た粒子上に、前記ビタミンK依存性タンパク質と1種ま
たはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物
質から前記ビタミンK依存性タンパク質を吸着し、
(b).カオトロピック試薬を含む緩衝水溶液を用い
て、前記粒子から前記ビタミンK依存性タンパク質を欠
いた源物質を除去し、さらに、(c).溶離液を用いて
前記粒子から吸着したビタミンK依存性タンパク質を溶
離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮さ
れたかたちの活性なビタミンK依存性タンパク質の組成
物を回収する、各ステップを具備し、プロテアーゼイン
ヒビターを添加することなしに実行される方法により得
ることができるものであることを特徴とする。
【0006】ここで、前記源物質が血漿、血漿分画また
は血漿濃縮であること、あるいは、前記ビタミンK依存
性タンパク質を生産するための遺伝子を含む細胞により
発現されたものであること、を特徴とすることができ
る。
は血漿濃縮であること、あるいは、前記ビタミンK依存
性タンパク質を生産するための遺伝子を含む細胞により
発現されたものであること、を特徴とすることができ
る。
【0007】また、別の本発明に係る活性で高い純度で
精製され濃縮されたかたちの第IX因子を含有する治療
用途に適した薬剤的組成物は、(a).第IX因子に特
異的なモノクローナル抗体に結合した吸着体粒子上に、
前記第IX因子と1種またはそれ以上の他のタンパク質
との混合物からなる源物質から前記第IX因子を吸着
し、(b).カオトロピック試薬を含有する緩衝水溶液
を用いて、前記吸着体粒子から前記第IX因子を欠いた
源物質を除去し、さらに、(c).溶離液を用いて前記
吸着体粒子から吸着した第IX因子を溶離することによ
り、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活
性な第IX因子を回収する、各ステップを具備し、プロ
テアーゼインヒビターを添加することなしに実行される
方法により得ることができるものであることを特徴とし
ている。
精製され濃縮されたかたちの第IX因子を含有する治療
用途に適した薬剤的組成物は、(a).第IX因子に特
異的なモノクローナル抗体に結合した吸着体粒子上に、
前記第IX因子と1種またはそれ以上の他のタンパク質
との混合物からなる源物質から前記第IX因子を吸着
し、(b).カオトロピック試薬を含有する緩衝水溶液
を用いて、前記吸着体粒子から前記第IX因子を欠いた
源物質を除去し、さらに、(c).溶離液を用いて前記
吸着体粒子から吸着した第IX因子を溶離することによ
り、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活
性な第IX因子を回収する、各ステップを具備し、プロ
テアーゼインヒビターを添加することなしに実行される
方法により得ることができるものであることを特徴とし
ている。
【0008】また、別の本発明に係る活性で高い純度で
精製され濃縮されたかたちで得られるビタミンK依存性
タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物
は、(a).ビタミンK依存性タンパク質からなる群か
ら選ばれるビタミンK依存性タンパク質に特異的なモノ
クローナル抗体に結合した吸着体粒子上に、前記ビタミ
ンK依存性タンパク質と1種またはそれ以上の他のタン
パク質との混合物である血漿、血漿分画または血漿濃縮
の源物質から前記ビタミンK依存性タンパク質を吸着
し、(b).塩化リチウムを含有する緩衝水溶液を用い
て、前記吸着体粒子から前記ビタミンK依存性タンパク
質を欠いた源物質を除去し、さらに、(c).溶離液を
用いて前記吸着体粒子から吸着したビタミンK依存性タ
ンパク質を溶離することにより、変性されておらず高い
純度で濃縮されたかたちの活性なビタミンK依存性タン
パク質の組成物を回収する、各ステップを具備し、4℃
で、キレート化合物の存在下で、プロテアーゼインヒビ
ターを添加することなしに実行される方法により得るこ
とができるものであることを特徴とする。
精製され濃縮されたかたちで得られるビタミンK依存性
タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物
は、(a).ビタミンK依存性タンパク質からなる群か
ら選ばれるビタミンK依存性タンパク質に特異的なモノ
クローナル抗体に結合した吸着体粒子上に、前記ビタミ
ンK依存性タンパク質と1種またはそれ以上の他のタン
パク質との混合物である血漿、血漿分画または血漿濃縮
の源物質から前記ビタミンK依存性タンパク質を吸着
し、(b).塩化リチウムを含有する緩衝水溶液を用い
て、前記吸着体粒子から前記ビタミンK依存性タンパク
質を欠いた源物質を除去し、さらに、(c).溶離液を
用いて前記吸着体粒子から吸着したビタミンK依存性タ
ンパク質を溶離することにより、変性されておらず高い
純度で濃縮されたかたちの活性なビタミンK依存性タン
パク質の組成物を回収する、各ステップを具備し、4℃
で、キレート化合物の存在下で、プロテアーゼインヒビ
ターを添加することなしに実行される方法により得るこ
とができるものであることを特徴とする。
【0009】本発明によれば、タンパク質に特異的な抗
体を用いての吸着操作でタンパク質を高度に精製された
かたちで得られる。
体を用いての吸着操作でタンパク質を高度に精製された
かたちで得られる。
【0010】上記構成において、ステップ(a) の段階
は、血漿または濃縮物のような源物質からのタンパク質
の免疫吸着を含む。ここで用いられる吸着体はタンパク
質に特異的なモノクローナル抗体であり、そのモノクロ
ーナル抗体は適当な基質、例えばアガロース球体に結合
されている。タンパク質を吸着した後、基質粒子を非吸
着タンパク質を除去するために大量の緩衝溶液で洗浄す
る。吸着したタンパク質を溶液で処理し溶離させる。回
収されたタンパク質は高純度、即ち不純物はほとんどな
く、治療に用いることも更に精製することもできる。
は、血漿または濃縮物のような源物質からのタンパク質
の免疫吸着を含む。ここで用いられる吸着体はタンパク
質に特異的なモノクローナル抗体であり、そのモノクロ
ーナル抗体は適当な基質、例えばアガロース球体に結合
されている。タンパク質を吸着した後、基質粒子を非吸
着タンパク質を除去するために大量の緩衝溶液で洗浄す
る。吸着したタンパク質を溶液で処理し溶離させる。回
収されたタンパク質は高純度、即ち不純物はほとんどな
く、治療に用いることも更に精製することもできる。
【0011】本発明に係るプロセスでは第IX因子の精製
が1500倍の程度で得られ、これは従来技術を通じて
大きな改良である。比活性は約34.8ユニット/mgで
あり、さらに第IX因子の収率はこの新規な方法において
平均約50%、高くて約70%である。
が1500倍の程度で得られ、これは従来技術を通じて
大きな改良である。比活性は約34.8ユニット/mgで
あり、さらに第IX因子の収率はこの新規な方法において
平均約50%、高くて約70%である。
【0012】本発明は、ビタミンK依存性タンパク質と
して知られている第11因子、第VII因子、第IX因
子、第V因子、プロトロンロビン、プロテインCおよび
プロテインSのあらゆるタンパク質精製フオームにおけ
る回収に容易に適用できる。血漿、血漿分画、血漿濃縮
物が典型的な源物質として含まれる。タンパク質はま
た、DNA組み換え技術、即ち、バクテリア、酵母また
は他の細胞の中へタンパク質を生産するための遺伝子を
組み入れたタンパク質の混合物からも精製することがで
きる。このような遺伝子組み込み技術は当該技術分野に
通常の技術を有するものであれば公知のことであり、ま
た、示されたタンパク質が1種またはそれ以上のタンパ
ク質、細胞の残骸等の混合状態であることは理解され
る。
して知られている第11因子、第VII因子、第IX因
子、第V因子、プロトロンロビン、プロテインCおよび
プロテインSのあらゆるタンパク質精製フオームにおけ
る回収に容易に適用できる。血漿、血漿分画、血漿濃縮
物が典型的な源物質として含まれる。タンパク質はま
た、DNA組み換え技術、即ち、バクテリア、酵母また
は他の細胞の中へタンパク質を生産するための遺伝子を
組み入れたタンパク質の混合物からも精製することがで
きる。このような遺伝子組み込み技術は当該技術分野に
通常の技術を有するものであれば公知のことであり、ま
た、示されたタンパク質が1種またはそれ以上のタンパ
ク質、細胞の残骸等の混合状態であることは理解され
る。
【0013】
【実施例】以下の説明は、従来一つの操作で達成される
とは知られていなかった純度と濃度にまで第IX因子の分
離と精製を達成するためになされ、用いられる本発明の
具体例の詳細を提供するものである。この説明は、第IX
因子の精製に適用される本発明の好適例であり、本発明
を限定するものでなく、当該技術分野の領域内にある変
化応用は本発明の範囲に属すると考えるべきである。そ
の他のビタミンK依存性タンパク質は同様の操作により
精製されるが、その操作は用いられる抗体を生じさせる
第IX因子に代わる他のタンパク質を用いる範囲で改変さ
れる。
とは知られていなかった純度と濃度にまで第IX因子の分
離と精製を達成するためになされ、用いられる本発明の
具体例の詳細を提供するものである。この説明は、第IX
因子の精製に適用される本発明の好適例であり、本発明
を限定するものでなく、当該技術分野の領域内にある変
化応用は本発明の範囲に属すると考えるべきである。そ
の他のビタミンK依存性タンパク質は同様の操作により
精製されるが、その操作は用いられる抗体を生じさせる
第IX因子に代わる他のタンパク質を用いる範囲で改変さ
れる。
【0014】A.第IX因子に対するモノクローナル抗体
の調製 第IX因子に吸着するモノクローナル抗体は、続いて分離
基質に結合されるが、そのモノクローナル抗体は種々の
公開されている方法により高度に精製される第IX因子の
調製することに始まる段階的手順により調製される。第
IX因子の精製は血漿源から得られる物質を用いて達成さ
れるが、純度が充分に高くないものは高濃度で用いられ
る。
の調製 第IX因子に吸着するモノクローナル抗体は、続いて分離
基質に結合されるが、そのモノクローナル抗体は種々の
公開されている方法により高度に精製される第IX因子の
調製することに始まる段階的手順により調製される。第
IX因子の精製は血漿源から得られる物質を用いて達成さ
れるが、純度が充分に高くないものは高濃度で用いられ
る。
【0015】抗凝血性の正常な血漿の精製はOster
ud等により示された方法、硫酸バリウムへの吸着およ
び溶離、DEAE−セルロースバツチクロマトグラフィ
ー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、そしてヘパリン
−アガロースカラムによるアフイニテイ−クロマトグラ
フイーの順序で行なわれた。この方法による順序は、高
度に精製された第IX因子を提供する。
ud等により示された方法、硫酸バリウムへの吸着およ
び溶離、DEAE−セルロースバツチクロマトグラフィ
ー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、そしてヘパリン
−アガロースカラムによるアフイニテイ−クロマトグラ
フイーの順序で行なわれた。この方法による順序は、高
度に精製された第IX因子を提供する。
【0016】以下の手順に従って、血漿から得られた高
度に精製された第IX因子をマウスに注射した。他の手
順でも同様の効果を期待できる。第0日目、前記タンパ
ク質100μgを0.05Mトリス、0.15M塩化ナ
トリウムを含むpH7.3の緩衝液0.1mlに溶解
(または懸濁)させ、同容量のフロインドの完全アジュ
バントで振とうして調製した組成物をマウスの腹膜を通
して注射した。第15日目、フロインドの完全アジュバ
ントをフロインドの不完全アジュバントに代えた以外は
同様のタンパク質56μgを再び注射した。第22、3
0、38および124日目、第15日目の注射を繰り返
した。第239日目、マウスに精製した第IX因子のみ
を注射した。第243日目、マウスの牌臓を取り出し、
定法に従って融合した。この方法はJ.P.Brown
等による「モノクローナル抗体との免疫沈降反応により
同定される正常および悪性の人細胞のタンパク質抗
原」、JOURNAL OF BIOLOGICAL
CHEMISTRY,225巻、頁4980〜4983
(1980年)に記載されている。この標準的手法は3
5%ポリエチレングリコール1000を50%ポリエチ
レングリコールに代える程度おいて変化させられる。
度に精製された第IX因子をマウスに注射した。他の手
順でも同様の効果を期待できる。第0日目、前記タンパ
ク質100μgを0.05Mトリス、0.15M塩化ナ
トリウムを含むpH7.3の緩衝液0.1mlに溶解
(または懸濁)させ、同容量のフロインドの完全アジュ
バントで振とうして調製した組成物をマウスの腹膜を通
して注射した。第15日目、フロインドの完全アジュバ
ントをフロインドの不完全アジュバントに代えた以外は
同様のタンパク質56μgを再び注射した。第22、3
0、38および124日目、第15日目の注射を繰り返
した。第239日目、マウスに精製した第IX因子のみ
を注射した。第243日目、マウスの牌臓を取り出し、
定法に従って融合した。この方法はJ.P.Brown
等による「モノクローナル抗体との免疫沈降反応により
同定される正常および悪性の人細胞のタンパク質抗
原」、JOURNAL OF BIOLOGICAL
CHEMISTRY,225巻、頁4980〜4983
(1980年)に記載されている。この標準的手法は3
5%ポリエチレングリコール1000を50%ポリエチ
レングリコールに代える程度おいて変化させられる。
【0017】陽性クローンは、正常人血漿の等量と各ク
ロークからの上清液をインキュベートし、第IX因子活
性を分析することにより同定される。クローンは、上清
液が実質的に第IX因子凝血活性を中和したならば陽性
と見なされる。クローンが陽性であると決定した後、そ
れらは少なくとも2度サブクローン化し、第IX因子に
対する抗体を生産する安定なクローンを得、少なくとも
細胞の注入4日目に0.5mlのプリスタン(pris
tane)で腹膜を通じて前もって処理したBalb/
cマウスの腹腔中に注射した。ハイブリドーマ細胞を牛
の胎児の血清を含まないDelbeccoで修飾された
Eagle媒質0.5mlにおいて、マウス1匹当り約
5×106細胞の濃度になるように注射した。マウスの
腹が膨れるのを確認して、腹水液をヘパリン中に約10
ユニット/mlで集めた。多数のマウスからの腹水液は
次のモノクローナル免疫グロブリン(IgG)の単離の
ために適当な容量に分けて貯蔵した。ヘパリン処理腹水
液をすぐに使用しない場合には、−70℃で貯蔵し、使
用直前に解凍するのがよい。腹水液からのIgGの最終
収率は、腹水液100ml当たり約lgのIgGであ
る。
ロークからの上清液をインキュベートし、第IX因子活
性を分析することにより同定される。クローンは、上清
液が実質的に第IX因子凝血活性を中和したならば陽性
と見なされる。クローンが陽性であると決定した後、そ
れらは少なくとも2度サブクローン化し、第IX因子に
対する抗体を生産する安定なクローンを得、少なくとも
細胞の注入4日目に0.5mlのプリスタン(pris
tane)で腹膜を通じて前もって処理したBalb/
cマウスの腹腔中に注射した。ハイブリドーマ細胞を牛
の胎児の血清を含まないDelbeccoで修飾された
Eagle媒質0.5mlにおいて、マウス1匹当り約
5×106細胞の濃度になるように注射した。マウスの
腹が膨れるのを確認して、腹水液をヘパリン中に約10
ユニット/mlで集めた。多数のマウスからの腹水液は
次のモノクローナル免疫グロブリン(IgG)の単離の
ために適当な容量に分けて貯蔵した。ヘパリン処理腹水
液をすぐに使用しない場合には、−70℃で貯蔵し、使
用直前に解凍するのがよい。腹水液からのIgGの最終
収率は、腹水液100ml当たり約lgのIgGであ
る。
【0018】第IX因子を精製する目的のためのモノクロ
ーナルIgGの特異性は、後述するようにモノクローナ
ルIgGが分離基質体にカップリングすることにより、
そして、分離基質に結合したIgGが血漿から第IX因子
を除きその第IX因子が続くチオシアン酸ナトリウムを含
む溶液で溶離されることを示すことにより評価される。
ーナルIgGの特異性は、後述するようにモノクローナ
ルIgGが分離基質体にカップリングすることにより、
そして、分離基質に結合したIgGが血漿から第IX因子
を除きその第IX因子が続くチオシアン酸ナトリウムを含
む溶液で溶離されることを示すことにより評価される。
【0019】モノクローナルIgGは、続く免疫吸着体
を調整するのに用いられ、採取後すぐまたは貯蔵溶液の
冷凍部分を解凍したヘパリン処理した腹水液から単離さ
れる。新鮮または凍結物に関わりなく使用され、溶液を
4℃とし、等容量のリン酸緩衝液の塩溶液(PBS)で
処理し、以下に示す組成物とする。希釈腹水を4℃で攪
拌しながら等容量の飽和硫酸アンモニウム(SAS)
(水中に過剰の硫酸アンモニウムを入れ沸とうさせ、4
℃に冷却し、不溶の結晶をろ過し水酸化アンモニウムで
pH7.0に調整して得る)を滴下しながら加え沈澱さ
せた。沈澱物と上清液を2時間以上攪拌し、4℃にて遠
心分離した。遠心分離は好ましくは、60分間、14,
000rpm(30,000xg)で行なう。腹水の上
清液はSASでさらに2回沈澱させ、その沈澱物と上清
液を第1回目と同様に攪拌し、遠心分離した。3回の沈
澱から得られたペレットを希釈した腹水液と等量のPB
Sで再懸濁した後、PBSに対し充分に透析した。透析
袋に凝固物が現われた時、20℃で遠心分離により除い
た。透析されたIgGを室温で5%の水酸化アルミニウ
ム水溶液と共に攪拌して吸着させ、吸着後20℃で遠心
分離した。吸着処理は第1回目の後少なくとも3回以
上、それぞれ2.5%水酸化アルミニウム溶液を用いて
繰り返される。吸着されたIgGは4℃にして、上記の
如くSASで再沈澱させた。沈澱させたぺレットは使用
するまで−200℃で貯蔵される。モノクローナルIg
G精製の他の方法は、ここで用いた方法と同様にもしく
はよりよいものであり、例えば、Bruck, C.,
Portetelle,D.,Glimeur,C.,
Bollen,A.の記述による「DEAEアフイニテ
イーゲルブルークロマトグラフイーによる腹水液からの
マウスモノクローナル抗体の一段階精製」がJourn
al of Immunological Mctho
ds,53巻、頁313〜319(1982年)に記載
されている。
を調整するのに用いられ、採取後すぐまたは貯蔵溶液の
冷凍部分を解凍したヘパリン処理した腹水液から単離さ
れる。新鮮または凍結物に関わりなく使用され、溶液を
4℃とし、等容量のリン酸緩衝液の塩溶液(PBS)で
処理し、以下に示す組成物とする。希釈腹水を4℃で攪
拌しながら等容量の飽和硫酸アンモニウム(SAS)
(水中に過剰の硫酸アンモニウムを入れ沸とうさせ、4
℃に冷却し、不溶の結晶をろ過し水酸化アンモニウムで
pH7.0に調整して得る)を滴下しながら加え沈澱さ
せた。沈澱物と上清液を2時間以上攪拌し、4℃にて遠
心分離した。遠心分離は好ましくは、60分間、14,
000rpm(30,000xg)で行なう。腹水の上
清液はSASでさらに2回沈澱させ、その沈澱物と上清
液を第1回目と同様に攪拌し、遠心分離した。3回の沈
澱から得られたペレットを希釈した腹水液と等量のPB
Sで再懸濁した後、PBSに対し充分に透析した。透析
袋に凝固物が現われた時、20℃で遠心分離により除い
た。透析されたIgGを室温で5%の水酸化アルミニウ
ム水溶液と共に攪拌して吸着させ、吸着後20℃で遠心
分離した。吸着処理は第1回目の後少なくとも3回以
上、それぞれ2.5%水酸化アルミニウム溶液を用いて
繰り返される。吸着されたIgGは4℃にして、上記の
如くSASで再沈澱させた。沈澱させたぺレットは使用
するまで−200℃で貯蔵される。モノクローナルIg
G精製の他の方法は、ここで用いた方法と同様にもしく
はよりよいものであり、例えば、Bruck, C.,
Portetelle,D.,Glimeur,C.,
Bollen,A.の記述による「DEAEアフイニテ
イーゲルブルークロマトグラフイーによる腹水液からの
マウスモノクローナル抗体の一段階精製」がJourn
al of Immunological Mctho
ds,53巻、頁313〜319(1982年)に記載
されている。
【0020】B.免疫吸着体の調製 免疫吸着体は、フカップリングのためのモノクローナル
IgGを調製し、カップリングのための固体基質を調製
し、モノクローナルIgGを固体基質に結合させるため
2つの成分を反応させることにより好適に調製される。
IgGを調製し、カップリングのための固体基質を調製
し、モノクローナルIgGを固体基質に結合させるため
2つの成分を反応させることにより好適に調製される。
【0021】(i) カップリングのためのIgGの調
製 新しく沈澱させたIgGまたは以前に冷凍した沈澱を解
凍したものを用いることができる。その物質をPBSに
対して透析し、PBS中にある間に、IgGの容量と濃
度(A280/1.4=mg/ml IgG)を決定す
る。次いで、IgG溶液50ml当たり、ジイソプロピ
ルフルオロリン酸の10〜30μl、好ましくは20μ
lで処理した。得られた溶液を30分間、ドラフト中室
温で攪拌し、その処理したIgGを使用直前にカップリ
ング緩衝液に対し一晩透析した。見い出されている最も
好適なカップリング用緩衝液は、好ましくは水酸化ナト
リウムでpH9に調整された0. 25M重炭酸ナトリ
ウム溶液である。
製 新しく沈澱させたIgGまたは以前に冷凍した沈澱を解
凍したものを用いることができる。その物質をPBSに
対して透析し、PBS中にある間に、IgGの容量と濃
度(A280/1.4=mg/ml IgG)を決定す
る。次いで、IgG溶液50ml当たり、ジイソプロピ
ルフルオロリン酸の10〜30μl、好ましくは20μ
lで処理した。得られた溶液を30分間、ドラフト中室
温で攪拌し、その処理したIgGを使用直前にカップリ
ング緩衝液に対し一晩透析した。見い出されている最も
好適なカップリング用緩衝液は、好ましくは水酸化ナト
リウムでpH9に調整された0. 25M重炭酸ナトリ
ウム溶液である。
【0022】(ii) カップリングのための固体基質の調
製 モノクローナル抗体はタンパク質、特には第IX因子自体
に高い親和性を有するものでなければあらゆる物質に結
合されるが、そのような物質として、ガラズビーズ、ア
ガロースおよびそれらの誘導体が好ましい。最も好まし
くは、架橋結合されたアガロースで、セフアロース4B
(Pharmacia Fine Chemical
s,Piscataway,N.J.の登録商標)とし
て知られたゲル市で市販されている。
製 モノクローナル抗体はタンパク質、特には第IX因子自体
に高い親和性を有するものでなければあらゆる物質に結
合されるが、そのような物質として、ガラズビーズ、ア
ガロースおよびそれらの誘導体が好ましい。最も好まし
くは、架橋結合されたアガロースで、セフアロース4B
(Pharmacia Fine Chemical
s,Piscataway,N.J.の登録商標)とし
て知られたゲル市で市販されている。
【0023】好ましい免疫吸着体樹脂を調製する方法
は、一般に文献に記載の方法と同様であり、例えば、
J.Porath等による方法、Journal of
Chromatography)86巻、頁53〜5
6(1973年)がある。見い出された最も好適な方法
は、以下の如くである。即ち、容量約2リットルのセフ
アロース4Bを酸で洗浄した2リットル用の焼結グラス
フィルターロートに入れた。樹脂を水洗し、ろ過して水
気のある状態にした。水洗した樹脂を回転子を入れた大
容量(約4リットル)のガラスビーカーに移した。次い
で、5Mの2塩基性リン酸カリウム溶液の1部と5Mの
3塩基性リン酸カリウム溶液の2部を混合して調製した
750mlの冷リン酸カリウム緩衝溶液を樹脂に加え
た。充分に冷却した水を加えて最終容量を3リットルと
した。次に、この混合物を4℃に冷却し、マグネチック
スターラ上の氷一水浴中で4〜10℃に保持した。ドラ
フト内で、臭化シアンを回転子を入れた栓付きガラスビ
ンの30mlの水中に加えた。混合物を溶液になるまで
迅速に攪拌した。この臭化シアン溶液を先の冷セフアロ
ース混合物に2分間以上攪拌しながら加えた。攪拌を続
けて8分間行ない、その溶液を4リットルの耐圧ビンに
固定した冷2リットル焼結ガラスフィルターロートに移
した。次いで、臭化シアン処理した樹脂を約20リット
ルの冷水で(ろ液のpHが中性になるまで)洗浄した。
水洗した樹脂は冷却したカップリング用緩衝液と速やか
に平衝状態とし、大きな回転子を入れた4リットルのプ
ラスチックビーカーに移した。
は、一般に文献に記載の方法と同様であり、例えば、
J.Porath等による方法、Journal of
Chromatography)86巻、頁53〜5
6(1973年)がある。見い出された最も好適な方法
は、以下の如くである。即ち、容量約2リットルのセフ
アロース4Bを酸で洗浄した2リットル用の焼結グラス
フィルターロートに入れた。樹脂を水洗し、ろ過して水
気のある状態にした。水洗した樹脂を回転子を入れた大
容量(約4リットル)のガラスビーカーに移した。次い
で、5Mの2塩基性リン酸カリウム溶液の1部と5Mの
3塩基性リン酸カリウム溶液の2部を混合して調製した
750mlの冷リン酸カリウム緩衝溶液を樹脂に加え
た。充分に冷却した水を加えて最終容量を3リットルと
した。次に、この混合物を4℃に冷却し、マグネチック
スターラ上の氷一水浴中で4〜10℃に保持した。ドラ
フト内で、臭化シアンを回転子を入れた栓付きガラスビ
ンの30mlの水中に加えた。混合物を溶液になるまで
迅速に攪拌した。この臭化シアン溶液を先の冷セフアロ
ース混合物に2分間以上攪拌しながら加えた。攪拌を続
けて8分間行ない、その溶液を4リットルの耐圧ビンに
固定した冷2リットル焼結ガラスフィルターロートに移
した。次いで、臭化シアン処理した樹脂を約20リット
ルの冷水で(ろ液のpHが中性になるまで)洗浄した。
水洗した樹脂は冷却したカップリング用緩衝液と速やか
に平衝状態とし、大きな回転子を入れた4リットルのプ
ラスチックビーカーに移した。
【0024】(iii)モノクローナル抗体の固体基質
へのカップリング 上記の如く調製した固体基質樹脂は、PBSと平衝状態
にある時は使用できる状態にあり、それ以後は貯蔵され
るべきではない。従って、樹脂混合物は、カップリング
反応用緩衝液に対して前もって1晩透析したIgGと結
合させた。この結合した樹脂/IgG懸濁混合物を24
時間4゜Cで攪拌した。カップリング時の上清液の無希
釈サンプルのA280は、標準試料として牛の血清アル
ブミン(BSA)を用いてまたは標準試料としてBSA
と共にバイオーラド(Bio−Rad)タンパク質分析
(ブラ・ッドフオード試薬)により決定される。次に、
カップリングしたリガンドのパーセンテージを計算す
る。上記した手順が行なわれる時、この値は通常約95
%である。抗体とカップリングしなかった樹脂上に残っ
ている活性サイトは、0.1Mグリシンを含有する冷カ
ップリング用緩衝液で焼結ガラスフイルターロート上の
樹脂を洗浄することによりブロックされる。次いで、こ
の樹脂を樹脂と抗体を結合させた時のそれぞれのカップ
リング用緩衝液と等容量になるように上記溶液で再懸濁
した。懸濁液をゆっくり4℃で1晩攪拌した。次いで、
この樹脂をPBSで充分に洗浄した。その組成を以下に
示す。カップリングし、ブロックされた上記樹脂は、付
加的に0.5Mカルシウムイオン、好ましくは塩化カル
シウムを含むPBSで予備溶離される。樹脂を再びPB
Sのみで洗浄し、4℃で貯蔵するかまたは使用できる用
意ができるまで、室温で連続したポンプの働いているカ
ラム内におかれる。セフアロースに対するIgGのカッ
プリング密度は、セフアロース球体1リットル当り2〜
5gIgG、好ましくは、3〜4gIgGであろう。
へのカップリング 上記の如く調製した固体基質樹脂は、PBSと平衝状態
にある時は使用できる状態にあり、それ以後は貯蔵され
るべきではない。従って、樹脂混合物は、カップリング
反応用緩衝液に対して前もって1晩透析したIgGと結
合させた。この結合した樹脂/IgG懸濁混合物を24
時間4゜Cで攪拌した。カップリング時の上清液の無希
釈サンプルのA280は、標準試料として牛の血清アル
ブミン(BSA)を用いてまたは標準試料としてBSA
と共にバイオーラド(Bio−Rad)タンパク質分析
(ブラ・ッドフオード試薬)により決定される。次に、
カップリングしたリガンドのパーセンテージを計算す
る。上記した手順が行なわれる時、この値は通常約95
%である。抗体とカップリングしなかった樹脂上に残っ
ている活性サイトは、0.1Mグリシンを含有する冷カ
ップリング用緩衝液で焼結ガラスフイルターロート上の
樹脂を洗浄することによりブロックされる。次いで、こ
の樹脂を樹脂と抗体を結合させた時のそれぞれのカップ
リング用緩衝液と等容量になるように上記溶液で再懸濁
した。懸濁液をゆっくり4℃で1晩攪拌した。次いで、
この樹脂をPBSで充分に洗浄した。その組成を以下に
示す。カップリングし、ブロックされた上記樹脂は、付
加的に0.5Mカルシウムイオン、好ましくは塩化カル
シウムを含むPBSで予備溶離される。樹脂を再びPB
Sのみで洗浄し、4℃で貯蔵するかまたは使用できる用
意ができるまで、室温で連続したポンプの働いているカ
ラム内におかれる。セフアロースに対するIgGのカッ
プリング密度は、セフアロース球体1リットル当り2〜
5gIgG、好ましくは、3〜4gIgGであろう。
【0025】C.第IX因子の分離と精製 人や動物の血漿および市販の第IX因子の濃縮物のような
第IX因子の試料調製は、本発明の方法を用いることがで
き、本方法は物質の特定のタイプに限定されない。好適
な物質、成功した結果を与えたものとしては、それぞれ
目的とするタンパク質を含む人の血漿、血漿分画および
濃縮物、市販または一部実験室で精製されたものであ
る。以下の記載では、正常な人の血漿を用いたもので詳
細を説明する。 新しく採取したものでない血漿は通常
の手段でクエン酸塩化され冷凍保存される。使用基準が
できた時、35〜40℃、好ましくは37℃の温度で解
凍し、カラムに直接入れる。
第IX因子の試料調製は、本発明の方法を用いることがで
き、本方法は物質の特定のタイプに限定されない。好適
な物質、成功した結果を与えたものとしては、それぞれ
目的とするタンパク質を含む人の血漿、血漿分画および
濃縮物、市販または一部実験室で精製されたものであ
る。以下の記載では、正常な人の血漿を用いたもので詳
細を説明する。 新しく採取したものでない血漿は通常
の手段でクエン酸塩化され冷凍保存される。使用基準が
できた時、35〜40℃、好ましくは37℃の温度で解
凍し、カラムに直接入れる。
【0026】本発明の説明では最初に直接にクロマトグ
ラフ用カラムに免疫吸着体がカップリングされた粒子を
入れて使用したが、適当な容器の中へ抗体と結合する樹
脂粒子を入れてバツチ法で分離し、その後再構成した濃
縮物または血漿を加え、上記で概要を示したように目的
とするタンパク質を回収する方法も本発明の範囲にある
ものである。以下、さらに詳細に説明する。
ラフ用カラムに免疫吸着体がカップリングされた粒子を
入れて使用したが、適当な容器の中へ抗体と結合する樹
脂粒子を入れてバツチ法で分離し、その後再構成した濃
縮物または血漿を加え、上記で概要を示したように目的
とするタンパク質を回収する方法も本発明の範囲にある
ものである。以下、さらに詳細に説明する。
【0027】クロマトグラフ工程を遂行するには、以下
の具体例が好ましい。
の具体例が好ましい。
【0028】樹脂をカラム、例えばAmicon 86
001(Amicon Corp.,Lexigto
n, Mass.の登録商標)に充填し、ぜん動性ポン
プで速やかに流れるようにする。人の血漿を第IX因子
源として使用する時、抗体を保持する球体の各容量に対
し約3〜7、好ましくは5部の血漿が処理される。血漿
はゆっくりとカラムに注がれ、流速は免疫吸着体上に血
漿からの第IX因子の望ましい量が吸着される接触時間
を与えるものである。より長い接触時間がタンパク質の
少なくとも約50%、好ましくは75%、より好ましく
は、95%以上を吸着させるのに必要であり、その時間
は1〜6時間、好ましくは2〜4時間で一般的に満足さ
れる。
001(Amicon Corp.,Lexigto
n, Mass.の登録商標)に充填し、ぜん動性ポン
プで速やかに流れるようにする。人の血漿を第IX因子
源として使用する時、抗体を保持する球体の各容量に対
し約3〜7、好ましくは5部の血漿が処理される。血漿
はゆっくりとカラムに注がれ、流速は免疫吸着体上に血
漿からの第IX因子の望ましい量が吸着される接触時間
を与えるものである。より長い接触時間がタンパク質の
少なくとも約50%、好ましくは75%、より好ましく
は、95%以上を吸着させるのに必要であり、その時間
は1〜6時間、好ましくは2〜4時間で一般的に満足さ
れる。
【0029】源物質をカラムに入れた後、50部のトリ
ス−塩化リチウム緩衝液(0.1Mリジン塩基と0.5
M塩化リチウム、pH8)で洗浄し、溶離タンパク質を
有効に除去する。除去率は好ましくは少なくとも90
%、より好ましくは最大の除去である。次いで、第2の
洗浄をトリス−塩酸緩衝液(0.05Mトリス−塩酸、
pH8)でカラムからリチウムイオンを最大限に除去す
る条件で行なう。約2〜4時間の接触時間で満足され
る。
ス−塩化リチウム緩衝液(0.1Mリジン塩基と0.5
M塩化リチウム、pH8)で洗浄し、溶離タンパク質を
有効に除去する。除去率は好ましくは少なくとも90
%、より好ましくは最大の除去である。次いで、第2の
洗浄をトリス−塩酸緩衝液(0.05Mトリス−塩酸、
pH8)でカラムからリチウムイオンを最大限に除去す
る条件で行なう。約2〜4時間の接触時間で満足され
る。
【0030】精製第IX因子の溶離は、ジエチルアミ
ン、塩化カルシウム、チオシアン酸ナトリウム塩、臭化
カリウム、酢酸(好ましくは濃度約0.1〜1.0M)
またはpH2〜3、好ましくは約2.2の塩酸−グリシ
ン混合物の如き溶離液を含む緩衝液で行なわれる。他の
適当な溶離剤は、当該技術分野の通常の技術で簡単に同
定することができる。直線的な濃度勾配の溶離液が良い
結果を与えるが、本発明の目的を達成するためには必要
はなく、一定のイオン濃度を有する溶液がさらに適当で
ある。流出速度はセフアロースの充填によりカラム内の
圧力を上げないでタンパク質の溶離を効果的に行うべき
である。このように、第IX因子をチオシアン酸ナトリ
ウムで溶離する時、チオシアン酸ナトリウムの溶離液を
2M〜4M、好ましくは3Mを流し、その流速は3リッ
トルカラムにおいて平方インチ当たり9ポンド以上の導
入部の圧力を与え、圧力の上昇をしないように行なう。
ジエチルアミンの溶離では、0.3〜0.7M、好まし
くは0.5Mの濃度で行なわれる。ジエチルアミンを溶
離液として用いた場合、分画はジエチルアミンを中和す
るために1Mグリシン中に集められるべきである。続い
て、そのカラムはPBSまたは中性緩衝液で洗浄され
る。
ン、塩化カルシウム、チオシアン酸ナトリウム塩、臭化
カリウム、酢酸(好ましくは濃度約0.1〜1.0M)
またはpH2〜3、好ましくは約2.2の塩酸−グリシ
ン混合物の如き溶離液を含む緩衝液で行なわれる。他の
適当な溶離剤は、当該技術分野の通常の技術で簡単に同
定することができる。直線的な濃度勾配の溶離液が良い
結果を与えるが、本発明の目的を達成するためには必要
はなく、一定のイオン濃度を有する溶液がさらに適当で
ある。流出速度はセフアロースの充填によりカラム内の
圧力を上げないでタンパク質の溶離を効果的に行うべき
である。このように、第IX因子をチオシアン酸ナトリ
ウムで溶離する時、チオシアン酸ナトリウムの溶離液を
2M〜4M、好ましくは3Mを流し、その流速は3リッ
トルカラムにおいて平方インチ当たり9ポンド以上の導
入部の圧力を与え、圧力の上昇をしないように行なう。
ジエチルアミンの溶離では、0.3〜0.7M、好まし
くは0.5Mの濃度で行なわれる。ジエチルアミンを溶
離液として用いた場合、分画はジエチルアミンを中和す
るために1Mグリシン中に集められるべきである。続い
て、そのカラムはPBSまたは中性緩衝液で洗浄され
る。
【0031】第IX因子活性を含む分画を貯蔵し、その全
容量および活性を決定する。溶離された第IX因子を溶液
のイオンを除くためにPBSに対して透析し、次いで分
析する。溶離された第IX因子は濃度約10〜30ユニッ
ト/mlであり、治療または分析に用いることができる。
容量および活性を決定する。溶離された第IX因子を溶液
のイオンを除くためにPBSに対して透析し、次いで分
析する。溶離された第IX因子は濃度約10〜30ユニッ
ト/mlであり、治療または分析に用いることができる。
【0032】第IX因子を集めた液は限外ろ過のような
通常の方法により10〜20mlに濃縮することができ
る。この目的のためには、窒素圧50psi下でYM−
10メンブランとアミコン攪拌セル(Amicon s
tirred cell)がよいことがわかった。ゆっ
くりとした攪拌を窒素圧を低下した後30分間続け、濃
縮液の容量と活性を決定した。ためた液は温度を4℃に
保つならば短期間、例えば1晩貯蔵してもよい。
通常の方法により10〜20mlに濃縮することができ
る。この目的のためには、窒素圧50psi下でYM−
10メンブランとアミコン攪拌セル(Amicon s
tirred cell)がよいことがわかった。ゆっ
くりとした攪拌を窒素圧を低下した後30分間続け、濃
縮液の容量と活性を決定した。ためた液は温度を4℃に
保つならば短期間、例えば1晩貯蔵してもよい。
【0033】上記した免疫吸着体カラムはカラムから精
製しタンパク質を除く溶離により再生される。カラムは
このように何回でも繰り返し使用できる。
製しタンパク質を除く溶離により再生される。カラムは
このように何回でも繰り返し使用できる。
【0034】分析は通常の部分トロンボプラスチン時間
分析(Partial thromboplastin
time assay)で行なわれる。
分析(Partial thromboplastin
time assay)で行なわれる。
【0035】すべての緩衝液において、EDTA 4ナ
トリウム塩の10mMを含んだもの、および/またはす
べての処理行程を4℃で行なうことは、第IX因子の活性
およびタンパク質分解を最小にする。
トリウム塩の10mMを含んだもの、および/またはす
べての処理行程を4℃で行なうことは、第IX因子の活性
およびタンパク質分解を最小にする。
【0036】緩衝液の組成を以下に示す。
【0037】リン酸緩衝塩溶液 1.6gのリン酸ナトリウム1塩基性1水和物 8.4gのリン酸ナトリウム2塩基性無水物 61.4gの塩化ナトリウム 水を加えて7リットルとする。pHを7.2に調整。
【0038】上記で説明した手順で7回の実験を行な
い、平均回収率52%、その範囲32%〜71%であっ
た。精製度は平均2400倍、比活性は34.8ユニッ
ト/mgであった。以下の実施例1で示すデータは、上で
述べた本発明で得られたものの代表である。冷凍された
正常人の血漿を37℃で解凍し、次いで4℃で処理した
ものである。
い、平均回収率52%、その範囲32%〜71%であっ
た。精製度は平均2400倍、比活性は34.8ユニッ
ト/mgであった。以下の実施例1で示すデータは、上で
述べた本発明で得られたものの代表である。冷凍された
正常人の血漿を37℃で解凍し、次いで4℃で処理した
ものである。
【0039】実施例1 実験A: 第IX因子活性の1.5ユニット/ml、0.0
21ユニット/mgを含む人の血漿100mlを免疫吸着体
カラムに入れ、最初に血漿を次いで第IX因子を上述した
方法に従って溶離した。溶離された第IX因子は31ユニ
ット/mgの比活性を有しており、約1500倍の精製度
を示した。第IX因子の回収率63.3%。溶離分画のピ
ークにおいては、第IX因子の濃度の12倍であった。
21ユニット/mgを含む人の血漿100mlを免疫吸着体
カラムに入れ、最初に血漿を次いで第IX因子を上述した
方法に従って溶離した。溶離された第IX因子は31ユニ
ット/mgの比活性を有しており、約1500倍の精製度
を示した。第IX因子の回収率63.3%。溶離分画のピ
ークにおいては、第IX因子の濃度の12倍であった。
【0040】実験B: 第IX因子活性の0.94ユニッ
ト/ml、0.013ユニット/mgを含む人の血漿100
mlを、すべての緩衝液にEDTA 4ナトリウム塩の1
0mMを含ませた以外は上記手順と同様にして回収し
た。溶離した第IX因子は17ユニット/mgの比活性を有
し、約1300倍の精製度を示した。回収率は61%、
溶離分画のピークにおいては、第IX因子の濃度の8倍で
あった。
ト/ml、0.013ユニット/mgを含む人の血漿100
mlを、すべての緩衝液にEDTA 4ナトリウム塩の1
0mMを含ませた以外は上記手順と同様にして回収し
た。溶離した第IX因子は17ユニット/mgの比活性を有
し、約1300倍の精製度を示した。回収率は61%、
溶離分画のピークにおいては、第IX因子の濃度の8倍で
あった。
【0041】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
血漿または濃縮物から、平均回収率52%、その範囲3
2%〜71%、精製度平均2400倍、比活性34.8
ユニット/mgの、すなわち、活性で高い純度で精製さ
れ濃縮されたかたちの、ビタミンK依存性タンパク質を
含有する治療用途に適した薬剤的組成物を得ることがで
きた。
血漿または濃縮物から、平均回収率52%、その範囲3
2%〜71%、精製度平均2400倍、比活性34.8
ユニット/mgの、すなわち、活性で高い純度で精製さ
れ濃縮されたかたちの、ビタミンK依存性タンパク質を
含有する治療用途に適した薬剤的組成物を得ることがで
きた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 9/50 C12N 9/50 (56)参考文献 BLOOD,VOL.59,NO.3 (1982),P.664−670
Claims (8)
- 【請求項1】 (a).第IX因子タンパク質に対して特異
的なモノクローナル抗体を結合した粒子上に、前記第I
X因子タンパク質と1種またはそれ以上の他のタンパク
質との混合物からなる源物質から前記第IX因子タンパ
ク質を吸着し、 (b).カオトロピック試薬を含む緩衝水溶液を用いて、前
記粒子から前記第IX因子タンパク質を欠いた源物質を
除去し、さらに、 (c).溶離液を用いて前記粒子から吸着した第IX因子タ
ンパク質を溶離することにより、変性されておらず高い
純度で濃縮されたかたちの活性な第IX因子タンパク質
の組成物を回収する、各ステップを具備し、プロテアー
ゼインヒビターを添加することなしに実行される方法に
より得ることができる、活性で高い純度で精製され濃縮
されたかたちの第IX因子タンパク質を含有する治療用
途に適した薬剤的組成物。 - 【請求項2】 前記源物質が血漿、血漿分画または血漿
濃縮物であることを特徴とする請求項1に記載の薬剤的
組成物。 - 【請求項3】 前記源物質が前記第IX因子タンパク質
を生産するための遺伝子を含む細胞により発現されてい
るものであることを特徴とする請求項1に記載の薬剤的
組成物。 - 【請求項4】 前記カオトロピック試薬がリチウム塩で
あることを特徴とする請求項1に記載の薬剤的組成物。 - 【請求項5】 4℃の条件下で前記方法を実行すること
によって得ることができる請求項1に記載の薬剤的組成
物。 - 【請求項6】 キレート化剤を存在させて前記方法を実
行することによって得ることができる請求項1に記載の
薬剤的組成物。 - 【請求項7】 前記カオトロピック試薬がリチウム塩で
あり、キレート化剤を存在させて前記方法を実行するこ
とによって得ることができる請求項1に記載の薬剤的組
成物。 - 【請求項8】 EDTAを存在させて前記方法を実行す
ることによって得ることができる請求項1に記載の薬剤
的組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US47241383A | 1983-03-04 | 1983-03-04 | |
US472413 | 1983-03-04 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59038886A Division JPH0794478B2 (ja) | 1983-03-04 | 1984-03-02 | ビタミンk依存性タンパク質を含む薬剤組成物を調整する方法及びそれに用いる免疫吸着体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07126183A JPH07126183A (ja) | 1995-05-16 |
JP2573467B2 true JP2573467B2 (ja) | 1997-01-22 |
Family
ID=23875410
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59038886A Expired - Lifetime JPH0794478B2 (ja) | 1983-03-04 | 1984-03-02 | ビタミンk依存性タンパク質を含む薬剤組成物を調整する方法及びそれに用いる免疫吸着体 |
JP6019626A Expired - Lifetime JP2573467B2 (ja) | 1983-03-04 | 1994-02-16 | 第ix因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59038886A Expired - Lifetime JPH0794478B2 (ja) | 1983-03-04 | 1984-03-02 | ビタミンk依存性タンパク質を含む薬剤組成物を調整する方法及びそれに用いる免疫吸着体 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0118256B1 (ja) |
JP (2) | JPH0794478B2 (ja) |
AU (2) | AU2529584A (ja) |
CA (1) | CA1252744A (ja) |
DE (1) | DE3485711D1 (ja) |
DK (1) | DK170806B1 (ja) |
NL (1) | NL930143I2 (ja) |
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US4902614A (en) * | 1984-12-03 | 1990-02-20 | Teijin Limited | Monoclonal antibody to human protein C |
JPH0619352B2 (ja) * | 1985-06-10 | 1994-03-16 | 帝人株式会社 | ヒト・プロテインcの測定方法 |
DE3751605D1 (de) * | 1986-01-06 | 1996-01-04 | Blood Systems Inc | Therapeutisches Blutprodukt, Mittel und Verfahren zu dessen Erzeugung. |
USH1148H (en) | 1987-04-17 | 1993-03-02 | Method of separating activated human protein C | |
DE3882411T2 (de) * | 1987-04-17 | 1993-12-16 | Teijin Ltd | Verfahren zur Trennung von aktiviertem menschlichem Protein C. |
DK0573605T3 (da) | 1991-03-01 | 2001-01-02 | Rhone Poulenc Rorer Int | Fremstilling af faktor IX |
DE19549262C2 (de) * | 1995-02-08 | 1997-10-09 | Martin Dr Kohlmeier | Präparat zur Abschätzung des Entstehungsrisikos eines beschleunigten Verlustes kognitiver Fähigkeiten |
CN1209548A (zh) * | 1998-06-08 | 1999-03-03 | 南开大学 | 碳化树脂dna免疫吸附剂的制备方法 |
KR101364001B1 (ko) * | 2004-12-23 | 2014-02-17 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | 관심있는 비타민 k-의존성 단백질을 포함한 조성물 중의단백질 오염물질의 양의 감소 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4361509A (en) * | 1981-12-14 | 1982-11-30 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
-
1984
- 1984-02-23 EP EP84301162A patent/EP0118256B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-02-23 DE DE8484301162T patent/DE3485711D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-03-02 JP JP59038886A patent/JPH0794478B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-03-02 AU AU25295/84A patent/AU2529584A/en not_active Abandoned
- 1984-03-02 CA CA000448706A patent/CA1252744A/en not_active Expired
- 1984-03-05 DK DK151784A patent/DK170806B1/da not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-12-19 AU AU27057/88A patent/AU641119B2/en not_active Expired
-
1993
- 1993-11-24 NL NL930143C patent/NL930143I2/nl unknown
-
1994
- 1994-02-16 JP JP6019626A patent/JP2573467B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BLOOD,VOL.59,NO.3(1982),P.664−670 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU641119B2 (en) | 1993-09-16 |
AU2529584A (en) | 1984-09-06 |
JPH07126183A (ja) | 1995-05-16 |
JPH0794478B2 (ja) | 1995-10-11 |
JPS6034916A (ja) | 1985-02-22 |
AU2705788A (en) | 1989-05-04 |
EP0118256A2 (en) | 1984-09-12 |
NL930143I1 (nl) | 1994-01-03 |
EP0118256A3 (en) | 1986-12-10 |
CA1252744A (en) | 1989-04-18 |
DK170806B1 (da) | 1996-01-22 |
EP0118256B1 (en) | 1992-05-13 |
NL930143I2 (nl) | 1998-09-01 |
DK151784D0 (da) | 1984-03-05 |
DK151784A (da) | 1984-09-05 |
DE3485711D1 (de) | 1992-06-17 |
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