FI58260B - Foerfarande foer framstaellning av rent insulin - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av rent insulin Download PDFInfo
- Publication number
- FI58260B FI58260B FI772204A FI772204A FI58260B FI 58260 B FI58260 B FI 58260B FI 772204 A FI772204 A FI 772204A FI 772204 A FI772204 A FI 772204A FI 58260 B FI58260 B FI 58260B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- insulin
- ethanol
- extract
- gel
- volume
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
-ι**ιτι— - ΓβΊ f11, KUULUTUSJULKAISU r q« / a lBJ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 5 82 60 C Patentti myönnetty 12 01 1901 ^Patent meddelat ^ (51) Kv.ik?/into.3 A 61 K 37/26, C 07 C 103/52
SUOMI—FINLAND (21) p»wnttn»k«mu»—p«t*M«ft»eknjnt T7220U
(22) Hmkainltplivt — Anaflknlnpdif 15.07·77 (23) AlloiplM—GIMghet*de| 15.07.77 (41) Tulkit julkis·k*) — Bllvlt offentHj 16.01.79
Patentti- Ja rekisterfhallltui (44) Nlhttvikelpenon js kuuL|ulk*l*m pvm. —
Patent- och reglsterstyrelaen AmMcm utitgd och utUkriften pubticend 30.09· 80 ' (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Be*lrd prlorltet (71) Laboratories Leo S.A., 99 Avda.de Pio XII, Madrid, Espanja-Spanien(ES) (72) Willy Henry Jensen, Madrid, Espanja-Spanien(ES) (7*0 Oy Kolster Ab (5*+) Menetelmä puhtaan insuliinin valmistamiseksi - Förfarande för fram-ställning av rent insulin
Keksinnön kohteena on menetelmä insuliinia, vettä ja etanolia sisältävän raa'an haimarauhasuutteen puhdistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että raaka uute, senjälkeen kun se on jäähdytetty rasvan poistamiseksi kiteyttämällä, mitä seuraa rasvakiteiden erottaminen uutteesta, ja mahdollisesti senjälkeen kun sitä on edelleen esipuhdistettu, jonka uutteen etanolipitoisuus on 60...80 tilav.-#, saatetaan geelisuodatukseen Sephadex®LH-60:llä, joka on epi-” kloorihydriinillä verkkoutettua dekstraania, ja jonka ekskluusioraja on noin 10 000 MP ja jonka vedensitomiskyky on 5,3-6,3 ml/g, ja joka sisältää dekstraani-ketjujen glukoosiyksiköihin eetterisidosten välityksellä sitoutuneita hydroksi-propyyliryhmiä, ja joka geeli on turvotettu etanolissa tai etanolin vesiliuoksessa, jonka etanolipitoisuus edullisesti on vähintäin 60 tilav.-#, ja jonka etanolipitoisuus ja pH-arvo edullisesti ovat samat kuin käytetyllä uuttoaineella, samalla kun eluoimisaineena samoin käytetään etanolia tai etanolin vesiliuosta, jonka etanolipitoisuus edullisesti on vähintäin 60 tilav.-%.
2 58260 Käsitettä "raaka insuliiniuute" käytetään tässä tavanomaisessa merkityksessään, toisin sanoen uutteesta, joka saadaan käsittelemällä haimarauhasia vesipitoisella orgaanisella liuottimena, erityisesti vesipitoisella etanolilla, tavallisesti 60...80-$;isella, ja myös uutteista, jotka sen lisäksi, että niistä on poistettu rasva, ovat olleet erilaisten käsittelyjen kohteena, joissa insu-liiniliuoksesta esimerkiksi seostetaan erilaisia proteiineja pH:ta muuttaen (ns. pH-8-saostus), ja/tai liuosta käsitellään käänteisosmoosilaitteessa, kuitenkin niin, että insuliini näiden käsittelyjen aikana pysyy nestefaasissa.
Käsitteellä ei niinmuodoin tarkoiteta insuliinipitoisia liuoksia, jotka on muodostettu liuottamalla alkuperäisestä uutteesta eristetty, puhdistettu, kiinteä insuliini liuottimeen. ~
Nyt oletetaan yleisesti, että antigeeni-pitoisuuteen insuliinivalmisteissa etupäässä ovat syynä valmisteissa olevat epäpuhtaudet, kun taas aikaisemmin on oltu sitä mieltä, että insuliini-vasta-aineet kehittyivät insuliinin itsensä — vaikutuksesta. Nämä epäpuhtaudet voivat olla insuliinille vieraita, haimasta peräisin olevia proteiineja, proinsuliinia, joka on insuliinin esiaste, välituote-insuliinia, dimeeriä, arginiini-insuliinia, etyyliesteri-insuliinia, desamido-insuliinia, joka on eriasteisesti deamidoitu, muita insuliini-muunnelmia, ja väriaineita.
Sentähden pyritään valmistamaan insuliinivalmisteita, jotka koostuvat puhtaasta insuliinista, ns. yksikomponentti-insuliinista, joka on vapaa kaikenlaisista epäpuhtauksista ja myötäseuraavista aineista.
Tätä päämäärää varten on ehdotettu tavallisella tavalla valmistettu amorfinen tai kiteinen insuliini saatettavaksi perusteelliseen lisäpuhdistukseen esim. ioninvaihtokäsittelyllä, geelisuodatuksella käyttäen ns. molekyyliseulaa, tai jako-kromatografiällä.
Puhdistusta jako-kromatografiaa käyttäen on kuvattu esim. saksalaisessa hakemusjulkaisussa n:o 2 212 695· Siitä on tunnettua saattaa liuos, joka on muodostettu liuottamalla kiinteää, vielä epäpuhdasta insuliinia vesipitoiseen liuo-tinsysteemiin, joka alkoholien, joissa on 1+...5 hiiliatomia, ohella sisältää karboksyylihappoja, joissa on 1.,.3 hiiliatomia, ja/tai ammoniakkia tai orgaanista emästä, jonka pK -arvot on väliltä n. 5,1,-.11, jako-kromatografiseen käsittelyyn, e G* jossa geelinä käytetään Sephadex^LH-20. Edellä mainittu geeli on dekstraani, joka on silloitettu epikloorihydriinillä ja joka sisältää hydroksipropyyliryhmiä, jotka on eetterisidoksin sidottu dekstraaniketjujen glukoosi-yksiköihin.
3 58260
Insuliinin puhdistusta geelisuodattamalla on selitetty US-patenttijulkaisussa 3 876 623. Tällöin lähdetään alkalimetalli- tai ammoniuminsuliinista ja käytetään geeliä, jolla on tarkoin määrätyt ominaisuudet, kuten määrätty veden-sitomiskyky ja määrätty raekoko. Puhdistettavan raakainsuliinin insuliinipitoi-suuden tulee olla yli 80 ts insuliinin ja sitä muistuttavien veren sokeripitoisuutta alentavien proteiinien määrän tulee olla ainakin 80 % läsnä olevien proteiinien kokonaismäärästä. On mainittu, että geelinä on mm. verkkoutettu dekstraani, kuten Pharmacia Fine Chemicals:n valmistama Sephadex-geeli, mutta ei ole täsmällisemmin mainittu, mikä Sephadex-geeli tulee kysymykseen.
Pitkälle puhdistetuilla insuliineilla, joita saadaan edellä mainituilla _ tunnetuilla puhdistusmenetelmillä, on voimakkaasti alentunut antigeenipitoisuus, mutta täydellisesti tämä ei ole poistunut. Syynä tähän on epäilemättä, että puh-distusvaiheista huolimatta puhdistetuissa valmisteissa on insuliinista poikkeavia aineita.
Aikaisemmin on kehitetty menetelmä hyvin puhtaan yksikomponentti-insuliinin valmistamiseksi (ks. suomalainen hakemus n:o 770 112, joka vastaa tanskalaista hakemusta n:o 1U1/77)-
Siinä kuvattu menetelmä voi muunmuassa käsittää vaiheen, jossa rasvasta vapautettu väkevöity raaka insuliiniuute (liuotinseos: vesi/orgaaninen liuotin) käsitellään ioninvaihtajalla, jolloin insuliini sitoutuu ioninvaihtajaan, josta se eluoidaan. Ko. raaka insuliiniuute voi olla esipuhdistettu siten, että rasva on saostettu pois alhaisessa lämpötilassa, esim. n. -U0°C:ssa, ja osa väriaineesta sekä oleellinen osa molekyyleistä, jotka ovat insuliinimolekyyliä suurempia tai pienempiä, on poistettu ultrasuodattamalla käänteisosmoosilaitteessa. Tällöin on vaikeata erottaa insuliinia sekä erittäin puhtaana että hyvällä saannolla, koska käsittelyajan pidentyessä syntyy insuliinimolekyylien yhteenkasaumia, jotka — ovat myöhemmin vaikeasti eluoitavissa.
Keksijät ovat sen takia pyrkineet löytämään puhdistusmenetelmän, joka voi täydentää tai korvata raakauutteen käsittelyn ioninvaihtajilla, niin että päästään _ tehokkaaseen erotukseen ilman insuliinihäviötä tai pienemmillä insuliinihäviöillä kuin aikaisemmin.
Nyt on siis keksitty, että voidaan puhdistaa insuliinin raakaa etanoli-uutetta n. 100-%:isella insuliini-saannolla saattamalla raakauute geelisuodatukseen käyttäen erikoista geeliä ja ottaen huomioon erikoisolosuhteet.
Sephadex^ LH-60 on muodoltaan pallomainen geeli, jolla on sekä hydrofii-lejä että lipofiilejä ominaisuuksia. Sephadex®LH-60 valmistaa Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi. Alunperin sen raekoko oli UO-120 jim, mutta nykyään löytyy muitakin raekokoja. Raekoko ei ole kriittinen keksinnön mukaisessa mene-teImussa.
11 58260 Tämän keksinnön mukaisessa geelisuodatuksessa tunkeutuvat insuliinimole-kyylit geeliosasten sisään, mikäli niiden molekyylipa!no on geelin ekskluusio-rajan alapuolella, Eluoitaessa saadaan insuliinijae, joka on täydellisesti vapaa väliaineesta ja joka ei sisällä, ainakaan käytännöllisesti katsoen, proteiineja, joiden molekyylit ovat suurempia tai pienempiä kuin insuliinin molekyylit, vaan ne sisältävät ainoastaan insuliini-johdannaisia, joilla on käytännöllisesti katsoen sama molekyylikoko kuin insuliinilla. Insuliinisaanto on käytännöllisesti katsoen 100 %.
Tätä menetelmää voidaan erityisen edullisesti käyttää suomalaisessa hakemuksessa n:o 770 112 (vastaa tanskalaista hakemusta n:o 1^1/77) esitetyn menetelmän yhteydessä, koska geelisuodatus täydentää tai korvaa tämän aikaisemman hakemuksen selityksessä esitetyn käsittelyn ioninvaihtajilla.
Tämän keksinnön mukainen geelisuodatus ei kuitenkaan ole rajoitettu mainittujen aikaisempien menetelmien yhteydessä käytettäväksi, vaan sitä voidaan ~ käyttää valitusti rasvasta vapautettuun vesi/etanolipitoiseen raakauutteeseen ja voi olla joko viimeisenä puhdistusvaiheena kiinteän insuliinin eristämiseksi tai välissä oleva puhdistusvaihe.
Mitä aikaisemmin mainittuun menetelmään tulee, joka on tunnettu saksalaisesta hakemusjulkaisusta n:o 2 212 695 ja joka käsittää liuoksen, joka on muodostettu liuottamalla kiinteätä insuliinia vesipitoiseen liuotinjärjestelmään, joka alkoholien, joissa on U...5 hiiliatomia, ohella sisältää karboksyylihapon ja/tai ammoniakkia tai orgaanisen emäksen, saattamisen jako-kromatografiseen käsittelyyn käyttäen Sephadex ®LH -20-geeliä, huomautetaan, että tässä on kysymys muunlaisesta erotustekniikasta kuin geelisuodatuksesta. Menetelmä ei sovi insuliinin raaka-uutteen puhdistukseen, mm. sen vuoksi, että siinä käytetään liuotinjärjestelmää, joka poikkeaa niistä liuottimista, joita tavallisesti käytetään haimarauhasten _ /R) /g\ uuttoon. On myös huomattava, että Sephadex^ LH-20 poikkeaa Sephadex^LH-60:stä sikäli, että sillä on alempi ekskluusioraja kuin Viimeksimainitulla, vrt. saksalaisen hakemusjulkaisun sivu U, 3:s täydellinen kappale, niin että insuliini-molekyylit eivät tunkeudu geelin sisään.
Puhdistettaessa raakainsuliiniuutetta keksinnön mukaisesti voidaan menetellä seuraavalla tavalla:
Saatetaan geeli turpoamaan etanolissa tai vesipitoisessa etanolissa, jonka etanolipitoisuus edullisesti on vähintäin 60 tilav.-#, esimerkiksi seoksessa, joka vastaa haimarauhasten uuttoon käytettyä liuosta, tai mahdollisesti seoksessa, jossa orgaanisen liuottimen pitoisuus on jonkinverran korkeampi.
5 58260
Kolonnia käytetään tavalliseen tapaan; raakauute, jonka etanolipitoisuus on väliltä 60...80 tilav.-#, johdetaan kolonniin, ja eluoimisaine, nimittäin etanoli tai etanolin vesiliuos, saatetaan virtaamaan kolonnin läpi. Eluoimisaine voi olla sama kuin turvotusaine.
pH-arvo Sephadex-kerroksen juoksevassa faasissa on edullisesti väliltä 3...8. (Eluaatit, joiden pH-arvo on alle n. 3, ovat liian happamia suoraan vietäviksi ioninvaihtajille ja pH-arvossa yli 8 insuliini saattaa hajota).
Insuliini eluoidaan ja fraktio kootaan. Se on melko vapaa väriaineista. Saavutetaan käytännöllisesti katsoen 100-#:inen insuliini-saanto.
Puhtaaseen yksikomponentti-insuliiniin pääsemiseksi puhdistetaan eluaattia edelleen esim. ioninvaihtajilla ja lopuksi insuliini eristetään esim. seostamalla.
Esimerkki
Insuliinipitoinen raakauute - joka oli saatu käsittelemällä jäädytettyjä hienojakoisia sian haimarauhasia 85~#:isella etanolilla, joka oli tehty happa-meksi pH-arvoon n. 3 rikkihapolla (2 1 85-#:ista etanolia/1 kg rauhasia, mikä yhdessä rauhasissa olevan veden kanssa antaa etanolin 65_#:isen vesiuutteen), poistamalla rasva uutteesta jäähdyttämällä -30°C:seen, erottamalla muodostuneet rasvakiteet, ja väkevöimällä 1/10-osaan alkuperäisestä tilavuudesta käänteis-osmoosilla - geelisuodatettiin seuraavalla tavalla: 50 1 edellä mainittua väkevöitettä vietiin pylvääseen (läpimitta U5 cm, (K) korkeus 75 cm), jossa oli Sephadex^LH-60, joka oli turvotettu ja tasapainoi-tettu 65_$:isella etanolilla (asetaattipuskuri, ioniväkevyys 0,025, pH-arvo 7,3).
Eluointi suoritettiin eluoimisaineella, joka oli sama kuin turvotusaine.
Ne jakeet, jotka sisälsivät insuliinihuipun, koottiin. Niistä olivat väriaineet täydellisesti poistuneet ja ne eivät sisältäneet ollenkaan tai käytännöllisesti katsoen ei ollenkaan proteiineja, joiden molekyylikoko oli insuliinimole-kyyliä suurempi tai pienempi.
Claims (1)
- 6 58260 Patenttivaatimus : Menetelmä insuliinia, vettä ja etanolia sisältävän raaJan haimarauhas-uutteen puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että raakauute, sen jälkeen kun se on jäähdytetty rasvan poistamiseksi kiteyttämällä, mitä seuraa rasvakiteiden erottaminen uutteesta, ja mahdollisesti senjälkeen kun sitä on edelleen esipuh-distettu, jonka uutteen etanolipitoisuus on 60...80 tilav.-#, geeli-suodatetaan Sephadex®LH-60:llä, joka on epikloorihydriinillä verkkoutettua dekstraania, ja jonka ekskluusioraja on noin 10 000 MP ja jonka vedensitomiskykv on 5,3-6,3 ml/g, ja joka sisältää dekstraaniketjujen glukoosiyksikköihin eetteri-sidosten välityksellä sitoutuneita hydroksipropyyliryhmiä, ja joka geeli on turvotettu etanolissa tai etanolin vesiliuoksessa, jonka etanolipitoisuus edullisesti on vähintäin 60 tilav.-ίϊ, ja jonka etanolipitoisuus ja pH-arvo edullisesti ovat samat kuin käytetyllä uuttoaineella, samalla kun eluoimisaineena samoin käytetään etanolia tai etanolin vesiliuosta, jonka etanolipitoisuus edullisesti on vähintäin 60 tilav.-/5.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI772204A FI58260C (fi) | 1977-07-15 | 1977-07-15 | Foerfarande foer framstaellning av rent insulin |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI772204 | 1977-07-15 | ||
FI772204A FI58260C (fi) | 1977-07-15 | 1977-07-15 | Foerfarande foer framstaellning av rent insulin |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI772204A FI772204A (fi) | 1979-01-16 |
FI58260B true FI58260B (fi) | 1980-09-30 |
FI58260C FI58260C (fi) | 1981-01-12 |
Family
ID=8510975
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI772204A FI58260C (fi) | 1977-07-15 | 1977-07-15 | Foerfarande foer framstaellning av rent insulin |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FI (1) | FI58260C (fi) |
-
1977
- 1977-07-15 FI FI772204A patent/FI58260C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI772204A (fi) | 1979-01-16 |
FI58260C (fi) | 1981-01-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Skeggs Jr et al. | The purification of hypertensin I | |
Karlsson et al. | Purification of a neurotoxin from the venom of Naja nigricollis | |
US5631347A (en) | Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein | |
JP2002500013A (ja) | ヒトプロインシュリンの製造方法 | |
CN103694316B (zh) | 一种阿基瑞林的制备方法 | |
CN101787071B (zh) | 一种伐普肽的纯化方法 | |
CN109851667A (zh) | 一种德谷胰岛素前体的纯化方法 | |
CN1240702C (zh) | 高获得率提取替曲朵辛的方法 | |
FI58260B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av rent insulin | |
CN106749626B (zh) | 一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法及利用牛血的方法 | |
JPS62188963A (ja) | 液体クロマトグラフイ−用移動相および蛋白質精製方法 | |
WO2006025697A1 (en) | Method of isolating 1,3-propanediol or 1,3-propanediol and 1,2-propanediol from solution containing 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, glycerol, and glucose | |
JPS59231097A (ja) | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ21kおよびその製造法 | |
EP0087066A1 (en) | Process for purifying secretin | |
FI64508B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av rent insulin saosom insulinav svin ur bukspottkoertlar | |
CN108586475A (zh) | 一种河豚毒素提取纯化方法 | |
EP0000439B1 (en) | Method of purifying an insulin-containing aqueous ethanolic raw extract from pancreas glands | |
CN115806591B (zh) | 一种维拉卡肽的纯化方法 | |
Yamada et al. | Nα-acetylhistidine metabolism in fish—I. Identification of Nα-acetylhistidine in the heart of rainbow trout Salmo gairdneri | |
CN114315932B (zh) | 一种两性霉素b的杂质a或杂质b的分离纯化方法 | |
CA1174972A (en) | Peptide | |
JPS625998A (ja) | 膵腺からのグルカゴンの回収法 | |
FR2640627A1 (fr) | Nouveaux fluorures d'aldosaminyle, leur preparation et leur utilisation pour la fabrication d'oligosaccharides amines lies (1 -> 4) | |
WO2006069029A1 (en) | Purified rhigf-i/rhigfbp-3 complexes and their method of manufacture | |
Cachia et al. | Fast preparative separation of “native” core E coli 30S ribosomal proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed |
Owner name: LABORATORIOS LEO S.A. |