JPH04230699A - クロマトグラフィーによるインスリンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、水混和性有機溶媒を含有する水
性、緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲル上でのク
ロマトグラフィーによるインスリンおよび／またはイン
スリン誘導体の精製方法に関し、水性、緩衝溶媒中には
両性イオンを溶解させることおよび／または溶媒のｐＨ
を精製すべきインスリンもしくはインスリン誘導体の等
電点の近傍とすることを特徴とするものである。

【０００２】インスリンまたはインスリン誘導体の、親
油性に改質した（逆相）シリカゲル上での精製は、分析
的分離方法として知られていて、何年も前から高圧液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の形で使用して好結果
が得られている（ＷＳ　Ｗｅｌｉｎｄｅｒら：Ｊ．　Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，　３６１，　３５７〜３６７，
　１９８６）。分析のスケールでは、μｇの範囲の蛋白
量が、改質シリカゲルを充填し、スチール、ガラスまた
はプラスチックで作られたカラム上に負荷され、ついで
流動液体混合物（通常は、一定のまたは変動する濃度で
有機溶媒を含有する酸性の、水性緩衝溶液）によって溶
出される。この場合負荷される蛋白質は、カラム容量１
ｍｌあたり３０μｇよりもはるかに少ない。

【０００３】現時点での精製方法は、実験室で採用され
る、比較的毒性の強い（アセトニトリル）溶媒や、腐蝕
性の、高価な緩衝成分たとえばテトラアルキルアンモニ
ウム塩、アルキルスルホネート、ヘキサフルオロアセト
ン、トリフルオロアセテートを使うことが多い（Ｅ．Ｐ
．　Ｋｒｏｅｆｆら、Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ，　
４６１，　４５〜６１，　１９８９）。これらの移動相
では、混合物にインスリン様物質がさらに強度に夾雜し
ている場合、品質、主要成分の収量および総回収率の点
で満足できる分取による分離を達成できない（Ｊ．　Ｒ
ｉｖｅｒ，Ｒ．　ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ，Ｊ．　Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒ，２６８，１１２〜１１９，１９８３；
Ｐｅｔｅｒら、Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ，４０８、
４３〜５２，１９８７）。

【０００４】前段階での化学的変換たとえば強酸性エス
テル切断、酵素的ペプチド交換、結晶化による精製等か
らのインスリンは通常、類似の性質の付随物を含有する
。これらは、電荷の差が十分であればイオン交換クロマ
トグラフィーにより、特定のｐＨ値を選ぶことによって
精製できる（米国特許第４　１２９　５６０号）。この
方法の欠点は、その希釈効果でしたがって沈殿の後処理
時における貴重な物質の上清中への喪失、比較的長いサ
イクル時間、または総回収率したがって収率が低いこと
である。

【０００５】カラムの含量、負荷量および溶出液の通過
量を拡大することにより、原理的には分取による分離を
達成することは可能である。この場合に必要な有機溶媒
の量は、たとえば直径２０ｃｍを越えるカラムの場合、
ｍ３の規模である。分析的ＨＰＬＣに用いられる溶媒（
たとえば、アセトニトリル、ＤＭＦ、メタノール、ジオ
キサン等）は毒性があるので、これらの方法を工業的な
分取規模で使用するためには、念入りな保護手段の準備
が要求される。

【０００６】本発明の目的は、インスリンおよびインス
リン誘導体のクロマトグラフィーによる精製方法を開発
することであった。すなわち、インスリンの生物活性が
維持され、１回のクロマトグラフィー工程で高純度が達
成され、サイクル時間は短く、カラムは５０クロマトグ
ラフィーサイクル以上の有効寿命、時間のかかる充填過
程を要しない固定シリカゲル相の再生および非毒性溶媒
の使用が達成され、したがって工業的分取規模を可能に
する方法である。

【０００７】本発明は、水混和性有機溶媒を含有する水
性緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲル上でのクロ
マトグラフィーにおいて、両性イオンを緩衝溶液中に溶
解させるか、または溶媒混合物のｐＨを精製すべきイン
スリンもしくはインスリン誘導体の等電点の近傍とし、
両性イオンを存在させる方法により、インスリンまたは
インスリン誘導体の精製が可能であることを発見したも
のである。

【０００８】両性イオンの存在、または精製すべきイン
スリンもしくはインスリン誘導体の等電点の近傍におけ
る溶媒のｐＨで両性イオンの存在下でのクロマトグラフ
ィーは、驚くべきことに、所望の生成物と不純物の良好
な分離のみでなく、固定相（親油性に改質したシリカゲ
ル）からの蛋白質の良好な脱着をも生じる。この分離方
法はインスリン様成分が著しく夾雑してインスリン溶液
でも精製することを可能にし、たとえばインスリンまた
はインスリン誘導体からＡ２１−デアミドインスリンを
分離することもできる。しかも、固相からの蛋白質の好
都合な脱着は、カラム充填剤が長い有効寿命をもつこと
と、インスリンの高い総収率の達成が可能になることを
意味する。

【０００９】本発明はしたがって、水混和性有機溶媒を
含有する水性、緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲ
ル上でのクロマトグラフィーによるインスリンおよび／
またはインスリン誘導体の精製方法において、両性イオ
ンを緩衝溶媒中に溶解させるか、または溶媒混合物のｐ
Ｈを精製すべきインスリンもしくはインスリン誘導体の
等電点の近傍とし、両性イオンを存在させる方法に関す
る。

【００１０】本発明の方法には、すべてのインスリン、
たとえば動物もしくはヒト起源のあらゆる種のインスリ
ン、インスリン前駆体たとえばプロインスリンもしくは
プレプロインスリン、または遺伝子的に修飾した微生物
によって発現される組換えインスリンもしくはインスリ
ン誘導体を使用できる。さらに、たとえば化学的または
酵素的誘導化によって製造されたインスリン誘導体、た
とえばＤｅ−Ｐｈｅ−Ｂ１−インスリン、インスリン−
β−ケテン−スルホネート、ジアルギニン−インスリン
（Ｂ３１、Ｂ３２）、モノアルギニン−インスリンまた
はジフェニルアラニン−インスリン（Ｂ３１、Ｂ３２）
（米国特許第４　６０１　８５２号）も使用できる。

【００１１】使用が好ましいインスリン誘導体は式Ｉ

【
化２】 で示される。式中、Ｒ３０は遺伝子でコードできるＬ−
アミノ酸の残基であり、Ｘは、ヒドロキシル基、本来塩
基性であって５０個までの炭素原子を有する生理的に許
容される有機基、遺伝子でコードできるＬ−アミノ酸で
あって存在するその末端カルボキシル基は適宜遊離、エ
ステル官能基、アミド官能基、ラクトンまたはＣＨ２Ｏ
Ｈに還元された形のＬ−アミノ酸であり、ｎは０〜１０
の整数であり、ｙは水素またはＬ−フェニルアラニンで
あり、ＡおよびＢ鎖は動物またはヒトインスリンの配列
である。

【００１２】使用がとくに好ましいインスリン誘導体は
式Ｉにおいて、Ｒ３０がＬ−アラニンまたはＬ−スレオ
ニンであり、ＸはＬ−アルギニン、Ｌ−リジンまたはＬ
−フェニルアラニンからなる群よりのＬ−アミノ酸１個
また２個以上のインスリン誘導体である。

【００１３】インスリンおよびインスリン誘導体は、比
較的不純な状態および精製前の形（たとえばゲルクロマ
トグラフィーによる）のいずれでも使用できる。結晶化
を何回も反復した後でも、またゲルクロマトグラフィー
後にも、インスリンはまだ、分子量がきわめて類似した
インスリン様の夾雜物を含んでいる。適当に選ばれたｐ
Ｈではそれらの電荷状態は互いにまたはインスリンと異
なるが、インスリンと複合体を形成する。このような物
質の例には、デアミノインスリン、アルギニン−および
ジアルギニン−インスリン、インスリンエチルエステル
等がある。

【００１４】親油性に改質されたシリカゲルとは、疎水
性マトリックスを表面上に付着させたシリカゲルを意味
する。疎水性マトリックスの例には、鎖長３〜２０の炭
素原子をもつアルカンがある。親油性に改質されたシリ
カゲルのとくに好ましい例には以下の物質がある。

【００１５】ＲＮｕｃｌｅｏｓｉｌ：Ｍａｃｈｅｒｅｙ
　＆　Ｎａｇｅｌによって供給されている。球形および
非球形物質、粒子径は４５μｍまで多様、孔径１００Å
、Ｃ８−またはＣ１８−改質。ＲＬｉｃｈｒｏｐｒｅｐ
：Ｍｅｒｃｋによつて供給されている。球形および非球
形物質、粒子径は４０μｍまで多様、孔径６０〜２５０
Å、Ｃ８〜Ｃ１８−改質。

【００１６】ＲＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ　Ｓｅｌｅｃｔ
　Ｂ：Ｍｅｒｃｋによって供給されている。球状物質、
粒子径２５μｍまで、Ｃ８−改質。ＲＷａｔｅｒｓ　Ｐ
ｒｅｐ：Ｃ１８−改質、５０〜１０５μｍ非球状、孔径
１００Å。

【００１７】ＲＺｏｒｂａｘ　Ｐｒｏ　１０：ＤｕＰｏ
ｎｔによって供給されている。Ｃ８−改質、１０μｍ、
球状、孔径１００Å。ＲＫｒｏｍａｓｉｌ：ＥＫＡ　Ｎ
ｏｂｅｌによって供給されている。Ｃ４−、Ｃ８〜Ｃ１
８−改質、１６μｍまで、球状、孔径１００、１５０ま
たは２００Å。

【００１８】両性イオンは、プロトンを取り込みそれを
消失させることができる化合物、すなわち酸性溶液にお
いては陽イオンを、アルカリ性溶液においては陰イオン
を形成する化合物で、たとえばα−アミノ酸、ベタイン
またはベタイン誘導体である。好ましい両性イオンは、
グリシン、グルタミンまたはベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ト
リメチルグリシン）である。グリシンはとくに好ましい
。

【００１９】インスリンまたはインスリン誘導体の等電
点（ＩＥＰ）は、溶解したインスリンの陽イオン性電荷
と陰イオン性電荷の数が０に等しくになるそのインスリ
ン溶液のｐＨである。たとえば、ブタインスリンのＩＥ
ＰはｐＨ５．３と５．４の間である（Ｈ．　Ｎｅｕｒａ
ｔｈ，　Ｋ．　Ｂａｉｌｅｙ，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｈｏ
ｒｍｏｎｅｓ，　Ｖｏｌ．ＩＩ／Ａ，Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ，　６３６頁）。「等電点の近傍」の語は、と
くに、精製すべきインスリンのＩＥＰの上下約１ｐＨ単
位のｐＨ値を意味する。 とくに好ましいｐＨ値はＩＥＰの上下０．５ｐＨ単位ま
での値である。

【００２０】溶出液には、溶出液のｐＨを一定に保持す
るために、緩衝物質を含有させる。適当な緩衝物質は文
献に知られていて、たとえばリン酸塩、アルカリ金属も
しくはアルカリ土類金属塩たとえばクエン酸ナトリウム
または酢酸カリウム、クエン酸、酢酸、硫酸もしくは塩
化アンモニウムである。溶出液にはさらに、水混和性有
機溶媒たとえばアルコール類、ケトン類、酢酸メチル、
ジオキサン、ジメチルスルホキシドまたはアセトニトリ
ルが添加される。アルコールたとえばｎ−、ｉｓｏ−プ
ロパノール、メタノールもしくはエタノール、または酢
酸メチルが好ましい。

【００２１】水混和性有機溶媒の濃度は１〜９０％、好
ましくは１０〜６０％、とくに好ましくは１０〜３５％
である。緩衝物質の濃度は、溶媒としての水に基づいて
１ｍｍｏｌ／ｌ〜２ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは２５ｍｍ
ｏｌ／ｌ〜１ｍｍｏｌ／ｌである。両性イオンの濃度は
広範囲に変動させることができる。有利な量は、溶媒と
しての水に基づいて１０ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｍｏｌ／ｌ
、好ましくは２０ｍｍｏｌ／ｌ〜５００ｍｍｏｌ／ｌで
ある。

【００２２】クロマトグラフィー時の温度は、０℃〜５
０℃、好ましくは１５〜３０℃、とくに好ましくは１５
〜２０℃である。クロマトグラフィー時の操作圧は実質
的に一定とする。クロマトグラフィーは可変圧力で実施
できる。たとえばクロマトグラフィーは５〜４００バー
ルの圧力下に、とくに２０〜１００バール下に行うこと
ができる。

【００２３】インスリンおよびインスリン誘導体のカラ
ムへの負荷、クロマトグラフィーおよび溶出は、既知の
、慣用の工業的方法によって実施される。精製すべきイ
ンスリンの溶液のカラムへの負荷は、含アルコール水性
または純粋な水性緩衝溶液を用いて行うのが好ましい。 インスリン溶液の蛋白含量は１〜１０％、好ましくは３
％である。

【００２４】本発明の方法におけるインスリンの溶出は
、緩衝物質の濃度を一定にして（アイソクラクティック
に）または緩衝液中の水混和性有機溶媒の含量を変化さ
せて行われる。有機溶媒の含量は、使用した有機溶媒の
濃度が溶出容量の関数として、とくに好ましくは直線関
数として増加するように変動させる。

【００２５】クロマトグラフィー後の溶出液からのイン
スリンの除去は、亜鉛による沈殿または結晶化によって
行われる。これは、真空蒸留によって溶媒を溶液から実
質的に除去するか、またはその濃度を水で希釈して低下
させるかのいずれかによって可能になる。いずれにして
も、上清中の蛋白質含量を＜５０ｍｇ／ｌに保持するた
めに、沈殿または結晶化前の溶媒濃度は１０％またはそ
れ以下にしなければならない。生成した純粋なインスリ
ンの沈殿は、傾瀉、遠心分離または濾過によって単純し
、乾燥することができる。

【００２６】本発明の方法は、分析的クロマトグラフィ
ーの場合のみでなく、分取クロマトグラフィー、とくに
本発明の方法を分取ＨＰＬＣシステムで行う場合にも適
している。

【００２７】「分取クロマトグラフィー」の語は、純粋
な生成物の単なる分析ではなく、その取得の目的での精
製方法を意味する。純粋な生成物の量は広い限界内で、
たとえば１ｍｇ〜５０ｋｇ、好ましくは５０ｍｇ〜１５
ｋｇで変動させることができる。

【００２８】本発明の方法を以下の実施例において詳細
に記述する。とくに指示のない限り、百分率のデータは
重量に関するものである。

【００２９】実施例１ 緩衝液Ａ：０．２Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグリシ
ン、０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、純水
溶液緩衝液Ｂ：０．１Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグ
リシン、０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、
水／ｎ−プロパノール　１：１ 吸着体：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　　Ｃ１８、１５〜２５μ
ｍ球状、孔径１００Å、Ｍａｃｈｅｒｅｙ　＆　Ｎａｇ
ｅｌ（Ｄｕｅｒｅｎ）より供給カラム寸法：４０ｍｍ×
２５０ｍｍ ヒトインスリンＢ３０−ジ−ｔｅｒｔブチルエステル／
エーテルからトリフルオロ酢酸で切断して得られたヒト
インスリン（蛋白質含量７９．１％）３．５ｇをカラム
に負荷する。インスリンは、適当な高圧ポンプを混合装
置とともに使用し、混合緩衝液ＡおよびＢで、プロパノ
ール勾配１４〜２０％が生じるように溶出する。インス
リンは、４６ｍｌ／分のポンプ作用下に、約１７．５％
プロパノール、２３分後に溶出される。

【００３０】結晶化したヒトインスリン（ＨＩ）の分画
化および単離により、主分画中に蛋白質含量９７％の生
成物が８８．５％の収率で、第二分画中に蛋白質含量８
５．７％の生成物が７．５％の収率で得られる。したが
って、総回収率は最初のインスリンの９６．０％である
。

【００３１】実施例２ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグリシ
ン、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、純
水溶液 緩衝液Ｂ：０．０５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグリ
シン、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、
水／ｎ−プロパノール　１：１ 吸着体：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　　Ｃ１８−Ｐ、１５〜２
５μｍ球状、孔径１００Å、Ｍａｃｈｅｒｅｙ　＆　Ｎ
ａｇｅｌ　社より供給　カラム寸法：４０ｍｍ×２５０
ｍｍ ヒトインスリンジ−ｔｅｒｔブチルエステル／エーテル
のエステル切断からのヒトインスリン（ＨＩ）（蛋白質
含量８６．１％）７．０ｇを０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ
緩衝液、ｐＨ２．８中３％濃度の溶液の形で、高圧ポン
プを用いて、カラムに負荷する。ついで、上述の緩衝液
で高圧下、ｎ−プロパノール勾配で溶出を行う。プロパ
ノール濃度を１４から１７．５％に６０分間を要して上
昇させる。上述したと同じ様式で分画化および結晶化を
行うと、蛋白質含量９８．７％の生成物が得られる。精
製ヒトインスリンの収率は使用したインスリンの９１％
である。

【００３２】実施例３ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグリシ
ン、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、純水溶
液緩衝液Ｂ：０．０５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグ
リシン、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、水
／ｎ−プロパノール　１：１ 吸着剤：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｂ、
Ｃ８、１５〜２５μｍ、孔径６０Å、Ｍｅｒｃｋ社より
供給カラム寸法：５０ｍｍ×２５０ｍｍ ブタインスリンのトリプシンによるアミド基交換からの
反応混合物１０ｇを２００ｍｌの０．１Ｍグリシン／Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ｐＨ２．８に溶解した溶液をカラムに負荷
する。個々の蛋白質成分は、流速４０ｍｌ／分で１２０
分を要し、この間プロパノール濃度を１４から３０％に
上昇させると、分離して溶出される。結晶化または沈殿
および乾燥後に得られる主分画は、純度＞９７％のヒト
インスリンＢ３０−ジ−ｔｅｒｔブチルスレオニンエス
テル／エーテルであり、使用したインスリンに基づく収
率は９３％である。

【００３３】実施例４ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍグリシン
、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、純水溶液
緩衝液Ｂ：０．０５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍグリシ
ン、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、水／ｎ
−プロパノール　１：１ 吸着剤：Ｚｏｒｂａｘ　Ｐｒｏ　　１０、Ｃ８、１０μ
ｍ、ＤｕＰｏｎｔ社より供給 カラム寸法：５ｃｍ×２５ｃｍ ヒトインスリンＢ３０−ジ−ｔｅｒｔブチルスレオニン
エステル／エーテルの０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ溶液１
００ｍｌ中トリフルオロ酢酸による切断で得られたＨＩ
　７．５ｇをポンプでカラム上に送り、８０ｍｌ／分の
流速で溶出させた。緩衝液Ｂの濃度を６０分間を要して
１８から２５％に上昇させた。この場合の保持時間（Ｒ
Ｔ）は約３７分であった。最初のＨＩの９６．８％が主
分画から、結晶化および乾燥後に、＞９７％の純度で単
離され、第二の分画は純度＜５０％のＨＩ　２．２％を
含有した。

【００３４】実施例５ 緩衝液Ａ：０．２Ｍ硫酸ナトリウム、０．１Ｍグリシン
、０．０３Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５、１０％酢
酸メチル 緩衝液Ｂ：０．０５Ｍ硫酸ナトリウム、０．１Ｍグリシ
ン、０．０３Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５、２０％
酢酸メチル 吸着剤：Ｋｒｏｍａｓｉｌ　　Ｃ８、１３μｍ、孔径１
００Å、ＥＫＡＮｏｂｅｌ社により供給 カラム寸法：５ｃｍ×２５ｃｍ カラム容量１ｌあたりウシインスリン８ｇを、３０％緩
衝液Ｂで平衡化したカラムに、０．１Ｍグリシン／ＨＣ
ｌ緩衝液の補助により適用した。緩衝液Ｂの濃度を、９
０分を要して８０％（＝１８％酢酸メチル）まで上昇さ
せた。ウシインスリンは６５分後に主画分中に＞９７．
５％の純度で溶出し（収率６３．５％）、水で希釈後、
塩化亜鉛で沈殿させた。総回収率は９２．５％であった
。

【００３５】実施例６ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグリシ
ン、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、５％ｎ
−プロパノール 緩衝液Ｂ：０．０５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグリ
シン、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、水／
ｎ−プロパノール　１：１ 吸着剤：Ｋｒｏｍａｓｉｌ　　Ｃ８、１３μｍ、孔径１
００Å、ＥＫＡＮｏｂｅｌ社により供給 カラム寸法：５ｃｍ×２５ｃｍ ヒトインスリンＢ３０−ジ−ｔｅｒｔブチルスレオニン
エステル／エーテルのトリフルオロ酢酸による切断から
のヒトインスリン（純度約９２％）４ｇ（＝８ｇ／ｌ）
を、カラムに負荷した。９０分を要して１８から２５％
への緩衝液Ｂの勾配を流すと、ヒトインスリンは４５分
後に主分画中に＞９７％の純度で（収率９１．８％）、
第二の分画中に８０．５％の純度で（収率４．７％）溶
出した。

【００３６】実施例７ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグリシ
ン、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１０％
ｎ−プロパノール 緩衝液Ｂ：０．０５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグリ
シン、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、水／
ｎ−プロパノール　１：１ 吸着剤：Ｋｒｏｍａｓｉｌ　　Ｃ８、１３μｍ、孔径１
００Å、ＥＫＡＮｏｂｅｌ社により供給 カラム寸法：１０ｃｍ×４０ｃｍ １８ｇのブタインスリンを、５％ｎ−プロパノール含有
０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０、１．８
ｌ中、カラムに導入した。勾配は、７０分で９％緩衝液
Ｂ（＝１３．６％ｎ−プロパノール）から１１％緩衝液
Ｂ（＝１４．４％ｎ−プロパノール）に変化させた。ブ
タインスリンは５０分後に、主分画中、蛋白質含量＞９
８％で溶出した（収率８９％）。総回収率は初期量の９
６．８％であった。

【００３７】実施例８ 緩衝液Ａ：０．２Ｍ塩化アンモニウム、０．１Ｍグリシ
ン、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム、５％ｎ−プロパ
ノール、ｐＨ５．５ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａと同じ、ただし５０％ｎ−プロパノ
ールを添加 吸着剤：Ｋｒｏｍａｓｉｌ　　Ｃ８、１３μｍ、孔径１
００Å、ＥＫＡ　Ｎｏｂｅｌ社（スェーデン）により供
給カラム寸法：５０ｍｍ×２５０ｍｍ 遺伝子操作で得られたヒトインスリン（蛋白質含量８９
．５％）４ｇを、０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ３．０
中に２％蛋白質溶液として溶解し、高圧ポンプでカラム
上に負荷する。溶出は、流速８０ｍｌ／分で７０分かけ
て、１３％から１６％ｎ−プロパノールの直線勾配によ
って行う。分画化および結晶化により、主分画中に蛋白
質含量９８％のヒトインスリンが９３％の収率で得られ
る。 総回収率は初期量に対して９８％である。

【００３８】実施例９ 緩衝液Ａ：０．２Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグリシ
ン、０．０２５Ｍクエン酸アンモニウム、５％エタノー
ル、ｐＨ５．５ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａと同じ、ただし５０％エタノールを
添加 吸着剤：Ｋｒｏｍａｓｉｌ　　Ｃ８、１０μｍ、孔径１
００Å、ＥＫＡ　Ｎｏｂｅｌ社（スェーデン）により供
給カラム寸法：５０ｍｍ×２５０ｍｍ 遺伝子操作で得られたヒトインスリン（蛋白質含量８６
．２％）４．５ｇを２５０ｍｌのグリシン緩衝液、ｐＨ
３．０に溶解し、ついでカラム上にポンプで負荷する。 蛋白質は、２個の高圧ポンプを用い２種の緩衝液ＡとＢ
から直線勾配を生成させて、クロマトグラフィーに付す
。溶出は、１００分後、エタノール濃度３３％、一定流
速８０ｍｌ／分で起こる。分画化および結晶化により、
主分画中、蛋白質含量９６％のヒトインスリンが得られ
る。総回収率は初期物質に対して９３％である。

【００３９】実施例１０ 緩衝液Ａ：０．２Ｍ塩化アンモニウム、０．１Ｍグリシ
ン、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム、１０％酢酸メチ
ル、ｐＨ５．５ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａと同じ塩濃度、ただし２０％酢酸メ
チル 吸着剤：Ｋｒｏｍａｓｉｌ　　Ｃ８、１０μｍ、孔径１
００Å、ＥＫＡ　Ｎｏｂｅｌ社（スェーデン）により供
給遺伝子操作によるインスリンの後処理から誘導された
粗製ヒトインスリン４．６ｇを２００ｍｌの水性グリシ
ン緩衝液に溶解し、ついで５０×２５０ｍｍのクロマト
グラフィー用ＨＰＬＣカラム上にポンプで負荷する。カ
ラム材料は、２個の高圧ポンプを用い、緩衝液ＡとＢを
混合することにより酢酸メチル濃度１３％に予め平衡化
する。 負荷後、ヒトインスリンは、９０分を要して酢酸メチル
１３％から１７％の直線勾配によって溶出する。主生成
物は溶出溶液から結晶化によって単離される。これによ
り蛋白質含量９６％のヒトインスリン３．８ｇが得られ
る。出発原料に基づく総回収率はこの場合、９０％であ
る。

【００４０】実施例１１ 緩衝液Ａ：０．２Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍベタイ
ン、０．０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液により
ｐＨ５．５（純水溶液） 緩衝液Ｂ：０．１Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍベタイ
ン、０．０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液により
ｐＨ５．５（水／イソプロパノール　１：１）吸着剤：
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　　Ｃ１８、１５〜２５μｍ球状、
１００Å カラム：４０ｍｍ×２５０ｍｍ 流速：４５ｍｌ／分 ヒトインスリンジ−ｔｅｒｔブチルエステル／エーテル
のエステル切断からのヒトインスリン３ｇ（蛋白質含量
７９％）を０．１Ｍベタイン／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．
０中３％濃度の溶液の形で、高圧ポンプを用いてカラム
に負荷した。ついで、上述の緩衝液系により４４％緩衝
液Ｂでのアイソクラティックな溶出を行った。保持時間
は約３５分であった。分画化により、主分画中に９８．
１％のヒトインスリンが８０．５％の収率で得られた。 総回収率は９０．５％であった。

【００４１】実施例１２ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグルタ
ミン酸、０．０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液で
ｐＨ５．５（純水溶液） 緩衝液Ｂ：０．１Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍグルタ
ミン酸、０．０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液で
ｐＨ５．５（水／ｎ−プロパノール　１：１）吸着剤：
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　　Ｃ１８−Ｐ、１５〜２５μｍ球
状、１００Å カラム：５０ｍｍ×２５０ｍｍ 流速：６０ｍｌ／分 ヒトインスリンジ−ｔｅｒｔブチルエステル／エーテル
のエステル切断からのヒトインスリン６ｇ（蛋白質含量
７３％）を、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ３．０中３％濃度の溶
液の形で、高圧ポンプを用いてカラムに負荷した。つい
で、上述の緩衝液系を用い、緩衝液Ｂ　２５％〜２８％
の勾配で溶出を行った。保持時間は約２５分であった。 分画化により、主分画中に９８．６％のヒトインスリン
が６５％の収率で得られた。総回収率は８８．５％であ
った。

【００４２】実施例１３ 緩衝液Ａ：０．１５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１０Ｍト
リエチルアミン、硫酸でｐＨ６．５（純水溶液）緩衝液
Ｂ：０．０８Ｍ硫酸アンモニウム、０．０５Ｍトリエチ
ルアミン、硫酸でｐＨ６．５（水／ｎ−プロパノール　
１：１） 吸着剤：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　　Ｃ１８−Ｐ、１５〜２
５μｍ球状、１００Å カラム：５０ｍｍ×２５０ｍｍ 流速：６０ｍｌ／分 ヒトインスリンジ−ｔｅｒｔブチルスレオニンエステル
／エーテルのトリフルオロ酢酸による切断からのヒトイ
ンスリン５ｇを、３％濃度の溶液としてカラムに負荷し
、ついで緩衝液Ｂ　３２〜４２％の間で溶出した。保持
時間は４０分であった。分画化および結晶化により、主
分画中に純度９２．７％の生成物７２％が得られた。総
回収率は初期量の７６％であった。

【００４３】実施例１４ 緩衝液Ａ：０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍ硫酸アンモニウ
ム、塩酸でｐＨ２．５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０．１Ｍクエン酸、０．１Ｍ硫酸アンモニウ
ム、塩酸でｐＨ２．５、水／ｎ−プロパノール　１：１
吸着剤：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　　Ｃ１８、Ｍａｃｈｅｒ
ｅｙ　＆　Ｎａｇｅｌ　社により供給 カラム：４０×２５０ｍｍ 流速：４５ｍｌ／分 ヒトインスリンジ−ｔｅｒｔブチルスレオニンエステル
／エーテルのトリフルオロ酢酸による切断からのヒトイ
ンスリン３ｇを、０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ３．０
中濃度の溶液の形でカラムに負荷し、ついで緩衝液Ｂ３
４〜３５％の間で溶出した。分画化し、結晶化し、乾燥
すると、主分画中に初期量の５７％が純度９４．８％で
、第二の分画中に１６％が純度８４％で単離された。

【００４４】実施例１５ 緩衝液Ａ：０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍ硫酸アンモニウ
ム、塩酸でｐＨ３．５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０．１Ｍクエン酸、０．１Ｍ硫酸アンモニウ
ム、塩酸でｐＨ３．５、水／ｎ−プロパノール　１：１
吸着剤：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　　Ｃ１８、Ｍａｃｈｅｒ
ｅｙ　＆　Ｎａｇｅｌ　社により供給 カラム：４０×２５０ｍｍ 流速：４５ｍｌ／分 実施例１４の場合と同様にカラムに負荷した。保持時間
は約４０分であった。分画化、結晶化および乾燥により
、主分画中に使用した初期ヒトインスリンの５１％が純
度９７．５％で、第二の分画中に４％が純度６８％で得
られた。

【００４５】実施例１６ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ　ｔｒｉｓ、０．１Ｍグリシン、０
．１Ｍ塩化アンモニウム、塩酸でｐＨ８．５、純水溶液
緩衝液Ｂ：０．１Ｍ　ｔｒｉｓ、０．１Ｍグリシン、０
．１Ｍ塩化アンモニウム、塩酸でｐＨ８．５、水／ｎ−
プロパノール　１：１ 吸着剤：Ｋｒｏｍａｓｉｌ　　Ｃ８、１３μｍ、１００
Åカラム：５０ｍｍ×２５０ｍｍ 流速：６０ｍｌ／分 カラムを３３％緩衝液Ｂで平衡化し、トリフルオロ酢酸
による切断からのヒトインスリン（実施例１４参照）６
ｇを０．１Ｍ　ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５中３％濃度
の溶液の形で負荷した。溶出は約３５分後に起こった。 主分画は、分画化および結晶化後、純粋なヒトインスリ
ン９６．６％を含有した（収率８６％）。総回収率は９
５％であった。

【００４６】実施例１７ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ塩化アンモニウム、０．０２５Ｍク
エン酸、アンモニアでｐＨ５．５、ｎ−プロパノール５
容量％ 緩衝液Ｂ：０．１Ｍ塩化アンモニウム、０．０２５Ｍク
エン酸、アンモニアでｐＨ５．５、ｎ−プロパノール５
０容量％　 吸着剤：Ｋｒｏｍａｓｉｌ　　Ｃ８、１３μｍ、１００
Åカラム：５０ｍｍ×２５０ｍｍ 流速：６０ｍｌ／分 トリフルオロ酢酸による切断からのヒトインスリン（実
施例１４参照）６ｇを既述のようにしてカラムに負荷し
た。インスリンは、６０分間での緩衝液Ｂ　２１％から
２５％の勾配内に保持時間４０分で溶出した。主分画は
初期生成物９１％を純度９７．５％で含有した。総回収
率は９６％であった。

【００４７】実施例１８ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ塩化カリウム、０．０２５Ｍクエン
酸、水酸化カリウム溶液でｐＨ５．５、５容量％ｎ−プ
ロパノール 緩衝液Ｂ：０．１Ｍ塩化カリウム、０．０２５Ｍクエン
酸、水酸化カリウム溶液でｐＨ５．５、５０容量％ｎ−
プロパノール　 吸着剤：Ｋｒｏｍａｓｉｌ　　Ｃ８、１３μｍ、１００
Åカラム：５０ｍｍ×２５０ｍｍ 流速：６０ｍｌ／分 負荷と勾配は実施例１７と同様にした。溶出は３５分後
に起こった。主分画は、初期量の９０％のヒトインスリ
ンを純度９６．５％で含有した。総回収率は９３％であ
った。

【００４８】実施例１９〜２４ 実施例１９〜２４におけるクロマトグラフィーは、実施
例１４の場合と同じ条件下に実施した。緩衝液と両性イ
オンの量のみを変えた。

【００４９】実施例１９ 緩衝液Ａ：０．１５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍトリ
エチルアミン、硫酸でｐＨ７．０ 緩衝液Ｂ：０．０８Ｍ硫酸アンモニウム、０．０５Ｍト
リエチルアミン、硫酸でｐＨ７．０ 結果：主分画の純度９５．２％、主分画における収率６
７％。

【００５０】実施例２０ 緩衝液は０．１Ｍグリシンを含まないほかは実施例１６
と同じ。結果：主分画の純度９６．１％；主分画におけ
る収率６５％、第二分画における収率２５％

【００５１
】実施例２１ 緩衝液は実施例１５の緩衝液に０．１Ｍグリシンを添加
結果：主分画における純度９６％；主分画における収率
６６％、第二分画における収率６％

【００５２】実施例２２ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ塩化アンモニウム、０．０２５Ｍク
エン酸、アンモニアでｐＨ４．５、５容量％ｎ−プロパ
ノール、０．１Ｍグリシンベタイン 緩衝液Ｂ：５０％ｎ−プロパノールを添加するほかは緩
衝液Ａと同じ 結果：主分画における純度９８．１％；主分画における
収率８８％、第二分画における収率６％

【００５３】実
施例２３ ｐＨ５．４とし、グリシンベタインを０．１％グリシン
に変えるほかは実施例２２と同じ緩衝液 結果：主分画における純度９７．９％；主分画における
収率９２％、第二分画における収率８％

【００５４】実
施例２４ 緩衝液：ｐＨ６．０とし、０．１Ｍグリシンを加えるほ
かは実施例１３の場合と同じ 結果：主分画における純度９４．３％；主分画における
収率７７％、第二分画における収率１３％

【００５５】
実施例２５ 表１に、インスリンの収率と純度を溶出液におけるｐＨ
および／または両性イオンの関数としてまとめる。

【００５６】

【表１】

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　水混和性有機溶媒を含有する水性の緩
   衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲル上でのクロマト
   グラフィーによるインスリンおよび／またはインスリン
   誘導体の精製方法において、両性イオンを緩衝溶媒中に
   溶解させるか、または溶媒混合物のｐＨを精製すべきイ
   ンスリンもしくはインスリン誘導体の等電点の近傍とし
   、両性イオンを存在させる方法。
2. 【請求項２】　　溶媒混合物のｐＨは精製すべきインス
   リンまたはインスリン誘導体の等電点から１ｐＨ単位下
   または上までとする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　溶媒混合物のｐＨは等電点から０．５
   ｐＨ単位下または上までとする請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】　　両性イオンとしてα−アミノ酸または
   ベタイン類を使用する請求項１〜３のいずれかに記載の
   方法。
5. 【請求項５】　　グリシン、グルタミン酸またはグリシ
   ンベタインを両性イオンとして使用する請求項４記載の
   方法。
6. 【請求項６】　　式Ｉ 【化１】 （式中Ｒ３０は、遺伝子でコードできるＬ−アミノ酸の
   残基であり、Ｘは、ヒドロキシル基、本来塩基性であっ
   て５０個までの炭素原子を有する生理的に許容される有
   機基、遺伝子でコードできるＬ−アミノ酸であって存在
   するその末端カルボキシル基は適宜遊離、エステル官能
   基、アミド官能基、ラクトンもしくはＣＨ２ＯＨに還元
   された形のＬ−アミノ酸であり、ｎは０〜１０の整数で
   あり、ｙは水素またはＬ−フェニルアラニンであり、Ａ
   およびＢ鎖は動物またはヒトインスリンの配列である）
   のインスリン誘導体を使用する請求項１〜５のいずれか
   に記載の方法。
7. 【請求項７】　　式Ｉにおいて、Ｒ３０はＬ−アラニン
   またはＬ−スレオニンであり、ＸはＬ−アルギニン、Ｌ
   −リジンまたはＬ−フェニルアラニンからなる群よりの
   Ｌ−アミノ酸１個または２個以上である請求項６記載の
   方法。
8. 【請求項８】　　分取高圧液体クロマトグラフィーシス
   テムを使用する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。