JPH04230699A - クロマトグラフィーによるインスリンの精製方法 - Google Patents
クロマトグラフィーによるインスリンの精製方法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
性、緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲル上でのク
ロマトグラフィーによるインスリンおよび/またはイン
スリン誘導体の精製方法に関し、水性、緩衝溶媒中には
両性イオンを溶解させることおよび/または溶媒のpH
を精製すべきインスリンもしくはインスリン誘導体の等
電点の近傍とすることを特徴とするものである。
油性に改質した(逆相)シリカゲル上での精製は、分析
的分離方法として知られていて、何年も前から高圧液体
クロマトグラフィー(HPLC)の形で使用して好結果
が得られている(WS Welinderら:J. C
hromatogr., 361, 357〜367,
1986)。分析のスケールでは、μgの範囲の蛋白
量が、改質シリカゲルを充填し、スチール、ガラスまた
はプラスチックで作られたカラム上に負荷され、ついで
流動液体混合物(通常は、一定のまたは変動する濃度で
有機溶媒を含有する酸性の、水性緩衝溶液)によって溶
出される。この場合負荷される蛋白質は、カラム容量1
mlあたり30μgよりもはるかに少ない。
る、比較的毒性の強い(アセトニトリル)溶媒や、腐蝕
性の、高価な緩衝成分たとえばテトラアルキルアンモニ
ウム塩、アルキルスルホネート、ヘキサフルオロアセト
ン、トリフルオロアセテートを使うことが多い(E.P
. Kroeffら、J. Chromatogr,
461, 45〜61, 1989)。これらの移動相
では、混合物にインスリン様物質がさらに強度に夾雜し
ている場合、品質、主要成分の収量および総回収率の点
で満足できる分取による分離を達成できない(J. R
iver,R. McClintock,J. Chr
omatogr,268,112〜119,1983;
Peterら、J. Chromatogr,408、
43〜52,1987)。
テル切断、酵素的ペプチド交換、結晶化による精製等か
らのインスリンは通常、類似の性質の付随物を含有する
。これらは、電荷の差が十分であればイオン交換クロマ
トグラフィーにより、特定のpH値を選ぶことによって
精製できる(米国特許第4 129 560号)。この
方法の欠点は、その希釈効果でしたがって沈殿の後処理
時における貴重な物質の上清中への喪失、比較的長いサ
イクル時間、または総回収率したがって収率が低いこと
である。
量を拡大することにより、原理的には分取による分離を
達成することは可能である。この場合に必要な有機溶媒
の量は、たとえば直径20cmを越えるカラムの場合、
m3の規模である。分析的HPLCに用いられる溶媒(
たとえば、アセトニトリル、DMF、メタノール、ジオ
キサン等)は毒性があるので、これらの方法を工業的な
分取規模で使用するためには、念入りな保護手段の準備
が要求される。
リン誘導体のクロマトグラフィーによる精製方法を開発
することであった。すなわち、インスリンの生物活性が
維持され、1回のクロマトグラフィー工程で高純度が達
成され、サイクル時間は短く、カラムは50クロマトグ
ラフィーサイクル以上の有効寿命、時間のかかる充填過
程を要しない固定シリカゲル相の再生および非毒性溶媒
の使用が達成され、したがって工業的分取規模を可能に
する方法である。
性緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲル上でのクロ
マトグラフィーにおいて、両性イオンを緩衝溶液中に溶
解させるか、または溶媒混合物のpHを精製すべきイン
スリンもしくはインスリン誘導体の等電点の近傍とし、
両性イオンを存在させる方法により、インスリンまたは
インスリン誘導体の精製が可能であることを発見したも
のである。
スリンもしくはインスリン誘導体の等電点の近傍におけ
る溶媒のpHで両性イオンの存在下でのクロマトグラフ
ィーは、驚くべきことに、所望の生成物と不純物の良好
な分離のみでなく、固定相(親油性に改質したシリカゲ
ル)からの蛋白質の良好な脱着をも生じる。この分離方
法はインスリン様成分が著しく夾雑してインスリン溶液
でも精製することを可能にし、たとえばインスリンまた
はインスリン誘導体からA21−デアミドインスリンを
分離することもできる。しかも、固相からの蛋白質の好
都合な脱着は、カラム充填剤が長い有効寿命をもつこと
と、インスリンの高い総収率の達成が可能になることを
意味する。
含有する水性、緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲ
ル上でのクロマトグラフィーによるインスリンおよび/
またはインスリン誘導体の精製方法において、両性イオ
ンを緩衝溶媒中に溶解させるか、または溶媒混合物のp
Hを精製すべきインスリンもしくはインスリン誘導体の
等電点の近傍とし、両性イオンを存在させる方法に関す
る。
たとえば動物もしくはヒト起源のあらゆる種のインスリ
ン、インスリン前駆体たとえばプロインスリンもしくは
プレプロインスリン、または遺伝子的に修飾した微生物
によって発現される組換えインスリンもしくはインスリ
ン誘導体を使用できる。さらに、たとえば化学的または
酵素的誘導化によって製造されたインスリン誘導体、た
とえばDe−Phe−B1−インスリン、インスリン−
β−ケテン−スルホネート、ジアルギニン−インスリン
(B31、B32)、モノアルギニン−インスリンまた
はジフェニルアラニン−インスリン(B31、B32)
(米国特許第4 601 852号)も使用できる。
化2】 で示される。式中、R30は遺伝子でコードできるL−
アミノ酸の残基であり、Xは、ヒドロキシル基、本来塩
基性であって50個までの炭素原子を有する生理的に許
容される有機基、遺伝子でコードできるL−アミノ酸で
あって存在するその末端カルボキシル基は適宜遊離、エ
ステル官能基、アミド官能基、ラクトンまたはCH2O
Hに還元された形のL−アミノ酸であり、nは0〜10
の整数であり、yは水素またはL−フェニルアラニンで
あり、AおよびB鎖は動物またはヒトインスリンの配列
である。
式Iにおいて、R30がL−アラニンまたはL−スレオ
ニンであり、XはL−アルギニン、L−リジンまたはL
−フェニルアラニンからなる群よりのL−アミノ酸1個
また2個以上のインスリン誘導体である。
較的不純な状態および精製前の形(たとえばゲルクロマ
トグラフィーによる)のいずれでも使用できる。結晶化
を何回も反復した後でも、またゲルクロマトグラフィー
後にも、インスリンはまだ、分子量がきわめて類似した
インスリン様の夾雜物を含んでいる。適当に選ばれたp
Hではそれらの電荷状態は互いにまたはインスリンと異
なるが、インスリンと複合体を形成する。このような物
質の例には、デアミノインスリン、アルギニン−および
ジアルギニン−インスリン、インスリンエチルエステル
等がある。
性マトリックスを表面上に付着させたシリカゲルを意味
する。疎水性マトリックスの例には、鎖長3〜20の炭
素原子をもつアルカンがある。親油性に改質されたシリ
カゲルのとくに好ましい例には以下の物質がある。
& Nagelによって供給されている。球形および
非球形物質、粒子径は45μmまで多様、孔径100Å
、C8−またはC18−改質。RLichroprep
:Merckによつて供給されている。球形および非球
形物質、粒子径は40μmまで多様、孔径60〜250
Å、C8〜C18−改質。
B:Merckによって供給されている。球状物質、
粒子径25μmまで、C8−改質。RWaters P
rep:C18−改質、50〜105μm非球状、孔径
100Å。
ntによって供給されている。C8−改質、10μm、
球状、孔径100Å。RKromasil:EKA N
obelによって供給されている。C4−、C8〜C1
8−改質、16μmまで、球状、孔径100、150ま
たは200Å。
消失させることができる化合物、すなわち酸性溶液にお
いては陽イオンを、アルカリ性溶液においては陰イオン
を形成する化合物で、たとえばα−アミノ酸、ベタイン
またはベタイン誘導体である。好ましい両性イオンは、
グリシン、グルタミンまたはベタイン(N,N,N−ト
リメチルグリシン)である。グリシンはとくに好ましい
。
点(IEP)は、溶解したインスリンの陽イオン性電荷
と陰イオン性電荷の数が0に等しくになるそのインスリ
ン溶液のpHである。たとえば、ブタインスリンのIE
PはpH5.3と5.4の間である(H. Neura
th, K. Bailey, Protein Ho
rmones, Vol.II/A,The Prot
eins, 636頁)。「等電点の近傍」の語は、と
くに、精製すべきインスリンのIEPの上下約1pH単
位のpH値を意味する。 とくに好ましいpH値はIEPの上下0.5pH単位ま
での値である。
るために、緩衝物質を含有させる。適当な緩衝物質は文
献に知られていて、たとえばリン酸塩、アルカリ金属も
しくはアルカリ土類金属塩たとえばクエン酸ナトリウム
または酢酸カリウム、クエン酸、酢酸、硫酸もしくは塩
化アンモニウムである。溶出液にはさらに、水混和性有
機溶媒たとえばアルコール類、ケトン類、酢酸メチル、
ジオキサン、ジメチルスルホキシドまたはアセトニトリ
ルが添加される。アルコールたとえばn−、iso−プ
ロパノール、メタノールもしくはエタノール、または酢
酸メチルが好ましい。
ましくは10〜60%、とくに好ましくは10〜35%
である。緩衝物質の濃度は、溶媒としての水に基づいて
1mmol/l〜2mmol/l、好ましくは25mm
ol/l〜1mmol/lである。両性イオンの濃度は
広範囲に変動させることができる。有利な量は、溶媒と
しての水に基づいて10mmol/l〜1mmol/l
、好ましくは20mmol/l〜500mmol/lで
ある。
0℃、好ましくは15〜30℃、とくに好ましくは15
〜20℃である。クロマトグラフィー時の操作圧は実質
的に一定とする。クロマトグラフィーは可変圧力で実施
できる。たとえばクロマトグラフィーは5〜400バー
ルの圧力下に、とくに20〜100バール下に行うこと
ができる。
ムへの負荷、クロマトグラフィーおよび溶出は、既知の
、慣用の工業的方法によって実施される。精製すべきイ
ンスリンの溶液のカラムへの負荷は、含アルコール水性
または純粋な水性緩衝溶液を用いて行うのが好ましい。 インスリン溶液の蛋白含量は1〜10%、好ましくは3
%である。
、緩衝物質の濃度を一定にして(アイソクラクティック
に)または緩衝液中の水混和性有機溶媒の含量を変化さ
せて行われる。有機溶媒の含量は、使用した有機溶媒の
濃度が溶出容量の関数として、とくに好ましくは直線関
数として増加するように変動させる。
スリンの除去は、亜鉛による沈殿または結晶化によって
行われる。これは、真空蒸留によって溶媒を溶液から実
質的に除去するか、またはその濃度を水で希釈して低下
させるかのいずれかによって可能になる。いずれにして
も、上清中の蛋白質含量を<50mg/lに保持するた
めに、沈殿または結晶化前の溶媒濃度は10%またはそ
れ以下にしなければならない。生成した純粋なインスリ
ンの沈殿は、傾瀉、遠心分離または濾過によって単純し
、乾燥することができる。
ーの場合のみでなく、分取クロマトグラフィー、とくに
本発明の方法を分取HPLCシステムで行う場合にも適
している。
な生成物の単なる分析ではなく、その取得の目的での精
製方法を意味する。純粋な生成物の量は広い限界内で、
たとえば1mg〜50kg、好ましくは50mg〜15
kgで変動させることができる。
に記述する。とくに指示のない限り、百分率のデータは
重量に関するものである。
ン、0.05Mクエン酸ナトリウム、pH5.5、純水
溶液緩衝液B:0.1M硫酸アンモニウム、0.1Mグ
リシン、0.05Mクエン酸ナトリウム、pH5.5、
水/n−プロパノール 1:1 吸着体:Nucleosil C18、15〜25μ
m球状、孔径100Å、Macherey & Nag
el(Dueren)より供給カラム寸法:40mm×
250mm ヒトインスリンB30−ジ−tertブチルエステル/
エーテルからトリフルオロ酢酸で切断して得られたヒト
インスリン(蛋白質含量79.1%)3.5gをカラム
に負荷する。インスリンは、適当な高圧ポンプを混合装
置とともに使用し、混合緩衝液AおよびBで、プロパノ
ール勾配14〜20%が生じるように溶出する。インス
リンは、46ml/分のポンプ作用下に、約17.5%
プロパノール、23分後に溶出される。
化および単離により、主分画中に蛋白質含量97%の生
成物が88.5%の収率で、第二分画中に蛋白質含量8
5.7%の生成物が7.5%の収率で得られる。したが
って、総回収率は最初のインスリンの96.0%である
。
ン、0.025Mクエン酸ナトリウム、pH5.5、純
水溶液 緩衝液B:0.05M硫酸アンモニウム、0.1Mグリ
シン、0.025Mクエン酸ナトリウム、pH5.5、
水/n−プロパノール 1:1 吸着体:Nucleosil C18−P、15〜2
5μm球状、孔径100Å、Macherey & N
agel 社より供給 カラム寸法:40mm×250
mm ヒトインスリンジ−tertブチルエステル/エーテル
のエステル切断からのヒトインスリン(HI)(蛋白質
含量86.1%)7.0gを0.1Mグリシン/HCl
緩衝液、pH2.8中3%濃度の溶液の形で、高圧ポン
プを用いて、カラムに負荷する。ついで、上述の緩衝液
で高圧下、n−プロパノール勾配で溶出を行う。プロパ
ノール濃度を14から17.5%に60分間を要して上
昇させる。上述したと同じ様式で分画化および結晶化を
行うと、蛋白質含量98.7%の生成物が得られる。精
製ヒトインスリンの収率は使用したインスリンの91%
である。
ン、0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、純水溶
液緩衝液B:0.05M硫酸アンモニウム、0.1Mグ
リシン、0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、水
/n−プロパノール 1:1 吸着剤:Lichrospher Select B、
C8、15〜25μm、孔径60Å、Merck社より
供給カラム寸法:50mm×250mm ブタインスリンのトリプシンによるアミド基交換からの
反応混合物10gを200mlの0.1Mグリシン/H
Cl緩衝液、pH2.8に溶解した溶液をカラムに負荷
する。個々の蛋白質成分は、流速40ml/分で120
分を要し、この間プロパノール濃度を14から30%に
上昇させると、分離して溶出される。結晶化または沈殿
および乾燥後に得られる主分画は、純度>97%のヒト
インスリンB30−ジ−tertブチルスレオニンエス
テル/エーテルであり、使用したインスリンに基づく収
率は93%である。
、0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、純水溶液
緩衝液B:0.05M塩化ナトリウム、0.1Mグリシ
ン、0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、水/n
−プロパノール 1:1 吸着剤:Zorbax Pro 10、C8、10μ
m、DuPont社より供給 カラム寸法:5cm×25cm ヒトインスリンB30−ジ−tertブチルスレオニン
エステル/エーテルの0.1Mグリシン/HCl溶液1
00ml中トリフルオロ酢酸による切断で得られたHI
7.5gをポンプでカラム上に送り、80ml/分の
流速で溶出させた。緩衝液Bの濃度を60分間を要して
18から25%に上昇させた。この場合の保持時間(R
T)は約37分であった。最初のHIの96.8%が主
分画から、結晶化および乾燥後に、>97%の純度で単
離され、第二の分画は純度<50%のHI 2.2%を
含有した。
、0.03M酢酸アンモニウム、pH5.5、10%酢
酸メチル 緩衝液B:0.05M硫酸ナトリウム、0.1Mグリシ
ン、0.03M酢酸アンモニウム、pH5.5、20%
酢酸メチル 吸着剤:Kromasil C8、13μm、孔径1
00Å、EKANobel社により供給 カラム寸法:5cm×25cm カラム容量1lあたりウシインスリン8gを、30%緩
衝液Bで平衡化したカラムに、0.1Mグリシン/HC
l緩衝液の補助により適用した。緩衝液Bの濃度を、9
0分を要して80%(=18%酢酸メチル)まで上昇さ
せた。ウシインスリンは65分後に主画分中に>97.
5%の純度で溶出し(収率63.5%)、水で希釈後、
塩化亜鉛で沈殿させた。総回収率は92.5%であった
。
ン、0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、5%n
−プロパノール 緩衝液B:0.05M硫酸アンモニウム、0.1Mグリ
シン、0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、水/
n−プロパノール 1:1 吸着剤:Kromasil C8、13μm、孔径1
00Å、EKANobel社により供給 カラム寸法:5cm×25cm ヒトインスリンB30−ジ−tertブチルスレオニン
エステル/エーテルのトリフルオロ酢酸による切断から
のヒトインスリン(純度約92%)4g(=8g/l)
を、カラムに負荷した。90分を要して18から25%
への緩衝液Bの勾配を流すと、ヒトインスリンは45分
後に主分画中に>97%の純度で(収率91.8%)、
第二の分画中に80.5%の純度で(収率4.7%)溶
出した。
ン、0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、10%
n−プロパノール 緩衝液B:0.05M硫酸アンモニウム、0.1Mグリ
シン、0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、水/
n−プロパノール 1:1 吸着剤:Kromasil C8、13μm、孔径1
00Å、EKANobel社により供給 カラム寸法:10cm×40cm 18gのブタインスリンを、5%n−プロパノール含有
0.1Mグリシン/HCl緩衝液、pH3.0、1.8
l中、カラムに導入した。勾配は、70分で9%緩衝液
B(=13.6%n−プロパノール)から11%緩衝液
B(=14.4%n−プロパノール)に変化させた。ブ
タインスリンは50分後に、主分画中、蛋白質含量>9
8%で溶出した(収率89%)。総回収率は初期量の9
6.8%であった。
ン、0.025Mクエン酸ナトリウム、5%n−プロパ
ノール、pH5.5 緩衝液B:緩衝液Aと同じ、ただし50%n−プロパノ
ールを添加 吸着剤:Kromasil C8、13μm、孔径1
00Å、EKA Nobel社(スェーデン)により供
給カラム寸法:50mm×250mm 遺伝子操作で得られたヒトインスリン(蛋白質含量89
.5%)4gを、0.1Mグリシン緩衝液、pH3.0
中に2%蛋白質溶液として溶解し、高圧ポンプでカラム
上に負荷する。溶出は、流速80ml/分で70分かけ
て、13%から16%n−プロパノールの直線勾配によ
って行う。分画化および結晶化により、主分画中に蛋白
質含量98%のヒトインスリンが93%の収率で得られ
る。 総回収率は初期量に対して98%である。
ン、0.025Mクエン酸アンモニウム、5%エタノー
ル、pH5.5 緩衝液B:緩衝液Aと同じ、ただし50%エタノールを
添加 吸着剤:Kromasil C8、10μm、孔径1
00Å、EKA Nobel社(スェーデン)により供
給カラム寸法:50mm×250mm 遺伝子操作で得られたヒトインスリン(蛋白質含量86
.2%)4.5gを250mlのグリシン緩衝液、pH
3.0に溶解し、ついでカラム上にポンプで負荷する。 蛋白質は、2個の高圧ポンプを用い2種の緩衝液AとB
から直線勾配を生成させて、クロマトグラフィーに付す
。溶出は、100分後、エタノール濃度33%、一定流
速80ml/分で起こる。分画化および結晶化により、
主分画中、蛋白質含量96%のヒトインスリンが得られ
る。総回収率は初期物質に対して93%である。
ン、0.025Mクエン酸ナトリウム、10%酢酸メチ
ル、pH5.5 緩衝液B:緩衝液Aと同じ塩濃度、ただし20%酢酸メ
チル 吸着剤:Kromasil C8、10μm、孔径1
00Å、EKA Nobel社(スェーデン)により供
給遺伝子操作によるインスリンの後処理から誘導された
粗製ヒトインスリン4.6gを200mlの水性グリシ
ン緩衝液に溶解し、ついで50×250mmのクロマト
グラフィー用HPLCカラム上にポンプで負荷する。カ
ラム材料は、2個の高圧ポンプを用い、緩衝液AとBを
混合することにより酢酸メチル濃度13%に予め平衡化
する。 負荷後、ヒトインスリンは、90分を要して酢酸メチル
13%から17%の直線勾配によって溶出する。主生成
物は溶出溶液から結晶化によって単離される。これによ
り蛋白質含量96%のヒトインスリン3.8gが得られ
る。出発原料に基づく総回収率はこの場合、90%であ
る。
ン、0.05Mクエン酸、水酸化ナトリウム溶液により
pH5.5(純水溶液) 緩衝液B:0.1M硫酸アンモニウム、0.1Mベタイ
ン、0.05Mクエン酸、水酸化ナトリウム溶液により
pH5.5(水/イソプロパノール 1:1)吸着剤:
Nucleosil C18、15〜25μm球状、
100Å カラム:40mm×250mm 流速:45ml/分 ヒトインスリンジ−tertブチルエステル/エーテル
のエステル切断からのヒトインスリン3g(蛋白質含量
79%)を0.1Mベタイン/HCl緩衝液、pH3.
0中3%濃度の溶液の形で、高圧ポンプを用いてカラム
に負荷した。ついで、上述の緩衝液系により44%緩衝
液Bでのアイソクラティックな溶出を行った。保持時間
は約35分であった。分画化により、主分画中に98.
1%のヒトインスリンが80.5%の収率で得られた。 総回収率は90.5%であった。
ミン酸、0.05Mクエン酸、水酸化ナトリウム溶液で
pH5.5(純水溶液) 緩衝液B:0.1M硫酸アンモニウム、0.1Mグルタ
ミン酸、0.05Mクエン酸、水酸化ナトリウム溶液で
pH5.5(水/n−プロパノール 1:1)吸着剤:
Nucleosil C18−P、15〜25μm球
状、100Å カラム:50mm×250mm 流速:60ml/分 ヒトインスリンジ−tertブチルエステル/エーテル
のエステル切断からのヒトインスリン6g(蛋白質含量
73%)を、0.1M酢酸、pH3.0中3%濃度の溶
液の形で、高圧ポンプを用いてカラムに負荷した。つい
で、上述の緩衝液系を用い、緩衝液B 25%〜28%
の勾配で溶出を行った。保持時間は約25分であった。 分画化により、主分画中に98.6%のヒトインスリン
が65%の収率で得られた。総回収率は88.5%であ
った。
リエチルアミン、硫酸でpH6.5(純水溶液)緩衝液
B:0.08M硫酸アンモニウム、0.05Mトリエチ
ルアミン、硫酸でpH6.5(水/n−プロパノール
1:1) 吸着剤:Nucleosil C18−P、15〜2
5μm球状、100Å カラム:50mm×250mm 流速:60ml/分 ヒトインスリンジ−tertブチルスレオニンエステル
/エーテルのトリフルオロ酢酸による切断からのヒトイ
ンスリン5gを、3%濃度の溶液としてカラムに負荷し
、ついで緩衝液B 32〜42%の間で溶出した。保持
時間は40分であった。分画化および結晶化により、主
分画中に純度92.7%の生成物72%が得られた。総
回収率は初期量の76%であった。
ム、塩酸でpH2.5、純水溶液 緩衝液B:0.1Mクエン酸、0.1M硫酸アンモニウ
ム、塩酸でpH2.5、水/n−プロパノール 1:1
吸着剤:Nucleosil C18、Macher
ey & Nagel 社により供給 カラム:40×250mm 流速:45ml/分 ヒトインスリンジ−tertブチルスレオニンエステル
/エーテルのトリフルオロ酢酸による切断からのヒトイ
ンスリン3gを、0.1Mグリシン緩衝液、pH3.0
中濃度の溶液の形でカラムに負荷し、ついで緩衝液B3
4〜35%の間で溶出した。分画化し、結晶化し、乾燥
すると、主分画中に初期量の57%が純度94.8%で
、第二の分画中に16%が純度84%で単離された。
ム、塩酸でpH3.5、純水溶液 緩衝液B:0.1Mクエン酸、0.1M硫酸アンモニウ
ム、塩酸でpH3.5、水/n−プロパノール 1:1
吸着剤:Nucleosil C18、Macher
ey & Nagel 社により供給 カラム:40×250mm 流速:45ml/分 実施例14の場合と同様にカラムに負荷した。保持時間
は約40分であった。分画化、結晶化および乾燥により
、主分画中に使用した初期ヒトインスリンの51%が純
度97.5%で、第二の分画中に4%が純度68%で得
られた。
.1M塩化アンモニウム、塩酸でpH8.5、純水溶液
緩衝液B:0.1M tris、0.1Mグリシン、0
.1M塩化アンモニウム、塩酸でpH8.5、水/n−
プロパノール 1:1 吸着剤:Kromasil C8、13μm、100
Åカラム:50mm×250mm 流速:60ml/分 カラムを33%緩衝液Bで平衡化し、トリフルオロ酢酸
による切断からのヒトインスリン(実施例14参照)6
gを0.1M tris緩衝液、pH8.5中3%濃度
の溶液の形で負荷した。溶出は約35分後に起こった。 主分画は、分画化および結晶化後、純粋なヒトインスリ
ン96.6%を含有した(収率86%)。総回収率は9
5%であった。
エン酸、アンモニアでpH5.5、n−プロパノール5
容量% 緩衝液B:0.1M塩化アンモニウム、0.025Mク
エン酸、アンモニアでpH5.5、n−プロパノール5
0容量% 吸着剤:Kromasil C8、13μm、100
Åカラム:50mm×250mm 流速:60ml/分 トリフルオロ酢酸による切断からのヒトインスリン(実
施例14参照)6gを既述のようにしてカラムに負荷し
た。インスリンは、60分間での緩衝液B 21%から
25%の勾配内に保持時間40分で溶出した。主分画は
初期生成物91%を純度97.5%で含有した。総回収
率は96%であった。
酸、水酸化カリウム溶液でpH5.5、5容量%n−プ
ロパノール 緩衝液B:0.1M塩化カリウム、0.025Mクエン
酸、水酸化カリウム溶液でpH5.5、50容量%n−
プロパノール 吸着剤:Kromasil C8、13μm、100
Åカラム:50mm×250mm 流速:60ml/分 負荷と勾配は実施例17と同様にした。溶出は35分後
に起こった。主分画は、初期量の90%のヒトインスリ
ンを純度96.5%で含有した。総回収率は93%であ
った。
例14の場合と同じ条件下に実施した。緩衝液と両性イ
オンの量のみを変えた。
エチルアミン、硫酸でpH7.0 緩衝液B:0.08M硫酸アンモニウム、0.05Mト
リエチルアミン、硫酸でpH7.0 結果:主分画の純度95.2%、主分画における収率6
7%。
と同じ。結果:主分画の純度96.1%;主分画におけ
る収率65%、第二分画における収率25%
】実施例21 緩衝液は実施例15の緩衝液に0.1Mグリシンを添加
結果:主分画における純度96%;主分画における収率
66%、第二分画における収率6%
エン酸、アンモニアでpH4.5、5容量%n−プロパ
ノール、0.1Mグリシンベタイン 緩衝液B:50%n−プロパノールを添加するほかは緩
衝液Aと同じ 結果:主分画における純度98.1%;主分画における
収率88%、第二分画における収率6%
施例23 pH5.4とし、グリシンベタインを0.1%グリシン
に変えるほかは実施例22と同じ緩衝液 結果:主分画における純度97.9%;主分画における
収率92%、第二分画における収率8%
施例24 緩衝液:pH6.0とし、0.1Mグリシンを加えるほ
かは実施例13の場合と同じ 結果:主分画における純度94.3%;主分画における
収率77%、第二分画における収率13%
実施例25 表1に、インスリンの収率と純度を溶出液におけるpH
および/または両性イオンの関数としてまとめる。
Claims (8)
- 【請求項1】 水混和性有機溶媒を含有する水性の緩
衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲル上でのクロマト
グラフィーによるインスリンおよび/またはインスリン
誘導体の精製方法において、両性イオンを緩衝溶媒中に
溶解させるか、または溶媒混合物のpHを精製すべきイ
ンスリンもしくはインスリン誘導体の等電点の近傍とし
、両性イオンを存在させる方法。 - 【請求項2】 溶媒混合物のpHは精製すべきインス
リンまたはインスリン誘導体の等電点から1pH単位下
または上までとする請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 溶媒混合物のpHは等電点から0.5
pH単位下または上までとする請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 両性イオンとしてα−アミノ酸または
ベタイン類を使用する請求項1〜3のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項5】 グリシン、グルタミン酸またはグリシ
ンベタインを両性イオンとして使用する請求項4記載の
方法。 - 【請求項6】 式I 【化1】 (式中R30は、遺伝子でコードできるL−アミノ酸の
残基であり、Xは、ヒドロキシル基、本来塩基性であっ
て50個までの炭素原子を有する生理的に許容される有
機基、遺伝子でコードできるL−アミノ酸であって存在
するその末端カルボキシル基は適宜遊離、エステル官能
基、アミド官能基、ラクトンもしくはCH2OHに還元
された形のL−アミノ酸であり、nは0〜10の整数で
あり、yは水素またはL−フェニルアラニンであり、A
およびB鎖は動物またはヒトインスリンの配列である)
のインスリン誘導体を使用する請求項1〜5のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項7】 式Iにおいて、R30はL−アラニン
またはL−スレオニンであり、XはL−アルギニン、L
−リジンまたはL−フェニルアラニンからなる群よりの
L−アミノ酸1個または2個以上である請求項6記載の
方法。 - 【請求項8】 分取高圧液体クロマトグラフィーシス
テムを使用する請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
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