JPS6036420A - ヒトのがん細胞に対するヒト腫瘍壊死因子およびヒト・インタ−フエロンの作用および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 背　景 ＴＮＦ 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の歴史は、１世紀以上前に、ヒ
トがある種の細菌感染を受けた際に、ｉｎ　ｖｌｖｏ　
に存在するいくつかのヒト腫瘍も同゛　時に退行するこ
とを発見した時点からはじｔＲ０４０年間以上にわたり
、Ｏｏｌ＠ｙその他の人は細菌細胞を含まない消液また
は混合細菌ワクチンによってヒトの悪性腫瘍を処置し、
しばしば良好な成績を得た。

研究は、モルモットおよびマウスで同じように実施され
た。実験動物における抗腫瘍効果は、被験体すなわち動
物に細菌を投与してから４時間以内に現れる腫瘍の中心
における激しい出血性反応として認められる。それに続
いて比較的遅い壊死形成効果が生じるが、それはその後
４８時間はその程度が次第に激しくなる。腫瘍塊は色が
次第に黒ずみ、壊死と出血の存在を示し、多くの場合に
腫瘍は完全に退行する。ある種の実験的１１１４Ｎにお
いてグラム陰性細菌によるか、あるいはその細胞壁から
誘導された内毒素（リポＩリサツカライド）によって誘
発されるこの顕著な出血性壊死は、長いあいだ前述の臨
床的観察に対応する実験的事実であると考えられていた
。

しかしながら、５ｌｏｎ　−Ｋｅｔｔｅｒｌｎｇ　（研
究所）における研究によって次のように結論されるに到
った。すなわち細菌の刺激によって、おそらく大食細胞
に由来するとみられるある種の因子が遊離され、こめ因
子自体が直接または間接に腫瘍細胞を殺す能力を持って
いるとされた。この結論は、内毒素（ニドキシン）′ｆ
：注射されたＢＯＧ感染マウスの血清によって、Ｍ＠ｔ
ｈ　Ａ移植肉腫やその他の腫瘍に出血性壊死が生じると
いう研究成績によって証明された。ＢＯＧを注射された
マウスの血清あるいは内毒素を投与された正常なマウス
の血清には効果はない。内毒素自体は、１１　ｖｌｔｒ
ｏではほとんどの腫瘍細胞に対し母性を示さない。仁の
活性のある血清成分は腫ｍ壊死因子（ＴＮＦ）と呼ばれ
ている。

ＴＮＦの活性は、発熱性、Ｌｉｍｕｌｕｓ　（カブトガ
ニ）テスト（パイロジエンの試論法）、内毒素部分に対
する化学分析などによって測定されるＴＮＦ中に残存す
る内毒素によるものではありえない。内毒素とはことな
、り、ＴＮＦはｊｎｖｉｔｒｏである種の腫瘍細胞に対
して直接の細胞毒性をもっているが、正常な出発材料か
ら培養された細胞はそれによって損傷を受けることはな
い［Ｌｌｏｙｄ　Ｊ、　０１ｄ＋　Ｎ＠ｗ　Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍ＠ｎｔ　１ｎＯａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ＋　
ＭＳＫ’　００　０１１ｎｌｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　
６２１１Ｂ　（１９７６）、　Ｅ、Ａ、０ａｒｓｖｅｌ
ｌら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　’　１．　Ａｃａｄ、　８
ｅｉ、　ＵＳＡ　７２３６６６〜７０５ｅｐｔ　１！１
１７５）。その他の罰歯動物、すなわちラットやウサギ
なども、内毒素とともにＢ　ＯＧを投与されると、同じ
ようにＴＮＦを産生ずる。ＴＮＦは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　Ｏａｌｍｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　（Ｂ　ＯＧ　）
によって初めて抗原刺激を受け、２〜３週間後に大腸菌
からの内毒素によって誘発刺激されたマウスの血清のな
かにはじめて発見された。ＢＯＧないしそれと同等のも
の（下記）も、あるいは内毒素単独でも、マウスの血ｉ
’７のなかにＴＮＦ因子を産生させず、この両者が存在
することがその産生に必要である。大食細胞や細網内皮
系のその他の細胞要素の顕著な過形成を、ＢＯＧと同じ
ように誘発するＣｌｇｒａｎｕ”　１１０１ｕ　＋　Ｏ
−Ｐａｒｖｕｍ　＊　マラリア（原虫）またはザイモサ
ン（酵母細胞壁）なども、ＴＮＦを遊離させるためにマ
ウスを抗原＊Ｊａする場合にＢＣＧの代用とな９うる。

これらの因子はＢＯＧと同等のものである。ＢＯＧおよ
び内協素処置のあとで調製された血清は、完全に凝塊を
形成しない点で非定型的である。マウスにおけるＴＮＦ
の最適産生条件および測定法についての実験記録（プ目
トコール）は次のようである： ａ）ＢＯＧ：細網内皮系（ＲＢ８）に最大の刺激を与え
、過形成をおこさせるには、２×１０１個の生育可能の
ＢＯＧ菌体を接種材料とする、 ｂ）内毒素＝１４〜２１日後に、ＢＯＧにょるＲＥＳ刺
激が最高に達している時点で内毒素（大腸菌からのりボ
ポリサッヵライドＷ）０．２５〜２５μｇを接種する。

最大の用量を投与した場合に、マウスでのＴＮＦ濃度は
最大となる、 ｃ）ＴＮＦ回収を 最適時間は内毒素投与よｔ）２時間後である（それ以後
になると、ショックによって循１ｆ、ｌ虚脱が生じるた
め効率が低下する）、ｄ）ＴＮＦ検定： １）　ｉｎ　ｖｌｖｏ　： （＋’１ＡＬｂ／’ｅＸＯ５７ＢＬ／６）ハイブリッド
に杉植されたＴＩＡ、Ｌｂ　／　ａ　Ｍｏｔｈ　Ａ腹水
肉腫に対する’ｌ’　Ｎ　Ｆ　ｌｉ＋１性マウス血清の
壊死形成作用は次のような方法で明らかにされる。７日
後にｉｎ　ｖｌｖ。

での皮下移植腫瘍に対するＴＮＦ陽性血清の効果を肉眼
によ９２４時間にわたって採点する。

反応は３〜４時間ではじめて認められる。−７日後の移
植片（がんの）では、一般に壊死反応は、約ｏ１ｍｌか
らｏ、　ｓ　ｍｌまでの投与されたＴＮＦ陽性血清１ｄ
に比例する。十＋十反応は、−見生存可能のようにみえ
る腫瘍組織の周縁部のみを残して、腫瘍塊が完全ないし
ほとんど完全に破壊されたことを示１−ている。６日後
の移植片の反応はよシ弱く、５日後の移植片では全く反
応はみられない。

２）　ｉｎ　ｖｉｔｒ。

ＴＮＦ感受性のＩＩ−Ｍ、？！１１胞は、Ａ、ｍｅｒｌ
ｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　０ｏｌｌｅｅｔｉｏ
ｎ　（アメリカ標べへ培養収集；　ＡＴＯＯ）のクロー
ンマウス　Ｌ９２９細胞から誘導された。Ｌ細胞の’ｒ
　Ｎ　Ｆ耐性系統は、ＴＮＦ感受性り細胞をＴ　Ｎ　Ｆ
を含有する培地で反復継代接種することによって誘導さ
れた。

ＴＮＦは、ＴＮＦ感受性り細胞ＣＬ　（Ｓ）　）に対し
て細胞毒性を示すが、ＴＮＦ耐性■、細胞〔■、（６）
〕に対してはそれを示さない。

測定は、各測定孔にＩ；；ａｇｌｅの最低必須培地ｏ、
　ｓ　ｍｌ　を加え、それにトリプシン処理をした５０
．０００個のＬ細胞を接ｆ３１　Ｌ　、その２〜３時間
後に測定孔（２４孔０ｏｓｔｏｒ板）に、ＴＮＦの逐次
希釈液を含む培地ｏ、　ｓ　ｍｌを加え、４８時間後に
位相差顕微鏡またはトリノξンブリュー排除法によって
細胞死滅を推定し、５０％死滅が起こりたたんば＜　ｊ
ｔを決定することで実施した。たとえば、一つの標準仕
込に対して、Ｉｎ　マｉｔｒ。

で部分的に精製されたマウスＴＮＦＩ単位は、たんば（
５８ｎｇまたは２０．０００単位／たんば＜　ｎｇの比
活性に等しい。この部分的に精製されたマウスＴＮＦに
は、ＩＦＮは含まれていない。イ１゛！製前の元の血清
には、若干のインターフェロン（ＩＦＮ）が含まれてい
る。

ＢＯＧ以外に、Ｏ，ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ＋　Ｏ，Ｐａ
ｒｖｕｍ＋マラリア原虫またはサイモザン（酵母細胞壁
）なども、感作剤として使用できる。Ｇｒｅｅｎ　ら［
：Ｊ、　Ｎａｔ’１．　Ｃａｎｃ＠ｒ　Ｉｎａｔ、５９
　：　１５１９（１９７７）］は、マウスはＯ，Ｐａｒ
ｖｕｍ注射後６日注射後６素目対して最高の過敏性を示
すと報告している。

その方法では、内毒素投与はＯ，Ｐａｒｖｕｍ投与から
４日後に開始されている。内氾素用散は０．２５μｇと
いう少社であるが、ＴＮＦ遊離を誘発させるために２５
μｇが使用されている。内毒素１μｇを静注したあと、
９０分後にＴＮＦ遊離は最大となる。ＴＮＦ産生敏はマ
ウスの株によって変化する。

大腸菌のようなグラム陰性菌から得られた内参素は、１
ｎｖ１マＯでＴＮＦを遊離させるのに、これまでに見出
され迄最も効果的な薬剤である。

（Ｏｒ、ｒａｖｒｅｌｌら、前記、）ＴＮＦの効果は各
種の腫瘍（マウス）系において認められている。すなわ
ち、肉腫８−１８０（ＯＤ−１スイス）、ＢＦ２　（０
３）（）ｉ白血病ＥＬ４（０５７Ｂ１／６　）、ＡＳＬ
Ｉ　（Ａ株）、ＲＡＤＡ−１（Ａ株）、ＲＬＯ１（ＢＡ
ＬＢ／ｅ　）、肥満細胞腫ｐｓ　ｌｓ　（ＤＢＡ／２．
）などである。腫瘍（細胞）がｉｎマｉｖｏ測定の場合
のように皮内に注射される場合には、Ｍ＠ｔｈＡはＴＮ
Ｆに対して高い感受性を示す。反応がもっと弱い腫瘍も
報告されている。すなわち、細網細胞肉腫几０ＳＳ（Ｓ
ＪＬ）は耐性を示し、Ｆ１乳腺腫瘍（０３Ｈ／　Ａｎ　
Ｘ　１　）はきわめてわずかな反応を示すだけであυ、
ＡＫ几特発性白血病は中程度の感受性を示した。したが
って、マウスのＴＮＦは、マウス腫瘍に対して明らかな
治療効果をもっている（　Ｏａｒｓｗｅｌｌら、前記）
。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、培養基中の変換ネズミ線維芽細
胞（Ｌ細胞）は、ＭｅｔｈＡ　肉腫細胞またはマウス胎
児ＰＪｍ芽細胞（ＭＢＦ）と比較して最も強い感受性を
示した。ＴＮＦ曝露よ９４８時間後に生存可能の細胞を
計数する。この場合、その効果は細胞毒性的あると同時
に細胞増殖抑制的でもあるが、最初の１６時間以内では
効果が認められないので遅効性である。Ｍ＠ｔｈＡのｉ
ｎ　ｖｌｖｏテストでの効果は、懐死プロセス（変化）
であり、それはＭ＠ｔｈＡ腫瘍の中心ではじまり、次第
に外側へ拡大するが、周辺に変化を受けていないように
みえる腫瘍組織を残す。次に昨瘍はこの残存部からふた
たび成長を開始することがありうる。最適用量のＴＮＦ
で処置したＪ、＋３合には、処置された動物の完全退行
の割合は良好である。Ｌ細胞効果に基づいて一堕ｖ１票
測定が実施される（前記）。ＴＮＦを含む培地中でＴＮ
Ｆ感受性り細胞を反復継代接種法で誘導することにより
、Ｌ細胞の耐性系統も育成された。ＴＮＦは感受性Ｌ　
ＩＩＩ胞（Ｌ　（８）　〕に対して細胞毒性を示すが、
耐性り細胞〔Ｌ（６）〕に対しては毒性を示さない。こ
れらの検定法は、ｈＴＮＦの検定にも使用される（後記
）。

これまでの所見から、間接的にマウスやウサギにおいて
は大食細胞がＴＮＦの一つの細胞性の出発材料であるこ
とが示唆される。というのは、肝や牌の大食細胞は、Ｂ
ＯＧ（ないしそれと同等のもの）および内毒素の作用に
よって顕著な過形成を示すからである。

要約すると、１）ＴＮＦ遊なのための感作剤は大食細胞
に顕著な過形成をひき起こす、２）牌の大食細胞の選択
的溶解は、ＢＯＧ感作マウスに内毒素を注射したあとま
もなく認められる、３）ＴＮＦを含む血清は、ライリゾ
ーム由来の酵素を多量に含んでおり、活性化された大食
細胞はその種の２イリゾームを多量に含んでいることが
特徴である。

マウス組織球腫のクローン系統（Ｊ７７４およびＰＵ５
−１．８）はＴＮＦを不質的に産生するが、その産生量
は内毒素に曝露されたあと著しく増加する（　ｍａｎｎ
ｅｌら（１９８０）　Ｉｎｔ＠ｅｔ。

Ｉｍｍｕｎ、３０．５２３〜５３０．およびＷｉｌｌｉ
ａｍｓｏｎら未発表〕。

血清から分離されたので、マウスＴＮＦは糖たんばくで
あり、４〜６万の分子量と１５万の分子量の、少なくと
も２種の形態で存在する（　ｍａｎｎａｌら（１９８０
）　Ｉｎｔａｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　２８　。

２０４〜２１１　；Ｋｕｌｌら（１９８１）　Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ。

１２６　、１２７９〜８３１Ｈａｒａｎａｋａ＋　Ｋ、
ら、（１９８１）Ｊｐｎ　Ｊ＊　Ｗｘｐ、　Ｍａｄ、、
　５１　＋　１９１〜１９４　；Ｇｒｅ＠ｎ。

Ｓ、ら（１９７６）　Ｆｒｅｅ、　Ｎａｔ’１．　Ａａ
ａｄ、　８ｃｉ、　ＵＳＡ７３．３８１〜３８５および
未発表〕。ＴＮＦは、凍結させ、特に−７ＯＣ以下に保
っておくと安定である。その活性は、７０Ｃ３０分間で
破壊される０それは、５〜５００μｇ／　ｋ！’の範囲
でウサギに対し発熱作用を示し、５μｇ　／ｋｆのレベ
ルでは発熱性はもたない。ウサギＴＮＦは約３９〜６８
キロダルトンの分子黛範囲をもって報告されている（　
Ｒｕｔｔ　、　Ｍ、　Ｒｏら（１９８０，）Ｊ。

Ｉｍｍｕｔ＋ｏｌ、１２５．　１６７１〜１６７７；Ｍ
ａｔｔｈｅｖｓ。

Ｎ、ら（１９８０）　Ｂｒ、　Ｊ、　０ａｎｏｏｒ　４
２　４１６〜４２２；　Ｍａｔｔｈｅｖｓ　＋　Ｎ、ら
（１９７８）　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ３Ｂ　＋　
３０２〜３０９１０ｓｔｒｏｖｅ　＋　Ｊ、　Ｍ、ら（
１９７９）Ｐｒｏｃ、　Ｓｅｅ、　ＥＸｐ、　Ｂ１０１
．　Ｍａｄ、１６０　、　３５４〜３５８〕。

インターフェロン たんばく性のインターフェロンは、先行するウィルス感
染の結果として、宿主動物によって産生される。産生さ
れた宿主のインターフェロンは、その後のウィルス感染
からその動物を保護する。ＩＦＮは免疫調節系において
重要な役割を果すことが明らかにされている。インター
フェロンは次に示すような機能を果すことが明らかにさ
れた。すなわちそれは細胞***、腫瘍発育、抗体形成、
赤血球系の分化、脂肪細胞の分化などを抑制するが、一
方で大食細胞の食作用、リンフ９球毒性、ＮＫ（ナチュ
ラルキラー）細胞活性、細胞表面抗原表現、抗体産生な
どを亢進させる。最近、インターフェロン（Ｉ　ＦＮ）
も抗がん剤になシうることが発見された。

インターフェロンにはα、β、γ型の３種の基本形態が
あり、その抗原的性質と生化学的性質によって分類され
る。α型は白血球すなわち白色血液細胞によって分泌さ
れ、β型は線維芽細胞によって分泌され、これらはいず
れもウィルスによって誘発されうる。ｒ−ＩＦＮはリン
パ球様細胞によって分泌され”免疫性”インターフェロ
ンとして知られている（　Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｗ。

Ｅ、ＩＩら、Ｎａｔｕｒｅ　２８６．１１０（１９８０
）］。

抗原性の大きな相違点が、これらのＩＦＨ種の僧別のた
めに主として利用されている。さらに、ＩＦＮは多数の
生物学的や物理化学的な性質においても相違がみられる
。ヒトのαおよびβ型のＩＦＮが精製され、そのアミノ
酸配列が部分的に直接アミノ酸配列決定法によって決定
され（Ｋｎｉｇｈｔ、　Ｅ、　Ｊｒ、ら、５ｃｉｅｎｃ
ｅ　２０７　、　５２５〜５２６　（１９８０）　；　
Ｚｏｏｎ、　Ｋ、　Ｏ，、５ｃｉｅｎｃｅ　２０７　ｒ
５２７〜５２８（１９８０）’）、またよシ完全にクロ
ーン袖体ＤＮＡ配列分析によって決定された（　Ｍａｎ
ｔｅｌ、　Ｎ、ら、Ｇｏｎｅ　１０，１〜１０（１９８
０）；　Ｔａｎｉｇｕｃｈｌ＋　Ｔ、ら、Ｇｏｎｅ　１
０　、　１１〜１５（１９８０））。クローンα−ＩＮ
Ｆおよびβ−ＩＮＦ　ＤＮＡ　配列を比較することによ
って、アミノ酸し４ルでの２種のＩＦＨのあいだには、
２９％の相同性しかないことが明らかにされた（　Ｔａ
ｎ１ｇｕｃｈｌ＋　Ｔ、）　Ｍａｎｔａｌ＋　Ｎ、ら、
Ｎａｔｕｒ＠２８５．５４７−５４９（１９８０））。

３種類のＩＦＮの主要型のそれぞれには、異質性の程度
がよシ少ない分子亜種が存在する可能性がある。ヒトα
−ＩＦＮの数種の亜種がこれまでにクローンＤＮＡ配列
を比較することによって認められている（　Ｎａｇａｔ
ａ、　Ｓ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　２８７　４０ｉ　〜４０
８（１９８０））。

ｒ−ＩＦＨに関して入手できる情報は、はるかに少ない
。このＩＦＮはマイトジェン（有糸***誘発因子）に曝
露されたリンパ球培養の上清液中に通常見出されるが−
マイトジエンとは感作細胞の培養中に存在する各種のレ
クチンまたは特異的抗原のようなものである。ｒ−Ｉ　
ＦＮは、主として次に示す判定規ＱＩＳに基づいて決定
されている。すなわち（１）α−ＩＦＮやβ−ＩＦＮと
はことなり、ｒ−ＩＦＮの生物学的活性は、ｐｎ　２に
なるとほとんど破懐され、（１１）α型やβ型のＴ　Ｆ
　Ｎに対してＧ１，１製された抗血清は、γ−ＩＦＮと
は交差反応しない。なおまた、比較的純度の低いγ−Ｉ
ＦＮ製剤を使用して実施された実ｒ５′！成と、＋１は
、生物学的にみてさまざまな違いがあることを示唆して
いる。たとえば、ｒ−ＩＦＮの抗ウイルス状態を誘発す
る速度は、α−ＩＦＮまたはβ−ＩＦＮよυはるかに遅
いことが明らかにされた［　Ｄｌａｎｚａｎｌ＋　Ｆ、
ら、Ｎａｔｕｒｅ２８３．４００〜４０２（１９８０）
）。それに反して、ｒ−ＩＦＮの細胞成長抑制剤や抗腫
瘍剤としての作用ははるかに強いようである（　Ｃｒａ
ｎｅ、　Ｊ。

Ｌ、Ｊｒ、ら、Ｊ、　Ｎａｔ、　０ａｎｅｅｒ　Ｉｎ＠
ｔｌ、　６１　８７１〜８７４（１９７３）、Ｇｕｐｔ
ａら、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔ’ｌ　。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、７６　、４８
１７　（１９７９）　。

Ｂｌａｌｏｃｋらｓ　０ｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ　４９　＋　３９０〜３９４（１９８０））。

がん治療に対するＩＮＦの臨床試験は、製造量が不十分
であったので、制約を受けていた。

遺伝子工学技術によって、この問題が打開され、Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ　０ａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅは、ヒ
トインターフェロン（ｈＩｐＮ）の大規模試験を実施中
である。したがって、天然型、組み換え型いずれのｈＩ
ＦＮも、よく知られておシ、臨床的に使用されている。

要約 杢発明は、ヒ）ＴＮＦ　（ｈＴＮＦ）の製造および精製
のためのプロセスをはじめて明らかにしたものである。

このようなプロセスは臨床試験に有用なものとなろう。

３０種以上の細胞系統が組織培養においてＴＮＦを産生
ずる能力をもつかどうかスクリーニングされる。フォル
セール、１２−ミリスチン酸エステル、１３−＋ｔｍエ
ステル（ＰＭＡ）も、ｈＴＮＦ産生を促進するのに必要
であることが見出される。ＰＭＡは腫瘍促進因子として
知られている。現時点くおいては、Ｂ細胞系統はＰＭＡ
を加えた場合も、加えない場合も、ｈＴＮＦ製造のため
の最も見込のある出発原料である。上記の標準的なＴＮ
Ｆ検定法は、ｈＴＮＦを検定するため、たとえば腫瘍壊
死のＩｎ　ｖ１マ０検定やＬ細胞の細胞抑制作用ないし
細胞毒性のｌｎ　ｖｌｔｒｏ検定のために使用される。

Ｔ細胞、単球、前骨髄球細胞系統はＴＮＦをほとんど産
生しないか、あるいは全く産生じない。本法によるｈＴ
ＮＦ産生のためには、外因性ＢＯＧも、外因性内毒素も
必要としない。ヒト腫瘍細胞を死滅ないし発育抑制する
ために、ｈ　ＴＮＦと組み換え型ないし天然型いずれか
のｈＩＦＮを併用した場合には、驚くべき相乗作用的抗
腫瘍効果が認められる。ｈＩＦＮないしｈＴＮＦは、そ
れぞれ抗腫瘍効果を示すが、ｈＴＮＦをｈＩＦＮと併用
した場合の効果は、それらの個別的抗ｊ重瘍効果の和よ
シ大きい。

説　明 本発明は、ヒト細胞系統がｈＴＮＦのソースとして役立
つことを明らかにしている。マウスＴＮＦの産生方法は
、主としてＢＯＧや内毒素の効果に依存しているようで
ある。ヒ）Ｂ細胞からＴＮＦを産生するこの方法では、
ＢＯＧまたは内毒素の添加を必要としないｏしたがって
、本法で得られるＴＮＦは、本質的に外因性内毒素、細
菌性汚染物、ならびに血清汚染物も含まない。ｆｉｌに
示されているように、試験された造血系細胞のうちＢ細
胞は、ＴＮＦを最もよく産生ずるものである。

なお、表１をも含め後出の表はすべて（１２表）本文末
に順次描記しである。外因性ＢＯＧないし外因性内毒素
のいずれも添加しないで、高濃度でＴＮＦが産生された
のは、予期しない結果で条る。Ｔｌ［胞、単球ｔたは前
骨髄球などに由来する細胞系統の上清（液）中には、少
欲ないし微量のｈ　ＴＮＦが認められる。１ｎ　ｖｉｔ
ｒ。

Ｌ細胞検定法（０ａｒｓｖ・１１ら一前出）によって＼
ヒト由来の細胞によって産生されたＴＮＦの濃度が決定
された。したがってはじめてのことであるが、以下に説
明される培養系には、内毒素は添加されていないので、
本研究で認められたＴＮＦ中には全く外因性内毒素汚染
物は存在していない。マウスにおけるその他の研究者に
よる従来の研究では内毒素の存在を認めているが、それ
は系から内毒素を除去することは困難なことであるので
大きい問題となる。

Ｂｎｖで（形質）転換されたＢ細胞系統は、黒色腫患者
から誘導さ糺る。その他の細胞系列は、５ｌｏａｎ　−
Ｋｅｔｔｅｒｌｎｇ　Ｉｎ５ｔ１ｔｕｔ＊のＤｒ、　Ｌ
ｌｏｙａＯｌｄ、　Ｄｒ、　Ｊｏｒｇｅｎ　Ｅ、　Ｆｏ
ｇｈＩｔたはＤｒ、　Ｐ＠ｔｅｒ１１ａｌｐｈの細胞ノ
ζンク収集からえられる。Ｌｕｋｌｌ細胞は、Ｄｒ、　
Ｗ、　Ｓｔｅｗａｒｔから入手される（　Ｐｌｃｋｅｒ
ｉｎｇら（１９８０）　Ｆｒｅｅ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｅ
ａｄ。

８ｅｉ、　ＵＳＡ　７７　、５９３８〜５９４２）。　
ＥＢＶ転換Ｂ細１Ｉ１１系統は黒色腫患者から誘導され
る（　Ｉｌｏｕｇｈｔｏｈらｓ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ
、Ａｅａｄ、８ａｉ、Ｕ８Ａ＋７７．４２６０（１９８
０））。

’ｒ　Ｎ　Ｆを産生させるために、造血系出所のヒト細
胞をスクリーニングするには、（表１参照）ｍｌあたシ
５Ｘ１０’個の細胞を、胎児仔ウシ血清（ＦＯＲ）８％
を含有し、ＰＭＡ（１０ｎｇ／＋ａｊ（８１ｇｍａ　Ｏ
ｈｅｍｉａａｌ　Ｏｏ、、　ＳＬ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍ
ｏ　）　：］を含むか、ＰＭＡを含まない几ＰＭＩ　１
６４０（培地）中で培養する。ＲＰＭＩ　１６４０の組
成は表２に示されている。３７Ｃで４８時間インキュベ
ートしたあと、遠沈によって細胞を集め、ＰＭＡを含ま
ないＲＰＭＩ　１６４０培地中にｄあたシｌＸｌ０”個
の濃度で、さらに４８時時間開垂させておく。細胞培養
（液）？：遠沈して細胞を含まない上清を分離する。こ
れらの上清は検定まで一２ＯＣで凍結させておき、ＴＮ
Ｆ活性を２倍に希釈した上清液上用いてＬ細胞検定法に
よって決定する。

ｌｎ　ｖｉｔｒｏ検定ではｓ　Ａｍｅｒｌｃａｎ　Ｔｙ
ｐｅ　０ｕｌｔｕｒ＋５Ｏｏ１１ｅｃｔｌｏｎ　（ＡＴ
ＯＯ）より、Ｎ０ＴＯクローン９２９（６）系統から誘
導されたマウスＬ−Ｍ細胞を入手し、必須ではないアミ
ン噛、ペニシリン（ｘｏｏｕ／ＴＬｌ）、ストレプトマ
イシン（１０（１／ツ）、熱失活胎児仔クシ血清８％な
どを補充したＢａｇｌ・の最低必須培地（ＭＢＭ）（Ｇ
ＩＢＯＯ。

Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎ４＋　Ｎ、　Ｙ、　）中で、３
７Ｃで発育させた。マウスＴＮＦ耐性り細胞系統Ｌ（６
）は、マウス’Ｉ’　Ｎ　Ｆを含む培地中で継代接種を
反復して感受性り細胞から誘導した。ｈＴＮＦの活性の
検定は次のようにしておこなった。すなわち検定の３時
間前にあらかじめトリゾシン処理をしたＬ細胞５０，０
００個を接種しておいた培養基（ｏ、　５ｍｌ　）　ｆ
加えである孔（２４孔（ｏｓｔａｒ板）に、ＴＮＦを逐
次希釈した培養液等量（ここでは６．５　ｍｌ　）を添
加し、４８時間後に位相差顕微鏡観察またはトリパンゾ
リュー排除によって、細）ｊ３　ｆｔｓ　ｏ％死滅させ
るたんばく社を測定して検定する。

表１に示したように、上記のような標準的なマウスＴＮ
Ｐのｉｎ　ｖｌｔｒｏ検定では、ヒトＢ細ｕａＫ、ｔつ
−ｃｉ生さｎ＊ｈ　ＴＮＦｕ、マウ、Ｘ、　Ｌ　（Ｓ）
に対して細胞毒性を示すが、マウスＬ（６）に対しては
毒性を示さない。ｈ　ＴＮＦの几めにスクリーニングに
かけられる細胞は、腫瘍成長促進因千全加えたり、ある
いは加えないで培養する。

たとえばＰＭ人は、表Ｉ　Ｑ）　Ｌ　（Ｓ）［に示し、
たように、Ｂ細胞のｈＴＮＦ反応を数倍に亢進させるＰ
Ｍ、ＡはまたＴＰＡとしても知られている。

ｈＴＮＦ（週ごとに約ｉｏ’個の細胞に対して２〜３μ
ｇをつづけて加える）を含む培養基中で継代接種を反復
して、ｈＴＮＦに対する耐性を持つように、Ｌ　（９２
９）（ＡＴＯＯ）から誘導、培養されたマウスＬ−Ｍ細
胞が、マウスＴＮＦに対しても完全な交差耐性を示す。

これは興味のある交差耐性効果でおるＯ Ｉｎ　ｖｌｖｏでｂＴＮｌｅ検定するには、（ＢＡＬＢ
／ｃＸＯ５７ＢＬ／６）Ｆｌ♀マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ
　Ｌａｂａ）に７日前にＭ・ｔｈ　Ａ肉腫細胞５Ｘ１０
’個を皮内注射しておき、それからｈ　ＴＮＦの１回静
脈投与をおこなった。２４時間後に、腫瘍出血性壊死を
次のように分類した：効果なしく−）、軽度（ト）、中
等度（十＋）、高度（＋＋十）であるが、最後の段階は
腫瘍表面の９０％に及ぶものである（参照・Ｏａｒｓｗ
ｅｌｌ前記）。し念がって、一般には、ヒト細胞標的に
対してｈＴＮＦは、マウスＴＮＦに比べてより高い比活
性を示すものでちるが、Ｋｎ　ｖｉｖｏと　ｉｎ　ｖＬ
ｔｒｏの標準ＴＮＦ検定では、よく似た効果を示してい
る。

内澄素は、カブトガニアメ−／９様細胞溶解液によって
測定される（　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｖｓ
ｏｃｌａｔｅ＋ｓ　）　。

マウス組織球のクローン系統はＴＮＦを産生ずるので、
これらの細胞によるヒトでのｈＴＮＦの産生を決定する
ために、さらに正常および悪性のヒトの絹織球について
研究を実施しなければならないことは明らかである。表
１に示したＢ細胞の例は、正常のＢｆｇｆＵ胞もこの能
力を同じようにもっていること全示唆しているＯｈ　Ｔ
ＮＦの調製と濃縮の実施例（Ｌｕｋ　Ｉ！細胞より）　
、　Ｔ、ｕｋ　Ｉ！　細胞５　Ｘ　１０ｍｌｍｌをＦＯ
８５％およびＰ　Ｍ　Ａ　１０　ｎｇ／ｍｌを含有する
ＲＰＭ１１６４０中で培養し、３７Ｃで４８時間インキ
ュベートする。４８時間の時点で、遠沈によってｊｌｌ
ｌ　１１２　ｆ　集メ、ｍ、９たｐ　８〜１０Ｘ１０’
の濃度に血清を含まないＲ−ＩＴＳ　ＰＩ’１．ＢＭＩ
Ｘ（配合清液）〔インスリン（５μｇ／ｍｌ）　、）９
ンスフエリン（５μｇ／ｍｌ）、セレン（５ｎｇ／ゴ）
代用血清（０ｏｌｌａｂｏｒａｔｔｖｅ　ＩＬ＊ｓ＠ａ
ｒｅｈ　ｒ　Ｗａｌｔｈａｍ　Ｍａｓｓ）　）およびエ
タノールアミンＺ　ｎＭ中に再懸垂し、さらに４８時間
インキュベートする。

遠沈して細胞を含まない上清を分離し、−２ＯＣで凍結
しておく　ｏ　Ｌｕｋ　ＩＩ上清はＡｍ１ｅ＋＋）ｎ攪
拌式セル（Ｅ’ＭＩＯ膜）によって濃縮し、トリメ０．
０５　Ｍ　、　Ｍａｉｌ　０．１５Ｍ緩衝液（ｐＨ７，
３）で５０で平衡状態とし７’ＣＤ　Ｂ　Ａ　Ｂ　８ｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０カラム（４ｏＸ２．６ｃｒｎ）
に加える。同じ緩衝液で溶出させ、５ｍｌに分画した。

ＴＮＦ活性は、初期の流出分画中に検出されるが、これ
らの分画はプールした。この操作によって、比活性は２
５倍に増加した（２〜５Ｘ１０’単位／たんば＜　＃　
）　ｏ　Ｌ　ｍＢａ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ検定法によって
ｈ　ＴＮＦ活性があると決定された分画をプールし、Ａ
ｍ　１　ｃ　ｏ　ｎセルで濃縮する。

細胞を胎児仔ウシ血清（ＦＯ８）を追加した培地中で増
殖させた場合には、プールした分画のｈ’ｒＮＦＣＤ比
活性は、オオむねｌＸ１０”　ＮｌＸ１０４の範囲内に
ある。細胞が血清を含まない培地で発育した場合には、
プールした分画の１＋　Ｔ　Ｎ　Ｆの比活性は、おおむ
ね２〜５Ｘ１０’μｇの範囲内にある。

１）　Ｅ　Ａ、　Ｅで分画されたｈＴＮＦ’ｉ静注する
と、Ｉｎ　ｖｌｖｏ試験（前出）によってＭｅｔｈＡ腫
瘍に出血性壊死がひき起される。３００μｇによってマ
ウスの１１５に＋＋十壊死が起こシ、残シの４１５に＋
十懐死が発生した０１５０μｇのｈ　Ｔ　Ｎ　Ｉ”では
、マクスの５／７に＋十壊死が生じ、マウスの２／７に
十壊死が発生した。ｈ　ＴＮＦ７６μｇでは、マウスの
１１５に＋十壊死が発生し、マウスの４１５には十壊死
がみられた。培地（ＲＰＭＩ　１６４０）の相当するＴ
）　Ｅ　Ａ　Ｅ分画を注射されたあとの対照マウス３匹
中の３匹（、３／３　）には、壊死は観察されなかった
。したがって、ＴＮＦ活性を検定するのに用いられた標
準試験ずれでも十分な活性を示している。

培地にＦＯ８が添加されても、添加されなくても、８ｅ
ｐｈａｅｒｙｌ　８−２００カラムクロマトグラフイー
による測定では、ｈＴＮＦの分子量は約７０．０００ダ
ルトンである。高いｐＨまたは低いｐＨで、たとえば１
２時間以上処理すると、ｈ　ＴＮＦ活性は破壊される：
たとえば、ＰＩ　２．０では活性は約９０％消失し、ｐ
Ｈ４，０では５５％の活性が破壊され、ｐｕｉｏでは約
４５％の活性が失われる。約６〜ＢのｐＨ範囲ではｈ　
ＴＮＦ活性は安定である。熱安定性については、７０ｒ
に６０分間曝露すると、ｈＴＮＦ活性は破壊されるが、
５６ｔｌ：’、６０分では安定である。−７３Ｃまたは
一２ＯＣで長期間保存しても、活性は失われない。

ＰＭＡで刺激したＬＵＫＩＩ細胞から得た分画前の上清
中にＺｏｏ単位／ゴのＩＦＮ活性が詔められる。ＤＥＡ
Ｅクロマトグラフィーによって誘導された精製ｈ　ＴＮ
Ｆのプール分画中にも、使用した精製マウスＴＮＦ中に
も、インクーフエロン活性は検出されない。ヒトインタ
ーフェロン活性は、ｗＩｓＨまたはＧ’Ｍ２７６７細胞
に対する水痘性口内炎ウィルスの細胞変性作用の抑制度
によって測定され（Ｓｔ＠ｗａｒｔ　Ｗ。

（８ｐｒｉｎｇｓｒ　ｒ　Ｖｉ＠ｎｎａ　）　）　＋組
み換えヒトα−Ｉ　Ｆ　Ｎ　（Ｈｏｆｆｍａｎ　−Ｌａ
　Ｒｏｅｈｅ　）の場合は国際基準と〜またヒト天然ｒ
−ＩＦＮの場合は実験室基バへと比較される。組み換え
α−ｈＩＦＮ（２〜４Ｘ１Ｇ”単位／たんば＜ｍ９）は
Ｈｏｆｆｍａｎ　−ＬａＲｏａｈ・から入手され、天然
α−ｈＩＦＮ（白血球よ勺誘導されたもの）（０，６４
Ｘ１０’単位／たんば＜　ｍ９　）　Ｋｏｅｈｅｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　（Ｂｏｒｎｅ　ｔスイス）によっ
て５ｌｏａｎ　−Ｉ（ｅｔｔｅｒｌｎｇ　Ｉｎｇｔｌｔ
ｕｔｅの評価計画のために調製されたものであシ、天然
β−ｈＩＦＮ（ｘｘｔｏ’単位／たんばくダ）はＲｏｓ
ｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｌｔ
ｕｔｅ　（ＲＰＭＩ）から入手され、天然ｒ−ｈＩｐｒ
ｌ白血球より誘導されたもの）（ｌｘｕ□ｙ単位／たん
ば＜ＩＲ９）は８１ｏａｎ　−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ　Ｉ
ｎ５ｔｌｔｕＬｅのＤｒ、Ｂ＠ｒｉｍｈＲｕｂｉｎから
入手される。マウス型、ヒト型いずれのＴ’　Ｎ　Ｆも
、若干精製を実施すると、ＩＦＮ活性はもはや認められ
ない。ｉｎ　ｖｌｔｒｏ検定（前出）で、Ｌ（Ｓ）に対
する細胞毒性または細胞増殖抑制作用の消失によって示
されるように、各種のｈＩＦＮは検出可能な程度のｈＴ
ＮＦ活性をもっていない。

表３に示されているように、産生されたｈ　ＴＮＦが細
胞に与える影響は、細胞系統が異なると、作用も変化し
てくる。細ＩＩ８毒性は、７日後に細胞生存率に３５％
以上の減少を示した場合に陽性とされるが、それに対し
て細胞増殖抑制性は、７日後に細胞数に３５％以上の減
少を示し念場合に陽性とする。この研究に対しても、ま
たこの説明において示される今後のすべての研究に対し
ても、上記のようなＬＵＫＩＩ細胞系統によって産生さ
れたｈ　ＴＮＦが使用される。実施例の特異の組合せは
、比較の目的だけに示したものであり、この発明を制限
するためのものではない。その他のＢ１ａ胞系統のｈＴ
ＮＦは、ヒトでのその他の細胞を出発点として得られた
ＴＮＦと同じように、１ｎ　ｖｌｖ。

およびｉｎ　ｖｌｔｒｏで各種のヒト細胞に対して使用
できることは明らかである。１ｎ　ｖｔｔｒｏおよびｉ
ｎ　ｖｉｖｏでヒトの細胞のＴＮＦ産生に対して１ＢＯ
（］やその痔刷物ならびに内毒末が効果を持っているこ
とをセ８めるのは、当業者にとっては明白なことであろ
う。

ｈ　Ｔ　Ｎ　Ｉｉ’とマウスＴＮＦは、いずれも試験さ
れた乳がん由来の細胞系統の大部分に対して細１１＋ｌ
　ｙ！７性を示しているから、ヒト乳（がん）細胞系統
（表３と４）に対するｂＴＮ、Ｆの効果は、マウスＴＮ
Ｆの効果と同程度のものである。肺や黒色腫の細胞も、
ｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆによって影ｇを受けるが、この場合の効
果は主として細胞増殖抑制的なものである。ｈＴＮＦで
試験された４種の正常細胞系統、すなわち肺、腎、胎児
肺、胎児皮ｈ！のうち、ｈＴＮＦに対して感受性を示し
たものはなかった。したがって、ｈＴＮＦのヒト細胞に
対する細胞毒性、細胞増殖抑制性、または出血性壊死の
各効果は、ヒトの腫瘍細胞に限られるようである。ｈ　
ＴＮＦは、マウスＴＮＦに比べると、ヒト細胞標的に対
して高い比活性を示す。

ヒトインターフェロンは、組み換え型でも、天然型でも
、ｔｅａ、β、γのいずれの型でも、腫瘍細胞成長に抑
制効果をもっているが、それは一般によく知られており
、またここでは４種の腫瘍細胞系統の実施例によって、
表５，６゜９に示されている。一般に、３５％以上の細
胞毒性または細胞増殖抑制性の効果をひき起こすのに必
要とされるＩＦＮの抗ウイルス単位数は、βおよびｒの
ｈＩＦＮの場合よシ、α−ｈＩＦＮの場合のほうが大き
い。ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは〜ＩＦ’Ｎ製剤はＬ　（Ｓ）
マウス細胞に対して細胞毒性作用または細胞増殖抑制作
用を示さず、したがってｈＴＮＦ活性の欠如を示してい
る。しかし表７と８に示され几実施例にみられるように
、これらの２つの細胞性産物を精製し、両者を併用する
と、それらの個々の効果の和よシ大きい効果を示す。Ｉ
ＦＮとｈＴＮＦの組み合せ細胞毒性効果も、０１ａｒｋ
によって示唆された方法（Ｃ１ａｒｋ。

Ｄ、　Ａ、　（１９５８）　、　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｏｌ、　７６゜９１５〜９２１）によ
って共力作用性、すなわち薬理学的に共力作用性である
ことが明らかにされる。表１０．１１．１２参照。この
予想外の成績は、ヒト腫瘍の治療にきわめて大きな価値
全もちつる。

ｂＴＮＦ　、ｈ　ＩＦＮ、あるいは雨音の併用の各効果
を示すのに使用された方法の実施例を以下に示す。細胞
をトリプシンで処理し、２回水洗し、ＦＣ８８％を含む
Ｍ　Ｅ　Ｍ中に４〜５×１０番個／孔（２４孔０ｏｓｔ
ａｒ枚）の縄胞ヲ加え、３７Ｃでインキュベートする。

１６〜２４時間後に、培地を吸引し、ＤＦｉＡＥで分画
したｈＴＮＦ。

またはＩＦＮ、ちるいはｂＴＮＦ＋ＩＦＮのいずれかの
希釈液１　ｍｌを添加する。３，５．７日後に、位相差
顕微鏡によって総細胞数（生育可能および生育不能のも
の）ｆ、決定する。５日後に、同じ濃度のｈＴＮＦおよ
び（ｔたは）ｈＩＦＮを含有する新鮮な培養基によって
培養を硫加した。この方法は表３〜９の成績を得るのに
使用されている。薬物共力作用ないし相乗作用をスクリ
ーニングするための０１ａｒｋ　（前記）のゾロトコー
ルは、２つの因子、ＸとＹ、この場合はｈＩＦＮ（Ｘ）
とｈＴＮＦ（１）を単独および併用で検討することであ
る。腫瘍増殖抑制まＩＣは細胞毒性の亢進がみられるな
らば、１／４　Ｘ　＋１／４　Ｙ　、すなわちこの場合
には１／４ｈＩＦＮ＋１／４　ｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆでの試験
を実施して、この１／４用量の併用がそれぞれ単独の全
用班の成績と同程度のものであるかどうかを調べ、もし
そうであれば、２つの因子ＸとＹｌこの場合にはｈＩＦ
ＮとｈＴＮＦの共力作用の存在が明らかにされる。

この共力作用が表１０．１１．１２に認められるが、こ
れらでは、（上記と）同じ方法は、表の実施例４〜８に
ついては、３日後と５日後だけで使用されている。明ら
かに、１／４　ｈ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　＋　１／４ｈＴＮＦに
おいて、ＴＮＦ単独またはｈＩＦＮ単独よシ大きい効果
を示した共力作用が、表１０．１１．１２の３種の細胞
系統について認められる。

し友がって、この両者、すなわちｈＴＮＦ’とｈＩＦＮ
は、併用するとそれぞれの単独の場合よシがんに対して
よシ強力な細胞毒性活性をひき出すから、ヒトの腫瘍や
がんを治療するために、前述のような方法あるいは種々
の量比で併用して使用することが可能である。実際に、
最大の治療効果をあげるためには、がん患者がＴＮＦ　
、ＩＦＮの両者またはいずれかを産生ずるように、患者
に刺激を与えたシ、上記の治療桑種（ＴＮＦとＩＦＮ）
ｔ一種の割合で併用し、おそらくその割合を最大薬効を
あげるために変更したり、異なった時間的順序で使用し
たりなどすることで患者を治療しなければならないこと
は言うまでもない。もしＴＮＦのようなその他の因子が
ＩＦＮ作用を最大にするために必要であるとすれば、こ
の欠如を補うことによって、がんに対するＩＦＮの作用
を向上させることが可能となろう。ＩＦＮ増強作用は、
免疫系の生物学的反応変更因子として作用するｈ　ＴＮ
Ｆの働きによるものであろう。さらに、当業者にとって
は、ヒトがん細胞に対抗するｈＩＦＮの作用を、ホルモ
ンのような生物学的反応変更因子の単独または併用と、
あるいはＩＬ−２、またはその他のサイトカイニン類、
またはリンホカイン、またはリンフォトキシンのような
、ホルモン類似のその他の免疫反応変更因子分子との組
合せを試みることは自明のことである。実際に、異なっ
たＩＦＮや抗がん性のそのような種々の分子とのいろい
ろ、な併用を試験することが指摘されている。これらの
方法に対して、抗がん性のいろいろな細胞ソースからの
ｈＴＮＦまたはｈＩＦＮの試験も追加することも可能で
あるＯ （以下余白） −求職　京　吠　京υ　釈求　請求　請求υ狭　Ｖ　載
承　釈ｃｓ　ｏ　ｃｏ　ａｏ口ωトロ　ＯＣｏ　ｔｏ口
０ロ　ω■■　ω：　＋−１ｗ−−ｘ　＋＋１　＋４　
ｘ　−ｘ　−擲 Ｉ酩 表　７ （制廟１１１始時に、５Ｘ１０’個の勿ｙ抱にｈＴＮＦ
やＩＦＮを加えて）ｈＴＮＦ＋ＩＦＮ　２６　６　５ ｈＴＮＦ４Ｕ　７４６４６２ ＩＩＴ−２０ＩＦＮ　３１２５Ｕ　８３７４６５対照　
９５　９３　９７ ｈ’ｌｌ’ＮＰ＋ＩＦＮ”　５３２５２０ｈＴＮＦ１６
Ｕ　８５８２７０ ＭＴ’１−１８０　ＴＦＮ　３１２５Ｕ　９０９１８７
対照　９８　９８　９８ ｈＴＮＦ＋ＴＦＮ”　３３　１９　２５８に−ＭＥＬ−
’ｈＴＮＦ３３Ｕ　９６９６９６１０９　ＩＦＮ７０１
Ｕ　７９６９７４Ｘ＝１照　９７　９８　９８ ｈＴＮＦ＋ＩＦＮ”　０７９３８５ ｈＴ’ＮＦ　３３Ｕ　９ｇ　９５８Ｂ ”　”　ＩＦＮ７８１　Ｕ　９４９５９０対　照　（１
８０６９３ じ各細胞系統に対して単独投与と併用投与の場合のｈＴ
ＮＦｆｆｌやｈＩＦＮ、５には同量である）。　Ｕ＝単
位。

表　８ （ｍＷ！ｔ＄、５　×１０　’　＠ｆ）＠’ｍｆｃ　ｈ
　ＴＮＦオヨヒｈ　Ｉ　ＦＮ　ｅ加エル）ｈＴＮＦ＋Ｉ
ＦＮ”　１１　１０　６ ｈＴＮＦ２５Ｕ　Ｓ６　４６　３１ Ｂ’ｌ’−２０１ＦＮ３１．２５Ｕ　８４　８６　７９
対照　９５　９７　９７ ｈＴＮＦ＋ＩＦＮ中　２　４　５ ｂＴＮＰ５０ＴＪ　７７　、７２　６０Ｍ１ｉ）−１８
０ＩＦＮ１２５Ｕ　６９　５６　２６対照　９８　９８
　．９６ ｈＴＮＦ＋ＩＦＮ”　９　６２ ８に−ＭＥＩ／−ｈＴＮＦ１００Ｕ　９５　９３　９２
１０９　ＩＦＮ１２５Ｕ　６７　６１　３８対照　９ｇ
　’１１８　９６ ｈＴＮＦ＋ＩＦＮ”　９９　９４　９４ｂＴＮＦ２００
Ｕ　９７　９７　９５ Ｔ−２４ＩＦＮ１２５Ｕ　９９　９７　９３対照　９９
　９８　９３ （２各細胞系統に対して単独投与と併用投与の場合の１
１ＴＮＦｆｆｉやｈＩＦＮ量は同量である）。　Ｕ＝単
位畳】に）てｓｒ−：ｇ 瞬乃の　噂トへ　−Ｈ８！ 一一一＋−１６７ ４噂噴　の　箇Ｉｎ　クト のロト　ヘ啼の　ヘト　ｅＪｔ。

−Ｈ８−へ―　〜Ｏ ＋７１１０　＋ｎ　ｃＱＬｌ’ｌ　ＩＱ　Ｉ−、Ｎトト
ト　田トド　φト　ψ〇 ｘ　ト のＱΦ　のψΦ　の−寸■ ｉｎ　の　の　へ　の　咀０　へ ０田■　ＣＤ■Φ　ψ０　φ− “　寸 Ｑ）　Ｎ　ｅ　ＩＮ　ｔｏ　の　Ｏ’ｌ　ｅＪ　ｘ　１
０＋６　＋Ｏｉｎ　ｌ／）　＋。

＋０１１’）ｅＱＮ、１０Ｃ’ＳｔｏＯｎ第１頁の続き ０発　明　者　エリザベス　カースウ ェル　リチャーズ ［株］発明者　ベリツシュ　ワイ・ル ーピン ０発　明　者　バーバラ　ディー、ウ ィリアムソン ０発　明　者　ジエイ　ニス、プレン ダーギャスト アメリカ合衆国、　０６８８０　コネチカット、ウェス
トポート、オツター　トレイル　１幡地 アメリカ合衆国？　１１２１８　ニーＬ−ヨーク、　ニ
ュー　ヨーり、イースト　８スストリート　５３幡地ア
メリ力合衆国、　０６８７０　コネチカット、オールド
　グリーンウィッチ、ショワーロード　３幡地アメリ力
合衆国、　１０５３８　ニュー　ヨーク、ラーチモント
、メープル　アヴエニュ　９番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　精製されたｈＴＮＦｏ ２　約７０．０００ダルトン程度の分子鼠をもつ特Ｉ′
   １１請求の範囲第１項記載のｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　。 ３　約６〜８のｐ■範囲で安定な特許請求の範囲第１項
   記載のｈＴＮＦｏ ４　マウスＬ細胞ｉｎ　Ｖｌｔｙｏ検定法によって測定
   したとき、２〜５Ｘ１０’単位／たんば＜１ｎ９の範囲
   の比活性をもつ特許請求の範囲第１項記載のｂＴＮ、Ｆ
   。 ５、　−７８０および一２ＯＣにおいて安定である特Ｆ
   Ｆ　請求ＣＤ　ｆａｎ　ｔＥＢ第１　項記ＲＥ＜　ノｈ
   　Ｔ　Ｎ　Ｆ　。 ６．５６Ｃで６０分間安定である特許請求の範囲第１項
   記載のｈＴＮＦｏ ７　次の各項よシなる精製ｈＴＮＦを製造する方法：（
   １）組織培養において、まずヒトの造血系細胞をインキ
   ュベートする；　（ｔｌ）前記の細胞から細胞培養上清
   を分離する；　（ｌｉｔ）前記の細胞を採集する。　（
   ＩＶ）前記の細胞を再懸垂し。 Ｍ）それらを再インキュベートする；　（ｖｌ）細胞上
   清を採集する；　（ｖｉｌ）前記の細胞を含まない上清
   を凍結する。 ８、　工程（１）の初期インキュ（−ジョンが約０〜８
   ％の範囲のＦＯ８を含有する几ＰＭ１１６４０培地内で
   おこなわれる特￥’ｆＢ？ｌ求の範囲第７項記載の方法
   。 ９、’ｆＪＪ期インΦユペーションが３７ｒで約４８時
   間おこなわれる特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、工程（１１）の分離が遠沈による特許請求の範囲
   第７項記載の方法。 １１、細胞が工程（１■）にオイてＩｔ、ＰＭＩ　１６
   ４０培地において再インキュベートされる特許請求の範
   囲第７項記載の方法。 １２、細Ｈさが工程切において３７Ｃで４８時間再イン
   キュベートされる特許請求の範囲第７項記載の方法。 １３．　造血系細胞がヒ）Ｂ細胞である特許請求の範囲
   第７項記載の方法。 １４、ヒトＢ細胞がＢＰ、ＢＩ、ＯＬ、ＯＷ。 ＤＦｉ、ＤＭ、ＤＳ、ＥＪ、ＰＬ、ＥＱ、ＢＲ，ＦＯ。 ＦＤ、ＦＧ、ＡＲＨ−７７、ＤＡＵＤＩ、ＬＵＫＩＩ。 ＲＰＭＩ　１７８Ｂ、几ＰＭＩ　８２２６．ＲＰＭＩ８
   ８６６　、ＡＲＡ−１０の群から選択される特許請求の
   範囲第１３項記載の方法。 １５、細胞を工程（１）においてＰＭＡの存在下に成長
   させる特許請求の範囲第７項記載の方法。 １６、Ｐ　Ｍ　Ａ濃度が１０ｎｇ／ｗｉｔである特許請
   求の範囲第１５項記載の方法。 １７、工程（１）において１ｍｌあたシ約５×１０σ個
   の細胞をインキュベートする特許請求の範囲第７項記載
   の方法。 １８、工程（１）の初期インキュベーションのあと、上
   記の細胞を血清を含まないＲ−ＩＴＳＰ　ＩＬ　ＥＭ　
   Ｉ　Ｘおよび２ｎＭのエタノールアミン中に町懸垂し、
   細胞を含まない上清を採取し、濃縮し、前記の濃縮した
   細胞上清液を緩衝液で平衡化した分離カラムに接触させ
   、前記力２ムから得たｈＴＮＦ活性を示す分画をプール
   し、濃縮することを特徴とする特許請求の範囲第１５項
   記載の方法。 １９．１プあたり８〜ｌ０ＸＩＯ’個の細胞を再懸垂さ
   せる特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、細胞を含まない上清およびｈＴＮＦ活性を示す分
   画を、ＰＭＩＯ膜を装着した攪拌式Ａｙｎ　１　ｃ　ｏ
   　ｎセルによって濃縮することを特徴とする特許請求の
   範囲第、１８項記載の方法。 ２１、分難カラムとしてＤ　Ｅ　Ａ　ＥＳｅｐｈａｄｅ
   ｘ　Ａ　−５０カラムを使用する特許請求の範囲第１８
   項記載の方法。 ２２、使用するＤＥＡＢ　８ｅｐｈａｄ＠ｘ　Ａ　−５
   ０カラムの大きさが４ｏ）＜２．６ｚである特許請求の
   範囲第２１項記載の方法。 ２３、使用する緩衝液がｐＨ７，３のトリス０．０５　
   Ｍ。 食塩０．１５　Ｍである％許請求の範囲第１８項記載の
   方法。 ２４、ｈＴＮＦおよびｈＩＦＮからなる組成物。 ２５、、ｈＴＮＦが特許請求の範囲第７項記載の方法に
   よって製造されたものである特許請求の範囲第２４項記
   載の組成物。 ２６、ｈＴＮＦが特許請求の範囲第１５項記載の方法に
   よって製造されたものである特許請求の範囲第２４項記
   載の組成物。 ２７、ｈＴＮＦが特許請求の範囲第１８項記載の方法に
   よって製造されたものである０Ｉｔ′１′請求の範囲第
   ２４項記載の組成物。 ２８、ｈＩＦＮが、α−ｈＩＦＮ、β−ｈＩＦＮ。 ｒ−ｈＩＦＮ、それらの混合物の群から選択されたもの
   である特許請求の範囲第２４項記載の組成物。 ２９、そこで使用されるｈＩＦＮが天然型のｈＩＦＮで
   ある特許請求の範囲第２４項記載の組成物。 ３０、そこで使用されるｈＩＦＮが組み換え型ｈＩＦＮ
   である特許請求の範囲第２４項記載の組成物。 ３１、混合物中の細胞をｈＴＮＦと接触させ、悪性細胞
   に対する成長抑制効果を観察することからなる混合物中
   の悪性細胞と正常細胞を区別する方法。 ３２、そこで使用されるｈ　ＴＮＦが特許請求の範囲第
   ７項記載の工程にしたがってｇ造されている特許請求の
   範囲第３１項記載の方法。 ３３、そこで使用されるｈ　ＴＮＦが特許請求の範囲第
   １５項記載の工程にしたがって製造されている特許請求
   の範囲第３１項記載の方法。 ３４、そこで使用されるｈＴＮＦが特許請求の範囲第１
   ８項記載の工程にしたがって製造されている特許請求の
   範囲第３１項記載の方法。 ３５、そこで利用される成長抑制効果が、細胞増殖抑制
   作用、細Ｋｔ毒性、出血性壊死、成長抑制作用、および
   以上の組み合せの群から選択されている％ＦＦ請求の範
   囲第３１項記載の方法。 ３６、混合物中の細胞をｈＴＮＦおよびｈＩＦＮからな
   る組成物と接触させ、悪性細胞に対する成長抑制効果を
   観察することからなる混合物中の悪性細胞と正常細胞を
   区別する方法。 ３８　そこで使用されるｈＴＮＦが特許請求の範囲第１
   ５項に記載の工程にしたがって製造されている特許請求
   の範囲第３６項記載の方法。 ３９　そこで使用されるｈ　ＴＮＦが特許請求の範囲第
   １８項記載の工程にしたがって製造されている特許請求
   の範囲第３６項記載の方法０４０　そこで利用される成
   長抑制効果が、細胞増殖抑制作用、細胞毒性、出血性壊
   死、成長抑制作用、および以上の組み合せの群から選択
   されている特許請求の範囲第３６項記載の方法。 ４１、そこで使用されるｈＩＦＮがα−ｈＩＦＮ。 β−ｈＩＦＮ、γ−ｈＩＦＮ、およびそれらの混合物か
   らなる群から選択されている特許請求の範囲第３６項記
   載の方法。 ４２、そこで使用されるｈＩＦＮが天然型ｈＩＦＮであ
   る特許請求の範囲第４１項記載の方法。 ４３、そこで使用されるｈＩＦＮが組み換え型ｈＩＦＮ
   である特許請求の範囲第４１項記載の方法。 ４４、ｈＴＮｐに対して耐性を示すマウスＬ（６）細胞
   。 ４５、ｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆを含む培地上でマウスＬ　（Ｓ）
   細胞の継代接種を反復することによりて、ｈ　ＴＮＦに
   対する耐性を示すマウスＬ　（Ｒ）細胞を製造する方法
   。 ４６、そこで使用されるｈＴＮＦが特許請求の範囲第７
   項記載の方法によって製造されている特許請求の範囲第
   ４５項記載の方法。 ４７、その場合のｈＴＮＦが特許請求の範囲第１５項記
   載の方法によって製造されている特許請求の範囲第４４
   項に記載の方法。 ４８、そこで使用されるｈＴＮＦが特許請求の範囲第１
   ８項記載の方法によって製造されている特許請求の範囲
   第４５項記載の方法。 ４９、ヒトがん細胞に、この細胞の成長を抑制するのに
   十分な量のｈＴＮＦｆ：作用させるコトからなるヒトが
   ん細胞の成長を抑制する方法。 ５０　そこで使用されるｈＴＮＦが特許請求の範囲第７
   項記載の方法によって製造されている特許請求の範囲第
   ４９項記載の方法。 ５１、　そこで使用されるｈＴＮＦがｌ特許請求の範囲
   第１５項記載の方法によって製造されている特許請求の
   範囲第４９項記載の方法。 ５２、そこで使用されるｈＴＮＦが特許請求の範囲第１
   ８項記載の方法によって製造されている特許請求の範囲
   第４９項記載の方法。 ５３　ヒトがん細胞に、この細胞の成長を十分に抑制で
   きるｈＴＮＦおよびｈＩＦＮからなるｉｒ、ｌＩ成物を
   作用させることからなるヒトがん細ＩＪＦｌの成長全抑
   制する方法。 ５４　その場合の成長抑制作用が共力作用性である特ｉ
   １’Ｆ　ｉ！ｉ’をの範囲第５３項記載の方法。 ５５　そこで使用されるｈ　ＴＮＦが特許請求の範囲第
   ７項記載の工程にしたがって製造されている特許請求の
   範囲第５３項記載の方法。 ５６、そこで使用されるｈＴＮＦが特許請求の範囲第１
   ５項記載の方法によって製造されている特許請求の範囲
   第５３項記載の方法。 ５７、そこで使用されるり、　Ｔ　Ｎ　Ｆが特許請求の
   範囲第１８項記載の方法によって製造されている特許請
   求の範囲第５３項記載の方法。 ５Ｂ　そこで使用されるｈＩＦＮがα−り工ＦＮ。 β−ｈＩＦＮ、γ−ｈＩＦＮ、およびそれらの混合物か
   らなる群から選択されている特許請求の範囲第５３項記
   載の方法。 ５９　そこで使用されるｈＩＦＮが天然型のｈＩＦＮで
   ある特許請求の範囲第５８項記載の方法。 ６０、そこで使用されるｈＩＦＮが組み換え型ｈＩＦＮ
   である特許請求の範囲第５８項記載の方法。