PL175343B1 - Sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, kompozycja farmaceutyczna do pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej i kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów - Google Patents
Sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, kompozycja farmaceutyczna do pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej i kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworówInfo
- Publication number
- PL175343B1 PL175343B1 PL94315513A PL31551394A PL175343B1 PL 175343 B1 PL175343 B1 PL 175343B1 PL 94315513 A PL94315513 A PL 94315513A PL 31551394 A PL31551394 A PL 31551394A PL 175343 B1 PL175343 B1 PL 175343B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- peripheral blood
- human
- interleukin
- activity
- Prior art date
Links
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 title abstract description 53
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title description 10
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 title 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims abstract description 165
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims abstract description 164
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 83
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 claims description 161
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 78
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 53
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 31
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 14
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 102000052620 human IL10 Human genes 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 96
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 33
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 29
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 28
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 28
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 26
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 23
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 16
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 15
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 3
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 3
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 235000009434 Actinidia chinensis Nutrition 0.000 description 2
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 description 2
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 101150067964 BcRF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N Chromium-51 Chemical compound [51Cr] VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 208000002291 Histiocytic Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100039068 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- GKWTZACONBQTNK-IVIZKJKWSA-N N-benzyl-7H-purin-6-amine (1R,2R,5R,8R,9S,10R,12S)-12-hydroxy-11-methyl-6-methylidene-16-oxo-15-oxapentacyclo[9.3.2.15,8.01,10.02,8]heptadecane-9-carboxylic acid (1R,2R,5R,8R,9S,10R,12S)-12-hydroxy-11-methyl-6-methylidene-16-oxo-15-oxapentacyclo[9.3.2.15,8.01,10.02,8]heptadec-13-ene-9-carboxylic acid Chemical compound C(Nc1ncnc2nc[nH]c12)c1ccccc1.CC12[C@H]3[C@H](C(O)=O)[C@@]45C[C@@H](CC[C@H]4[C@@]3(CC[C@@H]1O)OC2=O)C(=C)C5.CC12[C@H]3[C@H](C(O)=O)[C@@]45C[C@@H](CC[C@H]4[C@]3(OC1=O)C=C[C@@H]2O)C(=C)C5 GKWTZACONBQTNK-IVIZKJKWSA-N 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001284077 Perusia Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229940045985 antineoplastic platinum compound Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000009133 cooperative interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000002767 hepatic artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002687 nonaqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 150000003058 platinum compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2013—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2066—IL-10
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/212—IFN-alpha
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
1. Sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojadrzastych komórek krwi obwodowej, znamienny tym, ze jednojadrzaste komórki krwi obwodowej inkubuje sie w obecnosci samej interleukiny- 1 0 lub interleukiny- 1 0 w kombinacji z interleukina- 2 i/lub interferonem-a. 6 . Kompozycja farmaceutyczna do pozaustrojowego wytwarzania aktywowa- nych jednojadrzastych komórek krwi obwodowej, znamienna tym, ze zawiera inter- leukine- 1 0 i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik. 9. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów, znamienna tym, ze zawiera aktywowane interleukina-10 (IL-10) jednojadrzaste komórki krwi obwodowej i farma- ceutycznie dopuszczalny nosnik. PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, kompozycja farmaceutyczna do pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej i kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów.
Wynalazek niniejszy dotyczy zastosowania interleukiny-10 (IL-10) oraz konwencjonalnych czynników hamujących syntezę cytokin (Cytokine Synthesis Inhibitory Factors - czynniki hamujące syntezę cytokin, [CSIF]) w immunoterapii adoptywnej stosowanej w leczeniu chorób nowotworowych poprzez stymulację cytolitycznej aktywności jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (Peripheral Blood Mononuclear Cetts - jednojądrzaste komórki krwi obwodowej, [PBMC]).
Wprowadzenie metod leczenia nowotworów z wykorzystaniem własnego układu immunologicznego organizmu opiera się na obserwacji, że nowotwory w niewytumaczalny sposób
175 343 unikają niszczącego je działania naturalnych mechanizmów obronnych skierowanych przeciwko nieprawidłowym lub obcym komórkom i cząstkom. Pobudzanie własnej odporności jest wykorzystywane w onkologii, bowiem może prowadzić do zahamowania wzrostu lub zabijania komórek nowotworu. Metody takie opisał np. Klein (Immunology, WileyInterscience, Nowy Jork, 1982, strony 623-648). Dokonane ostatnio obserwacje dotyczące bezpośredniego lub pośredniego zahamowania wzrostu guza przez efektorowe mechanizmy immunologiczne stały się przyczyną ponownego zainteresowania metodami immunoterapii w onkologii. Wśród prac na uwagę zasługują przede wszystkim następujące: Heberman, Concepts Immunopathol. 1:96 (1985) [naturalne komórki cytotoksyczne NK (Natural Killer cells -[NK]) przeciwdziałają wzrostowi nowotworu]; Rosenberg i wsp., Ann. Rev. Immunol. 4:681 (1988) [zastosowanie aktywowanych przez IL-2 komórek cytotoksycznych do leczenia nowotworów]; Ralf i wsp., J. Exp. Med. 167:712 (1988) [skierowana przeciwko nowotworowi cytotoksyczna aktywność stymulowanych limfokinami makrofagów]; Tepper i wsp., Cell 57:503 (1989)] [interleukina-4 [IL-4] posiada działanie przeciwnowotworowe];
M. Cohen, Limfokiny i odporność przeciwnowotworowa [Lymphokines and Tumor Immunityn], strony 237-253, w książce pod red. S. Cohen, Lymphokines and the Immune Response (CRC Press, Boca Raton, 1990).
Odpowiedź immunologiczna na rozwijający się w organizmie nowotwór regulowana jest przez różnorodne komórki i obejmuje wspólne oddziaływanie limfocytów T oraz cytokin pochodzących z monocytów. Jedną z metod leczenia, która jak wykazano daje najbardziej . obiecujące wyniki kliniczne, jest tzw. immunoterapia adoptywna wykorzystująca aktywowane przez IL-2 naturalne komórki cytotoksyczne [Rosenberg i wsp., Ann. Rev. Immunol. 4:681 (1988); Rosenberg, Sci. Am., strony: 62-69 (Maj, 1990)]. Jakkolwiek stosowana w monoterapii lub skojarzeniu z tradycyjnie używanymi cytostatykami interleukina-2 okazała się skuteczną w leczeniu niektórych nowotworów (np. gruczolakoraka nerki), to jednak objawy toksyczne, takie jak zespół przesiękania śródnaczyniowego i obrzęki, związane z podawaniem terapeutycznych dawek IL-2 powodują, że niektórzy z badaczy uważają, iż ryzyko związane z zastosowaniem IL-2 u chorego może przewyższać potencjalne korzyści terapeutyczne [Cotran i wsp., J. Immunol. 139:1882 (1987); Edwards i wsp., Cancer Res. 52:3425 (1992)].
Okazało się że szczególnie wrażliwymi na toksyczne oddziaływanie IL-2 są ludzkie komórki śródbłonka naczyniowego (komórki endotelialne), czego dowodzą: ich zwiększona przepuszczalność (np. zespół przesiękania śródnaczyniowego) oraz obrzęki. Jednym z czynników wpływających na taki przebieg zjawiska może być, obserwowana wcześniej w badaniach in vitro, zdolność przylegania aktywowanych interleukiną-2 limfocytów T i granulocytów obojętnochłonnych do warstwy komórek śródbłonka [Edwards i wsp., powyżej, Damie i wsp., 138:1779 (1987)].
Alternatywnym postępowaniem do leczenia immunologicznego chorób nowotworowych jest adoptywne przeniesienie komórek immunokompetentnych. Immunoterapią adoptywną określany jest specyficzny sposób leczenia polegający na przeniesieniu do organizmu, w którym rozwija się nowotwór aktywnych komórek immunokompetentnych, takich jak np. limfocyty o właściwościach przeciwnowotworowych, które mogą - w sposób bezpośredni lub pośedni - wywierać działanie przeciwnowotworowe. Immunoterapia adoptywna jest cenną metodą leczenia chorób nowotworowych. Dodatkową jej zaletą jest to, że dzięki przeniesieniu do organizmu aktywnych komórek immunokompetentnych, układ immunologiczny biorcy nie musi być w pełni funkcjonalny. Tak więc, związana z rozwojem nowotworu immunosupresja występująca w ustroju biorcy' nie stanowi większego problemu przy tym postępowaniu leczniczym. Ze względu na to, że pełna immunokompetencja ustroju nie jest konieczna dla biorcy, a może tylko działać korzystnie, wspomagając adoptywne komórki immunologiczne, immunoterapia adoptywna może być z łatwością stosowana w skojarzeniu z innymi metodami leczenia przedwnowotworowego, takimi jak radio Czy chemioterapia. Dodatkowo, w przeciwieństwie do innych metod terapii, prawie niemożliwym jest wystąpienie w czasie leczenia adoptywnego immunosupresji.
175 343
Chorzy poddani chemioterapii lub radioterapii wskutek wywołanych przez nie zaburzeń układu immunologicznego nie są w stanie dostarczyć odpowiedniej liczby efektorowych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej [PBMC] koniecznych dla dalszej, pozaustrojowej ich aktywności. Dlatego dla uzyskania korzystnych wyników leczenia u takich pacjentów powinny zostać wybrane szczególnie te metody terapii, które wykazują skuteczność przy niskim stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych.
Odpowiedź immunologiczna w stosunku do nowotworów podlega regulacji wielu komórek immunokompetentnych i obejmuje oddziaływanie limfocytów T oraz cytokin pochodzących z monocytów. Immunoterapia adoptywna, w której stosuje się ludzkie rekombinowane cytokiny, polega na podawaniu stymulowanych poza organizmem [Phillips i wsp., J. Clin. Oncol. 5:1933 (1987); Perussia i wsp., Curr. Opin. Immunol. 3:49 (1991)] jednojądrzastych komórek krwi obwodowej [PBMC] poddanych działaniu IL-2 [Rosenberg i wsp., J. Immunol. 138:1779 (1985)]. Pozaustrojowa stymulacja PBMC powoduje powstanie aktywowanych limfokinami komórek cytotoksycznych LAK (LymphokineActivated Killer - aktywowane limfokinami cytotoksyczne komórki zabijające [LAK]) oraz aktywowanych naturalnych komórek cytotoksycznych NK, wykazujących zdolności cytolityczne wobec różnych rodzajów komórek nowotworowych.
, Wykazano, że ludzkie rekombinowane cytokiny: IL-5 [Nagasawa i wsp., Cell. Immunol. 133:317 (1991)], IL-7 [Stotter i Lotze, Arch. Surgery 126:1525 (1991)] oraz IL-12 [Gately i wsp., J. Immunol. 147:874 (1991)] posiadają zdolność stymulowania aktywności cytolitycznej ludzkich PBMC. Interleukina-10 (IL-10), jak w originale opisano mysią cytokinę hamujaca syntezę czynników wydzielanych przez podklasy specyficznych limfocytów T-pomocniczych, wpływa na różnicowanie mysich komórek -T-cytotoksycznych [Chen i Złotnik, J. Immunol. 147:528 (1991)]. Wykazano również, że ludzkie PBMC inkubowane z supematantami otrzymanymi z hodowli komórek COS transfekowanych ludzkim komórkowym DNA (cDNA) kodującym strukturę IL-10 (IL-100 cDNA), powodują in vitro lizę docelowych komórek nowotworu. W doświadczeniu tym udało się także zidentyfikować komórki T o zwiększonym potencjale cytolitycznym odpowiadajace na stymulacyjne działanie IL-10. Były nimi limfocyty o fenotypie CD56+, charakterystycznym dla komórek linii NK.
W pewnych warunkach, IL-4 może odwracalnie zaburzać powstawanie komórek LAK aktywowanych pod wpływem IL-2 [Nagler i wsp., J. Immunol. 141:2349 (1988)]. Dla przykładu, jeśli ludzkie PBMC hodowane są w obecności obu cytokin: IL-2 i IL-4, ilość zniszczonych docelowych komórek nowotworowych wrażliwych na działanie LAK jest znacznie obniżona [Spits i wsp., J. Immunol. 141:29 (1988)]. Jednak, jeśli PBMC zostaną przez 3 dni poddane wstępnej inkubacji w środowisku zawierającym IL-2, a dopiero następnie poddane działaniu IL-4, obserwuje się wzrost ich aktywności cytolitycznej [Spits i wsp., J. Immunol. 141:29 (1988)]. Co więcej, wywierana przez IL-4 blokada zależnej od IL-2 cytotoksyczności może zostać osłabiona poprzez włączenie do wstępnej mieszaniny inkubacynej interferonu alfa (alpha-interferon [a-IFN]) lub czynnika martwicy nowotworów alfa (Tumor Necrosis Factor-alpha [TNF-a]) [Swisher i wsp., Cell. Immunol. 128:450 (1990)].
Kedar i wsp., [Cancer Immunol. Immunother. 35:63 (1992)] wykazali ostatnio na modelu mysim, że sekwencyjne podawania IL-2 i α-IFN jest efektywnym sposobem immunoterapii mięsaka linii MCA-105 i raka M-109. Pierwotnym spostrzeżeniem wynikającym z tej pracy była obserwacja, że jak się wydaje skuteczność sekwencyjnego podawania każdej z cytolin jest większa niż łączne podawanie ich obu.
Immunoterapię adoptywną jako łatwą do zastosowania i skuteczną metodę leczenia różnych chorób, zwłaszcza jednak choroby nowotworowej u ludzi, opisano w patencie nr 4 690 915 (U.S. Patent No. 4 690 915) wydanym Rosenbergowi. Jednak, jak wspomniano o tym już powyżej, istnieje konieczność wprowadzenia takich modyfikacji omawianej, opartej na zasadzie immunoterapii adoptywnej techniki leczenia, które byłyby znacznie mniej toksyczne niż metody wykorzystujące wyłącznie UL-2. Istnieje także konieczność wyboru takiego
175 343 sposobu terapii, który byłby skuteczny przy niskich wartościach stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych.
Obecny wynalazek spełnia to zapotrzebowanie poprzez dostarczenie sposobu wzmocnienia aktywności cytolitycznej PBMC, w szczególności komórek LAK i NK, w którym wykorzystuje się jedynie IL-10 lub IL-10 w skojarzeniu z IL-2 i/lub α-IFN.
Sposób według wynalazku polega na tym, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej inkubuje sie w obecności samej interleukiny-10 lub interleukiny-10 w kombinacji z intrleukiną -2 i/lub interferonem-α.
Wynalazek dotyczy też kompozycji farmaceutycznej do pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, która zawiera interleukinę-10 ewentualnie w skojarzeniu z IL-2 i/lub α-IFN wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej do leczenia nowotworów, która zawiera aktywowane interleukiną-10 (IL-10) jednojądrzaste kotmórki krwi obwodowej i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Korzystnie IL-10, IL-2 i α-IFN stosowane w sposobie i kompozycjach według wynar lazku są ludzkiego pochodzenia, jednak najkorzystniej IL-10, IL-2 oraz α-IFN są ludzkimi rekombinowanymi cytokinami.
Obecny wynalazek stanowi ulepszenie znanych metod, w których w celu indukcji aktywności cytolitycznej komórek LAK oraz NK stosowano IL-2. Dzięki obecnemu wynalazkowi możliwe jest znaczne zmniejszenie toksyczności towarzyszącej zastosowaniu IL-2, uzyskiwane przez całkowite jej wyeliminowanie lub znaczące zmniejszenie jej ilości.
Jeżeli nie stwierdzono inaczej, różne stosowane w niniejszym opisie terminy mają takie same znaczenia jak znane w danej dzidzinie wiedzy. Stosowane tu pojęcie adoptywna immunoterapia oznacza taki rodzaj postępowania, który polega na wprowadzeniu aktywowanych, funkcjonalnych komórek immunolokompetentnych do organizmu pacjenta. Korzystnie komórkami tymi są komórki LAK oraz NK pochodzące z organizmu tego chorego, który zostaje w danym momencie poddany leczeniu.
Określenie regresja w niniejszym opisie oznacza możliwe do zmierzenia znanaymi sposobami zmniejszenie wielkości guza lub guzów nowotowrowych.
Pojęciem interleukina-10 lub IL-10 określa się w niniejszym wynalazku białko,, które odznacza się następującymi cechami: (a) posiada sekwencję aminokwasową dojrzałej IL-10 (to znaczy takiej, która utraciła początkowe aminokwasy tworzące, sekwecję lidera, charakterystyczną dla niedojrzałej formy sekrecyjnej białka) ujawnioną ' w zgłoszeniu patentowym USA nr 07/917,806 zgłoszonym 20 lipca 1992 r., które odpowiada opublikowanemu międzynarodowemu zgłoszeniu nr WO 91/00349 oraz (b) posiada aktywność biologiczną tożsamą z naturalną IL-10. Dla potrzeb niniejszego wynalazku zarówno forma glikozylowana IL-10 (np. Produkowana w komórkach eukariotycznych jakimi są np. komórki jajników chomika chińskiego - CHO) jak i jej postać nieglikozylowana (np. otrzymana na drodze syntezy chemicznej lub produkowane w E. coli) są równoważne i mogą być stosowane zamiennie. Dodatkowo, dla potrzeb wynalazku mogą być stosowane' muteiny oraz inne analogi IL-10, do których należy między innymi białko BCRF1 [Epstein Barr Virus viral IL-10 - odpowiadające IL-10 wirusowe białko produkowane przez wirus Epstein-Barra], posiadające biologiczną aktywność IL-10.
Interleukina-10 odpowiednia do stosowania w niniejszym wynalazku może pochodzić z kilku różnych źródeł. Dla przykładu może zostać wyizolowana z pożywki hodowlanej aktywowanych komórek posiadających zdolność jej sekrecji. Dodatkowo, zarówno sama IL-10 jak i jej aktywne fragmenty mogą zostać zsyntetyzowane na drodze chemicznej znanymi w technice metodami. Opis takich metod można znaleźć w publikacji Marrifielda, Scence 233:341 (1986) oraz w książce Athertona i wsp., zatytułowanej Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, 1989,1.R.L. Press, Oksford.
Korzystnie białko lub polipeptyd otrzymuje się drogą rekombinacji genetycznej stosując izolowane kwasy nukleinowe kodujące polipeptyd będący IL-10. Ogólne metody
175 343 biologii molekularnej, zostały opisane między innymi w drugim wydaniu książki zatytułowanej Molecular Cloning, a Laboratory Manuał, wydanej w 1989 roku pod redakcją Sambrooka i wsp. przez Cold Spring Harbor, Nowy Jork, a także w Current Protocols in Molecular Biology, wydanej przez Green/Woley, Nowy Jork pod redakcją Ausubel i wsp. (wydanie z 1987 roku wraz z cyklicznymi uzupełnieniami). Odpowiednie sekwencje nukleotydowe można uzyskać stosując standardowe techniki z biblio tek genomowych lub bibliotek komórkowego DNA (cDNA). Można także stosować metodę PCR (Polymerase Chain Reaktion - łańcuchowa reakcjapolimerazy [PCR]). Dla zapoznania się z tymi technikami zobacz np. wydaną pod red. Innis i wsp. książkę PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Nowy Jork, Nowy Jork USA, z 1990 r.
Biblioteki DNA tworzą kwasy nukleinowe ekstrahowane z odpowiednich komórek zobacz np. opublikowane międzynarodowe zgłoszenie nr WO 91/00349, w którym zawarto opis wytwarzania IL-10 metodą rekombinacji. W różnych bazach danych grupujących sekwencje genów - np. GenBank oraz BMPL zawierające sekwencje kwasów nukleinowych i PIR oraz Swiss-Prot z opisami sekwencji dla białek, świadectwo pochodzenia: Intelligenetics, Mountain View, Kalifornia, USA lub Genetics Computer Group, Centrum Biotechnologii Uniwersytetu w Wiskonsin, Madison, Wiskonsin, USA - można znaleźć użyteczne sekwencje genowe.
Klony zawierające sekwencje kodujące ludzką UL-10 zostały zdeponowane w American Type Culture Collection (ATCC) w Rockville, Maryland, USA pod numerami dostępu (Accession Nos.) 68191 i 68192. Identyfikacja innych klonów przenoszących sekwencje kodujące ludzką IL-10 może się odbywać z zastosowaniem techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych lub poprzez immunologiczne wykrywanie kodowanego białka, jeśli używano wektora ekspresyjnego. Szczególnie użyteczne są sondy oligonukleotydowe oparte na zdeponowanych sekwencjach ujawnionych w opublikowanym zgłoszeniu międzynarodowym nr WO 91/00349. Sondy oligonukleotydowe można także wytwarzać z konserwatywnych regionów pokrewnych genów różnych innych gatunków. Alternatywnie można wykorzystać zdegenerowane sondy oparte na sekwencjach aminokwasowych interleukiny-10.
Uzyskanie transformowanych linii komórkowych tak prokariotycznych jak i pochodzących od ssaków, drożdży lub owadów, w których w wyniku ekspresji powstają duże ilości pożądanego polipeptydu, jest możliwe przy zastosowaniu standardowych metod. Przykładowo, szczepami E. coli użytecznymi zarówno dla uzyskania ekspresji jak i klonowania mogą być linie: W3110 (ATCC Bi, 27325), Χ1776 (ATCC No. 31244), Χ2282, RR1 (ATCC Mp/31343). Przykładowymi liniami hodowlanymi komórek pochodzących od ssaków mogą być natomiast: COS-7, mysie komórki L lub komórki CHP [patrz: Sambrook (1989) oraz Ausubel i wsp., (1987 - uzupełnienia)].
Celem uzyskania ekspresji DNA kodującego EL-10 można stosować różne wektory ekspresyjne. Dla uzyskania ekspresji rekombinowanego białka w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych można stosować konwencjonalne wektory. Korzystne wektory pcD opisane przez Okayamę i wsp., Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983); oraz Takebe i wsp., Mol. Cell. Biol. 8:466 (1988). Inne wektory ekspresyjne oparte na wirusie ssaków SV-40 obejmują wektory opisane przez Kaufmana i wsp., Mol. Cell. Biol. 2:1304 (1982) i w patencie USA nr 4,675,285. Wektory oparte na SV-40 są szczególnie przydatne dla małpiej linii komórkowej COS-7 (ATCC nr CRL 1651), a także dla innych Unii z komórek ssaków, takich jak mysiej linii komórek L. Zobacz także w: Pouwels i wsp., (1989 i uzupełnienia) Cloning Vectors: A Laboratory Manuał, Elsevier, Nowy Jork.
Interleukina-10 może zostać wyprodukowana w postaci rozpuszczalnej, jak ma to miejsce w przypadku sekrecyjnego produktu transformowanych lub transfekowanych komórek drożdży lub ssaków. Peptydy można następnie oczyścić znanymi standardowymi metodami. Dla przykładu, etapy oczyszczania mogą obejmować wytrącanie siarczanem amonu, jonowymienną chromatografię, sączenie molekularne, elektroforezę, chromatografię powinowactwa itp., patrz Methods in Enzymology Purification Principles and Practices, (Springer-Verlag, Nowy Jork, 1982).
175 343
Alternatywnie IL-10 można wytwarzać w formie nierozpuszczalnej w postaci agregatów lub form inkluzywnych. IL-10 w takiej formie oczyszcza się dobrze znanymi metodami. Przykładowo, metody oczyszczania obejmują wydzielanie form inkluzyjnych z rozerwanych komórek gospodarza przez odwirowanie, a następnie ich rozpuszczenie w czynnikach chaotropowych i redukujących przez o peptydy przybierają konformację biologicznie czynną. Szczegółowy opis tej techniki znajduje się między innymi w: Winkler i wsp., Biochemistry, 25:4041 (1986); Winkler i wsp., Bio/Technology, 3:9923 (1985); Koths i wsp. i w patencie USA nr 4,569,790.
Sekwencja nukleotydowa służąca do transfekcji komórek gospodarza może być modyfikowana zgodnie ze standardowymi technikami po to, aby uzyskać IL-10 lub jej fragmenty o różnych żądanych właściwościach. Modyfikowane cząsteczki IL-10 mogą się różnić od endogennego białka strukturą pierwszorzędową, np. poprzez insercje, substytucje, delecje, lub fuzje aminokwasów. Modyfikacje takie można przeprowadzać w przeróżnych kombinacjach tak, aby stworzyć ostateczne modyfikowane łańcuchy białka.
Te warianty sekwencji aminokwasowej białka można wytwarzać w różnych celach: zarówno w celu wydłużenia okresu półtrwania w surowicy, jak i ułatwienia oczyszczania lub preparatyki, poprawy skuteczności terapeutycznej lub zmniejszenia nasilenia lub ilości występujących w czasie terapii działań niepożądanych. Zazwyczaj warianty sekwencji aminokwasowej są określonymi wcześniej polipeptydami niespotykanymi w naturze, jednak mogą być nimi także warianty potranslacyjne jak np. cząsteczki glikozylowane lub białka, które zostały skoniugowane z glikolem polietylenowym (PEG), itp. Warianty te mogą być stosowane w niniejszym wynalazku tak długo, jak długo zachowuje biologiczną aktywność IL-10,
Stosując różnorodne metody, np. technikę ukierunkowanej mutagenezy [Gillman i wsp., Gene 8:81 (1987)], można łatwo uzyskać modyfikacje sekwencji kodujących polipeptydy. Większość z tych modyfikacji można kontrolować stosując rutynowo używane testy przesiewowe. Dla przykładu, w opublikowanym zgłoszeniu międzynarodowym nr Wo. 91/00349 można znaleźć opisy kilku testów in vitro odpowiednich do oceny aktywności IL-10.
Korzystnie do leczenia ludzi stosuje się ludzką IL-10 jednak ewentualnie można też zastosować IL-10 pochodzenia wirusowego lub pochodzącą z komórek innych gatunków ssaków. Najbardziej korzystnie jako IL-10 stosuje się ludzką rekombinowaną IL-10. Wytworzenie ludzkiej i mysiej IL-10 opisano w opublikowanym zgłoszeniu międzynarodowym nr Wo 91/00349. Klonowanie i ekspresja wirusowej IL-10 (w postaci białka BCRF1) uzyskiwanej z wirusa Epsteina-Barra zostały omówione w pracy Moora i wsp., Science 248:1230 (1990). Ludzka rekombinowana IL-10 jest także dostępna w handlu z firmy PreproTech Inc., Rocky Hill, NJ, USA.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawierająca komórki jednojądrzaste ' krwi obwodowej (PBMC) aktywowane sposobem według wynalazku odpowiednia jest do leczenia pacjentów z chorobą nowotworową, którzy powinni odnieść korzyść ze stymulacji cytolitycznej aktywności PBMC, w szczególności aktywacji komórek LAK i NK. Przykłady nowotworów poddających się takiemu leczeniu można znaleźć w patencie wydanym Rosenbergowi oraz j'ego pracach opublikowanych w piśmie S«^j^entific American, cytowanych powyżej.
Opisane standardowe metody i techniki wytwarzania IL-10 dla potrzeb niniejszego wynalazku mogą zostać z powodzeniem wykorzystane do produkcji IL-2 i α-IFN. IL-2 i α-IFN stosowane w niniejszym wynalazku są także, dostępne w handlu (np. IL-2 z firmy Cetus Corporation, Emeiyville, Kalifornia, USA; natomiast α -IFN - z firmy Schering Corp., Kenilworth, NJ, USA).
Sposób pozaustrojowej aktywaqi PBMC (korzystnie, jeśli te komórki zostaną pobrane w standardowy sposób od chorego, który zostanie następnie poddany takiej terapii) oraz metoda wprowadzania ich do organizmu zgodne są zasadniczo z opisem Resenberga cyowanym powyżej, natomiast jedyny wyjątek stanowi łączne podawanie interleukiny-10 ze zmniejszonymi dawkami IL-2 i/lub α-IFN, tak jak to opisano w obecnym wynalazku.
175 343
Liczba aktywowanych PBMC przetaczanych następnie pacjentowi powinna być w zakresie od około 106 do około 1012. Zaleca się, jednak nie jest to obligatoryjne, aby przetaczać tak aktywowane komórki wraz z IL-10, którą podaje się równocześnie z PbMC, albo bezpośrednio po ich przetoczeniu.
W jednej z postaci wykonania wynalazku, PBMC aktywuje się poprzez ich wstępną inkubację z IL-10 [np. poprzez trzydniową inkubację w 37°C w obecności 4 ng/ml (100jednostek/ml) lub 40 ng/ml ludzkiej IL-10]. Następnie, komórki te przemywa się, aby usunąć nadmiar wolnej IL-10 i dodaje się IL-2 o niskim stężeniu (typowo około 2 jednostek/ml).
Podanie aktywowanych przez IL-10 komórek posiadających właściwości cytolityczne samych lub w skojarzeniu z innymi cytokinami w korzystny dla chorego sposób powinno nastąpić poprzez wlew dożylny. Można tego dokonać wykorzystując cewnik umieszczony w żyle głównej lub w jednej z większych żył obwodowych lub poprzez przezskóraie wprowadzoną do tętnicy wątrobowej kaniulę.
Interleukinę-10 podaje się w postaci kompozycji farmaceutycznej zawierającej farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz skuteczną ilość IL-10 samej lub w kombinacji z IL-2 i/lub α-IFN. Nośnikiem farmaceutycznym może być każda nietoksyczna, kompatybilna z aktywnym składnikiem mieszaniny substancja, odpowiednia dla dostarczenia pacjentowi związku czynnego. Postaci użytkowe przydatne do pozajelitowego podawania takich leków są dobrze znane i zostały np. opisane w 15 wydaniu książki pt. Remington' Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton, Filadelfia, USA, 1980 r.). Alternatywnie, kompozycje według wynalazku można wprowadzić do ustroju pacjenta poprzez implantację lub podanie w drodze iniekcji systemu przenoszenia leku tak, jak to przykładowo podano: w Urquhart i wsp., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199 (1984); Lewis (redaktor), Controlled Release ofPesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, Nowy Jork, USA, 1981); patencie USA nr 3,270,960 itp.
Cytokiny można podawać każdym ze znanych sposobów, w tym przez podawanie dożylne, dootrzewnowe lub podskórne. Korzystne jest podawanie dożylne.
W celu pozajelitowego wprowadzenia kompozycji farmaceutycznej przygotowuje się ją w postaci jednostkowej dawki do iniekcji (roztworu, zawiesiny, emulsji) wraz z nośnikiem farmaceutycznym. Przykładowymi nośnikami mogą być: fizjologiczny roztwór soli, płyn Ringera, roztwory dekstrozy, roztwór Hanka. Można także stosować niewodne nośniki takie jak oleje lub oleinian etylu. Korzystnym nośnikiem jest 5% roztwór dekstrozy w fizjologicznej soli. Nośnik może także zawierać niewielkie ilości dodatków takich jak substancje zapewniające izotoniczność roztworu lub jego chemiczną stabilność, np. bufory i środki konserwujące.
IL-10 korzystnie formułuje się w postaci oczyszczonej, zasadniczo wolnej od agregatów i innych białek, utrzymując stężenie w zakresie około 5 do 20 pg/ml.
Kompozycja według wynalazku może być również dostarczona z zastosowaniem technik terapii genowej, obejmujących między innymi bezpośrednią iniekcję DNA do tkanek, zastosowanie rekombinowanych wektorów wirusowych lub implantację transfekowanych komórek. Opisy takich metod można znaleźć np. u Rosenberga, J. Clin. Oncol. 10:180 (1992).
Skojarzone z IL-10 wprowadzanie jednej lub więcej substancji leczniczych może być jednoczasowe (jednoczesne z podaniem IL-10) lub sekwencyjne. Korzystnie IL-10 podaje się przed wprowadzeniem IL-2. Podanie α-IFN może nastąpić w tym samym czasie co podanie IL-10 i/lub IL-2 lub może on zostać zastosowany w innym czasie (sekwencyjnie). Wszystkie z podawanych substanqi leczniczych powinny występować w organizmie paqenta w stężeniach zapewniających skuteczność terapeutyczną mierzoną stopniem regresji guza.
Stosowany w niniejszym opisie termin skuteczna ilość oznacza taką ilość IL-10 jaka z jednej strony zapobiega lub powoduje przynajmniej zmniejszenie działań ubocznych występujących w immunoterapii adoptywnej, a z drugiej strony zapewnia stymulację cytolitycznej aktywności komórek LAK i NK. Skuteczna ilość cytokiny (cytokin) niezbędna dla konkretnego pacjenta może być różna, a zależy od takich czynnikówjak stopień zaawansowania
Π5343 i rodzaj nowotworu jaki podany zostanie leczeniu, ogólnego stanu zdrowia chorego, sposobu podawania leku, nasilenia objawów niepożądanych, ilości i rodzaju innych, jednoczasowo stosowanych terapeutyków itp.
Ilość cytokiny wystarczająca dla wzmocnienia aktywacji komórek LAK oznacza ilość cytokiny, ocenianą w doświadczalnym modelu cytolizy opartym na komórkach Daudi, jaka jest niezbędna aby spowodować co najmniej około 25% wzrost aktywności cytolitycznej, jaką jest w stanie wyindukować wyłączne podanie IL-10. Korzystny byłby wzrost co najmniej około 50% a najkorzystniejszy co najmniej około 100%.
Korzystnie, IL-10 podaje się w maksymalnej dobrze tolerowanej dawce, a jej zakres obejmuje ilości leku od 10jedn./kg masy dała na dobę do około 108jedn./kg masy dała na dobę. Podobnie, IL-2 oraz a -IFN powinny również być stosowane w maksymalnych dawkach dobrze przez chorych tolerowanych (np. dawki IL-2 wynoszą 105 jedn./kg masy ciała podawanych dożylnie co 8 godzin w 50 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej z 5% albuminy jako nośnika; dla α-IFN wynoszą odpowiednio 106 jedn./kg masy dała podawanych dożylnie co 8 godzin w 0,9% roztworze soli fizjologicznej z 5% albuminy jako nośnika). Jak to wcześniej podano, dawki muszą być dobierane indywidualnie przez prowadzącego pacjenta lekarza i muszą mieścić się w zakresie tolerancji chorego.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być zastosowana także w połączeniu z tradycyjnymi metodami terapii nowotworów, takimi jak radioterapia lub chemioterapia, na którą składają się rutynowo podawane leki cytostatycznej jak np. alkaloidy Vinca, związki platyny i 5-fluorouracyl.
Poddanie ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej działaniu wyłącznie IL-10 lub IL-10 w skojarzeniu z innymi cytokinami zapewnia wzrost ich aktywności cytolitycznej skierowanej przedwko determinantom ludzkich nowotworów. Ponieważ skuteczność immunoterapii w znacznym stopniu zależy od masy guza, opisany tu sposób leczenia wykorzystujący komórki aktywowane sposobem według wynalazku będzie szczególnie skuteczny wtedy, gdy wcześniej usunie się podstawową masę guza. Odczyn zapalny j'aki typowo towarzyszy postępowaniu chirurgicznemu może w korzystny sposób wpływać na wyniki leczenia uzyskiwane z zastosowaniem tych metod.
Przykład I. Następujący przykład podano w celu zilustrowania wynalazku, nie ograniczając jego zakresu.
Wpływ IL-10 na aktywność cytolityczną ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
Badano zdolność IL-10 do indukowania aktywności cytolitycznej ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej in vitro. Wyniki badania można przedstawić następująco:
1. IL-10 pobudza obecne wśród ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej’ aktywowane limfokinami komórki LAK i NK. Aktywność cytolityczną pobudzona działaniem IL-10 może zostać zneutralizowane podaniem szczurzych monoklonalnych przeciwciał skierowanych przedwko IL-10.
2. IL-10 uzyskane z ekspresji w CHOjak i-E coli wykazują podobną, zależną od dawki zdolność stymulowania komórek LAK oraz NK i ze względu na to możnaje uznawać za biologicznie ekwiwalentne.
3. Aktywność komórek LAK uzyskana po inkubacji PBMC z zastosowanymi łącznie IL-10 i w małej dawce IL-2 jest większa niż ta,jaką obserwuj’e się po stymulacji każdą z tych cytokin osobno.
4. Komórki PBMC poddane najpierw wstępnej, dwudniowej stymulacji IL-10, wykazują większą aktywność cytolityczną po dodaniu następnie IL-2.
5. IL-10 wywiera antagonistyczne działanie wobec IL-4, która hamuje stymulowaną IL-2 aktywność komórek LAK.
6. Skojarzone podawanie IL-10 oraz IL-2 powoduje zwiększenie aktywności cytolitycznej komórek LAK przy niskim stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych.
175 343
W dodatku do efektu jaki IL-10 wywiera wobec PBMC zaobserwowano, że komórki śródbłonka hodowane w obecności IL-10 wykazują niezaburzoną zdolność do odpowiedzi na egzogenne czynniki (tzn. na γ-IFN lub α-TNF), podczas gdy te same komórki inkubowane w obecności IL-2 pozostawały niezdolne do odpowiedzi ze względu na toksyczne zmiany jakie w nich zachodziły pod wpływem IL-2.
Materiały i metody
Ludzkie rekombinowane cytokiny i przeciwciała przeciwko IL-10
Ludzką rekombinowaną IL-10 (zarówno produkowaną przez E. coli jak i komórki CHO) uzyskiwano stosując standardowe metody. Specyficzna aktywność otrzymywanej tak IL-10, po oczyszczeniu jej przy pomocy standardowych technik, wynosiła odpowiednio: dla produkowanej przez komórki E. coli - 4,1 x 107 i przez komórki CHO - 2,1 x 107 jednostek/mg. Aktywność tę oceniano stosując test proliferancji komórek linii MC-9 [Thompson-Snipes i wsp., J. Exp. Med. 173:507 (1991)].
W ten sposób oceniono, że około 4 ng całkowicie homogennej IL-10 ma aktywność biologiczną równą około 100 jednostkom.
Szczurze przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko ludzkiej IL-10 określane symbolem 19F1 otrzymano od Dr John Abrams z DNAX Institute of Molecular Biology, Pało Alto, Kalifornia, USA.
Izolacja ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC)
Krew obwodową uzyskiwano nakłuwając żyłę zdrowych dorosłych dawców. Jako antykoagulantów używano heparyny lub EDTA. pBmC oddzielono stosując dwustopniową technikę. W pierwszym ' etapie komórki krwi ulegały sedymentacji w dekstranie, a następnie wirowano je na Ficollu Paque® z prędkością 1250 obrotów na minutę przez 30 minut. Warstwę interfazy zawierającą głównie limfocyty i monocyty zebrano i przepłukano co najmniej dwa razy RPMI zawierającą 10% płodową surowicę cielęcą (kompletna pożywka - JRH Bioscience).
Test cytotoksyczności
Komórki docelowe, Daudi (wrażliwe na LAK) oraz K562 (wrażliwe na NK) otrzymano z American Type Tissue Collection, gdzie są zdeponowane pod numerami odpowiednio: CCL 213 i CCL 243. Komórki linii Daudi i K562 oznakowano radioaktywnym chromem (51Cr) zgodnie z metodą opisaną przez Spitsa i wsp. [J. Immunol. 141:29 (1989)]. Po okresie hodowli, PBMC zbierano, następnie dwukrotnie płukano i używano jako komórek efektorowych badając uwalnianie 51Cr (zgodnie z powyższym opisem Spitsa i wsp.). W płytkach hodowlanych zawierających 96 dołków o dnie w kształcie litery V i pojemności 100 μΐ mieszano 5 x 103 znakowanych 5JCr komórek docelowych z różną ilością komórek fektorowych (E/T=20:1; 5:1 i 2:1). Płytki te wirowano przez 5 minut z prędkością 1000 obrotów na minutę, przy czym inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze wzbogaconej 5% CO2. Po 4 godzinach płytki ponownie wirowano przez 5 minut przy 500 x g. Przy zastosowaniu zbieracza SKATRON® (Skatron Instruments) odciągano następnie supernatanty znad hodowli i liczono je w liczniku-gamma (firmy LKB-Pharmacia). Całkowitą zdolność lityczną oceniano poprzez inkubację komórek docelowych znakowanych 5]Cr z 1% SDS. Otrzymane wyniki prezentowane są jako średnia z trzech kolejnych pomiarów.
Odsetek komórek ulegających rozpadowi (lizie) obliczano w następujący sposób.
cpm uzyskana w eksperymencie - cpm spontaniczna % rozpadu =------------------x 100 cpm przy całkowitym rozpadzie - cpm spontaniczna przy czym cpm oznacza liczbę impulsów na minutę.
175 343
Inkubacja ludzkich PBMC z cytokinami
a. Inkubacja wyłącznie z IL-10
Izolowane zgodnie z powyższym sposobem PBMC utrzymywano w pożywce RPMI-1640 wzbogaconej 10% cielęcą surowicą płodową w stężeniu 1 x 106 komórek/ml z IL-10 lub ludzką IL-10 (produkowaną przez komórki CHO) przez 3 dni w 37°C (jeśli nie określono inaczej). Aktywność cytotolityczną oceniano w podany powyżej sposób.
b. Jednoczasowa inkubacja z EL-10 i IL-2
PBMC inkubowano przez 3 dni w 37°C z 4 ng/ml IL-10 bez dodatku lub wraz z dodatkiem ludzkiej IL-2 (Genzyme) (2 lub 20 jedn./ml).
c. Sekwencyjna inkubacja i IL-10 i EL-2
PBMC inkubowano z 4 ng/ml IL-10 przez 2 dni w kompletnej pożywce. Następnie do hodowli dodawano ludzką IL-2 do końcowego stężenia 2 lub 20 jedn./ml. Po całonocnej inkubacji oceniano cytolityczną aktywność komórek LAK i NK.
Wpływ przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko IL-10 na aktywację komórek LAK i NK zależną od IL-10
PBMC inkubowano z 40ng/ml IL-10 przez 3 dni w obecności 2 μ g/ml przeciwciał monoklonalnych (19F1) skierowanych przeciwko IL-10 lub w obecności przeciwciał izotypowych stosowanych jako kontrola (szczurze przeciwciała klasy IgG2a).
Wpływ IL-10 na aktywność cytolityczną komórek LAK i NK obecnych w puli ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
Aktywność cytolityczną komórek LAK można odróżnić od aktywności cytolitycznej Komórek NK stosując różne układy nowotworowych komórek docelowych. Komórki linii hodowlanej Daudi, ustalonej z komórek ludzkiego chłoniaka złośliwego typu Burkitta, są już tradycyjnie celem ataku komórek LAK i ulegają wskutek ich działania cytolizie. Komórek linii hodowlanej K562, ustalonej z komórek ludzkiej białaczki układu czerwonokrwinkowego ( erytroleukemii), używa się jako celu dla komórek NK, pod wpływem których komórki te ulegają cytolizie. W prowadzonych doświadczeniach ludzkie PBMC hodowano przez 3 dni z różnymi stężeniami DL-10. Aktywność cytolityczną była oceniana w standardowym teście na uwalnianie 51Cr opisanym powyżej. Wyniki uzyskane w odniesieniu do komórek LAK przedstawiono w tabeli 1. Wartość błędu standardowego umieszczono poniżej wartości średnich.
175 343 Tabela 1
Stymulacyjne działanie IL-10 wobec aktywowanych limfokinami PBMC (wyrażone w % komórek ulegających liziea)
| Stężenie IL-10 (ng/ml)b | ||||||
| Dawca | 0 | 0,04 | 0,4 | 4 | 40 | 100 |
| 1 | 0 | 4,25 | 18,3 | 44 | 26,2 | 67,5 |
| 2 | 0 | 5,5 | 7,2 | 10 | 31,5 | 27,6 |
| 3 | 18 | 17,7 | 29,2 | 39,1 | 29,7 | 55,1 |
| 4 | 0 | 8,8 | 10,2 | 22,2 | 35,8 | 35,9 |
| 5 | 4,6 | 8,1 | 15,6 | 20,6 | 20,1 | 12,1 |
| 6 | 14,6 | 19,7 | 40,7 | 54,4 | 42,9 | 43,4 |
| Średnia: | 6,2 | 10,6 | 20,2C | 31,7® | 31,0C | 40,2C |
| ±33 | ±2,6 | ±5,1 | ±6,8 | ±3,2 | ±8,0 |
a 51
- % poddanych lizie, znakowanych Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu, przy stosunku E/T 20:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
k - Przed oceną aktywności cytolitycznej ludzkie PBMC uzyskane od zdrowych dawców poddano przez 3 dni działaniu IL-10. c - Istotna różnica między próbą traktowaną IL-10 i kontrolną p £ 0.05 określona w teście t-Studenta
Wyniki przedstawione w tabeli 1 potwierdzają działanie IL-10 stymulujące aktywność komórek LAK w PBMC od wszystkich 6 dawców. Jakkolwiek istniały oczywiste różnice pomiędzy dawcami, to jednak udowodniono, że IL-10 powoduje zależny od stężenia wzrost zdolności cytolitycznej komórek uzyskanych od wszystkich sześciu dawców. Znaczącą statystycznie aktywność (p = < 0.05) uzyskano przy stężeniach EL-100,4 ng/ml i większych.
Wykazano także (wyników nie prezentujemy obecnie), że pobrane od dawcy komórki PBMC posiadające podstawową aktywność cytolityczną (tzn. niestymulowaną cytokinami) o wartości 5% lub mniejszą najbardziej reagowały na IL-10 przy wszystkich badanych stosunkach komórek efektorowych do docelowych.
Podobne wyniki uzyskano stosując w modelu badawczym inne nowotworowe komórki docelowe, w tym: ludzkie komórki gruczolakoraka nerki, dwie różne linie hodowlane ustalone z ludzkich komórek czerniaka, a także linię ustaloną z ludzkich komórek raka jelita grubego. Ludzkie komórki gruczolakoraka nerki i czerniaka stosowane były także przez Rosenberga, który in vivo poddawał adoptywnej immunoterapii z zastosowaniem IL-2 chorych, u których te nowotwory wystąpiły. We wszystkich przypadkach wykazano zależność pomiędzy stężeniem IL-10 a odsetkiem komórek docelowych ulegających cytolizie.
W dalszych doświadczeniach wykazano, że IL-10 stosowana w monoterapii lub podawana w skojarzeniu z IL-2 posiada właściwość zwiększania aktywności cytolitycznej skierowanej przeciwko komórkom U937 (ludzki mięsak histiocytamy), SW620 (ludzki rak jelita grubego) oraz SKBR3 (ludzki rak sutka). W doświadczeniach, w których jako komórek docelowych użyto komórek ludzkiego czerniaka HS294T, przy badanych stężeniach IL-10, nie udało się wykazać wywoływania przez nią odpowiedzi.
Podstawowa aktywność cytolityczną komórek NK (np. zdolność do lizy komórek docelowych K562 w nieobecności cytokin) była większa niż podstawowa aktywność komórek LAK. Aktywność komórek NK można było dalej zwiększyć za pomocą cytokin takich jak IL-2 [Perusia, cytowany powyżej, Phillips i Lanier, J. Exp. Med. 164:814 (1986).
Działanie L^10 na aktywność NK oceniano równolegle do badań nad komórkami LAK, w doświadczeniach prowadzonych z PBMC uzyskanymi do tych samych, co opisano powyżej, 6 dawców.
175 343
Wyniki doświadczeń z komórkami NK przedstawiono w tabeli 2. Wartość błędu standardowego umieszczono poniżej wartości średnich.
Tabela 2
Wywierana przez IL-10 stymulacja aktywności komórek NK obecnych w puli PBMC (wyrażona w % komórek ulegających liziea)
| Stężenie IL-10 (ng/ml)b | ||||||
| Dawca | 0 | 0,04 | 0,4 | 4 | 40 | 100 |
| 1 | 22,4 | 30,6 | 25,2 | 57,2 | 51,5 | 49,7 |
| 2 | 20,4 | 24,7 | 31,3 | 56,7 | 65,6 | 71,5 |
| 3 | 61,4 | 55,6 | 37,9 | 81,1 | 80,0 | 81,5 |
| 4 | 13,8 | 25,2 | 23,2 | 37,5 | 52,2 | 54,2 |
| 5 | 13,0 | 19,9 | 20,2 | 25,1 | 23,5 | 20,3 |
| 6 | 15,9 | 253 | 45,4 | 66,6 | 43,7 | 56,1 |
| Średnia: | 24,4 | 30,2 | 30,5 | 54,0c | 52,5C | 55,5C |
| ±75 | ±5,2 | ±3,9 | ±8,2 | ±7,8 | ±8,5 |
- % poddanych lizie, znakowanych Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu, przy stosunku E/T 20:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
b - Przed oceną aktywności cytolitycznej ludzkie PBMC uzyskane od zdrowych dawców poddano działaniu IL-10 przez 3 dni. c - Znacząca różnica między próbą traktowaną ElIO i kontrolną p £ 0.05 określona w teście t-Studenta
Wyniki przedstawione w tabeli 2 potwierdzają, że IL-10 indukuje znaczny, zależny od stężenia wzrost cytotoksyczności komórek NK obecnych w puli PBMC uzyskanych od dawców. Statystycznie znaczący wzrost aktywności cytolitycznej uzyskano przy stężeniach IL-10 4 ng/ml i większych. Tak jak w doświadczeniach z zastosowaniem komórek LAK, wpływ IL-10 na aktywność komórek NK był różny u różnych dawców.
Porównanie oddziaływania EL-2 i EL-10 na komórki endotelialne
Wykonywano także doświadczenia mające na celu ocenę żywotności jednowarstwowej hodowli komórek endotelialnych po zastosowaniu IL-10. Komórki te, hodowane w obecności IL-10, wykazywały niezaburzoną zdolność do odpowiedzi na egzogenne cytokiny (γ-IFN i TNF-ćz), podczas gdy prowadzone równolegle hodowle, podane działaniu równoważnych dawek IL-2 w tym samym czasie inkubacji utraciły zdolność do odpowiedzi na bodźce pochodzące od egzogennych cytokin ze względu na toksyczność wywieraną przez EL-2.
Wpływ przeciwciał monoklonalnych anty-EL-10 na zależną od EL-10 aktywację komórek LAK i NK
Jak to odpowiednio dla każdej z klasy komórek wykazano w tabelach 3 i 4, w których przedstawionym średnim wartościom towarzyszą wartości błędu standardowego, zdolność do pobudzania aktywności cytolitycznej komórek LAK i NK wywierana przez IL-10 podawaną w stężeniu 40 ng/ml została trzykrotnie zmniejszona (p < 0.05) w obecności 2 μ g/ml przeciwciał monoklonalnych 19F1 skierowanych przeciwko IL-10. W przeciwieństwie do tego, dodanie do hodowli 2 mg/ml kontrolnych szczurzych przeciwciał izotypowych klasy IgG2a powodowało aktywację cytolityczną, która statystycznie nie różniła się od uzyskanej po podaniu wyłącznie 40 ng/ml IL-10.
Tabela 3
Hamowanie stymulowanej IL-10 aktywności cytolitycznej komórek LAK za pomocą przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko EL-10 (wyrażone jak % komórek ulegających lizie3)
| Warunki hodowlib | ||||
| Dawca | pożywka | IL-10 (40 ng/ml) | El-0+19F1 | IL-10+IgG2a |
| 1 | 5,6 | 23,5 | 15,7 | 28,2 |
| 2 | 4,7 | 213 | 11,0 | 17,5 |
| 3 | 5,4 | 42,5 | 0,0 | 35,8 |
| 4 | 2,1 | 42,0 | 12,8 | 26,5 |
| 5 | 4,7 | 19,1 | 0,0 | 11,65 |
| Średnia: | 4,5 ±0,6 | 29,6±5,3 | 7,9C±3,3 | 23,9±4,3 |
a - % poddanych lizie, znakowanych 51cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu, przy stosunku E/T 20:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
b - Ludzkie PBMC uzyskane od zdrowych dawców przed oceną ich aktywności cytolitycznej przez 3 dni poddano działaniu ng/ml ElIO w obecności albo 2 mg/ml przeciwciał 19F1 (skierowanych przeciwko ludzkiej IL-10) albo szczurzych przeciwciał klasy lgG2a (kontrola izotypowa).
c - Statystycznie istotna różnica pomiędzy podawaną jako jedyną IL-10 a IL-10 stosowaną wraz z przeciwciałami skierowanymi przeciwko niej przy p s 0,05 określona za pomocą testu t-Studenta.
Tabela 4
Neutralizacja stymulowanej IL-10 aktywności cytolitycznej komórek NK uzyskana przez podanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko IL-10 (wyrażona % komórek ulegających lizie3)
| Warunki inkubacji | ||||
| Dawca | czysta pożywka | IL-O0 (40 ng/ml) | Dl-0+19F1 | IL-10+IgG2a |
| 1 | 21,1 | 383 | 20,6 | 27,2 |
| 2 | 28,0 | 71,0 | 22,2 | 53,2 |
| 3 | 22,2 | 51,5 | 0,0 | 70,5 |
| 4 | 18,0 | 25,4 | 12,3 | 20,8 |
| 5 | 23,2 | 53,2 | 54,5 | 84,9 |
| Średnia: | 223±1,6 | 47,9±7,6 | 19,ic±6,6 | 503 ±12,7 |
a - % poddanych lizie, znakowanych ^Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu, przy stosunku E/T 20:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
- Ludzkie PBMC uzyskane od zdrowych dawców przed oceną ich aktywności cytolitycznej przez 3 dni poddano działaniu 40 ng/ml IL-10 w obecności albo 2 mg/ml przeciwciał 19F1 (skierowanych przeciwko ludzkiej IL-10) albo szczurzych przeciwciał klasy IgG2a (kontrola izotypowa).
c - Statystycznie istotna różnica pomiędzy podawaną jako jedyną IL-10 a IL-10 stosowaną wraz z przeciwciałami skierowanymi przeciwko niej przy p s 0,05 określona za pomocą testu t-Studenta.
175 343
Stymulacja aktywności cytolitycznej wywoływana skojarzonym z innymi cytokinami działaniem IL-10
a. Jednoczesna inkubacja z IL-10 i DL2
Ludzkie PBMC były inkubowane z IL-2 podawaną w stężeniach submaksymalnych (2 lub 20 jedn./ml) w obecności IL-10 przy stosunku komórek efektorowych do docelowych (E/T) 5:1.
Wyniki badania przedstawiono w tabeli 5, w której pod wartościami średnimi umieszczono wartości błędu standardowego.
Tabela 5
Indukowanie aktywowanej limfokinami cytolitycznej aktywności jednojądrzastych komórek krwi obwodowej wywierana przez jednoczasową ich inkubację z IL-10 i IL-2 (wyrażone jako % komórek ulegających liziea)
| Warunki inkubaqib | |||||
| Dawca | czysta pożywka | IL-2 (2 jedn,) | IL-10 (4ng) | IL-10+IL-2 | IL-2 (20 jedn,) |
| 1 | 0,0 | 33 | 3,7 | 15,9 | 24,6 |
| 2 | 2,6 | 7,6 | 3,8 | 23,5 | 41,0 |
| 3 | 6,1 | 5,0 | 133 | 17,7 | 11,4 |
| 4 | 3,3 | 50,1 | 51,6 | 68,7 | 80,0 |
| 5 | 2,4 | 9,4 | 12,8 | 29,3 | 45,7 |
| 6 | 9,9 | 28,9 | 16,0 | 38,8 | 67,1 |
| Średnia: | 4,1 | 17,4 | 16,8 | 323 | 44,9C |
| ±1,42 | ±7,6 | ±7,2 | ±7,2 | ±10,4 |
a 51
- % poddanych lizie, znakowanych Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu, przy stosunku E/T 5:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
b - Ludzkie jcdnojądrzaste komórki kiwi obwodowej uzyskane od zdrowych dawców przed oceną ich aktywności cytolitycznej przez 3 dni poddano działaniu 4 ng/ml IL-10 i 2 jednoetek/mi IL-2.
c - Nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy IL-10 i IL-2 w porównaniu z 20 jednymi IL-2 przy p < 0,05 (ocena wg testu t-Studenta).
Jak wykazano to w tabeli 5, przy stosunku komórek efektorowych do docelowych 5:1 stwierdzono dodatkowy wzrost aktywności komórek LAK poddanych inkubacji z 2 jedn./ml IL-2 i 4 ng/ml IL-10. Ta wyraźnie większa niż po inkubacji z każdą z cytokin osobno, indukowana skojarzonym działaniem obu cytokin aktywność, osiąga nawet poziom aktywacji uzyskiwany przy dziesięciokrotnie większym, stężeniu IL-2. Jak to oceniono w teście t-Studenta, wynik ten był statystycznie istotny przy wartości p < 0,05.
b. Jednoczesna inkubacja z EL-10 i a-EFN
Inkubacja PBMC IL-10 i α-IFN łącznie powodowała podobny do opisanego addytywny wzrost aktywności cytolitycznej wobec komórek Daudi, jednak działanie to nie obejmowało komórek NK.
Wyniki tego doświadczenia przedstawiono w tabeli 6, w której pod wartościami średnich umieszczono wartości błędu standardowego.
175343 Tabela 6
Indukowanie aktywności komórek LAK pochodzących z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej przez jednoczasową ich inkubację z IL-10 i α-EFN (wyrażone jako% komórek ulegających lizie3)
| , Warunki inkubacji5 | ||||
| Dawca | pożywka | α-IFN | IL-10 | IL-10+«-IFN |
| 1 | 4,4 | 7,9 | 17,8 | 35,7 |
| 2 | 1,0 | 11,7 | 15,4 | 32,0 |
| 3 | 1,6 | 123 | 5,5 | 26,4 |
| Średnia: | 2,3±1,0 | 10,6±1,4 | 12,6±3,8 | 31,4±2,7 |
a - % poddanych lizie, znakowanych 51cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu, przy stosunku E-T 10:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
b - Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej uzyskane od zdrowych dawców przed oceną ich aktywności cytolitycznej przez 3 dni poddano działaniu 4 ng/ml IL-10 i 100 jednTml α-IFN.
Jak to oceniono w teście t-Studenta, różnice pomiędzy aktywnością cytolityczną komórek PBMC dawcy indukowaną przez IL-10 i α-IFN w porównaniu z aktywnością cytolityczną jaką indukowała każda ze stosowanych osobno cytokin były statystycznie istotne przy wartości p < 0.05. Natomiast jednoczasowa inkubacja tych komórek z IL-10 i skojarzonymi z nią innymi cytokinami, takimi jak IL-4, IL-5, GM-CSF lub y-IFN nie powodowała większej aktywacji komórek PBMC, niż sama IL-10 (wyniki nie prezentowane).
Sekwencyjna inkubacja z IL-10 i IL-2
Stosując opisane powyżej metody, PBMC hodowano w pożywce bez dodatku żadnych cytokin lub w pożywce wzbogaconej IL-10.Po dwóch dniach do hodowli dodawano IL-2 do końcowego stężenia 2 lub 20 jedn./ml. Po dodatkowej całonocnej inkubacji oceniano aktywność cytotoksyczną PBMC skierowaną przeciwko komórkom Daudi.
Wyniki doświadczenia prowadzonego na puli komórek uzyskanych od 5 dawców przedstawiono w tabeli 7, w której pod wartościami średnich umieszczono wartości błędu standardowego.
175 343
Tabela 7
Indukowanie aktywności komórek LAK pochodzących z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej przez wstępną inkubację z IL-10 i następnie IL-2 (wyrażone jako % komórek ulegających liziea)
| Warunki hodowli wstępnejb | ||||
| Dawca | pożywka | IL-10C | IL-2d | IL-10+IL-2e |
| 1 | 29,7 | 21,1 | 44,8 | 116,0 |
| 2 | 5,5 | 18,3 | 12,2 | 20,7 |
| 3 | 14,7 | 58,1 | 74,5 | 100,0 |
| 4 | 26,2 | 59,5 | 54,3 | 81,9 |
| 5 | 4,8 | 28,2 | 22,5 | 40,6 |
| Średnia: | 16,2±5,1 | 37,0±9,0 | 41,7±11,4 | 71,8 ±17,9 |
a - % poddanych lizie, znakowanych 51Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu, przy stosunku E-T 5:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
- Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej uzyskane od zdrowych dawców przed oceną ich aktywności cytolitycznej przez 2 dni poddano wstępnej inkubacji z 4 ng/ml IL-10, a następnie do pożywki dodano 2 jedn./ml IL-2. Aktywność cytolityczną oceniano po dodatkowej inkubacji całonocnej.
c - Pochodzące od dawcy PBMC inkubowano przez 3 dni z IL-10.
d - Przed dodaniem IL-2 pochodzące od dawcy PBMC inkubowano przez 3 dni w czystej pożywce.
e - Przed dodaniem 20 jedn. IL-2 pochodzące od dawcy PBMC inkubowano przez 2 dni w obecności IL-10.
Jak to wykazano w tabeli 7, w części doświadczenia, w której PBMC dawcy były wstępnie inkubowane w obecności IL-10 przed dodaniem IL-2, uzyskano około dwukrotnie większą aktywność cytolityczną tych komórek (71,8± 17,9%), w porównaniu z aktywnością obserwowaną po wstępnej hodowli prowadzonej w pożywce przed dodaniem IL-2. Obserwowana różnica w wynikach doświadczenia prowadzonego ze wstępną inkubacją z IL-10 lub bez niej jest statystycznie istotna przy p < 0.14, jak to oceniono w teście t-Studenta.
Podane wyniki zwiększonej aktywności cytolitycznej uzyskano dla sekwencyjnej inkubacji z EL-10 i następnie inkubacji z α-IFN (wyniki obecnie nie prezentowane).
IL-10 a wywierana przez IL-4 blokada zależnej od EL-2 cytotoksyczności
Uzyskane od 6 ludzi PBMC hodowano w pożywce zawierającej albo wyłącznie 20 jedn./ml EL-2 albo łącznie wprowadzone: 20 jedn./ml IL-2 i 1000 jedn./ml IL-4 lub 20 jedn./ml I.L-2,1000 jedn./ml eL-4 i 4 ng/ml IL-10.
Wyniki doświadczenia przedstawiono w tabeli 8, w której pod wartościami średnich umieszczono wartości błędu standardowego.
175343 Tabela 8
Antagonistyczne działanie IL-10 wobec zależnej od IL-4 blokady indukowanej przez IL-2 aktywności cytolitycznej' jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (wyrażone odsetkiem komórek ulegających lizie3)
| Dawca | pożywka | IL-2b | IL-2c+IL-4 | IL-2d+IL-4+IL-10 |
| 1 | 12,7 | 27,6 | 35,0 | 45,7 |
| 2 | 5,4 | 26,3 | 17,5 | 33,7 |
| 3 | 1,7 | 25,1 | 14,1 | 36,0 |
| 4 | 3,8 | 29,6 | 14,1 | 22,1 |
| 5 | 33 | 47,1 | 17,1 | 63,8 |
| 6 | 6,6 | 49,5 | 20,6 | 40,8 |
| Średnia: | 5,5 ±1,6 | 34,2±4,5 | 19,7±3,2 | 40,3±5,7 |
a - % poddanych lizie, znakowanych 51cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu, przy stosunku E/T 20:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
- Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej uzyskane od zdrowych dawców inkubowano przez 3 dni z 20 jedn./mt IL-2. c - Pochodzące od dawcy PBMC inkubowano przez 3 dni z 20 jedn./ml IL-2 i 100 jedn-ml ludzkiej IL-4. d - Pochodzące od dawcy PBMC inkubowano przez 3 dni z 20 jednymi IL--21000 jednymi ludzkiej IL-4 i 4 ng/ml IL-10.
Przedstawione w tabeli 8 wyniki wskazują, że po inkubacji z 20 jedn./ml samej tylko IL-2 zdolność lityczna komórek LAK wynosi około 34,2%. Jeżeli od początku komórki te inkubowano dodatkowo w obecności 1000 jedn./ml ludzkiej IL-4 obserwowano około dwukrotne zmniejszenie ich zdolności cytolitycznej. Jednakże, jeżeli w czasie pierwszych 24 godzin inkubacji wprowadzono 4 ng/ml IL-10 nie obserwowano już supresyjnego oddziaływania IL-4.
Nie obserwowano statystycznie istotnej różnicy pomiędzy wynikami prób z zastosowaniem wyłącznie IL-2 i wszystkich trzech cytokin razem z p < 0.05, jak to oceniono w teście t-Studenta, co wskazuje na zdolność IL-10 do całkowitego zahamowania blokującego aktywację komórek efektorowych działania IL-4.
Przykłady ilustrujące kompozycje farmaceutyczne
Przykład II. Kompozycja do przaustrojrwego stymulowania aktywności cytolitycznej jednojądrzastych komórek krwi obwodowej ma postać roztworu i zawiera 4 ng/ml ludzkiej IL-10 w 0,9% roztworze soli fizjologicznej.
Przykład III. Kompnzyqa do pozaustrojowego stymulowania aktywności cytolitycznej jednojądrzastych komórek kiwi obwodowej ma postać roztworu i zawiera 40 ng/ml ludzkiej IL-10 w 0,9% roztworze soli fizjologicznej.
Przykład IV. Kompozycja do pozaustrojowego stymulowania aktywności cytolitycznej jednojądrzastych komórek krwi obwodowej ma postać roztworu i zawiera 4 ng/ml ludzkiej IL-10 i 2 jednostki (lub 20) IL-2/ml w 0,9% roztworze soli fizjologicznej.
Przykład V. Kompozycja do leczenia raka zawiera jednojądrzaste komórki krwi obwodowej uprzednio inkubowane in vitro z ludzką IL-10 przez 3 dni w 37°C, a następnie po usunięciu wolnej IL-10 z niewielką ilością IL-2 (około 2 jednostek/ml). Kompozycja zawiera od około 106 do około 1012 komórek zawieszonych w roztworze Hank’a. Kompozycja nadaje się do podawania pozajelitowego, korzystnie przez cewnik założony do żyły centralnej.
Dla specjalisty w tej dziedzinie wiedzy oczywiste jest, iż do metodologii stosowanej w obecnym wynalazku można wprowadzić wiele zmian wariantowych i modyfikacji, co jednak
175 343 nie zmienia w niczym jego istoty i znaczenia. Opisane tu konkretne wykonania wynalazku zostały przedstawione jedynie przykładowo a wynalazek jest jedynie ograniczony załączonymi zastrzeżeniami.
175 343
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz
Cena 4,00 zł
Claims (11)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, znamienny tym, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej inkubuje się w obecności samej interleukiny-10 lub interleukiny-10 w kombinacji z interleukiną-2 i/lub interferonem-a.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej inkubuje się z samą interleukiną-10.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej inkubuje się z interleukiną-10 i interleukiną-2.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej inkubuje się z interleukiną-10 i następnie z interleukiną-2.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jednojądrzaste komórki krwi obwodowej pochodzące od pacjenta z nowotworem.
- 6. Kompozycja farmaceutyczna do pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, znamienna tym, że zawiera interleukinę-10 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
- 7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera dodatkowo interleukinę-2 i/lub interferon-α.
- 8. Kompozycja według zastrz. 6 albo 7, znamienna tym, że jako interleukinę-10 zawiera ludzką interleukinę-10.
- 9. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów, znamienna tym, że zawiera aktywowane interleukiną-10 (IL-10) jednojądrzaste komórki krwi obwodowej i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
- 10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera dodatkowo samą IL-10 lub IL-10 kombinacji z interleukiną-2 i/lub interferonem-α.
- 11. Kompozycja według zastrz. 9 albo 10, znamienna tym, że jako interleukinę-10 zawiera ludzką interleukinę-10.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/IB1994/000008 WO1995019780A1 (en) | 1994-01-20 | 1994-01-20 | Use of il-10 to stimulate peripheral blood mononuclear cell cytolytic activity |
| CN94194863A CN1142186A (zh) | 1994-01-20 | 1994-01-20 | 用白介素-10激活外周血单核细胞的细胞溶解活性 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL315513A1 PL315513A1 (en) | 1996-11-12 |
| PL175343B1 true PL175343B1 (pl) | 1998-12-31 |
Family
ID=37708148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94315513A PL175343B1 (pl) | 1994-01-20 | 1994-01-20 | Sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, kompozycja farmaceutyczna do pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej i kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0740552A1 (pl) |
| JP (1) | JPH09508116A (pl) |
| CN (1) | CN1142186A (pl) |
| AU (1) | AU707019B2 (pl) |
| FI (1) | FI962813A0 (pl) |
| NO (1) | NO963029L (pl) |
| NZ (1) | NZ259584A (pl) |
| PL (1) | PL175343B1 (pl) |
| SK (1) | SK91696A3 (pl) |
| WO (1) | WO1995019780A1 (pl) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2356010A1 (en) | 1998-12-22 | 2000-06-29 | Schering Corporation | Treatment of hepatitis c virus infections with interleukin-10 |
| ES2367891T3 (es) | 2000-09-29 | 2011-11-10 | Schering Corporation | Interleucina-10 pegilada. |
| RU2322452C2 (ru) * | 2006-03-27 | 2008-04-20 | Михаил Николаевич Смирнов | Иммуномодулирующая композиция |
| CN101631560B (zh) * | 2006-09-28 | 2013-12-25 | 默沙东公司 | 聚乙二醇化的白细胞介素-10治疗癌的用途 |
| US20110044939A1 (en) * | 2007-06-27 | 2011-02-24 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Regulatory t cells in adipose tissue |
| ES2655364T3 (es) | 2008-12-17 | 2018-02-19 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Producción de IL-10 mono- y dipegilada y sus usos |
| MX2015014438A (es) | 2013-04-18 | 2016-05-18 | Armo Biosciences Inc | Metodos de uso de interleucina-10 para tratar enfermedades y trastornos. |
| US9823255B2 (en) | 2013-06-17 | 2017-11-21 | Armo Biosciences, Inc. | Method for assessing protein identity and stability |
| JP6509867B2 (ja) | 2013-08-30 | 2019-05-08 | アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | 疾患及び障害を治療するためにインターロイキン−１０を使用する方法 |
| EP3068425B1 (en) | 2013-11-11 | 2021-01-27 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
| WO2015187295A2 (en) | 2014-06-02 | 2015-12-10 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of lowering serum cholesterol |
| CN107001438A (zh) | 2014-10-14 | 2017-08-01 | 阿尔莫生物科技股份有限公司 | 白细胞介素‑15组合物及其用途 |
| CN107106655A (zh) | 2014-10-22 | 2017-08-29 | 阿尔莫生物科技股份有限公司 | 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法 |
| US10618970B2 (en) | 2015-02-03 | 2020-04-14 | Armo Biosciences, Inc. | Method of treating cancer with IL-10 and antibodies that induce ADCC |
| JP7121496B2 (ja) | 2015-05-28 | 2022-08-18 | アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | 癌治療で使用するためのペグ化インターロイキン－１０ |
| US10398761B2 (en) | 2015-08-25 | 2019-09-03 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using combinations of PEG-IL-10 and IL-15 for treating cancers |
| AU2022374787A1 (en) * | 2021-10-25 | 2024-05-02 | Ellennbe Gmbh | Pharmaceutical composition and kit comprising an immunomodulatory substance for treating diseases |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3260368B2 (ja) * | 1991-01-16 | 2002-02-25 | シェリング・コーポレーション | インターロイキン−１０による腫瘍性疾患の処置 |
| ATE124866T1 (de) * | 1991-01-16 | 1995-07-15 | Schering Corp | Verwendung von interleukin-10 in der adoptive immunotherapie von krebs. |
| US5055045A (en) * | 1991-03-18 | 1991-10-08 | Dickie Robert G | Disposable dental matrix retainer clamp |
-
1994
- 1994-01-20 NZ NZ259584A patent/NZ259584A/en unknown
- 1994-01-20 SK SK916-96A patent/SK91696A3/sk unknown
- 1994-01-20 CN CN94194863A patent/CN1142186A/zh active Pending
- 1994-01-20 WO PCT/IB1994/000008 patent/WO1995019780A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-01-20 PL PL94315513A patent/PL175343B1/pl unknown
- 1994-01-20 JP JP7519439A patent/JPH09508116A/ja active Pending
- 1994-01-20 AU AU58425/94A patent/AU707019B2/en not_active Ceased
- 1994-01-20 EP EP94904303A patent/EP0740552A1/en not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-07-11 FI FI962813A patent/FI962813A0/fi unknown
- 1996-07-19 NO NO963029A patent/NO963029L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1142186A (zh) | 1997-02-05 |
| WO1995019780A1 (en) | 1995-07-27 |
| NO963029L (no) | 1996-09-19 |
| SK91696A3 (en) | 1997-04-09 |
| AU707019B2 (en) | 1999-07-01 |
| EP0740552A1 (en) | 1996-11-06 |
| NZ259584A (en) | 1998-01-26 |
| AU5842594A (en) | 1995-08-08 |
| FI962813A (fi) | 1996-07-11 |
| FI962813A0 (fi) | 1996-07-11 |
| JPH09508116A (ja) | 1997-08-19 |
| PL315513A1 (en) | 1996-11-12 |
| NO963029D0 (no) | 1996-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL175343B1 (pl) | Sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, kompozycja farmaceutyczna do pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej i kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów | |
| Harshan et al. | In vivo depletion of natural killer cell activity leads to enhanced multiplication of Mycobacterium avium complex in mice | |
| US5443983A (en) | Method of culturing lymphocytes and method of treatment using such lymphocytes | |
| Brizzi et al. | Interleukin 3 stimulates proliferation and triggers endothelial-leukocyte adhesion molecule 1 gene activation of human endothelial cells. | |
| HU215389B (hu) | Eljárás hatóanyagként IL-4-et tartalmazó tömött tumorok kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására | |
| Kim et al. | Host CD25+ CD4+ Foxp3+ regulatory T cells primed by anti-CD137 mAbs inhibit graft-versus-host disease | |
| Ortaldo et al. | Adoptive cellular immunotherapy of human ovarian carcinoma xenografts in nude mice | |
| US5871725A (en) | Use of IL-10 to stimulate peripheral blood mononuclear cell cytolytic activity | |
| AU658588B2 (en) | TNF and IL-4 compositions | |
| Moore et al. | Susceptibility of human leukaemias to cell-mediated cytotoxicity by interferon-treated allogeneic lymphocytes | |
| Lotze et al. | Interleukin-2 as a pharmacologic reagent | |
| CZ205496A3 (cs) | Farmaceutický prostředek k léčení rakoviny, způsob jeho výroby a použití IL-10 k výrobě léčiv k antagonizaci blokády cytotoxiciny vyvolané IL-2 endogenním IL-4 | |
| Naganuma et al. | Antiproliferative cytokines secreted by lymphokineactivated killer cells stimulated with tumor cells | |
| Taub | Natural Killer Cell-Chemokine Interactions: Biologic Effects on Natural Killer Cell Trafficking and Cytolysis | |
| HUT78097A (hu) | IL-10 alkalmazása perifériás vér mononukleáris sejt citolitikus aktivitás stimulálására | |
| Steller | Enhancement and abrogation: modifications of host immune status influence IL-2 and LAK cell immunotherapy | |
| Kuramitsu et al. | Transforming growth factor beta 1 (TGF-beta 1) produced in tumour tissue after chemotherapy acts as a lymphokine-activated killer attractant | |
| CA2098509A1 (en) | Pharmaceutical compositions for the treatment of b-cell malignancies | |
| Hamprecht et al. | A dialysable acid factor from human leukocyte extracts activates tumor cell lysis mediated by human monocytes and natural killer cells | |
| Butler et al. | In vivo effects of recombinant human interleukin 2 on antitumor and antiviral natural immunity in induced or natural murine immunodeficiency states | |
| Veldhuis et al. | Interleukin-3: its role in the physiopathology of allergy and clinical use in oncology | |
| Hadden et al. | Cyclic nucleotides in the immunopharmacology of lipopolysaccharide endotoxins | |
| Eisenthal et al. | Effect of recombinant human tumor necrosis factor α on the induction of antibody-dependent cellular cytotoxicity in the treatment of established B16 melanoma liver nodules | |
| Puri et al. | In vitro and in vivo suppression of interleukin-2-activated killer cell activity by chimeric proteins between interleukin-2 and Pseudomonas exotoxin | |
| Frost | IN VlTRO CYTOKINE REGULATION BY A NOVEL |