JPH0695939B2

JPH0695939B2 - ウサギ癌壊死因子をコ−ドするクロ−ン化ｄνａ

Info

Publication number: JPH0695939B2
Application number: JP58228790A
Authority: JP
Inventors: 山田　　正明; 泰治古谷; 三津恵野竹
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1983-12-02
Filing date: 1983-12-02
Publication date: 1994-11-30
Anticipated expiration: 2009-11-30
Also published as: EP0146026A3; ES547436A0; ES8605578A1; PH26947A; DK572284A; EP0146026B1; ES8604309A1; DE3484125D1; JPS60120990A; AU3601484A; KR850004272A; ATE60933T1; ES538000A0; DK572284D0; US5043271A; KR920009523B1; AU577810B2; EP0146026A2

Description

【発明の詳細な説明】本発明はウサギ癌壊死因子をコードするクローン化DNA,
それらを組込んだベクターDNA及びそれらのベクターDNA
で形質転換された宿主に関する。

本明細書では記載の簡略化のために以下の略記を使用す
る。

A アデニン C シトシン G グアニン T チミン Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Met メチオニン Phe フェニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトファン Tyr チロシン Val バリン DNA デオキシリボ核酸 cDNA 相補DNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸オリゴ（dC）オリゴデオキシシチジル酸オリゴ（dG）オリゴデオキシグアニル酸オリゴ（dT）オリゴデオキシチミジル酸ポリ（Ａ）ポリアデニル酸ポリ（Ｕ）ポリウリジル酸ポリ（dA）ポリデオキシアデニル酸ポリ（dC）ポリデオキシシチジル酸ポリ（dG）ポリデオキシグアニル酸ポリ（dT）ポリデオキシチミジル酸 ATP アデノシン三リン酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸 kb キロ塩基 kbp キロ塩基対 Carswellらは、あらかじめbacillus Calmette-Gurin
（BCG）で感染させ、次いでエンドトキシンで処理した
マウスの血清中には、移植したMethA肉腫による癌を壊
死させる物質が含まれていることを見いだし、この物質
を癌壊死因子と名づけた［Proc.Nat.Acad.Sci.USA,72,3
666（1975）］。

癌壊死因子はマクロファージから放出される生理活性物
質と考えられており、その特徴としては、（ｉ）担癌動
物に投与するとある種の癌を壊死させ治癒せしめること
（ii）in vitroである種の癌細胞（例えばマウスの癌細
胞であるＬ細胞，ヒト癌由来のPC-10細胞）を傷害する
が、正常細胞にはほとんど有害な作用を及ぼさないこ
と、及び（iii）その作用が種特異的でないことが知ら
れている。このような特徴の故に癌壊死因子は、新しい
タイプの制癌剤としてその臨床的応用が強く期待されて
いる。

しかしながら、従来の癌壊死因子製造法はマウスやウサ
ギなどの動物にBCG又はPropionibacterium acnesを注射
し、次いでエンドトキシンを投与した後その血液及び体
液より癌壊死因子を単離精製するものであるため、安定
して多量の癌壊死因子を安価に得ることは難しい状況で
あった。

この問題点解決のため、近年進歩の著しい遺伝子組換え
技術の応用が考えられるが、その実施に際して必要な癌
壊死因子のアミノ酸配列やmRNAの採取方法に関する基礎
的知見はこれまで全く報告されていなかった。

そこで本発明者らは、まずウサギの体内に産生させた癌
壊死因子を単離精製し、その蛋白質化学的性質を明らか
にし、次いで、ウサギ肺胞マクロファージを用いてin v
itroで癌壊死因子mRNAを効率よく産生蓄積させる誘導条
件を見いだし、ウサギ癌壊死因子mRNAを精製濃縮した。
更に、遺伝子組換え技術を応用することにより、ウサギ
癌壊死因子をコードするcDNAをクローン化することに成
功して本発明を完成した。

本発明は、ウサギ癌壊死因子のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドをコードする塩基配列を有するDNA、特に下記
塩基配列（Ｉ）（５′）‐TCA GCT TCT CGG GCC CTG AGT GAC AAG CCT
CTA GCC CAC GTA GTA GCA AAC CCG CAA GTG GAG GGC CA
G CTC CAG TGG CTG AGC CAG CGT GCG AAC GCC CTG CTG
GCC AAC GGC ATG AAG CTC ACG GAC AAC CAG CTG GTG GT
G CCG GCC GAC GGG CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTT
CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC TAC GTG CTC CT
C ACT CAC ACT GTC AGC CGC TTC GCC GTC TCC TAC CCG
AAC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TG
C CAC CGG GAG ACC CCC GAG GAG GCT GAG CCC ATG GCC
TGG TAC GAG CCC ATC TAC CTG GGC GGC GTC TTC CAG TT
G GAG AAG GGT GAC CGG CTC AGC ACC GAG GTC AAC CAG
CCT GAG TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TA
C TTT GGG ATC ATT GCC CTG-（３′）（Ｉ）を有するDNAを提供するものである。

上記（Ｉ）で示されるDNAは、次のアミノ酸配列（II） Ser Ala Ser Arg Ala Leu Ser Asp Lys Pro Leu Ala Hi
s Val Val Ala Asn Pro Gln Val Glu Gly Gln Leu Gln
Trp Leu Ser Gln Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gl
y Met Lys Leu Thr Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ala
Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Se
r Gly Gln Gly Cys Arg Ser Tyr Val Leu Leu Thr His
Thr Val Ser Arg Phe Ala Val Ser Tyr Pro Asn Lys Va
l Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys His Arg
Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala Trp Tyr Gl
u Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
Gly Asp Arg Leu Ser Thr Glu Val Asn Gln Pro Glu Ty
r Leu Asp Leu Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly
Ile Ile Ala Leu （II）を有するポリペプチドをコードする。

上記DNA（Ｉ）は、その５′末端に下記塩基配列（III）（５′）‐CCC TCT GGA GAG AGC GCC ATG AGC ACT GAG
AGT ATG ATC CGG GAC GTC GAG CTG GCG GAG GGG CCG CT
C CCC AAG AAG GCA GGG GGG CCC CAG GGC TCC AAG CGC
TGC CTC TGC CTC AGC CTC TTC TCT TTC CTG CTC GTG GC
T GGA GCC ACC ACG CTC TTC TGC CTG CTG CAC TTC AGG
GTG ATC GGC CCT CAG GAG GAA GAG CAG TCC CCA AAC AA
C CTC CAT CTA GTC AAC CCT GTG GCC CAG ATG GTC ACC
CTC AGA-（３′）（III）を有していてもよい。更に、DNA（Ｉ）及びその５′末
端に（III）で示される塩基配列を有するDNA［以下DNA
（III＋Ｉ）という］は、５′末端にATGを有していても
よい。

DNA（Ｉ）の５′末端に上記（III）で示される塩基配列
を有するDNAは、ポリペプチド（II）に加えて（II）の
Ｎ末端に次のアミノ酸配列（IV） Pro Ser Gly Glu Ser Ala Met Ser Thr Glu Ser Met Il
e Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Gly Pro Leu Pro Lys
Lys Ala Gly Gly Pro Gln Gly Ser Lys Arg Cys Leu Cy
s Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala
Thr Thr Leu Phe Cys Leu Leu His Phe Arg Val Ile Gl
y Pro Gln Glu Glu Glu Gln Ser Pro Asn Asn Leu His
Leu Val Asn Pro Val Ala Gln Met Val Thr Leu Arg（I
V）を有するポリペプチド［以下ポリペプチド（IV＋II）と
いう］をコードする。DNA（Ｉ）の５′末端にATGで示さ
れる塩基配列を有するDNAは、ポリペプチド（II）に加
えて（II）のＮ末端にMetを有するポリペプチドをコー
ドし、DNA（III＋Ｉ）の５′末端にATGで示される塩基
配列を有するDNAは、ポリペプチド（IV＋II）に加えて
（IV＋II）のＮ末端にMetを有するポリペプチドをコー
ドする。

本発明には、上記DNA,それらを組込んだベクターDNA及
びそれらのベクターDNAで形質転換された宿主だけでな
く、上記DNAが対立遺伝子変異，遺伝子コードの縮重又
は一部の修飾を含む場合であっても、それらを組込んだ
ベクターDNAで形質転換された宿主により産生されるポ
リペプチドがウサギ癌壊死因子と等価の免疫学的又は生
物学的活性を示すポリペプチドである限り、上記DNAの
変異体，それらを組込んだベクターDNA及びそれらのベ
クターDNAで形質転換された宿主も又含まれる。なお、D
NAの一部の修飾を含む場合とは、上記DNAの一部が欠落
している場合及び上記DNAに他のDNA断片が付加している
場合を意味する。

以下に本発明を詳細に説明する。

（１）ウサギ癌壊死因子の単離精製参考例１に詳記したように、ウサギにPropionibacteriu
m acnesを投与し、更にエンドトキシンを投与すること
によりその体内に癌壊死因子を産生させ、その血液中よ
りイオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過等の組合
せによりウサギ癌壊死因子を単離精製した。ウサギ癌壊
死因子の同定はその生物学的活性を指標として行った。
用いた指標は（ｉ）マウスL-M細胞（ATCC CCL1.2）に対
する細胞傷害活性及び（ii）マウスに移植したMethA肉
腫に対する抗腫瘍活性である。これらの試験方法は例え
ば特開昭58-174330号に記載されている。

分離精製されたウサギ癌壊死因子についていて、その分
子量を8M尿素存在下及び非存在下における高速液体クロ
マトグラフィーによるゲル濾過分析で測定した。その結
果、ウサギ血漿由来の癌壊死因子の分子量は尿素非存在
下では約4.5万ダルトン、尿素存在下では単一のポリペ
プチドに解離し、その分子量は約1.6万ダルトンと求め
られた。尿素存在下、即ち完全解離状態の分子量がウサ
ギ癌壊死因子の基本構成単位の分子量であると考えられ
る。更に、Ｎ末端及びＣ末端を含む部分アミノ酸配列を
それぞれエドマン分解法並びにヒドラジン分解法とカル
ボキシペプチダーゼを用いる酵素法で解析した。その結
果、Ｎ末端及びＣ末端部分のアミノ酸配列は以下に示す
構造であることが明らかになった。

Ｎ末端:Ser-Ala-Ser-Arg-Ala・・・・・・・Ｃ末端：・・Val-Tyr-Phe-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu （２）ウサギ癌壊死因子mRNAの調製ウサギ癌壊死因子mRNAを得るには、まずウサギにPropio
nibacterium acnes,BCG,Zymosanのような網内系賦活剤
を静脈内又は腹腔内に注射する。投与７〜14日後にウサ
ギを屠殺し、肺胞，腹腔，血液，その他の組織からマク
ロファージを得る。このマクロファージを培養器面１cm
²当り約２×10⁴〜１×10⁶個播き、35〜38℃、好ましく
は約37℃、約５〜10％炭酸ガス含有空気中、湿度約90〜
100％で約30分〜２時間前培養する。次いでグラム陰性
菌より得られたエンドトキシン、例えば大腸菌，緑膿
菌，チフス菌由来のリポポリサッカライド及び蛋白合成
阻害剤（例えばシクロヘキシミド）を加え、更に培養を
３〜８時間継続してウサギ癌壊死因子mRNA合成を誘導蓄
積させる。なお前培養は省略してもよい。エンドトキシ
ンの添加量は、一般に約0.1〜1000μg/ml（最終濃度、
以下同じ）、好ましくは約１〜100μg/mlである。この
際、ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート，
ホルボール−12,13−ジデカノエート，ホルボール−12,
13−ジベンゾエートのようなホルボールエステル類を約
１〜2000ng/ml添加してもよい。蛋白合成阻害剤の添加
量は、化合物の種類等により異なるが、例えばシクロヘ
キシミドの場合、0.1〜50μg/mlである。培地として
は、高等動物細胞の培養に適した各種合成培地が用いら
れ、例えばRPMI-1640,イーグルのMEM培地，ダルベッコ
変法によるMEM培地（以上の培地の組成については、例
えば宗村庚修編「細胞培養マニュアル」，講談社,1982
年に記載されている）が挙げられる。培地には、全培養
液量の約１〜20％の動物血清（例えば牛胎児血清，子牛
血清）を加えておくのが好ましい。培養終了後、細胞よ
り常法、例えばChirgwinらの方法［Biochemistry,18,52
94（1979）］により全RNAを抽出し、次いでこれを常法
に従ってオリゴ（dT）セルロース又はポリ（Ｕ）セファ
ロース（ファルマシア社）などを用いる吸着カラムクロ
マトグラフィーに付すか又はバッチ法によりpoly（Ａ）
mRNA画分を分離する。このpoly（Ａ）mRNA画分を酸性尿
素アガロースゲル電気泳動又はショ糖密度勾配遠心分離
に付すことによりウサギ癌壊死因子mRNAを濃縮精製する
ことができる。

ここに得られたmRNAが目的とするウサギ癌壊死因子をコ
ードするものであることを確認するためにはmRNAを蛋白
質に翻訳させてその生物活性を調べればよい。例えばア
フリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞，網状
赤血球ライセート，小麦胚芽のような適当な蛋白合成系
にmRNAを注入又は添加して蛋白質に翻訳させ、その蛋白
質がマウスL-929細胞に対して細胞傷害活性を示すこと
及びこの細胞傷害活性が前述のウサギ血漿から単離した
精製ウサギ癌壊死因子に対する抗体により中和されるこ
とを確認することにより行われる。なお、アフリカツメ
ガエルの卵母細胞を用いる方法は、例えば次のようにし
て行われる。卵母細胞１個当り約50ngのmRNAをマイクロ
インジェクション法で注入し、その10個を100μｌのバ
ース培養液［Gurdon,J.B.,J.Embryol.Exp.Morphol.,20,
401（1968）］中、22℃で24時間培養し、ホモジナイズ
した後、その遠心上清液（10,000rpm,10分間）を検体と
して、L-929細胞傷害活性を指標として癌壊死因子活性
を測定する［L-929細胞傷害活性の測定法はRuff,M.R.,e
t al.,J.Immunol.,125,1671（1980）に記載されてい
る］。

本発明のウサギ癌壊死因子をコードするmRNAは次の性質
により特徴づけられる。

1.6〜2.7kbの大きさを有する。

３′末端にポリアデニル酸構造を有する。

ウサギ癌壊死因子のポリペプチドをコードする。

（３）ウサギ癌壊死因子cDNAのクローニング（２）の工程で得られたmRNAを鋳型とし、オリゴ（dT）
又はウサギ癌壊死因子の部分アミノ酸配列に対応すると
考えられる塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを
プライマーとして、DATP,dGTP,dCTP,dTTPの存在下で逆
転写酵素（例えばトリ骨髄性白血病ウイルス由来逆転写
酵素）によりmRNAと相補的な単鎖cDNAを合成し、アルカ
リ処理で鋳型mRNAを分解，除去する。次いでこの単鎖cD
NAを鋳型にして、逆転写酵素あるいは大腸菌DNAポリメ
ラーゼＩ（ラージフラグメント）を用いて二重鎖cDNAを
合成する。ここに得られたDNAを、ポリ（dG）−ポリ（d
C）又はポリ（dA）−ポリ（dT）ホモポリマー伸長法［N
oda,M.,et al.,Nature,295,202（1982）;Nelson,T.S.,
“Methods in Enzymology",68,41（1979）,Academic Pr
ess Inc.,New York］のような常法に従って、例えばプ
ラスミドpBR322の制限酵素PstI切断部位に組込ませる。
得られた組換えプラスミドを、例えばCohenらの方法［P
roc.Nat.Acad.Sci.USA,69,2110（1972）］に準じて例え
ばE.coli X 1776株のような宿主に導入して形質転換さ
せ、テトラサイクリン耐性株を選択してcDNAライブラリ
ーを作製する。

このcDNAライブラリーについて、プラス・マイナス法に
よるコロニー・ハイブリダイゼーション試験［Hanahan,
D.,et al.,Gene,10,63（1980）］により、目的のクロー
ンをスクリーニングする。即ち、（２）の工程で得られ
たウサギ癌壊死因子mRNAを鋳型として³²P標識cDNAを合
成し、誘導プラス・プローブとする。別途に、正常無処
置ウサギより得た肺胞マクロファージを材料にして、癌
壊死因子mRNAの誘導操作を除いて同様の操作を行って抽
出濃縮したmRNAを鋳型として³²P標識cDNAを合成し、誘
導マイナス・プローブとする。前述のcDNAライブラリー
の中から、誘導プラス・プローブと強く結合し、誘導マ
イナス・プローブとはほとんど結合しないクローンを選
択する。ここに得られたクローンからプラスミドDNAを
分離し、加熱又はアルカリ変性により単鎖cDNAとしニト
ロセルロースフィルターに固定する。これにウサギ癌壊
死因子mRNAを含むmRNA画分を加えハイブリダイズさせた
後、結合したmRNAを溶出回収し、これをアフリカツメガ
エルの卵母細胞に注入し、回収されたmRNAがウサギ癌壊
死因子をコードしているか否かを試験する（以下ハイブ
リダイゼーション・トランスレーション試験という）。
以上の方法によりウサギ癌壊死因子のmRNAと相補性のあ
る塩基配列を含むDNA断片を組込んだクローン化DNAプラ
スミドを含む形質転換株を得ることができる。

更に、この形質転換株のクローン化DNA断片を適当な制
限酵素で切り出し、³²Pで標識したものをプローブとし
て用い、前述のcDNAライブラリーを再スクリーニングす
ることにより、より大きなサイズのcDNAを選択してもよ
い。

このようにして得られた多くのクローン化DNA断片につ
いて、例えばMaxam-Gilbert法［Proc.Nat.Acad.Sci.US
A,74,560（1977）］に従って塩基配列を解析し、既に明
らかになっているウサギ癌壊死因子の部分アミノ酸配列
（Ｎ末端及びＣ末端を含む）をコードする塩基配列を探
し、最終的に癌壊死因子の全翻訳領域に対応する塩基配
列［前記において（Ｉ）で示された塩基配列］を含むcD
NAを選び出すことにより、ウサギ癌壊死因子のアミノ酸
配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列を有する
クローン化DNAを得ることができる。

本発明のクローン化DNAを適当に処置した後、適当な形
質発現ベクターに組込んでウサギ癌壊死因子生産用ベク
ターを得ることができる。ベクターとしては、形質転換
させる微生物中で増殖するものはすべて用いることがで
きる。例えばプラスミド（大腸菌プラスミド,pBR322な
ど），ファージ（ラムダファージ誘導体など），ウイル
ス（SV40など）が挙げられる。これらは単独で、又はそ
れらの組合せ、例えばpBR322-SV40ハイブリッドプラス
ミドなどの形で用いてもよい。そのDNAの組込み部位も
任意に選択することができる。即ち、適当な形質発現ベ
クターの適当な位置を常法により適当な制限酵素を作用
させて開裂させ、その開裂部位に該クローン化DNAを適
当な長さに処理して組込むことができる。

上記クローン化DNAを組込んだベクターを常法により適
当な宿主に作用させて形質転換させることにより形質発
現宿主が得られる。形質発現用オペロンとしては、例え
ばβ−ガラクトシダーゼ，トリプトファン，β−ラクタ
マーゼ，アルカリホスファターゼなどのオペロンが挙げ
られる。更に、形質転換に用いられる宿主としては、例
えば大腸菌，枯草菌，酵母などの微生物及びCOS monkey
細胞などの培養細胞が挙げられる。

本発明のクローン化DNAは、ヒトを含む異種動物の癌壊
死因子DNAのクローニングにおいてプローブ又はプライ
マーとして極めて有用であり、かつそれ自体が癌壊死因
子生産微生物又は細胞を作るための材料となる。

以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。

実施例（１）ウサギ肺胞マクロファージからのmRNA分画の単離
精製ウサギ（体重約2.5kg）にPropionibacterium acnes死菌
体を１羽当り100mgの投与量で静脈内に注入し、８日後
に屠殺した。直ちに開胸気管切開し、気管内に挿入した
チューブを介してリン酸緩衝化生理食塩液を用い肺洗浄
を繰返し、肺胞マクロファージを採取した。12羽のウサ
ギより約３×10⁹個の肺胞マクロファージが得られた。
この肺胞マクロファージを10％牛胎児血清含有のRPMI-1
640培地に懸濁させてペトリディッシュ（直径8cm）に１
枚当り２×10⁷個となるように播き、37℃で５％炭酸ガ
ス含有空気中、湿度90〜100％で前培養した。１時間の
前培養の後、エンドトキシン（大腸菌由来のリポポリサ
ッカライド）,TPA（ホルボール−12−ミリステート−13
−アセテート）及びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃
度が10μg/ml,10ng/ml及び１μg/mlとなるように添加混
和し、更に培養を継続した。４〜4.5時間後（通算５〜
5.5時間）に培養液を吸引除去し、ディッシュ上に残っ
たマクロファージを0.6％ラウロイルサルコシン酸ナト
リウムと6mMクエン酸ナトリウムを含有する5Mグアニジ
ルチオシアネート液で溶解しホモジナイズした。このホ
モジネートを0.1M EDTA含有5.7M塩化セシウム水溶液上
に重層し、超遠心分離機（RPS27-2ローター，日立製作
所）を用い26,500rpmで20時間遠心し全RNA画分をペレッ
トとして得た。これを0.35M NaCl,20mM Tris及び20mM E
DTAを含む7M尿素液の少量に溶解し、エタノール沈殿と
して回収した。12羽のウサギより全RNAとして5.2mgが得
られた。

この全RNA画分を1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl緩衝液
（pH7.4）（以下TE液という）2mlに溶解し、65℃で５分
間加熱した。これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加えた
後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平衡化したオリ
ゴ（dT）セルロースカラムに付し、吸着したpoly（Ａ）
mRNAをTE液で溶出することにより、314μｇのpoly
（Ａ）mRNAを得た。ここで得たpoly（Ａ）mRNAの200μ
ｇをアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％,6M尿素存
在下,pH4）に付し、その分子サイズに従って７つの画分
に分け、ゲルを融解（70℃,10分間）させた後、水飽和
フェノールによる抽出とクロロホルムによる抽出のの
ち、エタノールにより沈殿させて各画分よりpoly（Ａ）
mRNAを回収した。各画分のpoly（Ａ）mRNAについてアフ
リカツメガエルの卵母細胞を用いる方法でウサギ癌壊死
因子mRNA量を測定し、分子サイズとして1.6〜2.7kbに相
当する画分にウサギ癌壊死因子mRNAを高濃度に回収し
た。この精製poly（Ａ）mRNAの比活性は約1,230単位／
μgRNAであり、未精製poly（Ａ）mRNA調製品の比活性約
320単位／μgRNAに比べて約４倍に濃縮された（第１
図）。

この精製poly（Ａ）mRNAを鋳型としてアフリカツメガエ
ルの卵母細胞の中で翻訳合成された蛋白質がウサギ血漿
から調製した癌壊死因子と同一であることを参考例３で
調製した精製抗ウサギ癌壊死因子抗体を用いて確認し
た。即ち、poly（Ａ）mRNAをアフリカツメガエルの卵母
細胞に注入し、バース培養液で22℃,24時間培養した
後、ホモジナイズしその遠心上清液を検体とした。この
検体100μｌに精製抗ウサギ癌壊死因子抗血清20μｌを
加え、37℃で２時間反応させた後、L-929細胞に対する
細胞傷害活性を測定した。その結果、抗体非存在下では
1,267単位/mlを示したが、抗体存在下では１単位/ml以
下となり、ほぼ完全に中和された。第２図に測定結果を
ウサギ血漿由来癌壊死因子の場合と対比させて示した。
図中、●はアフリカツメガエルの卵母細胞中でmRNAから
翻訳されたウサギ癌壊死因子の細胞傷害活性を、○はウ
サギ血漿由来癌壊死因子の細胞傷害活性を、点線は抗体
存在下の場合を、実線は抗体非存在下の場合を示す。

ここで得られた精製poly（Ａ）mRNAを以下の実験に用い
た。

（２）cDNAの合成精製poly（Ａ）mRNA 4μｇを用い以下に示す条件でcDNA
を合成した。

反応液量;100μｌ 50mM Tris-HCl緩衝液（pH8.3）;10mM MgCl₂;70mM KCl;1
mMジチオスレイトール;0.5mM dTTP,dCTP,dATP,dGTP（但
しdCTPは³²Pで標識，比活性4.4×10⁶cpm/nmole）;3μｇ
オリゴ(dT)_12〜18,80単位トリ骨髄性白血病ウイルス由
来逆転写酵素。

43℃で90分間反応させた後、EDTA水溶液で反応を停止さ
せた。フェノール−クロロホルム混液（1:1）によりcDN
A-mRNA複合体を抽出し、エタノールにより沈殿させ回収
した。更に、アルカリ加温処理することによりmRNAを分
解除去した後、合成された単鎖cDNAをエタノールにより
沈殿させ回収した。

この単鎖cDNAの沈殿を下記組成の反応緩衝液40μｌに溶
解した。

反応緩衝液； 0.5mM dATP,dTTP,dGTP,dCTP;5mMMgCl₂;70mM KCl;1.5mM
β−メルカプトエタノール;8単位大腸菌DNAポリメラー
ゼＩ（ラージフラグメント）を含有する0.1MHepes緩衝
液（pH6.9）。

15℃で20時間反応させ二重鎖cDNAを合成した。反応液に
ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を加えて反応を停止さ
せ、二重鎖cDNAをフェノール−クロロホルム混液で抽出
し、エタノールにより沈殿させ回収した。

得られた二重鎖cDNAの沈殿を、50mM酢酸ナトリウム（pH
4.5）,1mM ZnSO₄,200mM NaCl,0.5％グリセロール及びS1
ヌクレアーゼ0.5単位を含有する水溶液100μｌに溶解
し、37℃で20分間反応させてヘアピン構造を開裂させ
た。反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール
−クロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出し
た後、エタノールにより沈殿させcDNAを回収した。

（３）オリゴ（dC）テール付加cDNAの調製上記により得られた二重鎖cDNAに次の組成の反応緩衝液
100μｌを加え37℃で20分間反応させ、二重鎖cDNAにオ
リゴ（dC）テールを付加させた。

反応緩衝液； 1mM CoCl₂,0.1mMジチオスレイトール,0.2μｇポリ
（Ａ）,0.1mM ³H‐dCTP（比活性5400cpm/pmol）及び10
単位ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼを含有する130mMカコジル酸ナトリウム−30mM Tris
-HCl緩衝液（pH6.8）。

反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール−ク
ロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出した
後、オリゴ（dC）テール付加cDNAをエタノールにより沈
殿させ回収した。これを10mM Tris-HCl緩衝液（pH7.
4）,1mM EDTA及び100mM NaClを含む水溶液に1ml当り0.2
μｇのオリゴ（dC）テール付加cDNAを含むように溶解し
た。

（４）オリゴ（dG）テール付加プラスミドpBR322DNAの
調製 20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.4）,10mM MgCl₂,50mM(NH₄)₂
SO₄及び1ml当り0.1mgのウシ血清アルブミンを含む水溶
液100μｌにpBR322を10μｇ溶解し、制限酵素PstIエン
ドヌクレアーゼ15単位を加え、37℃で１時間反応させ
た。反応終了後、反応液をフェノール抽出し、水層から
エタノール沈殿によってDNAを回収した。得られたDNAを
前述のオリゴ（dC）テール付加に用いた水溶液（但し³H
‐dCTPの代りに³H‐dGTPを含む）200μｌに溶解し、タ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ80
単位を用いて37℃で20分間反応させ、約10〜15個のdG残
基を取り込ませた。反応液を水飽和フェノール−クロロ
ホルム混液で抽出し、水層からエタノール沈殿によって
オリゴ（dG）テール付加プラスミドpBR322DNAを回収し
た。これをオリゴ（dC）テール付加cDNAの場合と同様の
緩衝液に1ml当り２μｇのオリゴ（dG）テール付加プラ
スミドpBR322DNAを含むように溶解した。

（５）組換え体プラスミドの作製オリゴ（dC）テール付加cDNA溶液50μｌをオリゴ（dG）
テール付加pBR322DNA溶液50μｌと混合し、65℃で10分
間、57℃で120分間、45℃で60分間、35℃で60分間及び
室温で60分間インキュベートしてアニーリングを行い、
組換え体プラスミド溶液を調製した。

（６）形質転換体の選択上記で得られた組換え体プラスミド溶液を用い、E.coli
x1776株を形質転換させた。即ち、E.colix1776株を、ジ
アミノピメリン酸100μg/ml及びチミジン40μg/mlを補
ったＬ−ブロス20ml中、37℃で吸光度（600nm）が0.5と
なるまで培養し、菌体を冷却器付遠心分離機で集め、50
mM CaCl₂含有10mM Tris-HCl緩衝液（pH7.3）10mlに分散
し、０℃で再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同じ
緩衝液2mlに分散し、０℃で５分間静置した。この分散
液0.2mlに上記組換え体プラスミド溶液0.1mlを添加混合
し、０℃で15分間静置し、更に42℃で２分間保持した
後、前の培養で用いたのと同一組成のＬ−ブロス0.5ml
を加えて１時間振盪培養を行った。この培養液の一部を
取り、前述の成分の他にテトラサイクリン15μg/mlを含
むＬ−ブロス寒天平板に広げ37℃で約12時間培養し、テ
トラサイクリン耐性菌を選択してcDNAライブラリーを作
製した。

（７）ハイブリダイゼーション試験前記のcDNAライブラリーについて、ウサギ癌壊死因子を
コードするcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体をス
クリーニングするため³²P標識cDNAプローブを用いるコ
ロニー・ハイブリダイゼーション試験をHanahanらの方
法［Gene,10,63（1980）］に従って行った。³²P標識cDN
Aプローブは、誘導プラス及びマイナス肺胞マクロファ
ージより上記（１）項の方法で得たmRNAを鋳型として、
（２）項の方法で合成した。但し、³²P‐dCTPは高放射
能比活性のものを用い、高濃度に標識した。この試験に
より誘導プラスのプローブと強く結合し、誘導マイナス
のプローブとはハイブリダイズしない塩基配列を含む組
換え体プラスミドを有する形質転換体を選別した。約２
万個のコロニーから50個のコロニーが選び出された。

次いで、これらの選択された菌株についてハイブリダイ
ゼーション・トランスレーション試験をManiatis,T.,et
al.,（ed）“Molecular Cloning",329（1980）,Cold S
pring Harbor Lab.,に記載の方法に従って行った。それ
ぞれの形質転換体よりプラスミドDNAを抽出し、ニトロ
セルロースフィルター上に加熱変性させたのち固定し、
これに上記（１）項で得たウサギ癌壊死因子mRNAを含む
poly（Ａ）mRNA画分を加え、50℃で180分間反応させ、
ハイブリダイゼーションを行った。結合したmRNAを溶出
回収した後アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、回
収されたmRNAがウサギ癌壊死因子mRNAであるか否かを検
定した。この試験により、上記で選択された20個の形質
転換体よりウサギ癌壊死因子mRNAと強くハイブリダイズ
するcDNAを含むプラスミドを持つ菌株３個を見いだし
た。そのうち最も長いcDNA（約750bp）を有するプラス
ミドより、制限酵素DdeIでDNA断片を切り出し、二次ス
クリーニング用のプローブとした。このDNA断片を³²Pで
標識し、上記（６）項で得たcDNAライブラリーについて
再度コロニー・ハイブリダイゼーション試験を行い、標
識プローブと強く結合するcDNAを含むプラスミドを持つ
形質転換体を選んだ。cDNAライブラリーの約６万個のコ
ロニーのうち98個が陽性コロニーであった。これらから
cDNAを制限酵素PstIで切り出し、そのサイズをポリアク
リルアミドゲル電気泳動で調べ、1kbp以上のサイズを有
する17個のクローンを選び出した。これらのうち最も大
きなcDNAを含む形質転換体（菌体番号:RTNF802,クロー
ン化DNA番号:pRTNF802）について、クローン化DNAを単
離し、後述の方法で塩基配列を決定した。

（８）クローン化DNAの塩基配列の決定（７）項で選択された菌株（RTNF802）をジアミノピメ
リン酸及びチミジンを添加したＬ−ブロスで培養して菌
体を得た。この菌体をWilkieらの方法［Nucleic Acids
Res.,7,859（1979）］に従って処理し、プラスミドDNA
を得た。このプラスミドDNAを制限酵素PstIで分解し、
精製分離してクローン化DNAを得た。このクローン化DNA
断片を種々の制限酵素で分解し、適当な制限酵素断片に
ついてそれぞれの塩基配列をMaxam−Gilbert法により脱
リン酸化，³²Pによる末端標識，塩基特異的化学分解反
応，ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーから決定
した。

第３図に塩基配列決定に用いた制限酵素切断部位と塩基
配列を決定した方向及び範囲を矢印で示す。

はウサギ癌壊死因子の翻訳領域をコードする部分を示
す。

その塩基配列は第１表の通りである。第１〜15番はcDNA
をベクターに組込むために付加したＧ連鎖テールであ
る。第16〜276番は癌壊死因子の前駆体を構成するに必
要なポリペプチドをコードすると推定される塩基配列で
ある。第277〜291番の塩基はウサギ癌壊死因子のＮ末端
に相当するアミノ酸配列をコードし、第715〜738番目の
塩基はＣ末端部分のアミノ酸配列をコードしているＣ末端アミノ酸（ロイシン）のコドンに続いて終止コド
ン（TGA）がある。

ウサギ癌壊死因子のポリペプチドをコードする領域の塩
基配列（第277〜738番）から翻訳されるアミノ酸残基数
は154個であり、その組成及び計算分子量は第２表に示
す通りである。第２表から明らかなように、参考例１に
記載の方法で得た精製ウサギ癌壊死因子のアミノ酸組成
及び測定分子量と測定誤差の範囲内で一致した。なお、
表中のカッコ内の数値は分析値を四捨五入した整数値を
表す。

参考例１ウサギ癌壊死因子の単離精製ウサギ（体重2.5〜3.0kg）にPropionibacterium acnes
死菌体50mgを耳静脈より注射した。８日後にエンドトキ
シン（大腸菌由来のリポポリサッカライド）100μｇを
耳静脈より注射し、２時間後に心臓より全採血した。採
取した血液に100ml当り100単位のヘパリンナトリウムを
加えた後、5,000rpmで30分間冷却遠心操作を行い、血球
及び不溶固形物を除去した。400羽のウサギより3,000単
位/mlの力価を有する血漿24lが得られた。

この血漿24lにEDTA24g及びセライト240gを加え１時間攪
拌した後、孔径３μ,1μ及び0.2μのフィルターで順次
濾過した。

濾液24lに0.04M Tris-HCl緩衝液（pH7.8）12lを加えた
後、0.1M NaClを含む0.04M Tris-HCl緩衝液（pH7.8）で
十分に平衡化したDEAE−セファロースCL-6B（ファルマ
シア社）のカラム（27×45cm）に徐々に付した。次いで
カラム平衡化緩衝液75l及び0.15M NaClを含む0.04M Tri
s-HCl緩衝液（pH7.8）50lで順次洗浄後、0.18M NaClを
含む0.04M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）を用いて溶出し
た。溶出液は8lずつ分画して活性画分を集めた。この活
性画分に同容量の0.04M Tris-HCl緩衝液（pH7.8）を加
えて希釈した後、DEAE−セファロースCL-6Bのカラム（1
0×13cm）に付した。次いで0.1M NaClを含む0.04M Tris
-HCl緩衝液（pH7.8）１を用いて洗浄した後、0.18M N
aClを含む0.04M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）5lを用いて溶
出した。溶出液は250mlずつ分画して活性画分を集め
た。

次にこの溶出液を容器に移し70℃の湯浴中に浸し、攪拌
しながら溶出液の温度が60℃になるまで加熱した。その
後60℃の別の湯浴に移し、30分間加熱処理した後、速や
かに４℃に冷却した。加熱処理した溶液は、限外濾過に
より濃縮した。

0.1M NaClを含む0.005Mリン酸緩衝液（pH7.4）で十分に
平衡化したセファクリルS-200（ファルマシア社）のカ
ラム（５×80cm）に上記濃縮液を付し、同緩衝液で溶出
した。40mlずつ分画して活性画分を採取し、限外濾過に
より濃縮した。

ゲル濾過によって得られた活性画分の濃縮液をZn²⁺キレ
ートセファロースカラムに付した。Porath,J.,et al.,N
ature,258,598（1975）に記載の方法で得られたキレー
トセファロース（イミノジ酢酸固定化樹脂）を充填した
カラム（1.6×20cm）に、1mg/mlの塩化亜鉛水溶液120ml
を流した。次いで0.1M NaClを含む0.05Mリン酸緩衝液
（pH7.4）で十分に平衡化した後、前工程で得られた濃
縮液を付し、同緩衝液で溶出した非吸着画分を採取し
た。活性はこの画分にはほとんどが回収された。

前精製工程で得られた活性画分を濃縮し、0.15M NaClを
含む0.005Mリン酸緩衝液（pH7.4）で十分に平衡化した
トヨパールHW-55（東洋ソーダ株式会社）のカラム（1.5
×90cm）に付した。同緩衝液で溶出し活性画分を採取し
た。全精製工程を通しての活性の回収率は60％、精製度
は7.5×10⁴倍であった。このようにして得られた精製ウ
サギ癌壊死因子の比活性は6.0×10⁶単位/mg蛋白質であ
った（活性単位の定義は特開昭58-174330号のそれと同
じである）。また、マウスに移植したMeth A肉腫を用い
る生物評価において、１匹当り3,000〜5,000単位を静脈
内に投与した場合の活性は（＋）以上であった。

参考例２ウサギ癌壊死因子の性質（１）分子量測定参考例１で得られた精製ウサギ癌壊死因子について、TS
K-G3000SWカラム（東洋ソーダ株式会社）を用い高速液
体クロマトグラフィーにより分子量を決定した。溶媒に
は、0.2Mリン酸緩衝液（pH7）及び8M尿素と0.5％β−メ
ルカプトエタノールを含有する同緩衝液を用いた。下記
の分子量測定用標準蛋白質を用いて分子量検量線を作成
し、分子量を測定した：ウシ血清アルプミン（6.6×10⁴），ウサギ・トリオース
ホスフェートイソメラーゼ（5.3×10⁴），オボアルブ
ミン（4.5×10⁴），ブタ・ペプシン（3.27×10⁴），大
豆トリプシンインヒビター（2.05×10⁴），ウマ・ミ
オグロビン（1.78×10⁴），ウマ・チトクロームＣ（1.2
4×10⁴）［カッコ内の数値は分子量（ダルトン）を示
す］。

その結果、ウサギ癌壊死因子の分子量は尿素非存在下で
は約4.5万ダルトン、尿素存在下では約1.6万ダルトンで
あった。

（２）アミノ酸組成精製ウサギ癌壊死因子を常法に従って塩酸加水分解した
後、オルトアルデヒドを用いた蛍光法による微量アミノ
酸分析システム（島津製作所）により各アミノ酸を定量
した。精製ウサギ癌壊死因子15〜30μｇを6N塩酸中、11
0℃で、24,48,72時間加熱し、加水分解した。各アミノ
酸の含量値は３時点の平均値及び補正値（Ser,Thr,Val,
Ile）より求めた。

結果は第２表（前出）に示す通りである。

（３）アミノ酸配列決定ｉ）精製ウサギ癌壊死因子のＮ末端部分のアミノ酸配列
はエドマン分解法（Arch.Biochem.Biophys.,22,475（19
49）］により決定した。

精製ウサギ癌壊死因子0.3mgをフェニルイソチオシアネ
ートと反応させ、Ｎ末端より順次分解した後、遊離して
くるフェニルチオヒダントインのアミノ酸誘導体をZorb
ax ODSカラム（4.6×250mm,ジュポン社）を用いた高速
液体クロマトグラフィーにより同定し、Ｎ末端部分のア
ミノ酸配列を決定した。

ii）Ｃ末端部分のアミノ酸配列はヒドラジン分解法とカ
ルボキシペプチダーゼを用いる酵素法により決定した。

ヒドラジン分解は赤堀の方法［Bull.Chem.Soc.Jap.,25,
214（1952）］に従い、精製ウサギ癌壊死因子30μｇを
無水ヒドラジン100μｌ中、100℃で９時間分解した後、
ベンズアルデヒド処理してアミノ酸のヒドラジド誘導体
を除去し、アミノ酸分析した。更に、精製ウサギ癌壊死
因子にカルボキシペプチダーゼＡとＹ（酵素と基質の比
はそれぞれ1:25と1:1000）を作用させ、反応開始後２分
から180分間にわたり経時的に遊離してくるアミノ酸を
分析した。

その結果、Ｎ末端及びＣ末端部分のアミノ酸配列は以下
に示す構造であることが明らかになった。

Ｎ末端:Ser-Ala-Ser-Arg-Ala・・・・・Ｃ末端：・・Val-Tyr-Phe-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu 参考例３抗ウサギ癌壊死因子抗体の作製参考例１で得られた精製ウサギ癌壊死因子1.9×10⁵単位
を含む溶液を等量のフロインドの完全アジュバントで乳
濁化し、それをモルモットの背部皮下数カ所に注射し
た。その後、1,3及び６週後に同様の方法で免疫した。
更に８週後に、同量の精製ウサギ癌壊死因子を水酸化ア
ルミニウムゲルとともに腹腔内に注射した。最初の免疫
から９週後に心臓より全採血し、遠心分離により血清を
分離することによって抗ウサギ癌壊死因子抗体を含む抗
血清を得た。

この抗血清を、正常ウサギ血清成分を吸着させたセファ
ロース4B（ファルマシア社）カラムに３回繰返して通過
させることにより非特異的な抗体を除去し、ウサギ癌壊
死因子に対する特異抗体のみを含む精製抗血清を得た。
この抗血清は、免疫電気泳動法及びゲル内二重拡散法に
より精製ウサギ癌壊死因子との間にのみ単一の沈降線を
形成した。この精製抗血清を約60,000倍希釈したもの
は、ウサギ癌壊死因子のL-M細胞傷害活性100単位を50％
中和する能力を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図はウサギ癌壊死因子mRNAの酸性尿素アガロースゲ
ル電気泳動による分画図であり、第２図はウサギ癌壊死
因子mRNAの注入によりアフリカツメガエルの卵母細胞中
で翻訳されたウサギ癌壊死因子のL-929細胞傷害活性が
抗ウサギ癌壊死因子抗体により中和されることを示す図
であり、第３図はウサギ癌壊死因子をコードするクロー
ン化DNA（pRTNF802）の塩基配列決定に用いた制限酵素
切断部位の位置と大きさを示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のアミノ酸配列を含むウサギ癌壊死因
子ポリペプチドをコードするDNA。 Ser Ala Ser Arg Ala Leu Ser Asp Lys Pro Leu Ala Hi
s Val Val Ala Asn Pro Gln Val Glu Gly Gln Leu Gln
Trp Leu Ser Gln Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gl
y Met Lys Leu Thr Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ala
Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Se
r Gly Gln Gly Cys Arg Ser Tyr Val Leu Leu Thr His
Thr Val Ser Arg Phe Ala Val Ser Tyr Pro Asn Lys Va
l Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys His Arg
Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala Trp Tyr Gl
u Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
Gly Asp Arg Leu Ser Thr Glu Val Asn Gln Pro Glu Ty
r Leu Asp Leu Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly
Ile Ile Ala Leu （II）
【請求項２】ウサギ癌壊死因子ポリペプチドをコードす
るDNAが下記の塩基配列を含むDNAである特許請求の範囲
第（１）項記載のDNA。（５）‐TCA GCT TCT CGG GCC CTG AGT GAC AAG CCT CT
A GCC CAC GTA GTA GCA AAC CCG CAA GTG GAG GGC CAG
CTC CAG TGG CTG AGC CAG CGT GCG AAC GCC CTG CTG GC
C AAC GGC ATG AAG CTC ACG GAC AAC CAG CTG GTG GTG
CCG GCC GAC GGG CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTT CT
C TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC TAC GTG CTC CTC
ACT CAC ACT GTC AGC CGC TTC GCC GTC TCC TAC CCG AA
C AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC
CAC CGG GAG ACC CCC GAG GAG GCT GAG CCC ATG GCC TG
G TAC GAG CCC ATC TAC CTG GGC GGC GTC TTC CAG TTG
GAG AAG GGT GAC CGG CTC AGC ACC GAG GTC AAC CAG CC
T GAG TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC
TTT GGG ATC ATT GCC CTG-（３′）（Ｉ）