JPS62500631A - ヒト腫瘍壊死因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト腫瘍壊死因子 加ｂ１ この発明はヒト蛋白質因子の組換生産に関する。これは特に、腫瘍に対して選択 的に毒性である蛋白質及び比活性について改良されているそのミューティンの製 造に関する。

茸１皿歪 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）としてよく知られるようになった因子は最初Ｃａｒｓｗ ｅｌｌ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、　（ＵＳＡ）　（１９７ ５）７２　：　３６６６により見出された。バシルス・カルメツチーブリン（Ｂ ａｃｔｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｒｉｎ）（ＢＣＧ）のごとき免疫増強 剤によりあらかじめ怒作されたマウス、ラビット又はラットであってエンドトキ シン処理されたものの血清が、移植された腫瘍を担持するマウスに注射された場 合に受容者に不所望の副作用を伴わないで該腫瘍の広範な出血を惹起する物質を 含有することが見出された。従って、この血清は腫瘍細胞に対して選択的に壊死 作用を有しそして正常なＭｌｗｉとのその反応については中立的であり、それ故 にＴＮＦと称される物質を含有することが予想された。全体動物に注射された場 合にこの選択的なＩ！ｆｆｉ瘍破壊を生じさせる能力がＴＮＦを定義する標準的 なインビボアッセイ法となった。

ＴＮＦはまた細胞培養物中にも生産された。Ｍａｔｔｈｅｗｓ等、Ｂｒ１ｔ、Ｊ 、Ｃａｎｃｅｒ　（１９８１）４４　：　４１８は、ＢＣＧ注射されたラビット 由来の単核食細胞の培地中にＴＮＦ活性を得ることができたＣＭａｎｎｅ＋等、 Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、（１９８０）　３０　：　５２３　：同（１９８１ ）３３　：　１５６　）　、細胞培養後にＢＣＧ感染されたマウスからのマクロ ファージ富化腹腔滲出細胞から得られるＴＮＦ活性はエンドトキシンにより誘導 された。

新生物細胞に対する選択的細胞毒性を担当する因子を精製する試みが行われたが 全体動物の血清中又は組織培養培地中に極めて小量のみ存在する様であるため完 全な精製を行うことは不可能であった。さらに、蛋白質（１又は複数）は明らか に不安定であり、そして２つの最近の米国特許Ｎａ４，４４７．３５５及び１１ ｈ４，４５７，９１６は、例えばアルブミン又は炭水化物材料の添加により調製 物の活性を安定化する方法に向けられている。

他人によって開発された標準的精製法を用いるこれらの開示の方法においては、 約１×１０６ユニツ）／ｍｇのＴ　Ｎ　Ｆ　ｔｌ’９製物の比活性を得ることが 可能であり、このユニットはネズミＬ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　１．２）に対 する細胞毒性についてのインビトロ・アッセイにおいて定義されたものである。

しかしながら、ＴＮＦについてのインビボ（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）腫瘍壊死アッセ イにおいて活性であり、且つアミノ酸配列情報を得ることができるために十分な 純度を有する材料を得ることは不可能であった。

確かに、純粋な細胞毒性蛋白質が入手不可能であるため、現在のところ、癌細胞 に対して選択的な壊死作用を有する蛋白質をいかに多く得ることができるか明ら かでない。Ｃａｒｓｗｅｌｌ等（前掲）のインビボ法はＴＮＦを定義する標準と して承認されている。これらの因子の種間交差活性（ｃｒｏｓｓ　５ｐｅｃｉｅ ｓａｃｔｉｖｉ　ｔｙ）のため、このアッセイ法はある意味において便利で診断 的である。しかしながら、細胞毒性についての一層便利なインビトロアッセイ法 がＴＮＦ活性の指標としてしばしば使用される。この方法は、このインビトロア ッセイ法とＴＮＦを定義する試験との間に１：１の相互関係が存在するか否かに ついてかなりの混乱があるにもかかわらず使用されている。確かに、インビトロ アッセイにおいて活性である形質転換されたＢ−セルライン由来の蛋白質が“リ ンホトキシン”と命名され、均一に精製され、そして部分的に配列決定された（ ゼネンテソク、ヨーロッパ特許出願公開１ｋｏ１００６４１．１９８４年２月１ ５日公開）。リンホトキシンは、それが非マクロファージ由来であるため、”Ｔ ＮＦ″とは異る蛋白質であると予想されている。さらに、リンホトキシンに対し て調製された抗−血清はマクロファージから精製された細胞毒性因子（ＴＮＦ） と交差反応しない（Ｓ　ｔｏｎｅ−Ｗｏ　ｌ　ｆ　ｆ　＋口１等、ムハＬハ虹（ １９８４）皿：８２８）。

腫瘍細胞に対して特異的に向けられた細胞毒性効果を発揮することができる明確 にされた蛋白質配列を提供することは、言うまでもなく、悪性疾患の診断及び治 療の両者のために大きな利益をもたらすであろう。さらに、これらの因子の幾つ かは抗−寄生活性を有するようであり、ＢＣＧを注射されたマウスの血清由来の ＴＮＦと称する蛋白質が、インビボ及びインビトロにおいてマラリア寄生体〔プ ロスモジラム・フプルシバリウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｉ ｕｍ）に対して細胞毒的１皿辺」−丞 ヒト前骨髄球性白血病セルライン（ＨＬ−６０、ＡＴＣＣＮｏ　ＣＣＬ２４０） が、適切に誘導された場合、腫瘍壊死因子を有意な量で生産することが示された 。この因子が精製され、配列決定され、そして組換技法によって生産された。従 って、第１に、ヒト腫瘍細胞に対して選択的に細胞毒性である化学的に定義され た因子が存在する。これは、医療において使用するために十分な量の材料を提供 し、活性を改良するためにプログラムされた変形を行い、そして生物中の腫瘍の 存在を検出するための適切な診断試験を設計する機会をもたらす。すなわち、こ の蛋白質の組換源の入手可能性は、この有用なペプチドの治療及び診断のための 操作の実施可能性をもたらす。以上の形態のＩＮＦが腫瘍形態に応答してヒトに よりおそら（天然に生産されるであろうが、組換生産によりもたらされる柔軟性 並びに質及び量の保証がなければ、その性質を利用する手段を手にすることがで きない。

従って、１つの観点において、この発明は組換ヒ）ＴＮＦに関する。他の観点に おいて、これはこの蛋白質をコードする中断されないＤＮＡ配列、その発現を行 うことができる配列、形質転換宿主にＴＮＦを発現する能力を付与することがで きる形質転換ベクター、こうして形質転換された組換体宿主、及びこの発明の種 々の組成物を得るだめの方法に関する。

他の観点において、この発明は特にグリコジル化された形又はグリコジル化され ていない形の、第１図に示すＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列の蛋白 質に関する。

この発明はまた、第１図に示されるものと比較して一次構造中に変化を含有する ＴＮＦの幾つかの特定の組換ミューティン、並びにそれらの製造のための方法及 び材料に関する。

これらのミューティンは、腫瘍細胞を選択的に殺すそれらの能力において、第１ 図に示す一次配列のＴＮＦ　（ｍＴＮＦ）に匹敵し、又はそれより活性が高い。

これらのミューティンは、１〜１ＯＮ−末端アミノ酸残基が除去されている対応 する蛋白質、及び１〜ｌ０Ｎ−末端アミノ酸が存在せずシスティンが除去されて いるミューティンを包含する。

この発明は特に、Ｎ−末端配列：　Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ− Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−八１ａ−Ｖａ１．−５ｅｒ −Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−（Ｇｌｎ）−（Ａｌａ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ を有する蛋白質、及び前骨髄球性白血病細胞からこのアミノ酸配列の生産を誘導 しそしてそれを精製するための改良された方法に関する。この発明はさらに、Ｔ ＮＦ’を含有する医薬組成物、これらの組成物を使用する治療方法、及びＴＮＦ のための改良されたアッセイ方法に関する。

顕立潅爪ム説ユ 第１図はｐＥ４の完全ヌクレオチド配列及びヒトＴＮＦの推定されるアミノ酸配 列を示す。

第２図はｐＥｄ中の挿入部の制限地図を示す。

第３図は発現用プラスミド及び種々のＴＮＦミューティンのためのそれらを造成 するために使用されたオリゴマーを示す。

第４図は幾つかのＴＮＦミューティンの比活性の比較を示す。

第５図は精製された組換ＴＮＦ　（ｒＴＮＦ）ミューティンに対して行われたＳ ＤＳゲルを示す。

第６図は精製されたｒＴＮＦミューティンに対して行われた等電点電気泳動ゲル の結果を示す。

第７ａ図及び第７ｂ図は腫瘍担持マウスにおけるＴＮＦ活性のインビボ試験の結 果を示す。

、■を・　るためのピ１ Ａ、定義 この明細書において使用する場合、“腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、腫瘍細胞に対 して選択的細胞毒性であることができ、第１図に示されるものと実質的に同等の アミノ酸配列に関する。この定義に合致するアミノ酸配列は後に記載する連続性 ネズミ結合組織セルラインＬ−９２９に基くインビトロ細胞毒性アッセイにおい て活性でなければならない。ＴＮＦ活性のこの定義は、Ｃａｒｓｗｅｌｌ等（前 掲）によるこの用語を造り作した開示中に示されているそれとは正確に同一では ない。しかしながら、ヒト腫瘍細胞に対するこのインビトロ細胞毒性アッセイに より確認される活性は、このアッセイを用いる腫瘍壊死因子としての性質決定が 正当化されるに十分な有用性の保証をもたらす。下記のごとく、Ｌ−９２９に対 する細胞毒性は他のヒト腫瘍に一般化されるようである。上に特定した細胞毒性 アッセイにおいて活性な因子とＣａｒｓｗｅｌｌにより要約されているインビボ アッセイにおいて活性な因子との間に実質的なオーハーラソブが存在すると予想 される。

この発明のＴＮＦ蛋白質は、懸濁されているか又は？容液であればその環境のｐ ｉ＋に依存して、あるいは固体の形であれば結晶化又は沈澱の際のその環境のｐ ｌ＋に依存して、医薬として許容される塩の形であることができ、又は中性の形 であることができる。この蛋白質の遊離アミノ基は言うまでもな（、例えば無機 酸、例えば塩酸、リン酸もしくは硫酸、又は有機酸、例えば酢酸、グリコール酸 、コハク酸もしくはマンデル酸と共に酸付加塩を形成することができる。ｔｔ離 カルボキシル基は、塩基、例えば無機塩基、例えばすトリウム、カリウム又はカ ルシウムの水酸化物、及び有機酸、例えばピペリジン、グルコサミン、トリメチ ルアミン、コリン又はカフィインと共に塩を形成することができる。さらに、蛋 白質は他の生物学的物質、例えばリビド及びサツカライドとの結合により、又は 側鎖修飾、例えばアミノ基のアセチル化、ヒドロキシル側鎖のリン酸化、又はス ルヒドリル基の酸化により修飾され得る。ＴＮＦ活性が保持される限り、これら の修飾のすべてがこの発明の範囲に属する。

最後に、−次アミノ酸配列のある種の変形がなお、第１図に示される配列に比べ て実質上同等の又は増強された活性を有する蛋白質をもたらすことができること が理解される。これらの変形は、部位特定変異誘発によるごとく意図的であって もよ（、又はＴＮＦ生産宿主中における変異によるごとく偶然的であってもよい 。特定の変形がＴＮＦ活性を有する蛋白質を導くであろうことは予想されず、そ してどの変形が許容されるかをあらかじめ予想することはできないが、上記のよ うにＴＮＦ活性が保持されている限りこれらの変形のすべてが’　Ｔ　Ｎ　Ｆ’ ”の定義に含まれる。

特に、第１図に示される配列のＮ−末端の最初の１０個までのアミノ酸（１０番 目のアミノ酸を含む）を欠くミューティンが示されている構造のＴＮＦに匹敵す るか又はそれより高い比活性を有することが見出され、そして後で説明する。

比活性のパターンは、６〜８個のＮ−末端アミノ酸が除去された場合に最適活性 を伴って、ベル形曲線に従うようである。

従って、ＴＮＦの定義は特にこれらの切り取られた形態を包含する。明らかに、 Ｎ−末端からの１０個までのアミノ酸の除去は生物学的活性を破壊せず、しかし 事実、しばしばそれを増強するからである。

従って、この明細書においてＴＮＦの定義は特に、第１図に示すものと実質上同 じアミノ酸配列を有するが、しかしその図中に示されるＮ−末端配列において１ 〜１０個のアミノ酸を欠く蛋白質を包含する。５ｈｉｒａｉ　、　Ｔ、等、Ｎａ ｔｕｒｅ（１９８５）　３１３：８０３−８０６が、ヒト−ゲノムバンクから得 られたＤＮＡから造成された発現ベクターを用いて組換ＴＮＦを製造したことが 注目される。この造成物においては、コードされた蛋白質は第１図に示されるＮ −末端配列の最初の２アミノ酸を欠いている。明らかではないがしかしラビット ＴＮＦゲノム構造に関連するらしい理由で、５ｈｉｒａｉ等は、正しいＮ−末端 はこの明細書において示されている位置の３位から始まると予想し、そしてこの ために前記ベクターを造成した。その結果、５ｈｉｒａｉにより製造されたＴＮ ＦはＮ−末端配列Ｓｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ等を有する。５ｈｉ ｒａｉにより製造されたＴＮＦはインビボ活性を有することが示された。この蛋 白質の活性と、この発明の組換生産されたｍＴＮＦ及びＴＮＦミューティンのそ れとの直接比較は現在のところ得られていない。

さらに、第１図に示すＴＮＦのＣ−末端からの除去も無害であると予想される。

１７個までのアミノ酸の除去をコードする遺伝子の造成も行われた。

米国特許ｍ４．５１８．５８４は生物学的に活性な蛋白質のシスティンが除去さ れたミューティンを記載している。ＴＮＦの場合においては、６９位のシスティ ンの中性アミノ酸による置き換えが活性なＴＮＦ蛋白質をもたらす。１０１位の システィンも不必要なようであり、そしてこの位置にこれに代る中性アミノ酸を 有するミューティン、並びにシスティン６９及び１０１の両者が置き換えられた ミューティンも調製された。これらのミューティンもまた、この発明の方法に従 って、変形してＴＮＦ活性を保持しておりそしてインビボ及びインビトロにおい て増強された比活性を有するであろう切り取られた形を得ることができる。これ らのミューティンはＮ−末端の１〜１０個のアミノ酸、Ｃ−末端におけるアミノ 酸の配列、又はこの両者を欠いている。これらのミューティンもまた特徴的にＴ ＮＦの定義に属する。

最後に、天然源から精製されたＴＮＦをモデルとして使用して遺伝子が造成され た。３位及び４位の２個のセリン残基が除去されているミューティンをコードす る遺伝子及び１５位及び１６位のｈｉｓ−ｖａｌカブレットがｖａｌ−ｓｅｒに より置換されているミューティンをコードする遺伝子が調製された。

記号に関し、便宜上第１図中１〜１５７と番号を付したアミノ酸配列を有する蛋 白質を参照として使用し、そしておそらく勝手にｍＴＮＦ　（成熟ＴＮＦ）と称 されるであろう。ｍＴＮＦとの相同性を有しそしてＴＮＦの生物学的活性を示す 他のすべてのアミノ酸配列はｍ、　Ｔ　Ｎ　Ｆのミューティンと称され、そして 図中に示される残基の番号を用いてｍＴＮＦからの差異にしいて示されるであろ う。例えば、６９位のシスティンの置換を有するミューティンは置換された残基 及び位置の番号を用いて示され、例えば６９位においてシスティンの代りにセリ ンを有するペプチドは５ｅｒｂｑＴＮＦとして示されるであろう。残基が単に欠 失している場合には、それはｄｅｓ−残基として命名され、従って例えば、３位 及び４位のセリンが除去されているミューティンはｄｅｓ−ｓｅｒ３ｄｅｓ−ｓ ｅｒｎ　Ｔ　Ｎ　Ｆと称されるであろう。Ｎ−末端の除去は、及びそれに次ぐ欠 失の数を用いて対応する数のアミノ酸を欠くものとして示されるであろう。例え ば、第１図に示した蛋白質に比較して１個のＮ−末端アミノ酸を欠くミューティ ンはＩＴＮＦとして命名されるであろう。Ｃ−末端の欠失については、の次に最 後の残っている残基の番号及びマイナス記号が付されるであろう。

従って、Ｃ−末端から７個のアミノ酸が除去されているミューティンについては 名称は１５０−ＴＮＦであろう。上記の変化の組み合わせが行われる場合、名称 はそのすべてを示し、例えば△ＬｄｅＳ−３ｅｒ３ｄｅＳ−５ｅｒａＳｅｒｈｑ １５０−ＴＮＦとなるであろう。

ｍＴＮＦのミューティンのすべてが組換により又は意図的に製造されるわけでは ない。確かに、Ｄ、１．ｈ、に後記するＨ　ｔ、　−６０により分泌されるＴＮ Ｆの２２個のＮ−末端アミノ酸について得られた配列を第１図に示される推定さ れる配列の対応する部分と比較することにより、両帯白質はＴＮＦ活性を示すに もかかわらず一次構造中にわずかな変化が存在することがわかる。具体的には、 推定される配列は、ＨＬ−６０由来の蛋白質の４〜１２位と推定される配列の６ 〜１４位の間で示される相同性を回復する前に３位のセリンの次に追加の一対の セリン残基を有する。さらに、ＨＬ−６０由来蛋白質の１３位及び１４位はｖａ ｒ−ｓｅｔであり、推定される配列の対応する１５位及び１６位はｈｉｓ−ｖａ ｒである。

“作用可能に連結された”とは、複数の構成成分がそれらの通常の機能を行うよ うに配置されている並置を意味する。

従って、コード配列に作用可能に連結されている制御配列は該コード配列の発現 を行うことができる。

゛制御配列”は、１又は複数のＤＮＡ配列であって、目的のコード配列に作用可 能に連結された場合に、該ＤＮＡ配列と適合性の宿主中で該コード配列の発現を 行うことができるものを意味する。このような制御配列は原核生物及び真核生物 宿主の両者におけるプロモーター、及び原核生物においてはさらにリボゾーム結 合部位配列、そして真核生物においてはターミネーションシグナルを含む。発現 を行うために必要であるか又は好ましい追加のファクターも後で特定されよう。

この明細書において使用する場合、“制御配列”は単に、使用される特定の宿主 において発現を行うために必要とされるすべてのＤＮＡ配列に関する。

“細胞”、“組換宿主”、又は“宿主細胞”はしばしば交換可能に使用され、そ して文脈から明らかになるであろう。

これらの用語は直接の対象細胞、及び言うまでもなくそれらの子孫を包含する。

環境中での偶然変異及び変化のため、すべての子孫が親細胞と正確に同一という わけではないことが理解される。しかしながら、上記の用語が使用される場合、 このような変化した子孫も含まれる。

Ｂ、二股血ｊｕ ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡ配列を得るために下に示される方法は例示的であ り且つ典型的なものである。他の方法を使用することもできる。完全なりＮＡ配 列がイントロンを含まない形で得られたので、そしてこの明細書中に開示するの で、言うまでもなく目的とするＤＮＡ配列を得るために同じ方法を反復する必要 はない。のみならず、発現のためにこの明細書に例示するのと同じ系を使用する 必要もない。０項においてさらに詳細に示すように、目的とするＴＮＦの生産を 行うために使用され得るであろう種々の宿主及び制御配列が当業界において入手 可能である。

例示される方法において、Ｂ、］３項に記載するようにＴＮＦを分泌するように 、ヒト前骨髄球性白血病セルラインｌ（Ｌ−６０が改良された誘導法によって８ Ｍ　＝’ｌｉされた。この蛋白質は、Ｂ、２１項において記載するように新規な 精製法を用いて均一に精製され、そして生ずる精製された蛋白質がアミノ酸配列 決定にかけられた。これがプローブ混合物の造成を可能にし、このプローブが次 に、Ｂ、３９項に記載するように適切なコード配列を得るために使用された。こ のコード配列は、適当な原核性制御系を含有しそして補乳類細胞での発現のため にウィルスプロモーターを用いるベクター中に連結することにより、この例示に おける発現のために使用された。

ｃＤＮＡ配列の検索からすでに得られているＤＮＡ配列のミューティンを生じさ せるためコード配列中の変形を行った。

このような変形はプライマー指令変異誘導により行われ、そして増強された活性 を示す短縮された形のＴＮＦが提供された。

且ニー改良ｉ：ｔｌＪ、：’１頭汰 ｇａｆｆにかけるセルラインＨＬ−６０ヒト前骨髄球性白血球セルラインはそれ 自体比較的未分化である。分化することが許容されれば、このものは一層特異的 に規定された細胞タイプのコロニーを形成する。その後の事象に依存して、この ものは顆粒球に、又は単球に成熟し、この単球は次にさらに分化してマクロファ ージになることができる。マクロファージ画分がＴＮＥのインビボ生産を担当す ると予想される。他方、見かけ上密接に関連しているリンホトキシンはＢリンパ 球により生産されると考えられる。

対象細胞により生産されるＴＮＦのレベルは誘導法の改良により１０〜２０倍増 加し得ることが見出された。Ｇｉｆｆｏｒｄ、Ｇ等により考案された既知の方法 （私信）は２０％血清中３７℃、３０分間、１０Ｍｇ　／　ｍ　１１でのホルボ ル（ｐｈｏｒｂｏｌ）エステル１２−０−テトラデカノイルホルボルー１３−ア セテート（ＴＰＡ）による処理を用いる。次に、細胞培養物が回転沈降され、そ してインシュリン及びトランスフェリン（各１０μｇ／ｍＪ）が補充された無血 清培地中１０ＩＪｇ／ｍｌのエンドトキシンにより処理される。最初のインキュ ベーションにおいて無血清培地を用いてホルボルエステルの濃度を１００μｇ／ ｍβに低下せしめることにより、そしてエンドトキシン処理の段階において１０ ＭＭカルシウムイオノホーレＡ２３８１７を添加することにより、エンドトキシ ンと共にインキュベートした後の上清中のＴＮＦの含量が実質的に増加する。

Ｂ、２．１凡且傅簾裂 さらに、誘導された細胞培養物からＴＮＦを精製するための改良された方法が開 示される。この方法はＴＮＦを含有する上清を、ＴＮＦの吸着を許容しない条件 下で陰イオン交換樹脂により処理し、次にＴＮ’Ｆ含有画分をサイズ分画用ゲル で処理して活性画分を得、次にこれを５ＯＳ−ＰＡＧＥにかけることを含んで成 る。５ＤＳ−ＰＡＧＥからのＴＮＦ含有画分をＨＰＬＣによりさらに精製する。

第１段階において、陰イオン交換樹脂に適用する前に、ＴＮＦを含有する上清を 場合によっては例えば市販の濃縮用フィルター、例えばアミコン中空繊維又はミ リポアペリコン限外は過ユニットで処理することにより濃縮する。次に、濃縮物 を適当な陰イオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥアガロース、ＤＥＡＥセルロース、 又はＱＡＥアガロース、好ましくはＤＥＡＥアガロースで処理する。処理条件、 すなわちｐＨが約７〜９で合計塩？農度が約０．０１〜０．０７Ｍの溶液は、Ｔ ＮＦ活性が支持体に吸着しないようなものである。

次に、非結合画分を、例えば任意の市販のサイズ分画用ゲル、例えば約７０，０ ００ダルトンの分子量排除を有するセファデックスＧ−７５スーパーフアイン（ ファルマシア）を用いるゲル濾過によりさらに精製する。ゲルで処理した後のＴ ＮＦ含有画分を次に適当な条件下で５Ｏ３−ＰＡＧＥにかけ、そしてＴＮＦ活性 を含有するゲルスライスを回収する。５ＤＳ−ＰＡＧＥは１、ａｅｍｍｌｉ等、 　Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）　２２７：６８０　の方法に従って行われそしてこ れは当業界においてよく知られている技法である。

適切な範囲内での特定の条件の変更は可能でありそしてよく理解される。

次に、５ＤＳ−ＰＡＧＥからの活性含有画分を逆相ＨＰＬＣにがけ、そして０． １％ＴＦＡ中０〜６０％アセトニトリルグラジェントにより溶出する。使用する ことができるイ也のグラジェント溶出系は酢酸及びｎ−プロパツールを含む。

こうして得られるヒトＴＮＦはＮ−末端アミノ酸の配列決定を可能にするのに十 分に純粋である。

Ｂ、３．二ｎλ亀胤 ＨＬ−６０細胞から調製されたｍＲＮＡは、標準的な卯母細胞翻訳系に加えられ た場合、Ｌ−９２９細胞毒性アツセイにおいて活性なＴＮＦ因子の生産を行うこ とができる。オリゴマープローブの相対効率を、このｍＲＮＡ調製物と前インキ ュベートした場合にこの翻訳系におけるＴＮＦの生産に負の影響を与えるそれら の能力により試験することができた（“バイブリド捕捉”）。卵母細胞系での画 分の翻訳により所望のＴＮＦコードｍ　ＲＮ　Ａがすでに同定されている場合、 キナーゼ処理されたブローブヘハイプリダイズするｍ　ＲＮ　Ａグラジェントの ラジオオートグラフィーにより、前記の基準を一層精密なものにすることができ る。蛋白質中の配列Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−八１ａをコードする４個 のブールｍＲＮＡに相補的であるように設計された１６個の１４−マーを含む） のいずれが正しい配列を含有しているかを決定することが可能であった。１６個 のオリゴマーのこの混合物がＴＮＦコードｍＲＮＡのみにハイブリダイズするた めに十分に特異的ではないことをＮｏｒｔｈｅｒｎプロットにより示すことがで きたので、これらの“バイブリド捕捉”実験を８対の１４−マーを用いて反復し た。１対がｍＲＮＡを特異的にハイブリダイズするのに好結果をもたらした。

一旦十分に特異的なプローブが同定した後、目的のＴＮＦをコードするｍＲＮＡ 画分から形成されたｃＤＮＡライブラリーを検索するためにこれを使用した。２ ８個の好結果のハイブリダイズするコロニを拾い、プラスミドＤＮＡを単離し、 そして幾つかの挿入部を配列決定した。完全なコード配列を含有するプラスミド 調製物をｐＥ４と命名し、そしてコード配列源として使用した。追加のプラスミ ド調製物ｐＢ１１を哺乳動物発現のために使用した。

Ｂ、４．工Ｎ旦少光里 ｐＥ４の挿入部のヌクレオチド配列決定は、言うまでもなく、コード配列の位置 及び挿入部中の利用可能な制限部位の分析を可能にした。相同性は完全ではなか ったが、正しい置き換えを容易に行うことができた。操作を容易にするため、成 熟蛋白質のＮ−末端アミノ酸のためのコドンと位相を合わせて且つそのすぐ前に ＡＴＧ開始コドンを置き、そしてこのＡＴＧのすぐ上流に旧ｎｄＩ［ｒ部位を含 有せしめるのが望ましかった。これは部位特定変異誘発により達成された。その 詳細は後で記載する。次に、この適切な開始シグナルを有するコード配列を２つ の部分、すなわちＨｉｎｄＩ［Ｉ／　Ｐｓｔｌ断片及びＰｓ　ｔ　Ｔ　／　Ｂａ ｍｔｌ　Ｉ断片にに切り取り、そしてこれらの断片を制御配列を含有する宿主発 現ベクターに挿入することが可能であった。他の方法として、完全な配列を旧ｎ ｄＩＩ［断片として切り取ることができた。使用される特定の宿主発現ベクター は、１１ｉｎｄｌＩｒ部位の上流のｔｒｐプロモーター及び下流ＢａｍＨＩ部位 を含有するｐＴＲＰ３　、並びに同様に配置されたＰＬプロモーターを含有する ｐＦＣ５４，を及びｐｐｔ、ｏｐである。

これらの発現ベクターを適当なＥ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主に形質転換し、 そして得られた形質転換体をＴＮＦの生産をもたらす条件下で培養した。音波処 理し、そして次に音波処理物をチャオトロビソク剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　ａ ｇｅｎｔ）で処理して目的のＴＮＦを可溶化することによりＴＮＦを細胞から回 収することができ、又は該音波処理物を直接アッセイすることができる。

最初の発現はＥ、コリ中で達成された。しかしながら、Ｃ，１項において非常に 詳細に記載するごとく、ｐＥ４又はｐＢｌｌからのコード配列を、他の原核生物 、酵母、Ｍｉ織培養物、又は植物細胞中での発現に適する制御配列に連結するこ ともできた。哺乳動物細胞中での発現は実際にｐＢｌｌのＳＶ４０プロモーター を用いて達成された。適切な宿主の選択は、分泌を行う可能性、翻訳後プロセシ ングを行う可能性、及び適切な増殖条件下で目的の蛋白質を高レベルで生産する 能力を含む多くの因子に依存するであろう。

Ｂ、５．アッセイ Ｂ、５．ａ　、１　アッセイ法 Ｌ−９２９アッセイ系は、ＴＮＦ活性の迅速な測定を可能にする改良された便利 なインビトロアッセイ法である。Ｃａｒｓｉｖｅｌｌのインビボ腫瘍壊死アッセ イとの相関の程度は現在のところ知られていない。しかしながら、これは特にネ ズミ腫瘍細胞を使用するので、相関性は高いと予想される。ＥＰＯ公開１’ｈｏ １００６４１　（前掲）においてリンホトキシンと称される蛋白質もこのアッセ イにおいて活性を与える。このアッセイ法は概念において、ネズミＬ−Ｍ細胞及 びメチレンブルー染色を使用する米国特許Ｎｆ１４，４５７，９１６に開示され ているものに類似する。Ｌ−９２９アツセイ法はヒト腫瘍セルライン細胞毒性と 相関する（ＨＬ−６０由来ＴＮＦについて）ことが示された（Ｄ、１．ｂ項を参 照のこと）。

この発明のＬ−９２９アツセイ系において、Ｌ〜９２９　！ＩＩ胞はミクロタイ タープレート中で単層として一夜調製される。試験サンプルをプレートにわたっ て２倍稀釈し、ＵＶ照射し、ぞして次に調製された細胞単層上に加える。次に、 ウェル中の培地を１μｇ　／　ｍ　ｌアクチノマイシンＤにする。プレートを３ ７℃にて１８時間インキュベートし、そしてプレートを顕微鏡下で視覚的にスコ アーする。ウェル中の細胞死の程度を示す２５％、５０％、７５％及び１００％ の標示を各ウェルに与える。ＴＮＦ活性の１ユニツトを５０％の死滅を生じさせ る稀釈の逆数として定義する。

さらに、このアッセイ法の一層高怒度の変法が開発された。

この方法は、試験サンプル及びアクチノマイシンＤにより処理された場合に、前 ラベルされた細胞からの３ＳＳでラベルされたペプチドの放出をモニターする。

アッセイ法のこの変法は力価を定量するため、例えば卵母細胞により翻訳された 物質の相対力価を評価するために使用することができる。要約すれば、活発に増 殖しているＬ−９２９の培養物を、２％の透析されたウシ胎児血清が補充された メチオニン不含有培地中で３５８−メチオニン（２００μＣｉ／ｍｌ）により３ 時間ラベルする。次に細胞を洗浄し、そして９６ウエルプレート中にプレートし 、そして−夜インキユベートし、そして次の日に試験サンプルの２倍稀釈物及び １μｇ　／　ｍ　ｌのアクチノマイシンＤで処理する。次に、培養物を３７℃に て１８時間インキュベートする。次に、各ウェルからの１００μｌの上清アリコ ートを他の９６ウエルプレートに移し、酸（ＴＣＡ）沈澱せしめ、そしてガラス 繊維フィルター上に回収する。フィルターを９５％エタノールで洗浄し、乾燥し 、そして計数する。すべてのアッセイにＮＰ、。洗剤対照を含めて細胞からの放 射能の最大放出を測定する。次に、１５３放出（％）を処理細胞と未処理対照と の間のカウントの差をＮＰ、。処理細胞と未処理細胞との間のカントンの差で除 した比率、すなわち、で表わされる比率により計算する。ＴＮＦの力価が高くな るに従ってこの比率が高い値となる。上記のアッセイ法は、対象細胞としてヒト 腫瘍セルラインを使用するために便利に変更される。上記のＬ−９２９細胞の場 合と同様にしてユニットを定義し、そして放出（％）を計算する。

Ｂ、５．ｂ　−±２よ］肛乙ヱ−＆−（−調製物はまた、腫瘍を殺し又はその成 長を抑制し、そして該腫瘍を担持する動物を死亡から保護するその物質の能力を 用いて、ＴＮＦ活性について試験することができる。Ｂａ１ｈ／ｃマウスに種々 のタイプの腫瘍細胞を皮下注射することにより局在化した腫瘍を形成せしめた。

腫瘍セルラインは腹水からの細胞懸濁物として得られるＭｅｔｈＡマウス線維肉 腫、及び１　ｍｍ３の細胞塊として投与されるＭＣＦ−７ヒト乳癌を包含した。

アッセイのため、雌性Ｂａ１ｈ／ｃマウス（１９〜２２ｇ）に２６ゲージ針によ り０．１　ｍ　７！の媒体中に５Ｘ１０５個の線維肉腫細胞を含有する懸濁′液 又はＭＣＦ−７塊を皮下注射した（繊維肉腫懸濁液は８白目の腹水から細胞の計 数及び血清不含有培地による稀釈により調製した）。９〜１０日後、腫瘍が触知 可能になった時、試験すべきＴＮＦＯ量（マウス当り１μｇの範囲）を注射し、 そしてその後の日に所望によりＴＮＦ投与を反復した。腫瘍の体積を測定するこ とにより、及び生存率により結果を評価した。

Ｂ、６．ＴＮＦミューティンの止１ この発明は、最適活性の蛋白質を得るために有利なｍＴＮＦの多数の変形を意図 する。前記Ｂ、５．ａ項の細胞毒性アッセイにおいて匹敵する又は増加した比活 性をもたらす一層アミノ酸配列の幾つかの特定の変化を得った。ｍＴＮＦの配列 からの最初の１０個又はそれより少い数のアミノ酸の除去の幾つかは、“天然” 組換蛋白質の比活性と同等か又は数倍高い比活性を有する蛋白質をもたらす。ｍ ＴＮＦのシスティン除去ミューティンもまた、これらのミューティンのＮ−末端 除去形がそうであると同様に、ＴＮＦ活性を示す。

これらのミューティンの幾つかの製造は、ＴＮＦのためのコード配列を含有する 発現ベクターを所望のコード配列に対応するプライマーを用いて部位特定変異誘 発にかけることにより行われる。こうして、コード配列中に適切な変化を有する 変形された発現ベクターが得られる。得られた変形されたベクターを適当な宿主 に形質転換し、次にこれをコードされたミューティンの生産をもたらす条件下で 培養する。次に、これらのミューティンは“天然蛋白質”と同様に細菌培養物か ら精製され、そして低下していないか又は増強されている活性を有することが示 される。

特に、４ＴＮＦミューティン及び６−１０ＴＮＦミユーテインは２つの点におい てｍＴＮＦに明らかに卓越している。

すなわち、これらは一層高い比活性を有し、そしてこれらは“きれいな”生成物 として生産される。後に一層詳細に示すように、これらの好ましい具体例の幾つ かについて、精製された蛋白質の活性は細胞毒性アッセイにおいてｍＴＮＦによ り示されるそれよりも数倍高い。さらに、等電点電気泳動ゲル上での挙動により 証明されるように、精製された組換ｍＴＮＦは側鎖の変形を有するらしい一層の 蛋白質を示すのに対して、これらのミューティンはこの方法にかけられた場合本 質的に１個のバンドを与える。

Ｃ３盗準泣立迭 細胞を形質転換し、ベクターを造成し、メツセンジャーＲＮＡを抽出し、ｃＤＮ Ａライブラリーを調製する等のために使用される技法のほとんどは当業界におい て広〈実施されており、そしてほとんどの実施者は特定の条件及び方法を記載す る標準的手段に親しんでいる。しかしながら、便宜上次の項がガイドラインとし て役立つであろう。

Ｃ、１，、布」」じ８肌Ｍ鳶ｐ 原核生物はほとんどの場合Ｅ、コリの種々の株により代表される。しかしながら 、他の微生物株、例えばバシルス、例えばバシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の色 々な種、又は他の細菌株を使用することもできる。このような原核生物系におい て、宿主と適合性の種に由来する複製開始点及び制御配列を含有するプラスミド ベクターが使用される。例えば、Ｅ、コリは、、　Ｂｏｌｉｖｅｒ等、Ｇｅｎｅ 　（１９７７）　２　：　９５によるＥ、コリ株由来のプラスミドであるｐＢＲ ３２２の誘導体を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテト ラサイクリン耐性のための遺伝子を含有しそしてそれ故に所望のベクターの造成 において維持されるか又は破壊されることができる追加のマーカーを提供する。

この明細書において転写開始のためのプロモーター及び場合によってはオペレー ターをリボゾーム結合配列と共に包含するものとして定義される一般に使用され る原核性制御配列には、−二一一うクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトー ス（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇ等、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７）　 １９８１０５６）　、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄ ｄｅｌ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８０）　８　：　４ ０５７）　、並びにラムダ由来ＰＬプロモーター及びＮ−遺伝子リボゾーム結合 部位ＣＳｈｉｍａｔａｋｅ等、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）　２９２　：　１ ２８　）　（これは、１９８４年２月８日に出願され、そして同じ承継人に承継 された係属中の出願１１ｈ　５７８，１３３中に記載されているようにポータプ ル制御カセットとして有用にされている）のごとき一般に使用されるプロモータ ーが含まれる。しかしながら、原核生物に適合性の任意の入手可能なプロモータ ー系を使用することができる。

細菌のほかに、真核性微生物、例えば酵母を宿主として使用することもできる。

パン酵母であるサツカロミセス・セレヒシＩ　−（５；Ｂ＋匹加■旦す旦邦−鱈 工卦１１１搬−の実験室株が最も使用される。但し他の多くの菌株も一般に入手 可能である。２ミクロン複製開始点を用いるベクターが例示される（Ｂｒｏａｃ ｈ。

Ｊ、　Ｒ，、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、（１９８３）　１０１　：　３０７）が、酵 母での発現のために適当な他のベクターが知られている〔例えば、Ｓｔｉｎｃｈ ｃｏｍｂ等、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）　２８２　：　３９　；　Ｔｓｃｈｅ ｍｐｅ等、　Ｇｅｎｅ（１９８０）ユニ１５７；及びＣ１ａｒｋｅ、　Ｌ、等、 　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、（１９８３）　１０１　：　３００を参照のこと〕。酵 母ベクターのための制御配列には解糖系酵素の合成のためのプロモーターが含ま れる（ｌｌｅｓｓ等、Ｊ、＾ｄｖ。

ハ互凹」弧、　（１９６８）ニー１４９　；　）Ｉｏｌｌａｎｄ等、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒ（１９７８）　１７　：　４９００）　、当業界において知られて いる他のプロモーターには３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター　（ ｌｉｔｚｅｍａｎ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９８０）　２５５　 ：　２０７３）　、並びに他の解糖系酵素、例えばグリセルアルデヒド−３−ホ スフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ 、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３− ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリホスフェートイソメラ ーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターが含 まれる。増殖条件により転写が制御されるという追加の利点を有する他のプロモ ーターはアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣＸ酸性ホスファタ ーゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、並びにマルトース及びガラクトースの資化 を担当する酵素（Ｉｌｏｌｌａｎｄ、前掲）である。さらに、コード配列の３′ 末端においてターミネータ−配列が望ましいと信じられる。このようなり−ミネ ーターは酵母由来配列中コード配列に続く３′非翻訳領域中に見出される。例示 されるベクターの多（がエノラーゼ遺伝子含有プラスミドｐｏｎｏ４６　Ｃ１１ ｏｌｌａｎｄ、　Ｍ、　Ｊ、等、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９８１）　 ２５６　：１３８５）又はＹ　Ｅ　ｐ　１３から得られるＬＥＩＪ２遺伝子（Ｂ ｒｏａｃｈ。

Ｊ０等１銃匹（１９７８）主：１２１）が含まれるが、酵母適合性プロモーター 、複製開始点及び他の制御配列を含有する任意のベクターが適当である。

言うまでもなく、多細胞生物由来の真核宿主細胞培養物中でポリペプチドをコー ドする遺伝子を発現せしめることも可能である。例えば、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅｓ　、アカデミツクプレス、Ｃｒｕｚ及びＰａｔｔｅｒｓｏｎｌｉｇ（ １９７３）を参照のこと。有用な宿主セルラインにはベロ細胞、ヒーラ細胞、及 びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。このような細胞のた めの発現ベクターは一般に哺乳類細胞と適合性のプロモーター及び制御配列、例 えばシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）由来の一般に使用される初期及び後期 プロモーター（Ｆｉｅｒｓ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７３　：１１３）　 、及び他のウィルスプロモーター、例えばポリオーマ、アデノウィルス２、ウシ パピローマウィルス、又は烏肉腫ウィルス由来のプロモーターが含まれる。

咄乳類細胞宿主系形質転換の一般的観点は１９８３年８月１６日に与えられたＡ ｘｅｌ等の米国特許ｋ　４，３９９，２１６に記載されている。今やさらに、発 現を最適化するために“エンハンサ−”領域が重要なようであり、これらは一般 に非コードＤ　Ｎ　Ａ　？Ｊ域中プロモーター領域の上流又は下流に見出される 配列である。必要であれば、複製開始点はウィルス源から得ることができる。し かしながら、染色体への組込みが真核生物におけるＤ　Ｎ　Ａ複製の一般的機構 である。植物細胞も今や宿主として使用することができ、そして植物細胞と適合 性の制御配列、例えばツバリン・シンサーゼプロモーター及びポリアゾニレ−ジ ョンシグナル配列［Ｄｅｐｉｃｋｅｒ、　Ａ、等、Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　１．Ｇｅｎ 。

（１９８２）　１　：　５６１を使用することができる。

Ｃ１２１反ｌ紅換 使用される宿主細胞に依存して、そのような細胞に適する標準的技法を用いて形 質転換が行われる。Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＬＩＳＡ）　（１９７２）　６９　：　２１１ ０により記載されるような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、又はＭａｎ ｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：八Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　 Ｍａｎｕａｌ　（１９８）コールドスプリングハーバ−プレス、２５４頁に記載 されているＲｂＣｊｌ！２法を原核細胞、又は実質的な細胞壁障壁を含有する他 の細胞のために使用した。アグロバクテリウム・チュメファシエンス（ん江剋狙 見型す１１」児咀り匹お狙Ｏ−による感染（Ｓｈａｗ、Ｃ，Ｈ，等、Ｇｅｎｅ（ １９８３）　２３　：　３１５）をある種の植物細胞のために使用する。このよ うな細胞壁を有しない哺乳類細胞のためには、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ　ｄｅｒ 　Ｅｂ、　亘皿■■（１９７８）　５２　：　５４６のリン酸カルシウム沈澱法 が好ましい。酵母への形質転換はＶａｎＳｏｌｉｎｇｅｎ、Ｐ、等、Ｊ、Ｂａｃ ｔ、　（１９７７）１３０　：　９４６及びｌ１ｓｉａｏ、Ｃ，Ｌ。

等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　（１９７９）　７６ 　：３８２９の方法に従って行う。

Ｃ，３，ＣＤ−ＮＡ　び゛　云　ライブラリーの　穴ｃ　ＤＮＡ又はゲノムライ ブラリーはコロニーハイブリダイゼーション法を用いてスクリーニングする。各 ミクロタイタープレートを２株のニトロセルロース濾紙（ＳＡＳタイプＢＡ−８ ５）上にレプリカし、そしてコロニを３７℃にて１４〜１６時間、５０μｇ　／ 　ｍ　ｌのＡｍｐを含有するし寒天上で増殖せしめる。コロニを細胞溶解し、そ して５００ｍＭ　Ｎａ０１１．１．５ＭＮａＣ１にて５分間処理することにより ＤＮＡをフィルターに固定し、そして５×積標準塩クエン酸塩（Ｓ　Ｓ　Ｃ’） により２回それぞれ５分間ずつ洗浄する。フィルターを空気乾燥し、そして８０ ℃にて２時間加熱する。２枚のフィルターを４２°Ｃにて６〜８時間、フィルタ ー当り１０ｍ１のＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液（５Ｘ５ｓｃ、ｐＨ７， ０，５×デンハート溶溶（ポリビニルピロリドン＋フィコール及びウシ血清アル ブミン；１×−各０．０２％）、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０ ，０，２％ＳＤＳ、２（ｌｃｒｇ／ｍｊ！ポリＵ、及び５０μｇ／ｍβ変性サケ ***ＤＮＡ）とハイブリダイズせしめる。

サンプルを、所望の厳しさに依存する条件下でキナーゼ処理されたプローブとハ イブリダイズせしめる。典型的な中程度の厳しさの条件は、プローブを含有する ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液１〜５ｍβ／フィルターと共に２４〜３６ 時間４２℃の温度を用いる。より高い厳しさのためには高い温度及びより短い時 間が用いられる。フィルターを、３７°Ｃにて３０分間ずつ４回、２ＸＳＳＣ， ０，２％ＳＤＳ及び５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）により洗浄し、 次に２ｘｓｓｃ及び０．２％ＳＤＳにより２回洗浄し、空気乾燥し、そして−７ ０℃にて２〜３日間オートラジオグラフ処理する。

Ｃ０４，さ又又二ｑ遣底 所望のコード配列及び制御配列を含有する適当なベクターの造成は当業界におい てよ（理解されている標準的連結及び制限技法を用いる。単離されたプラスミド 、ＤＮＡ配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドは開裂され、仕立てられ、そ して所望の形に再連結される。

部位特異的ＤＮＡ開裂は、適当な制限酵素（１種又は複数種）で処理することに より、当業界で一般に理解されている条件下で行い、そして具体的な条件はそれ らの市販制限酵素の製造者により特定されている。例えば、ニューイングランド ビオラプスの製品カタログを参照のこと。一般に約１μｇのプラスミド又はＤＮ Ａ配列を１ユニツトの酵素により約２０μｌの緩衝液中で行う。この発明の例に おいては、典型的には過剰の制限酵素を用いてＤＮＡ基質の完全な消化を保証す る。３７℃にて約１〜２時間のインキュベーション時間が実施可能であるが、こ れと異ることもできる。各インキュベーションの後、フェノール／クロロホルム を用いる抽出により蛋白質を除去し、そして次にエーテル抽出することもでき、 そしてエタノールにより沈澱せしめることにより水性画分から核酸を回収し、次 にセファデックスＧ−５０スピンカラムに通す。所望により、開裂された断片の サイズ分離を標準的技法を用いるポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲルミ 気泳動により行うことができる。サイズ分離の一般的技法はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　（１９８０）　６５　：４９９−５６０に見出される。

制限酵素開裂された断片ば、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼの大断片（Ｋｌｅｎｏ ｗ）を用いて、４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェ−）　（ｄＮＴＰ） の存在下で２０〜２５°Ｃにて約１５〜２５分間のインキュベーション時間を用 いて、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６）　、５０ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭ　 ＭｇＣｌ！ｚ　、６ｍＭＤＴＴ及び５〜１０ｐＭ　ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ中で処理する ことより平滑末端化することができる。Ｋｌｅｎｏｗ断片は５′接着末端をフィ ルインするが、４種類のｄＮＴＰが存在していても突出３′単鎖をチューバック する。所望により、接着末端の性質により指定される制限内で唯一の又は選択さ れたｄＮＴＰを供給することにより選択的修復を行うことができる。Ｋｌｅｎｏ −で処理した後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノー ル沈澱を行い、次にセファデックスＧ−５０スピンカラムに通す。適当な条件下 での３１ヌクレアーゼによる処理が単鎖部分の加水分解をもたらす。

合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ等、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　（１９８１）　１０３　：　３１８５のトリエステル法により、又は 市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製する。アニーリングに先立つ 、又はラベル化のための単鎖のキナーゼ処理は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐｌ！７ ．６）　、１０ｍＭ　Ｍｇ（１１！□、５ｍＭジチオスレイトール、１〜２　ｍ ＭＡＴ　Ｐ、１．７　ｐｍｏｌｅ３２Ｐ　−ＡＴ　Ｐ（２，９ｍ　Ｃｉ　／　ｍ ｍｏｌｅ）　、０．１　ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭＥＤＴＡの存在下で、過 剰の、例えばＱ、　ｌ　ｎ　ｍｏｌｅの基質に対して約１０ユニツトのポリヌク レオチドキナーゼを用いて達成される。

連結は１５〜３０μβの容積中で次の標準的条件及び温度で行う：　２０　ｍＭ 　ＴｒｉｓｉｌＣ！！（ｐＨ７，５）　、１０　ｍＭ　ＭｇＣｊｉｚ、１、Ｏｍ ＭＤＴＴ、３３　ｐ　ｇ　／ｍ　ＲＢ　Ｓ　Ａ、　１０ｍＭ　〜５０ｍＭＮａ１ ！；及び“接着末端”連結のためには４０μＭＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗ ｅｉｓｓ）ユニットのＴ、ＤＮＡリガーゼ、０℃、又は“平滑末端連結のために は１ｍＭＡＴＰ、０．３〜０．６（匈ｅｉｓｓ）ユニットのＴ、ＤＮＡリガーゼ 、１４℃。分子間“接着末端”連結はば通常、３３〜１００μｇ　／　ｍ　！ｌ の全ＤＮＡ濃度（５〜１１００ｎ全末端濃度）で行う。分子間平滑末端連結（通 常、１０〜３０倍モル過剰のリンカ−を用いる）は１ｕＭ全末端濃度で行う。

“ベクター断片ゝを用いるベクターの造成において、ベクター断片は一般に細菌 アルカリホスファターゼ（Ｂ　Ａ　Ｐ）で処理して５′のリン酸を除去し、そし てベクターの再連結を防止する。ＢＡＰ消化は、ｐＨ８にて約１５０ｍ　Ｍ　Ｔ ｒｉｓ中で、Ｎａ”及びＭｇ”の存在下１μｇのベクター当り約１ユニツトのＢ ＡＰを用いて６０℃にて約１時間行う。核酸断片を回収するため、調製物をフェ ノール／クロロホルムで抽出しそしてエタノール沈澱を行い、そしてセファデッ クスＧ−５０スピンゲルに適用して脱塩する。別の方法として、不所望の断片の 追加の制限酵素消化により２重消化されたベクターにおいて再連結を回避するこ とができる。

配列の変更を必要とするＣＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来のベクターの部分のため に、部位特定プライマー指令変異誘発を用いる。これは、目的の変異を代表する 限定されたミスマツチを除くほか変異すべき単鎖ファージＤＮＡに相補的なプラ イマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行う。要約すれば、ファージに相補的な 鎖の合成を指令するためのプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用い、そ して得られた２本鎖ＤＮＡをファージを支持する宿主細菌中に形質転換する。形 質転換された細菌の培養物を上層寒天中にプレートし、ファージを担持する単一 細胞からのプラークを形成せしめる。

理論的には、新しいプラークの５０％は単一鎖として変異した形を有するファー ジを含有し、５０％はもとの配列を有するであろう。得られたプラークを、正確 にマツチするハイブリダイゼーションを許容するがしかじもとの鎖とのミスマツ チがハイブリダイゼーションを回避するのに十分であるような温度において、キ ナーゼ処理された合成プライマーとハイブリダイズせしめる。次に、プローブと ハイブリダイズするプラークを袷い、培養し、そしてＤＮＡを回収する。部位特 定変異法の詳細は具体的な例において後記する。

Ｃ９５，遣底血皇逍認 下記の造成物において、プラスミド造成物の正しい連結の確認においてはまず、 Ｅ、コリゼネテインク・ストック・センターから得られるＥ、コリＭＭ２９４株 （ＣＧＳＣ＃　６１３５）を連結混合物により形質転換する。好結果の形質転換 体を、アンピシリン、テトラサイタリンもしくは他の抗生物質耐性により、又は プラスミド造成の態様に依存して他のマーカーを用いて選択する。次に、形質転 換体からのプラスミドを、場合によってはクロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗ ｅｌｌ、Ｄ、Ｂ、＋　Ｊ、Ｂａｃｔｅ−ｒｉｏｌ、　（１９７２）　１１０：６ ６７）の後、Ｃｌｅｗｅｌｌ、Ｄ、Ｂ、等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　（１９６９）　６２　：　１１５９の方法に 従って調製する。

単離されたＤＮＡを制限酵素処理により分析し、そして／又はＭｅｓｓｉｎｇ等 、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８１）　９　：　３０９により さらに記載されたＳａｎｇｅｒ、　Ｆ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、　（ＵＳＡ）（１９７７）　７↓：　５４６３のジデオキシ法により、又 はＭａｘａｍ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　（１９８０）　６ ５　：　４９９の方法により配列決定する。

Ｃ，６，！！ｌ玉豆並ｉ且土 この発明においてクローニング及び発現のために使用される宿主菌株は次の通り である。

クローニング及び配列決定、並びにほとんどの細菌プロモーターの制御のもとで の造成物の発現のため、Ｅ、コリ？１Ｍ２９４株（前掲）　、Ｔａｌｍａｄｇｅ 、に、等、Ｇｅｎｅ　（１９８０）ユニ　２３５；Ｍｅｓｅｌ−ｓｏｎ＋Ｍ、等 、Ｎａｔｕｒｅ（１９６８）２１７　：　１１１０を宿主として使用した。

ＰＬＮ！Ｉ１１！プロモーターの制御のもとでの発現のため、Ｅ、コ’Ｊ　Ｋ１ ２　ＭＣ１００Ｏラムダ溶原株Ｎ７Ｎｓｉｃ１８５７５ｕ−Ｐｓｏ　、ＡＴＣＣ ３９５３１（以後、ＭＣ１０００−３９５３１と称する場合がある）を使用する 。

Ｍ１３ファージ組換体のため、ファージ感染に感受性のＥ、コリ株、例えばＥ、 コリに１２株Ｄ０９８を使用する。

ＤＣ９８株は１９８４年７月１３日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号１９ ６５を有する。

Ｄ、ヒトＴＮＦのクローニング　び 次に、ヒト−ＴＮＦ　１のためのコード配列を取得し、この配列の発現ベクター への配置し、そして目的の蛋白質の発現を得るための方法を例示する。

Ｄ、１．ヒトＴＮＦの言ｊ、＋■　び″浅り、１．ａ、工凡旦生誘盪 高濃度（約２Ｘ１０６細胞／　ｍ　ｌ　）の定常期のＨＬ−６０細胞を遠心分離 し、血清の非存在下でＲＰＭ１１６４０培地で洗浄し、そして次に１×１０７細 胞／　ｍ　Ｒの濃度に再懸濁した。次に、細胞を一定撹拌を伴って３７℃にて３ ０分間、懸濁培養において、１１００ｎ／ｍｌのホルボールエステル、１２−０ −テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）で処理した。培養 物を遠心し、上清をデカントし、細胞を１０μｇ　／　ｍ　ｌの縮閉リボポリサ ンカライド（ＬＰＳ）及び１０μＭのＣａイオノホーレ（Ａ　２３８１７）を含 有するＲＰ旧中に１×１０７細胞／　ｍ　ＩＩで一定撹拌のもとて３７℃にて４ 時間再懸濁した。細胞を１２００ｒｐｍにて１０分間回転沈降せしめ、そして上 清を８００Ｏｒｐｍにて２０分間再遠心分離した。得られた上清をり、１．ｂ項 の精製法において用いて天然ＴＮＦを得た。

Ｄ、１．ｂ、工に旦■簾製 り、１．ａ、項において誘導されたＨＬ−６０から調製された約４〜８βの上滑 をアミコン中空繊維（１平方フイートのカートリッジ／１０．ＯＯＯＭＷカット オフ）により約３００ｍｊ！に濃縮した。濃縮された培養液を遠心して細胞破片 を除去し、そして上清を３０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８，２）に より６．２　ｍ　Ｓの電導度に調製した。この溶液をＰＭＩＯ（アミコン）膜を 用いる限外濾過によりさらに濃縮し、そして濃縮された液を遠心分離（２０，０ ＯＯＸ　ｇ、１０分間）により透明にした。

次に、上清を、３０ｍＭ炭酸水素アンモニウム／１ｍＭＮａＣ１（ｐＨ８，２） 中で平衡化したＤＥＡＥイオン交換カラムに適用し、そしてカラムを同じ緩衝液 で洗浄した。両分を集め、そして蛋白質を２８０ｎｍでモニターした。これらの 非結合画分をＬ−９２９細胞毒性アツセイを用いてアッセイし、そしてＴＮＦ活 性を有する両分をプールし、そして限外濾過により再度濃縮した。

この濃縮物を、３０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐ）１７．４）中で平衡 化したセファデックスＧ７５スーパーフアイン（ファルマシア）に適用した。同 じ緩衝液により洗浄することによって得られた非結合画分を２８０ｎｍにおいて モニターし、そしてＴＮＦについてアッセイした。ピークＴＮＦ生物活性を含有 する両分を凍結乾燥した。

凍結乾燥された蛋白質をＬａｅｍｍｌｉＳＤＳサンプル緩衝液中に再懸濁し、そ して５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ゲルを２鶴の切片に細 断し、そして各切片からの蛋白質を１ｍβの３０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝 液（ｐＨ７，４）中への漫清しそして室温にて一夜振とうすることにより溶出し た。

ＴＮＦ生物活性を有する切片を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で平衡 化されたバイダック（Ｖｙｄａｃ）　Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム上に適用し、そし て０．１％ＴＦＡ中０％〜６０％アセトニトリルの直線グラジェントを用いて活 性を溶出した。

蛋白質を２８０　ｎ　ｍ及び２１４ｎｍにおいてモニターし、そして両分を凍結 乾燥後にバイオアッセイし、そして３０ｍＭ炭酸水素アンニニウム緩衝液（ｐＨ ７，４）中に懸濁した。ＴＮＦ活性を含有する両分を再度凍結乾燥した。

得られた蛋白質は配列決定分析のために使用するのに十分な純度を使していた。

ガス相シーケンサ−（アプライド・ビオシステムス社）を用いて配列を決定した 。最初の２２個のアミノ酸から得られた配列を次に示す。

Ｖａｌ　−八ｒｇ　−Ｓｅｒ　−八ｒｇ　−Ｔｈｒ　−Ｐｒｏ　−Ｓｅｒ　−Ａ ｓｐ　−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｖａｌ　−八ｌａ　−Ｖａｔ　−Ｓｅｒ　−Ｖａ ｔ　−八ｌａ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−１’９　２０　２１　２２ （Ｇｉｎ）　−（Ａｌａ）　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙさらに、精製された蛋白質（Ｇ −７５ゲルから）を他のヒト腫瘍及び正常セルラインを基材（ｓｕｂｓｔｒａｔ ｅ）として用いるＬ−９２９細胞毒性アツセイの変法を用いて試験した。Ｌ−９ ２９細胞に対するこのアッセイにおいて毒性であったＧ−７５画分は、Ｈｓ９３ ９Ｔ　（黒色腫系）、ＢＴ−２０（乳癌”）　、Ａ４２７（肺癌）　、ＨＴ−１ ０８０（結腸癌）、及びＨＴ−２９（結腸癌）に対しても毒性であった。これら の両分はＨｓ９３９ｓｋ（皮虜線維芽細胞）、ヒーラ細胞（頭痛）　、Ｈｓ２７ Ｆ（***線維芽細胞）、又はＣ０Ｓ７　（ＳＶ−４０で形質転換されたサルの細 胞）に対して毒性でなかった。

Ｄ、２．　１−Ｆ！びＤへ既製 ヒトＴＮＦをコードするイントロン不含有ＤＮＡ配列をこの明細書に記載する方 法により調製した。誘導された場合に大量のＴＮＦを生産するヒト前骨髄球性白 血病セルラインＨＬ−６０系（ＮｏＣＣＬ２４０として＾ＴＣＣから入手）を、 ｃ　ＤＮＡライブラリーを得るためのｍＲＮＡ源として使用した。これらの細胞 から精製されたＴＮＦから決定された蛋白質配列に基いて造成されたオリゴヌク レオチドプローブを用いてこのｃＤＮＡライブラリーを検索し、蛋白質の完全コ ード配列を回収した。

Ｄ　、２．ａ、−されたｍＲＮＡのＵ 次の様にしてＨＬ−６０細胞から全メツセンジャーＲＮＡを抽出しそして精製し た。ＨＬ−６０細胞をＴＮＦ生産のためにり、１．ａ、に記載したようにして誘 導し、そして４時間の細胞懸濁液を遠心分離により収得した。全細胞質性リボ核 酸（ＲＮＡ）を次のようにして単離した。すべての段階は４℃で行う。細胞をＰ ＳＢ　（リン酸緩衝化塩溶液）で２回洗浄し、そして１０ｍＭバナジルアデノシ ン錯体ＣＢｅｒｇｅｒ、Ｓ、Ｌ、等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９７９）±８：５ １４３）を含有するＩ　ＨＢ　（１４０ｍＭＮａＣＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、 １．５ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ！ｚ　、ｐＨ８）に？！、濁する。

エチレンオキシドポリマータイプの非イオン性洗剤を０．３％になるように加え て核膜ではなく細胞膜を溶解した。１　、０ＯＯＸｇにて１０分間遠心分離する ことにより核を除去した。核後の上清をＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、１　ｍ Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、ｐｌ＋７．５　）で飽和したフェノ ール／クロロホルム（＋、　：　１）　（０，５％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ ＤＳ）及び１０　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する〕等容量に加えた。上清を４回再抽 出しそして２０００Ｘｇにて１０分間遠心して相分離した。

サンプルを０．２５Ｍ　ＮａＣβに調製し、２容量の１００％エタノールを添加 し、そして−２０℃に貯蔵することによりＲＮＡを沈澱せしめた。ＲＮＡを５， ０００Ｘｇにて３０分間ペレット化し、７０％及び１００％のエタノールで洗浄 し、そして乾燥した。ポリアデニル化（ポリＡＭメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲ ＮＡ＞を全細胞質ＲＮＡからオリゴｄＴセルロース上でのり０７トグラフイーに より得た（Ａｖ＋ｖ＋Ｊ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（１９７２）　６９　：　１４０８４４１２　）　、すな わち、ＲＮＡをＥＴＳ　（１０ｒｎＭ　Ｔｒｉｓ　、１　ｍＭ　［ＥＤＴＡ　、 　０．５％５ＤＳＸｐ）１７．５）に２ｍ　ｇ　／　ｍ　ｅの濃度で溶解した。

この溶液を６５℃にて５分間加熱し、次に迅速に４℃に冷却した。ＲＮＡ溶液を 室温にした後、これを０．１　Ｍ　ＮａＣβに調整し、そして結合緩衝液（５０ ０ｍ　Ｍ　ＮａＣ１２，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　％　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐ Ｈ７，５）によりあらかじめ平衡化したｄＴセセルースカラムに通した。流過液 をさらに２回カラムに通し、そしてカラムを１０容量の結合緩衝液で洗浄した。

ポリＡ″ｍＲＮＡをＥＴＳのアリコートにより溶出し、ＴＥを飽和したフェノー ル・クロロホルムにより１度抽出し、そして０．２　ＭへのＮａＣβ及び２容量 の１００％エタノールの添加により沈澱せしめた。ＲＮＡを２回再沈澱せしめ、 ７０％エタノール中で１回、そして次に１００％エタノール中で洗浄した後に乾 燥した。

ポリＡ’　ｍＲＮＡを、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（１（ｐＨ７，４）　、１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ　、　１０　ｍＭ　ＮａＣ＃及び０．１％ＳＤＳ中でのシュークロ ースグラジェントにより分画した。ベックマンＳＷ４０ローター中３８．　ＯＯ Ｏｒｐｍにて１７時間遠心した後、ｍＲＮＡをグラジェントからエタノール沈澱 により回収した。ｍＲＮＡを卵母細胞に注入しそして卵母細胞抽出物を細胞毒性 活性についてアッセイすることによりＴ　Ｎ　Ｆ　ｍ　ＲＮ　Ａを含有する両分 を同定した。ピーク活性を含有する両分をプールしてｃＤＮＡライブラリーの造 成のために使用した。

Ｄ、２．ｂ、ｃＤＮＡライブラリー〇′告ポリＡテイルのオリゴｄＴプライミン グ及びＡＭＵ逆転写酵素を用い、Ｏｋａｙａｍａ、ｔｌ、等、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、（１９８３）　３　：　２８０（引用によりこの明細書に組み入れ る）を用いて濃縮された１　６　ＳｍＲＮＡ画分からｃＤＮＡを調製した。この 方法は高い比率の十分に長いコドンをもたらし、そして宿主ベクターとしてそこ に記載されておりそして著者から容易に入手することができる２つのベクター、 すなわちｐｃＤＶ　１及びｐＬｌの部分を使用する。得られたベクターは近位Ｂ ａｍＨＩ及びＸｈｏ　１制限部位を含むベクター断片間に挿入部を含有する。こ のベクターはｐＢＲ３２２の複製開始点及びＡｍｐ耐性遺伝子を含有する。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーを調製するための他の方法は、言うまでもなく当業 界において良く知られている。今や古典的となった１つの方法は、オリゴｄＴプ ライマー、逆転写酵素、ボ１ＪｄＧによる２末鎖ｃＤＮＡのテイル形成、及び所 望の制限部位において開側されておりそしてポリｄＣによりティル形成されてい るｐＢＲ３２２又はその誘導体のごとき適当なベクターへのアニーリングを用い る。この代替可能な方法の詳細な記載は例えば本承継人と同じ承継人に承継され た米国特許出願Ｎｔ１５６４，２２４中に見られる（これを引用によりこの明細 書に組み入れる）。

この発明において使用される方法においては、濃縮されたｍＲＮＡ　（５ＩＩ　 ｇ）を、２２°Ｃにて５分間１０ｍＭメチル水銀で処理することによって変性し 、そして１００ｍＭ２−メルカプトエタノールを添加することにより解毒した（ Ｐａｙｖａｒ。

Ｆｏ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９７９）２５４　：　７６３６−７６４ ２　）　、プラスミドｐｃＤＶ　１をＫｐｍｌで開裂せしめ、ｄＴＴＰでティル 形成し、そして変性したｍＲＮＡにアニールした。このオリゴｄＴプライムドｍ ＲＮＡを逆転写酵素で処理し、そして新しく合成されたＤＮＡ鎖にｄＣＴＰによ りテイル形成した。最後に、ｐｃＤＶ　１ベクターの不所望の部分をＨｉｎｄＩ ［Ｉによる開裂によって除去した。

これとは別に、ｐＬｌをＰｓｔＩにより開裂せしめ、ｄＧＴＰによりテイル形成 し、ｔｌｉｎｄｌｌｌにより開裂せしめ、そして次にｐｃＤＶ１ベクター断片に より延長されたポリＴティル形成されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡコンプレックスに、 Ｅ９コリ・リガーゼを用いて連結し、そしてこの混合物をＤＮＡポリメラーゼ■ （Ｋｌｅｎｏｕ）、Ｅ、コリ・リガーゼ、及びＲＮアーゼＨで処理した。生じた ベクターをＥ、コリに１２　ＭＭ２９４に形質転換して八ｍ　ｐ　Ｒとした。

Ｄ　、２．ｃ、ブ０−７”Ｏ”１仮 精製されたＴＮＦ配列のアミノ酸８−１２のコード配列に相補的なオリゴマーを 調製した。コドンの冗長性のため、合計６４種類の１４−マーをこの部分をコー ドするメンセンジャーに対する相補性の候補とする。合計６４種類の１４−マー を調製し、そして１６種類ずつの４個のプールに分けた。

各プールを、上記のようにして調製したシュークロースグラジェント画分した濃 縮されたｍＲＮＡ調製物と混合し、そしてこの混合物を卵母細胞翻訳系に注入し た。未処理のメツセンジャーＲＮＡを用いて対照試行を行った。卵母細胞系で生 産された蛋白質をＬ−９２９細胞毒性アツセイ　（：ｌＳ　ｓ放出）にかけ、対 照及びｍＲＮＡと３つのオリゴマープールとの混合物を注射された卵母細胞由来 の蛋白質が活性を示した。この１バイブリド捕捉”アッセイにおいて、次の配列 ：を有するプールで処理されたメツセンジャーを注入された卵母細胞のみ不活性 であった。このオリゴマープールの特異性を、誘導されたＨＬ−６０細胞及び未 誘導ＨＬ−６０細胞の両者から上記のようにして調製した濃縮したｍＲＮＡ、並 びにリンホトキシンを生産することが知られている細胞から得られた対応するｍ ＲＮＡ画分との“ドツト・プロット”ハイブリダイゼーション用いてさらに決定 した。このプールは誘導されたｍＲＮＡには良好にハイブリダイズしたが、しか し未誘導細胞又はリンホトキシン生産細胞からの対応する両分とはハイブリダイ ズしなかった。しかしながら、プローブとしてキナーゼ処理されたプールを用い るＮｏｒｔｈｅｒｎブドットは、これが１８８（リボゾーム）ＲＮＡ画分及びｐ ＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａと交差ハイブリダイズする配列を含有することを示した。

従って、この好結果のプールを、８対の１４−マーとしてその構成員を合成し、 その各対を用いて上記のようにして“バイブリド捕捉”アッセイを行いことによ りさらに分画した。次の配列： を有する対のみが、卵母細胞中でのＴ　Ｎ　、Ｆの合成の阻害において好結果で あった。分画された誘導されたＨＬ−６０ｍＲＮＡ画分、誘４された全ＨＬ−６ ０ポリＡ”　ＲＮＡ、未誘導ＨＬ−６０ポリＡ″ＲＮＡ、及びｐＢＲ３２２Ｄ　 Ｎ　Ａを用いるドツト・プロット実験は、目的のメソセンジャーにハイブリダイ ズするために前記の１４−マ一対が特異的であること、及び他の対が不能である ことを確認した。

Ｄ、２．ｄ、旦ユ上鳶刀盗１１゜ 上に調製したｃＤＮＡをＤ　、２．ｃ、において同定した１４−マ一対を用いて 検索した。プローブとハイブリダイズする２８個のコロニーを拾い、培養し、そ してプラスミドＤＮＡを単離した。全配列をコードするのに十分な長さの挿入部 を含有するプラスミドを選択し、そしてＢ、５項において前記したようにして、 細胞毒性アッセイの３５８放出形式と組合わせたバイブリド翻訳を用いて正しい 配列について幾つかのプラスミドをアッセイした。バイブリド翻訳アッセイは、 試験配列が未分画調製物から正しいｍ　ＲＮ　Ａを回収することを利用し、これ は回収されたメソセンジャーを注入した卵母細胞翻訳系により生産された蛋白質 をアッセイすることにより確認される。

試験すべきプラスミドｃＤＮＡをフィルターに結合せしめ、そして誘導されたＨ Ｌ−６０細胞から単離されたポリＡ″ＲＮＡにより前記フィルターを処理する。

次に、フィルターを溶出し、溶出物を卵母細胞翻訳系に注入する。卵母細胞を蛋 白質について抽出し、次にこれをＬ−９２９毒性アツセイの３５３形式において 試験する。Ｅ２〜Ｅ４、Ｅ６、及びＥ８と称する若干のハイブリダイズするクロ ーンについての結果をｐＢＲ３２２９ Ｂや　２４ （Ａ、及びＢヤはシュークロースグラジェントにより得られた？農縮されたｍＲ ＮＡを用いる対照であり、Ｅｌ及びｐＢＲ３２２は陰性対照である。） 挿入部の制限分析及び部分配列決定は、２つの候補プラスミドｐＥ４及びｐＢｌ ｌが完全なＴ　Ｎ　Ｆコード配列を有するらしいことを示した。ｐＥ４について のこの分析の結果を第２図に示す。

ｐＥ４を配列決定し、そして３つの可能なリーディングフレームすべての翻訳か ら推定されるアミノ酸配列を、精製された蛋白質のＮ−末端配列決定により決定 された天然成熟ＴＮＦの既知のＮ−末端配列とマツチさせることにより、ＴＮＦ のための正しいリーディングフレームを同定した（第１図を参照のこと）。成熟 蛋白質中のアミノ酸配列には、１位のバリンから出発して番号を付す。前記のご とく、相同性は完全ではながした。しかしながら、高度の相同性により正しいｃ ＤＮＡが選択されていたことが示された。第２図に示す実験的に決定された制限 開裂部位の証明も与えられる。１．１に、ｂＰｓｔｌ断片中の３’Ｐｓｔ１部位 の上流の旧ｎｄｌＩＩは終止コドンの下流にあり、従って後記のごとき上流領域 の変形の後コード配列を旧ｎｄｌｎカセントとして切り出すことを可能にする。

Ｄ、３．ＤＮＡ配置からパ　されるヒトＴＮＦの、−徹オしり第１図中に示され るｃＤＮＡ配列から推定されるように、成熟ＴＮＦ蛋白質は１５７個のアミノ酸 残基を含有し、そしてグリコジル化を伴わないで約１７，３５４の分子量を有す る。リーダー配列は、最初の利用可能なＭｅｔ出発コドンから始まっておよそ７ ６個のアミノ酸を含有する様である。６９位及び１０１位に２個のシスティン残 基が存在し、活性構造がジスルフィド結合を含有する可能性を導く。

Ｄ、４．−　ベタ　−の８゜−１ Ｄ　、４．ａ、Ｎ−〇“コドンの・ノ 成熟蛋白質の発現を行うために、成熟蛋白質のＮ−末端バリン（第１図中１とし て示される）をコードするＧＴＣ配列にすぐ先行してＡＴＣ開始コドンを導入し 、そして適当な宿主発現ベクターへの連結のためにＡＴＧのすぐ上流に旧ｎｄＩ ＩＩ部位を設けるのが便利であった。これは、Ｃ，４項に記載した部位特定変異 誘発により達成した。

さらに詳細には、コード配列の上流部分を含有するＤＮＡ断片をＰｓ口によりｐ Ｅ４から切り出し、アガロースゲル電気泳動により単離し、電気溶出により回収 し、そしてバクテリオファージＭ１３ｍｐ１８のＰｓｔＩ部位に連結した。

連結されたファージを凍結されたコンピテントＥ、コリに１２株Ｄ　Ｇ　９８　 （ＡＴＣＣ＃３９７６８）に形質導入し、そしてシグマ社（セントルイス）から 入手したイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）　５　Ｘ　１０−’Ｍ及び ４０μｇ／ｍｌｌのＸ−ｇａｌを含有する培地上にプレートすることにより培養 した。非−α−補完白色プラークは新たな培地に拾い上げた。予想される（ｉ、 １ｋｂ）サイズの挿入部を含有する組換体単鎖ファージＤＮＡについてミニ−カ ルチ、１アーをスクリーニングした。

クローン４．１と称する目的とする組換体ファージの構造を制限酵素分析を用い てｌＩ！認した。

次の配列： ５　’　−ＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＧＡＣＣＡＴＡＡＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＧ ＣＣ−３’を有する化学合成され精製された３３−マーオリゴデオキシリボヌク レオチドを用いて、成熟ＴＮＦ蛋白質の第１アミノ酸（バリン）をコードするＧ ＴＣコドンの前に旧ｎｄＩＩＩ制■酵素部位及びＡＴＧ−開始コトンを導入した 。

１０　ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドを、ｌ　Ｑ　ｍ　Ｍ　ＮａＣｌ−％２０ 　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ’　（ｐＨ７，９）　、２０　ｍＭ　ＭｇＣ６ｚ及び ２０ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有する混合物１５μβ中で、６７°Ｃに て５分間及び４２℃にて２５分間加熱することにより２．６μｇのｓｓクローン ４．１ＤＮＡとハイブリダイズせしめた。このアニールされた混合物を氷上で冷 却し、そして次に０．５ｍＭの各ｄ　ＮＴ　Ｐ、１７　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ ！　（ｐＨ７，９）、１７ｍＭ　Ｍｇ１ｚ　、８３ｍＭ　ＮａＣｆ、］、７７ｍ Ｍβ−メルカプトエタノール５ユニツトのＤ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎ ｏｗ断片を含有する反応混合物２５μｐの初期容量に調製し、３７°Ｃにて１時 間インキュベートした。８０℃に加熱することにより反応を停止し、そしてこの 反応混合物を用いてコンビテン）Ｄ０９８細胞を形質転換し、寒天プレート上に プレートし、そして−夜インキユベートしてファージプラークを得た。

変異したクローン４．１プラークを含有するプレート、及び変異していないクロ ーン４．１フアージプタークを含有する２枚のプレートを４℃に冷却し、そして 寒天プレート上に第１ノ乾燥フイルターを５分間置き、そして第２のフィルター を２５分間置くことによって、各プレートからファージプラークを２枚のニトロ セルロースに移した。次に、このフィルターを、０．２　ＮＮａＯＨ，１，５Ｍ 　ＮａＣ１及び０．２％トリトンＸ−１００に浸漬した厚いフィルター上に５分 間置き、そしてＱ、　５　ＭＴｒｉｓ　−１１Ｃ（１（ｐｉｆ　７．５　）及び １．５　Ｍ　ＮａＣｅに浸漬したフィルター上にさらに５分間置くことによって 中和した。このフィルターを、２ＸＳＳＣ浸漬したフィルター上で同様にして洗 浄し、乾燥し、そして真空オーブン中で８０℃にて２時間加熱した。２枚のフィ ルターを４２℃にて４時間、フィルター当り１０ｒｒｌのＤＮＡハイブリダイゼ ーション緩衝液〔５×ＳＳＣ，、ｐｉ（７，０，４×デンハート溶液（ポリビニ ルピロリドン、フィコール及びウシ血清アルブミン、１×−各０．０２％）、０ ．１％ＳＤＳ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０、及び１００μｇ 　／　ｍ　Ｅ変性サケ***ＤＮＡ）により前ハイブリダイブせしめた。プライマ ーをラベルされたＡＴＰと共にキナーゼ処理することにより３２ｐ−ラベル化プ ローブを調製した。フィルターを、フィルター当り１〜５ｍｌのＤＮＡハイブリ ダイゼーション緩衝液中５　Ｘ　１１０６ｃｐ／　ｍβの３２ｐ−ラベル化プラ イマーに６４°Ｃにて８時間ハイブリダイズせしめた。

フィルターを室温にて１０分間、０．１％ＳＤＳ、２０ｍＭリン酸すＩ・リウム （緩衝剤）及びｅＸＳＳＣ中で１回；３７°Ｃにて２０分間、緩衝剤及び２ＸＳ ＳＣ中で１回；５０℃にて２０分間、緩衝剤及び２ＸＳＳＣ中で１回；並びに最 後に６０℃にて２０分間、緩衝剤及びＩ　Ｘ５ＳＣ中で洗浄した。

フィルターを空気乾燥し、そして−７０″Ｃにて４時間オートラジオグラフ処理 した。変異したクローン中に新たなＨｉｎｄＩ［［制限部位を形成するためにオ リゴヌクレオチドプライマーを選択したので、このプライマーとハイブリダイズ した多数のクローンからのＲＦ−ＤＮＡをこの制限酵素により消化した。新しい 旧ｎｄＩ［Ｉ制限部位を有する変異したクローン４．１プラークの１つを拾い、 そしてＤＧ９８の培養物中に接種し、５ｓＤＮＡを培養上清から調製し、そして ｄｓＲＦ−ＤＮＡを細胞ベレ・７トがら調製した。正しい配列をジデオキシ配列 決定法により確認した。

正しく合成された鎖を単離し、そしてＰｓｔｌ及び旧ｎｄｎ［（部分的）により 、又は旧ｎｄｌＩ［のみにより開裂せしめて発現ベクターに連結した。

Ｄ、４．ｂ、　ベクターの浩゛ 原核性発現のため、コード配列（幾らがの３′非翻訳ヌクレオチドと共に）をｄ ｓＭ１３−ＡＷ７０１がら２つの方法で切り出した。

第１の方法においては、ｄｓＭ１３〜ＡＷ７０１をＰｓｔｌで消化し、そして次 に旧ｎｄｌＩ［で部分消化して旧ｎｄｌｌｌ　−Ｐｓｔ　Ｉ　ＴＮ　Ｆコード配 列を得た。（Ｍ１３−ＡＷ７０１中には幾つがの旧ｎｄ１１１部位が存在するた め旧ｎｄｌＩ＋部分消化が必要である。）ＤＮＡ断片の部分消化は、ＤＮＡの完 全消化のために必要な制限酵素量の１７１０を用いることにより行うことができ る。混合物をその酵素について適当な温度においてインキュベートし、そして消 化混合物のアリコートを１０分間の間隔で１時間まで取り出した。次に、これら のアリコートをゲルに負荷し、そしてＤＮＡ断片を分析した。必要とされるＤＮ Ａ断片の最高収量をもたらした時点を制限酵素による調製的消化のために使用し 、そして適切な断片を電気溶出によりゲルから精製した。

ＴＮＦ遺伝子の３′−非コード配列を含有するＰｓｔ　Ｉ　／ＢａｍＨＩ断片を 、ｐＥ４から、酵素ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩによるＤＮＡの消化の後に精製した 。

ＨｉｎｄｌＩ［／　ＰｓｔＴ断片及びＰｓｔ　Ｉ　／Ｂａｍ）Ｉ　Ｉ断片は一緒 になってコード配列＋ＤＮＡの６００ｂｐ　３　’非翻訳部分を構成する。

２つの断片を次のようにして、旧ｎｄｍ／ＢａｍＨＩ消化した宿主ベクターｐＴ ＲＰ３に連結した。

ｐＴＲＰ３　（下記を参照のこと）はＥ、コリｔｒｐプロモーター及びリボゾー ム結合部位を含有する。ｐＴＲＰ３を旧ｎｄＩ［［及びＢａｍＨＩで消化し、そ してベクター断片をアガロースゲル上で精製した。次に、単離された断片を上記 の旧ｎｄＩ［［／　Ｐｓｔｌセグメント及びＰｓｔ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩセグメ ントと共に３方連結により連結し、そしてこの混合物を用いてＥ、コリＭＭ２９ ４をＡｌｌ１ｐＨに形質転換してｐＡＷ７０１を得た。

第２の方法においては、ｄｓＭ１３−ＡＷ７０１を旧ｎｄＩ［Ｉにより消化し、 そして遺伝子を含有する断片をアガロースゲル上で単離した。この単離された断 片を、ＨｉｎｄＩ［Ｉにより開裂されＢＡＰにより処理されたｐＴＲＰ３に連結 し、そしてＥ、コリＭＭ２９４に形質転換してｐＡＷ７０２を得た。

ＰＬプロモーター及びバシルス・ポジティブ・レトロレギュレトリー配列を含有 するｐＦＣ５４、ｔ　（ＡＴＣＣ３９７８９）又はｐＰＬＯＰ　（下記を参照の こと）を宿主ベクターとして使用することもできる。これらのベクターを旧ｎｄ ｌｌｌ及びＢａｍＨｉにより消化し、そして制御配列を含有する大プラスミド断 片をアガロス上で精製する。上記のようにして調製したＴＮＦ遺伝子の旧ｎｄＩ ＩＩ／ＰｓｔＩ部分及びＰｓｔＩ／Ｂａｍｔ目部分を、３方連結により、これら のベクターの旧ｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ部位に連結し７てそれぞれプラスミド ｐＡＷ７１１及びｐＡＷ７１２を得る。

他の方法として、ｐＨ４からの精製された１ｌｉｎｄＩＩＩ断片を、ＨｉｎｄＩ ］Ｔで開されＢＡＰで処理されたｐＦＣ５４，を又はｐＰＬＯＰに連結してそれ ぞれｐＡＷ７１３及びｐＡＷ７１４を得る。

Ｄ、４．ｃ、原基　−でのＴＮＦの　−ｐＡＷ７０１及びｐＡＷ７０２をＥ、コ リ財２９４に形質転換し、そしてｔｒｐプロモーターを抑制する条件下で培養物 を増殖せしめる。トリプトファンの涸渇による誘導の後、ＴＮＦの生産が開始さ れた。同様にして、ｐＡＷ７１１を造成し、そしてＥ、コリＭＣ１０００−３９ ５３１中に形質転換し、そして細胞を高温により誘導した。誘導条件下で数時間 培養した後、細胞を音波処理し、Ｌ−９２９細胞毒性アツセイにより音波処理物 がＴＮＦを含有することを確認した。結果は次の通りである。

プラスミド　ＴＪ／ｍ！ ７０１　１、３　ｘ　１０’ ７０２　１、３　Ｘ　１０’ ７１１　２　ＸＩＯ’ ＩＮＦ活性のユニットはＢ、５１項に定義した通りである。

Ｄ、４．ｄ、真挨立、血注沖１１どヨ飢ＬΔを里前記り、２．ｄ項のｃＤＮＡラ イブラリーから単離されたベクターｐＢ１１はＴ　Ｎ　Ｆコード配列に作用可能 に連結されたＳＶ４０プロモーターを含有する。２８個の陽性にハイブリダイズ するコロニーのすべて（特にｐＨ４及びｐＢｌｌを含む）はこの連結を含有する と予想され、そしてそれ由に適当な哺乳動物宿主中で発現することができる。従 って、ｐＢｌｌを用いてＣＯ３−７モンキー腎細胞を形質転換し、そしてこの細 胞をＳＶ４０プロモーターの誘導を行う条件下で培養した。シグナル配列がｐＢ ｌｌ中になお存在し、そして哺乳動物細胞系において機能するため、ＴＮＦは培 地に分泌された。

単層を形成したＣＯ３−７細胞上の上清中のＴＮＦをＬ−９２９細胞からの３５ ３の放出によりアッセイし、次の結果を得た。

プラスミド　３ＳＳ（λ改比によ搬− Ｂ　１１　２２，７６３ Ｅ９（陰性対照）２．７３９ −ＤＮＡ　２，５６５ Ｄ、５１皿狽ユΣ里と Ｄ・５・ａ−葺翌 ｐ静７１１により形質転換されたＥ、コリＤ　Ｇ　９５　（ＭＣ１００Ｏ−５９ ５３１に類似するラムダ溶原株）を３７℃にて標準的増殖培地中で約０．５のＯ Ｄ　ｂ。。に増殖せしめ、そして次に温度を４２℃に上昇せしめることにより誘 導した。２時間後、細胞を音波処理し、そしてＬ−９２９細胞毒性アツセイ　（ 前記）を用いて音波処理物がＴＮＦ活性を含有していることを確認した。次に、 音波処理物をＤＥＡＥセファロースカラム（ファルマシア）に適用し、そして緩 衝液（１０ｍ　ＭＴｒｉｓ、　ｐＨ８，２，１ｍ　Ｍ　ＮａＣｊ２　）により洗 浄した。１０　ｍ　ＭＴｒｉｓ　（ｐｔ＋　８．２　）中０．０２Ｍ、０．０４ Ｍ、０．１Ｍ、及び０．８　Ｍ　ＮａＣＡによる段階的摘出によりＴＮＦ活性を 含有する両分を得た。

Ｔ　Ｎ　Ｆ　ｌ活性のほとんどが０．０４Ｍ　ＮａＣβにおいて）８出した。

これらの両分を限外濾過により濃縮し、そして次にフェニルＴＳＫ−５ＰＷカラ ム（ＬＫＢ）を用いる）ＩＰＬｃによりさらに精製した。Ｔ　Ｎ　Ｆは０．１　 Ｍリン酸ナトリウム（ｐｌ＋　７．０　＞中１．８Ｍ硫酸アンモニウムの存在下 でカラムに結合し、そしてＯにまで低下する硫酸アンモニウム濃度によりカラム を展開した場合約０．４Ｍ塩化アンモニウムにおいて溶出した。Ｔ　Ｎ　Ｆを含 有する両分を限外濾過により濃縮し、そしてＧＨ７５サイズ分画カラム（アミコ ン）に適用して純粋なＴＮＦを得た。

Ｄ、５．ｂ、ＴＮＦミューティンの＼ 等電点電気泳動は、前項に記載したようにして調製されたＴＮＦが５．８〜６． ５の間の異るｐｉ値の幾つかの種から成ることを示した。すべての主要な種は予 想された成熟ＴＮＦ（ｍＴＮＦ）であることが示されたが、汚染ミューティン形 ４ＴＮＦも存在した。等電点電気泳動ゲルの結果はＴＮＦの多数の変形体が存在 することを示した。

調製的規模において４ＴＮＦからｍＴＮＦを分離するため、Ｄ、５１項に記載し たＥＤＴＡセファロースカラムを高度の分画を用いて溶出し、主ｍ　Ｔ　Ｎ　Ｆ ピークの溶出の前に、約０．０３Ｎ　ＮａＣ１において４ＴＮＦが富化された両 分を得た。富化された４ＴＮＦ４ＴＮＦ縮し、そして前記の条件のもとて１１　 Ｐ　Ｌ　ＣのためにフェニルＴＳＫ−５ＰＷカラムに適用した。富化された両分 の）ＩＰＬｃは上記のように約０．４硫酸アンモニウムにおいてｍＴＮＦ含有ピ ークをもたらし、そして０．１Ｍホスフェート（ｐＨ７）から脱イオン水への逆 グラジェントの場合に溶出する精製されたＴＮＦを脱イオン水と共にカラムに適 用した。４ＴＮＦピーク画分を濃縮し、そして前記のようにしてＧＨ７５上でさ らに精製し、ゲル上での等電点電気泳動において５．８のｐｒを有する均一な４ ＴＮＦを得た。　。

２８０ｎｍにおける吸収により同定される、前記のＧＨ７５精製段階から得られ るＴＮＦピークを含む両分の比活性を試験した０次の結果が得られた。

画　分　蛋白質濃度　生物活性　比活性ｔｌｈ　（ｍｇ／ｍ　ｌ　）　（Ｕ／ｍ ｊ！　）　（Ｕ／ｍｇ）１６　０．０４３　４．７Ｘ１０’　１．ｌＸ１０”１ ７　０．０９１　１．９　ｘ　１０’　２．Ｉ　Ｘ　１０”１８　０、１０２　 １．４　Ｘ　１０”　１．４　Ｘ　１０”１９　０．０６３　７．Ｏｘ　１０６ １，１　ｘ　１０’２０　．０．０３５　２゜４　Ｘ　１０’　６．９　Ｘ　１ ０’純蛋白について予想されるピークにわたって一貫している平均比活性は１． ３　ＸＩＯ’　Ｕ／ｍ　ｇである。これはｍＴＮＦのそれに比べて約１０倍高い 。

Ｄ・５・Ｃ−二王主」」び４ＴＮＦ（７）確認２種類のＴ　Ｎ　Ｆのアミノ酸組 成が下記の結果をもって比較された。

アミノ酸　予想組成　ＴＮＦ、　ＴＮＦ、　差（ｃＤＮＡ）　ｐ１５．Ｌ６．５ 　ｐＨ５，８ＴＮＦ＋−ＴＮＦｚＡｓｘ　１２　１２．７　］、２．４　０．３ Ｔｈｒ　６　６．２　６．１　０．ｌ ５ｅｒ　１３　１２．６　１０．９　１．７Ｇｌｘ　２０　２０．５　２０．２ 　０．３Ｐｒｏ　１０　１０．１　１０．３　−０．２ｃｒｙ　１１　１１．１ 　１１．１　０．０八Ｉａ　１３　１３．４　１３．１　０．３Ｖａｌ　１３　 １０．９　１０．２　０．７Ｍｅｔ　ＯＯ，２００，２ １ｉｅ　８　６．５　６．６　−０．ＩＬｅｕ　１７　１８．７　１８．５　０ ．２Ｔｙｒ　７　６．９　７．０　０．Ｉ Ｐｉｋｅ　４　４．０　４．０　０．０Ｌｙｓ　６　６．１　６．２　−０．Ｉ Ｈｉｓ　３　３．０　３．０　０．Ｏ Ａｒｇ　９　９．０　８．０　１．Ｏ ｎ＝　１５２　１５１．９　１４７．４　４．５両蛋白質は組成について比較し た場合ｃＤＮＡ配列から予想される組成と合理的に一致するが、しかしながら４ ＴＮＦは２個のセリン、１個のバリン、及び１個のアルギニン残基を欠いている ようであった。Ｎ−末端配列からのこれらの残基の除去は自動蛋白質シーケンサ −上での４ＴＮＦの配列決定により確認され、最初の１０個のアミノ酸の配列が 次のように与えられた。

この配列と第１図中の推定アミノ酸配列との比較は、この配列が最初の４個のア ミノ端残基Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−３ｅｒを欠くがこれに続く位置に一致する Ｎ−末端配列を有することを示し現 次の配列： ５　’　−ＣＡＣＴＣＧＧＧＧＴＴＣＧＡＧＡＣＡＴＡＡＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧ ＧＧＣＣ−３’を有する化学合成された精製された１５−マーオリゴデオキシリ ボヌクレオチドを用いてプールアウトし、そしてこれによってメチオニン開始コ ドンから下流の４個のＮ−末端アミノ酸をコードする１２ヌクレオチドを除去し た。

ｌ　Ｑ　ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドを２．６μｇのＳＳクロー７Ｍ１３− ＡＷ７０１　Ｄ　Ｎ　Ａに、　１００ｍＭ　Ｎａ１Ｊ　、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ −ＨＣｊ２（ｐＨ７，９）　、２０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ及び２０ｍＭβ−メルカプ トエタノールを含有する混合物１５μβ中で、６７℃にて５分間及び４２℃にて ２５分間加熱することによりハイブリダイズせしめた。アニールされた混合物を 氷上で冷却し、そして次に０．５　ｍ　ＭずつのｄＮＴＰ、　１７ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，９）、１７　ｍＭ　ｈｇｃＩ２２．８３　ｍＭ　ＮａＣ ，ｇ、１．７ｍＭβ−メルカプトエタノール、及び５ユニツトのＤＮＡポリメラ ーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片を含有する反応混合物の２５μβの最終容量に調製し 、３７°Ｃにて１時間インキュベートした。８０℃に加熱することにより反応を 停止し、そして反応混合物を用いてコンビテン１−ＤＧ９Ｂ細胞を形質転換し、 寒天プレート上にプレートし、そして−夜インキユベートしてファージプラーク を得た。

変異したクローンＭ１３−ＡＷ７０１プラークを含有するプレート、及び非変異 りローンＭ１３−ＡＷ７０１ファージプラークを含有する２枚のプレートを４℃ に冷却し、そして第１の乾燥したフィルターを寒天プレート上に５分間置き、そ して第２のフィルターを２５分間置くことにより各プレートからファージプラー クを２枚のニトロセルロースフィルターに移した。次に、これらのフィルターを 、０．２ＭＮａ叶、１．５　Ｍ　ＮａＣｌ及び０．２％トリトンＸ−１００中に 浸漬した厚いフィルター上に置き、そして０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ ｐＨ７，５）及び１．５　Ｍ　ＮａＣｊ２に浸漬したフィルター上に５分間置く ことにより中和した。フィルターを同様にして２ｘＳＳＣに浸漬したフィルター 上で２回洗浄し、乾燥し、そして次に真空オーブン中で８０°Ｃにて２時間加熱 した。２枚のフィルターを４２℃にて４時間、フィルター当り１０ｍ１のＤＮＡ ハイブリダイゼーション緩衝液Ｃ３ＸＳＳＣ（ｐＨ７，０）４ｘデンハート溶液 （ポリビニルピロリドン、フィコール及びウシ血清アルブミン、１×−それぞれ ０．０２％）、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０ ）及び１０（ｂＪｇ／ｍ７！の変性サケ***ＤＮＡ）と前ハイブリダイズせしめ た。フィルターを、フィルター当り１〜５ｍｊ２のＤＮＡハイブリダイゼーショ ン緩衝液中５×１０’ｃｐｍ／　ｍβの３２ｐ−ラベル化プライマーに６４℃に て８時間ハイブリダイズせしめた。

フィルターを、室温にて１０分間、０．１％ＳＤＳ、２０ｍＭリン緩ナトリウム （緩衝剤）及び５ＸＳＳＣ中で１回；３７℃にて２０分間、緩衝剤及びＺＸＳＳ Ｃ中で１回；５０℃にて２０分間、緩衝剤及び２　Ｘ５ＳＣ中で１回；及び最後 に６０℃にて２０分間、緩衝剤及びＩ　Ｘ５ＳＣ中で洗浄した。

フィルターを空気乾燥し、そして−７０℃にて４時間オートラジオグラフ処理し た。

陽性クローンからのＲＦ−ＤＮＡを１ｌｉｎｄＩＩＩで処理し、そして変異した ＴＮＦコード配列を含有する断片をゲル電気泳動により単離した。回収された配 列を旧ｎｄＩＩＩ開裂されそしてＢＡＰ処理されたｐＡＷ７１１に連結してｐＡ Ｍ７３６を得た。１２個のヌクレオチドの除去の存在を旧ｎｄｌＩ［及びｐｖｕ 　ＩＩによる制限分析により確認した。ｐＡＷ７１１により生成される１４６ｂ ｐＨ４ｎｄ　ＩＩＩ　／　Ｐｖｕ　ＩＩ断片に比べてｐＡＷ７３６は１３４ｂｐ 　ｌ１ｉｎｄｎｌ／Ｐｖｕ　ＩＩ断片を含有する。

ｐＡＷ７３６は１９８５年４月１０日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＮｏ、５３ ０９２の受託番号を有する。

ｐＡＷ７３６で形質転換されたＥ、コリＤＣ９５を前記のようにして増殖せしめ そして誘導した。音波処理物を前記のようにして調製し、そしてアリコートを１ ２．５％５ＯＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。４ＴＮＦを正確に前記のようにし て音波処理物から精製し、そして前に調製した４ＴＮＦと同一であることが等電 点電気泳動により示された。単離された４ＴＮＦをＬ−９２９細胞毒性アツセイ を用いて試験し、そして約２Ｘ１０”Ｕ／ｍｇの比活性を有することが示された 。

Ｄ、６項に前記したのと正確に同様の方法により、第１図に示される配列に比べ て最初の３〜１１個のアミノ酸残基を欠＜ＴＮＦ除去ミューティンを調製した。

第３図は得られるベクターの名称、及び除去を生じさせるために使用した部位特 異的変異誘発におい使用したオリゴマーを示す。この図はまた、１５６−１１５ ０−１及び１．４Ｏ−ＴＮＦ、並びにｄｅｓ−ｓｅｒ３ｄｅｓ−ｓｅｒ４及びｖ ａｌ＋５ｓｅｒ＋６ミエーテインのベクターの名称及びこれらの造成のために使 用したオリゴマーを示す。

５ｅｒ５　はＳｅｒ＋ｏ＋ミューティン同様にして、オリゴヌクレオチド指令変 異誘発を用いて、ＴＮＦ活性を有するがしかしＣｙＳｂｑが他のアミノ酸に変え られているか又は除去されており、そして／又はｃｙｓ　、。、が置き換えられ ているか又は除去されているミューティンをコードする変異ＴＮＦ遺伝子を得る 。ＣｙＳ６９から５ｅｒｂｑへの例示的な転換のために好ましいオリゴヌクレオ チドブライマーは、５　’　−ＣＡＴＧＧＧＴＧＣＴＣＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴ− ３’である。このオリゴヌクレオチドはＴＮＦ遺伝子のコドン６９と対合するト リブレット中にＴ−Ａの変化を有する。同様にして、１０１位のコドンと対合す るトリブレットに対応する変化を含むプライマーを用いてＣｙＳ　、。、をＳｅ ｒ　ｌ　ＯＩに転換することができる。

Ｄ　、４．ａ項に記載したようにしてｐＥ４のＰｓｔ処理により調製されたクロ ーン４．１を、Ｄ　、４．ａ項に記載したのと実質上同様であるがしかし次のプ ライマー： ５　’　−ＣＡＴＧＧＧＴＧＣＴＣＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴ−３’くこれは６９位 のシスティンに隣接する配列に相補的であるがしかしＴＧＣからＡＧＣへの変化 を行うコドンに相補的なヌクレオチドを含有する）を用いる部位特定変異誘発に かけた。変異したプラークを前記のようにして同定しそして配列決定により確認 した。目的とする変異を含有する１つのプラークＭＢ−ＡＷ７３１をＡｖａ　Ｉ 及びＰｓｔＩで消化し、そしてこの断片をＰｓｔｌ／Ａｖａｌで消化したｐｊＶ ７１１に連結した。連結混合物をＥ、コリＭＣ１０００・３９５３１に　形質転 換してＡｍｐ”にし、そしてプライマープローブを用いて形質転換体を正しい配 列についてスクリーニングした。ｐＡＷ７３１と称する１つのコロニーを変形さ れた配列の発現のために用いた。ｐＡＷ７３１は１９８５年１月２５日にＡＴＣ Ｃに寄託され、そして受託番号Ｎｏ、５３００７を有する。

同様にして、ｓｅｒ、。、ＴＮＦのだめの発現ベクターであるｐＡＷ７４］を８ 周製した。

システィン−６９及び／又はシスティン−１０１が除去されたＴＮＦミューティ ンをコードするＤＮＡ配列を用いてＮ−末端又はＣ−末端が除去されたミューテ ィンを変形して対応する“ダブル”ミューティン形を得る。これらのミューティ ンのための発現ベクターを、これらの変形を含有するＤＮＡコード領域のスイッ チ部分を適切な制限酵素を用いて断片化して上に調製したベクターに入れること により造成する。

５ｅｒｂＱ　、５１３ｒ＋Ｏ＋ｓ及び５Ｇｒ６９Ｓｅｒ＋ｏＩＴ　Ｎ　Ｆ形をそ れぞれプラスミドｐＡＷ７３１、ｐＡＷ７３２、又はｐＡ讐７３５から得る。特 に、プラスミドｐＡＷ７３１は広範に前記されており、ｐＡＷ７３２及びｐＡＷ ７３５はＳｅｒ＋ｏ　Ｔ　Ｎ　Ｆ及び５ｅｒｂｑｓｅｒｌｏ＋　Ｔ　Ｎ　Ｆをコ ードし、そして同様にして製造される。こうして得られた発現ベクターをＥ。

コリに形質転換し、そして細胞を培養し、そして上記のようにして誘導して目的 の蛋白質を得る。得られるＴ　Ｎ　ＦミューティンはｍＴＮＦに匹敵して活性で ある。

Ｄ、７．ｂ、也のミュー−インの　旦 ｐ静７３１を担持するＥ、コリＭＣ１００Ｏ−３９５１を増殖せしめそしてＤ　 、５．ａ、項に記載したようにして高温において誘導した。

誘導された細胞からの音波処理物をアッセイし、そしてｐＡＷ７１１形質転換体 とおよそ同じｍ１当りのＴＮＦ活性を有することが見出された。しかしながら、 ＳＤＳ分析は、これらの抽出物中の１７ｋＤＴＮＦ蛋白質の量は約５倍少なく、 ５ｅｒｉｑ　Ｔ　Ｎ　Ｆの比活性は変化していない蛋白質のそれよりも高いこと が示された。

後に記載する方法に従って、精製され（９５％）だ未変化の蛋白質をＤＴＴ及び ヨードアセテートで処理することにより還元しそしてアルキル化した。未処理の 蛋白質は２．６Ｘ１０’Ｕ　／　ｍ　ｌの活性を有していたが、還元された蛋白 質、又は還元されアルキル化された蛋白質は４．４〜４．８　ＸＩＯ’　Ｕ／ｍ βの活性を有していた。

処理　活性 Ｎｏ　ＤＴＴ　２．６Ｘ１０’ ０．１ｎ＋Ｍ　ＤＴＴ　３．３Ｘ１０’１　ｍＭ　ＤＴＴ　４．８Ｘ１０’ ２　ｍＭ　ＤＴＴ　３．９Ｘ１０’ １０　ｍＭ　ＤＴＴ　１．２Ｘ１０’ ２０　ｍＭ　ＤＴＴ　１．７ＸＸＯ’ 緩衝剤＋２．４　ｍＭ　ＩＡＡ　１．５Ｘ１０’１ｍＭ　ＤＴＴ＋２．４　ｍＭ 　ＩＡＡ　４．４Ｘ１０’ｐＡＷ７１１について前記したのと全く類似する方法 により、ＴＮＦのＮ−末端除去ミューティンをコードする第３図に記載するプラ スミドをＥ、コリに形質転換し、そして形質転換された細胞を培養し、そして誘 導して目的蛋白質の生産を得た。ｍＴＮＦ及び４ＴＮＦについて前記したのと同 様にして、こうして得られた組換蛋白質を精製しそしてアッセイした。Ｌ−９２ ９細胞毒性アツセイにおいて、これらのミューティンの比活性は６−８ＴＮＦを 最貰とするベル形曲線を示した。これらのミューティンの比活性はｍＴＮＦのそ れよりも５〜１０倍高いと算定される。これらの結果を第４図に示す。

さらに、これらのミューティンは、ｍ換生産の条件下でｍＴＮＦよりも均一な形 で生産されるようである。これは第５図及び第６図に例示されており、これらは それぞれ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動ゲルにか けられた場合のｍＴＮＦ及び種々のミューティンの精製された調製物を示す。各 図は、ｐＡＷ７１１　（ｍＴＮＦ）　、並びにそれぞれ４，６，７，８，９．及 び１０個のＮ−末端アミノ酸を欠（ｐ静７３６、ｐＡ讐７３９、ｐＡＷ７３７、 ｐＡＡｌ２Ｏ２ｐ静７４１及びｐ静７４２の発現生成物についての結果を示す。

第５図において、すべての蛋白質は均一のようであり、調製物が単離された蛋白 質のサイズに関して純粋であることを示している。しかしながら、第６図の結果 は、ｐＡＷ７１１　（ｍＴＮＦ）発現の生成物がｐｌ値を異にする蛋白質の混合 物であること示し、従って一次配列の側鎖の変形を示している。

ｐＡＷ７３Ｇの生成物は変形した側鎖を存する少量の蛋白質を含有するようであ るが、その他のプラスミドの発現生成物はきれいなようである。

Ｄ、８　インビボアッセイの′七− 組換生産されたｍ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　（ｒ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　）はＢ、５．ｂ、項に前記 したインビボアッセイにおいて活性であった。第７ａ図及び第７ｂ図は、ネズミ の線維肉腫及びの増殖及び宿主の生存に対するｒＴＮＦの０．５．１．０及び２ ．０μｇの注射の効果を示す。これらのアッセイにおいて、ＴＮＦの各示された 投与レヘルは個々の注射当たりの量を示す。注射は腫瘍を移植した後９日に開始 し、そして１日おきに合計６回の注射の間継続した。第７ａ図は、ＴＮＦ注射の 開始を示す０時点から始まる腫瘍の増殖に対するＴＮＦの効果を示す。底線にそ う矢印は投与時を示す。これらの結果は、静脈内投与された６×０．５μｇのｒ ＴＮＦさえ、対照と比較してｌｌｆｆ１瘍体積の有意な増加を防止することを示 している。第７ｂ図は、ＴＮＦ注射の最終日としての０時点くすなわち第７ａ図 の１０日間）から始まる生存率を示す。この結果は生存率（％）が３投与レベル のすべてにおいて劇的に改良されることを示している・ＭＣＦ−７腫瘍を移植さ れたマウスにおいて、腫瘍移植後７日に静脈内ＴＮＦ注射を始めた。第１の注射 （２μｇ）は毒性であり（１０マウス中５マウスが死亡）、そして合計５回の追 加の間１日おきに行われたその後の注射は、１ａｇ／マウスで行った。マウスに はさらに、１ａｇのエストラジオールを筋肉内に０日、２日、４日、７日、９日 及び１１日間に注射した。１４日間にわたり、ＴＮＦを注射されたマウスの腫瘍 体積は３００’から５０ｍｍｆｆにわずかに増加したが、対照のそれは３０ｆ１ ３から１３０ｍｍ’に増加した。

Ｄ、９．−吐凶シ以遺戊 ｐ　Ｐ　Ｌ　ＯＰは１９８４年１２月１８日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託 番号Ｎｏ、３９９４７を有する。その造成を下に記載する。

Ｄ、９．ａ、複製型並立 ｐＣＳ３は高温においてｐＰＩ、ＯＰ宿主ベクターの高コピー数をもたらす複製 開始点を提供する。その造成は１９８３年１０月１４日に出願された米国特許出 願１ｂ５４１．９４８に広範に記載されている（これを引用によりこの明細書に 組み入れる）。ｐＣ３３は１９８２年６月３日に寄託されており、そして受託番 号ＡＴＣＣ１１ｈ３９１４２を有する。

ｐＣ３３はｐＥＷ２７及びｐＯＰ９に由来する。ｐＥＷ２７はＥ、Ｍ、　Ｗｏｎ ｇ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　（１９８２）７９　：　３５ ７０に記載されている。

このものはその複製開始点の近傍にコピー数の温度制御をもたらす変異を含有す る。これらの変異の結果として、高温において高コピー数の複製が生ずるが、し かし低温においては低コピー数の複製が生ずる。

ｐＯＰ９は全温度において高コピー数のプラスミドであり、このものはＣｏｌ　 ＥｌタイプのプラスミドｐＯＰ６　（Ｇｅｌｆａｎｄ、　Ｄ、等、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　（１９７８）７５　：　５８ ６９）からのＥｃｏＲＩ／Ｐｖｕ　ＩＩ開始点含有断片をｐＢＲ３２２に挿入す ることにより造成された。挿入前に、この断片は次のようにして変形された。５ ０μｇのｐＯＰ６を２０ユニツトずつのＢａｍＨＩ及び５ｓｔｌにより完全消化 した。５ｓｔＴ３’突出末端を除去しそしてＢ　ａ　ｍ　５　’末端をフィルイ ンするため、消化されたｐＯＰ６ＤＮＡをＥ、コリＤＮＡポリメラーゼＩ（にｌ ｅｎｏｗ）により、まず３’５ｓｔｌ突出末端を除去するために２０℃における 、及び次に５′末端を修復するために９℃における２段階反応において処理した 。平滑末端断片を消化しそして０．０２μｍｏｌｅを使用してコンピテントＤＧ 　７５　（０’　Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｐ、等」よりａｃｔｅｒｉｏｌｏ　（１９ ７８）　１３４　：　６４５−６５４　〕を形質転換した。形質転換体を５０μ ｇ／ｍβアンピシリンを含有するしプレート上で選択し、そして３．３ｋｂの除 去、Ｓｓｔ　１部位の喪失、及び新たに形成されたＢａｍ旧部位の存在について スクリーニングした。

ｐＯＰ７と称する１つの候補を選択し、そして２５μｇのｐＯＰ７を２０ユニツ トのＢａｍ１　Ｉで消化し、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼＩ断片（Ｋｌｅｎｏｗ ）で修復し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼにより再連結することによりＢａｍ１（ １部位を除去した。コンピテントＤＧ７５を０．１ａｇのＤＮＡで処理し、そし て形質転換体を５０μｇ　／　ｍ　＋２のアンピシリンを含有するしプレート上 で選択した。候補をＢａｍ１日制限部位の喪失についてスクリーニングした。ｐ ＯＰ８を選択した。ｐＯＰ９を得るため、ｐＢＲ３２２からのＡｖａＩ　（修復 ）　／ＥｃｏＲＩ　Ｔｅｔ”断片を調製し、そして単離し、そしてｐＯＰ８から の単離されたＰｖｕｌＩ（修復）／ＥｃｏＲＩ３５６０ｂｐ断片に連結した。

１．４２ｋ　ｂＥｃｏＲＩ　／　Ａｖａ　Ｉ　（修復）Ｔｅｒ”（断片Ａ）と３ ．５６ｋ　ｂ　ＥｃｏＲＩ　／　Ｐｖｏ　ＩＩ　Ａｍｐ”　（断片Ｂ）の連結は ＩＥｃｏＲＩ末端の分子間連結を促進するため２段階反応において０．５μｇの 断片Ｂ及び４．５μｇの断片Ａを用いた。

コンビテン）ＤＧ７５を５μｌの連結混合物で形質転換し、そして形質転換体を アンピシリン（５０μｇ／　ｍ６）含有プレート上で選択した。ＡｍｐＲＴｅｔ Ｒ形質転換体から単離されたｐＯＰ９は、高コピー数、コリシン耐性、ＥｃｏＲ Ｉ　、　ＢａｍＨＩ　。

ｐｖｏ　ＩＩ及び旧ｎｄｌＩＩのための１個の制限部位、旧ｎｃＩＩのための２ 個の制限部位、並びに適切なサイズ及びＨａｅ　ｍ消化パターンを示した。

ｐＣ３３を得るため、５０μｇのｐＥＷ２７　Ｄ　Ｎ　ＡをＰｖｕ　ＩＩ及びＥ ｃｏＲＩにより完全消化した。同様に、５０μｇのｐＯＰ９をＰｖｕ　ｎ及びＥ ｃｏｌ’ｌ　Ｔにより完全消化し、そして３．３　ｋ　ｂ断片を単離した。

０．３６μｇ　（０，３２７ｐｍｏｌｅ）のｐＥＷ２７断片及び０．３５μｇ　 （０，１６μｍｏｌｅ）のｐｏｐ９断片を連結し、そしてＥ、コリ聞２９４を形 質転換するのに用いた。ＡｍｐＲＴｅｔＲ形質転換体を選択した。好結果のコロ ニーをまず３０℃及び４１℃においてβ−ラクタマ−ゼアソセイプレート上でス クリーニングし、そして次に３０゛Ｃ及び４１℃における増殖の後６、′プラス ミドＤＮＡレベルについてスクリーニングした。ｐＣ３３と称する好結果の候補 を配列決定により確認した。

Ｌｌ、９．ｂ、ＰＬＮＲよ二肥に饋ｑ汎盟ＰＬファージプロモーター及びＮ−遺 伝子（ＮＲＩＩ５）のためのリボゾーム結合部位を含有するＤＮＡ配列をｐＦＣ ５から、そして最終的にＳｈｉｍａＬａｋｅ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｎａｔ ｕｒｅ　（１９８１）２９２　：　１２８により掲載されたｐＫｃ３０の誘導体 から得た。ｐＫｃ３０はｐＢＲ３２２からのｌ１ｉｎｄ　ｎｌ　／　ＢａｍＨＩ 　ベクター断片中にクローン化されたラクダファージからの２．３４ｋｂ断片を 含有する。ＰＬプロモーター及びＮＲ１１，はｐＫＣ３０中Ｂｇｌ　ＩＩ及びＨ ｐａＩ部位間を占める。ｐＫｃ３０はＨｃｏＩＩ　１部位に転換されたＢｇｌＴ Ｉ部位を有する。

ＰＬプロモーターにすぐ先行するＢｇｌＩＩを次のようにしてＥｃｏＲ１部位に 転換した。ｐＫｃ３０をＢｇｌＩｌにより消化し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰで 修復し、そしてＴ４リガーゼによりＥｃｏＲＩリンカ−にューイングランド　ビ オラプスから入手）に連結し、そしてＥ、コリに１２株聞２９４ラムダ７に転換 した。プラスミドをＡｍｐＲＴｅｔ’形質転換体から単離し、そして所望の配列 を制限分析及び配列決定により確認した。生じたプラスミドｐＦＣ３をＰｖｕ　 Ｉ及びＩＩｐａＴにより２重消化して約５４ｏｂｐの単離された断片を得、そし てＫｌｅｎｏｗ及びｄＡＴＰで処理し、次にＳｌヌクレアーゼで処理して３′末 端配列−ＡＧＧＡＧＡＡ（−ＡＧＧＡＧＡ部分はＮＲＩＩ３である）を有する平 滑末端断片を生成せしめた。この断片をＨｃｏＩＩ　Ｉで制限処理して５　’　 −ＥｃｏＲＩ（接着末端）及びＨ４ｎｆｌ（部分修復、Ｓ１平滑）−３′末端を 有する３４７塩基対ＤＮＡ断片を得る。

ｐＦＣ５を完成するため、ｐβＬＺ１５を用いてＮ、ｌ、、、の３′にｔｌｉｎ ｄＩＩ１部位を形成した。ｐβＩ　−Ｚ　１−５は１９８４年１月１３日にＡＴ ＣＣｌＴｈ３９５７８とＬ７て寄託された。これは、ＡＴＧ　＋　１ａｃＺに融 合したβ−ＩＦＮの１４０ｂｐを含有する配列をｐＢＲ３２２に融合せしめるこ とによって調製された。ｐβｌ−２１５においては、ｐ［１Ｒ３２２のＥｃｏＲ １部位が維持されており、そして挿入部はβ−ＩＦＮのＡＴＧ開始コドンにすぐ 先行する旧ｎｄｌ１１部位を含有する。

ｐβＩ−Ｚ１５を旧ｎｄｌｌｌで制限処理し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰで修復 し、そして次にＥｃｏＲＩにより消化した。生じたＥｃｏＲＩ　／ＢｉｎｄｌＩ Ｉ　（修復）ベクター断片を上記のＥｃｏＲＩ　／１ｌｉｎｆ　Ｉ　（修復）断 片に連結し、そして連結混合物を用いてＭＣ１００Ｏ１３９５３１を形質転換し た。好結果の造成物を含有する形質転換体を、ラクト−ス最少培地上で３４°Ｃ にて増殖するが３０°Ｃにて増殖しない能力により同定した。（形質転換体を３ ０°Ｃ及び３４°ＣにおいてＸ−ｇａｌ−Ａｍｐｍｐ−レート上並びに３０℃及 び３４゛Ｃにおいて最少ラクトースプレート上にプレートした。適切な造成物を 有する形質転換体は両温度においてＸ−ｇａｌ−Ａｍｐｍｐ−レート上色である が、最少ラクトース培地上では３４℃においてのみ増殖する。）良結果の造成物 をｐＦｃ５と称した。

Ｄ　、９．ｃ、ｌ１ 次に、ＰＬ及びＮＲＨ５制限配列を設けるためにｐＣ３３を変形した。ｐＣ３３ をｔｌｉｎｄＩＩ［で消化し、そして次にＥｃｏＲＩで消化した。

ベクター断片をＰＬＮＲＢ３を含有するｐＦＣ５からの単離されたＥｃｏＲＩ　 ／　１ｌｉｎｄ　ｍと連結し、そしてＥ、コリ闘２９４に形質転換した。単離さ れたプラスミドＤＮＡの正しい構成を制限分析及び配列決定により確認し、そし てプラスミドをｐＰＬＯＰと命名した。

Ｄ、１０．　ユ鳳 ｐＴｒｌＰ３は１９８４年１２月１８日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号 Ｔｈ３９９４６を有する。この造成は次の通りである。

ｔｌｉｎｄＩＩＴ部位の後にｔｒｐ制御配列を含仔する宿主ベクターを造成する ため、アテヌエーター領域を欠（ｔｒｐプロモーター／オペレーター／リボゾー ム結合部位配列を、スタンホード大学Ｃ，Ｙａｎｏｆｓｋｙから入手したｐＶＩ Ｉ１５３から得た。ｔｒｐ配列は当業界においてよく知られた種々のプラスミド から得られる。ｐＶＩ＋１５３をＨｈａｌ（これは、露出されたご接着末端を残 してｔｒｐプロモーターのちょうど５′を切断する）により処理し、Ｋｌｅｎｏ ｗにより平滑末端化し、そしてＴａｇ　Ｉにより部分分解した。ｔｒｐリーダー のＡＴＧ開始コドンに先行する６ヌクレオチドであるＴａｇ　１部位における制 限に対応する９９ｂｐ断片を単離し、そして次にＥｃｏＲＩ　（修復）／Ｃ１ａ Ｉ消化されたｐＢＲ３２２に連結してｐＴＲＰ３を得た。

下記のプラスミドがアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション、ロンクビ ル、ＭＤ、米国（ＡＴＣＣに寄託された。これらの寄託は特許手続上の微生物の 寄託の国際的承認に関するブタペスト条約及びその規則（ブタペスト条約）の規 定のも、とになされた。これば、寄託の日から３０年間にわたる生存培養物の維 持を保証する。これらの生物は、ブタペスト条約に基き、そして該当する米国特 許が発効した後に無制限の入手可能性を保証する出願人とＡＴＣＣとの合意に従 って、ＡＴＣＣがら入手可能にされるであろう。寄託された菌株の入手可能性は 、いずれかの政府の権威のもとにその特許法に従って与えられた権利を侵害して 発明を実施する許諾であると解釈してはならない。

プラスミド　ＣＭＣＣＮｏ　ＡＴＣＣＮｏ　寄　託　日ｐＥ４／Ｅ、　ｃｏｌｉ 　ＭＭ２９４　２３１８　３９８９４　１９８４年１０月１５日ｐＡＷ７１１／ Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＧ９５　２１６２　３９９１８　１９８４年１１月　８日ｐ ＡＷ７３６／ＩＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＧ９５　２３１７　５３０９２　１９８５年 　４月１ｏ日ｐＡＷ７４２／Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＤＧ９５　２３４５　５３１６１ 　１９８５年　６月２１日ｐＡＷ７４１／Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＤＧ９５　２３４４ 　５３１６２　１９８５年　６月２１日ｐＡＷ７３９／Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＧ９ ５　２３４２　５３１６３　１９８５年　６月２１日ｐｌＶ７３７／Ｅ、　ｃｏ ｌｉ　ＤＧ９５　２３４０　５３１６４　１９Ｂ５年　６月２１日ｐＡＷ７４０ ／Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＧ９５　２３４３　５３１６５　１９８５年　６月２１日ｐ ＡＷ７３１／Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＧ９５　５３００７　１９８５年　１月２５日 ＦＩＧ、　２ 手続補正書（方式） 昭和６２年１月に日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８５１０１９２１ 、発明の名称 ヒト腫瘍壊死因子 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　シタス　コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１ｏ号静光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１５、補正命令の日付 昭和６１年１２月２３日（発送日） ６、補正の対象 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （２）委任状 ７、補正の内容 （１）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （２）　別紙の通り ８、　添付書類の目録 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（２）委任状及びその翻訳文　各 １通 国際調査報告 ｌｍｆｉａｌｎＭＩ　Ａ＊１ｍｍＭ　Ｎ、ＰＣＴ／ＵＳ　８５１０１９２１ＡＮ ＮＥＸ　Ｔｏ　Ｔ）！Ｅ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯ ＲＴ　ＯＮ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．組換ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）。
2. ２．第１図中位置１７−１５７に示されるアミノ酸配列を含んで成る組換ＴＮＦ 。
3. ３．第１図のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項に記載のＴＮＦ（ｍＴＮＦ ）。
4. ４．システインが除去されたミューテインである請求の範囲第１項に記載のＴＮ Ｆ。
5. ５．▽１−、▽３−、▽４−、▽５−、▽６−、▽８−、▽９−、及び▽１０− ＴＮＦから成る群から選ばれる請求の範囲第１項に記載のＴＮＦ。
6. ６．次のＮ−末端配列：【配列があります】を有する請求の範囲 第１項に記載のＴＮＦ。
7. ７．次のＮ−末端アミノ酸配列：【配列があります】を有する請求の範囲第１項 に記載の ＴＮＦ。
8. ８．ヒトＴＮＦをコードする組換ＤＮＡ。
9. ９．コードされたＴＮＦが第１図の位置１７−１５７中に示されるアミノ酸配列 を含んで成る請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ。
10. １０．コードされたＴＮＦが第１図のアミノ酸配列（ｍＴＮＦ）を有する請求の 範囲第８項に記載のＤＮＡ。
11. １１．コードされたＴＮＦがシステインが除去されたミューテインである請求の 範囲第８項に記載のＤＮＡ。
12. １２．コードされたＴＮＦが▽１−、▽３−、▽４−、▽５−、▽６−、▽８− 、▽９−、及び▽１０−ＴＮＦから成る群からのものである請求の範囲第８項に 記載のＤＮＡ。
13. １３．コードされたＴＮＦが次のＮ−末端配列：Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ ｏを有する請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ。
14. １４．コードされたＴＮＦが次のＮ−末端アミノ酸配列：【配列があります】 を有する請求の 範囲第８項に記載のＤＮＡ。
15. １５．適合性の宿主細胞中で請求の範囲第８項〜第１４項のＤＮＡの発現を行う のに効果的な制御配列及びコード配列を含んで成る組換ＤＮＡ。
16. １６．請求の範囲第８項〜第１４項のＤＮＡにより形質転換された組換宿主細胞 。
17. １７．請求の範囲第８項〜第１４項のＤＮＡにより形質転換された組換宿主細胞 を培養することを含んで成るヒト組換ＴＮＦの製造方法。
18. １８．活性成分が請求の範囲第１項〜第７項のＴＮＦである、哺乳動物において 腫瘍の壊死を行うのに有用な組成物。
19. １９．請求の範囲第１項〜第７項に定義する組換ヒト腫瘍壊死因子の抗腫瘍有効 量を宿主に投与することによる、腫瘍の治療方法。