JP4440342B2 - 二次性免疫不全症の治療用薬剤の製造方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明はサイトカインの天然混合物の改良された製造方法に関する。
発明の背景
近年、免疫系を調節してその応答を改善することが可能になってきており、この場合、その系の成分はその成分の機能を部分的または完全に回復するのに非機能性である。例えば、幹細胞を置換し、または欠けている幹細胞を与えるのに使用される骨髄移植がひどい複合免疫不全症を治癒することができる。別の例において、免疫細胞が癌患者から除去され、治療され、腫瘍退縮がある患者に戻される（Hwu及びRosenberg，1994a; Hwu及びRosenberg，1994b）。更に、γ−グロブリン及び静脈内免疫グロブリン（IVIG）の如き体液性免疫系の成分は広い治療用途があることが知られている（Desimoneら，1990; Hall，1993）。また、その他の免疫系成分が治療薬として使用されている（Hadden及びSmith，1992; Hadden，1993; Talmadge及びHadden，1994）。
免疫調節薬は、免疫機能を調節し、または免疫系の活性に正または負の効果を有する化合物である。臨床医薬中の免疫調節薬の使用は免疫機能の再生（または免疫不全症の修正）及び正常または過度の免疫機能の抑制を含む。免疫調節薬の主要なクラスはサイトカインである。組換え技術により、サイトカインの多くが臨床上の使用に現在利用できる。しかしながら、免疫系は複雑であり、しかも種々の成分の相互作用が免疫機能を有効に調節するのにしばしば必要である。免疫機能を有効に調節する種々の成分及び相互作用を与える製剤を設計することが有益であろう。
サイトカインは、胸腺由来Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球及び単球／マクロファージを含む活性化免疫細胞により産生されるペプチド／タンパク質免疫調節薬である。サイトカインとして、インターロイキン（IL-1〜IL-15）、顆粒細胞および／またはマクロファージに関するコロニー刺激因子（CSF）（CSF-G、CSF-M、CSF-GM）、腫瘍壊死因子（TNFα＆β）、及びインターフェロン（IFNα、β＆γ）が挙げられる。
インターロイキン-2（IL-2）はＴ細胞成長因子として最初に記載されたリンホカインである（Morganら，1976）。化学的には、IL-2は133アミノ酸、15,000ダルトン分子量の糖タンパク質である。それは正常な末梢血リンパ球、扁桃及び脾臓のＴ細胞、並びに大顆粒リンパ球により産生される。IL-2は抗原またはマイトジェン刺激Ｔ細胞の増殖を誘導し、支持する。Ｔリンパ球刺激機能に加えて、IL-2は免疫応答の開始、増大及び調節、γインターフェロン（IFNγ）の産生、リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞の誘導、細胞溶解Ｔ細胞の増殖、及びナチュラルキラー（NK）細胞のキラー活性の増強の如きプロセスに重要である。
組換えIL-2（rIL-2）はヒトｃＤＮＡ配列により生成される非グリコシル化タンパク質である。遺伝子操作されたIL-2はTaniguchiら（1983）及びDevos（1983）並びに米国特許第4,604,327号及び同第4,569,790号明細書に記載されたようにして得られてもよい。野生型または天然分子の位置125にあるシステインが中性アミノ酸、例えば、アラニンまたはセリンで置換されたrIL-2は、Markらの米国特許第4,518,584号明細書に記載されたようにして得られてもよい。
rIL-2を生成し、臨床純度で単離する方法が、培養Ｔ細胞からの天然IL-2の単離と同様に、Kothsらの米国特許第4,569,790号明細書に見られる。また、天然IL-2の生成方法が米国特許第4,390,623号、同第4,464,355号、及び同第4,448,879号明細書に見られる。Thurmanら（1986）は、部分精製された天然IL-2（nIL-2）製剤及びrIL-2製剤の異なる製剤が種々の生物学的アッセイにおいてそれらの活性の点でかなり変化することを開示している。
天然及び組換えの両方の種々の個々のサイトカインが癌及びその他の疾患の治療について調べられていた。例えば、組換えインターフェロンα2（rIFN α2）が有毛状細胞性白血病、カポジ肉腫、尖圭コンジローム、及び慢性肝炎の治療について米国食品薬剤管理局（FDA）により認可されている。白血球によりつくられた20種以上の混合物（アルフレオン▲Ｒ▼）としての天然IFN αが尖圭コンジロームについてライセンスされている。組換えIFN-γ（rIFN-γ）が慢性肉芽腫性疾患についてライセンスされている。rIL-2が腎臓細胞癌についてライセンスされている。これら及びその他のrIL及びrIFNが、癌の幾つかの形態を含む種々の疾患において活性評価中である。
更に、rIL-2癌治療が多くの診療所及び研究センターで研究されていた。Rosenberg及び同僚（Rosenbergら，1985; Mule及びRosenberg，1987; Rosenberg，1988; Belldegrun及びRosenberg，1989; Chang及びRosenberg，1989; Rosenberg，1994）は腎臓細胞癌、及び悪性メラノーマの患者の免疫治療における全身投与されるrIL-2の使用を報告していた。Cortesinaら（1988，1994）は頭部及び首の癌の患者における天然IL-2及びrIL-2のロコリージョナル（loco-regional）注射の効果を記載し、天然IL-2が腫瘍退縮を生じるのに更に有効であることを見出した。大投薬量のrIL-2を投与された患者は寿命を短くする毒性に苦しんでいた（Rosenbergら，1994）。
遺伝子操作された（組換え）免疫調節薬の開発及び商業上の利用可能性が癌臨床におけるこれらの薬剤の評価を加速した。高投薬量のrIL-2、rIFN−γ、γTNF-α、及びその他の単一治療薬と関連する制限された効力及びかなりの毒性は、治療戦略におけるサイトカインの天然組み合わせの再考を示唆する。更に、百より多い異なるサイトカイン活性が同定され、これが、組換えサイトカインを組み合わせることに基く免疫療法が近い将来の癌診療の成功の妥当な可能性を有することについてかなりの疑問を生じる。
例えば、IL-2はＴ細胞成長因子としてＴリンパ球増殖を刺激することができるが、その他のインターロイキン及び胸腺ペプチドを含む幾つかのその他の因子が胸腺中で産生され、Ｔリンパ球発育及び機能に必要と考えられる（Hadden，1992）。
天然インターロイキン製剤（NI）と称される特性決定されていない製剤が本件出願人によりＴリンパ球発育を促進するのに有効であることが示された。この特性決定されていない混合製剤（また、バフィコートインターロイキン、BC-ILと称される）が前胸腺細胞、未熟胸腺細胞及び成熟胸腺細胞の増殖を均等濃度のrIL-2よりもin vitroで更に有効に刺激した（Haddenら，1989）。このNI製剤は新生児マウスのＴリンパ球発育を増進したが、rIL-2は不活性であった（Haddenら，1989）。更に、このNI製剤はヒドロコルチゾン処理された老化マウスのＴリンパ球発育及び機能を増進したが、均等投薬量のrIL-2は不活性であった（Haddenら，1992）。更に、低投薬量の特性決定されていないNI混合物は悪性メラノーマを有するマウスの寿命を延ばした。均等投薬量のrIL-2は不活性であった（Kamedaら，1992）。これらの知見は、天然インターロイキン混合物がIL-2により与えられない活性を有することを示す。
Ｔリンパ球欠陥を修正しようとする試みが老化、癌、エイズ、及びその他の免疫不全症で生じるＴリンパ球枯渇（リンパ球減少症）及びＴリンパ球不全（アネルギー）を含む種々のセッティングにおいて実験で試みられた。例えば、rIL-2及び胸腺ペプチドが種々の結果でエイズ（HIV）ウイルス感染症に使用された（Hadden,1991）。連続注入による高投薬量のrIL-2はHIV感染症の患者の血液中でＴリンパ球カウントを一時的に増加することが示されたが、かなりの毒性を有していた（Lane及びFauci，1985）。百万〜3百万単位のペギル化（pegylated）rIL-2は毒性を殆ど生じなかったが、HIV感染症のヒトのリンパ球カウントにごくわずかの作用を生じた（Merigan，1993）。NI製剤は毒性なしにリンパ球減少癌患者のＴリンパ球カウントをかなり高めた（Haddenら，1994）。これらの知見は、天然インターロイキンがヒト中で低投薬量で作用して毒性を生じないでＴ細胞を増加すること及びrIL-2が高投薬量で活性ではあるものの医療用途にはあまりに毒性であることを示す。また、これらの知見はマウスデータからヒトへの外挿を支持する。
以上は、天然産サイトカインの製剤の使用が低毒性で免疫系に影響するのに一層有効であり得ることを示唆する。しかしながら、現在入手し得る製剤は良く特性決定されておらず、しかも以下に記載されるように製造するのが面倒である。免疫系を再現性良く調節するために、容易かつ廉価で製造でき、しかも臨床上の使用のために再現性の低毒性製剤を確立することが可能である、血清及びマイトジェンを含まないサイトカインの良く特性決定された製剤を有することが有益であろう。
Zimmermanらの米国特許第4,985,241号明細書は、遊離基発生により哺乳類宿主に生じた生物学的損傷の治療及び予防上の措置において生物学的変性剤、例えば、遊離基脱除剤または代謝インヒビターと組み合わせた組換えリンホカインまたはサイトカインの使用を開示しているが、天然産サイトカインの特定混合物の製造を示唆していない。
それ故、Ｔリンパ球の低下された機能、発育及び数、即ち、細胞性免疫不全症を含む疾患及びその他の症状の治療に治療上使用し得るサイトカインの天然混合物（NCM）をリンパ球から生成することが有益であろう。治療上有益であるために、NCMは無菌であり、内毒素を含まず、血清を含まず、マイトジェンを含まず、ウイルスを含まず、かつＤＮＡを含まないでレシピエントからの反応を避けることが必要である。分子篩技術がこれらの汚染物質の多くを除去することができる。しかしながら、製造に必要な操作が多い程、コストが高い。更に、必要とされる取扱い工程が多い程、収率が低いだけでなく、汚染の機会が増える。それ故、NCMをこれらの汚染物質のいずれかを最小にし、または排除するような方法で製造し得る場合、その製造はコスト効率が更に良いであろう。
上記の研究に使用されたNIの製剤は血清を含まず、マイトジェンを含まなかったが、使用前に10倍に濃縮される必要があった。
米国特許第4,390,623号及び同第4,464,355号明細書に教示されたようにしてつくられる天然インターロイキン-2は無血清培地中で生成され、それにより血清タンパク質を除去する工程を必要としない。その製剤は、血清を含まず、マイトジェンを含まない、癌に対する活性を有する天然インターロイキン-2として記載されている。この物質は、細胞をHaddenら（1970）により最初に記載されたマイトジェンに短時間露出すること（パルス技術）により調製された。
パルス技術はリンパ球を組織培養中に刺激し、それが回収される時に培地中に存在するマイトジェンを有することを避けるのに使用される。細胞は最初にマイトジェンの存在下で無血清培地中で2時間培養される。このインキュベーション後に、細胞が再度単離され、マイトジェンを含まない培地中で3回洗浄され、次いでマイトジェンを含まない新しい組織培養無血清培地中で低密度で再度懸濁される。製剤はIL-2以外の成分について特性決定されなかった。
また、Fabriciusらの米国特許第4,448,879号明細書は天然の無血清かつ無マイトジェンのIL-2を製造するための細胞培養方法を教示している。その方法はローラー培養系、または培地を機械的に循環する系中でバフィコート細胞を使用した。しかしながら、その方法は、細胞が洗浄されてマイトジェン及び血清を除き、次いで無血清、無マイトジェンの培地中で再度培養される工程を依然として必要とする。重要なことに、記載された方法は細胞を刺激するのに不十分に有効であるにすぎず、しかもIL-2の低収率を生じる。必要な大容積は高価であり、徹底的な熟練された取扱いを必要とし、使用前に濃縮される必要があり、活性の損失をもたらす（約50％）。
Martorellら（1987）は血清を含む培地中でマイトジェンの連続の存在下で有糸***誘発を誘導する方法を提供している。彼らの方法において、IL-2の収率は極めて低く、しかも血清の存在を必要とする。
血清及びマイトジェンを含まない細胞を洗浄する工程を必要とせず、しかも高価な装置を必要としない方法を有することが有益であろう。
上記の系において、マイトジェンは一般に植物レクチン、例えば、植物性血球凝集素（PHA）及びコンカナバリンＡ（ConA）であり、これらはＴリンパ球抗原レセプター（TCR）（Chilson及びKelly-Chilson，1989）に対するアフィニティーを有し、かつＴリンパ球に対して有糸***誘発効果を有する。このようなレクチンへのＴリンパ球の露出は天然サイトカインの産生を刺激する。培地中の血清の不在下で、一般にわずかに低レベルのサイトカイン、特にインターロイキンが産生される。例えば、IL-2は一般に無血清培養条件下で1ml当たり0〜20単位/ml単位の範囲でのみ見られる（米国特許第4,390,623号及び同第4,464,355号）。血清を含む場合、IL-2産生の範囲は一般に1ml当たり10単位以上である。
リンパ球を刺激してIL-2の如きサイトカインを血清の不在下で高レベルで産生することが有益であり、その結果、その混合物は、パルス化露出後に細胞を洗浄し、または特殊な装置を使用して関連する活性の損失を伴って製剤を濃縮するという工程を追加しないで、しかも収率を低下しないで、治療薬として有効に使用し得る。
発明の要約及び利点
本発明は少なくとも一種のマイトジェンを組織培養容器中で固定する工程により天然サイトカイン混合物を製造する特異な方法を提供する。好中球及び赤血球を含まないリンパ球の単離された集団が無血清培地中で懸濁され、容器に入れられる。リンパ球が培養され、マイトジェンを含まず、かつ血清を含まない培地が除去され、サイトカインの収率について特性決定される。
【図面の簡単な説明】
本発明のその他の利点が、図面に関して考慮される時に以下の詳細な説明を参考にして良く理解されるようになるので容易に認められるであろう。
図1はX-vivo-10（EX10）、X-vivo-15（EX15）、X-vivo-20（EX20）及び最小必須培地（MEM）中のNCMのIL含量（ELISAにより測定されるIL-2（IL2）の光学密度として表される）を示し、マイトジェンPHAへの連続露出（開いたバー）をパルス化露出（クロスハッチ付き）と比較する棒グラフである。
図2は異なる培地、1 x 106/mlの細胞（クロスハッチ付き）、2.5 x 106/mlの細胞（斜線）及び5 x 106/mlの細胞（開いたバー）中1μg/mlのPHAによるNCM生成に関する細胞濃度の効果を示す棒グラフである。
図3は異なる培地、1 x 106/mlの細胞（クロスハッチ付き）、2.5 x 106/mlの細胞（斜線）及び5 x 106/mlの細胞（開いたバー）中2μg/mlのPHAによるNCM生成に関する細胞濃度の効果を示す棒グラフである。
図4は均等濃度のIL-2における組換えIL-2（破線）と比較したNCM（実線）によるナイーブマウスからの脾臓細胞のin vitro処理のチミジンとり込み（ConA刺激）に関する効果を示す投薬量応答グラフである。
図5は均等濃度のIL-2における組換えIL-2（破線）と比較したNCM（実線）によるナイーブマウスからの胸腺細胞のin vitro処理のチミジンとり込みに関する効果を示す投薬量応答グラフである。
図6はrIL-1、rIL-2、rIL-1 + rIL-2またはNCMによるin vivo処理後のrIL-1（開いたバー）、rIL-2（ソリッドバー）、NCM（クロスハッチ付き）及びコンカナバリンＡ（斜線）に対するin vitroの脾臓細胞応答の棒グラフである。
図7は図6のようなin vivo処理後のrIL-1、rIL-2、NCM及びConAに対するin vivoの胸腺細胞応答の棒グラフである。
図8はCD4+細胞、CD8+細胞、及びCD4-/CD8-（--）細胞の脾臓細胞マーカーに関する対照（開いたバー）またはNCM（ソリッドバー）によるマウスのin vivo処理の効果を示す棒グラフである。
図9はCD4-/CD8-細胞（--）、CD4+/CD8+（++）並びにCD8+細胞とCD4+細胞（CD4 + CD8）の胸腺細胞マーカーに関する対照（開いたバー）またはNCM（ソリッドバー）によるマウスのin vivo処理の効果を示す棒グラフである。
図10は対照培地（開いたバー）及びNCM（閉じたバー）によるin vivo処理後のIL-1、IL-2及びNCMに対するin vitroの胸腺細胞応答の棒グラフである。
図11は図10と同様の脾臓細胞応答の棒グラフである。
図12は対照培地（開いたバー）及びNCM（閉じたバー）によるin vivo処理後のConA及びPHAに対するin vitroの胸腺細胞応答の棒グラフであり、そして
図13は図12と同様の脾臓細胞応答の棒グラフである。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は特性決定された天然サイトカイン混合物（NCM）、即ち、多種サイトカインを含む細胞培養上澄みを再現性良く製造する方法を提供する。
一般にHIV陰性、肝炎ウイルス陰性の多数のドナーからの好中球及び赤血球を含まない、バフィコートからの溜められたリンパ球が本発明のサイトカイン混合物を製造するのに使用される。多数のドナーの使用は混合リンパ球応答（MLR）を利用する。更に、好ましい実施態様において、50までのドナーが混合物を製造するのに毎回使用されて、MLR応答が夫々の製剤について一定であることを確実にし、かつ変化をなくす。
別の実施態様において、自己リンパ球がNCMを生成するのに使用されるであろう。これらの場合、患者はウイルスを含まない必要がないであろう。更に、自己リンパ球が使用される場合、それらは必要に応じて患者にもどされるであろう。別の実施態様において、動物は獣医学上の使用の細胞源であってもよい。
リンパ球は組織培養容器中で固定されたマイトジェンの存在下で培養される。好ましい実施態様において、マイトジェンは製造業者の指示に記載されたようにして細胞サブセット（AIS microCELLectorTM T-25プレート）の選択用の表面活性化細胞培養フラスコに固定される。しかしながら、マイトジェンを培養容器の表面に固定するその他の方法、例えば、その他の“パンニング”技術を合体する方法またはセファロース4Bビーズにカップリングする方法が、細胞分離の業界で公知であるように使用し得る。選択のための固定細胞の使用が当業界で公知である。しかしながら、サイトカイン生成のための使用は新規である。
マイトジェンは一般にレクチン及びリンパ球を刺激してサイトカインを産生するモノクローナル抗体から選ばれる。好ましい実施態様において、植物性血球凝集素（PHA）またはOKT3（オルトクローン▲Ｒ▼、Ortho Pharmaceuticals）が使用される。Ｂ細胞を刺激するその他のレクチン、例えば、コンカナバリンＡ（Con A）またはアメリカヤマゴボウマイトジェンが使用し得る。Ｔ細胞レセプターのモノクローナル抗体、例えば、CD2、CD28、CD45がマイトジェンとして使用でき、有効であろう。抗CD28抗体及び抗CD45抗体がIL-2のハイパープロデューサーであることが報告されている（Deansら，1989及びJuneら，1989）。更に、抗リンパ球グロブリン（ALG）がＴ細胞の有糸***誘発活性を有する。その他に、マイトジェンの組み合わせがリンパ球亜集団の組み合わせを活性化するのに使用し得る。PHAが好ましい実施態様において使用され、約25μg/mlの開始濃度で被覆される。
リンパ球は、マイトジェンへの連続露出により、即ち、洗浄しないで、無血清培地中で24〜48時間インキュベートされる。好ましい実施態様において、培地はX vivo-10培地またはX vivo-15培地（Whittaker）である。これは製造業者のパンフレットに示されているように患者中のIL-2/LAK注入のための無血清のFDA認可された培地である。RPMI-1640（Sigma）のようなヒトリンパ球増殖を支持することができる無血清培地がまた使用し得る。
また、培地は4−アミノキノロン抗生物質を含む。好ましい実施態様において、抗生物質はシプロフロキサシンである。その抗生物質は無菌性を維持し、リンホカインを過剰生産するのに使用される。シプロフロキサシン及び関連抗生物質は可溶性マイトジェン及び血清の存在下でIL-2及びその他のサイトカインを増加すると報告されていた（Riesenbeckら，1994）。それらは血清の不在下で有効ではないと報告されていた。また、固定されたマイトジェンと一緒のそれらの使用が新規である。シプロフロキサシンは好ましい実施態様において約20μg/mlから約200μg/mlまでの濃度、更に好ましくは約80μg/mlの濃度で使用される。
上澄みが除去され、本発明の天然サイトカイン混合物（NCM）の源である。上澄みは実施例1に示されるようにマイトジェンを含まず、また動物研究及び初期のヒト研究において濃縮される必要はない。
ヒト血清アルブミン（HSA）がNCMを上澄み中で安定化するのに添加し得る。HSAは非ヒト起源からの血清アルブミンに代えて使用される。何となれば、HSAはヒト用にFDAにより認可されていたからである。
上澄みのサイトカインプロフィールが、下記のアッセイを使用して確立される。上澄みのインターロイキン（IL）含量がIL-2に関するバイオアッセイ及びその他のインターロイキン、CSF、TNF、及びIFNに関するELISAにより確認される。無菌性が懸濁され、内毒素がリムルス細胞分解産物アッセイにより測定される。詳しくは、下記のアッセイ及びキットが好ましい実施態様において使用される。
INF-γELISA（ENDOGEN）、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、GM-CSF、G-CSF及びTNF-αELISA（R ＆D Systems）。IL-2バイオアッセイはGillisら（1978）の方法によるものであり、IL-2の既知の標準物質（Schiapparelli Biosystems，Inc.，Fairfield，NJ）と比較して単位/mlとして表される。
PHAがマイトジェンとして使用される好ましい実施態様において、上澄みのサイトカインプロフィールは以下のプロフィールを有する。
サイトカイン 量
IL-1 10-2000pg/ml
IL-2 100-500単位/ml
IL-6 250-10,000pg/ml
IL-8 12,000-100,000pg/ml
IL-12 100-10,000pg/ml
IFN-γ 50-15,000pg/ml
TNF-α 50-15,000pg/ml
CSF-G 50-1500pg/ml
CSF-GM 10-1500pg/ml
IL-3/IL-4/IL-7 痕跡量
マイトジェンの固定化は従来技術のパルス技術よりもNCMの高い収率を生じる。例えば、無血清培地中のPHAを用いるパルス技術によるインターロイキンの製造は0-20単位/ml培地でIL-2を生じた（米国特許第4,390,623号及び同第4,464,355号）。
しかしながら、本発明は4−アミノキノロン抗生物質を無血清培地に添加してインターロイキンを過剰誘導して約8-140単位/mlのIL-2を生じることによりパルス技術による増大された生産を可能にする。先に引用された動物研究により予想されるように、天然インターロイキン混合物（NIM）として特性決定されたこの製剤は、200単位のIL-2/投薬量で、頭部及び首の癌を有するリンパ球減少患者の血液中のＴ細胞リンパ球カウントを増加し（Haddenら，1994）、これはこのような低い投薬量ではrIL-2について報告されていなかった。IL-2の同様の効果がNCM中のIL-2の量の5000倍よりも大きい投薬量でのみ報告されていた。こうして、NCMに均等なIL-2の投薬量がその効力のインデックスとして使用され、NCMの全生物活性がIL-2のみの全生物活性であることを意味するものではないことを注目することが重要である。
本発明の好ましい実施態様において、固定化によるマイトジェンへの連続露出及び4−アミノキノロン抗生物質の存在を利用して、一般に生成されるNCMは100-353単位/mlのIL-2を含む（製剤の効力のインデックス）。それ程好ましくない実施態様において、本発明は4−アミノキノロン抗生物質の連続の存在及びマイトジェンのパルス化存在により実施でき、NIMを生成し得る。この組み合わせはパルス化マイトジェンのみによる従来技術よりも大きいサイトカインのレベルを生じるが、本発明の好ましい実施態様：連続の固定されたマイトジェン及び4−アミノキノロン抗生物質で見られるレベルを生じない。この状況における好ましい実施態様は生物活性の損失をもたらす濃縮を必要としないサイトカイン製剤の効力により特定される。IL-2の均等投薬量における好ましい実施態様は、それ程好ましくない実施態様（NIMまたはNI）（Haddenら（1992）及び本件出願と同じ日に出願され、本発明の同じ譲受人に譲り受けられた同じ出願人による共同未決出願を参照のこと）と同じ生物活性を有する。
PHAで刺激されたリンパ球による天然サイトカインの混合物の産生はＴリンパ球抗原レセプター（TCR）に対するアフィニティーを有する植物レクチンを代表する。その他のこのような刺激物質はコンカナバリンＡ（Con A）である。高レベルのインターロイキンをこれらの条件下で誘導することが同様に予想されるであろう。TCRに関連するＴリンパ球表面レセプターに結合するOKT-3の如きモノクローナル抗体による天然サイトカインの混合物、即ち、CD3複合体の産生がDC2、CD28、CD45の如きレセプターのその他のモノクローナル抗体を代表し、それらは同様にこれらの条件下で高レベルのサイトカインを誘導すると予想されるであろう。Ｂ細胞または単球を刺激するその他のマイトジェンが、Ｔ細胞を刺激するマイトジェンと組み合わせて使用されて天然サイトカイン混合物を与え得る。
これらの刺激物質の組み合わせがIL-1及びIL-2について表3に観察されるような累積的効果を有することが予想されるであろう。
PHAにより産生されたNCMがIL-1、IL-2、IFN-γに富み、またIL-12（323pg/ml）を含み、かつほんの痕跡量のIL-3、IL-4、及びIL-7を有するという本明細書に含まれる観察は、これらの条件下でPHAがＴヘルパー型II細胞よりも優先的にＴヘルパー型Ｉ細胞（TH-1）を刺激することを示す。これは、これらのリンホカイン製剤がアジュバント活性を有して細胞の免疫応答を増強するという測定を可能にする（Hadden，1994を参照のこと）。固定されたマイトジェンによるNCMの産生は、PHAまたはその他のマイトジェンによる刺激の前にパンニングしてこれらの細胞型に特異性のサイトカインについて濃縮されているNCMを得ることにより細胞分離に適したプレートを使用してＴ細胞サブセット（CD4、CD8、CD30、TH-1、TH-2等）により利用し得る。
NCMはアリコートに分けられ、4℃以下で貯蔵されて生物活性を維持する。
本発明プロトコルの有効量の天然サイトカイン混合物は本件出願と同日に出願され、本件出願と同じ譲受人に譲り受けられ、参考として本明細書に含まれる本件出願人による共同未決出願に記載されているとおりである。天然サイトカイン混合物は哺乳類宿主、好ましくはヒトに投与でき、特定のサイトカインプロフィールを有し、一般にヒトについて投薬量当たり約200-500単位のIL-2を有するであろう。
その治療を受ける患者は細胞性免疫不全症それ自体またはその他の症状と組み合わせた細胞性免疫不全症と診断された患者であろう。患者のＴ細胞機能及び血液レベルは当業界で知られているように評価され、正常より下回る場合にはＴ細胞異常を特異的に治療するように設計された本発明による細胞性免疫不全症を有する治療の候補であろう。Ｔ細胞リンパ球減少症は癌及びエイズの如き疾患における細胞性免疫不全症の反映であるだけでなく、疾患のない老人の死亡率の予測因子であることを注目することが重要である（Benderら，1986）。
NCMは、個々の患者の臨床状態、投与の部位及び方法、投与の計画、及び医療実務家に知られているその他の因子を考慮して、良好な医療実務に従ってIL-2均等物の低投薬量（200-500単位）で投与される。こうして、本明細書に記載された目的のための“有効量”は当業界で知られているような考慮事項により決定される。効果が失われ、毒性が増大するので、高投薬量（>1000単位／投薬量）を使用しないことが重要である。その量は、細胞性免疫機能のin vitro測定、in vivoの増大されたＴリンパ球レベル、再生抗原またはNCMに対する改善された皮膚試験応答、改善された生存率、一層迅速な回復、または症候の改善もしくは排除並びに腫瘍塊の癌減少における改善された応答を含むが、これらに限定されない、治療患者の25％の免疫機能の改善を示すように有効である必要がある。NCMはその他の治療とともに使用されて免疫機能を改善し、癌を治療し得る。NCMまたはNIMの臨床上の使用の例が頭部及び首の癌においてHaddenら（1994）により例示される。
本発明の方法において、NCMは種々の方法で投与し得る。NCMは単独で、または医薬上許されるキャリヤーと組み合わせて投与し得ることが注目されるべきである。それは皮下投与でき、または静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、外リンパ投与、リンパ内投与及び鼻内投与を含む、非経口投与し得る。部位特異的投与が可能な場合に好ましい。化合物の移植または注入がまた有益である。ガイダンスがHaddenら（1990）及びHaddenら（1994）により与えられる。
ヒトにおける非経口投与について、本発明は一般に好ましくは医薬上許されるキャリヤー媒体中で単位投薬注射形態で製剤化され、好ましい実施態様において、それはx-vivo-10媒体であろう。また、公的なキャリヤー媒体として、食塩水、スクアレン、デキストロース溶液、通常の血清アルブミン、リンゲル液等が挙げられるが、これらに限定されない。必要により、少量の添加剤、例えば、安定剤、防腐剤または緩衝剤がこのようなビヒクル中に含まれてもよい。このような製剤は非経口投与のために水性注射液中の再生に適している。混合物は典型的には約50〜500単位のIL-2（当量）/ml、好ましくは約150〜350単位のIL-2（当量）/mlの濃度でキャリヤー媒体中で製剤化されるであろう。更に、混合物は本発明について示されたその他のサイトカインについて不変のプロフィールを有するであろう。
必要により、NCMは無菌の安定な凍結乾燥製剤にされ、その中で活性成分が水溶性キャリヤー、及び必要により、安定剤または無毒性防腐剤と混合される。抗菌性防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、及び緩衝剤を含む組成物の安定性、無菌性、及び等張性を増強するこれらの種々の添加剤が使用し得る。微生物の作用の防止はシプロプロキサシンの存在及び種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により確実にし得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を含むことが望ましいであろう。注射可能な医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらされる。しかしながら、本発明によれば、使用されるあらゆるビヒクル、希釈剤、または添加剤もしくは送出ビヒクルはNCMと適合性にされる必要があり、また本発明の生物活性を変化しないであろう。
投薬量及び投薬レジメは主として治療される個々の患者、患者の履歴、患者に対する生物学的損傷の型及び大きさ、治療の長さ及び治療のプロトコルに依存するであろう。投薬は数日の期間にわたって単一投薬または多投薬であってもよい。最も好ましい投薬量は、癌の場合の疾患の最大の退縮またはその他の症状における症候の最大の減少を得る投薬量である。ヒトは本明細書に例示されたマウスよりも一般に長く治療され、その治療は疾患プロセスの長さ及び薬剤有効性に比例する長さを有することが注目される。
NCMの薬理学的製剤はあらゆる適合性キャリヤー、例えば、種々のビヒクル、アジュバント、添加剤、及び希釈剤を含む注射可能な製剤中で患者に投与でき、または本発明に使用される化合物が徐放性皮下移植体または標的送出系、例えば、注入ポンプ、ポリマーマトリックス、リポソーム、及び微小球体の形態で患者に非経口投与し得る。本発明における使用に適した移植体は、移植された後に徐々に溶解するペレットまたは当業者に公知の生体適合性送出モジュールの形態をとり得る。このような公知の投薬形態及びモジュールは、活性成分が数日〜数週間の期間にわたって徐々に放出されるように設計される。
例えば、注入送出系に関するこのような徐放性形態は、癌の付近の局所のリンパ節に本明細書に記載されたNCMを送出するように肺癌及び食道癌に使用されることが考えられるであろう。その他の癌は同様の局所送出技術を使用するであろう。
本発明に有益な公知の移植体及びモジュールの例として、米国特許第4,487,603号明細書（これは薬物を調節された速度で分配するための移植可能な超小型注入ポンプを開示している）、米国特許第4,486,194号明細書（これは薬物を皮膚中に投与するための治療装置を開示している）、米国特許第4,447,233号明細書（これは薬物を正確な注入速度で送出するための薬物注入ポンプを開示している）、米国特許第4,447,224号明細書（これは連続薬剤送出のための可変流量の移植可能な注入装置を開示している）、米国特許第4,439,196号明細書（これはマルチチャンバー区画を有する浸透圧薬剤送出系を開示している）、及び米国特許第4,475,196号明細書（これは浸透圧薬剤送出系を開示している）が挙げられる。これらの特許が参考として本明細書に含まれる。多くのその他のこのような移植体、送出系、及びモジュールが当業者に公知である。
本発明は胸腺細胞の数及び機能を増大し、かつ癌、HIV、感染症、老化等で生じる二次性免疫不全症を反転するのに有効である。その方法は入院患者並びに外来患者基準で患者を治療するのに使用されてもよく、後者が好ましい。
上記の説明は天然サイトカイン混合物（NCM）をつくるための実際の基礎を与える。本発明により使用される方法及び本発明の実用性が下記の実施例により示される。
実施例はマウス系における本発明の実用性を実証する。しかしながら、均等製剤（NI及びNIM）がヒトの免疫系に関する活性を示していた（Pulleyら，1994; Haddenら，1994）。マウス系が選択された。何となれば、ヒト以外に、マウスが免疫系の構造及び機能に関して最も良く研究された種であり、またヒト応答を高度に予測するものとして当業者により認められているからである。今までのところ、わずかに微小の差異がマウスとヒトの間で観察されていた。マウスが種々の病原体及び腫瘍に対しそれ自体を防御するメカニズムの殆どがヒトと実質的に同じである。マウスモデルがヒト用の免疫調節薬の評価に広範囲で使用されていた（Talmadgeら，1985）。この従来技術のために、現行のマウス実験からの結果がヒト応答を予測する。
三つの例は免疫調節薬によるマウス系の予想の性質を実証する。マウス腫瘍モデルの広いスペクトルを使用して、インターフェロン（IFN）の抗腫瘍活性が示されており（Borden，1979; Talmadgeら，1985）、それに応じてヒトでは、IFNは多種の腫瘍に対して活性を示した（Goldstein及びLaslo，1988）。
第二の例において、マウス腫瘍モデルを使用して、腫瘍に対して単独で使用されたレバミゾールの効果がなかったが、活性が化学療法後に見られた（Symoens及びRosenthal，1977; Spreafico，1980）。同様にヒトでは、レバミゾールは5フルオロウラシルとともに使用された時にヒト結腸癌に活性を示したが、単独では示さなかった（Mutch及びHutson，1991）。
第三の例において、マウス腫瘍モデルを使用して、低投薬量のインターロイキン2（IL-2）は毒性を生じないで抗腫瘍活性を有することが示されたが、高投薬量のIL-2は特にリンホカイン活性化キラー（LAK）細胞で活性を有していたが（Rosenbergら，1985）、潜在的に致死性の毒性を有していた。また、ヒト研究は悪性メラノーマ及び腎臓細胞癌における高投薬量のIL-2±LAK細胞の有効性を示したが、大きな毒性があった（Rosenberg，1994）。そうであっても、それは現在腎臓細胞癌についてFDAによりライセンスされている。最近の研究は毒性を生じないヒト癌における低投薬量のIL-2の有効性を示す（Cortesinaら，1988及び1994）。これらのメカニズムはマウス系で見られた低投薬量の効果と同様である（Chirigos及びTalmadge，1985）。
免疫調節薬の上記の三つの例は癌における臨床上の使用について現在認可されており、マウス腫瘍研究により良く予想された。
その他に、動物研究は組換えインターロイキン（rIL）により共有されない天然インターロイキン混合物（nIL）の効果を示した。rIL-2ではなく、nILは胸腺依存性免疫応答を回復し、促進するのに活性であり（Haddenら，1992）、シクロホスファミドとともに悪性メラノーマに対する耐性を促進するのに活性である（Kamedaら，1992）。この同じパターンは、天然ILが組換えIL-2により共有されない方法でヒトの頭部及び首の癌に活性であった点でヒトで見られた（Cortesina，1988，1994; Haddenら，1994; Mattijissenら，1991）。
実施例
全般の方法
細胞培養に関する全ての工程を無菌条件下で行う。本明細書に記載されなかった細胞免疫学の全般の方法を、細胞免疫学技術に関する一般的な文献、例えば、Mishell及びShiigi（Selected Methods in Cellular Immunology，1981）に記載されたようにして、また当業界で知られているようにして行う。
物質
組換えヒトインターロイキンβ1（rIL-1β）はC.Reynolds博士（Biological Response Modifiers Program．NCI（Frederick，MD））からの贈答品であった。ヒトインターロイキン2（IL-2；比活性640U/ml）をファーマシアAB（Silver Spring，MD）から入手した。組換えIL-2はG.Caspritz（Hoescht Pharm.，Frankfort，ドイツ）からの贈答品であった。シプロフロキサシンをマイルズ社（West Haven，CT）から購入し、オフロキサシンをマックネイル・ファーマシューティカル（Spring House，PA）から購入し、ノルフロキサシンをメルク社（West Point，PA）から購入した。ヒト血清アルブミン（HSA）をアーマー・ファーマシューティカルズ（Kankakee，IL）から入手した。X-vivo培地をホイットテーカー・バイオプロダクツ（Walkersville，MD）から購入した。ヒドロコルチゾン21-ヘミスクシネート及びCon Aをシグマ・ケミカルズ（St.Lois，MO）から購入した。PHA（HA-16）をムレックス・ディアグノスチックス社（Dartford，U.K.）から入手した。OKT3をオルト・ファーマシューティカルズ（Raritan，NJ）から購入した。
天然サイトカイン混合物（NCM）の調製
多数のHIV陰性、肝炎ウイルス陰性のドナーからのヒト血液のバフィコート白血球を回収する。別の実施態様において、動物は獣医学上の使用のための細胞源であり得る。ドナーからの細胞を溜め、フィコールハイペーク勾配（Pharmacia）の上で層形成して好中球及び赤血球を含まないリンパ球を得る（米国特許第4,390,623号及び同第4,448,879号）。当業界で知られているような同じ出発リンパ球集団をもたらす別法が使用し得る。
リンパ球を洗浄し、フラスコ（MicroCELLectorTMT-25細胞培養フラスコ）中でX vivo-10培地（ホイットテーカー・バイオプロダクツ）中に分配し、そのフラスコ中に固定された刺激物質、即ち、マイトジェンがある。実験の一つの組において、X vivo-15及びX vivo-20培地を示されるように使用した。刺激物質に関する固定化方法は、フラスコ中のパンニング操作、即ち、細胞分離のための種々の物質を固定化することについて製造業者により記載されたとおりである。
細胞を37℃でCO2/空気インキュベーター中で80μg/mlのシプロフロキサシン（Miles Lab）を含むX vivo-10培地中で24〜48時間インキュベートする。また、RPMI1640培地を使用することができた（Webbら，1973）。一般にHSAを0.1〜0.5％（重量／容積）で使用する。インキュベーション後に、上澄みを注いで除き、回収する。ヒト血清アルブミン（HSA）を添加してインターロイキンを更に安定化することができる。上澄みを4℃〜-70℃で貯蔵する。
上澄みの特性決定
サイトカイン含量をIL-2についてバイオアッセイにより、また残りのインターロイキンIL-1〜IL-15、CSF、TNF、及びIFNについてELISAにより測定することにより、溜めた上澄みを特性決定する。無菌性をチオグルコレートブロース中の培養により試験し、内毒素を当業界で知られているようにリムルス細胞分解産物アッセイにより測定する。
サイトカイン含量に関する上澄みの標準化
比較を行うことができるように、夫々の上澄みを投与された濃度または量により標準化する。
上澄みに関する汚染物質の除去
使用する場合、ＤＮＡ及びウイルス排除は限外濾過、カラムクロマトグラフィー、ビラゾール（virasol）、エタノール分別、ポリエチレングリコール／ベントナイト沈殿、γ線照射、および／または静脈内γグロブリン及びモノクローナル抗体に使用されたような溶媒／洗剤処理（例えば、IGIV News Updateパンフレット）の如き技術を使用するであろう。
モデル
特に示されない限り、老化マウスにおけるヒドロコルチゾン誘導胸腺退縮のモデルを使用した（Haddenら，1992）。
実験動物
胸腺が退縮し始めた雌BALB/c（Life Science，St.Petersburg，FL）老化した引退したブリーダーマウス（8-9ケ月）をin vitro試験に使用した。マウスを体重マッチングし、5匹のグループでランダムに溜めた。動物に随時飲用水とともに通常の実験食で給餌した。対照グループを除く、全てのマウスを連続2日間にわたってヒドロコルチゾン（0.9％の塩化ナトリウム0.1ml中5mg/マウス）で腹腔内（i.p.）処理して化学的胸腺除去及び脾臓重量の減少を誘導した。
ヒドロコルチゾン処理した成体マウスは2日で急性胸腺退縮（対照の30％未満）及び脾臓サイズの減少（対照の80％未満）、10日までに進行性回復を示す。
実験設計
夫々の処理グループは5匹の動物を有し、夫々の実験を2〜5回繰り返した。処理を3日目に腹腔内（i.p.）で開始し、合計5日間にわたって毎日1回続けた。処理グループに本明細書に示されたようにして下記のin vivo処理の一つを注射した。
1．発熱物質を含まない食塩水（対照）；
2．組換えインターロイキン−1（rIL-1; 4ng）;
3．組換えインターロイキン−2（rIL-2; 50単位）;
4．rIL-1 + rIL-2（夫々、4ng + 50単位）
5．天然サイトカイン混合物（NCM; 50単位IL-2当量）
8日目に、マウスを計量し、頸部脱臼により犠牲にし、それらの脾臓及び胸腺を除去し、計量した。臓器を細断し、塩化アンモニウムを使用して残留赤血球を溶解し（Mishell及びShiigi 1981）、細胞をカウントした。
次いで種々の物質に対する細胞の増殖応答を測定した。細胞のサンプルを、5％のウシ胎児血清、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）及び2−メルカプトエタノール（2 x 10-5M）を含むRPMI 1640培地中37℃、5％のCO2での細胞培養のために調製した。細胞を4回の反復実験で0.2mlのミクロウェルプレートに1.5 x 106/mlの濃度で塗布し、本明細書に示されたようにして下記の一つとともに72時間インキュベートした。
1．対照希釈剤（完全RPMI 1640培地）;
2．rIL-1（1ng/ml）;
3．rIL-2（2単位/ml）;
4．NCM（2単位/mlのIL-2当量）
5．コンカナバリンＡ（Con A; 1.5μg/ml）
6．植物性血球凝集素（PHA; 0.5μg/ml）
培養を終了して、トリチウム標識チミジン（3H-チミジン; New England Nuclear，Boston，MA; 比活性6.7Ci/mM）の18時間パルスでＤＮＡ合成、ひいては細胞増殖を測定し、多重自動サンプル回収装置で回収、液体シンチレーションカウンティングのために処理した。また、マーカー研究をHaddenら（1992）により記載されたようにして行った。結果を夫々の動物について三つのサンプルからのcpmの算術平均として表した。異なる動物で得られたデータの代表を簡素化するために、異なる動物による結果を溜め、一緒に計算し、幾つかの場合に対照に対する比として表し、その他の場合に平均＋平均の標準偏差（SEM）に関する括弧として表した。
統計分析
スチューデントＴテストを使用して適当にデータを分析した。
実施例1
その目的はリンパ球を刺激して血清の不在下で上澄み中にかなりの量のPHAを生じない方法で高レベルのインターロイキン−2を生成する方法を見出すことであった。これを行うために、PHAを“パンニング”細胞分離について製造業者の指示に記載されたようにして細胞サブセットの選択用の標識活性化細胞培養フラスコ（AISmicroCELLectorTMT-25プレート）に固定した。
これらの実験に使用した培地はX vivo-10（ホイットテーカー）であり、インターロイキン−2−リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞プロトコルについて米国食品、薬品管理局によりヒトへの投与について認可されている。また、最小必須培地（MEM）またはRPMI-1640（シグマ）のようにヒトリンパ球増殖を支持することができる無血清培地を使用することができた。
初期実験は、PHA（HA-16、ムレックス・ディアグノスチックス社（Dartford，U．K.））が製造業者により記載された技術により固定できること及び7.5-15 x 106/mlの細胞数、24時間〜48時間の露出の時間、及び25または50μg/mlのPHA濃度の適当な最適条件下で、無血清上澄み中のインターロイキン−2の高収率が得られることを示した。収率はPHA（NI）への短い露出、続いて洗浄及びその後の無血清培地中のシプロフロキサシン（NIM）と一緒の培養を使用する従来の方法（パルス技術）よりも優れていた（表1）。それ故、このフラスコ操作を使用してNCM混合物を生成する。
Gillisら（1978）により記載された方法によりCTLL IL-2依存性細胞系を使用してIL-2含量を上澄み中で測定した。IL-2を640単位を含む既知標準物質（Pharmacia AB）に対する国際単位で定量した。
細胞を使用しないでインキュベートされたフラスコからの無細胞上澄みをヒトリンパ球で試験して、残留PHAが増殖応答を生じるのに充分な量で存在するのかを測定した。0.01μg/mlより大きい残留PHAがこのような応答を生じるであろう。細胞の不在下で、少量のPHAを40〜48時間で上澄み中に観察した。しかしながら、PHA（25μg/ml）をわずかに24時間使用した時、これらのレベルはごくわずかであった。こうして、24時間のインキュベーションが最適と考えられた。
新しいフラスコを匹敵する条件下で旧式のフラスコと比較した時、高レベルのIL-2が古いフラスコで観察された。それ故、旧式のフラスコは一般的であったが、NC混合物を生成する実施例には常に使用されなかった。
実施例2
本発明におけるX vivo-10、X vivo-15及びX vivo-20（ホイットテーカー）並びにMEMの比較を行って、図1〜3に示した。X vivo-10及びX vivo-15はインターロイキン−2−リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞プロトコルについて米国食品、薬品管理局によりヒトへの投与について認可されている。1μg/mlのPHAへの連続露出vsパルス化露出を使用して、NCMの生成を異なる培地中で比較した。細胞濃度の効果を1μg/mlのPHA（図2）及び2μgのPHA（図3）への連続露出で調べた。これらの因子の最適組み合わせは2μg/mlのPHAを使用する2.5または5.0 x106/mlまたは1μg/mlのPHAを使用する5.0 x106/mlの細胞濃度におけるX vivo-10中の固定化による連続露出であることがわかった。細胞当たりの収率は2.5 x106/mlで最も有効であるので、2μg/mlのPHAを用いるその濃度が最適として選択される。
実施例3
フラスコではなく管中の予備実験を行って、PHAへの露出後のヒト白血球からのサイトカイン産生を増進するシプロフロキサシン及び2種のその他の4−アミノキノロン抗生物質（ノルフロキサシン及びオフロキサシン）に関するパラメーターを測定した。表2は、これらの4−アミノキノロン抗生物質の夫々80μl/mlがIL-1、IL-2、IL-6、IFN-δ、TNF α、及びG-CSFの産生を増進したことを示す。IL-8産生が最高であった。IL-3、IL-4、及びIL-7が全ての上澄み中でこれらの状況下で検出できなかった。これらの結果は、これらの無血清条件下で、80μg/mlで試験した全ての4−アミノキノロンが無血清条件下でPHA誘導サイトカイン産生を増進したことを示す。
IL-2以外のサイトカインに関する単位はpg/mlであり、IL-2に関する単位は国際単位/mlである。
ND: 検出できなかった。
実施例4
Ｔリンパ球を誘導して増殖させ、インターロイキンを産生させるモノクローナル抗体、OKT-3（Ortho）がこれらの条件下で刺激物質として使用し得ることをまた測定した。表3は、OKT-3が実施例1に示されたフラスコ中でインキュベートされた細胞を用いてPHA＋シプロフロキサシンにより誘導されたサイトカインと同様のサイトカインを誘導したことを示す。IL-3、4及び7は刺激物質のいずれの組でも検出されなかった。OKT-3は、PHA及びシプロフロキサシン（CIPRO）と一緒にされた時に幾つかのILについて小さい累積的効果を生じた。
IL-2以外のインターロイキンの単位はpg/mlであり、IL-2に関する単位は国際単位/mlである。
ND- 検出できなかった。
実施例5
in vitroでrIL-1に対しNCMの優れることを示すために、マウス脾臓細胞及び胸腺細胞をバイオアッセイ及びトリチウム標識チミジンとり込みにより測定したＤＮＡ合成により測定してIL2の匹敵するレベルでMEM及びrIL-2とともに培養した。NCMはIL2含量に基いてrIL-2よりも脾臓細胞（図4）及び胸腺細胞（図5）の大きな増殖を誘導する。
実施例6
図6及び7に示された一連の実験において、退縮した胸腺を有するマウスをrIL-1、rIL-2、これらの因子の組み合わせ、NCMまたは食塩水（対照）でin vivoで処理した。脾臓及び胸腺を除去し、細胞をインターロイキン（IL-1、IL-2）、NCM及びマイトジェンConAに対する細胞増殖応答について試験した。結果を食塩水処理した対照に対する比として表す。rIL-1、rIL-2、及びそれらの組み合わせ（rIL-1及びrIL-2）によるin vivo処理はIL-1、IL-2、NCMまたはConAによるin vitro刺激に対する脾臓細胞（図6）または胸腺細胞（図7）の増殖応答を増大する有意な効果を有していなかった。in vivoのNCM処理は全ての四つの刺激に対し脾臓細胞及び胸腺細胞の両方を有意に増強した。これらの結果は刺激に対するこれらの細胞の増強された感受性および／または応答細胞の数の増加と一致する。
実施例7
図8及び9は脾臓細胞マーカー及び胸腺細胞マーカーに関するin vivoのNCM処理の効果を示す。非成熟Ｔ細胞が--により示され、特に胸腺中のＴリンパ球前駆体に相当し得る。NCMは脾臓及び胸腺中でこの集団を比例して増加した。未熟Ｔ細胞が++により示され、この集団はNCM処理により胸腺中で比例して減少される。成熟Ｔ細胞がCD4+及びCD8+により示される。NCMは脾臓ではなく胸腺中の成熟Ｔ細胞の比率を増加した。これらの結果はＴ細胞前駆体を増加し、胸腺中の成熟Ｔ細胞へのそれらの発育を促進するNCMの効果と一致する。
実施例8
図10及び11はヒドロコルチゾンモデル中の対照培地またはNCMによるin vivo処理後の培地（RPMI）、rIL-1（IL1）、rIL-2（IL2）、またはNCMに対する脾臓細胞応答及び胸腺細胞応答を示す。マウスを上記のようにして処理した。これらのデータは、NCMがバックグラウンド脾臓細胞応答、IL-1及びIL-2に対する脾臓細胞応答を増強するが、NCMがバックグラウンド胸腺細胞応答並びにIL-1、IL-2、及びNCMに対する胸腺細胞応答を増強しないことを実証する。
図12及び13は対照培地またはNCMによるin vivo処理後のConA及びPHAに対するin vitroの脾臓細胞応答及び胸腺細胞応答を示す。マウスを上記のようにして処理した。
in vitro研究は、脾臓細胞及び胸腺細胞を増殖シグナルに感作する際の均等投薬量でrIL-2よりもNCMの優れることを実証する。胸腺細胞に関する効果は同様に分化の促進を反映する。rIL-1、rIL-2、またはそれらの組み合わせではなく、NCM組成物はin vivoのＴリンパ球機能（IL応答）及び発育（マイトジェン応答及び細胞マーカー）を強力に促進し、これは免疫系の刺激を必要とし、または損傷された免疫系または欠損免疫系の部分機能を回復する治療手段において治療上妥当である。例えば、化学療法薬は免疫応答に関与したＴリンパ球を含む細胞を損傷し得る。Ｔリンパ球機能及び発育を刺激することによる本発明は、損傷された場合の免疫系のこの特徴を部分的または完全に回復し得る。
この明細書中、米国特許を含む、種々の刊行物が引用または番号により参考にされる。刊行物に関する完全な引用が以下にリストされる。本発明が関係する技術水準を更に充分に記載するために、これらの刊行物及び特許のそのままの開示が本件出願の参考として本明細書に含まれる。
本発明が例示様式で記載され、使用された用語は限定の性質ではなく説明の用語の性質であることが意図されていることが理解されるべきである。明らかに、本発明の多くの改良及び変化が上記の教示に鑑みて可能である。それ故、請求の範囲内で、本発明は明記された以外に実施し得ることが理解されるべきである。
本発明はサイトカインの天然混合物の改良された製造方法に関する。
発明の背景
近年、免疫系を調節してその応答を改善することが可能になってきており、この場合、その系の成分はその成分の機能を部分的または完全に回復するのに非機能性である。例えば、幹細胞を置換し、または欠けている幹細胞を与えるのに使用される骨髄移植がひどい複合免疫不全症を治癒することができる。別の例において、免疫細胞が癌患者から除去され、治療され、腫瘍退縮がある患者に戻される（Hwu及びRosenberg，1994a; Hwu及びRosenberg，1994b）。更に、γ−グロブリン及び静脈内免疫グロブリン（IVIG）の如き体液性免疫系の成分は広い治療用途があることが知られている（Desimoneら，1990; Hall，1993）。また、その他の免疫系成分が治療薬として使用されている（Hadden及びSmith，1992; Hadden，1993; Talmadge及びHadden，1994）。
免疫調節薬は、免疫機能を調節し、または免疫系の活性に正または負の効果を有する化合物である。臨床医薬中の免疫調節薬の使用は免疫機能の再生（または免疫不全症の修正）及び正常または過度の免疫機能の抑制を含む。免疫調節薬の主要なクラスはサイトカインである。組換え技術により、サイトカインの多くが臨床上の使用に現在利用できる。しかしながら、免疫系は複雑であり、しかも種々の成分の相互作用が免疫機能を有効に調節するのにしばしば必要である。免疫機能を有効に調節する種々の成分及び相互作用を与える製剤を設計することが有益であろう。
サイトカインは、胸腺由来Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球及び単球／マクロファージを含む活性化免疫細胞により産生されるペプチド／タンパク質免疫調節薬である。サイトカインとして、インターロイキン（IL-1〜IL-15）、顆粒細胞および／またはマクロファージに関するコロニー刺激因子（CSF）（CSF-G、CSF-M、CSF-GM）、腫瘍壊死因子（TNFα＆β）、及びインターフェロン（IFNα、β＆γ）が挙げられる。
インターロイキン-2（IL-2）はＴ細胞成長因子として最初に記載されたリンホカインである（Morganら，1976）。化学的には、IL-2は133アミノ酸、15,000ダルトン分子量の糖タンパク質である。それは正常な末梢血リンパ球、扁桃及び脾臓のＴ細胞、並びに大顆粒リンパ球により産生される。IL-2は抗原またはマイトジェン刺激Ｔ細胞の増殖を誘導し、支持する。Ｔリンパ球刺激機能に加えて、IL-2は免疫応答の開始、増大及び調節、γインターフェロン（IFNγ）の産生、リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞の誘導、細胞溶解Ｔ細胞の増殖、及びナチュラルキラー（NK）細胞のキラー活性の増強の如きプロセスに重要である。
組換えIL-2（rIL-2）はヒトｃＤＮＡ配列により生成される非グリコシル化タンパク質である。遺伝子操作されたIL-2はTaniguchiら（1983）及びDevos（1983）並びに米国特許第4,604,327号及び同第4,569,790号明細書に記載されたようにして得られてもよい。野生型または天然分子の位置125にあるシステインが中性アミノ酸、例えば、アラニンまたはセリンで置換されたrIL-2は、Markらの米国特許第4,518,584号明細書に記載されたようにして得られてもよい。
rIL-2を生成し、臨床純度で単離する方法が、培養Ｔ細胞からの天然IL-2の単離と同様に、Kothsらの米国特許第4,569,790号明細書に見られる。また、天然IL-2の生成方法が米国特許第4,390,623号、同第4,464,355号、及び同第4,448,879号明細書に見られる。Thurmanら（1986）は、部分精製された天然IL-2（nIL-2）製剤及びrIL-2製剤の異なる製剤が種々の生物学的アッセイにおいてそれらの活性の点でかなり変化することを開示している。
天然及び組換えの両方の種々の個々のサイトカインが癌及びその他の疾患の治療について調べられていた。例えば、組換えインターフェロンα2（rIFN α2）が有毛状細胞性白血病、カポジ肉腫、尖圭コンジローム、及び慢性肝炎の治療について米国食品薬剤管理局（FDA）により認可されている。白血球によりつくられた20種以上の混合物（アルフレオン▲Ｒ▼）としての天然IFN αが尖圭コンジロームについてライセンスされている。組換えIFN-γ（rIFN-γ）が慢性肉芽腫性疾患についてライセンスされている。rIL-2が腎臓細胞癌についてライセンスされている。これら及びその他のrIL及びrIFNが、癌の幾つかの形態を含む種々の疾患において活性評価中である。
更に、rIL-2癌治療が多くの診療所及び研究センターで研究されていた。Rosenberg及び同僚（Rosenbergら，1985; Mule及びRosenberg，1987; Rosenberg，1988; Belldegrun及びRosenberg，1989; Chang及びRosenberg，1989; Rosenberg，1994）は腎臓細胞癌、及び悪性メラノーマの患者の免疫治療における全身投与されるrIL-2の使用を報告していた。Cortesinaら（1988，1994）は頭部及び首の癌の患者における天然IL-2及びrIL-2のロコリージョナル（loco-regional）注射の効果を記載し、天然IL-2が腫瘍退縮を生じるのに更に有効であることを見出した。大投薬量のrIL-2を投与された患者は寿命を短くする毒性に苦しんでいた（Rosenbergら，1994）。
遺伝子操作された（組換え）免疫調節薬の開発及び商業上の利用可能性が癌臨床におけるこれらの薬剤の評価を加速した。高投薬量のrIL-2、rIFN−γ、γTNF-α、及びその他の単一治療薬と関連する制限された効力及びかなりの毒性は、治療戦略におけるサイトカインの天然組み合わせの再考を示唆する。更に、百より多い異なるサイトカイン活性が同定され、これが、組換えサイトカインを組み合わせることに基く免疫療法が近い将来の癌診療の成功の妥当な可能性を有することについてかなりの疑問を生じる。
例えば、IL-2はＴ細胞成長因子としてＴリンパ球増殖を刺激することができるが、その他のインターロイキン及び胸腺ペプチドを含む幾つかのその他の因子が胸腺中で産生され、Ｔリンパ球発育及び機能に必要と考えられる（Hadden，1992）。
天然インターロイキン製剤（NI）と称される特性決定されていない製剤が本件出願人によりＴリンパ球発育を促進するのに有効であることが示された。この特性決定されていない混合製剤（また、バフィコートインターロイキン、BC-ILと称される）が前胸腺細胞、未熟胸腺細胞及び成熟胸腺細胞の増殖を均等濃度のrIL-2よりもin vitroで更に有効に刺激した（Haddenら，1989）。このNI製剤は新生児マウスのＴリンパ球発育を増進したが、rIL-2は不活性であった（Haddenら，1989）。更に、このNI製剤はヒドロコルチゾン処理された老化マウスのＴリンパ球発育及び機能を増進したが、均等投薬量のrIL-2は不活性であった（Haddenら，1992）。更に、低投薬量の特性決定されていないNI混合物は悪性メラノーマを有するマウスの寿命を延ばした。均等投薬量のrIL-2は不活性であった（Kamedaら，1992）。これらの知見は、天然インターロイキン混合物がIL-2により与えられない活性を有することを示す。
Ｔリンパ球欠陥を修正しようとする試みが老化、癌、エイズ、及びその他の免疫不全症で生じるＴリンパ球枯渇（リンパ球減少症）及びＴリンパ球不全（アネルギー）を含む種々のセッティングにおいて実験で試みられた。例えば、rIL-2及び胸腺ペプチドが種々の結果でエイズ（HIV）ウイルス感染症に使用された（Hadden,1991）。連続注入による高投薬量のrIL-2はHIV感染症の患者の血液中でＴリンパ球カウントを一時的に増加することが示されたが、かなりの毒性を有していた（Lane及びFauci，1985）。百万〜3百万単位のペギル化（pegylated）rIL-2は毒性を殆ど生じなかったが、HIV感染症のヒトのリンパ球カウントにごくわずかの作用を生じた（Merigan，1993）。NI製剤は毒性なしにリンパ球減少癌患者のＴリンパ球カウントをかなり高めた（Haddenら，1994）。これらの知見は、天然インターロイキンがヒト中で低投薬量で作用して毒性を生じないでＴ細胞を増加すること及びrIL-2が高投薬量で活性ではあるものの医療用途にはあまりに毒性であることを示す。また、これらの知見はマウスデータからヒトへの外挿を支持する。
以上は、天然産サイトカインの製剤の使用が低毒性で免疫系に影響するのに一層有効であり得ることを示唆する。しかしながら、現在入手し得る製剤は良く特性決定されておらず、しかも以下に記載されるように製造するのが面倒である。免疫系を再現性良く調節するために、容易かつ廉価で製造でき、しかも臨床上の使用のために再現性の低毒性製剤を確立することが可能である、血清及びマイトジェンを含まないサイトカインの良く特性決定された製剤を有することが有益であろう。
Zimmermanらの米国特許第4,985,241号明細書は、遊離基発生により哺乳類宿主に生じた生物学的損傷の治療及び予防上の措置において生物学的変性剤、例えば、遊離基脱除剤または代謝インヒビターと組み合わせた組換えリンホカインまたはサイトカインの使用を開示しているが、天然産サイトカインの特定混合物の製造を示唆していない。
それ故、Ｔリンパ球の低下された機能、発育及び数、即ち、細胞性免疫不全症を含む疾患及びその他の症状の治療に治療上使用し得るサイトカインの天然混合物（NCM）をリンパ球から生成することが有益であろう。治療上有益であるために、NCMは無菌であり、内毒素を含まず、血清を含まず、マイトジェンを含まず、ウイルスを含まず、かつＤＮＡを含まないでレシピエントからの反応を避けることが必要である。分子篩技術がこれらの汚染物質の多くを除去することができる。しかしながら、製造に必要な操作が多い程、コストが高い。更に、必要とされる取扱い工程が多い程、収率が低いだけでなく、汚染の機会が増える。それ故、NCMをこれらの汚染物質のいずれかを最小にし、または排除するような方法で製造し得る場合、その製造はコスト効率が更に良いであろう。
上記の研究に使用されたNIの製剤は血清を含まず、マイトジェンを含まなかったが、使用前に10倍に濃縮される必要があった。
米国特許第4,390,623号及び同第4,464,355号明細書に教示されたようにしてつくられる天然インターロイキン-2は無血清培地中で生成され、それにより血清タンパク質を除去する工程を必要としない。その製剤は、血清を含まず、マイトジェンを含まない、癌に対する活性を有する天然インターロイキン-2として記載されている。この物質は、細胞をHaddenら（1970）により最初に記載されたマイトジェンに短時間露出すること（パルス技術）により調製された。
パルス技術はリンパ球を組織培養中に刺激し、それが回収される時に培地中に存在するマイトジェンを有することを避けるのに使用される。細胞は最初にマイトジェンの存在下で無血清培地中で2時間培養される。このインキュベーション後に、細胞が再度単離され、マイトジェンを含まない培地中で3回洗浄され、次いでマイトジェンを含まない新しい組織培養無血清培地中で低密度で再度懸濁される。製剤はIL-2以外の成分について特性決定されなかった。
また、Fabriciusらの米国特許第4,448,879号明細書は天然の無血清かつ無マイトジェンのIL-2を製造するための細胞培養方法を教示している。その方法はローラー培養系、または培地を機械的に循環する系中でバフィコート細胞を使用した。しかしながら、その方法は、細胞が洗浄されてマイトジェン及び血清を除き、次いで無血清、無マイトジェンの培地中で再度培養される工程を依然として必要とする。重要なことに、記載された方法は細胞を刺激するのに不十分に有効であるにすぎず、しかもIL-2の低収率を生じる。必要な大容積は高価であり、徹底的な熟練された取扱いを必要とし、使用前に濃縮される必要があり、活性の損失をもたらす（約50％）。
Martorellら（1987）は血清を含む培地中でマイトジェンの連続の存在下で有糸***誘発を誘導する方法を提供している。彼らの方法において、IL-2の収率は極めて低く、しかも血清の存在を必要とする。
血清及びマイトジェンを含まない細胞を洗浄する工程を必要とせず、しかも高価な装置を必要としない方法を有することが有益であろう。
上記の系において、マイトジェンは一般に植物レクチン、例えば、植物性血球凝集素（PHA）及びコンカナバリンＡ（ConA）であり、これらはＴリンパ球抗原レセプター（TCR）（Chilson及びKelly-Chilson，1989）に対するアフィニティーを有し、かつＴリンパ球に対して有糸***誘発効果を有する。このようなレクチンへのＴリンパ球の露出は天然サイトカインの産生を刺激する。培地中の血清の不在下で、一般にわずかに低レベルのサイトカイン、特にインターロイキンが産生される。例えば、IL-2は一般に無血清培養条件下で1ml当たり0〜20単位/ml単位の範囲でのみ見られる（米国特許第4,390,623号及び同第4,464,355号）。血清を含む場合、IL-2産生の範囲は一般に1ml当たり10単位以上である。
リンパ球を刺激してIL-2の如きサイトカインを血清の不在下で高レベルで産生することが有益であり、その結果、その混合物は、パルス化露出後に細胞を洗浄し、または特殊な装置を使用して関連する活性の損失を伴って製剤を濃縮するという工程を追加しないで、しかも収率を低下しないで、治療薬として有効に使用し得る。
発明の要約及び利点
本発明は少なくとも一種のマイトジェンを組織培養容器中で固定する工程により天然サイトカイン混合物を製造する特異な方法を提供する。好中球及び赤血球を含まないリンパ球の単離された集団が無血清培地中で懸濁され、容器に入れられる。リンパ球が培養され、マイトジェンを含まず、かつ血清を含まない培地が除去され、サイトカインの収率について特性決定される。
【図面の簡単な説明】
本発明のその他の利点が、図面に関して考慮される時に以下の詳細な説明を参考にして良く理解されるようになるので容易に認められるであろう。
図1はX-vivo-10（EX10）、X-vivo-15（EX15）、X-vivo-20（EX20）及び最小必須培地（MEM）中のNCMのIL含量（ELISAにより測定されるIL-2（IL2）の光学密度として表される）を示し、マイトジェンPHAへの連続露出（開いたバー）をパルス化露出（クロスハッチ付き）と比較する棒グラフである。
図2は異なる培地、1 x 106/mlの細胞（クロスハッチ付き）、2.5 x 106/mlの細胞（斜線）及び5 x 106/mlの細胞（開いたバー）中1μg/mlのPHAによるNCM生成に関する細胞濃度の効果を示す棒グラフである。
図3は異なる培地、1 x 106/mlの細胞（クロスハッチ付き）、2.5 x 106/mlの細胞（斜線）及び5 x 106/mlの細胞（開いたバー）中2μg/mlのPHAによるNCM生成に関する細胞濃度の効果を示す棒グラフである。
図4は均等濃度のIL-2における組換えIL-2（破線）と比較したNCM（実線）によるナイーブマウスからの脾臓細胞のin vitro処理のチミジンとり込み（ConA刺激）に関する効果を示す投薬量応答グラフである。
図5は均等濃度のIL-2における組換えIL-2（破線）と比較したNCM（実線）によるナイーブマウスからの胸腺細胞のin vitro処理のチミジンとり込みに関する効果を示す投薬量応答グラフである。
図6はrIL-1、rIL-2、rIL-1 + rIL-2またはNCMによるin vivo処理後のrIL-1（開いたバー）、rIL-2（ソリッドバー）、NCM（クロスハッチ付き）及びコンカナバリンＡ（斜線）に対するin vitroの脾臓細胞応答の棒グラフである。
図7は図6のようなin vivo処理後のrIL-1、rIL-2、NCM及びConAに対するin vivoの胸腺細胞応答の棒グラフである。
図8はCD4+細胞、CD8+細胞、及びCD4-/CD8-（--）細胞の脾臓細胞マーカーに関する対照（開いたバー）またはNCM（ソリッドバー）によるマウスのin vivo処理の効果を示す棒グラフである。
図9はCD4-/CD8-細胞（--）、CD4+/CD8+（++）並びにCD8+細胞とCD4+細胞（CD4 + CD8）の胸腺細胞マーカーに関する対照（開いたバー）またはNCM（ソリッドバー）によるマウスのin vivo処理の効果を示す棒グラフである。
図10は対照培地（開いたバー）及びNCM（閉じたバー）によるin vivo処理後のIL-1、IL-2及びNCMに対するin vitroの胸腺細胞応答の棒グラフである。
図11は図10と同様の脾臓細胞応答の棒グラフである。
図12は対照培地（開いたバー）及びNCM（閉じたバー）によるin vivo処理後のConA及びPHAに対するin vitroの胸腺細胞応答の棒グラフであり、そして
図13は図12と同様の脾臓細胞応答の棒グラフである。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は特性決定された天然サイトカイン混合物（NCM）、即ち、多種サイトカインを含む細胞培養上澄みを再現性良く製造する方法を提供する。
一般にHIV陰性、肝炎ウイルス陰性の多数のドナーからの好中球及び赤血球を含まない、バフィコートからの溜められたリンパ球が本発明のサイトカイン混合物を製造するのに使用される。多数のドナーの使用は混合リンパ球応答（MLR）を利用する。更に、好ましい実施態様において、50までのドナーが混合物を製造するのに毎回使用されて、MLR応答が夫々の製剤について一定であることを確実にし、かつ変化をなくす。
別の実施態様において、自己リンパ球がNCMを生成するのに使用されるであろう。これらの場合、患者はウイルスを含まない必要がないであろう。更に、自己リンパ球が使用される場合、それらは必要に応じて患者にもどされるであろう。別の実施態様において、動物は獣医学上の使用の細胞源であってもよい。
リンパ球は組織培養容器中で固定されたマイトジェンの存在下で培養される。好ましい実施態様において、マイトジェンは製造業者の指示に記載されたようにして細胞サブセット（AIS microCELLectorTM T-25プレート）の選択用の表面活性化細胞培養フラスコに固定される。しかしながら、マイトジェンを培養容器の表面に固定するその他の方法、例えば、その他の“パンニング”技術を合体する方法またはセファロース4Bビーズにカップリングする方法が、細胞分離の業界で公知であるように使用し得る。選択のための固定細胞の使用が当業界で公知である。しかしながら、サイトカイン生成のための使用は新規である。
マイトジェンは一般にレクチン及びリンパ球を刺激してサイトカインを産生するモノクローナル抗体から選ばれる。好ましい実施態様において、植物性血球凝集素（PHA）またはOKT3（オルトクローン▲Ｒ▼、Ortho Pharmaceuticals）が使用される。Ｂ細胞を刺激するその他のレクチン、例えば、コンカナバリンＡ（Con A）またはアメリカヤマゴボウマイトジェンが使用し得る。Ｔ細胞レセプターのモノクローナル抗体、例えば、CD2、CD28、CD45がマイトジェンとして使用でき、有効であろう。抗CD28抗体及び抗CD45抗体がIL-2のハイパープロデューサーであることが報告されている（Deansら，1989及びJuneら，1989）。更に、抗リンパ球グロブリン（ALG）がＴ細胞の有糸***誘発活性を有する。その他に、マイトジェンの組み合わせがリンパ球亜集団の組み合わせを活性化するのに使用し得る。PHAが好ましい実施態様において使用され、約25μg/mlの開始濃度で被覆される。
リンパ球は、マイトジェンへの連続露出により、即ち、洗浄しないで、無血清培地中で24〜48時間インキュベートされる。好ましい実施態様において、培地はX vivo-10培地またはX vivo-15培地（Whittaker）である。これは製造業者のパンフレットに示されているように患者中のIL-2/LAK注入のための無血清のFDA認可された培地である。RPMI-1640（Sigma）のようなヒトリンパ球増殖を支持することができる無血清培地がまた使用し得る。
また、培地は4−アミノキノロン抗生物質を含む。好ましい実施態様において、抗生物質はシプロフロキサシンである。その抗生物質は無菌性を維持し、リンホカインを過剰生産するのに使用される。シプロフロキサシン及び関連抗生物質は可溶性マイトジェン及び血清の存在下でIL-2及びその他のサイトカインを増加すると報告されていた（Riesenbeckら，1994）。それらは血清の不在下で有効ではないと報告されていた。また、固定されたマイトジェンと一緒のそれらの使用が新規である。シプロフロキサシンは好ましい実施態様において約20μg/mlから約200μg/mlまでの濃度、更に好ましくは約80μg/mlの濃度で使用される。
上澄みが除去され、本発明の天然サイトカイン混合物（NCM）の源である。上澄みは実施例1に示されるようにマイトジェンを含まず、また動物研究及び初期のヒト研究において濃縮される必要はない。
ヒト血清アルブミン（HSA）がNCMを上澄み中で安定化するのに添加し得る。HSAは非ヒト起源からの血清アルブミンに代えて使用される。何となれば、HSAはヒト用にFDAにより認可されていたからである。
上澄みのサイトカインプロフィールが、下記のアッセイを使用して確立される。上澄みのインターロイキン（IL）含量がIL-2に関するバイオアッセイ及びその他のインターロイキン、CSF、TNF、及びIFNに関するELISAにより確認される。無菌性が懸濁され、内毒素がリムルス細胞分解産物アッセイにより測定される。詳しくは、下記のアッセイ及びキットが好ましい実施態様において使用される。
INF-γELISA（ENDOGEN）、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、GM-CSF、G-CSF及びTNF-αELISA（R ＆D Systems）。IL-2バイオアッセイはGillisら（1978）の方法によるものであり、IL-2の既知の標準物質（Schiapparelli Biosystems，Inc.，Fairfield，NJ）と比較して単位/mlとして表される。
PHAがマイトジェンとして使用される好ましい実施態様において、上澄みのサイトカインプロフィールは以下のプロフィールを有する。
サイトカイン 量
IL-1 10-2000pg/ml
IL-2 100-500単位/ml
IL-6 250-10,000pg/ml
IL-8 12,000-100,000pg/ml
IL-12 100-10,000pg/ml
IFN-γ 50-15,000pg/ml
TNF-α 50-15,000pg/ml
CSF-G 50-1500pg/ml
CSF-GM 10-1500pg/ml
IL-3/IL-4/IL-7 痕跡量
マイトジェンの固定化は従来技術のパルス技術よりもNCMの高い収率を生じる。例えば、無血清培地中のPHAを用いるパルス技術によるインターロイキンの製造は0-20単位/ml培地でIL-2を生じた（米国特許第4,390,623号及び同第4,464,355号）。
しかしながら、本発明は4−アミノキノロン抗生物質を無血清培地に添加してインターロイキンを過剰誘導して約8-140単位/mlのIL-2を生じることによりパルス技術による増大された生産を可能にする。先に引用された動物研究により予想されるように、天然インターロイキン混合物（NIM）として特性決定されたこの製剤は、200単位のIL-2/投薬量で、頭部及び首の癌を有するリンパ球減少患者の血液中のＴ細胞リンパ球カウントを増加し（Haddenら，1994）、これはこのような低い投薬量ではrIL-2について報告されていなかった。IL-2の同様の効果がNCM中のIL-2の量の5000倍よりも大きい投薬量でのみ報告されていた。こうして、NCMに均等なIL-2の投薬量がその効力のインデックスとして使用され、NCMの全生物活性がIL-2のみの全生物活性であることを意味するものではないことを注目することが重要である。
本発明の好ましい実施態様において、固定化によるマイトジェンへの連続露出及び4−アミノキノロン抗生物質の存在を利用して、一般に生成されるNCMは100-353単位/mlのIL-2を含む（製剤の効力のインデックス）。それ程好ましくない実施態様において、本発明は4−アミノキノロン抗生物質の連続の存在及びマイトジェンのパルス化存在により実施でき、NIMを生成し得る。この組み合わせはパルス化マイトジェンのみによる従来技術よりも大きいサイトカインのレベルを生じるが、本発明の好ましい実施態様：連続の固定されたマイトジェン及び4−アミノキノロン抗生物質で見られるレベルを生じない。この状況における好ましい実施態様は生物活性の損失をもたらす濃縮を必要としないサイトカイン製剤の効力により特定される。IL-2の均等投薬量における好ましい実施態様は、それ程好ましくない実施態様（NIMまたはNI）（Haddenら（1992）及び本件出願と同じ日に出願され、本発明の同じ譲受人に譲り受けられた同じ出願人による共同未決出願を参照のこと）と同じ生物活性を有する。
PHAで刺激されたリンパ球による天然サイトカインの混合物の産生はＴリンパ球抗原レセプター（TCR）に対するアフィニティーを有する植物レクチンを代表する。その他のこのような刺激物質はコンカナバリンＡ（Con A）である。高レベルのインターロイキンをこれらの条件下で誘導することが同様に予想されるであろう。TCRに関連するＴリンパ球表面レセプターに結合するOKT-3の如きモノクローナル抗体による天然サイトカインの混合物、即ち、CD3複合体の産生がDC2、CD28、CD45の如きレセプターのその他のモノクローナル抗体を代表し、それらは同様にこれらの条件下で高レベルのサイトカインを誘導すると予想されるであろう。Ｂ細胞または単球を刺激するその他のマイトジェンが、Ｔ細胞を刺激するマイトジェンと組み合わせて使用されて天然サイトカイン混合物を与え得る。
これらの刺激物質の組み合わせがIL-1及びIL-2について表3に観察されるような累積的効果を有することが予想されるであろう。
PHAにより産生されたNCMがIL-1、IL-2、IFN-γに富み、またIL-12（323pg/ml）を含み、かつほんの痕跡量のIL-3、IL-4、及びIL-7を有するという本明細書に含まれる観察は、これらの条件下でPHAがＴヘルパー型II細胞よりも優先的にＴヘルパー型Ｉ細胞（TH-1）を刺激することを示す。これは、これらのリンホカイン製剤がアジュバント活性を有して細胞の免疫応答を増強するという測定を可能にする（Hadden，1994を参照のこと）。固定されたマイトジェンによるNCMの産生は、PHAまたはその他のマイトジェンによる刺激の前にパンニングしてこれらの細胞型に特異性のサイトカインについて濃縮されているNCMを得ることにより細胞分離に適したプレートを使用してＴ細胞サブセット（CD4、CD8、CD30、TH-1、TH-2等）により利用し得る。
NCMはアリコートに分けられ、4℃以下で貯蔵されて生物活性を維持する。
本発明プロトコルの有効量の天然サイトカイン混合物は本件出願と同日に出願され、本件出願と同じ譲受人に譲り受けられ、参考として本明細書に含まれる本件出願人による共同未決出願に記載されているとおりである。天然サイトカイン混合物は哺乳類宿主、好ましくはヒトに投与でき、特定のサイトカインプロフィールを有し、一般にヒトについて投薬量当たり約200-500単位のIL-2を有するであろう。
その治療を受ける患者は細胞性免疫不全症それ自体またはその他の症状と組み合わせた細胞性免疫不全症と診断された患者であろう。患者のＴ細胞機能及び血液レベルは当業界で知られているように評価され、正常より下回る場合にはＴ細胞異常を特異的に治療するように設計された本発明による細胞性免疫不全症を有する治療の候補であろう。Ｔ細胞リンパ球減少症は癌及びエイズの如き疾患における細胞性免疫不全症の反映であるだけでなく、疾患のない老人の死亡率の予測因子であることを注目することが重要である（Benderら，1986）。
NCMは、個々の患者の臨床状態、投与の部位及び方法、投与の計画、及び医療実務家に知られているその他の因子を考慮して、良好な医療実務に従ってIL-2均等物の低投薬量（200-500単位）で投与される。こうして、本明細書に記載された目的のための“有効量”は当業界で知られているような考慮事項により決定される。効果が失われ、毒性が増大するので、高投薬量（>1000単位／投薬量）を使用しないことが重要である。その量は、細胞性免疫機能のin vitro測定、in vivoの増大されたＴリンパ球レベル、再生抗原またはNCMに対する改善された皮膚試験応答、改善された生存率、一層迅速な回復、または症候の改善もしくは排除並びに腫瘍塊の癌減少における改善された応答を含むが、これらに限定されない、治療患者の25％の免疫機能の改善を示すように有効である必要がある。NCMはその他の治療とともに使用されて免疫機能を改善し、癌を治療し得る。NCMまたはNIMの臨床上の使用の例が頭部及び首の癌においてHaddenら（1994）により例示される。
本発明の方法において、NCMは種々の方法で投与し得る。NCMは単独で、または医薬上許されるキャリヤーと組み合わせて投与し得ることが注目されるべきである。それは皮下投与でき、または静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、外リンパ投与、リンパ内投与及び鼻内投与を含む、非経口投与し得る。部位特異的投与が可能な場合に好ましい。化合物の移植または注入がまた有益である。ガイダンスがHaddenら（1990）及びHaddenら（1994）により与えられる。
ヒトにおける非経口投与について、本発明は一般に好ましくは医薬上許されるキャリヤー媒体中で単位投薬注射形態で製剤化され、好ましい実施態様において、それはx-vivo-10媒体であろう。また、公的なキャリヤー媒体として、食塩水、スクアレン、デキストロース溶液、通常の血清アルブミン、リンゲル液等が挙げられるが、これらに限定されない。必要により、少量の添加剤、例えば、安定剤、防腐剤または緩衝剤がこのようなビヒクル中に含まれてもよい。このような製剤は非経口投与のために水性注射液中の再生に適している。混合物は典型的には約50〜500単位のIL-2（当量）/ml、好ましくは約150〜350単位のIL-2（当量）/mlの濃度でキャリヤー媒体中で製剤化されるであろう。更に、混合物は本発明について示されたその他のサイトカインについて不変のプロフィールを有するであろう。
必要により、NCMは無菌の安定な凍結乾燥製剤にされ、その中で活性成分が水溶性キャリヤー、及び必要により、安定剤または無毒性防腐剤と混合される。抗菌性防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、及び緩衝剤を含む組成物の安定性、無菌性、及び等張性を増強するこれらの種々の添加剤が使用し得る。微生物の作用の防止はシプロプロキサシンの存在及び種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により確実にし得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を含むことが望ましいであろう。注射可能な医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらされる。しかしながら、本発明によれば、使用されるあらゆるビヒクル、希釈剤、または添加剤もしくは送出ビヒクルはNCMと適合性にされる必要があり、また本発明の生物活性を変化しないであろう。
投薬量及び投薬レジメは主として治療される個々の患者、患者の履歴、患者に対する生物学的損傷の型及び大きさ、治療の長さ及び治療のプロトコルに依存するであろう。投薬は数日の期間にわたって単一投薬または多投薬であってもよい。最も好ましい投薬量は、癌の場合の疾患の最大の退縮またはその他の症状における症候の最大の減少を得る投薬量である。ヒトは本明細書に例示されたマウスよりも一般に長く治療され、その治療は疾患プロセスの長さ及び薬剤有効性に比例する長さを有することが注目される。
NCMの薬理学的製剤はあらゆる適合性キャリヤー、例えば、種々のビヒクル、アジュバント、添加剤、及び希釈剤を含む注射可能な製剤中で患者に投与でき、または本発明に使用される化合物が徐放性皮下移植体または標的送出系、例えば、注入ポンプ、ポリマーマトリックス、リポソーム、及び微小球体の形態で患者に非経口投与し得る。本発明における使用に適した移植体は、移植された後に徐々に溶解するペレットまたは当業者に公知の生体適合性送出モジュールの形態をとり得る。このような公知の投薬形態及びモジュールは、活性成分が数日〜数週間の期間にわたって徐々に放出されるように設計される。
例えば、注入送出系に関するこのような徐放性形態は、癌の付近の局所のリンパ節に本明細書に記載されたNCMを送出するように肺癌及び食道癌に使用されることが考えられるであろう。その他の癌は同様の局所送出技術を使用するであろう。
本発明に有益な公知の移植体及びモジュールの例として、米国特許第4,487,603号明細書（これは薬物を調節された速度で分配するための移植可能な超小型注入ポンプを開示している）、米国特許第4,486,194号明細書（これは薬物を皮膚中に投与するための治療装置を開示している）、米国特許第4,447,233号明細書（これは薬物を正確な注入速度で送出するための薬物注入ポンプを開示している）、米国特許第4,447,224号明細書（これは連続薬剤送出のための可変流量の移植可能な注入装置を開示している）、米国特許第4,439,196号明細書（これはマルチチャンバー区画を有する浸透圧薬剤送出系を開示している）、及び米国特許第4,475,196号明細書（これは浸透圧薬剤送出系を開示している）が挙げられる。これらの特許が参考として本明細書に含まれる。多くのその他のこのような移植体、送出系、及びモジュールが当業者に公知である。
本発明は胸腺細胞の数及び機能を増大し、かつ癌、HIV、感染症、老化等で生じる二次性免疫不全症を反転するのに有効である。その方法は入院患者並びに外来患者基準で患者を治療するのに使用されてもよく、後者が好ましい。
上記の説明は天然サイトカイン混合物（NCM）をつくるための実際の基礎を与える。本発明により使用される方法及び本発明の実用性が下記の実施例により示される。
実施例はマウス系における本発明の実用性を実証する。しかしながら、均等製剤（NI及びNIM）がヒトの免疫系に関する活性を示していた（Pulleyら，1994; Haddenら，1994）。マウス系が選択された。何となれば、ヒト以外に、マウスが免疫系の構造及び機能に関して最も良く研究された種であり、またヒト応答を高度に予測するものとして当業者により認められているからである。今までのところ、わずかに微小の差異がマウスとヒトの間で観察されていた。マウスが種々の病原体及び腫瘍に対しそれ自体を防御するメカニズムの殆どがヒトと実質的に同じである。マウスモデルがヒト用の免疫調節薬の評価に広範囲で使用されていた（Talmadgeら，1985）。この従来技術のために、現行のマウス実験からの結果がヒト応答を予測する。
三つの例は免疫調節薬によるマウス系の予想の性質を実証する。マウス腫瘍モデルの広いスペクトルを使用して、インターフェロン（IFN）の抗腫瘍活性が示されており（Borden，1979; Talmadgeら，1985）、それに応じてヒトでは、IFNは多種の腫瘍に対して活性を示した（Goldstein及びLaslo，1988）。
第二の例において、マウス腫瘍モデルを使用して、腫瘍に対して単独で使用されたレバミゾールの効果がなかったが、活性が化学療法後に見られた（Symoens及びRosenthal，1977; Spreafico，1980）。同様にヒトでは、レバミゾールは5フルオロウラシルとともに使用された時にヒト結腸癌に活性を示したが、単独では示さなかった（Mutch及びHutson，1991）。
第三の例において、マウス腫瘍モデルを使用して、低投薬量のインターロイキン2（IL-2）は毒性を生じないで抗腫瘍活性を有することが示されたが、高投薬量のIL-2は特にリンホカイン活性化キラー（LAK）細胞で活性を有していたが（Rosenbergら，1985）、潜在的に致死性の毒性を有していた。また、ヒト研究は悪性メラノーマ及び腎臓細胞癌における高投薬量のIL-2±LAK細胞の有効性を示したが、大きな毒性があった（Rosenberg，1994）。そうであっても、それは現在腎臓細胞癌についてFDAによりライセンスされている。最近の研究は毒性を生じないヒト癌における低投薬量のIL-2の有効性を示す（Cortesinaら，1988及び1994）。これらのメカニズムはマウス系で見られた低投薬量の効果と同様である（Chirigos及びTalmadge，1985）。
免疫調節薬の上記の三つの例は癌における臨床上の使用について現在認可されており、マウス腫瘍研究により良く予想された。
その他に、動物研究は組換えインターロイキン（rIL）により共有されない天然インターロイキン混合物（nIL）の効果を示した。rIL-2ではなく、nILは胸腺依存性免疫応答を回復し、促進するのに活性であり（Haddenら，1992）、シクロホスファミドとともに悪性メラノーマに対する耐性を促進するのに活性である（Kamedaら，1992）。この同じパターンは、天然ILが組換えIL-2により共有されない方法でヒトの頭部及び首の癌に活性であった点でヒトで見られた（Cortesina，1988，1994; Haddenら，1994; Mattijissenら，1991）。
実施例
全般の方法
細胞培養に関する全ての工程を無菌条件下で行う。本明細書に記載されなかった細胞免疫学の全般の方法を、細胞免疫学技術に関する一般的な文献、例えば、Mishell及びShiigi（Selected Methods in Cellular Immunology，1981）に記載されたようにして、また当業界で知られているようにして行う。
物質
組換えヒトインターロイキンβ1（rIL-1β）はC.Reynolds博士（Biological Response Modifiers Program．NCI（Frederick，MD））からの贈答品であった。ヒトインターロイキン2（IL-2；比活性640U/ml）をファーマシアAB（Silver Spring，MD）から入手した。組換えIL-2はG.Caspritz（Hoescht Pharm.，Frankfort，ドイツ）からの贈答品であった。シプロフロキサシンをマイルズ社（West Haven，CT）から購入し、オフロキサシンをマックネイル・ファーマシューティカル（Spring House，PA）から購入し、ノルフロキサシンをメルク社（West Point，PA）から購入した。ヒト血清アルブミン（HSA）をアーマー・ファーマシューティカルズ（Kankakee，IL）から入手した。X-vivo培地をホイットテーカー・バイオプロダクツ（Walkersville，MD）から購入した。ヒドロコルチゾン21-ヘミスクシネート及びCon Aをシグマ・ケミカルズ（St.Lois，MO）から購入した。PHA（HA-16）をムレックス・ディアグノスチックス社（Dartford，U.K.）から入手した。OKT3をオルト・ファーマシューティカルズ（Raritan，NJ）から購入した。
天然サイトカイン混合物（NCM）の調製
多数のHIV陰性、肝炎ウイルス陰性のドナーからのヒト血液のバフィコート白血球を回収する。別の実施態様において、動物は獣医学上の使用のための細胞源であり得る。ドナーからの細胞を溜め、フィコールハイペーク勾配（Pharmacia）の上で層形成して好中球及び赤血球を含まないリンパ球を得る（米国特許第4,390,623号及び同第4,448,879号）。当業界で知られているような同じ出発リンパ球集団をもたらす別法が使用し得る。
リンパ球を洗浄し、フラスコ（MicroCELLectorTMT-25細胞培養フラスコ）中でX vivo-10培地（ホイットテーカー・バイオプロダクツ）中に分配し、そのフラスコ中に固定された刺激物質、即ち、マイトジェンがある。実験の一つの組において、X vivo-15及びX vivo-20培地を示されるように使用した。刺激物質に関する固定化方法は、フラスコ中のパンニング操作、即ち、細胞分離のための種々の物質を固定化することについて製造業者により記載されたとおりである。
細胞を37℃でCO2/空気インキュベーター中で80μg/mlのシプロフロキサシン（Miles Lab）を含むX vivo-10培地中で24〜48時間インキュベートする。また、RPMI1640培地を使用することができた（Webbら，1973）。一般にHSAを0.1〜0.5％（重量／容積）で使用する。インキュベーション後に、上澄みを注いで除き、回収する。ヒト血清アルブミン（HSA）を添加してインターロイキンを更に安定化することができる。上澄みを4℃〜-70℃で貯蔵する。
上澄みの特性決定
サイトカイン含量をIL-2についてバイオアッセイにより、また残りのインターロイキンIL-1〜IL-15、CSF、TNF、及びIFNについてELISAにより測定することにより、溜めた上澄みを特性決定する。無菌性をチオグルコレートブロース中の培養により試験し、内毒素を当業界で知られているようにリムルス細胞分解産物アッセイにより測定する。
サイトカイン含量に関する上澄みの標準化
比較を行うことができるように、夫々の上澄みを投与された濃度または量により標準化する。
上澄みに関する汚染物質の除去
使用する場合、ＤＮＡ及びウイルス排除は限外濾過、カラムクロマトグラフィー、ビラゾール（virasol）、エタノール分別、ポリエチレングリコール／ベントナイト沈殿、γ線照射、および／または静脈内γグロブリン及びモノクローナル抗体に使用されたような溶媒／洗剤処理（例えば、IGIV News Updateパンフレット）の如き技術を使用するであろう。
モデル
特に示されない限り、老化マウスにおけるヒドロコルチゾン誘導胸腺退縮のモデルを使用した（Haddenら，1992）。
実験動物
胸腺が退縮し始めた雌BALB/c（Life Science，St.Petersburg，FL）老化した引退したブリーダーマウス（8-9ケ月）をin vitro試験に使用した。マウスを体重マッチングし、5匹のグループでランダムに溜めた。動物に随時飲用水とともに通常の実験食で給餌した。対照グループを除く、全てのマウスを連続2日間にわたってヒドロコルチゾン（0.9％の塩化ナトリウム0.1ml中5mg/マウス）で腹腔内（i.p.）処理して化学的胸腺除去及び脾臓重量の減少を誘導した。
ヒドロコルチゾン処理した成体マウスは2日で急性胸腺退縮（対照の30％未満）及び脾臓サイズの減少（対照の80％未満）、10日までに進行性回復を示す。
実験設計
夫々の処理グループは5匹の動物を有し、夫々の実験を2〜5回繰り返した。処理を3日目に腹腔内（i.p.）で開始し、合計5日間にわたって毎日1回続けた。処理グループに本明細書に示されたようにして下記のin vivo処理の一つを注射した。
1．発熱物質を含まない食塩水（対照）；
2．組換えインターロイキン−1（rIL-1; 4ng）;
3．組換えインターロイキン−2（rIL-2; 50単位）;
4．rIL-1 + rIL-2（夫々、4ng + 50単位）
5．天然サイトカイン混合物（NCM; 50単位IL-2当量）
8日目に、マウスを計量し、頸部脱臼により犠牲にし、それらの脾臓及び胸腺を除去し、計量した。臓器を細断し、塩化アンモニウムを使用して残留赤血球を溶解し（Mishell及びShiigi 1981）、細胞をカウントした。
次いで種々の物質に対する細胞の増殖応答を測定した。細胞のサンプルを、5％のウシ胎児血清、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）及び2−メルカプトエタノール（2 x 10-5M）を含むRPMI 1640培地中37℃、5％のCO2での細胞培養のために調製した。細胞を4回の反復実験で0.2mlのミクロウェルプレートに1.5 x 106/mlの濃度で塗布し、本明細書に示されたようにして下記の一つとともに72時間インキュベートした。
1．対照希釈剤（完全RPMI 1640培地）;
2．rIL-1（1ng/ml）;
3．rIL-2（2単位/ml）;
4．NCM（2単位/mlのIL-2当量）
5．コンカナバリンＡ（Con A; 1.5μg/ml）
6．植物性血球凝集素（PHA; 0.5μg/ml）
培養を終了して、トリチウム標識チミジン（3H-チミジン; New England Nuclear，Boston，MA; 比活性6.7Ci/mM）の18時間パルスでＤＮＡ合成、ひいては細胞増殖を測定し、多重自動サンプル回収装置で回収、液体シンチレーションカウンティングのために処理した。また、マーカー研究をHaddenら（1992）により記載されたようにして行った。結果を夫々の動物について三つのサンプルからのcpmの算術平均として表した。異なる動物で得られたデータの代表を簡素化するために、異なる動物による結果を溜め、一緒に計算し、幾つかの場合に対照に対する比として表し、その他の場合に平均＋平均の標準偏差（SEM）に関する括弧として表した。
統計分析
スチューデントＴテストを使用して適当にデータを分析した。
実施例1
その目的はリンパ球を刺激して血清の不在下で上澄み中にかなりの量のPHAを生じない方法で高レベルのインターロイキン−2を生成する方法を見出すことであった。これを行うために、PHAを“パンニング”細胞分離について製造業者の指示に記載されたようにして細胞サブセットの選択用の標識活性化細胞培養フラスコ（AISmicroCELLectorTMT-25プレート）に固定した。
これらの実験に使用した培地はX vivo-10（ホイットテーカー）であり、インターロイキン−2−リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞プロトコルについて米国食品、薬品管理局によりヒトへの投与について認可されている。また、最小必須培地（MEM）またはRPMI-1640（シグマ）のようにヒトリンパ球増殖を支持することができる無血清培地を使用することができた。
初期実験は、PHA（HA-16、ムレックス・ディアグノスチックス社（Dartford，U．K.））が製造業者により記載された技術により固定できること及び7.5-15 x 106/mlの細胞数、24時間〜48時間の露出の時間、及び25または50μg/mlのPHA濃度の適当な最適条件下で、無血清上澄み中のインターロイキン−2の高収率が得られることを示した。収率はPHA（NI）への短い露出、続いて洗浄及びその後の無血清培地中のシプロフロキサシン（NIM）と一緒の培養を使用する従来の方法（パルス技術）よりも優れていた（表1）。それ故、このフラスコ操作を使用してNCM混合物を生成する。
細胞を使用しないでインキュベートされたフラスコからの無細胞上澄みをヒトリンパ球で試験して、残留PHAが増殖応答を生じるのに充分な量で存在するのかを測定した。0.01μg/mlより大きい残留PHAがこのような応答を生じるであろう。細胞の不在下で、少量のPHAを40〜48時間で上澄み中に観察した。しかしながら、PHA（25μg/ml）をわずかに24時間使用した時、これらのレベルはごくわずかであった。こうして、24時間のインキュベーションが最適と考えられた。
新しいフラスコを匹敵する条件下で旧式のフラスコと比較した時、高レベルのIL-2が古いフラスコで観察された。それ故、旧式のフラスコは一般的であったが、NC混合物を生成する実施例には常に使用されなかった。
実施例2
本発明におけるX vivo-10、X vivo-15及びX vivo-20（ホイットテーカー）並びにMEMの比較を行って、図1〜3に示した。X vivo-10及びX vivo-15はインターロイキン−2−リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞プロトコルについて米国食品、薬品管理局によりヒトへの投与について認可されている。1μg/mlのPHAへの連続露出vsパルス化露出を使用して、NCMの生成を異なる培地中で比較した。細胞濃度の効果を1μg/mlのPHA（図2）及び2μgのPHA（図3）への連続露出で調べた。これらの因子の最適組み合わせは2μg/mlのPHAを使用する2.5または5.0 x106/mlまたは1μg/mlのPHAを使用する5.0 x106/mlの細胞濃度におけるX vivo-10中の固定化による連続露出であることがわかった。細胞当たりの収率は2.5 x106/mlで最も有効であるので、2μg/mlのPHAを用いるその濃度が最適として選択される。
実施例3
フラスコではなく管中の予備実験を行って、PHAへの露出後のヒト白血球からのサイトカイン産生を増進するシプロフロキサシン及び2種のその他の4−アミノキノロン抗生物質（ノルフロキサシン及びオフロキサシン）に関するパラメーターを測定した。表2は、これらの4−アミノキノロン抗生物質の夫々80μl/mlがIL-1、IL-2、IL-6、IFN-δ、TNF α、及びG-CSFの産生を増進したことを示す。IL-8産生が最高であった。IL-3、IL-4、及びIL-7が全ての上澄み中でこれらの状況下で検出できなかった。これらの結果は、これらの無血清条件下で、80μg/mlで試験した全ての4−アミノキノロンが無血清条件下でPHA誘導サイトカイン産生を増進したことを示す。
ND: 検出できなかった。
実施例4
Ｔリンパ球を誘導して増殖させ、インターロイキンを産生させるモノクローナル抗体、OKT-3（Ortho）がこれらの条件下で刺激物質として使用し得ることをまた測定した。表3は、OKT-3が実施例1に示されたフラスコ中でインキュベートされた細胞を用いてPHA＋シプロフロキサシンにより誘導されたサイトカインと同様のサイトカインを誘導したことを示す。IL-3、4及び7は刺激物質のいずれの組でも検出されなかった。OKT-3は、PHA及びシプロフロキサシン（CIPRO）と一緒にされた時に幾つかのILについて小さい累積的効果を生じた。
ND- 検出できなかった。
実施例5
in vitroでrIL-1に対しNCMの優れることを示すために、マウス脾臓細胞及び胸腺細胞をバイオアッセイ及びトリチウム標識チミジンとり込みにより測定したＤＮＡ合成により測定してIL2の匹敵するレベルでMEM及びrIL-2とともに培養した。NCMはIL2含量に基いてrIL-2よりも脾臓細胞（図4）及び胸腺細胞（図5）の大きな増殖を誘導する。
実施例6
図6及び7に示された一連の実験において、退縮した胸腺を有するマウスをrIL-1、rIL-2、これらの因子の組み合わせ、NCMまたは食塩水（対照）でin vivoで処理した。脾臓及び胸腺を除去し、細胞をインターロイキン（IL-1、IL-2）、NCM及びマイトジェンConAに対する細胞増殖応答について試験した。結果を食塩水処理した対照に対する比として表す。rIL-1、rIL-2、及びそれらの組み合わせ（rIL-1及びrIL-2）によるin vivo処理はIL-1、IL-2、NCMまたはConAによるin vitro刺激に対する脾臓細胞（図6）または胸腺細胞（図7）の増殖応答を増大する有意な効果を有していなかった。in vivoのNCM処理は全ての四つの刺激に対し脾臓細胞及び胸腺細胞の両方を有意に増強した。これらの結果は刺激に対するこれらの細胞の増強された感受性および／または応答細胞の数の増加と一致する。
実施例7
図8及び9は脾臓細胞マーカー及び胸腺細胞マーカーに関するin vivoのNCM処理の効果を示す。非成熟Ｔ細胞が--により示され、特に胸腺中のＴリンパ球前駆体に相当し得る。NCMは脾臓及び胸腺中でこの集団を比例して増加した。未熟Ｔ細胞が++により示され、この集団はNCM処理により胸腺中で比例して減少される。成熟Ｔ細胞がCD4+及びCD8+により示される。NCMは脾臓ではなく胸腺中の成熟Ｔ細胞の比率を増加した。これらの結果はＴ細胞前駆体を増加し、胸腺中の成熟Ｔ細胞へのそれらの発育を促進するNCMの効果と一致する。
実施例8
図10及び11はヒドロコルチゾンモデル中の対照培地またはNCMによるin vivo処理後の培地（RPMI）、rIL-1（IL1）、rIL-2（IL2）、またはNCMに対する脾臓細胞応答及び胸腺細胞応答を示す。マウスを上記のようにして処理した。これらのデータは、NCMがバックグラウンド脾臓細胞応答、IL-1及びIL-2に対する脾臓細胞応答を増強するが、NCMがバックグラウンド胸腺細胞応答並びにIL-1、IL-2、及びNCMに対する胸腺細胞応答を増強しないことを実証する。
図12及び13は対照培地またはNCMによるin vivo処理後のConA及びPHAに対するin vitroの脾臓細胞応答及び胸腺細胞応答を示す。マウスを上記のようにして処理した。
in vitro研究は、脾臓細胞及び胸腺細胞を増殖シグナルに感作する際の均等投薬量でrIL-2よりもNCMの優れることを実証する。胸腺細胞に関する効果は同様に分化の促進を反映する。rIL-1、rIL-2、またはそれらの組み合わせではなく、NCM組成物はin vivoのＴリンパ球機能（IL応答）及び発育（マイトジェン応答及び細胞マーカー）を強力に促進し、これは免疫系の刺激を必要とし、または損傷された免疫系または欠損免疫系の部分機能を回復する治療手段において治療上妥当である。例えば、化学療法薬は免疫応答に関与したＴリンパ球を含む細胞を損傷し得る。Ｔリンパ球機能及び発育を刺激することによる本発明は、損傷された場合の免疫系のこの特徴を部分的または完全に回復し得る。
この明細書中、米国特許を含む、種々の刊行物が引用または番号により参考にされる。刊行物に関する完全な引用が以下にリストされる。本発明が関係する技術水準を更に充分に記載するために、これらの刊行物及び特許のそのままの開示が本件出願の参考として本明細書に含まれる。
本発明が例示様式で記載され、使用された用語は限定の性質ではなく説明の用語の性質であることが意図されていることが理解されるべきである。明らかに、本発明の多くの改良及び変化が上記の教示に鑑みて可能である。それ故、請求の範囲内で、本発明は明記された以外に実施し得ることが理解されるべきである。
Claims (9)
- 少なくとも一種のマイトジェンを組織培養容器中で固定する工程、
好中球及び赤血球を含まないリンパ球の単離された集団を４−アミノキノロン抗生物質を含む無血清培地中で懸濁させる工程、
懸濁されたリンパ球を容器に入れる工程、
リンパ球を培養する工程、
培地を除去する工程、及び
培地をサイトカインの収率について特性決定する工程
を含むことを特徴とする天然サイトカイン混合物を含む二次性免疫不全症の処置用の医薬組成物の製造方法。 - マイトジェンがレクチン及びリンパ球を刺激してサイトカインを産生するモノクローナル抗体からなる群から選ばれる請求の範囲第１項に記載の方法。
- レクチンが植物性血球凝集素（ＰＨＡ）及びコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）からなる群から選ばれる請求の範囲第２項に記載の方法。
- モノクローナル抗体がＯＫＴ３、抗ＣＤ２、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ４５からなる群から選ばれる請求の範囲第２項に記載の方法。
- マイトジェンの組み合わせを使用する請求の範囲第２項に記載の方法。
- マイトジェンがＰＨＡである請求の範囲第３項に記載の方法。
- 特性決定されるサイトカインがＩＮＦ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ 及びＴＮＦ−αからなる群からの少なくとも一種を含む請求の範囲第１項に記載の方法。
- ４−アミノキノロン抗生物質がシプロフロキサシン、ノルフロキサシン及びオフロキサシンからなる群から選ばれる請求の範囲第１項に記載の方法。
- 培養が２４時間〜４８時間にわたる請求の範囲第１項に記載の方法。
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