JPS5995886A - Ｌ−トリプトフアンアミノペプチダ−ゼ及びその製造方法 - Google Patents
Ｌ−トリプトフアンアミノペプチダ−ゼ及びその製造方法Info
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- JPS5995886A JPS5995886A JP20360982A JP20360982A JPS5995886A JP S5995886 A JPS5995886 A JP S5995886A JP 20360982 A JP20360982 A JP 20360982A JP 20360982 A JP20360982 A JP 20360982A JP S5995886 A JPS5995886 A JP S5995886A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な酵素に関し、さらに詳しくは、Ｚ、−）
リフ０トフアンアミドに特異的に作用する性質ヲもつＬ
−トリプトファンアミンペプチダーゼに関する。
リフ０トフアンアミドに特異的に作用する性質ヲもつＬ
−トリプトファンアミンペプチダーゼに関する。
Ｌ−）リゾトファンは必須アミノ酸として重要な化合物
であり、アミノ酸輸液、動物飼料添加物、睡眠導入剤な
どの用途がちシ、従来は合成法により製造されたＤＬ−
ト’ｌ）ブトファン誘導体、例えばＤＬ−トリプトファ
ンアミドを光学分割する方法等により製造されている。
であり、アミノ酸輸液、動物飼料添加物、睡眠導入剤な
どの用途がちシ、従来は合成法により製造されたＤＬ−
ト’ｌ）ブトファン誘導体、例えばＤＬ−トリプトファ
ンアミドを光学分割する方法等により製造されている。
今回、本発明において、トリコスポロン属のある種の菌
体から、Ｌ−トリプトファンアミドのアミド結合に特異
的に作用して、Ｌ−）リプトファンを遊離する新規なア
ミンペプチダーゼが見い出され、ＤＬ−トリプトファン
アミド誘導体の不斉加水分解によるＬ−）リプトファン
の製造に極めて有用であることが判明した。
体から、Ｌ−トリプトファンアミドのアミド結合に特異
的に作用して、Ｌ−）リプトファンを遊離する新規なア
ミンペプチダーゼが見い出され、ＤＬ−トリプトファン
アミド誘導体の不斉加水分解によるＬ−）リプトファン
の製造に極めて有用であることが判明した。
従来１Ｌ−トリットファンアミドのアミド結合（又はペ
プチド結合）に特異的に作用するアミノペプチダーゼは
知られておらず、本明細書においては本酵素ｋＬ−）リ
プトファンアミノペプチダーゼと呼ぶこととする。
プチド結合）に特異的に作用するアミノペプチダーゼは
知られておらず、本明細書においては本酵素ｋＬ−）リ
プトファンアミノペプチダーゼと呼ぶこととする。
もつとも、Ｌ−１，リプトファンアミドを加水分解して
Ｌ−）リプトファンを生成する酵素としてはプロタミラ
ーゼが知られているが（Ｂｒｂｌ １． Ａｇγ。
Ｌ−）リプトファンを生成する酵素としてはプロタミラ
ーゼが知られているが（Ｂｒｂｌ １． Ａｇγ。
Ｃｈ、ｅｙｎ、Ｓｏｃ、Ｊａｐａｎ、 Ｖｏｌ、 ２
１ 、 ＡＩ 、 ｐ ６２−６６．１９５７）、これ
は膵臓由来の酵素混合物と考えられＬ−トリプトファン
アミドに特異性を扇する酵素であるかどうか不明である
。才だ、動物起源であるためその製造は微生物起源の酵
素に比べて容易ではない。
１ 、 ＡＩ 、 ｐ ６２−６６．１９５７）、これ
は膵臓由来の酵素混合物と考えられＬ−トリプトファン
アミドに特異性を扇する酵素であるかどうか不明である
。才だ、動物起源であるためその製造は微生物起源の酵
素に比べて容易ではない。
トリプトファンアミノペプチダーゼ活性が栄養障害のマ
ウスに認められることが報告されているが（Ｊ、Ｃ１１
ｎ、Ｉｎｖｅａｔ 、６７ （１） 、ｐ５１−９．１
９８１）、該活性物質の分離精製は行なわれておらす、
この活性がトリノトファンアミノペプチグーゼの作用に
よるものかどうか不明である。
ウスに認められることが報告されているが（Ｊ、Ｃ１１
ｎ、Ｉｎｖｅａｔ 、６７ （１） 、ｐ５１−９．１
９８１）、該活性物質の分離精製は行なわれておらす、
この活性がトリノトファンアミノペプチグーゼの作用に
よるものかどうか不明である。
ロイシンアミノペプチダーゼ（ＥＣ３，４，１１，１）
もＬ−）リプトファンアミドを加水分解する能力を有し
ているが、Ｌ−ロイシルアミドに対する活性を１００と
するとＬ−）リプトファンアミドに対する活性は２４に
すぎず、Ｌ−トリプトファンアミド加水分解活性は非常
に低い（Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ 。
もＬ−）リプトファンアミドを加水分解する能力を有し
ているが、Ｌ−ロイシルアミドに対する活性を１００と
するとＬ−）リプトファンアミドに対する活性は２４に
すぎず、Ｌ−トリプトファンアミド加水分解活性は非常
に低い（Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ 。
２ｔＬｄ ｅｄ、、Ｖｏｌ、４．ｐ、４９，１９６（Ｊ
）。
）。
このように、従来り一トリグトファンアミドに特異性を
有するアミノペプチダーゼは知られておらず、本発明の
酵素は全く新規な酵素といえる。
有するアミノペプチダーゼは知られておらず、本発明の
酵素は全く新規な酵素といえる。
本発明により提供される上記酵素の理化掌的性質は以下
のとおシである。
のとおシである。
（１）作用
Ｚ、−）リプトファンアミド及びアミン末端にＬ−トリ
プトファンを有するペプチドに作用し、アミド結合を加
水分解してＬ−）リプトファンを遊離する。
プトファンを有するペプチドに作用し、アミド結合を加
水分解してＬ−）リプトファンを遊離する。
（２）基質特異性
本酵素の基質特異性を後記第１表及び第２表に１とめて
示す。
示す。
第１表は本酵素の各種アミノ酸アミドに対する特異性を
示したもので各基質の相対活性は次のようにして求めた
。
示したもので各基質の相対活性は次のようにして求めた
。
２Ｓ製した酵素溶液０．０１ゴ、８ ｍ Ｍ Ｍｎ Ｃ
１２溶液０．０５ｍ／！、 ０．５Ｍ）リス−塩酸緩
衝液（ｐ Ｈ７，５）００９−に０．１２ Ｍ各基質溶
液０．０５ｍ／＋ｅ加え３７°Ｃで１０分間反応させた
。次いで、９０”Ｃで５分加熱して反応を停止させ蒸留
水５ ｒｒｌを加えた。
１２溶液０．０５ｍ／！、 ０．５Ｍ）リス−塩酸緩
衝液（ｐ Ｈ７，５）００９−に０．１２ Ｍ各基質溶
液０．０５ｍ／＋ｅ加え３７°Ｃで１０分間反応させた
。次いで、９０”Ｃで５分加熱して反応を停止させ蒸留
水５ ｒｒｌを加えた。
生成したアンモニアをダルクメートデヒドロダナーゼ（
ＥＣ１，４，１，４）を用いる酵素法（臨床検査法提装
改訂２８版、Ｖ］！−４７）により定量しＬ−トリプト
ファンアミドに対する活性を１００として各基質に対す
る活性を求めた。
ＥＣ１，４，１，４）を用いる酵素法（臨床検査法提装
改訂２８版、Ｖ］！−４７）により定量しＬ−トリプト
ファンアミドに対する活性を１００として各基質に対す
る活性を求めた。
第２表はベゾチド類に対する本酵素の基質特異性を示し
たものである。表中の数値は上述の方法と同様に反応さ
せ（但し、２０ｒｎＭ各基買溶液０．０５−使用）、反
応停止後に蒸留水５ｍｌ’ｘ加えて得られる反応液の１
ｍｌについてニンヒドリン法を用いて生成した遊離ア
ミノ酸の５７０？Ｚ？ｌＺにおける吸光度の増加（△０
Ｄ）Ｑ示す。従って、△ＯＤが零の場合は全く作用せず
、△ＯＤが大きい程強く作用したこと全意味する。
たものである。表中の数値は上述の方法と同様に反応さ
せ（但し、２０ｒｎＭ各基買溶液０．０５−使用）、反
応停止後に蒸留水５ｍｌ’ｘ加えて得られる反応液の１
ｍｌについてニンヒドリン法を用いて生成した遊離ア
ミノ酸の５７０？Ｚ？ｌＺにおける吸光度の増加（△０
Ｄ）Ｑ示す。従って、△ＯＤが零の場合は全く作用せず
、△ＯＤが大きい程強く作用したこと全意味する。
本酵素は各釉アミノ酸アミドに作用し、Ｎ−アセチルト
リブトファンや馬尿酸に全く作用しないことからアミノ
ペプチダーゼであることがわかる。
リブトファンや馬尿酸に全く作用しないことからアミノ
ペプチダーゼであることがわかる。
特に、Ｌ−トリプトファンアミド及びアミノ末端がＬ
−） ’Ｊグトファンであるペプチドに最も強く作用す
るのでトリプトファンアミノペプチダーゼと呼ぶことが
できる。また、疎水基をもつアミノ酸アミドおよびアミ
ノ末端のアミノ酸が疎水基をもつペプチドにも比較的よ
く作用する。
−） ’Ｊグトファンであるペプチドに最も強く作用す
るのでトリプトファンアミノペプチダーゼと呼ぶことが
できる。また、疎水基をもつアミノ酸アミドおよびアミ
ノ末端のアミノ酸が疎水基をもつペプチドにも比較的よ
く作用する。
Ｌ−ロイシンアミドに対する活性は２６であるので本酵
素はロイシンアミノペプチダーゼとは明らかに異なって
いる。
素はロイシンアミノペプチダーゼとは明らかに異なって
いる。
まだ、下記の第３表１ｄ本酵素のエステラーゼ活性を調
べたもので、後述する力価測定法と同様に本酵素を作用
させてＬ−）リプトファンアミドに対する活性を１００
として相対活性を求めた。
べたもので、後述する力価測定法と同様に本酵素を作用
させてＬ−）リプトファンアミドに対する活性を１００
として相対活性を求めた。
第３表
（注）反応時の基質温度は、３０ｍＭである。
第３表に示す如く本酵素はＬ −） ＩＪブトファンエ
ステルをわずかに加水分解するのみでちる。
ステルをわずかに加水分解するのみでちる。
（３）力価測定法
力価測定法は２段階の反応よシ成る。ず々わち、第１段
階はＬ −トリプトファンアミドの加水分解反応で、０
２４ＭのＤＩ、−トリプトファンアミド溶液（ｐＨ７，
０）を基質とする以外は前（２）項の相対活性の測定に
おけると同様に反応を行なう。
階はＬ −トリプトファンアミドの加水分解反応で、０
２４ＭのＤＩ、−トリプトファンアミド溶液（ｐＨ７，
０）を基質とする以外は前（２）項の相対活性の測定に
おけると同様に反応を行なう。
第２段階は生成したＬ−ト＋）ブトファンの定量で、ト
リプトファナーゼ（ＥＣ４，１，９９，１）によりＬ−
トリプトファンをインドールに分解してＥｈγ１ｉｃｈ
試架−（Ｈ加え５７０ｎｍの吸光度を測定する。
リプトファナーゼ（ＥＣ４，１，９９，１）によりＬ−
トリプトファンをインドールに分解してＥｈγ１ｉｃｈ
試架−（Ｈ加え５７０ｎｍの吸光度を測定する。
この第２段階の反応条件は次の通りである：トリプトフ
ァナーゼ溶液０．１−にｏ、２ｍＭ２−メルカプトエタ
ノールを含む０５１２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐ １
１７．８ ） ０．１ ｙｄと６ｍＭピリドキザールー
５′−リン凶０１πｌｆ加え３７℃で１０分間加熱する
。この酵素溶液０．３ ｍｌに前記第１段階の反応液（
反応停止後蒸留水５ｍ７！を加えたもの）０．２ｍ１．
（ｒ、′加え、３７℃で１０分［旬反応させる。Ｅｈｒ
ｌｉｃｈ試薬（京都大学農学部農芸化学教室綿、新改版
農芸化学実験搭、第２巻、ｐ、８７６）１ｔｎｌを加え
て反応を終了させ、２０分放置後５ＴＯｎｍの吸光度を
測定する。同時に作成しておいたＬ −＋−！Ｊブトフ
ァンの恢蔽線から生成したＬ−ト＋）ブトファンをγム
出する。
ァナーゼ溶液０．１−にｏ、２ｍＭ２−メルカプトエタ
ノールを含む０５１２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐ １
１７．８ ） ０．１ ｙｄと６ｍＭピリドキザールー
５′−リン凶０１πｌｆ加え３７℃で１０分間加熱する
。この酵素溶液０．３ ｍｌに前記第１段階の反応液（
反応停止後蒸留水５ｍ７！を加えたもの）０．２ｍ１．
（ｒ、′加え、３７℃で１０分［旬反応させる。Ｅｈｒ
ｌｉｃｈ試薬（京都大学農学部農芸化学教室綿、新改版
農芸化学実験搭、第２巻、ｐ、８７６）１ｔｎｌを加え
て反応を終了させ、２０分放置後５ＴＯｎｍの吸光度を
測定する。同時に作成しておいたＬ −＋−！Ｊブトフ
ァンの恢蔽線から生成したＬ−ト＋）ブトファンをγム
出する。
ここで用いるトリプトファナーゼはＹ、 Ｍｏｒｉｎ。
ａｎｄ Ｅ、 Ｅ、 Ｓｎｅ ｌ ｌ ｔ７）方法（ｋ
ｉｅｔｈｏｄｓ ｉｎ、 Ｂｎｚｙｍｏ−１ｏｇｙ、Ｖ
ｏｌ、”）（■Ｉ、Ａ 、 ｐ、 ４３９〜４４６
、１９７０）に従いＥ、 Ｃｏ ｌｉＫ −１２株の無
細胞抽出液から熱処理、硫安分画によシ調製したもので
ある。
ｉｅｔｈｏｄｓ ｉｎ、 Ｂｎｚｙｍｏ−１ｏｇｙ、Ｖ
ｏｌ、”）（■Ｉ、Ａ 、 ｐ、 ４３９〜４４６
、１９７０）に従いＥ、 Ｃｏ ｌｉＫ −１２株の無
細胞抽出液から熱処理、硫安分画によシ調製したもので
ある。
本酵素の酵素単位は上記反応条件で１分間に１μモルの
Ｌ−ト＋）ブトファンを遊離する酵素量を１羊位とする
。
Ｌ−ト＋）ブトファンを遊離する酵素量を１羊位とする
。
（４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲
本酵素のｐ Ｈと酵素活性の関係を第１図のグラフに示
す。この第１図から明らか左とおり、本酵素は中性から
弱アルカリ性で作用し、至適ｐＨは９．５である。本酵
素の水溶液のｐＨと１０℃、２０時間放置後の残存活性
の関係を第２図のグラフに示す。安定ｐＨ範囲は第２図
に示す如くｐＨ７゜５〜８．５である。
す。この第１図から明らか左とおり、本酵素は中性から
弱アルカリ性で作用し、至適ｐＨは９．５である。本酵
素の水溶液のｐＨと１０℃、２０時間放置後の残存活性
の関係を第２図のグラフに示す。安定ｐＨ範囲は第２図
に示す如くｐＨ７゜５〜８．５である。
（５）作用適温の範囲
力価測定と同様の糸外で、ただし温度を変えて反応を行
なった場合の酵素活性を第３図に示す。
なった場合の酵素活性を第３図に示す。
第３［ｘＢからす１］らかな如り、］役適温度は４０〜
４５℃で、作用摘温は３０〜５５℃である。
４５℃で、作用摘温は３０〜５５℃である。
（６）熱による失活条件
熱による失活について各温度で酵素水溶液を１０分間処
理後の残存活性を測定した。結果を第４図に示す。第４
図から明らかなように、蔗糖の添加により熱安定性が増
加する。６０’Ｃ，１０分間の熱処理後の残存活性は５
０係で本酵素は比較的熱安定性の高い酵素である。
理後の残存活性を測定した。結果を第４図に示す。第４
図から明らかなように、蔗糖の添加により熱安定性が増
加する。６０’Ｃ，１０分間の熱処理後の残存活性は５
０係で本酵素は比較的熱安定性の高い酵素である。
（７）阻害および活性化
各棹阻害剤および金民イオ／の影響を検討した。
ｔａｇ剤の影響は４℃で３０分間処理した後の活性をｂ
ＩＪ記の力価測定法に従って測定し、また金属イオンの
影響はＭｎＣ１，の代りに各神金属イオンを加えたＪ−
ｕ合の活性を測定し、ＭｎＣ１，に対する相対活性で表
わす。結果を下記第４表に示す。
ＩＪ記の力価測定法に従って測定し、また金属イオンの
影響はＭｎＣ１，の代りに各神金属イオンを加えたＪ−
ｕ合の活性を測定し、ＭｎＣ１，に対する相対活性で表
わす。結果を下記第４表に示す。
第４表
本酵素はα、αＬジピリソル及びＮ−メチルマレイミド
で頻く阻害された。金属イオンのうちＭ ｇＳＯ，及び
Ｚ？１．ＳＯ４は全く活性化効果がな（ＣｏＣＬ。
で頻く阻害された。金属イオンのうちＭ ｇＳＯ，及び
Ｚ？１．ＳＯ４は全く活性化効果がな（ＣｏＣＬ。
ば２５％の活性を示したＭｎＣｌ２が最も優れた活性化
効果をもつ。
効果をもつ。
（８） 精製方法
後述する。
（９）分子量
セファデックスＧ−２ｏｏのグル口過法により約２７万
である。寸だ、ドデシルサルフェートポリアクリルアミ
ドグル電気泳動によれば、本酵素は分子１ｊ６８，００
０の４つのサブユニットからなるものと推察される。
である。寸だ、ドデシルサルフェートポリアクリルアミ
ドグル電気泳動によれば、本酵素は分子１ｊ６８，００
０の４つのサブユニットからなるものと推察される。
０ω ディスク市１気泳ｍｌノ
Ｂ、 Ｊ、 Ｉ）ａｖｉｓ （７） ｐ ＩＩ ９．５
ｔｖｒルＣＡｎｎ、Ｎ、 Ａｃａｄ。
ｔｖｒルＣＡｎｎ、Ｎ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、１２１．４０４ （１９６４））を用いて打
力つだディスク′屯気泳吻によれば、マーカーとして加
工たプロモフユノールプル−の泳動距離を１００とした
場合泳動距離２１のところに単一バンドが認められた。
力つだディスク′屯気泳吻によれば、マーカーとして加
工たプロモフユノールプル−の泳動距離を１００とした
場合泳動距離２１のところに単一バンドが認められた。
圓 等電点
日本生化学余線、生化学実験講座、第１巻クン白質の化
学Ｌ ７）、２７０〜２Ｔ６（昭和５２年３月３０日東
京化学同人発行）に示す方法に従って行なったエレクト
ロフォーカシングの結果、等電点けｐ Ｈ４，７であっ
た。
学Ｌ ７）、２７０〜２Ｔ６（昭和５２年３月３０日東
京化学同人発行）に示す方法に従って行なったエレクト
ロフォーカシングの結果、等電点けｐ Ｈ４，７であっ
た。
０ｚ 結晶構造
本酵素は第６図に示す如く正六角形状の結晶性物質であ
る。
る。
ｔ１粉 Ｋｍ値
本発明酵素のＺ、−）リプトファンアミドおよびＭｎ
Ｃｌ ２に対する見掛けのＫｍ値はそれぞれ５．６ｍＭ
および０．２ｗ、Ｍである。
Ｃｌ ２に対する見掛けのＫｍ値はそれぞれ５．６ｍＭ
および０．２ｗ、Ｍである。
本発明の酵素は、トリコスポロン属に属しＬ−トリシト
ファンアミノペプチダーゼ生産能を有する菌体を培地に
培養し、菌体内にＬ−トリプトファンアミノペプチダー
ゼを生産蓄積せしめ、次いで菌体からＬ−トリプトファ
ンアミノペプチダーゼを分１ｔ５ イＷ 製することに
よって製造することができる。
ファンアミノペプチダーゼ生産能を有する菌体を培地に
培養し、菌体内にＬ−トリプトファンアミノペプチダー
ゼを生産蓄積せしめ、次いで菌体からＬ−トリプトファ
ンアミノペプチダーゼを分１ｔ５ イＷ 製することに
よって製造することができる。
本発明の酵素の生産菌としては、本発明の酵素を生産す
るものである限シ特に制限はないが、好適な菌株として
は、例えば、トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃん
ｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｒｎ ） Ｉ Ｆ ０
０１７３、トリコスポロン・ベイプリー（Ｔｒｉ−ｃｈ
ｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ ） Ｉ Ｆ
Ｏ０５９８、ト リコスポロン・フェルメンタス（Ｔ
ｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎＦ’ｅｒｒｎ、ｅｎｔａｓ ）
Ｉ Ｆ Ｏ１１９９、トリコスポロン・キャピタタム
（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ Ｃａｐｉｔａｔｕｍ ）
ＩＦＱ１１９７等を季げることができる。
るものである限シ特に制限はないが、好適な菌株として
は、例えば、トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃん
ｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｒｎ ） Ｉ Ｆ ０
０１７３、トリコスポロン・ベイプリー（Ｔｒｉ−ｃｈ
ｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ ） Ｉ Ｆ
Ｏ０５９８、ト リコスポロン・フェルメンタス（Ｔ
ｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎＦ’ｅｒｒｎ、ｅｎｔａｓ ）
Ｉ Ｆ Ｏ１１９９、トリコスポロン・キャピタタム
（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ Ｃａｐｉｔａｔｕｍ ）
ＩＦＱ１１９７等を季げることができる。
かかる菌株を培養するための培地の栄養源としては微生
物の培養に通常用いられるものが広く使用され、窒素源
としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母、大豆粉
、コーンステイープリカー、尿素、アンモニウム塩など
が挙げられ、炭素源としては、例えばデンプン、デキス
トリン、蔗糖、ブドウ糖、麦芽糖、糖蜜、グリセリン、
エタノール、マンニット、ソルビットなどが挙げられる
。
物の培養に通常用いられるものが広く使用され、窒素源
としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母、大豆粉
、コーンステイープリカー、尿素、アンモニウム塩など
が挙げられ、炭素源としては、例えばデンプン、デキス
トリン、蔗糖、ブドウ糖、麦芽糖、糖蜜、グリセリン、
エタノール、マンニット、ソルビットなどが挙げられる
。
また、無４穴塩類としては、例えばマグネシウム、カル
シウム、カリウム、ナトリウム、リン、鉄、マンガン、
モリブデンなどの塩が適宜使用される。
シウム、カリウム、ナトリウム、リン、鉄、マンガン、
モリブデンなどの塩が適宜使用される。
特に、窒素源としてコーンステイブリカーを用い且つ炭
素源としてグリセリンを用いるのが好適である。
素源としてグリセリンを用いるのが好適である。
培養の形態としては通常液体培養が好適であり、工業的
には深部通気攪拌培養で行なうのが有利である。
には深部通気攪拌培養で行なうのが有利である。
また、培養条件として、温度は一般に２５〜３７℃の範
囲が適当であり、また、培地の初発ｐＨは一般に６．５
〜８．０、好ましくは７．０〜７．５とするのが有オリ
である。かかる条件下に培養は通常約３０〜１５０四間
行なうことができ、これによυ本発明の酉享素を好ｊ又
量で得ることができる。
囲が適当であり、また、培地の初発ｐＨは一般に６．５
〜８．０、好ましくは７．０〜７．５とするのが有オリ
である。かかる条件下に培養は通常約３０〜１５０四間
行なうことができ、これによυ本発明の酉享素を好ｊ又
量で得ることができる。
このようにして本発明の酵素が光分に蓄積された菌体か
らの本酵素の回収は、菌体内酵素の分離精製の′に法に
従って行なうことができる。例えは、培養液よシ遠心分
離によシ採取した菌体を適当量のトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，ｓ）に懸濁し、ダイノミル、フレンチプレス、
乳鉢などで摩砕する。
らの本酵素の回収は、菌体内酵素の分離精製の′に法に
従って行なうことができる。例えは、培養液よシ遠心分
離によシ採取した菌体を適当量のトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，ｓ）に懸濁し、ダイノミル、フレンチプレス、
乳鉢などで摩砕する。
次いで遠心分前を行ない未破砕の菌体を除去して粗ｉ膵
素液をイ％る。この粗酵素液から目的酵素を得るには先
ず、該粗酵素液を５０〜５５℃で５〜１０分間熱処理を
行なって生じた沈殿を遠心除去する。このとき酵素安定
化のため必要に応じてグリセロール斗たは蔗糖を１０係
程度加えて熱処理を行なってもよい。
素液をイ％る。この粗酵素液から目的酵素を得るには先
ず、該粗酵素液を５０〜５５℃で５〜１０分間熱処理を
行なって生じた沈殿を遠心除去する。このとき酵素安定
化のため必要に応じてグリセロール斗たは蔗糖を１０係
程度加えて熱処理を行なってもよい。
次いで、得られる酵素液を硫安塩析、ＤＥＡＥセルロー
スイオン交換クロマトグラフィー、ノ・イドロキシアパ
タイト吸着クロマトグラフィー、エレクトロフォーカシ
ングなどに付することにより精製される。
スイオン交換クロマトグラフィー、ノ・イドロキシアパ
タイト吸着クロマトグラフィー、エレクトロフォーカシ
ングなどに付することにより精製される。
本発明により提供されるＺ、−）リゾトファンアミノペ
プチダーゼは、高いアミド加水分解能を有し、Ｌ−トリ
プトファン製造触媒として用いることができ（例えば特
願昭５５−８４６１８号明細書参照）、マた、タン白お
よびペプチドのアミノ酸配列決定用試薬として用いるこ
とも可能である。
プチダーゼは、高いアミド加水分解能を有し、Ｌ−トリ
プトファン製造触媒として用いることができ（例えば特
願昭５５−８４６１８号明細書参照）、マた、タン白お
よびペプチドのアミノ酸配列決定用試薬として用いるこ
とも可能である。
その他食品加工の分野において或いは医薬品として抗炎
症剤に使用できる可能性がある。
症剤に使用できる可能性がある。
次に実施例を掲けて本発明をさらに説明する。
実施例１
グリセロール５襲、コーン・ステイープ・リカ−５％、
１１Ｎ／−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）１係、
ミネラルｒｌｌｉ合（ｑ （Ｍｇ５０４−７８２０２
％ 、Ｆ ｅＳ０４゜Ｔｌ１２００．５ ｆｂ、ＣａＣ
１，０，２％、ＩｖｆｎＣｌ、 −４８２００，０２％
、Ｎ ａＡｉ ｏ Ｏ４・２１１，００．０１ ％、Ｎ
ａＣ１０，０１係）１％の組成をイｑしｐＨ７，０に？
Ａ 整した培地２０１にトリコスポロン・クタネウムＩ
ＦＯＯ１７３の沖培養液１．５１を接種し、５０１容ツ
ヤ−ファーメンタ−中で２０Ｏｒｐｍ、ｌｏＮノ／ｍｉ
ｎの１ｍ気気下０℃で３０時間棺養する。培養終了後、
シャープレス遠心分前機で個体を集め、０．０５乃の２
−メルカプトエタノールを含む冷５０ ｍＭ ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）１０ｊ！に懸濁してり゛イノ
ミルによシ菌体を摩砕する。この操作および以下の操作
はいずれも４℃以下で行なう。
１１Ｎ／−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）１係、
ミネラルｒｌｌｉ合（ｑ （Ｍｇ５０４−７８２０２
％ 、Ｆ ｅＳ０４゜Ｔｌ１２００．５ ｆｂ、ＣａＣ
１，０，２％、ＩｖｆｎＣｌ、 −４８２００，０２％
、Ｎ ａＡｉ ｏ Ｏ４・２１１，００．０１ ％、Ｎ
ａＣ１０，０１係）１％の組成をイｑしｐＨ７，０に？
Ａ 整した培地２０１にトリコスポロン・クタネウムＩ
ＦＯＯ１７３の沖培養液１．５１を接種し、５０１容ツ
ヤ−ファーメンタ−中で２０Ｏｒｐｍ、ｌｏＮノ／ｍｉ
ｎの１ｍ気気下０℃で３０時間棺養する。培養終了後、
シャープレス遠心分前機で個体を集め、０．０５乃の２
−メルカプトエタノールを含む冷５０ ｍＭ ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）１０ｊ！に懸濁してり゛イノ
ミルによシ菌体を摩砕する。この操作および以下の操作
はいずれも４℃以下で行なう。
遠心分し１Ｆによってイ：キた上澄液にグリセロールを
１０％加え５５℃で５分間熱処理をして生じた沈殿を遠
心除去する。この上澄液に硫安５．３ Ｋ９を加え生じ
た沈殿を遠心除去後、梃に硫安１．８６ Ｋ２を加える
。生じた沈殿は遠心分離により集めて前述の緩衝液に対
し２０時間の透析を行なう。
１０％加え５５℃で５分間熱処理をして生じた沈殿を遠
心除去する。この上澄液に硫安５．３ Ｋ９を加え生じ
た沈殿を遠心除去後、梃に硫安１．８６ Ｋ２を加える
。生じた沈殿は遠心分離により集めて前述の緩衝液に対
し２０時間の透析を行なう。
透析後、あらかじめ０．０５ Ｍ’ＫＣｌを含む同緩衝
液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム（φ３６×３
０の）透析液を吸着させ、ｏ、ｏ ５ＭＫＣｌを含む同
緩衝液で十分洗浄後、０．０７５ＭＫＣｌを含む同緩衝
液１１次いでｏ、ＩＭＫＣｌを含む同緩衝９１１で浴出
する。
液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム（φ３６×３
０の）透析液を吸着させ、ｏ、ｏ ５ＭＫＣｌを含む同
緩衝液で十分洗浄後、０．０７５ＭＫＣｌを含む同緩衝
液１１次いでｏ、ＩＭＫＣｌを含む同緩衝９１１で浴出
する。
０、 Ｉ ＭＭＣ１区分で得られた活性区分に硫安６９
０７を加えて生じた沈殿を集め０．０５％の２−メルカ
プトエタノールを含む５ｍＭリン深カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）に対し２０時間の透析を行なう。透析後、同
緩衝液でＸＩＬ衡化しておいたヒドロキシアパタイトカ
ラム（φ３．６ Ｘ ６ ｃａ ）に透析液を吸着させ
同緩衝液で十分洗浄する。ｏ、 ＩＭリン酸カリウム緩
衝液２００ｍ１次いで０．２ Ｍリン酸カリウム緩衝液
（いずれも０．０５ ％の２−メルカプトエタノールを
含む）で溶出を行ない、０，２ＭＩＪン酸カリウム緩衝
液区分で得られた活性区分ＶＣ硫安９２１ｉ’を加える
。生じた沈殿を集めて０．０５係の２−メルツＪフ０ト
エタノールを含む５ｍＭ）リスー塩ｔ〃緩ｆｉｉＴＡ７
（ｐＨ７，５）に対し２０時間透析を行かう。不溶物を
遠心遠去後、上澄液６ ｍｌ、をＬノ（Ｂ Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｅｒｇ １１０−容カラムを用いてｐ ＩＩ ４
〜６の範囲でエレクトロフォーカシングを行なう。結果
を第５図に示す。活性区分（フラクシ’Ｅｌン３９〜５
０）ｉ集めることによりディスク電気泳動で単一ピーク
を示す酵素標品を得だ。なお、等′ｒ＋３：点はｐＨ４
，ｑであった。各稍製段階の収率、比活性は次の通シで
ある。
０７を加えて生じた沈殿を集め０．０５％の２−メルカ
プトエタノールを含む５ｍＭリン深カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）に対し２０時間の透析を行なう。透析後、同
緩衝液でＸＩＬ衡化しておいたヒドロキシアパタイトカ
ラム（φ３．６ Ｘ ６ ｃａ ）に透析液を吸着させ
同緩衝液で十分洗浄する。ｏ、 ＩＭリン酸カリウム緩
衝液２００ｍ１次いで０．２ Ｍリン酸カリウム緩衝液
（いずれも０．０５ ％の２−メルカプトエタノールを
含む）で溶出を行ない、０，２ＭＩＪン酸カリウム緩衝
液区分で得られた活性区分ＶＣ硫安９２１ｉ’を加える
。生じた沈殿を集めて０．０５係の２−メルツＪフ０ト
エタノールを含む５ｍＭ）リスー塩ｔ〃緩ｆｉｉＴＡ７
（ｐＨ７，５）に対し２０時間透析を行かう。不溶物を
遠心遠去後、上澄液６ ｍｌ、をＬノ（Ｂ Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｅｒｇ １１０−容カラムを用いてｐ ＩＩ ４
〜６の範囲でエレクトロフォーカシングを行なう。結果
を第５図に示す。活性区分（フラクシ’Ｅｌン３９〜５
０）ｉ集めることによりディスク電気泳動で単一ピーク
を示す酵素標品を得だ。なお、等′ｒ＋３：点はｐＨ４
，ｑであった。各稍製段階の収率、比活性は次の通シで
ある。
参考例１
実施例１で得られた精製酵素０．５ ｍｅ （０，５単
位）に８ ｍＭＭｎｃ １２ｉ’ｆ３液０．２５７！、
０．２４ＭＤＬ−トリシトファンアミド％’（（ｆｆ、
（ｐＨ７，０） ０．２５１ｎｌ。
位）に８ ｍＭＭｎｃ １２ｉ’ｆ３液０．２５７！、
０．２４ＭＤＬ−トリシトファンアミド％’（（ｆｆ、
（ｐＨ７，０） ０．２５１ｎｌ。
を加えて３７°Ｃで６０分間反応させた後、９０°Ｃで
５分間加熱して反応を停止させた後、トリプトファナー
ゼを用いる方法（力価１測定法と同様）により生成しだ
Ｌ−トリブトファンを定値したところ、収率は９６係で
あった。
５分間加熱して反応を停止させた後、トリプトファナー
ゼを用いる方法（力価１測定法と同様）により生成しだ
Ｌ−トリブトファンを定値したところ、収率は９６係で
あった。
第１図はン１発明酵素の活性に及はすｐＨの影響を示す
グラフでわシ、第２図は本発明酵素の安定性に及はず′
ｐＨの影響を示すグラフであシ、第３図は本発明酵素の
活性に及ぼす温度の影響を示すグラフであり、第４図は
本発明酵素の安定性に及ぼす泥Ｆｔの影岬ヲ示すグラフ
であり、第５図はエレクトロフォーカシングの結果を示
すグラフであり、第６図は本発明酵素の結晶の拡大写真
（６００倍）である。 第１図及び第２図において、曲テ捏ａはトリス−マレイ
ド緩衝液を用いた場合、曲線すはグリシン−ＮαＯ１ｉ
緩衝液を用いた場合のグラフである。また、第４図にお
いて曲１Ｂ ６は蔗糖無添加の場合、曲線ｄは蔗糖１０
％添加の場合のグラフである。 千１図 ｐＨ ７茅彫 ≧ 温度 （０Ｃ） 第２図 ｐＨ 竿４図 ？１ 蚤７Ｌ（’Ｃ） 半５図 フラクション・ナシバー ！０．８ｒｎＬ／フク２シ
タン）第６図 手続補正書（＃Ｆ、） 昭和５８年１月２４日 特許庁反ｊ） イ、１ 移 利 夫 殿１、事件
の表示 ・、・；ｌ１５７中目１自、１＋１弓’、２０３ｔｉ０
９シイ２、発明の名称 ノＪ−トリフ７トフーｆンアミノベフ’＝ｆり” −−
ｅ’及び−ンジ−の−】ノ１法 ３補止をする渚 事何＾の関係 特許出願人 （ｌ−所 山［」迷ＩＪ−ｉ”ｉｔ＼山閂ント町１丁目
１２ Ｗ「３２ ＋ｒ名 称 （ｏ２ｏ） Ｊ−イ
十；４＋、；Ｈ＋本Ｓ’、り＋１（氏 名） ４代 理 人〒１０７ （１） １月Ｉ猶１ｉ −２’ ４’−ｙ １
２ 自 ｉｔ ４ イーｊ υｃ ［−Ｅ、
Ｃｏ１１Ｋ−１２」とあるＹ ｒ Ａ’、 Ｃ０Ａ
Ｌ 八−１２」と計重する。 （２） ｌｒ」」ンＨ１４ｍ、（７） 第４ ：ｊ＜中
−トから８’ｉｌ目に１−Ｎ−メチルマレイミド」とあ
る２ ｉ Ｎ −：ｘ−チルマ１／イミド」とｄ」止す
る。 （３）同第１５１０４４１〜２有にＩ−１＼Ｉ−メチル
マ）／イミド」とある＝ｆ ｒ Ｎ−工°γ′ルマ１／
イミド」と１．］正する。 （４１１ｉｊＪ４．１５自第９１」ｌ／ｉＬ「−ケ゛ル
Ｌ１面」とある紮「ダルイ）過」ど１１止する。 （５） 同車１５ ｍ”’Ｆｄ−ら；４！、３イｊ乙
ｃ １Ａ７１．７＋、Ｎ、 Ｊとｉ” Ａｎｎ、 ｈａ
ｔｉ、 Ｊとｉ」正する。 同、ａｘ６↓４メ″ｊλ１ ｊ、、ｉｔ ｌ−グロモフ
ユノールプとあるヲ「グロモフコーノールプル−ｊとＭ
Ｊ同記１７貞）から・４・、４イＪに１Ｊイ゛ｇ ｒｍ
、ｎ ｎ ｔ Ｑ、ｓＪどあるをｒｆｇｒｍ、ｅｎｔａ
ｓＪとＭＪ正する。 （８）同第１７頁下から嘱３行にｇｃａｐ′ｉｔａ ｔ
、ｑｂｍＪとあるｆ 「ｃａｐｉｔａｔｕｍ Ｊと訂正
する。 （９）回ｄ４２２自；Ｊ４６行に「ａｏＣｍ）透析」と
あるをｆ３０ｃｍ）に透析」と訂正する。 以上
グラフでわシ、第２図は本発明酵素の安定性に及はず′
ｐＨの影響を示すグラフであシ、第３図は本発明酵素の
活性に及ぼす温度の影響を示すグラフであり、第４図は
本発明酵素の安定性に及ぼす泥Ｆｔの影岬ヲ示すグラフ
であり、第５図はエレクトロフォーカシングの結果を示
すグラフであり、第６図は本発明酵素の結晶の拡大写真
（６００倍）である。 第１図及び第２図において、曲テ捏ａはトリス−マレイ
ド緩衝液を用いた場合、曲線すはグリシン−ＮαＯ１ｉ
緩衝液を用いた場合のグラフである。また、第４図にお
いて曲１Ｂ ６は蔗糖無添加の場合、曲線ｄは蔗糖１０
％添加の場合のグラフである。 千１図 ｐＨ ７茅彫 ≧ 温度 （０Ｃ） 第２図 ｐＨ 竿４図 ？１ 蚤７Ｌ（’Ｃ） 半５図 フラクション・ナシバー ！０．８ｒｎＬ／フク２シ
タン）第６図 手続補正書（＃Ｆ、） 昭和５８年１月２４日 特許庁反ｊ） イ、１ 移 利 夫 殿１、事件
の表示 ・、・；ｌ１５７中目１自、１＋１弓’、２０３ｔｉ０
９シイ２、発明の名称 ノＪ−トリフ７トフーｆンアミノベフ’＝ｆり” −−
ｅ’及び−ンジ−の−】ノ１法 ３補止をする渚 事何＾の関係 特許出願人 （ｌ−所 山［」迷ＩＪ−ｉ”ｉｔ＼山閂ント町１丁目
１２ Ｗ「３２ ＋ｒ名 称 （ｏ２ｏ） Ｊ−イ
十；４＋、；Ｈ＋本Ｓ’、り＋１（氏 名） ４代 理 人〒１０７ （１） １月Ｉ猶１ｉ −２’ ４’−ｙ １
２ 自 ｉｔ ４ イーｊ υｃ ［−Ｅ、
Ｃｏ１１Ｋ−１２」とあるＹ ｒ Ａ’、 Ｃ０Ａ
Ｌ 八−１２」と計重する。 （２） ｌｒ」」ンＨ１４ｍ、（７） 第４ ：ｊ＜中
−トから８’ｉｌ目に１−Ｎ−メチルマレイミド」とあ
る２ ｉ Ｎ −：ｘ−チルマ１／イミド」とｄ」止す
る。 （３）同第１５１０４４１〜２有にＩ−１＼Ｉ−メチル
マ）／イミド」とある＝ｆ ｒ Ｎ−工°γ′ルマ１／
イミド」と１．］正する。 （４１１ｉｊＪ４．１５自第９１」ｌ／ｉＬ「−ケ゛ル
Ｌ１面」とある紮「ダルイ）過」ど１１止する。 （５） 同車１５ ｍ”’Ｆｄ−ら；４！、３イｊ乙
ｃ １Ａ７１．７＋、Ｎ、 Ｊとｉ” Ａｎｎ、 ｈａ
ｔｉ、 Ｊとｉ」正する。 同、ａｘ６↓４メ″ｊλ１ ｊ、、ｉｔ ｌ−グロモフ
ユノールプとあるヲ「グロモフコーノールプル−ｊとＭ
Ｊ同記１７貞）から・４・、４イＪに１Ｊイ゛ｇ ｒｍ
、ｎ ｎ ｔ Ｑ、ｓＪどあるをｒｆｇｒｍ、ｅｎｔａ
ｓＪとＭＪ正する。 （８）同第１７頁下から嘱３行にｇｃａｐ′ｉｔａ ｔ
、ｑｂｍＪとあるｆ 「ｃａｐｉｔａｔｕｍ Ｊと訂正
する。 （９）回ｄ４２２自；Ｊ４６行に「ａｏＣｍ）透析」と
あるをｆ３０ｃｍ）に透析」と訂正する。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、Ｌ−）リプトファンアミノベプチダーゼ。 ２ トリコスポロン属に属しＬ−トリプトファンアミノ
ペプチダーゼ生理能を有する菌株を培地に培養し、菌体
内にＬ −） ＩＪブトファンアミノペプチダーゼを生
産蓄積せしめ、次いで菌体からＬ−トリプトファンペプ
チダーゼを分離精製することを特徴とするＬ−トリプト
ファンアミンペプチダーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20360982A JPS5995886A (ja) | 1982-11-22 | 1982-11-22 | Ｌ−トリプトフアンアミノペプチダ−ゼ及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20360982A JPS5995886A (ja) | 1982-11-22 | 1982-11-22 | Ｌ−トリプトフアンアミノペプチダ−ゼ及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5995886A true JPS5995886A (ja) | 1984-06-02 |
Family
ID=16476869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20360982A Pending JPS5995886A (ja) | 1982-11-22 | 1982-11-22 | Ｌ−トリプトフアンアミノペプチダ−ゼ及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5995886A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111690587A (zh) * | 2019-03-13 | 2020-09-22 | 华东理工大学 | 一种离心筛选具有高含油率油脂酵母菌株的方法及其应用 |
-
1982
- 1982-11-22 JP JP20360982A patent/JPS5995886A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111690587A (zh) * | 2019-03-13 | 2020-09-22 | 华东理工大学 | 一种离心筛选具有高含油率油脂酵母菌株的方法及其应用 |
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