JPS6248380A - セフアロスポリンｃアシラ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、７−アミノセファロスポラン酸（以下、［７
−ＡＣＡＪと略す）およびその誘導体の酵素的製造法に
利用される新規酵素の製造法に関するものである。

（従来の技術および発明が解決しようとする問題点） 発酵生産によって得られるセファロスポリンＣは、７位
アミン基に結合したアシル基を除去する反応により、７
−ＡＣＡに−４され、これを出が合成され、医薬品とし
て実用に供されている。

セファロスポリンＣのＮ−アシル基を除去する方法とし
て工業的に利用されている方法は、（１）化学的方法、
（２）中間体を経由する酵素的方法の二つに大別される
。これらの方法のうち、化学的方法は、例えば特公昭４
１−１３８６２号あるいは特公昭４５−４０８９９号記
載の方法である。また、中間体を経由する酵素的方法は
、例えば特公昭５５−１２９１０号の方法によシセファ
ロスボリンＣｉ７β−（５−カルボキシ−５−オキソペ
ンタンアミド）セファロスポラン酸に誘導し、ついで過
酸化水素を作用させて７β−（４−カルボキシブタンア
ミド）セファロスポラン酸（以下。

「ＧＬ−７ＡＣＡＪと略す）に誘導し、さらに微生物酵
素、例えば、アグリカルチャー・アンド・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　４５巻
、１５６１頁（１９８１年）記載の酵素を作用させて７
−　ＡＣＡを製造する方法である。これらの二つの７−
　ＡＣＡ裂遣製造は、いずれも多段の反応工程を必要と
する点において共通している。

したがって、セファロスポリンＣを７−　ＡＣＡとＤ−
α−アミノアジピン酸に加水分解する酵素を利用して、
一段の反応工程でセファロスポリンＣから７−ＡＣＡを
製造できれば、工業的に極めて有利であると予測されて
きた。

今日までに、微生物菌体またはその処理物の酵素作用を
利用して、セファロスポリンＣから７−ＡＣＡを製造す
る方法としては、（１）米国特許５２５９５９４　（１
９６６）記載の方法、（２）特開昭５２−１４５２８９
号記載の方法、（３）特開昭５３−９４０９３号記載の
方法および（４）％開開５９−４４５９２号記載の方法
の四つが知られている。

このうち、米国特許３２５９５９４の方法は、アクロモ
バクタ−属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　）、ブレビ
バクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）、
あるいはフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　）の細菌を用いる方法であるが、プリン著「
セファロスポラン酸・アンド・ペニシリンズｊ　（Ｅ、
Ｈ，Ｆｌｙｎｎ　；Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ　ａ
ｎｄ　Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉｎｓ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７２年）の３
７頁に記載されている如く、本特許は追試不能であるこ
とが知られている。また、アルタナリア属（Ａｌｔｅｒ
ｎａｒｉａεあるいはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ　）の真菌を用いる特開昭５２−１４３２８
９号記載の方法、シュードモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）近縁の細菌ＢＮ−１８８
株を用いる特開昭５３−９４０９３号記載の方法、およ
びペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　）の真
菌を用いる特開昭５９−４４３９２号記載の方法に、い
ずれも微生物の酵素作用全利用した７−ＡＣＡの製造方
法であるが、該酵素作用を触媒する酵素の実体について
は記載されていない。

すなわち、これらの特許には、該酵素作用を触媒する酵
素の分画精製に関する記載がないため、該酵素作用が単
ムの酵素で触媒される一段反応か。

ま之は複数の酵素で触媒される多段反応か明らかでない
。従来、該多段反応系が微生物細胞内に存在することは
予測されていなかったが、本発明者らは、先に該多段反
応系を保有する微生物を発見した（％願昭５９−１４１
４７５号）。まｆ？：、、こレラの特許においては、Ｄ
−α−アミノアジピン酸の生成が明らかにされていない
ため、該酵素作用がセファロスポリンＣを７−ＡＣＡと
Ｄ−α−アミノアジピン酸に加水分解する酵素によるも
のか、または未知の酵素によるものか明確でない。

したがって、前記の特許において、セファロスポリンＣ
から７−ＡＣＡ’ｉ生成する酵素作用を利用しているこ
とは、セファロスポリンＣを７−　ＡＣＡとＤ−α−ア
ミノアジピン酸に加水分解する酵素を発見し、これを利
用していることを意味するとは限らない。

ペニシリン比合物の６位あるいはセファロスポリン比合
物の７位のアミド結合を加水分解して、それぞれの母核
である６−アミノペニシラン酸化合物あるいは７−ＡＣ
Ａ化合物を生成する酵素は、アシラーゼと総称されてお
シ、基質特異性の異なる多数のものが知られている。し
かし、セファロスポリンＣを７．−ＡＣＡとＤ−α−ア
ミノアジピン酸に加水分解するアシラーゼ（以下、セフ
ァロスポリンＣアシラーゼと呼称しｂ　　ｒ’ｐ？：ア
シラーゼ」と略す）は、多くの研究者の長年の努力にも
かかわらず、その存在が明らかにはされていなかったも
のである。

そこで、本発明者らは、Ｃｐｅアシラーゼの製造を目的
に生産菌の探索を行ってきた。

（問題点を解決するための手段および作用）本発明者ら
は、先にシュードモナス　エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ｓｐ、　）　Ｓ　Ｅ　−８３（微工研菌寄第７
６４９号）がＧＬ−７ＡＣＡを７−ＡＣＡとゲルタール
酸に加水分解する２種類のアシラーゼ（以下。

「アシラーゼＩ型」および［アシラーゼＴＩ型Ｊ　、！
：呼称する）を産生じていること、およびこのうちのア
シラーゼ■型がｃｐｃアシラーゼであることを見出し、
本菌の菌体あるいは菌体処理物を利用する７〜ＡＣＡの
酵素的製造法を発明した（特願昭５９−１４１４７５号
）。ついで、本菌のｃｐｃアシラーゼ産生遺伝情報を担
うＤＮＡ断片を大腸菌にクローニングし、その塩基配列
を明らかにした（特願昭５９−２７４１０８号）。

さらに今回、本発明者らは、土壌から新たに分離された
細菌５Ｅ−４９５株がＧＬ−７ＡＣＡｆｃ７−ＡＣＡと
ゲルタール酸に加水分解する２種類のアシラーゼ（以下
、「アシラーゼＩ、］および「アシラーゼＩ（２）型」
と呼称する）を産生し、このうちのアシラーゼＩ（２）
型は、５Ｅ−８３株の産生ずるｃｐｃアシラーゼとは異
なる新規なｃｐｃアシラーゼであることを発見した。

これらの発見に基づく本発明は、一般式（Ｉ）０ＯＨ （式中、　ＲＦｉ−ＯＣＯＣＨ，、−Ｈまたは一〇Ｈを
表わす。）で示される化合物を一般弐〇 （式中、Ｒは前記と同じ意味を有する。）で示される化
合物とＤ−α−アミノアジピン酸に加水分解するｃｐｃ
アシラーゼを産生ずる、土壌よシ分離されたシュードモ
ナス属に属する細菌を培養し、培養物から該酵素を採取
することを特徴としている。

先に発見された５Ｅ−８５株は、分離学的研究ｏ結果、
シュードモナス　デミニュータ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｄｉｍｉｎｕｔａ　）に近縁ではあるが、クエン
酸資化性および栄養要求性がシュードモナスデミニュー
タ僅と異なっておシ、新種であると判定されている（特
願昭５９−１４１４７５号）。

今回、新たに発見され１ｓＥ−４９５株は、山口系の土
壌よシ分離され友細菌であって、その菌学的性質は以下
のとおシである。

５Ｅ−４９５株の菌学的性質 （Ｉ）　　形態的性質 肉汁寒天上で培養しｆｃＭＢ胞は、１．Ｑ〜１．２×１
．９〜２．１ミクロンの桿菌であシ、他生性のペン毛で
運動する。胞子は作らず、多形性も示さない。

ダラム染色性は陰性である。

■　培養的性質 （１）肉汁寒天培養：菌体は黄白色を呈して増殖する。

拡散性色素の生産は認められない。粘調性、遊走性とも
に示さない。

（２）肉汁液体培養：培地全体がかすかに濁る。菌膜の
形成は認められない。

（３）ゼラチン液化穿刺培養：ゼラチンの液化は認めら
れない（２５Ｃ１１４日間）。

（４）リドマスミルク培養：カゼインの液化は認められ
ない。

（１１Ｄ　　生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：陽性 （２）脱窒反応：陰性 （３１Ｍ　Ｒテスト：陰性 ＋４１ＶＰテスト：陽性 （５）インドールの生成：陰性 （６）硫ｆヒ水素の生成：陰性 （カデンブンの加水分解：陰性 （８）クエン酸の利用：陰性 （９）無機窒素源の利用ニアンモニウム塩を唯一のＮ源
として利用する。

ＱＯ）色素の生成：色素の生成は認められない。

０υオキシダーゼ：陽性 （１２＋カタラーゼ：陽性 ０３）生育の範囲：２５Ｃ〜３０Ｃで良く生育する。

３７Ｃ以上では生育しない。

０滲酸素に対する態度：嫌気下での増殖は認められない
。

（＋５）ＯＦテスト（ヒューレイフソン法）：ｆｉｊｌ
ｂパラフィンの有無に関係なく酸生成は認められない。

（１６）炭素源の利用性 （１）利用する炭素源：グルタミン酸、アスパラギン酸 （１１）利用しない炭素源ニゲルコース、アラビノース
、キシロース、マンノース、ガ ラクトース、イノジット、マルトース、シュークロース
、グリセリンソルビッ ト、マンニット ση栄養要求性：パントテン酸要求 αＱアルギニンの分解：陰性 Ｃ１９１１Ｊジンの脱炭酸反応：陰性 （２０）オルニチンの脱炭酸反応：陰性Ｑυエスクリン
の分解：陰性 以上の菌学的性質をバーシーズ・マニュ７ｋ・オプ・デ
ターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ　
’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ）第８版（１９７４年）、
マニュアル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー
（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ　）第３版（１ｑ　ａ　０年）、　オヨ
びバーシーズ・マニュアル・オプ・システマチック・バ
クテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）（１９８４年〕の記載と比較し、次の結論を得た。

ダラム陰性桿菌で胞子を作らず、他生によって運動する
という形態的性質を有し、絶対好気性でグルコース発酵
能を持たないことから、本菌株はシュードモナス属に所
属すると同定できる。また、グルコース酸化陰性および
オキシダーゼ陽性の性質から、シュードモナス　アルカ
リゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ　）、シュードモナスシュードアルカリゲネス　
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ　）、シュードモナス　テストステロニイ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ　）
、シュードモナス　デミニュータおよびシュードモナス
　ペシキュラリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｖｅｓｉ
ｃｕｌａｒｉｓ）に限定される。さらに、単極毛、フラ
クトース酸化陰性、エスクリン分解陰性、硝酸塩還元陰
性であり、栄養要求性を示すことから、本菌株はシュー
ドモナス　デミニュータ種に近縁であると判定できる。

以上の結果から、５Ｅ−８３株および５Ｅ−４９５株は
シュードモナス属の近縁の種に属していると結論される
。なお、５Ｅ−４９５株は工業技術院微生物工業技術研
究所に、シュードモナス　エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ｓｐ、　）　Ｓ　Ｅ　−４９５（微工研菌寄Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−８１８）として寄託されている。

次に、本発明に係るシュードモナス属の細菌を用いて、
本発明のｃｐｃアシラーゼを製造する方法について説明
する。培養は公知の方法に準じて行うことができる。培
地としては、一般微生物の栄養源として公知のものが使
用され、例えば、炭素源として種々の有機酸類、窒素源
として大豆粉、小麦胚芽、肉エキス、ペプトン、コーン
ステイープリカー、酵母エキス等を使用しうる。その他
必要に応じてマグネシウム塩、リン酸塩、カルシウム塩
などの塩類のほか、菌の生育と活性発現に必要な添加物
を適宜組合せて使用することができる。

培養方法としては、好気的な液体培養法が適している。

培養温度は２５〜３２Ｃの範囲で選べばよく、培養時間
は培養条件によって異なるが、通常２〜４日を要する。

本発明のｃｐｃアシラーゼは、得られた培養物から公知
の精製方法全適宜組合せて製造される。すなわち、ｃｐ
ｃアシラーゼは、通常は大部分が細胞内に存在するので
、まず、上記の培養物から遠心分離などの手段で菌体を
集め、ついで、超音波処理などの物理的処理あるいは酵
素処理を加えて細胞を破砕する。さらに、遠心分離など
の手段で固彫物を除去した後、塩析、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハ
イドａフオビツククロマトグラフイーあるいはゲル濾過
などの精製手段と透析、限外濾過、遠心分離、濃縮ある
いは凍結乾燥などの手段を適宜組合せて製造される。

なお、５Ｅ−８３株のアシラーゼ■型と５Ｅ−４９５株
のアシラーゼ■（２）型は、上記の精製工程において若
干異なった挙動をするため、同一物質ではなバことがわ
かる。例えば、ＤＥＡＥセファデックスカラムクロマト
グラフィーにおいて、上記の二つのｃｐｃアシラーゼが
溶離される塩濃度は異なっている。すなわち、ｏ、１Ｍ
’！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡ｆヒし、７’ｃ
ＤＥＡＥセファデックスＡ−５０（ファルマシア社Ｍ）
を充填し之カラムにｃｐｃアシラーゼを吸着させ、つい
で、食塩濃度勾配芯出法で溶出する場合、アシ２−ゼ■
型は約０．１７Ｍの食塩濃度で溶出されるが、アシラー
ゼＩ（２）型は約０．１２Ｍの食塩濃度で溶出される。

本発明法によシ製造されるｃｐｃアシラーゼの性質およ
び酵素活性測定法は、次のとおシである。

（Ｉ）性　質 （１）作　用 ｃｐｃアシラーゼはペニシリン　アミドハイドロラーゼ
（Ｂ、Ｃ，３，５，１，１１）の一つであり、化合物（
Ｉ）　’！＆化合物（至）とＤ−α−アミノアジピン酸
に加水分解する点に特徴がある。

本酵素が化合物（Ｉ）を加水分解して化合物σＤとＤ−
α−アミノアジピン酸を生成することは、前記の方法で
精製された酵素標品について証明されている。すなわち
、化合物刊は後述の高速液体クロマトグラフィーを用い
る方法で、また、Ｄ−α−アミノアジピン酸はアミノ酸
分析計を用いて、それぞれ同定および定量が行われてい
る。なお、α−アミノアジピン酸の光学活性はＬ−およ
びＤ　−アミノ酸酸化酵素を用いた実験に基づき決定さ
れている。

（２）基質特異性 ５Ｅ−８５株および５Ｅ−４９５株のｃｐｃアシラーゼ
は、上記の作用に加えて、ＧＬ−７ＡＣＡ。

７β−（５−カルボキシペンタンアミド）セファロスポ
ラン酸および７β−（３−カルボキシプロパンアミド）
セファロスポラン酸全７−ＡＣＡとジカルボン酸に加水
分解する。一方、セファロスポリンＣのＮ−アセチル比
合物および７β−（フェニルアセトアミド）セファロス
ポラン酸は加水分解しない。なお、いずれの菌株におい
ても、該酵素のＣＬ−７ＡＣＡ加水分解活性は、セファ
ロスポリンＣ加水分解活性の１５〜２５倍の範囲にある
。

（３）至適ｐＨ 該酵素の至適ｐＨは、いずれも約９にある。例として、
　５Ｅ−８５株のｃｐｃアシラーゼの反応速度へのｐＨ
の影響を、ＧＬ−７ＡＣＡ全基質としてＩ１１定した結
果を第１図に示す。使用した緩衝液は、ｐＨ５〜６はク
エン酸緩衝液、ｐＨ６〜８はリン酸緩衝液、およびｐＨ
８〜１０はグリシン緩衝液である。

（４）安定ｐＨ範囲 該酵素はジチオスレイトール存在下では、ｐＨ７〜１０
の範囲でいずれも安定である。例として、５Ｅ−８５株
のｃｐｃアシラーゼをジチオスレイトール０．５ｍＭ存
在下、５０Ｃで２時間処理後の残存活性を第２図に示し
た。使用し次緩衝液は、上記（３）で使用したものと同
様である。

（５）阻害剤 該酵素はいずれもｐ−クロロマーキュリ−ベンゾエート
によシ阻害され、フェニルメチルスルホニルフルオライ
ドでは阻害されなｈｏ （６）等電点 ファルマンア社のポリバッファー２用いるクロマトフオ
ーカシング法によシ求めた該酵素の等１点は、いずれも
ｐＨ４〜４．５の範囲にちる。

以上の結果から、５Ｅ−８３株と５Ｅ−４９５株のｃｐ
ｃアシラーゼは別物質ではあるが、酵素化学的性質はよ
く類似して−ることがわかる。

■酵素活性測定法 （１）セファロスポリンＣ加水分解活性測定法セファロ
スポリンＣ５０ｍＭを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（＋）
Ｈ８，０）１−およびジチオスレイトール２ｍＭを含む
酵素溶液（ｐＨ８，０’）１−を混合し、３７Ｃ，１０
分間反応させる。６７％酢酸水溶液（ｐ　Ｈ２，０）　
０．４−を加えて反応を止め、遠心分離およびメンプラ
ン濾過により固型物を除去した後、生成した７−ＡＣＡ
を高速液体クロマトグラフィーで定量し、酵素活性を求
める。高速液体クロマトグラフィー条件は、次のとおり
である。

カラム二マイクロボンダバツク（μｍＢｏｎｄａｐａｃ
ｋ　）Ｃｔａカラム（ウォーターズ社製） 移動相：５％酢酸アンモニウム９８容とアセトニトリル
２容の混合液 検出波長：　２６０　ｎｍ １２１セフアロスポリンＣ以外の化合物（Ｉ）の加水分
解活性測定法 化合物（Ｉ）を基質として、上記（Ｉ）の方法と同様に
酵素反応を行い、生成した化合物■は、以下の方法でＮ
−フェニルアセチル化合物を誘導して、高速液体クロマ
トグラフィーを用いて定量する。

すなわち、化合物０を含む一定量の水溶液に重曹を加え
アルカリ性に保つ、これに１７１０容のアセトンと、化
合物面の推定量の約５倍モルのフェニルアセチルクロラ
イドを添加し、室温で反応させる。３０分後、％容のエ
ーテルで抽出し、過剰のフェニルアセチルクロライドを
除去する。水層をｐＨ２に調節し、等容の酢酸エチルで
２回抽出し、酢酸エチル層を合せて減圧乾固する。残渣
を一定量のメタノールに溶解し、生成したＮ−フェニル
アセチル化物を高速液体クロマトグラムで分析し、標品
と比較定量する。カラムはマイクロボンダパックＣＩ８
を用い、移動相としては０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）とメタノールの混合液を適宜用いる。検出は２
６０　ｎｍで行い、生成したＮ−フェニルアセチル化物
の定量値、および既知濃度の化合物を用いた対照実験で
得られた回収率から生成物の量を求め、酵素活性を計算
する。

＋３１　Ｇ　Ｌ　−７Ａ　ＣＡの加水分解活性測定法Ｇ
Ｌ−７ＡＣＡを基質として、前記（１１の方法と同様に
酵素反応を行い、生成し７’（７−ＡＣＡは、ｐ−ジメ
チルアミノベンズアルデヒドを用いる比色定量法で定量
する。すなわち、酵素反応液２−に６７係酢酸水溶液（
ｐ　Ｈ２，０）　０．４−を加えて反応を停止させる。

ついで、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドのメタノ
ール溶液（５ｆ／ｌ）を０．４−加え攪拌する。遠心分
離により固形物を除去した後、生成する化合物の黄色を
波長４００ｎｍで定量し、あらかじめ作成した検量線か
ら７−ＡＣＡ生成量を求め、さらに、酵素活性を計算す
る。酵素活性の表示は、上記の酵素反応条件下で１分間
に１マイクロモル（μｍｏｌ　）の７−ＡＣＡを生成す
る酵素量を１単位とする。

（実施例） 次に、本発明を実施例をもって説明する。

実施例１ 肉エキス０．２％、酵母エキス０．２％、ペプトン０．
５％、グルタミン酸ソーダ０．５％、硫酸マグネシウム
ｏ、ｏ　ｏ　ｓ％の組成からなる培地（ｐＨ７，０）１
５１ｆｔ５０１容量ジャーファーメンタ−に仕込み、１
２０Ｃ，３０分殺菌後、予め同培地で前培養シタシュー
ドモナス・エスピー　５Ｅ−８３を２％になるように植
菌した。２５Ｃで４８時間培養後、菌体を遠心分離によ
り集め湿菌体５２ｆを得た。本菌体に含まれる２種類の
アシラーゼ（アシラーゼ■型およびアシラーゼ■型）に
よって触媒されるＧＬ−７ＡＣＡ加水分解活性は、約０
．８６単位／２−湿菌体であった。この湿菌体５２７を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）（８，０）２００ゴに懸濁
し、５Ｃで超音波細胞破砕処理後、固型物を除去し酵素
液を調製した。ついで、本酵素液に５Ｃ冷却下で硫酸ア
ンモニウムを３０％飽和濃度まで攪拌しながら徐々に添
加し、生成した沈でん物を除去した。上清両分に硫酸ア
ンモニウムを６０係飽和濃度まで添加し、１時間攪拌後
、沈殿画分を集め、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１８，
０）１００−に溶かした。この酵素液を、同緩衝液に対
し５Ｃで−晩透析した後、あらかじめ同緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥセファデックスＡ−５０（ファルマシア社
Ｈ）６０　ａ７！を充填したカラムに通すと、活性は吸
着された。活性の溶出は、溶出液としてカラム容量の５
倍量の０．１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８，０）を使用し
、食塩濃度を最終濃度０．３Ｍまで直線的に上昇させる
食塩濃度勾配溶出液によった。その結果、アシラーゼ■
型は食塩濃度０．０５　Ｍ付近で溶出され、ｃｐｃアシ
ラーゼ（アシラーゼ■型）は食塩濃度０．１７Ｍ付近で
溶出されることがわかった。また、アシラーゼＩ型とｃ
ｐｃアシラーゼは、はソ等量存在することがわかった。

第３図にＤＥＡＥセファデックスカラムクロマトグラフ
ィーの溶出パターンを示す。ついで、ｃｐｃアシラーゼ
画分を集めたところ、１８単位のＧ　Ｌ　−７ＡＣＡ加
水分解活性が回収された。この画分を、再度同一条件で
ＤＥＡＥセファデックスカラムクロマトグラフィーにか
け、精製酵素標品を得た。この標品中の蛋白量は４５■
であり、酵素活性はＧＬ−７ＡＣＡ加水分解活性で示せ
ば約９単位、また、セファロスポリンＣ加水分解活性で
示せば約０．５単位であった。なお、蛋白量はロー’Ｊ
　−（Ｌｏｗｒｙ　）法により、牛血清アルブミンを標
準と゛して測定した。

実施例２ 実施例１と同様の方法でシュードモナス　エスピー５Ｅ
−４９５を培養し、菌体を遠心分離により集めたところ
、湿菌体５０？を得た。本菌体に含まれる２種類のアシ
ラーゼ（アシラーゼ■型およびアシラーゼＩ（２）型）
によって触媒されるＧＬ−７ＡＣＡ加水分解活性は、約
０．５２単位／２−湿菌体であった。この湿菌体５０ノ
を、実施例１と同様な方法で超音波処理、硫安分画およ
びＤＥＡセファデックスカラムクロマトグラフィー精製
に供した。その結果、アシラーゼ■型は食塩濃度０．０
５Ｍ付近で溶出され、ｃｐｃアシラーゼ（アシラーゼ■
（２１型）は食塩濃度０．１２Ｍ付近で溶出されること
がわかった。また、アシラーゼ■型とｃｐｃアシラーゼ
は、はｙ等量存在することがわかった。第４図にＤＥＡ
Ｅセファデックスカラムクロマトグラフィーの塵出パタ
ーンを示す。

ついで、ｃｐＣアシラーゼ画分を集めたところ、１０単
位のＧＬ−７Ａ　ＣＡ加水分解活性が回収された。この
画分を、再度同一条件でＤＥＡＥセファデックスカラム
クロマトグラフィーにかけ、精製酵素標品を得た。得ら
れた標品中の蛋白量は４０ｆｆｌ？であり、酵素量はＧ
Ｌ−７Ａ　ＣＡ加水分解活性で示せば約４．８単位であ
り、また、セファロスポリンＣ加水分解活性で示せば約
０．２４単位であった。

（発明の効果） 本発明者らは、化合物（Ｉ）を化合物面とＤ−α−アミ
ノアジピン酸て加水分解する酵素（ｃｐｃアシラーゼ）
を産生ずる微生物を探索し、シュードモナス　エスピー
５Ｅ−８５およびシュードモナス　エスピー５Ｅ−４９
５を発見した。これらの発見に基づき、実施例に示す如
く、化合物■の酵素的製造に用いられるｃｐｃアシラー
ゼの製造方法が確立された。

【図面の簡単な説明】 第１図はｃｐｃアシラーゼの至適ｐＨを示すグラフ、第
２図はｃｐｃアシラーゼのｐＨ安定曲線、第３図はシュ
ードモナス　エスピー　５Ｅ−ａｓのｃｐｃアシラーゼ
のＤＥＡＥセファデックスカラムクロマトグラフィーに
おける溶出パターンを示すグラフ、第４図はシュードモ
ナス　エスピー５Ｅ−４９５のｃｐｃアシラーゼのＤＥ
ＡＥセファデックスカラムクロマトグラフィーにおける
溶出パターンを示すグラフである。 第１図 第２図 蛋白Ｃｍ９／ｍｌ＞　（Δ−−−−Δ）食塩濃度（Ｍ）
　　（−−−−） 蛋白閂たｌ）（Δ−−−Δ） 食塩ｊ１度（Ｍ）　　（−−−−） 手　続　補　正　！＋方式） ％式％ １　事件の表示 特願昭６０−１８７３２７号 ２　発明の名称 セファロスポリンＣアシラーゼの製造法３　補正をする
者 事件との関係・特許出願人 （００３）　旭化成工業株式会社 ４代理人 東京都港区虎ノ門−丁目２番２９号虎ノ門産業ビル５１
者（６８２３）　　　　弁理士　　清　　水　　　　　
　猛°゛・５　補正命令の日付 昭和６０年１１月２６日 ６　補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄 発明の詳細な説明の欄 ７　補正の内容 明細書の記ｅ１．ヲ次のとおり補正する。 Ｈｌ　　特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （２１第８頁１１行の一般式（Ｉ）を下記のとおり補正
する。 「 」 （３１第８頁下から２行の一般式（ＩＩ）を下記のとお
り補正する。 ［ 特許請求の範囲　　　　　　　　　　　　別　紙＋１１
　一般式（Ｉ） ０ＯＨ （式中、Ｒは一０ＣＯＣＨい−Ｈまたは−ＯＨを表わす
。）で示される化合物を一般式（ＩＩ） ０ＯＨ （式中、Ｒは一０ＣＯＣＨい−Ｈまたは一〇Ｈを表わす
。）で示される化合物とＤ−α−アミノアジピン酸に加
水分解するセファロスポリンＣアシラーゼを産生ずるシ
ュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）の細菌を
培養し、培養物から該酵素を採取することを特徴とする
発酵法によるセファロスポリンＣアシラーゼの製造法。 （２１シュードモナス属の細菌がシュードモナスエスピ
ー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　）　Ｓ　Ｅ　−
８３（倣工研菌寄第７６４９号、ＦＥＲＭ　ＢＰ−８１
７）である特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３１シュードモナス属の細菌がシュードモナスエスピ
ー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、）　Ｓ　Ｅ　−４
９５（微工研菌寄ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８１８）である特
許請求の範囲第１項記載の方法。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒは−ＯＣＯＣＨ＿３、−Ｈまたは−ＯＨを表
   わす。）で示される化合物を一般式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｒは−ＯＣＯＣＨ＿３、−Ｈまたは−ＯＨを表
   わす。）で示される化合物とＤ−α−アミノアジピン酸
   に加水分解するセフアロスポリンＣアシラーゼを産生す
   るシユードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の細菌
   を培養し、培養物から該酵素を採取することを特徴とす
   る発酵法によるセフアロスポリンＣアシラーゼの製造法
   。
2. （２）シユードモナス属の細菌がシユードモナスエスピ
   ー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＳＥ−８３（微
   工研菌寄第７６４９号、ＦＥＲＭ　ＢＰ−８１７）であ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）シユードモナス属の細菌がシユードモナスエスピ
   ー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）ＳＥ−４９５（
   微工研菌寄ＦＥＲＭ　ＢＰ−８１８）である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。