JP2950865B2 - 新規アスパラギン酸ラセマーゼ - Google Patents
新規アスパラギン酸ラセマーゼInfo
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- JP2950865B2 JP2950865B2 JP23139589A JP23139589A JP2950865B2 JP 2950865 B2 JP2950865 B2 JP 2950865B2 JP 23139589 A JP23139589 A JP 23139589A JP 23139589 A JP23139589 A JP 23139589A JP 2950865 B2 JP2950865 B2 JP 2950865B2
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- aspartate racemase
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、Ｄ−アミノ酸の製造に用いるＤ−トランス
アミナーゼ反応のアミノ基供与体としてのＤ−アスパラ
ギン酸をＬ−アスパラギン酸のラセミ化により供給する
のに有用なアスパラギン酸ラセマーゼ及びその製造方法
に関する。
アミナーゼ反応のアミノ基供与体としてのＤ−アスパラ
ギン酸をＬ−アスパラギン酸のラセミ化により供給する
のに有用なアスパラギン酸ラセマーゼ及びその製造方法
に関する。
（従来技術及びその問題点） アスパラギン酸ラセマーゼについてはストレプトコッ
カス フェーカリス（Streptococcus faecalis）ATCC97
90菌株にその存在が示唆されているに過ぎず単一蛋白と
しての存在が確認されていないばかりかアスパラギン酸
のみならずアラニンもラセミ化する事が知られている
（J.Biol.Chem.247（16）5103（2072））。従って本酵
素によりＤ−アミノ酸の製造に用いるＤ−トランスアミ
ナーゼ反応のアミノ基供与体としてのＤ−アスパラギン
酸をＬ−アスパラギン酸のラセミ化により供給すること
を考えた場合、本酵素の基質特異性が大きな問題とな
り。
カス フェーカリス（Streptococcus faecalis）ATCC97
90菌株にその存在が示唆されているに過ぎず単一蛋白と
しての存在が確認されていないばかりかアスパラギン酸
のみならずアラニンもラセミ化する事が知られている
（J.Biol.Chem.247（16）5103（2072））。従って本酵
素によりＤ−アミノ酸の製造に用いるＤ−トランスアミ
ナーゼ反応のアミノ基供与体としてのＤ−アスパラギン
酸をＬ−アスパラギン酸のラセミ化により供給すること
を考えた場合、本酵素の基質特異性が大きな問題とな
り。
（問題を解決するための手段） 本発明者らは、アスパラギン酸をラセミ化しうる酵素
の探索を目的に、アスパラギン酸ラセマーゼ産生能を有
する菌株を求めて、公知の保存菌株も含めて鋭意に研究
を続けた結果、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス
属にアスパラギン酸ラセマーゼ産生能を見出し、ストレ
プトコッカス サーモフィラスIAM10064にその中で最も
高度に安定性を示すアスパラギン酸ラセマーゼを産生す
る事を見出し本発明に至った。
の探索を目的に、アスパラギン酸ラセマーゼ産生能を有
する菌株を求めて、公知の保存菌株も含めて鋭意に研究
を続けた結果、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス
属にアスパラギン酸ラセマーゼ産生能を見出し、ストレ
プトコッカス サーモフィラスIAM10064にその中で最も
高度に安定性を示すアスパラギン酸ラセマーゼを産生す
る事を見出し本発明に至った。
本発明のアスパラギン酸ラセマーゼの理化学的性質に
ついて以下に説明する。
ついて以下に説明する。
（ａ）作用： Ｌ−アスパラギン酸からＤ−アスパラギン酸及びＬ−
アスパラギン酸を生成するラセミ化反応、ならびにＤ−
アスパラジン酸からＬ−アスパラギン酸及びＤ−アスパ
ラギン酸を生成するラセミ化反応を触媒する。
アスパラギン酸を生成するラセミ化反応、ならびにＤ−
アスパラジン酸からＬ−アスパラギン酸及びＤ−アスパ
ラギン酸を生成するラセミ化反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性： ラセミ化反応はアスパラギン酸に特異的に作用し、他
のアミノ酸には殆ど作用しない。
のアミノ酸には殆ど作用しない。
（ｃ）至適pH: 反応測定においては、37℃の温度で、10mMリン酸カリ
ウム緩衝液（pH5.5〜８）［第１図○］、100mMピロリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.9〜9.0）［第１図△］を用い
て検討した。
ウム緩衝液（pH5.5〜８）［第１図○］、100mMピロリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.9〜9.0）［第１図△］を用い
て検討した。
その結果、第１図に示すように、至適pHは、37℃の反
応でpH8付近である。
応でpH8付近である。
（ｄ）安定pH範囲 本酵素液0.1mlに対して、後述する各pH値の緩衝液を
0.4ml加え、50℃で10分間処理し、氷冷してサンプルと
した。これについて比活性を求めた。緩衝液はpH4〜６
に対しては50mM酢酸−酢酸ナトリウム、pH6〜８に対し
ては50mMリン酸カリウム、pH8〜９に対しては50mMトリ
ス−塩酸をそれぞれ使用した。
0.4ml加え、50℃で10分間処理し、氷冷してサンプルと
した。これについて比活性を求めた。緩衝液はpH4〜６
に対しては50mM酢酸−酢酸ナトリウム、pH6〜８に対し
ては50mMリン酸カリウム、pH8〜９に対しては50mMトリ
ス−塩酸をそれぞれ使用した。
その結果、第２図に示すように、本酵素は45℃、１時
間の処理ではpH6.5〜8.0付近まで安定である。
間の処理ではpH6.5〜8.0付近まで安定である。
（ｅ）熱安定性： 本酵素液0.1mlに対し、50mMリン酸カリウム緩衝液（p
H7.0）0.4mlを加えた試験管を６本用意し、25、37、4
5、50、55、60℃の温度でそれぞれを60分間処理し氷冷
してサンプルとした。これについて非活性を求めた。
H7.0）0.4mlを加えた試験管を６本用意し、25、37、4
5、50、55、60℃の温度でそれぞれを60分間処理し氷冷
してサンプルとした。これについて非活性を求めた。
その結果、第３図に示すように、本酵素は60分間の処
理では50℃まで安定であるが、55℃では活性は殆ど残存
しない。
理では50℃まで安定であるが、55℃では活性は殆ど残存
しない。
（ｆ）分子量 全分子量の測定は、スーパーローズ12HR10/30のカラ
ム（ファルマシア製）を用いるゲル濾過法で行なった。
標準蛋白質には、牛血清アルブミン（分子量67,000）、
卵白アルブミン（分子量43,000）、キモトリプシノーゲ
ンＡ（分子量25,000）、リボヌクレアーゼ（分子量13,7
00）を用いた。
ム（ファルマシア製）を用いるゲル濾過法で行なった。
標準蛋白質には、牛血清アルブミン（分子量67,000）、
卵白アルブミン（分子量43,000）、キモトリプシノーゲ
ンＡ（分子量25,000）、リボヌクレアーゼ（分子量13,7
00）を用いた。
サブユニットの分子量測定は、SDS−スラブ電気泳動
法で行なった。標準蛋白質には、ホスホリラーゼｂ（分
子量94,000）、牛血清アルブミン（分子量67,000）、蛋
白アルブミン（分子量43,000）、カルボニックアンヒド
ラーゼ（分子量30,000）、大豆トリプシンインヒビター
（分子量20,000）、α−ラクトアルブミン（分子量14,0
00）を用いた。
法で行なった。標準蛋白質には、ホスホリラーゼｂ（分
子量94,000）、牛血清アルブミン（分子量67,000）、蛋
白アルブミン（分子量43,000）、カルボニックアンヒド
ラーゼ（分子量30,000）、大豆トリプシンインヒビター
（分子量20,000）、α−ラクトアルブミン（分子量14,0
00）を用いた。
その結果、全分子量は60,000である。また、サブユニ
ットの分子量は28,000であり、SDS蛋白質バンドが１つ
であったことから、本酵素は同一サブユニットの２量体
構造であることがわかる。
ットの分子量は28,000であり、SDS蛋白質バンドが１つ
であったことから、本酵素は同一サブユニットの２量体
構造であることがわかる。
（ｇ）アミノ末端側アミノ酸配列 アミノ酸配列の決定は本酵素標品20μｇを用い自動エ
ドマン分解による気相シークエンサーで行なった。その
結果、下記に示すアミノ末端側アミノ酸配列が確認され
た（Ｘは不明のアミノ酸を表す）。
ドマン分解による気相シークエンサーで行なった。その
結果、下記に示すアミノ末端側アミノ酸配列が確認され
た（Ｘは不明のアミノ酸を表す）。
本発明のアスパラギン酸ラセマーゼは、例えばストレ
プトコッカス属に属するアスパラギン酸ラセマーゼ産生
菌を培養し、培養物から、アスパラギン酸ラセマーゼを
採取する事によって製造する事が出来る。
プトコッカス属に属するアスパラギン酸ラセマーゼ産生
菌を培養し、培養物から、アスパラギン酸ラセマーゼを
採取する事によって製造する事が出来る。
本発明のアスパラギン酸ラセマーゼの製造方法に用い
られる微生物は、アスパラギン酸ラセマーゼを産生する
事が出来るストレプトコッカス属に属する全ての菌株、
突然変異株、変種を含む。その好ましい具体例は、スト
レプトコッカス サーモフィラスであり、この種に属す
る保存菌としては、ストレプトコッカス サーモフィラ
スIAM10064を挙げる事が出来る。
られる微生物は、アスパラギン酸ラセマーゼを産生する
事が出来るストレプトコッカス属に属する全ての菌株、
突然変異株、変種を含む。その好ましい具体例は、スト
レプトコッカス サーモフィラスであり、この種に属す
る保存菌としては、ストレプトコッカス サーモフィラ
スIAM10064を挙げる事が出来る。
本発明のアスパラギン酸ラセマーゼを得るにあたって
のアスパラギン酸ラセマーゼ産生菌の培養は通常の乳酸
菌培地中で行なう事が出来る。例えば、ペプトン、酵母
エキス、肉エキス、無機塩類などを含む培地が用いられ
る。
のアスパラギン酸ラセマーゼ産生菌の培養は通常の乳酸
菌培地中で行なう事が出来る。例えば、ペプトン、酵母
エキス、肉エキス、無機塩類などを含む培地が用いられ
る。
培養は固体培地または液体培地のいずれを用いて行な
っても良いが、目的酵素を大量に得るためには、液体培
地を用い、静置培養などにより嫌気的条件下で培養を行
なう事が望ましい。培養温度は菌が生育しアスパラギン
酸ラセマーゼが生産される温度範囲内であれば良いが好
ましくは25〜45℃である。培養時間は酵素活性が発現さ
れる時間が選べば良いが好ましくは６〜24時間である。
培養のpHは５〜７が好ましい。この培養によって本酵素
の大部分は菌体内に蓄積される。
っても良いが、目的酵素を大量に得るためには、液体培
地を用い、静置培養などにより嫌気的条件下で培養を行
なう事が望ましい。培養温度は菌が生育しアスパラギン
酸ラセマーゼが生産される温度範囲内であれば良いが好
ましくは25〜45℃である。培養時間は酵素活性が発現さ
れる時間が選べば良いが好ましくは６〜24時間である。
培養のpHは５〜７が好ましい。この培養によって本酵素
の大部分は菌体内に蓄積される。
培養終了後は培養物をそのまま酵素源として利用して
も良いが、通常は分離精製を行なう。精製法としては通
常の酵素精製法を用いる事が出来る。例えば遠心分離に
より菌体を集め超音波処理、ダイノミルなどの機械的方
法によって菌体を粉砕する。続いて遠心分離等により細
胞片等の固形物を除き粗酵素液を得る。つぎにこの粗酵
素液を硫安沈殿法により分画し、疎水クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などによ
って均一の酵素標品を単離することが出来る。
も良いが、通常は分離精製を行なう。精製法としては通
常の酵素精製法を用いる事が出来る。例えば遠心分離に
より菌体を集め超音波処理、ダイノミルなどの機械的方
法によって菌体を粉砕する。続いて遠心分離等により細
胞片等の固形物を除き粗酵素液を得る。つぎにこの粗酵
素液を硫安沈殿法により分画し、疎水クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などによ
って均一の酵素標品を単離することが出来る。
つぎに本発明のアスパラギン酸ラセマーゼの活性測定
について説明する。
について説明する。
Ｌ−アスパラギン酸からアスパラギン酸ラセマーゼに
より生成するＤ−アスパラギン酸をＤ−アミノ酸オキシ
ダーゼによりオキサロ酢酸に酸化的脱アミノし、生じた
オキサロ酢酸を2,4−ジニトロフェニルヒドラジンと反
応させて、ヒドラゾンを形成せしめ、ヒドラゾンの生成
量を定量する事で反応速度を決定する。表１にしめす様
な反応液を30〜60分間、37℃でインキュベートし、2,4
−ジニトロフェニルヒドラゾン塩酸液を加え、30分間37
℃でインキュベートし、NaOH溶液を加え更に30分間37℃
でインキュベートしヒドラゾンの生成を435nmの吸光度
により測定する。
より生成するＤ−アスパラギン酸をＤ−アミノ酸オキシ
ダーゼによりオキサロ酢酸に酸化的脱アミノし、生じた
オキサロ酢酸を2,4−ジニトロフェニルヒドラジンと反
応させて、ヒドラゾンを形成せしめ、ヒドラゾンの生成
量を定量する事で反応速度を決定する。表１にしめす様
な反応液を30〜60分間、37℃でインキュベートし、2,4
−ジニトロフェニルヒドラゾン塩酸液を加え、30分間37
℃でインキュベートし、NaOH溶液を加え更に30分間37℃
でインキュベートしヒドラゾンの生成を435nmの吸光度
により測定する。
本酵素に於ける酵素活性単位は、１μmol/minのＤ−
アスパラギン酸を生成する酵素量を1unit（単位）と定
義する。比活性は酵素蛋白質1mg当りの単位数で表す。
アスパラギン酸を生成する酵素量を1unit（単位）と定
義する。比活性は酵素蛋白質1mg当りの単位数で表す。
つぎに実施例によって本発明のアスパラギン酸ラセマ
ーゼの製造方法を説明するが本発明はこれに限定される
ものではない。
ーゼの製造方法を説明するが本発明はこれに限定される
ものではない。
（実施例） ストレプトコッカス サーモフィラスIAM10064を表２
にしめす培地で37℃、５〜20時間静置培養を行ない得ら
れた菌体を超音波で破砕後遠心分離等の手段にて無細胞
抽出液を調製し、粗酵素液を得る。
にしめす培地で37℃、５〜20時間静置培養を行ない得ら
れた菌体を超音波で破砕後遠心分離等の手段にて無細胞
抽出液を調製し、粗酵素液を得る。
粗酵素液を先ず硫安分画し以後フェニル−セファロー
ズ、セファクリルＳ−300、DEAE−セファセル、セファ
クリルＳ−200、モノＱ（ファルマシア製、商品名）の
各カラムクロマトグラフィーの手段を駆使して精製し、
電気泳動的に単一な酵素標品とする事が出来る。つぎに
この各精製段階でえられた酵素液について総蛋白質量、
総活性及び比活性を測定した。その結果を表３にしめ
す。総蛋白質量の測定は最終段階を除いてはLowry法
で、最終段階は280nmの吸光度により求めた。総活性の
測定は前述した活性測定法にしたがって行なった。
ズ、セファクリルＳ−300、DEAE−セファセル、セファ
クリルＳ−200、モノＱ（ファルマシア製、商品名）の
各カラムクロマトグラフィーの手段を駆使して精製し、
電気泳動的に単一な酵素標品とする事が出来る。つぎに
この各精製段階でえられた酵素液について総蛋白質量、
総活性及び比活性を測定した。その結果を表３にしめ
す。総蛋白質量の測定は最終段階を除いてはLowry法
で、最終段階は280nmの吸光度により求めた。総活性の
測定は前述した活性測定法にしたがって行なった。
第１図は、本発明酵素の活性とpHとの関係を示したグラ
フであり、第２図は本酵素のpH安定性を示したグラフで
あり、第３図は本酵素の温度安定性を示したグラフであ
る。
フであり、第２図は本酵素のpH安定性を示したグラフで
あり、第３図は本酵素の温度安定性を示したグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，24（６) （1985），ｐ．1333−1341 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】つぎの理化学的性質を有するアスパラギン
酸ラセマーゼ。 （ａ）作用： Ｌ−アスパラギン酸からＤ−アスパラギン酸及びＬ−ア
スパラギン酸を生成するラセミ化反応、ならびにＤ−ア
スパラギン酸からＬ−アスパラギン酸及びＤ−アスパラ
ギン酸を生成するラセミ化反応を触媒する。 （ｂ）基質特異性： ラセミ化反応はアスパラギン酸に特異的に作用し、他の
アミノ酸には殆ど作用しない。 （ｃ）至適pH: 37℃の反応でpH8付近。 （ｄ）安定pH範囲： 45℃、１時間の処理でpH6.5〜８の範囲で活性の低下は
全く見られない。 （ｅ）熱安定性： pH7で、50℃、60分間の処理で活性の低下は全く見られ
ない。 （ｆ）分子量： 全分子量 約６万（ゲルろ過法） サブユニットの分子量 28,000（同一サブユニットの２
量体構造） （ｇ）アミノ末端側アミノ酸配列： - 【請求項２】ストレプトコッカス（Streptococcus）属
に属するアスパラギン酸ラセマーゼ産生菌を培養し、培
養物から特許請求の範囲第１項記載のアスパラギン酸ラ
セマーゼを採取することを特徴とするアスパラギン酸ラ
セマーゼの製造方法。 - 【請求項３】ストレプトコッカス属に属するアスパラギ
ン酸ラセマーゼ産生菌がストレプトコッカス サーモフ
ィラス（Streptococcus thermophilus）IAM10064である
特許請求の範囲第２項記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23139589A JP2950865B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 新規アスパラギン酸ラセマーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23139589A JP2950865B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 新規アスパラギン酸ラセマーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0394678A JPH0394678A (ja) | 1991-04-19 |
| JP2950865B2 true JP2950865B2 (ja) | 1999-09-20 |
Family
ID=16922934
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23139589A Expired - Fee Related JP2950865B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 新規アスパラギン酸ラセマーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2950865B2 (ja) |
-
1989
- 1989-09-08 JP JP23139589A patent/JP2950865B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４（６）（１９８５），ｐ．１３３３−１３４１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0394678A (ja) | 1991-04-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |