JPS58152481A - 新規なホスホリパ−ゼｄ−ｐおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な特徴を有するホスホリパーゼＤ−Ｐおよ
びその製造法に関する。

ホスホリパーゼＤは平〜シリン脂質に作用して１＋１．
：　ｑＶを遊離せしめる酵素作用を有しているためコリ
ンオキシダーゼと組み合せてコリンリン脂質脂質に作用
するため、特定の〜へ■リン脂質の定蓋は不可能であっ
た。

本発明者らは、ＩＶリン脂質のうち、し／ｆ／に高い基
質特異性を示し、レシチンに作用してホスファチジン酸
およびコリンを生成する反応を触媒するホスホリパーゼ
Ｄ活性を有する新規な酵素を見い出した。本酵素をホス
ホリパーゼＤ−Ｐと命名した。また本発明のホスホリパ
ーゼＤ−Ｐの微生物の培養による製造法を確立した。

ホスホリパーゼＤ−Ｐは、Ｆ記の理化学的性質を有する
ものである。

■　酵素作用は、反応′式（Ｉ）で示す通り。

レシチン十Ｈ２Ｏ−〉 ホスファチジン酸十コリン　　□（１’１本酵素はまた
、下記の性質を有するものである。

■　分子量：約４６０００（バイオゲル・ゲル濾過法に
よる） ■　至適ｐＨ：５．５付近 ■　ｐＨ安定性：　ｐＨ４，２−８，５付近■　等電点
：ｐＨ４，２付近 ■　熱安定性：ｐＨ６，０で６０℃、１０分間の加熱ま
で安定 本発明者らは、宮崎系えびの市の土壌より分離したスト
レプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　）属に属す
る細菌ＡＡ５８６株が、主にその菌体外にホスホリパー
ゼＤ−Ｐ全生産することを見い出し、該酵素を単一まで
に精製した。

上記の細菌ＡＡ５８６株の菌学的性状は、以ドの通りで
ある。

（ａ）形態的性状 イーストエキス・麦芽エキス寒天培地上で、２６’Ｃ，
１０〜１５日間培養し観察した所見は次の通シである。

■　気菌糸；直径０．６−０．８μ１曲線状で、単紳分
岐をなして伸長し、多数の連鎖した胞子を形成する。胞
子の連鎖は螺旋を呈し、ゆるく２−４回巻いたものが多
い。

■　胞子；短稈状ないし卵形で、大きさ０．６〜０．８
×１．０〜１．５μ１表面は平滑。

■　基生菌糸；分岐をなして曲線状に伸長し、直径０．
５〜０．７μ、菌糸の***や着生はみられない。

■　鞭毛胞子、胞子のう；形成しない。

（＋））ジアミノピメリン酸形成 全細胞による分析で、Ｌ−型のジアミノピメリン酸が検
出された。

（ｃ）各培地における生育状態 各種培地上で２６℃、１４日間培養し、観察した所見は
以Ｆの通りである。

■／ユクロース・硝酸塩寒天培地 生育；僅少ないし不良。

基生菌糸の色；２イト・アイボＩＪ　−（ＬｉｇｈｚＩ
ｖｏｒｙ（２，、ｃａ）　） 気菌糸；生じない。

可溶性色素；生じない。

■グルコース・アスパラギン寒天培地 生育；不良 基生菌糸の台；ライト・ビート（Ｌｉ　ｇｈ　ｔ　Ｗｈ
ｅａ　＋（２ｅａ）’）ないしバンブー［：Ｂａｍｂｏ
ｏ　（２ｇ　ｃ　）　’ｌ。

気菌糸；生じない。

可溶性色素；生じない。

■グリセリン・アスパラギン寒天培地 生育；中程度。

基生菌糸の色；バンブー（２ｇｃ）。

気菌糸；不良。

気菌糸の色；ナチュラル（Ｎａｔｕ［ａｌ　（３ｄ　ｃ
　）　ｌないしンルバー・グレイ〔Ｓｉ　１ｖｅｒＧｒ
ａｙ　（３ｆｅ）　１゜可溶性色素；ライト・イエｏ　
−（Ｌｉｇｈｔ　Ｙｅｌｌｏｗ（２ｅａ））。

■スターチ・無機塩寒天培地 生育；中程度 基生菌糸の色；ライト・ビート’（２ｅａ）。

気菌糸；僅少ないし不良。

気菌糸の色；ホワイト［’Ｗｈｉｔｅ　（ａ　）　〕な
いしビスタ（Ｂｉｓ’ｑｕｅ（３ｅ　ａ　）　）。

可溶性色素：生じない。

■チロンン寒天培地 生育；中程度ないし良好。

基生菌糸の色；クロラブ・ブラウン（ＣｌｏｖｅＢｒｏ
ｗｎ（ａｐｌ））。

気菌糸；不良ないし７中程度。

気菌糸の色；シルバー・グレイ（８ｊｅ）ないしグレイ
（Ｇｒａ、ｙ　、（ｇ　）　）。

可溶性色素；生じない。

■オート・ミール寒天培地 生育；中程度 基生菌糸の色；ライト・アイポリ−（２ｃａ）ないしラ
イト拳ビート（２ｅａ）。

気菌糸；僅少。

気菌糸の色；ホワイト（ａ）。

可溶性色素；生じない。

０イ〜ス）エキス・麦芽エキス寒天培地生育；良好。

基生菌糸の色；マスタード・ゴールド（Ｍｕｓｔａｒｄ
Ｇｏｌｄ（２ｐｇ））ないしマスタード・ブラウン〔Ｍ
ｕｓｔａｒｄ　Ｂｒｏｗｎ（２ｐ　ｉ　）　）。

気菌糸；中程度ないし良好。

気菌糸の色；グレイ（ｇ）ないしンルバー゛グレイ（８
ｆｅ）。

可溶性色素；マスタード・ゴールド（２ｐｇ）。

■ペネット氏寒天培地 生育；中程度 基生菌糸の色；マスタード・ブラウン（２ｐ　ｉ　）。

気菌糸；中程度。

気菌糸の色；グレイ（ｇ）。

可溶性色素；マスタード・ゴールド（２ｐｇ）。

０１７７７氏寒天培地 生育；中程度。

基生菌糸の色；マスタード・ゴールド（２ｐｇ）。

気菌糸：生じない 可溶性色素；マスタード・ゴールド（２ｐｇ）。

■栄養寒天培地 生育；僅少。

基生菌糸の色；無色 気菌糸；生じない。

可溶性色素；生じない。

０ペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地生育；僅少。

基生菌糸の色；無色 気菌糸；生巳ない。

可溶性色素；生じない。

（ｄ）生理的諸性質 ■　生育温度範囲：１３〜３５℃（至適温度２２−２８
℃）。

■　ゼラチンの液化；液化しない。

■　スターチの加水分解；加水分解する。

（４）脱脂牛乳のペプトン化、凝固；ペプトン化および
凝固しない。

■　メラニン様色素の生成；チロノン寒天培地上では生
成するが、ペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地上で
は生成しない。

■炭素源の利用性； Ｌ−アラビノース　　　　　　− Ｄ−フラクトース　　　　　　− イノ／トール　　　　　　　　　− Ｄ−マンニトール　　　　　　− ラフィノース　　　　　　　　　− Ｌ−ラムノース　　　　　　　− シュクロース　　　　　　　　− Ｄ−キシロース　　　　　　　− Ｄ−グルコース　　　　　　　　＋ （ただし、プリドハム・ゴドリーブの基礎培地にグルコ
ースを添加しても、生育がみられなかったので、スター
チ・無機塩寒天培地のスターチを除いたも・のを基礎培
地として用いて試験した。）以上の菌学的性状を総括す
ると、本菌ＡＡ５８６株は、真性の気菌糸より多数の胞
子の連鎖を有する気菌糸を形成し、ジアミノピメリン酸
がＬ−型であり、鞭毛胞子や胞子のうを形成しないこと
などの性状を有しており、このような性状を有する菌株
ヲ、バーシーズ・マニュアル・オブ嗜ザ番デタミネイテ
ィブ・バクテリオロジ＝（Ｂｅ　ｒ　ｇｅ　ｙ’ｓＭａ
ｎｕｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第８版（１’９７４年）
で検索すると、ストレプトミセス属に属するものである
と同定された。よってＡＡ５８６株を、ストレグトミセ
ス夢エスーヒー−Ａ　Ａ５８６　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　８１）＠　ＡＡ５８６　）と命名した。

また、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に、
微生物受託番号「徴工研菌寄第６１００号、ＦＥＦｔＨ
Ｐ−６１００Ｊとして寄託されている。

さらに、本菌に限らず、本発明の新規なホスホリパーゼ
Ｄ−Ｐを生産する菌はすべて、本発明に使用することが
できる。また簡便には、ストレプトミセス属に属するホ
スホリパーゼＤ−Ｐ生産Ｉが使用される。

本発明を実施するにあたっては、該ホスホリパーゼＤ−
Ｐ生産菌を酵素を生産する通常の方法で培養する。培養
の形態は通常は液体培養で行なうが、工業的には深部通
気攪拌培養を行なうのが有利である。培地の栄養源とし
ては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れ得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であれば
よく、例エバ、グルコース、シュクロース、乳糖、麦芽
糖、スターチ、デキストリン、糖蜜、グリセリンなどが
使用される。窒素源としては、利用可能な窒素化合物で
あれば良く、特に有機化合物が好ましい。例ｔば、コー
ン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実紛、小麦グルテン
、ペプトン、肉エキス。

酵母エキス、乾燥酵母、カゼイン加水分解物などが使用
される。その他、リン酸塩、マグネシウム。

カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類
が必要に応じて使用される。培養温度はホスホリパーゼ
Ｄ−Ｐを生産する範囲内で適宜変更し得るが、好ましく
は２５〜３０°Ｃ９特に好４しくは２６℃程度である。

培養時間は条件によって異なるが、ホスホリパーゼＤ−
Ｐが最高収量に達する時期を見計って適当な時期に培養
を終了すればよく、通常は４０〜９０時間である。

このようにして得られた培養物からホスホリパーゼＤ−
Ｐを採取するのであるが、本酵素は水に易溶性であって
、主として培養Ｐ液中に存在する。

培養液中に存在するホスホリパーゼＤ−Ｐは培養ｐ液を
濃縮するかもしくは濃縮することなく可溶性塩類例えば
硫安１食塩などで飽和沈澱させるか、または親水性有機
溶媒９例えばメタノール、エタノール、アセトンなどを
添加することにより沈澱させることができる。沈澱物は
水に溶解し、半透膜で透析することにより低分子の不純
物を除去することができる。また、例えばジエチルアミ
ノエチル−セルロース、ジエチルアミノエチル−セファ
ロース、バルミトイル化ガーゼ（％公昭５５−４８７９
１号に基いて調製したもの）力どの吸着剤に対する吸着
親和力の差を利用してイオン交換クロマトグラフィーま
たは吸着クロマトグラフィー。

あるいはデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、
セファロースなどのゲル涙過剤を用いるゲル濾過などの
通常の手段を利用して培養液中の低分子の不純物、有色
物質などを有効に分離することかできる。これらの手段
により得られる酵素溶液から減圧濃縮、凍結乾燥力どの
操作により、粗製ホスホリパーゼＤ−Ｐを得ることがで
きる。

上記の処理によシ得られる粗製ホスホリノく−ゼＤ−Ｐ
の溶液あるいは固形物は、さらに蛋白質。

酵素などの精製に通常用いられる手段９例えば吸着剤、
ケル濾過などを使用することにより、ホスホリパーゼＤ
−Ｐを精製することができる。

次に本発明のホスホリパーゼＤ−Ｐの活性の測定法、性
質などについて述べる。

■酵素活性測定法 １０ｍＭ　　　ＣａＣ１２５０ｔｔｌ、　　８　　％　
ト　リ　ト　７Ｘ−１００Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００
）５０μＪ、　０．２Ｍジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ
緩衝液（ｐＨａ５）１００μＡ’、１０ｍＭレシチンエ
マルジョン１００μ１．　水１５０μ１（７）組成を有
する反応液０４５ｍ１を８７℃で３分間ブレインキュベ
ーション後、５０μｌのホスホリパーゼＤ　−Ｐを含む
酵素液を加え、反応を開始する、正確に１０分後に１０
ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　−Ｉ　Ｍ　）リス−ＨＣ１緩衝
液（ｐＨ８）に溶解した１チセチルトリメチ／Ｌアンモ
ニウムクロリド０５ｍ１を添加して反応を停止せしめた
。次いで生成したコリンを、コリンオキシダーゼ２．５
単位、ペルオキシダーゼ２５単位。

０２％フェノール５０μ！、０３％４−アミノアンチピ
リン５０μ７．ＩＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨｉ）５
０μｌの組成を有する反応液Ｑ５ｍ／を加乏て２０分間
反応せしめて発色させた。さらにこれに、１．５＋＋＋
ｔの１チドリトンＸ−１００を加えた後、５００ｎｍで
比色定鷲を行なった。酵素活性は下記の計算式により求
めた。１単位（Ｉ　Ｕｎｉｔ）は上記反応条件下、１分
間に１　、ｃａｎｏｌｅのコリンを遊離させる活性とし
た。

酵素活性（ＩＪｎｉ　ｔ　／　ｍｌ　）　＝４　５０　
　１０ （ただしΔＡ５００ｎｍ　　：上記方法で酵素液を加え
ないで同様の操作を行ない、酵素液を添加した値から差
し引いた５００ｎｍの吸光度の値）■基質特異性 上記の酵素活性測定法における反応液中のレシチンの代
わりに下記の種々の物質を用いて、ホスホリパーゼＤ−
Ｐの基質特異性を検討した。その結果をレシチンに対す
る相対活性で示す。

基質　　　　　　相・　　チ レシチン　　　　　　　　　　　　　１００リゾレシチ
ン　　　　　　　　　　　　ａ４スフィンゴミエリン　
　　　　　　　　α０３上記の結果より、本酵素は少な
くともレシチンに対し、非常に高い特異性を示すものと
認められ、リゾレシチンに対してはわずかながら作用し
、またスフィンゴミエリンに対してはほとんど作用せず
、レシチンを基質とする相対活性において、リゾレシチ
ン、スフィンゴミエリンに対する活性は５チ以下である
と認められるものである。

■酵素作用 １モルのレシチンおよび１モルの水から、１モルのホス
ファチジン酸およびコリンを生成する反応を触媒する作
用を有する。

■至適ｐＨ 前記の酵素活性測定法における０２Ｍジメチルグルタル
酸−ＮａＯＨ緩衝液の代りに、０２Ｍジメチルグルタル
酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４−１５）（第１図中、Ｏ−
０で示す）、リン酸緩衝液（ｐＨ６５−８１第１図中、
酬叱で示す）、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８−９）（
第１図中、ロー［で示す）を用いて、本発明のホスホリ
パーゼＤ〜Ｐのレシチンに対する酵素活性を測定した結
果第１図に示す通りであって、至適ｐＨは五５付近と認
められる。

■熱安定性 ００５チ牛血清アルブミンを含む１０ｍＭジメチルグル
タル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ［））に溶解した酵素液
（２５Ｕ／ｍＡ’）を４５〜７５℃の各温度１１０分間
処理し、その後水冷し、前記の酵素活性の測定法に従っ
てホスホリパーゼＤ−Ｐのレシチンに対する酵素活性（
残存活性）を測定した。その結果、第２図に示す通りで
あって、その熱安定性において本酵素は、６０′Ｃまで
安定であった。

■ｐＨ安定性 （１０５％牛血清アルブミンを含むジメチルグルタル酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４−７５）（第３図中、○で示
す）、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８−８５）（第８図
中、Δで示す）、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１５
）（第８図中、口で示す）およびリン酸緩衝液（ｐＨ６
５−７）（第８図中、・で示す）に４８Ｕ／−になるよ
う酵素液を調製し、３７℃、６０分間放置後、ホスホリ
パーゼＤ−Ｐのレシチンに対する酵素活性（残存活性）
を測定した。

その結果は第８図に示す通りであって、そのｐＨ安定性
は、４．２−＆５付近と認められる。

■等電点 ｐ　Ｈ４，２付近（キャリアアンフオライトを用いる電
気泳動法により測定した。） ■分子量 約４６０００　（バイオゲルＰ　−２００を用いるゲル
濾過法において測定した。） ■種々の金属イオンおよびＥＤＴＡの影１ｉ１前記の酵
素活性の測定法において種々の添加物を加えてホスホリ
パーゼＤ−Ｐのし／ザンに対する酵素活性を測定した結
果は次の通りである。

試　薬　　　　濃度（ｍＭ）　　　相対活性（％）無添
加　　　　　　　　　　　　　１００ＣａＣ１２１，０
１００ ＭｇＣ１２１，０１０３ ＭｎＣ１２１，０１１７ Ｚｎ（Ｊ’２　　　　　　１．０　　　　　　９９Ｃｏ
Ｃ１２１，０１０６ Ｂａ（Ｊ２　　　　　　１．０　　　　　１０１ＣｕＣ
ｌ２　　　　　　　　１．０　　　　　　　　　６５Ｋ
Ｃ１１００９Ｏ ＮａＣ１１００９４ ＮＨ４Ｃｌ　　　　　　　１００　　　　　　　　　　
　７４ＬｉＣ４’　　　　　　　　　１００　　　　　
　　　　　　９２ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　１０　
　　　　　　　　　　９４上に示す通り、ＣｕＣｌ２．
ＮＨ４Ｃｌ　　のイオンにより少し阻害されるが、他の
イオンはほとんど影響を及ぼさない。

■各種界面活性剤の影響 前記の酵素活性の測定法において種々の界面活性剤を加
えてホスホリパーゼＤ−Ｐのレシチンニ対する酵素活性
を測定した結果は次の通りである。

界面活性剤　　　　　　濃度（％）　　相対活性（％）
無添加　　　　　　　　　　　　　　　　１トリトンＸ
−１０００５１００ アデカトール５Ｏ−１２０（１５８ プリジ　８５　　　　　　　　（１５５ラウリル洩＊弘
髪 硫酸ナトリウム　　　　　０１　　　　１ｇツイン−２
００５３９ セチルピリジニウムクロライド　　　α１４セチルトリ
メチルアンモ ニウムクロライド　　　　０１　　　　　２以上の通り
、本発明のホスホリパーゼＤ−Ｐはレシチンに強く作用
し、かつリゾレシチンおよびスフィンゴミエリンに対し
て相対活性が５％以下と認められる特徴を有し、かつし
７チンに作用して、ホスファチジン酸とコリンを生じせ
しめ、またその等電点が４．２．その分子量が４６００
０であることなどの理化学的性質により、公知のホスホ
リパーゼＤとは異なるものと認められ、本発明の酵素ホ
スホリパーゼＤ−Ｐは新規な酵素と認められる。

さらに本酵素は臨床検査試薬として、リン脂質中レシチ
ンの特異的定量に用いることができ得る有用なものであ
る。

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発
明は何らこの実施例によって限定さ′！’ｌるものでは
ない。

実施例　１ 税脂大豆紛２チ、グルコース２チ、　Ｋ＝　ＨＰＯ４０
０５％、Ｍｇ５０４（１０１％、Ｎａ０７Ｑ２％、ジス
７、ｔ−ムＣＣ−２２２０１％（７）組成を有する培地
１００ｍ／！（ｐＨ６５）を５００　ｍｌ容三角フラス
コニ入し、１２０℃、２０分間滅菌後、ストレプトミセ
ス・ニス・ビー・ＡＡ５８６株をスラントより一白金耳
移植し。

２６℃でロータリー・シェーカーにょシ通気攪拌を行な
った。経時的に菌体外に分泌されたホスホリパーゼＤ−
Ｐ活性を測定したところ、７０時間目に最大活性を示し
た（ｆｈ８Ｕ／＋＋ｙｊり。

実施例　２ 脱脂大豆粉２％、グルコース１．５％、マルトテキ、＜
　ト＋）　７１　％　、に２ＨＰ０４Ｑ０５％、Ｍｇ５
０４０．０ｉ％、ＮａＣｌＯ２％、ジス７、ｔ−ムｃｃ
−２２２（１２％の組成を有する培地２０１　（ｐＨ６
５）を８０１容ジャーファーメンタ−に入れ、加圧滅菌
後、実施例１に記載の条件で培養したストレプトミセス
・ニス・ピーＡＡ５８６株の培養液２ｕＯｍ／を移植し
、２６°Ｇ、２０１／分の通気条件、　８００ｒ、　ｐ
６ｍ。

の攪拌条件下で培養を行なった。６４．５時間後に活性
の熾大値が得られた（　４．７　Ｕ　／　ｍｌ　）。

実施例　３ 実施例２で得られた培養液を、５０００ｒ、ｐ、ｍ、。

１０分間遠心分離して菌体を除去した。得られた上清２
８１を４１まで減圧濃縮した。この濃縮液に１２１の冷
アセトンを加え、４℃で６０分間靜装し、上清をデカン
テーションにより除去した。

沈澱に２１の冷アセトンを加え、静置後上清を除去した
。沈澱物を５１の精製水に溶解し、これを１　ｋｇのバ
ルミトイル化ガーゼを充てんしたカラムに通し、酵素を
吸着させた。次いでこのカラムを１０ｍＭ酢酸緩衝液で
充分洗浄後、（１１％）ＩＪ）ンＸ−１００を含む１０
ｍＭ酢酸緩衝液で溶出を行なった。得られた溶出液２１
１を１１″！！で減圧濃縮し、ＩＮ酢酸でｐＨを４４に
調製した。

その後、１１の冷アセトンを加え、生じた沈澱を５００
０’ｒ、ｐｍ、１０分間の遠心分離で除去し、上清液を
得た。次いで上清液に２１の冷了セトンを加え、生じた
沈澱を１１０　ｒｎｌの１０ｍＭ酢酸緩衝ｉ　（ｐ　Ｈ
ａ　Ｏ）　Ｋ溶解し、セファデックス０−２５で脱塩後
凍結乾燥し、８５０Ｕ／叩の比活性を有する精製ホスホ
リパーゼＤ−Ｐの粉末１１３即を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のホスホリパーゼＤ−Ｐの至適ｐＨ曲線
を示し、第２図は本発明のホスホリパビＤ−Ｐの熱安定
性曲線を示し、第３図は本発明のホスホリパーゼＤ−Ｐ
のｐＨ安定性曲線を示す。 特許出願人 東洋醸造株式会社 代表者伊東富士馬 第１図 ４　　　　５　　　　　ε　　　　　７　　　　８　　
　　９第２図 ４５　　　　５０　　　　　５５　　　６０　　　　６
５　　　　７Ｑ　　　　　７５温度（＠Ｃ） 第３ｍ Ｃ７ＣＤ　　　　　　１．０ ｐＩ＋

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１Ｆ　　少なくとも下記の理化学的性質を有すること
   を特徴とするホスホリパーゼＤ−Ｐ０ ■　基質特異性としてレシチンに作用し、リゾレアーｙ
   ンおよびスフィンゴミエリンに対して、レシチンを基質
   とする相対活性が５チ以下である。 ［有］）酵素作用は、反応式〔Ｉ〕で示す通り。 レシチン＋Ｈ２Ｏ−〉 ホスフ公与ン酸＋コリン　　〔■〕 （２）■分子量：約４６０００（バイオゲル・ゲル濾過
   法による）■至適ｐＨ：　５．５　　付近 ■ｐＨ安定性：　ｐＨ４，２−８，５付近■等電点：ｐ
   Ｈ４，２付近 ■熱安定性：ｐＨ６，０で６０℃、１０分間の加熱まで
   安定、である理化学的性質を有する特許請求の範囲第１
   項記載のホスホリパーゼＤ−Ｐｏ （３）　　ホスホリパーゼＤ−Ｐの製造において、ホス
   ホリパーゼＤ−Ｐを生産するホスホリバービＤ−Ｐ生産
   菌を培地に培養し、培養物からホスホリパーゼＤ−Ｐを
   採取することを特徴とするホスホリパーゼＤ−Ｐの製造
   法。 （４）　　ホスホリパーゼＤＰ生産菌がストレプトミセ
   ス属に属するホスホリパーゼＤ−Ｐ生産菌である特許請
   求の範囲第３項記載のホスホリパーゼＤ−Ｐの製造法。 （５）　　ストレプトミセス属に属するホスホリパーゼ
   Ｄ−Ｐ生産菌が、ストレプトミセス尋ニス・ビー・ＡＡ
   ６８６株である特許請求の範囲第４項記載のホスホリパ
   ーゼＤ−Ｐの製造法。