JPH0236230B2 - - Google Patents

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JPH0236230B2
JPH0236230B2 JP58142803A JP14280383A JPH0236230B2 JP H0236230 B2 JPH0236230 B2 JP H0236230B2 JP 58142803 A JP58142803 A JP 58142803A JP 14280383 A JP14280383 A JP 14280383A JP H0236230 B2 JPH0236230 B2 JP H0236230B2
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neuraminidase
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acid
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micromonospora
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はノイラミニダーゼの製造法に関する。
さらに詳しくは、本発明はミクロモノスポラ属に
属し、ノイラミニダーゼを生産する能力を有する
微生物を培地に培養し、培養物中にノイラミニダ
ーゼを蓄積せしめ、該培養物から該酵素を採取す
ることを特徴とするノイラミニダーゼの製造法に
関する。 ノイラミニダーゼ（EC3，２，１，18）は生体
の重要な構成成分である糖蛋白質や糖脂質等の末
端に位置するシアル酸（ノイラミン酸のアシル誘
導体の総称）のα配位のケトシドを基質とし、こ
のシアール酸残基を遊離させる加水分解酵素であ
る。 このノイラミニダーゼは、ウイルス，細菌，放
線菌などの微生物，鳥類，哺乳動物の種々の組織
に広く分布していることが知られている。 また、ノイラミニダーゼは血清等の生体中のシ
アル酸含有物質の定量に用いられることはよく知
られており、ノイラミニダーゼを安価に工業的に
製造する方法を提供することが望まれている。 従来、微生物を用いてノイラミニダーゼを生産
する方法としては、ノイラミニダーゼ産生能を有
する微生物をコロミン酸や各種動物組織の浸出・
抽出液をノイラミニダーゼ誘導物質として加えた
培養基中で培養してノイラミニダーゼを製造する
方法が知られている。〔代謝16(5)，761（1979），
Biochim.Biophys.Acta，350，425―431（1974），
J.Biochem.82，1425―1433（1977），J.Bacteriol.
119(2)，394―400（1974），Canadian J.
Microbiology18，1007，（1972），特公昭50―
11991〕然るにこれらのノイラミニダーゼ誘導物
質を大量に使用することは経済的に極めて困難で
あるので、ノイラミニダーゼ生産量向上のために
は、ノイラミニダーゼ生産性の高い微生物を用い
る必要がある。 本発明者らは工業的に安価にノイラミニダーゼ
を製造する方法について種々検討した結果、ミク
ロモノスポラ属に属する微生物を培地に培養した
ときに培養物中にノイラミニダーゼが著量に生産
されることを見い出し、本発明を完成した。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明によれば、ミクロモノスポラ属に属し、
ノイラミニダーゼ生産能を有する微生物を培地に
培養し、培養物中にノイラミニダーゼを蓄積せし
め、該培養物から該酵素を採取することにより、
ノイラミニダーゼを製造することができる。 本発明に使用する微生物としては、ミクロモノ
スポラ属に属し、ノイラミニダーゼを生産する能
力を有するものであればいずれの菌株でもよい。 具体的に好適な菌株の例としては、ミクロモノ
スポラ・ビリデイフアシエンス
（Micromonospora viridifaciens）ATCC31146，
ミクロモノスポラ・グロボーサ
（Micromonospora globosa）NRRL Ｂ―2673，
ミクロモノスポラ・カルセア（Micromonospora
chalcea）ATCC12452があげられる。 これらの菌の属する種の菌学的性質は次の文献
に記載されている。“US Patent 3991183（1977）”
ミクロモノスポラ・ビリデイフアシエンス。 “Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology”第８版（1974）。 ミクロモノスポラ・グロボーサ
（Micromonospora globosa）p852，ミクロモノ
スポラ・カルセア（Miciromonospora chalcea）
p848。 本発明に使用される培地としては、炭素源，窒
素源，無機物その他の栄養素を程よく含有するも
のであれば、天然培地、合成培地のいずれも用い
ることができる。 炭素源としては、グルコース，フラクトース，
シユクロース，マルトース，マンノース，澱粉，
澱粉加水分解液，糖蜜などの種々の炭水化物、あ
るいはグリセロール，ソルビトール，マンニトー
ルなどの種々の糖アルコール，酢酸，乳酸，ピル
ビン酸，フマール酸，クエン酸などの各種有機
酸，メタノール，エタノールなどの各種アルコー
ル，エチレングリコール，プロピレングリコール
などの各種グリコール、各種アミノ酸あるいはｎ
―ヘキサデカンなどの炭化水素、牛心臓や牛脳の
浸出液，牛血液粉末などが使用可能である。 窒素源としはアンモニア、あるいは塩化アンモ
ニウム，炭酸アンモニウム，燐酸アンモニウム，
硝酸アンモニウム，酢酸アンモニウムなど各種無
機および有機アンモニウム塩，尿素，アミノ酸お
よびその他の窒素化合物、ならびにペプトン，
NZ―アミン，肉エキス，コーンスチープリカー，
カゼイン加水分解物，蛹加水分解物，フイツシユ
ミールあるいはその消化物、脱脂大豆あるいはそ
の消化物などの窒素含有有機物質などが用いられ
る。 無機物としては、燐酸第一カリウム，燐酸二カ
リウム，塩化カリウム，硫酸マグネシウム，硫酸
マンガン，硫酸第一鉄，塩化ナトリウム，炭酸カ
ルシウムなどが用いられる。 培地にコロミン酸やムチンなどのシアル酸含有
物質を加えれば、より大量のノイラミニダーゼを
生成させることができる。この際、これら添加物
の量は培地重量当り0.01〜1.0％（Ｗ／Ｖ）で良
い結果を得ることができる。 培養はPH6.0〜7.0、温度25〜35℃で４〜５日
間、通気撹拌しながら行う。 このようにして培養することにより、培養物
中、主に培養液中にノイラミニダーゼが生成蓄積
する。培養物中からのノイラミニダーゼの採取は
次のごとく行なう。 培養終了後、培養液を過あるいは遠心分離
し、菌体を除き液あるいは上清を得る。この
液あるいは上清液を通常酵素精製に用いられる方
法、例えば、塩析、有機溶媒沈殿、透析、イオン
交換カラムクロマト、ゲル過、凍結乾燥などの
方法にて処理する。かくして精製ノイラミニダー
ゼを採取することができる。 たとえば、培養液を、硫酸アンモニウム90％
飽和による塩析を行ない、生じる沈殿を緩衝液に
溶解、透析後、DEAE―セフアデツクスやDEAE
―セルロースのような陰イオン交換樹脂を充填し
たカラムに吸着させ、吸着した酵素を食塩または
硫酸アンモニウムの濃度勾配により溶出させる。
溶出された酵素を更にセフアデツクスＧ―75やバ
イオ・ゲルＰ―100によるゲル過法により精製
する。 本発明で得られる酵素の有する性質をミクロモ
ノスポラ・ビリデイフアシエンスATCC31146か
ら生産されるノイラミダーゼを代表として以下に
述べるが、ミクロモノスポラ・グロボーサ
NRRL Ｂ―2673およびミクロモノスポラ・カル
セアATCC12452から生産されるノイラミニダー
ゼもぼぼ同様の性質を有する。 ノイラミニダーゼの酵素活性の測定は、酵素反
応によつて生成するＮ―アセチルノイラミン酸
に、Ｎ―アセチルノイラミン酸リアーゼ
（EC4.1.3.3）を作用させ、生成したピルビン酸を
乳酸脱水素酵素（EC1.1.1.27）の存在下にNADH
と反応させ、NADHの340nmにおける吸光度の
減少量を分光光度計で測定することによつて行な
う。 反応式は次式(1)，(2)，(3)で示される。 Ｎ―アセチルイラミニル＋H2Oグリコシドノイラミニダ
ーゼ ―――――――――――→ Ｎ―アセチルノイラミン酸＋アグリコン
(1) Ｎ―アセチルノイラミン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸 ―――――――――――――――→ リアーゼＮ―アセチル―Ｄ ―マンノサミン＋ピルビン酸 (2) ピルビン酸＋NADH乳酸脱水素酵素 ――――――――――→ 乳酸＋NAD (3) (イ) 試 薬 基質：40mg／mlコロミン酸水溶液 0.1ml 緩衝液：200mMクエン酸―リン酸二ナト
リウム緩衝液（PH5.0） 0.1ml Ｎ―アセチルノイラミン酸リアーゼ溶液：
10mMリン酸緩衝液（PH7.0）で１単位／ml
になるように調製 0.05ml NADH：100Mmリン酸緩衝液（PH7.4）で
0.3mMになるように調製 ２ml 乳酸脱水素酵素：100mMリン酸緩衝液
（PH7.4）で300単位／mlになるように調製
0.01ml 酵素溶液 0.1ml (ロ) 操 作 上記試薬，を試験管に入れ、37℃５分間
予備加温する。次いで酵素溶液を加えて溶液
の全量を0.5mlに調整し37℃で15分間振とうし
て反応させる。100℃３分間の加熱処理によつ
て反応を停止する。次いでを添加して70℃で
15分間反応させる。さらにを添加してすぐに
340nmの吸光度を求める（OD0min）。を添
加して25℃で10分間反応させた後340nmの吸光
度（OD10min）を測定して、その差ΔODtest
を求める。一方コントロールとして酵素の代り
に、水を用いたもの上記と同様の操作を行ない
吸光度の変化ΔODblankを求める。 (ハ) 力価の計算法 ノイラミニダーゼの１単位は37℃で１分間に
1μmoleのＮ―アセチルノイラミン酸を生する
酵素量と定義する。一方、1mMのNADHの吸
光係数は6.22と報告されている（The Merck
Index，９版，p824）から、求める酵素溶液１
ml当りの力価(A)は Ａ＝（ΔODtest−ΔODblank）×2.55／6.22×0.10×15 ＝（ΔODtest−ΔODblank）×0.273（単位／
ml） より求められる。 次に本発明で得られたノイラミニダーゼの諸性
質を示す。 (1) 作 用 本酸素はシアロ糖複合体の末端に位置するＮ
―アセチルノイラミン酸のα配位のケトシドを
基質とし、このＮ―アセチルノイラミン酸残基
を遊離させる反応を触媒する。 (2) 基質特異性 本酵素はコロミン酸，Ｎ―アセチルノイラミ
ン酸ラクトース，フエツイン，ムチン等の各種
Ｎ―アセチルノイラミン酸ケトシドを加水分解
する。 【表】 Ｎ―アセチルノイラミン酸ラクトースに対す
るKm値は約2mMであつた。 (3) 至適PH 本酵素の至適PHは37℃，15分間の反応でPH
5.0〜5.5付近にある。 (4) 安定PH範囲 本酵素の安定PH領域は４℃，20時間の処理で
PH6.0〜9.0の間にある。 (5) 作用適温の範囲 本酵素の最温適度はPH5.0，15分間の反応に
おいて50゜〜60℃付近にある。 (6) 温度安定性 本酵素はPH6.0，15分間の処理で50℃まで安
定、55℃では50％程度失活する。 (7) 阻 害 37℃，PH5.0で反応させた場合、下記の物質
によつて阻害される。 【表】 (8) 分子量 セフアデツクスＧ―150ゲル過法により、
本酵素の分子量は30000と算出された。 (9) 結晶構造および元素分析値は本酵素が結晶化
されていないので測定していない。 (10) 本酵素はデイスク電気泳動により単一のバン
ドが得られた。 すなわち、7.5％ポリアクリルアミドゲルを
用いて、トリス―グリシン緩衝液（PH8.3）中
で約90分間泳動を行なつた。そしてゲルをアミ
ドブラツク染色液で染色することにより、単一
の蛋白質のバンドが観察された。 以下実施例をあげて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ ミクロモノスポラ・ビリデイフアシエンス
ATCC31146をグルコース１ｇ／／dl，可溶性デ
ンプン１ｇ／dl，ペプトン0.75ｇ／dl，肉エキス
0.75ｇ／dl，食塩0.30ｇ／dl，硫酸マグネシウム
0.10ｇ／dl，リン酸二カリウム0.10ｇ／dl，コロ
ミン酸0.1ｇ／dlからなる培地（PH7.0）300mlを
含む２エルレンマイヤーフラスコに植菌し、30
℃で48時間振盪培養した。 この培養液600mlを上記培地と同じ組成の培地
15を含む30ジヤーフアーメンターに入れ、通
気撹拌（300rpm）しつつ、30℃で４日間培養を
行つた。 この培養物15を大型ヌツチエで過助剤とし
てラジオライト＃100を用い過し、培養液約
15を得た。 この培養液に硫安を加え、硫安90％飽和で沈
殿する部分を採取した。 この沈殿のノイラミニダーゼ活性収率は約80％
で、比活性は約５倍に上昇していた。 この沈殿を少量（約100ml）の0.01Mトリスー
塩酸緩衝液（PH7.0）に溶解した。 この溶液を同緩衝液10で24時間透析した。透
析液を同緩衝液で平衡化したDEAE―セフアデツ
クスカラム（１，口径６cm）に通塔した。この
操作で、ノイラミニダーゼはDEAE―セフアデツ
クスに吸着される。さらに、同緩衝液で不純蛋白
質を洗い流した。 次に0.01Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.0）から
1.0M食塩を含む同緩衝液までの食塩の濃度勾配
液で溶出を行つた。 溶出してくる活性画分をあわせ、これに硫安を
加えて、硫安90％飽和で沈殿する部分を遠心分離
（12000×ｇ，20分）で集め、0.01Mトリス―塩酸
緩衝液（PH7.0）10mlに溶解した。 この溶液を同緩衝液５で24時間透折した。 透折後、酵素液を同緩衝液で平衡化したセフア
デツクスＧ―75のカラム（500ml，口径3.5cm）に
通した。溶出液を分画回収し、比活性の高い分画
を集め凍結乾燥し、ノイラミニダーゼの粉末精製
酵素標品50mg（比活性50単位／mg）を得た。 精製酵素は細胞液に比べて比活性は約2000倍
に上昇し、活性の収率は約50％であつた。 実施例 ２ 使用菌株をミクロモノスポラ・グロボーサ
NRRL Ｂ―2673に替え、発酵培地をペプトン0.2
ｇ／dl，肉エキス0.1ｇ／dl，酵母エキス0.1ｇ／
dl，ムチン２ｇ／dlからなる培地（PH7.2）に替
えて行う以外は実施例１と同様に行つて比活性30
単位／mgの精製ノイラミニダーゼ約20mgを得た。
活性の収率は約30％であつた。 実施例 ３ 使用菌株をミクロモノスポラ・カルセア
ATCC12452に替えて行う以外は実施例１と同様
に行い、比活性40単位／mgの精製ノイラミニダー
ゼ約30mgを得た。活性の収率は約40％であつた。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ ミクロモノスポラ属に属し、ノイラミニダー
    ゼを生産する能力を有する微生物を培地に培養
    し、培養物中にノイラミニダーゼを蓄積せしめ、
    該培養物から該酵素を採取することを特徴とする
    ノイラミニダーゼの製造法。
JP58142803A 1983-08-04 1983-08-04 ノイラミニダ−ゼの製造法 Granted JPS6034181A (ja)

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JP58142803A JPS6034181A (ja) 1983-08-04 1983-08-04 ノイラミニダ−ゼの製造法
US06/636,552 US4710470A (en) 1983-08-04 1984-08-01 Process for producing neuraminidase
EP84109221A EP0133694B1 (en) 1983-08-04 1984-08-03 Process for producing neuraminidase and method and reagent for the quantitative determination of a sialic acid-containing substance using neuraminidase
DE8484109221T DE3482804D1 (de) 1983-08-04 1984-08-03 Verfahren zur herstellung von neuraminidase und verfahren und reagenz zur quantitativen bestimmung einer sialinsaeure enthaltenden substanz unter verwendung von neuraminidase.
DE198484109221T DE133694T1 (de) 1983-08-04 1984-08-03 Verfahren zur herstellung von neuraminidase und verfahren und reagenz zur quantitativen bestimmung einer sialinsaeure enthaltenden substanz unter verwendung von neuraminidase.

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JPS6034181A JPS6034181A (ja) 1985-02-21
JPH0236230B2 true JPH0236230B2 (ja) 1990-08-16

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Country Status (4)

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US (1) US4710470A (ja)
EP (1) EP0133694B1 (ja)
JP (1) JPS6034181A (ja)
DE (2) DE3482804D1 (ja)

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