JPH06503748A - 磁気分離のための装置および方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 磁気分離のための装置および方法 発明の分野 本発明は、磁気粒子を利用した高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）によって非磁性試験 媒質から対象物質を分離する磁気分離装置と方法に関するものである。

発明の背景 本発明は、磁気分離装置と非磁性媒質から磁気粒子を分離する方法の改良に関す るものであり、生物特異的親和反応を伴うさまざまな実験的および臨床的処置へ の利用がとくに効果的である。このような反応は、血液や尿といった生物学的サ ンプルの検査でさまざまな種類の標的物質、とくに細胞、たんばく質、核酸塩基 配列などの生物学的実体を測定するために広く用いられている。

この明細書において「標的物質」という用語は、特異結合対の構成要素、すなわ ち相互に親和性を示す一対の物質または１つの物質と１つの構造を指し、細胞成 分、生物特異的リガンドおよびレセプタなどがこれに含まれる。ここで「リガン ド」とは、抗原、ハブテン、および各種細胞関連構造のような物質で、レセプタ によって生物特異的に認識され、レセプタと結合する能力のある特徴的な決定基 またはエピトープを少なくとも１つ有するものを指す。また、ここで「レセプタ 」とは、特定のリガンドに対して生物特異的結合親和性を有する物質または物質 群を指し、実質的に他の物質は除外する。生物特異的親和反応を通じて決定され るレセプタには、抗体（多クローン性と単クローン性）、抗体フラグメント、酵 素、核酸、Ｃ１ｑなどがある。生物特異的結合対の構成要素は、対を成す他方の 構成要素との選択的相互作用に基づいて決定される。

上記の標的物質を測定する場合には、対象物質とその特異結合相手による複合体 形成に応じてさまざまな方法が利用できる。どのような場合についても、標的物 質とその結合相手の複合体形成の発生または度合いを測定できる手段がある。

例えば、抗原を測定するための競合的アンセイの場合には、限られた数量の特異 抗体結合部位に対してテストサンプル中の対象抗原と既知の量の標識抗原を競合 させる。このようにすると、適切な反応時間の経過後には、特異抗体と結合した 標識抗原の量がテストサンプル中の抗原量と反比例する。標識抗原の代わりに標 識抗体（通常は単クローン性抗体）を用いる抗体用の競合的アッセイの場合も原 理はこれと同様である。結果として生じた免疫複合体は、例えば、複合体か非結 合抗原のいずれか一方の免疫吸収、物理化学的吸着、または沈降によって分離す る。その後、抗体と結合した標識抗原を測定し、既知の抗原濃度から標準曲線を 描いて、そこから未知の抗原濃度を計算する。

これとは対照的に、一般に「サンドイッチ」アッセイと呼ばれる抗原測定用のイ ムノメトリックアッセイでは、標識分析物ではなく、標識抗体を利用する。イム ノメトリックアッセイを行うと、抗体／多価（最低２価）抗原／抗体という「層 」から成るサンドイッチが形成される。結合して完全なサンドイッチ複合体（抗 体／抗原／抗体）を形成する標識抗体の量は、テストサンプル中の標的抗原物質 の量と正比例する。サンドイッチアッセイは、多クローン性抗体を用いて多段階 で行うことも、独立の抗原決定基に対応する単クローン性抗体を用いて少ない段 階で行うこともできる。

上述した伝統的な競合的イムノア・ンセイとイムノメトリックアッセイでは、標 的物質を測定するために、結合型と遊離型の標識リガンドまたは標識レセプタを 物理的に分離する必要がある。

結合型と遊離型の分離は、重力を利用し、標的物質と結合した細かい粒子またよ っては、このような粒子またはビードを帯磁させ、結合型／遊離型の分離を容易 にすることができる。磁気粒子は既知の技術であり、免疫およびその他の生物特 異的親和反応で利用されている。これについては、例えば米国特許第４，５５４ ．０８８号や、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　ｆｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ（臨床化学のためのイムノアッセイ、１４７−１６２ページ、Ｈｕ ｎｔｅｒほか編、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　ＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎＳＥｄｉｎｂ。

ｒｏｕｇｈ、１９８３年）で詳しく述べられている。一般に、この目的のために は、磁気または重力分離を促進するものであればどんな材料を用いても構わない 。

小さな磁気粒子は、たんばく質のような生物機能的ポリマー（重合体）とともに 効果的に作用し、表面積が非常に広く、適度な反応力学特性を有しているため、 生物特異的親和反応を伴う分析に非常に有用であることが実証されている。磁気 粒子の大きさは、例えば米国特許第３，９７０．５１８：４．０１８，８８６； ４．２３０，６８５；４．２６７．２３４：４．４５２．７７３：４，５５４゜ ０８８：および４．６５９．６７８号などの資料では、Ｑ、７−１．５ミクロン の範囲内である。これらの磁気粒子の中には、免疫試薬の支持体として有用と開 示されているものも含まれ、軽く撹拌すると優れた懸濁特性を示す。しかし、現 在知られている限り、市販されているすべての磁気粒子は、ある程度の撹拌を行 わないと時間とともに沈澱し、利用する際に再び懸濁させなければならない。従 って、このような試薬を利用する処理に余分な段階を加える結果となる。

上記のような磁気微粒子は、一般に大きく２つのカテゴリーに分類される。１つ は永久に磁気を帯びている粒子のカテゴリーと、もう１つは磁場にさらされたと きだけ磁気を帯びる粒子のカテゴリーである。この２つ目のカテゴリーに属する ものをここでは磁気反応性粒子と呼ぶことにする。磁気反応性を示す材料は、場 合によって超常磁性材料と呼ばれることもある。また、磁性酸化鉄など強磁性材 料の中には、結晶の直径が約３０ＯＡまたはそれ以下である場合に磁気反応性と なるものがある。これとは対照的に、サイズ的に大きい強磁性材料の結晶は永久 磁石の特性を保持し、磁場にさらされた後では凝集する傾向がある。これについ ては、Ｐ、ＲｏｂｉｎｓｏｎほかのＢｉｏｔｅｃｈ　Ｂｉｏｅｎｇ、ＸＶ：５０ ３−０６　（１９７３年）を参照されたい。

既知のものに磁気反応性コロイド磁鉄鉱がある。Ｏｗｅｎほかの米国特許第４゜ ７９５．６９８号を見ると、ポリマーとともに作用し、本当のコロイドとして作 用するサブミクロン（極微粒子）サイズの磁鉄鉱粒子について述べである。

標的物質と結合した磁気粒子による試験媒質からの結合型−遊離型分離に用いら れる磁気分離装置／方法は、磁気粒子の性質と大きさによって決定される。ミク ロンサイズの強磁性粒子、すなわち永久磁気粒子は、比較的安価な永久磁石を利 用した市販の磁気分離装置によって溶液から簡単に取り出せる。このような磁気 分離装置には、５ｅｒｏｎｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（Ｎｏｒｗｅ　ｌ　ｌ 、マサチューセッツ州）製のＭＡＩＡ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　５ｅｐａｒａｔｏｒ 。

ＤＹＮＡＬ、Ｉｎｃ社（Ｇｒｅａｔ　Ｎｅｃｋ、＝ニーヨーク州）製のＤＹＮＡ Ｌ　ＭＰＣ−１、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ社（Ｃａｍｂ ｒｉｄｇｅ、ｖサチューセッツ州）製のＢｉｏＭａｇ　５ｅｐａｒａｔｏｒなど がある。これらと同様のＣｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉａｇ ｎＯｓｔｉｃｓ社（Ｗａｍｐｏ　］　ｅ、？サチューセッツ州）製の磁気分離装 置は、装置の基部に平行に並んだ複数の棒磁石を備えている。この装置には６０ 本の試験管が入り、各試験管の閉じた方の端を２本の棒磁石の間の凹部に収める 。

上記の各種磁気分離装置には、サンプル容器の内側表面に磁気粒子の層が幾重に も形成されがちになるという欠点があり、不純物とともにこびりついた磁気粒子 は強くこすり洗いしてもなかなか落ちない。

コロ・イド磁性材料の場合には、強力な電磁石によっても簡単には溶液から分離 てきないため、高勾配磁気分離技術が必要となる。Ｒ，Ｒ，０ｄｅｒ、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ、Ｍａｇｎｅｔ　ｉｃｓ、１２　：　４２８−３５　（１９７６年） ：Ｃ１０ｗｅｎおよびＰ、Ｌｉｂｅｒｔｉ、Ｃｅ１ｌ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ： 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　５ｅｌｅｃｔｅｄ　、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ 細胞分離方法とその応用例）、Ｖｏｌ、５、ＰｒｅｔｌｏｗおよびＰｒｅｔｌｏ ｗｌｇ。

、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８６年）を参照されたい 。

勾配磁場は、通常、強力な磁力を発生する材料の濾過に利用される。凝集剤の添 加などコロイド磁気粒子をさまざまに操作することによって試験媒質から磁気分 離する別の効果的な技術は、同時係属出願中の米国特許出願第３８９．６９７号 （１９８９年８月４日出願）の主題である。

市販されている高勾配磁気分離装置には、非剛性スチールウールマトリックス（ 基質）で満たしたカラムと永久磁石を利用するＭｉ　Ｉｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅ ｃ　ＧｍｂＨ社（Ｇｌａｄｂａｃｈ、西ドイツ）製のＭＡＣ３装置がある。この 装置を用いると、磁気を帯びていない試験媒質はカラムを通過して外へ出てくる のに対し、磁気粒子はスチールウールの近くに生じた高磁場勾配によって引きつ けられ、保持される。

このような従来技術の高勾配磁気分離装置のスチールウールマトリックスは、標 的物質以外の生物学的実体も非特異的に取り込んでしまう場合が多く、標的物質 を取り出すには十分に洗浄して、標的物質と結合した粒子を再び懸濁させなけれ ばならない。また、従来技術の高勾配磁気分離装置の多くはカラムの大きさに応 じて多量の実験材料を必要とし、このことが実験室レベルのさまざまな効果的分 離を行う上で妨げとなっている。さらに、傷つきやすい種類の細胞にとってはス チールウールマトリックスが有害となる場合がある。

高勾配磁気分離にはコロイド磁気粒子が関係する生物特異的親和反応に基づく医 学的または生物学的分析を行う上でさまざまな利点があるが、これまでに開発さ れているシステムは、上記のような理由によって完全に満足のいくものとはいえ ない。従って、構造と操作が比較的簡単で、磁場勾配が最大限に利用でき、標的 以外の物質の取り込みが少なく、せん断力または他の生物学的実体との衝突によ る固定化標的物質の喪失がなく、標準的なミクロ滴定プレートウェル（小筒）を 利用するなど、実験レベルのさまざまな分離、と（にイムノアッセイや細胞選別 に効果的に利用できる高勾配磁気分離装置と方法が提供できれば理想的である。

発明の概要 本発明の目的は、磁気反応性のコロイド粒子を非磁性の試験媒質から分離するた め、試験媒質中に高勾配磁場を発生できる磁気分離装置と方法を提供することに ある。試験媒質と分かれて沈澱する傾向がある比較的大きなサイズの磁気粒子と は異なり、磁気反応性コロイド粒子は試験媒質中にいつまでも懸濁したまま残る ため、標的物質へ容易に接近することができる。

本発明の磁気分離装置は、少なくとも１つの試験容器と、１つまたはそれ以上の 剛性強磁性素子の形で試験容器内に配置することが望ましい磁場勾配増強手段と 、試験容器の外部に配置して試験容器内の強磁性素子を横切る磁場を発生させる 磁気手段によって構成される。試験容器は帯磁せず、磁気粒子が含まれる試験媒 質を受け入れるための開口部を備えているものが望ましく、目的とする分離を行 うための区画を提供する。

磁場発生手段は、試験容器が入り、発生した磁場とともに作用する強磁性素子を 位置させるための穴または溝を形成する一対の向かい合った磁石によって構成す ることが望ましい。

強磁性素子は、一方または両方の端を容器の外に位置するキャリア（支持体）に 取り付けた剛性磁気ワイヤで構成することができる。細胞分離用のとくに好まし い実施例の場合には、ワイヤの両端をキャリアに取り付け、ワイヤの形状をルー プ状にする。別の実施例では、キャリアを容器に取り付ける環状のキャップまた は蓋とし、キャップの下側に１一本またはそれ以上、できれば複数の剛性磁気ワ イヤを取り付け、使用時にワイヤが容器内に位置するようにする。

別の好ましい実施例では、磁場増強手段が容器内の定められた位置に固定できる ワイヤスクリーンの形をとる。ワイヤスクリーンの形状はどのようなものでも構 わない。スクリーンの好ましい形状としては、両端の口が開いた三角柱状構造や 、やはり両端の口が開いた中空の円柱状構造が挙げられる。

本発明を実行するために利用される磁気粒子の物理的特性、とくにその大きさが 比較的小さいことにより、既知のものではこれまで達成し得なかった水準の利用 効率が実現できる。また、試験媒質に加える磁気粒子の量を磁場増強手段の露出 面積に対して調節し、そのような露出表面が十分に磁場にさらされるようその向 きを調節すれば、磁場増強手段の表面に付着する磁気粒子を実質的に１層とし、 標的物質と結合した磁気粒子の大きさにほぼ相当する厚さとすることができる。

付着磁気粒子による非特異結合物質の取り込みは、事実上、無視して構わない。

？本発明の方法に従って試験媒質の非磁性成分から磁気粒子を分離する際には、 磁気粒子を試験媒質中に拡散させ、試験媒質を安定的な懸濁液にする。磁気粒子 には、試験媒質中の標的物質と特異結合できるレセプタが含まれている。試験媒 質が入った１つまたはそれ以上の容器、レセプター磁気粒子抱合体、および磁場 増強手段を磁気分離装置に配！し、とくに磁場増強手段は試験媒質の中に十分に 浸す。分離装置は容器に外部磁場を印加して試験媒質中に磁場勾配を形成し、そ れによって磁気粒子を磁場増強手段に引き寄せ、そこへ付着させる。ここで非磁 性試験媒質を分離装置から除去すれば、磁気粒子がワイヤに付着したまま残り、 必要に応じて引き続き処理を行うことができる。生物特異的親和反応を伴う分析 を以上のように行えば、標的物質と結び付いた磁気粒子を再び懸濁させる必要が なくなる。従ってこの方法を利用すれば、生物学的分析試験に要する時間と費用 が大幅に節約できる。

また、磁気粒子を構成する遷移金属酸化物のコーティングしていない表面部分に よる非特異結合を抑えることによって本発明の方法を効果的にする合成物を提供 することも本発明の目的である。本発明の合成物は、陰イオン高分子電解質と、 生理的に適合性の担体によって構成される。

上記の概要から明らかな通り、本発明は、標的物質と結合した磁気粒子を試験媒 質から効率的・効果的に分離できる、構造および操作が比較的簡単な分離装置と 方法を提供するものである。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の実施例である磁気分離装置の斜視図で、説明のために装置の一 部を取り壊して示したものであり、 図２は、図１に示した装置を下から見た部分平面図であり、図３は、図１に示し た装置の部分縦断面図であり、図４は、図３の縦断面図と同様の横断面図であり 、図５は、本発明の別の実施例の斜視図であり、図６は、図５に示した本発明の 実施例に用いられる試験媒質容器について示した部分平面図であり、 図７は、図６の７−７線に沿った断面図であり、図８は、毛細管を分離区画とし て利用する本発明のさらに別の実施例の斜視図であり、 図８Ａは、磁場勾配増強手段として内部にワイヤフィラメントを備えた毛細管の 部分拡大断面図である。

これらの図面中の各図において、同じ参照符号は同じ部分を示している。

好適な実施例の説明 以下において、添付の図面に従い、本発明の装置および方法の好適な実施例につ いて詳しく説明する。

本発明の磁気分離装置と方法は、生物特異的親和反応を伴うさまざまな実験的お よび臨床処置においてと（に有用である。このような処置に利用する粒子は、磁 気反応性であると同時にコロイドであり（すなわち、超常磁性でありながら非磁 性の試験媒質中で懸濁し続ける能力があり）、試験媒質中の対象物質に対して結 合能を有するレセプタから構成される。本発明の方法では、レセプタを標的物質 と結合させた後、磁気分離装置を用いた高勾配磁気分離によって試験媒質から磁 気粒子を取り出す。

このような生物特異的親和反応は、生物学的サンプルの検査においてさまざまな 標的物質を測定するために利用されるが、その標的物質は、細胞、細胞成分、細 胞下部集団（真核生物と原核生物の両方）、細菌、寄生生物、抗原、特異抗体か ら、遺伝子分析を行う際のビタミン、ウィルス、特異的核酸塩基配列のような特 異的生体因子まで非常に多岐にわたっている。従って、本発明の磁気分離装置お よび方法は、Ｔ細胞リンパ腫細胞系からＴ細胞、Ｂ細胞リンパ腫細胞系からＢ細 胞、白血球からＣＤ４陽性細胞、白血球からリンパ球といった各種分析のための 細胞選別や細胞の単離に利用することができる。

また、本発明の方法は、単球、顆粒球、およびその他の細胞種の免疫特異的単離 、微量細胞の取り出し、ナチュラルキラー細胞の除去、網状赤血球の測定、好中 球機能などのアッセイや、膜電位変化の測定、酸化バースト分析、食作用アッセ イ、およびオプソニン作用検査にも利用できる。

同様に、本発明の磁気分離装置と方法は細菌または寄生生物の分離にも利用でき 、糞便、尿、汚泥、スラリー、水（地下水や川の水など）からの各種細菌または 寄生生物の分離などがこれに含まれる。さらに本発明は、食品（液体から固体ま で）、痰、および尿中のさまざまな細菌を分離する場合にも利用することができ る。

本発明の実行に適した磁気粒子は、本当のコロイドとして作用する粒子である。

このような粒子は、その大きさがミクロンサイズ以下、通常は約２００ナノメー トル（ｎｍ）（０，２０ミクロン）以下であることと、重力にょる溶液からの分 離に対して長時間の安定性を有することを特徴とする。材料として適したものは 、超常磁性材料の結晶質の中心とそれを取り囲む分子によって構成され、その分 子は磁心に物理的に吸収されるかまたは磁心と共有結合し、粒子に安定的コロイ ド特性を与える。コロイド粒子はサイズ的に非常に小さいため、完全な磁区をも たず、そのブラウンエネルギーは磁気モーメントを上回る。この結果、中程度の 強度の磁場にあってもこれらのコロイド磁気粒子にはＮ極もＳ極も生じず、従っ て粒子が互いに引き合うことも反発することもなく、その溶液は安定的となる。

このため、コロイド磁気粒子は強力な電磁石を用いても溶液がら簡単には分離で きず、個々の粒子を分離するためには粒子が懸濁している試験媒質中に磁場勾配 を発生させる必要がある。

上記のような特性を有する磁気粒子は、米国特許第４．７９５．６９８号の説明 に従って調製できるが、ここではこれを引例として挙げるにとどめ、そのすべて の開示内容について詳しく述べたと同じこととする。

細胞を分離する場合には、通常、血液、尿、痰、分泌物などの適切に調製された 体液から試験媒質を調製する。コロイド磁気粒子は、緩衝液に入れて試験媒質に 加えるのが望ましい。この目的に適合する緩衝液は、５％のウシ血清アルブミン （”ＢＳＡ−と９５％の生体適合性リン酸食塩水の混合液がら構成し、場合によ っては比較的少量のブドウ糖、塩化ナトリウム、および塩化カリウムを加える。

緩衝液はｐＨ約７の等張液とする。緩衝液に含まれるたんぼ（質は、分析の障害 となりがちな各種相互作用を抑える働きをする。標的物質の添加は、磁気粒子を 加える前でも後でも、また同時でも構わない。本発明の方法はコロイド磁気粒子 の拡散制御溶解運動を利用し、この運動は試験媒質を加熱することで高められる 。試験媒質は、その中のレセプタと対象リガンドの結合を促進するため、インキ ュベートするのがふつうである。インキュベートは、通常、室温かまたは試験媒 質の氷点よりやや上の温度（すなわち４℃）て行う。また、通常はインキュベー トを短時間（約１５分）で行う。インキュベート中には試験媒質を撹拌すると、 レセプタとリガントの結合が促進される。

緩衝液の一部を適切な陰イオン高分子電解質と入れ替えると、レセプタと試験媒 質中の標的物質以外の物質との結合（非特異結合）が減少することが分かった。

Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ社（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンンルバニア州 ）からＴａｍｏｌ　８．）Ｏという名称で市販されている抑制因子を利用すると 、満足できる結果が得られる。Ｔａｍｏｌ　８５０は、ポリメタクリル酸水溶液 として販売されており、分子量１２，０００（平均）、総固形分２９−３１％、 濃度９．９　１ｂｓ、／ｇａ１．　（２５６Ｃ）、ブルックフィールド粘度１２ ５−３２５（２５°Ｃ）、スピンドル／速度！２＠６０である。本発明を実行す る際には、リン酸緩衝液に（活性ベースで）約０．１−３％のＴａｍｏｌ　８５ ０を加えると、非特異結合が効果的に減少する。このような緩衝液の成分と非特 異結合を減少させる目的でのその利用も本発明の範囲内に含まれる。

レセプタと対象物質を結合させた後、本発明の装置と方法によって試験媒質から コロイド磁気粒子を磁気分離する。容器に試験媒質を入れて外部から磁場を印加 し、試験媒質中に磁束を発生させる。本発明の好ましい実施例では、磁場勾配を 高めるために試験媒質中に磁気ワイヤを浸し、その磁気ワイヤの表面に磁気粒子 を引き寄せて付着させ、磁気粒子が試験媒質から容易に分離できるようにする。

図１−図４は、本発明による磁気分離装置の実施例について示したものである。

分離装置２１は１２個の容器２３から成る列２６を備えており、各容器へはそれ ぞれ一対のワイヤループ２５が挿入される。各ループの両端はキャリア２９に取 り付けられている。また、この磁気分離装置は、容器の列をはさんで互いに向か い合って位置する一対の対面磁石３１も備えている。

図１に示す通り、試験媒質を入れるために利用する容器は、ここでは上方の口が 開いた円柱状の形をしている。図示した実施例においては、各容器２３はミクロ 滴定ウェル（小筒）であり、１２個のウェルが溶接またはその他の手段によって ２４で互いに連結されて列２６を形成する。本発明の方法だとすべてのウェルが 同時に利用できるため、必要に応じてたくさんの試験媒質から磁気粒子が同時ま たは連続的に分離できる。列２６の連結部２４は、各テストサンプルの処理が行 いやすいよう、必要であれば各ウェルが列から容易に切り離せるように構成する 。列の連結部２４は、実質的にどのような手段によって達成してもよく、切り離 しやすいよう切り込み線またはその他の軟弱部を備えた単体として列を成型して も、切り離し式のコネクタや適切な接着剤を利用しても構わない。また、相互に 連結された容器の列は、磁気分離装置に配置できるものであればいくつの容器か ら構成してもよく、容器が単体であっても毛細管のような成型管であっても構わ ない。

図１−図４の実施例では、磁場勾配増強手段が対になった生卵形のループを形成 するワイヤ２５によって達成されており、各容器にそれぞれ一対ずつが入り、そ の大部分が試験媒質中に沈む。このため、ループ２５を形成するワイヤの両端は 、試験媒質の外部に位置するキャリア２９に固定されている。

この磁気分離装置に用いるワイヤは、強磁性であればどのような材質でも構わな い。ワイヤの直径は標準ゲージワイヤよりも太くてよく、領　８−３．０ｍｍ程 度が望ましい。このようなやや太めのワイヤであれば、磁場に配置したりそこか ら出したり、あるいは磁場中に不均等な領域が存在しても、ワイヤに変形が生じ に（い。また、コロイド磁気粒子が付着する表面積も広くなる。上記のような条 件で用いる場合の本発明の磁気分離装置の長所は、コロイドの量を適切に調節す れば、高磁場勾配の媒質と接触する表面に粒子が均等に付着しやすくなる点にあ る。この結果、磁気粒子は、従来技術の磁気分離装置のように面積の小さなワイ ヤ表面に幾重にも重なって、あるいは塊となって付着するのではなく、面積の広 いワイヤ表面に実質的に単一層で付着する。粒子が事実上一層で付着することに より、不純物またはその他の妨害物質がワイヤ上や標的物質と結合した磁気粒子 の塊中に閉じ込められるという問題が大幅に減少する。このため、試験媒質と接 触する部分のワイヤの大きさは、試験媒質中の磁気粒子がほぼ一層で付着した場 合に要する表面積の約２倍の表面積となるように選択することが望ましい。

図１および図３に示したキャリア２９は、非磁性で透明なものが望ましい。キャ リアはワイヤを定位値に固定し、容器２３の上でカッ＼−の役割りも果たす。キ ャリアの材質はどのようなものでも構わないが、プレキンガラスが望ましい。ま た、ループ状のワイヤの両端を固定するのではなく、ワイヤの一方の端だけをキ ャリアに固定しても構わない。１本またはそれ以上のワイヤは、試験媒質中にそ の大部分が沈むという条件を満たすものであれば、実質的にどのような形をとっ てもよい。ワイヤは１本でも複数のものをより合わせたものても構わないが、隣 接するワイヤの表面には試験媒質の非磁性成分を取り込む可能性がある毛細管、 ポケント、または隙間が形成されないようにする。

図１に示す通り、試験媒質中に磁束を発生させるための手段は、互いに向かい合 った２つの磁石３１によって構成され、その向かい合った磁石の表面によって形 成される溝または穴に容器２３が連なった列２６を配置する。この外部磁気装置 の磁場強度は約４ｋＧ（キロカラス）から約１５ｋＧまでの範囲内とし、とくに ７ｋＧ　８．、：＋ｋＧ程度が望ましい。図１に示した各磁石から容器の列まで の距離は０．５−２．５ｃｍ程度であり、とくに約１ｃｍであることが望ましい 。

外部磁石の磁場強度と磁石３１から試験媒質を入れる容器２３まての距離は、容 器中の磁気ワイヤ２５によって十分な高勾配磁場が達成されるものでなければな らない。ワイヤループ２５の向きは、外部磁石３１の磁場の方向がワイヤの縦軸 を広（横切るようにするのが望ましく、それによって試験媒質中の磁場勾配を最 大限に利用する。

互いに向かい合った磁石３１のそれぞれ一方の面３５は、Ｕ字形支持構造３３の 内側に取り付ける。Ｕ字形支持構造は、基部３７と、基部の両側に平行に取り付 けられた２つの側壁３９によって構成される。基部３７の上、側壁３９の間の間 隙３８は、列２６を操作するための空間を提供する。この間隙３８には、例えば 、列２６を図示した位置に上げて保持する昇降機構（図示せず）を配置する。

キャリア２９は間隙３８に蓋をする働きをし、間隙３８の上方て磁石３１に載せ る横材４０より構成する。横材４０の下面には、向かい合った磁石３１の表面と かみ合い、ループを磁石表面間の溝の中心に位置させる中心合わせプレート４２ を取り付ける。場合によっては中心合わせプレート４２の下面を容器の円柱状の 内壁と合う形にし、列が図３の位置にあるときにはこの下面が容器の蓋になるよ うにする。

図２−図４は、容器内のワイヤループの好ましい形状について示したものである 。ループと容器の内壁は接触しないようにし、ループと内壁の間に標的物質がは まり込むのを防止する。また、各ループ表面の磁気粒子から最も近いループの最 も近い表面の磁気粒子までの距離が最大となるよう、ループ同士およびループと 内壁の間隔は等間隔とするのが望ましい。

図５は、図１の磁気分離装置と同様に、本発明の磁気分離装置の実施例について 示したものである。図５、図６および図７に示した分離装置は、代替磁場増強手 段を含む容器１２３が８個連なった列１２６を利用し、容器の列１２６をはさん で互いに向かい合う磁石１３１を備えている。この実施例では、容器は中空の円 柱状部材が各容器１２３の底を形成する基部１２４に取り付けられたものであり 、この基部は列中の隣接する容器を連結するコネクタの役割も果たす。また、必 要に応じて容器間のこの基部に切り込み線または軟弱線（図示せず）を入れてお けば、各容器を切り離すことができる。各容器には、磁束密度を高めるための磁 気ワイヤスクリーン１４１が配置されている。

スクリーン１４１は、多孔性のソート状部材となるよう強磁性ワイヤで編み込み 、両端の口が開いた中空の三角柱とするのが望ましい。スクリーンはこのような 三角柱状にすると固定しやすいが、両端の口が開いた円柱など、別の形状とする こともできる。各ワイヤスクリーン１４１は、容器１２３内に固定できる大きさ にする。三角柱は、試験媒質の非磁性成分が取り込まれないよう容器１２３の円 柱状の内壁に密着させ、摩擦によって定位値に保持することが望ましい。

ワイヤスクリーンは、磁場がスクリーン中のワイヤをその各縦軸に沿って横切る よう配置する。また、三角柱内部のスペースは、スクリーンを定位値に保ったま ま試験媒質の各種測定（吸光測定）に利用できる。スクリーンの上端と容器の上 端は、容器から試験媒質を除去した後に残る試験媒質の小滴がスクリーンから除 去しやすいよう同じ高さとすることが望ましい。

図６に示す通り、容器１２３の列１２６には、分離装置中で容器を支持するため 分離装置支持構造（図示せず）の溝にはめ込むことができるつまみまたは末端部 １４３を備える。また、容器を磁石１３１の間へ配置したり、そこから出す働き をする昇降装置（図示せず）のプラットフォームに容器を載せることもてきる。

図８は、多くのイムノアッセイを同時に行うのに効果的な分離区画として機能す る毛細管２４１の列を利用する、本発明の磁気分離装置のさらに別の実施例につ いて示したものである。各毛細管の内部には、磁気勾配増強手段として、長さが ｌＱｃｍで直径が０．０２５ｃｍの磁気ワイヤが配置されている。分析のために 管から取り出す試験媒質を集めるため、容器またはウニルが連なった列２２６が 備えである。毛細管は、各容器に正しく位置するようフレーム２４５に取り付け る。適切な供給装置２４８は、標識免疫複合体を形成するために必要なす・〈て の試薬を入れてあらかじめ調製した試験媒質を各毛細管に供給する働きをする。

また、この供給装置は、アッセイに利用するその他の試薬も毛細管に供給する。

ブロック磁石２３１．２３１°は、フレーム２４５の取り付けと取り外しが簡単 にできるよう適切な間隔で配置されている。毛細管２４１内の磁気ワイヤは、外 部から磁場を印加した場合に毛細管中の磁場勾配が高まるよう強磁性であること が望ましい。

図１の磁気分離装置を利用して試験媒質から磁気粒子を分離する場合には、試験 媒質を十分な時間磁場にさらして磁気粒子をループへ向かって移動させ、そこへ 付着させた後、容器の列２６を下へ降ろしてキャリア２９から取り外す。磁気粒 子はループに付着したまま保持されるが、試験媒質の非磁性成分は容器とともに 除去される。続いて、緩衝液、すすぎ液、またはその他の新しい溶液が入った同 じような容器の列を定位置まで上げ、すすぎのためにループを新しい溶液に浸す 。新しい溶液中でループをすすぎ、ループに残留している非磁性成分を洗い落と す。場合によっては、すすぎ液を除去し、液体試薬による処理を繰り返す。分析 しやすくするなどの目的のため液体試薬中に磁気粒子を懸濁させたい場合には、 ループと容器の列を磁場から取り出し、適切な操作を行うと、磁気粒子がワイヤ から離れて液体試薬中に懸濁する。また、液体試薬を入れずに新しい列を収集媒 質として利用することもてきる。

図５に示した磁気分離装置を利用する場合も収集手順は上記と同様である。この 場合には、容器の列１２６を磁場から取り出した後、分離した磁気粒子を各スク リーンから落として容器の底に集める。場合によっては、粒子の処理または分析 が行いやすいよう三角柱状のスクリーンを容器から取り外すこともてきる。

試験媒質を除去した後も磁気勾配増強ワイヤに付着した粒子が保持できることは 非常に有用である。このようにすれば別の再懸濁段階が不要となり、反応混合液 の細胞または標識成分のような標的物質の洗浄やすすぎなど各種の操作が効果的 に行えるようになる。また、ワイヤに粒子が付着していると、標識した免疫反応 性物質と磁気粒子上の標的物質との相互作用を伴う二次反応がもっと効果的に実 行できる。この場合もコロイド磁気粒子の再懸濁が省略できる。さらに、本発明 に従って酵素標識イムノアッセイを行う場合には、固定したコロイド磁気粒子上 で基質をインキュベートするのが望ましい。このようにすれば、−次インキュベ ーション混合液の拡散制御溶解運動特性が効果的に利用できる。これにより、定 量測定などの各種分析が磁気によって固定されたコロイド上で行えるようになる 。このような段階には、非特異結合物質を除去するための洗浄、二次免疫化学反 応、および検出反応（酵素反応、蛍光反応、または化学発光反応など）が含まれ る。

本発明の磁気分離法を流動システムではなく、上記のようなバッチまたは定常シ ステムで実行することにはい（つかの利点がある。標的物質と結合した固定化磁 気粒子は、他の粒子と衝突して移動することがない。また、バッチ操作を行うと 、流動性の試験媒質によって生じるせん断力を原因とする固定化磁気粒子の移動 がなくなる。換言すれば、磁気粒子のワイヤへの付着力が強いため、ワイヤから 磁気粒子をほとんど剥さずに洗浄ができ、二次反応や他の試薬との相互作用を生 じさせることができる。加えて、粒子をさらに反応させる際や粒子の処理を行う 際にワイヤを磁場から取り出しても、磁気粒子のワイヤへの付着力がある程度維 持される。

一般に磁気粒子は、ワイヤを磁場から取り出せば比較的簡単にワイヤから離れる 。磁気粒子をワイヤから離す場合には、ワイヤを調製緩衝液に接触させたり、水 浴音波破砕装置を利用する。磁気粒子はプローブ音波破砕装置でワイヤから剥し ながら集めることもでき、また、振動磁場を利用して強磁性ワイヤを消磁すると 同時に粒子に力を加えることもできる。

ワイヤに付着した粒子の保持能力やワイヤから粒子を除去する能力は、必要に応 じてワイヤ表面をコーティングすることによって大幅に高められる。例えば、磁 気粒子は、透明または無色のアクリルコーティングを施したワイヤよりもコーテ ィングしていないワイヤに付着する傾向がはるかに強い。ワイヤに塗布するとワ イヤの摩擦係数が下がる生物適合性被覆材は、磁気粒子をワイヤからはがれやす くする場合に利用する。

磁束密度を高めるためにワイヤスクリーンを利用する場合には、スクリーンのメ ッシュ構造を、表面張力によってワイヤメツシュの隙間に保持される試験媒質の 非磁性成分をできるだけ抑えつつ、磁力によって磁気粒子が引きつけられるよう に選択する。このような表面張力は、ワイヤスクリーンのコーティングによって 弱めることができる。はとんどの場合は、隙間を埋めず、ワイヤスクリーン素子 の多孔性を減じたり損なったりしないコーティングが望ましい。

以下において、本発明の実行および利用の方法と手順を詳しく説明する実例を挙 げ、本発明を実施するために発明者が意図する最良の形態について詳しく説明す るが、本発明がこれに限定されるものではない。例中の温度は、とくに指示しな い限り、すべて摂氏（’Ｃ）である。

例１ 対になったワイヤループを利用する図１に示したような全体的構造の磁気分離装 置を用いて、試験媒質からコロイド磁気粒子を分離した。米国特許第４，７９５ ．６９８号の例１の手順に従って磁気粒子のバッチを３つ、すなわち非特異性た んばく質でコーティングしたちの１つとそれぞれ特異結合たんばく質でコーティ ングしたちの２つを調製し、後に分離するコロイド／標的物質複合体を形成する 各コロイド粒子と標的物質の結合効率を比較評価した。この実験では、クロム５ １（”ＣＲ５１”）で標識したヒトＴ細胞（ＡＴＣＣ受入番号、ＣＣＬ　１１９ ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）を標的物質とした。これらの細胞の培養に適した条件に関す る情報は、ＡＴＣＣより入手可能である。細胞の標識は、Ｇ、Ｇ、Ｂ、Ｋｌａｕ ｓＳ　Ｌｉｍｐｈｏｃｙｔｅ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｒ リンパ球、実際的アプローチ」、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ　１９８ ７年、１４４ページ）に従って行った。上記の引例に従って細胞を標識し、洗浄 した後、細胞適合性ＰＢＳと０．　１％のアジ化ナトリウムから成るｐＨ７，２ の緩衝液Ａに１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを添加し、約３Ｘ１０’個／ｍｌの割合で 細胞を再懸濁させた（細胞の計数には血球計を利用した）。続いて、ガンマカウ ンタでＣＲ５１標識細胞のアリクウォット（部分標本）をカウントし、細胞数当 たりの毎分カウント（”ｃｐｍ”）を測定した。

磁気粒子のコーティングに用いた非特異性たんばく質はウシ血清アルブミン（” ＢＳＡ’）であり、その懸濁液のＢＳＡ濃度は１ｍｇ／ｍｌであった（コロイド Ｎｏ、１１０５４−１）。特異結合たんばく質でコーティングする１つ目の磁気 粒子は、親和性精製ヤギ抗マウスＦｃ抗体（ＧＡＭＦｃ）でコーティングした（ コロイドＮｏ、０８３１４−１）。コロイドＮｏ、０８３１４−１の抗体濃度は １ｍｇ／ｍ１であった。特異結合たんばく質でコーティングする２つ目の磁気粒 子は、親和性精製ヒツジ抗マウス全分子抗体（ＳＡＭ）でコーティングした（コ ロイドＮｏ、０６０６４−１）。：ｌＯイドＮｏ、０６０６４−１の抗体濃度も １ｍｇ／ｍｌであった。

あらかじめ活性ベースで０．　５％（ｗ／ｖ）のＴａｍｏｌ　８５０を加えてお いた緩？Ｉ７Ｔ液Ａによって、通常はじめは鉄１ｍｇ／ｍｌである非特異性およ び特異結合コロイドを希釈し、鉄０．０２ｍｇ／ｍｌおよびたんばく質（ＢＳＡ またはＧＡＭＦｃまたはＳＡＭ）０．０２ｍｇ／ｍｌにした。

希釈したコロイドＮｏ、１１０５４−１のアリクウォット（１５０μ］）を１２ ｘ７５ｍｍのガラス管４本に入れた。希釈コロイドＮｏ、０８３１４−１と希釈 コロイドＮｏ、０６０６４−１についても同量のアリクウォットを同じサイズの ガラス管それぞれ２本ずつに入れ、アリクウォットの入ったカラス管を全部で８ 本用意した（カラス管１−４にはコロイドＮｏ、１１０５４　Ｌガラス管５と６ にはコロイドＮｏ、０８３１４−１、ガラス管７と８にはコロイドＮｏ、０６０ ６４−１がそれぞれ入っていた）。

続いて、本発明の緩衝液成分２０μｍをカラス管１と２に、単クローン性抗体Ｃ Ｄ４５　１０Ｌｉｂ　ＣＡＴ　０６４６　ロット１（”ＣＤ４５″）２０μＪを ガラス管３−８に添加した。ＣＤ４５は、有効期限が「９０年１１月」と表示さ れているものをＡ　Ｍ　Ａ　Ｃ社免疫工学部（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、メイン州） より入手した。

最後に、各ガラス管１−８に１５０μｍのＣＲ５１標識ヒトＴ細胞を加え、その 混合液を室温で１５分間、さらに４°Ｃで１５分間インキュベートした。室温で １５分間のインキュベート中にガラス管１−８の内容物をガンマカウンタでカウ ントした。このカウント結果が各反応混合液の総ｃｐｍである。

４℃で１５分間インキュベートした後、各ガラス管１−８から試験媒質のアリク ウォット（２５０μｌ）をカラス管と同じ番号がついた互いに連続する別々のミ クロ滴定ウェルへ移した。ガラス管に残った媒質（７０μＩ）のｃｐｍをガンマ カウンタで測定し、その測定結果を上記の総ｃｐｍから減じて２５０μｌの反応 混合液のｃｐｍを算出し、さらにそれを上記のｃｐｍ／細胞数に基づいて各反応 ごとの細胞数に換算した。次に、各ウェル１−８へ一対の磁気金属ループを挿入 した。各ワイヤの両端は、図１に示す通り、プラスチック製のキャリアに固定し た。続いて上記のミクロ滴定ウェルとウェルに挿入するワイヤループを図１に示 すような磁気装置へ配置したが、ここで用いた磁気装置の磁場強度は、ガウスメ ーターのプローブ（探針）を互いに向かい合った磁石の間隙の中心において測定 したところ、８−８．５ｋＧであった。ウェルとワイヤループを磁気装置へ配置 する際には、図３および４に示すように、木製ブロックを用いてミクロ滴定ウェ ルとワイヤループ・キャリアが隣接するように保持した。磁石の作用によってワ イヤループに高勾配磁場が生じ、それによってコロイド粒子が表面に付着した試 験媒質中の細胞がワイヤループに引き寄せられる。

この外部磁場にそのまま１０分間さらした後、ウェル１−８を下へ降ろしてルー プから離し、各ウェルには分離された上澄み液だけが残った。切り離し式の各ウ ェルを切り離して計数管に入れ、ガンマカウンタで各上澄み液の残留ｃｐｍを測 定し、さらにそれを上記のｃｐｍ／細胞数に基づいて上澄み液に残された細胞数 に換算した。これて各反応ごとの細胞数と各上澄み液に含まれる細胞数が分かっ たため、前者（各反応ごとの細胞数）から後者（各上澄み液の細胞数）を減じ、 その差を前者によって割り、１００を乗じて細胞除去率、すなわち細胞が取り除 かれた割合を算出した。

この試験では、ワイヤループ・キャリアからミクロ滴定ウェルを取り外した後、 ループ（および細胞）を磁場においたまま、ワイヤループに固定した細胞に対し て洗浄作業を行った。洗浄は、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを添加した緩衝液Ａを８ 個の新しいミクロ滴定ウェル（１−８と表示）にそれぞれ２５０μｌずつピペッ トで移し、試験１−８のワイヤループの各セントを新しいウェル１−８の緩衝液 が接触する位置にウェルとワイヤループ・キャリアを保持して行った。そのまま の位置で３０秒間待った後、ウェルを磁場から取り出し、それぞれ切り離して上 記のように上澄み液をカウントし、洗浄中に除去された細胞数を測定した。

この実験の結果について示したものが表１である。

ワイヤループで　分離された　分離されたウェル　試験媒質中　分離された細胞 　細胞の割合　細胞の割合番号　の細胞数　（洗浄せず）　（洗浄せず）　（１ 回洗浄）１　３５８．７３１　４６．７２１　１３．０２　１１．２３２　３４ ６、５９７　３９．８８８　１１．５１　１０．５０３　３４８．６１３　４６ ．２７８　１３．２７　１２．０３４　３４９、０３６　５０．８７３　１４． ５８　１３．４８５　３４３、７５５　２７１．３９６　７８．９５　７７、１ ６６　３５０．６４８　２７４．８０２　７８．３７　７７．０３７　３４３、 １５０　１０６．５８２　３１．０６　２８．６８８　３４３、７１５　１１５ ．９３６　３３．７３　３２．０２表１から明らかなように、ウェル５と６では 標的のＣＲ５１標識細胞が７７％以上分離され、試験媒質からコロイド磁気粒子 を取り出す場合の本発明の磁気分離装置と方法の効果、および標的物質に対する このような粒子の結合能の高さを実証する結果が得られた。

（以下余白） 例２ 例１の磁気分離装置を用いて、本発明を実行する際のコロイド粒子とヒトＴ細胞 の非特異結合を減少させるのに適した陰イオン高分子電解質としてのＴａｍ。

Ｉ　８５０の効果を評価した。

本発明に従って、実効負電荷を有するポリマー、たんぼ（質、添加物、洗浄剤、 およびこれらと同様の物質を標準細胞生体適合性緩衝液に加えたものをコロイド 磁気粒子の希釈に用いると、コロイド粒子と細胞の非特異結合が大幅に減少する ことが判明した。コロイド粒子と細胞の非特異結合は、磁気粒子の正に帯電した 部位と細胞表面に残留している負に帯電したシアリン酸との相互作用にその一因 がある。従って、負に帯電した物質を正に帯電した磁気粒子に加えれば、これら の正に帯電した部位がブロック（阻害）され、粒子に大きな負の表面電荷が生じ 、それによって細胞との非特異結合が減少する。この現象を実証するため、コロ イド磁気粒子の希釈に用いる緩衝液に８つの正に帯電した材料（たんばく質２、 ポリマー６）を別々に入れて試験を行ったところ、全（逆の効果が得られ、粒子 と細胞の非特異結合が大幅に増加した。

８本の試験管（番号９−１６）に１５０μｌのＣＲ５１標識ヒトＴ細胞（例１と 同じ細胞だが、濃度は３．２６Ｘ１０’個／ｍ１）を加えた。試験管９には、５ ％（ｗ／　ｖ　）のＢＳＡを添加した緩衝液Ａ（例１で説明したものと同じ）と 細胞の混合液１５０μｌが入っていた。試験管１０には、５％のＢＳＡを添加し た緩衝液Ａで鉄０．０２ｍｇ／ｍｌまで希釈したコロイド０８３１４−１が１５ ０μｍ人っていた。残った試験管には、５％のＢＳＡとそれぞれ順に０．１２５ ．０゜２５．０．５．１．２．４％（Ｗ／Ｖ）のＴａｍｏｌ　８５０を添加した 緩衝液Ａで上記のように希釈した上記コロイドが１５０μｌずつ入っていた。い ずれの試験管についてもコロイドを適切な緩衝液で希釈し、使用前にあらかじめ ブロック作用を生じさせるため室温で３０分間放置した。なお、Ｔａｍｏｌ　８ ５０の濃度はすべて活性物質がベースである。細胞とコロイドが含まれる最終反 応混合液を室温で１５分間インキュベートし、その間にガンマカウンタでそれぞ れのＣＦ３Ｉをカウントして各混合液の細胞数を測定し、撹拌してさらに４°Ｃ で１５分間インキュベートした。

この後、各試験管から試験媒質のアリクウオット（２５０μｍ）を試験管と同じ 番号がついた別々のミクロ滴定ウェルへ移した。例１の場合と同様、２５０μｌ のアリクウォットを取り出した後に各試験管に残った媒質をカンマカウンタでカ ウントした。続いて各ミクロ滴定ウエルヘ一対のワイヤループを挿入し、例１の ようにこれを磁石の間に配置し、分離および分析を行った。ただし、洗浄は行表 ２はこの結果についてまとめたものである。

表７ ワイヤループで　分離された サンプル　試験媒質中　分離された細胞　細胞の割合番号　の細胞数　数　（洗 浄せず） ９　４１０４８７　４８７０　１、１７１０　４０３６５１　３２６００４　８ ０、７６１１　４１１０５５　３２３１３　７、８６１２　４２５７８１　３６ １２６　８、４８１３　４３２７３８　３０３０４　７、００１４　４０６６３ ３　２７３８４　６、７３１５　４２７８７０　４２２５１　９、８７１６　４ ２６５５２　１３８０７３　３２、３７表２から明らかな通り、コロイド磁気粒 子とヒトＴ細胞の非特異結合は、Ｔａｍｏｌ　８５０を約０．１−２％の範囲で 用いた場合に大幅に減少した。Ｔａｍｏ１８５０と同様に機能することが分かつ ている陰イオン高分子電解質にはこのほか、ヘパリン（採血に用いられる抗凝固 薬）　、Ｄａｘａｄ　３０　（Ｔａｍ。

１８５０と同様の陰イオン界面活性剤−Ｗ、Ｒ，Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ、社［ＬｅＸ ｉｎｇｔＯｎ、マサチューセッツ州］製）、ポリウニ・ソト　ＮＤ−２（Ｕｎｉ ｒｏｙａｌ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社［Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｙ、　コネチがソト州］ 製の陰イオン分散剤）、エアロゾル　ＯＳ　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｙａｎａｍ ｉｄＣｏ、社［Ｗ　ａ　ｙ　ｎ　ｅ、ニューシャーシー州］製の陰イオン界面活 性剤）、Ｄ−グルクロン酸（Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ、Ｇ−８６４５）などがあり、こ れらはすべで中性ｐＨ領域では実効負電荷を有するものである。

温 例１の磁気分離装置を用いて、ワイヤループのコーティングによって試験媒質か ら細胞および／またはコロイド磁気粒子を分離する場合の装置の有効性が変化す るかどうかと、分離後にワイヤループから分離細胞を回収する際のこれらコーテ ィングの有効性を評価した。

６本の各試験管（番号１７−２２）中で、例１のＣＲ５１標識ヒトＴ細胞１５０ μｌ　（２，４６Ｘ１０’個／ｍ１）と１５０μｌの上記コロイドＮｏ、０８３ １４−１および２０μＩのリン酸緩衝食塩水（”ＰＢＳ”）を混合した。また、 ６本の別の各試験管（番号２３−２８）中で、上記のＣＲ５１標識ヒトＴ細胞１ ５０μｌと１５０μｌの上記コロイドＮｏ、０８３１４−１および２０μｌのＣ Ｄ４５Ｍａｂ（例１で説明）を混合し、試験管１７−２２とともに室温で１５分 間インキュベートし、その間にガンマカウンタで各試験管をカウントして総ｃｐ ｍを測定し、例１と同様にそこから総細胞数を算出した。これらの試験管１７− ２８については、例１のようにコロイドＮｏ、０８３１４−１を鉄０．０２ｍｇ ／ｍ１まで希釈したが、この実験では緩衝液Ａに１％のＴａｍｏ　Ｉ　８５０　 （ｗ／Ｖ）と５％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）を添加したものを用いた。さらに、試験管 ２３−２８については、細胞と結合させる前に希釈コロイドをＣＤ４５　Ｍａｂ とともに室温で１時間、あらかじめインキュベートした。

この後、各試験管１７−２８から試験媒質のアリクウオ・７ト（２５０μｌ）を 試験管と同じ番号がついた互いに連続する別々のミクロ滴定ウェルへ移した。例 １の場合と同様に、２５０μｌのアリクウオットを取り出した後に各試験管１７ −２８に残った媒質をガンマカウンタでカウントした。続いて各ミクロ滴定ウエ ルヘ一対の磁気金属ループを挿入した。１７．１８．２３．２４のウェルにはコ ーティングしていないループ対を挿入した。１９．２０．２５．２６のウェルに は、透明なアクリルエナメル被覆剤で３回コーティングしたループ対を挿入した 。

また、２１．２２．２７．２８のウェルには、白色のアクリル被覆剤で３回コー ティング（全体的に白くコーティング）した。透明な被覆剤も白色の被覆剤もｒ ＭＡＪＩｃ　スプレー」の商標でＹｅｎｋｉｎ−Ｍａｊｅｓｔｉｃ　Ｐａ１ｎｔ 　Ｃｏｒｐ　社（Ｃｏｌｏｍｂｕｓ、オハイオ州）より発売されているものを利 用した。

ループを挿入したウェルを例１て用いた２つの磁石の間に配置した。ウェル１７ −２８中の試験媒質を室温で１５分間磁場にさらした後、（上澄み液が残った） ウェルを磁場から取り出して切り離し、カンマカウンタでＣＲ５１を測定して上 澄み液中の残留細胞数を算出した。例１と同様に、ワイヤループに固定された細 胞を磁場においたまま洗浄し、その上澄み液をガンマカウンタでカウントしてＣ Ｒ５１を測定した。続いて、試験１７−２８のワイヤループを磁場から取り出し 、１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含む緩衝液Ａが２５０μ】入った新しいミクロ滴定 ウェル（同じ＜１７−２８と表示）に挿入した。ワイヤループのプラスチ・ツク フレームハウ／フグを１分間数回にわたって上下させた後、ミクロ滴定ウェルを 切り離して計数管に入れ、この処理によってワイヤループから除去された細胞数 をガンマカウンタで測定した。

表３ ワイヤル　ワイヤル ワイヤル　−プで分　−ブで分　ワイヤループで分　離された　離された　−プ からサン　試験媒質　離された　細胞の　細胞の　回収されプル　ループ　中の 　細胞数　割合　割合　だ細胞の番号　の表面　細胞数　（洗浄せず）（洗浄せ ず）（１回洗浄）　割合１７　コーティ　２８０．０５４　１７．０９７　６． １０　５．１０　Ｎ、Ｃ。

ングなし １８　同上　２７８．４２７　２１．７９８　７．８３　６．８８　Ｎ、Ｃ。

１９　透明　２７５，５４７　１３．０８３　４．７５　３．７９　Ｎ、Ｃ。

アクリル ２０　同上　２７５．４７７　１３．４５５　４．８８　４．１８　Ｎ、Ｃ。

２１　白色　２７６．４６６　１３．１５８　４．７６　３．８５　Ｎ、Ｃ。

アクリル ２２　同上　２７７．３８５　８．５９１　３．１０　２．４８　Ｎ、Ｃ。

２３　コーティ　２５７．７６１　２００．２５３　７７．６９　７６．４５　 ２０．５０ングなし ２４　同上　２４６．８２７　１９２．０８３　７７．８２　７６．５５　２１ ．２６２５　透明　２５６．９３２　２０１．５１２　７８．４３　７６．９５ 　３８．３１アクリル ２６　同上　２４８．８４２　１９３．６６６　７７．８３　７５．９７　４１ ．９２７　白色　２５１．５９８　１９４．１０３　７７．１５　７５．３５　 ３６．０５アクリル ２８　同上　２４２．１２０　１８９．４１４　７８．２６　７７．０４　３４ ．４７Ｎ、　Ｃ，は、細胞がカウントされなかったことを表わす。

この実験結果をまとめたものが上の表３である。この表３から明らかなように、 コーティングしたワイヤループに保持された細胞は、コーティングしていないワ イヤループに付着した細胞よりもはるかに高い割合で緩衝液に回収された。従っ て、コーティングしたワイヤループの場合には、細胞と結合した磁気粒子がルー プから離れやすい傾向がある。

例４ 上記の例１の磁気分離装置を用いて、コロイド磁気粒子と標的物質、この場合に はヒトＴ細胞を末梢血液単核細胞と全血の両方から分離し、複合的基質から細胞 を分離する際のこの装置と方法の有効性を評価した。この実験では、Ｔ細胞上の ＣＤ４抗原（Ｔヘルパー細胞抗原）をコロイド粒子の標的とした。

親和性精製ヤギ抗マウスＦｃ抗体の濃度を７００μｇ／ｍＬとした以外は例１と 同様にコロイド磁気粒子を調製した。調製したコロイドは鉄１ｍｇ／ｍＬであっ た。このコロイド（コロイドＮｏ、０７０７５−１）を緩衝液で鉄０．２ｍｇ／ ｍＬに希釈した。利用した緩衝液は、緩衝液Ａに５％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）と１％ のＴａｍｏｌ　８．５０（活性ベースでｗ／ｖ）を加えたもので、最終ｐＨは７ ゜２５である。この成分の緩衝液をここでは緩衝液Ｂと呼ぶことにする。コロイ ドは利用する前に少なくとも３０分間放置した。

全血をＢｅｃｔ、ｏｎ　Ｄｉｃｋｅ’ｎ５ｏｎ　ＥＤＴＡ（ｋ３）リキッドバキ ュテナーに入れ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ　１０７７　（Ｓｉｇｍａ　Ｄｉａｇｎ ｏｓｔ　ｉｃｓ、シグマ処理番号１０７７）によって末梢血液単核細胞（ＰＢＭ Ｃ）を単離した。ＰＢＳｉＣをｐ）（７，２の等張ＰＢＳで３回洗浄し、１％の ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含むｐＨ７，２の平衡食塩水（Ｂ　Ｓ　Ｓ）中に再懸濁させ た。また、上記から単離した赤血球を等張ＰＢＳで３回洗浄し、あらかじめ分離 しておいた血漿成分と混合した。ヒトＴ細胞（例１から明らかな通り、これはＣ Ｄ４抗原でもある）をＣＲ５１て標識し、以下のいずれか、すなわち（１）上記 のＰＢＭＣまたは（２）ＰＢＭＣと上記の血漿／赤血球混合液の混合液に加えた 。いずれの場合にも（ウェル２９−４４）　、ＣＲ５’標識Ｔ細胞は、２５０μ ｌの反応溶液がすべて細胞で占められる量に相当する各試験当たり約２００．０ ００個、すなわち１１７．６５μｌ当たりＴ細胞２００．０００個の濃度で利用 した。上記のケースコ（ウェル２９−３６）では１１７．６５μｌ中にＰＢＭＣ が約４００．０００個、ケース２（ウェル３７−４４）では１１７．６５μｍ中 にＰＢＭＣが約４００゜０００個と赤血球が２．９Ｘ１０’個含まれていた。

ウェル２９．３０．３７．３８には１１７．６５μｍの緩衝液Ｂと１４７μｍの ＰＢＳ、さらにウェル２９と３０については上記のケース１の細胞が１１７゜６ ５μｌ、ウェル３７と３８については上記のケース２の細胞が同じ＜１１．７゜ ６５μｍ人っていた。ウェル３１．３２．３９．４０には１１７．６５μｍの上 記コロイドと１４７μｍのＰＢＳ、さらにウェル３１と３２については上記のケ ース１の細胞が１１７．６５μ１１ウエル３９と４０については上記のケース２ の細胞が同じ＜１１７．６５μｍ人っていた。ウェル３３．３４．４１．４２に は１１７．６５μｌの上記コロイドと１４．７μｌの抗ＣＤ４　Ｍａｂ　（Ｇｅ ｎ　Ｔｒａｋ、Ｉｎｃ　社［ＰＩｙｍｏｕｔｈ　Ｍｅｅｔ　ｉｎｇ、ペンシルバ ニア州］、１１００Ａｔ／ｍＬでＰＢＳに溶かした精製１　ｇＧｌ　）　、さら にウェル３３と３４については上記のケース１の細胞が１１７．６５μｍ、ウェ ル４１と４２については上記のケース２の細胞が１１７．６５μｍ入っていた。

ウェル３５．３６．４３．４４には上記コロイド１１７．６５μｌと１００μｇ ／ｍＬの非特異性１ｇＧ、Ｍａｂ　（Ｓｉｇｍａ　ＭＯＰＣ２１、Ｓｉｇｍａ　 Ｎｏ、Ｍ−７８９４を０．　１％のＢＳＡ入りＰＢＳで１００　ｔｔ　ｇ／ｍＬ に希釈）１４．７μｌ、さらにウェル３５と３６については上記のケース１の細 胞が１１７．６５μｍ、ウェル４３と４４については上記のケース２の細胞が１ １７．６５μｍ入っていた。

いずれの場合にも、Ｍａｂは細胞とともにあらかじめ室温で５分間インキユベー トシ、コロイドを加えて２分間インキュベートした後、３分間で分離した。反応 混合液は、例１．２．３と同様の定量分析を行うため、すべて上記の１．３倍の 量を１２Ｘ７５ｍｍのガラス管で混合し、実際の試験にはそのうちの２５０μ１ を用いた。１２ｘ７５ｍｍのガラス管から反応混合液をガラス管と同じ番号のつ いた上記の互いに連続するミクロ滴定ウェルに移した。インキュベート時間が短 いため、総ｃｐｍは、他の試薬を加える前の試験管中に細胞しか入っていないと きに測定した。この実験では、図１に示した磁石構成に、ミクロ滴定ウェルの昇 降によってその磁場への配置やそこからの取り出しが簡単に行えるようプラスチ ック製の昇降装置を取り付けた（この装置を上げると、例１．２．３のように各 ミクロ滴定ウェルが磁場に配置されてその中に一対のワイヤループが入り、分離 後にこれを降ろすと、ワイヤループは磁場中に残り、上澄み液の入ったウェルは 磁場の外へ出る）。この実験ではＨＧＭＳ　（高勾配磁気分離）時間を３分とし た。

表４は、上記の実験結果についてまとめたものである。

表４ ウェル　ウェル中　２５０μｍ　上澄み液の　分離された番号　の細胞本　のｃ ｐｍ　ｃｐｍ　Ｔ細胞の割合２９　Ｔ　＋　Ｐ　６９９４６　６７２００　３． ９２３０　１７７４９４　７４９３８　３．３０３１　”　８４６９７　７９５ ５３　６．０７３２　／／７８３５１　７３７００　５．９４３３　／／６６５ ７４　１２２２３　８１．６４３４　”　６１９２１　１１１７７　８１．９５ ３５　ｌ’　６１７２８　５７９２６　６．１６３６　／’　６９３０９　６４ ８１４　６．４９３７　Ｔ　＋　Ｐ　＋　Ｒ４３１１５４１３４１４，１１３８ ”　４４０９４　４２１５１　４．４１３９　／／６７６７８　６３１０７　６ ．７５４０　／１５７９４５　５４４３１　６．０６４１　ｌ！５８７７４　１ ０５３０　８２．０８４２　７４４４７　１２３３７　８３．４３４３　／／４ ９５７８　４６０５７　７．１０４４　”　７７７６１　７３０６６　６．０４ 本Ｔ＝Ｔ細胞、Ｐ＝ＰＭＢＣ，Ｒ＝赤血球表４のデータが示す通り、本発明の磁 気分離装置と分離方法の利用によって、上記のような複合的混合液からＴ細胞（ とくにＴヘルパー細胞）が高い割合で分離された。分離された細胞の割合をウェ ル２９．３０と３１．３２、およびウェル３７．３８と３９．４０で比較すると 、これらの試験で分離されたＴ細胞の約６０−７０％は磁気粒子なしで分離され たことがわかる。これは、ミクロ滴定ウェルを磁場から取り出した後にワイヤル ープに残る液体中の遊離ＣＲ５１であることが確認された。従って、コロイド粒 子と細胞の非特異結合の割合は、ウェル３１．３２．３９．４０から得られたデ ータよりも実際にはもつと少ない。

また、注目すべきこととして、特異性の抗ＣＤ４　Ｍａｂを非特異性のＭａｂと 入れ替えた場合（ウェル３５．３６．４３．４４）には、分離されたＴ細胞数に （対照と比較して）増加は見られなかった。

氾 ＨＧＭＳによるコロイドの「層化」作用とイムノアッセイでの定量コロイド磁性 材料が表面（例えば磁気勾配増強部材）に均等またはほとんど均等な単一層とし て付着すれば、免疫化学的分析が全く新しい方法で実施できる。

例えば、レセプタ／リガンド反応の後で結合型／遊離型分離を単一ワイヤ入り毛 細管または三角グリッド（格子）装置（例６−９）で行うと、洗浄、酵素／基質 反応、またはその他の免疫化学反応といった分析段階が磁力によって固定された 材料上で直接行えるようになり、磁性材料を再懸濁させる必要がなくなる。上記 のような分析は、この新しい方法を利用することで大幅に簡素化される。これを 可能にするのが、コロイドサイズの粒子によって達成される表面積の大幅増と、 分離に要する媒質の質量の低下である。従って、ここで述べる分析は、大きな粒 子を用いる場合とは全く異なる方法で行われる。以下では、各種所見、理論的計 算、および実験データを挙げ、この方法の原理について説明する。

単一ワイヤ装置での磁力による固定化に関しては、肉眼で見えるコーティングを 形成する量のコロイドを用いると、ＨＧＭＳ理論から予測される通り、磁性材料 は磁極片に面するワイヤ側面、すなわち磁場を横切る面で観察される。三角グリ ッド装置の場合にも同様のコーティングパターンが見られるが、ワイヤ２本分の 厚さがある部分の外面、すなわち２本のワイヤが交差する部分に相当するグリッ ド領域にかなり多くの層が形成される。グリッドについても単一ワイヤの場合と 同様、コロイド材料が多く集まる表面または「スポットは常に磁極片に面し、磁 場を横切っている。グリッドに対しコロイド材料の量をちりと少なくして顕微鏡 で観察すると、固定化のほとんどは２本のワイヤが交差する部分の外面のみで生 じ、他のグリッド表面には見られないことがわかる。また、コロイド材料が集ま る「スポット」は（ワイヤの軸に沿った）長さが幅に対して２倍になる。ここか らそのスポットの表面積が算出できる。長さ１．５ｃｍのワイヤ１６本と長さ１ ｃｍのワイヤ２５本から成る１、５Ｘ１．Ｏｃｍのスクリーンストリップ（条片 ）を用いて三角グリッドを構成した。このようなグリッド１つ当たりの交点の数 は４００　（２５ｘ１６）であり、コロイド材料は磁場を横切る交点の前面と後 面に集まるため、集積「スポット」は全部で８００カ所存在することになる。こ の実験では直径０．０２５ｃｍのワイヤを用いており、「スポット」を０．０２ ５ｃｍｘ０．０５０ｃｍの長方形とみなせば、最初の単一層が形成される集積面 の面積は、５ｏｏｘｏ、０２５ｃｍＸ０．０５０ｃｍ＝１ｃｍ２と算出される。

表５は、上記の三角グリッドと直径８０ｎｍのアビディンコロイドを用いて行っ た実験の結果を示したものである。この実験で用いた磁気コロイドは、前述した 例１のコロイドと同様に調製し、コロイド溶液のアビディン濃度は１５０μｇ／ ｍ１とした。この実験では、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に対する単ク ローンを２つ利用した（Ｍｅｄｉｘ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、カリフォルニア 州）。捕捉単クローンはビオチニル化し、標識ＭＡＲはアルカリホスファターゼ と結合させた。この新しいプロトコールにおける事実上単一のコロイド層形成の 重要性を評価するためご０”および１００ｍＩＵ／ｍＬのｈＣＧ標準液に一定量 の捕捉および標識Ｍａｂと形成されたサンドイッチを捕捉するのに十分な量のア ビディンコロイド（７，５μｇ　Ｆｅ）を入れてインキュベートした。磁力によ って固定されたコロイドを洗浄した後、その固定された材料の酵素活性を直接測 定することによってご０”および１００ｍ１Ｕ／ｍＬの標準液中で捕捉された酵 素を定量した。吸光度は４０５ｎｍで測定した。前述した通り、これらの作業は すべて磁場中で行い、磁性材料は再懸濁させなかった。続いて、Ｍａｂの量は変 えずにアビディンコロイドの量を増やして分析を行った。実験した最低レベル（ ７，５μｇ）のコロイドですべてのサンドイッチが捕捉されたため、コレクタ（ 収集器）の表面容量を越えると分離または磁気固定による層化が生じることにな る。表５は、このような実験の結果と、各実験で用いた異なる量のコロイドが「 単一層」を形成するのに必要な表面積について示したものである。この表面積に 関しては、約８５Ｘ８５ｎｍの面積を占める各コロイド（直径８０ｎｍのコロイ ドと結合する標的物質を考慮）が単一層に「正方形」状に詰まっていると仮定し た。このアビディンサンプルのコロイドと鉄の対応関係は、鉄１μｇに対してコ ロイド粒子が１．８Ｘ１０９個である。表５を見ると、”０”標準液の値は鉄７ ５１１ｇで実験した場合が最低であり、鉄４５μｇではこれが２倍以上に達して いる。］、ＯＯｍＩＵ／ｍＩＪＩ準液の数値は、鉄７．　５ｔｔｇのときの１． ７５からコロイド量が倍になるに従って減少し、最高レベルの実験ではかなり大 きな落差となった。最も好ましい信号値が得られるのは明らかに実験中最低レベ ルのコロイドであるが、各使用量のコロイドが「単一層」を形成するのに要する 表面積の欄に示す通り、この最低レベルのコロイドが必要とする表面積は０．９ ８ｃｍ２である。これは、利用した三角グリッドの推定「第−単一層」形成面積 と非常に近い数値である。

単一層木　ｈＣＧ　標準液［吸光度４０５コμｇＦｅ　表面積（ｃｍ２）　”０ ”標準液　１００　ｍＩｕ標準液７、５　０．９８　０．０６８　１．７５１５ 、０　１．９５　０．０６８　１．５０３０　３．９０　０．１０９　１．２９ ４５　５、８０　０．１５３　１．１８本前述の方法に従って算出 アビディンによって捕捉されるサンドイッチの量はいずれの場合も一定のはずで あり（実験的考察と理論的考察のいずれに基づいても鉄７．５μｇはすべてのビ オチニル化抗体を捕捉するのに十分な量である）、高レベルの捕捉コロイドによ る酵素活性の低下は、「埋没」酵素への基質の接近を妨げる層化と一致する。

同様に、コロイド量の増加に伴う”０”標準液の数値の上昇は、「単一層」実験 条件であれば洗い落とされるはずの酵素標識ＭＡＢが層化によって閉じ込められ ることを表す。また、最高レベルのコロイド使用量から得られた値には、閉じ込 められた酵素−ＭＡＢの影響も含まれると考えられるため、この実験結果は、１ ００ｍＩＵ／ｍＬ標準液の信号値の低下に大きな偏りがあることも示している。

従って、このような閉じ込めがなければ、実験結果はもっと悪くなるものと思わ れる。材料の閉じ込めは無作為に生じるため、磁気コロイドが実質的に単一層を 形成する条件を整えない限り、変動係数はどうしても大きくなる。

図８のようなワイヤ入り毛細管による実験では、長さ１Ｏｃｒｎ、直径０．０２ ５ｃ’ｍの単一ワイヤを用いてコロイドを固定した。このようなワイヤの表面積 は０．８２ｃｍ２であり、磁場を横切ってコロイドの固定に役立つ面積はその約 半分（０，４１ｃｍ２）である。上記のような８０ｎｍの粒子が「正方形」状に 並ぶと仮定すれば、鉄４μｇで単一層が形成される。５０−６００ｍの粒子が抗 体でコーティングされており、６５Ｘ６５ｎｍの「正方形」状に並ぶとすれば、 鉄１．４μｇで単一層が形成される。これとほぼ同じ大きさのコロイドとこの構 成の装置を用い、上記の非再懸濁法によってサンドイッチアッセイを行ったとこ ろ、鉄２μｇ以上を用いた場合に最低レベルと最大効果が明らかになった。

例６ 両端の口が開いた三角柱状の磁気金属スクリーン（グリッド）を有し、その頂点 が各ミクロ滴定ウェルの内をと機能的に接触するよう配置された図５のような構 成の磁気分離装置を用いて分離を行った。利用する三角スクリーンのいくつかに 塗料またはラッカーを塗布し、エストラジオールイムノアッセイを行う場合のコ ーティングの効果を評価した。　コーティングなし、塗料を塗布、およびラッカ ーを塗布した各金属スクリーンを用いて４組の”ゼロ”標準液をアッセイした。

また、塗料を塗布したグリッドを用いて磁場の中と外で基質をインキュベートし た場合の効果を比較した。標準液は、ヒト血清（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｌ ａｂ、、５ａｎｔｅｅ、カリフォルニア州）にＯｏ−３０００ｐ／ｍＬのエスト ラ／オールを入れて調製した。２００μ］の”ゼロ”標準液、適切に希釈した５ ０μｍのアルカリホスファターゼ抱合ニストランオール、およびヤギ抗マウス（ Ｆｃ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ−ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、。

Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ペンノルバニア州）を含む５０μｍのコロイドを混合して 標準反応混合液を調製し、これに免疫特異的な単りローン性抗エストラジオール 抗体を添加した。この実験に用いる磁気コロイドは前述の例１と同様に調製し、 ＧＡＭＦｃおよび鉄濃度はそれぞれＱ、５ｍｇ／ｍｌおよび０．９ｍｇ／ｍｌと した。単クローンは、このコロイド試薬中て最終濃度が１／１０．０００となる ようにした。反応混合液を３７℃で１５分間、試験管中でインキュベートした後 、６．５ｋＧの外部磁場を発生する２個の磁石の間に配置された互いに連続する ８個一組のグリッド入りミクロ滴定ウェルに移した。そのまま３分間の高勾配磁 気分離を行い、その間にすべてのコロイド磁気粒子を磁力によってワイヤスクリ ーンへ引き寄せ、そこへ付着させた。続いて洗浄段階に入り、グリッド入りウェ ルを磁石ごとひっくり返して内容物を出し、吸収紙を重ねたものでウェルをそっ と拭き取った。次にグリッド入りウェルを磁場においたまま各ウェルに洗浄緩衝 液を入れ、上記のように内容物を出して吸収紙で吸い取った。この洗浄処理をも う１度繰り返した。その上で、磁場に配置したままの各グリッド入りウェルに３ ００μｌの酵素基質（２０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスファーテ：　Ｓ　ｉ　 ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を 添加し、３７°Ｃで１５分間インキュベートした。続いて磁場中の各グリッド入 りウェルに５０μｍの停止液（７Ｎ１のＮａ０Ｈ）を加え、各ウェルの内容物を マルチチャンネルピペットで混合した。イムノプレートリーダー（ＮＪ−２００ ０、Ｉｎｔｅｒ−Ｌａｂ、Ｎｅｗｂｕｒｙ　Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）を用 いて各グリッド入りウェル中の酵素産生物の色強度をウェルの中心縦軸（グリッ ドによって形成される三角部分）に沿って４０５ｎｍで測定した。この作業は８ 個一組のグＩルノド入りウェルを磁石から取り出し、適切なミクロ滴定プレート フレームに配置してから行った。コロイドは、上記の測定を行っている間もグリ ッドに付着したままであった。このことから明らかなように、グリッドにはコロ イドを保持するだけの十分な磁場が存在する。

これらの実験についてまとめたのが表６である。この表６から明らかな通り、塗 料またはラッカーを塗布したスクリーンを利用すると、コーティングしていない スクリーンと比較して高い信号値、すなわち高い結合水準が得られる。また、コ ーティングしたスクリーンの変動係数は約１％の低さに抑えることができ、実験 の誤差を最小限にしたり、結果の再現性を高める上でコーティングが効果的であ ることを示している。

コーティングなし　１．３１５　０．０５３　４．１％塗料を塗布　２．０９５ 　０．０５０　２．４％コーティングなし　１．４２６　０．０９０　６．３％ ラッカーを塗布　１．９４４　０．０２３　１．２％磁場中でインキュベート１ ．７１７　０．０５１　３．０％磁場外でインキュベート　２．１０８　０．０ ５３　２．５％ミクロ滴定ウェルに三角柱状の磁気金属スクリーンが入った図５ に示すような磁気分子装置を用いて、”ｈＣＧ”　（ヒト絨毛性ゴナドトロピン ）のサントイ・ソチ型イムノアンセイを行った。標準液は、ヒト血清に０．５． ２５．５０．１００、および５００ｍＩＵ／ｍｌの”　ｈＣＧ″　（Ｓｉｇｍａ 　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、　、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を入れて調製し た。標準液２００μｌ、ビオチン標識捕捉単クローンとアルカリホスファターゼ 標識（Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ、、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、カリ フォルニア州）を含む混合液５０μｌ、および上記の例５のように調製したアビ ディン被覆コロイド５μｍを混合して標準反応混合液を調製した。この反応混合 液を室温で３０分間インキュベートした後、６．５ｋＧの磁場を発生する２個の 磁石の間に配置された互いに連続する８側御組のグリッド入りミクロ滴定ウェル にそれを移した。これ以降の作業は、基質を室温でインキュベートした以外は、 例６と全く同じ手順で行った。各標準液を２つずつ測定し、その結果を表７にま とめた。

（４０５ｎｍ） 氾 磁場勾配増強手段として塗料を塗布した三角スクリーンを備えた例６のような磁 気分離装置を用いて、臨床的に重要な範囲のエストラジオール酵素イムノア・ソ セイについての用量−反応曲線を描いた。例６の場合と同様に、エストラジオー ル標準液はさまざまな濃度（０−４０００ｐｇ／ｍＬ）のものを用いた。２００ μｍの標準液、５０μｍのアルカリホスファターゼ抱合エストラジオール、およ び５０μｍのヤギ抗マウス（Ｆｃ）コロイドを混合して標準反応混合液を調製し 、これに単りローン性抗エストラジオール抗体を添加して免疫特異的に結合させ た。

コロイドは前述の例６と同様に調製した。単クローンは、このコロイド試薬中で 最終濃度が１／１０，０００となるようにした。反応混合液を３７℃で１５分間 、試験管中でインキュベートした後、６．５ｋＧの磁場を発生する２個の磁石の 間に配置された互いに連続する８側御組のグリッド入りミクロ滴定ウェルにそれ を移した。アッセイのこれ以降の作業は、例６と全く同じ手順で行った。各標準 液を２つずつ測定し、得られた結果を表８にまとめた。

表８ エストラジオール　０　３０　５０　１００　３００　１０００　４０００標準 液　ｐｇ、　／ｍｌ。

吸光度　１．８９５　１．７３４　１．６８３　１．６０９　１．４２３　０． ９６７　０．３６（４０５ｎｍ） ”０”標準液については、１０回の反復実験の結果、１．６％の変動係数と＋／ −０，０３０の標準偏差が得られた。

例９ 長さ４インチ、直径０．０１インチの磁気ワイヤが各１本ずつ含まれる８本−組 で容量１００μＩの毛細管を備えた図８に示すような本発明の磁気分離装置の別 の実施例を用いて、サンドイッチ型のイムノアッセイを行った。

この例では、分析物としてマウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）（ＪａｃｋｓｏｎＩ ｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、、Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ペンシルバニ ア州）を用いた。５％のＢＳＡ、リン酸緩衝食塩水、および０．１％のアジ化ナ トリウムにマウスＩｇＧを加え、さまざまな濃度の標準液（０−４０００ｎｇ／ ｍＬ）を調製した。標準反応混合液は、６０μｍの標準液、２０μｍのヤギ抗マ ウス（Ｆａｂ）−アルカリホスファターゼ抱合体（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　ＣｏｍｐａｎｙＳＳｔ、Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、および２０μｍのコロ イド含有親和性精製ヤギ抗マウス（Ｆｃ）抗体を混合することによって調製した 。コロイドは上記の例１と同様に調製した。この反応混合液を室温で３０分間イ ンキュベートした後、注射型ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ。

５ｏｕｔｈ　Ｎａｔｉｃｋ、マサチューセッツ州）によって毛細管へ移した。こ の毛細管を８ｋＧの磁場に配置し、２分間の磁気分離を行った。磁気分離中には すべてのコロイド磁気粒子が磁力によってワイヤ表面に引き寄せられ、そこへ付 着した。次に３９０μｍの緩衝液を毛細管に流し込み、その中を洗浄した。続い て１３０μｌの酵素基質（２０ｍＭのｐ−ニトロフェニルフォスフアーチ）を毛 細管内へ送り込んだ。磁場で５分間インキュベートした後、停止液（６ＭのＨ２ ＳＯ４）が入ったミクロ滴定ウェルに酵素産生物を移し、イムノプレートリーダ ーで４０５ｎｍの吸光度を記録した。三角グリッド入りウェルを用いた場合と同 様、このアッセイの上記の作業、すなわちワイヤに固定されたコロイドの洗浄、 基質の添加、および基質のインキュベートは、（磁性材料を再懸濁させずに）磁 場に配置した毛細管内で行った。

各標準液を２つずつ測定し、得られた結果を表９にまとめた。

表９ マウスＩｇＧ　０　６２．５　１２５　２５０　５００　１０００　２０００　 ４０００表９のデータから明らかな通り、試験媒質中の標的物質の濃度が上昇す ると、それに対応して吸光度の読み値も上昇する。

上記において好適な実施例をいくつか挙げて本発明のさまざまな態様について説 明したが、技術に精通した者にとってほかにもさまざまな実施例が考えられるこ とは明白である。従って、本発明はとくに説明および例示した実施例に限定され るものではなく、本発明の精神に反することなく変更および修正が可能であり、 添付の請求の範囲で述べることのすべてが本発明の範囲である。

ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、６ 国際調査報告 □１−−−−１■ゴ／１ｌｓ９１１０６２６５フロントページの続き （７２）発明者　フィーリ−、ブライアン・ピーアメリカ合衆国、ペンシルベニ ア州 １８０４２、イーストン、パナクック・アベニュー　４５６５ （７２）発明者　ゴーエル、ダーネッシュ・アイアメリカ合衆国、ペンシルベニ ア州 １９１４４、フィラデルフィア、ウェスト・ハーヴエイ・ストリート６００

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．磁気粒子が懸濁している非磁性試験媒質から前記磁気粒子を分離するために 用いられる磁気分離装置において、 ａ）前記試験媒質を受け入れるための開口部を有し、分離区画を形成する非磁性 容器と、 ｂ）磁場の印加によって試験媒質中に発生する磁場勾配を増強するために容器内 および実質的に前記試験媒質中に配置された１本またはそれ以上の磁気ワイヤと 、前記分離区画の外側で前記ワイヤを支持するキャリア（支持体）と、ｃ）試験 媒質中の磁気粒子に作用する磁場勾配を発生させるために前記ワイヤの縦軸を横 切る磁場を印加し、帯磁したワイヤに前記磁気粒子を引き寄せ、そのような粒子 をワイヤヘ付着させるための磁気手段と、から構成されることを特徴とする磁気 分離装置。 ２．前記容器内に配置する前記磁気ワイヤが、４−１５ｋＧ（キロガウス）の磁 場へ配置する際またはそこから取り出す際に変形しないだけの十分な剛性を有し ていることを特徴とする、請求項１記載の磁気分離装置。 ３．前記１本またはそれ以上の磁気ワイヤの直径が約０．８ｍｍから約３．０ｍ ｍまでの範囲内であることを特徴とする、請求項１記載の磁気分離装置。 ４．前記非磁性容器がミクロ滴定ウェル（小筒）から構成されることを特徴とす る、請求項１記載の磁気分離装置。 ５．前記非磁性容器が毛細管から構成されることを特徴とする、請求項１記載の 磁気分離装置。 ６．前記ワイヤの表面から前記粒子を除去しやすくする被覆材で前記ワイヤがコ ーティングされていることを特徴とする、請求項１記載の磁気分離装置。 ７．前記ワイヤが、前記キャリアに端が固定された半ループ状の形状であること を特徴とする、請求項１記載の磁気分離装置。 ８．前記ワイヤが、前記キャリアに端が固定された２本のほぼ平行な半ループ状 の形状であることを特徴とする、請求項１記載の磁気分離装置。 ９．磁気手段が互いに向かい合った磁石から構成され、また、キャリアが非磁性 であり、その向かい合った磁石上に配置できる形状であることを特徴とする、請 求項８記載の磁気分離装置。 １０．前記互いに向かい合った磁石が約７．０−８．５ｋＧの磁場を発生させる ことを特徴とする、請求項９記載の磁気分離装置。 １１．磁気粒子が懸濁している非磁性試験媒質から前記磁気粒子を分離するため に用いられる磁気分離装置において、 ａ）試験媒質が受け入れられるよう上方の口が開いた非磁性容器と、ｂ）容器内 の定位置に保持される大きさの、内部が中空で両端の口が開いた三角柱状に形成 されているワイヤスクリーンと、ｃ）試験媒質中の磁気粒子に作用する磁場勾配 を発生させるために前記ワイヤスクリーンのワイヤの縦軸を実質的に横切る磁場 を印加し、帯磁したスクリーンに前記磁気粒子を引き寄せ、そのような粒子をス クリーンへ付着させるための磁気手段と、から構成されることを特徴とする磁気 分離装置。 １２．容器がスクリーンを保持する容器から試験媒質を除去した後も帯磁したス クリーンに付着したまま残る磁気粒子を集めるための粒子コレクタ（収集器）か らも構成されており、前記粒子がスクリーンから分離しやすく、前記粒子コレク タで集めやすいよう調製されていることを特徴とする、請求項１１記載の磁気分 離装置。 １３．スクリーンの表面から粒子を除去しやすくする被覆材でスクリーンがコー ティングされていることを特徴とする、請求項１２記載の磁気分離装置。 １４．磁場を印加するための磁気手段が、ワイヤスクリーンを保持する非磁性容 器をはさんで両側に位置する互いに向かい合った磁石から構成されることを特徴 とする、請求項１１記載の磁気分離装置。 １５．前記互いに向かい合った磁石が約７．０−８．５ｋＧの磁場を発生させる ことを特徴とする、請求項１４記載の磁気分離装置。 １６．磁気粒子が懸濁している非磁性試験媒質から前記磁気粒子を分離するため に用いられる磁気分離装置において、 ａ）前記試験媒質を受け入れるための開口部をそれぞれ有する毛細管の列と、ｂ ）毛細管内に配置され、実質的に前記試験媒質と接触する１本またはそれ以上の 磁気ワイヤと、 ｃ）試験媒質中の磁気粒子に作用する磁場勾配を発生させるために前記ワイヤの 縦軸を実質的に横切る磁場を印加し、帯磁したワイヤに前記磁気粒子を引き寄せ 、そのような粒子をワイヤヘ付着させるための磁気手段と、から構成されること を特徴とする磁気分離装置。 １７．磁気粒子が懸濁している非磁性試験媒質から前記磁気粒子を分離するため に用いられる磁気分離装置において、 ａ）試験媒質が受け入れられるようそれぞれ上方の口が開いた非磁性ミクロ滴定 ウェルが互いに連結されている列と、ｂ）実質的に各ミクロ滴定ウェル内に配置 され、前記試験媒質と接触できる１本またはそれ以上の磁気ワイヤと、 ｃ）試験媒質中の磁気粒子に作用する磁場勾配を発生させるために前記ワイヤの 縦軸を横切る磁場を印加し、帯磁したワイヤに前記磁気粒子を引き寄せ、そのよ うな粒子をワイヤヘ付着させるための磁気手段と、から構成されることを特徴と する磁気分離装置。 １８．前記ワイヤが端部を有する半ループ状の形状をしており、前記端部がホル ダに固定され、前記ループが前記ウェル内に位置することを特徴とする、請求項 １７記載の磁気分離装置。 １９．前記ワイヤが、中空で両端の口が開いた形状のワイヤスクリーンとして形 成され、容器内の定位置に固定されていることを特徴とする、請求項１７記載の 磁気分離装置。 ２０．前記ワイヤスクリーンが三角柱状の形状をしていることを特徴とする、請 求項１９記載の磁気分離装置。 ２１．分離装置が試験媒質を入れた容器をワイヤから離した後も帯磁したワイヤ に付着したまま残る磁気粒子を集めるための粒子コレクタからも構成されており 、前記粒子がワイヤから分離しやすく、前記粒子コレクタで集めやすいよう調製 されていることを特徴とする、請求項１記載の磁気分離装置。 ２２．上方の口が開いた容器と、容器内に位置して一定の露出表面積を有する磁 気ワイヤ手段と、磁気やワイヤ手段を帯磁させるための磁気手段から構成される 磁気分離装置で非磁性試験媒質から標的物質を磁気分離するための方法において 、ａ）前記標的物質に対して特異結合能を有するレセプタから構成される一定量 の磁気粒子を前記レセプタと前記標的物質の結合が生じる条件で前記試験媒質と 接触させ、標的物質と結合した磁気粒子を形成すること、ｂ）前記磁気ワイヤ手 段を保持する前記容器へ前記磁気粒子が懸濁している前記試験媒質を入れること 、 ｃ）前記磁気ワイヤ手段を保持する前記容器とその中の磁気粒子が懸濁している 試験媒質とを前記磁気手段の近くに配置し、試験媒質中の磁気粒子に作用する磁 場勾配を試験媒質中に発生させることにより、前記磁気粒子を帯磁したワイヤの 露出面に引き寄せ、そのような粒子を前記露出面に付着させること、およびｄ） 磁気粒子が前記標的物質結合磁気粒子の大きさにほぼ相当する厚さの事実上単一 層として表面に付著するよう、前記ワイヤ手段の露出面積に対して容器へ入れる 磁気粒子の量と前記露出面の向きを調節すること、の各段階から構成されること を特徴とする磁気分離方法。 ２３．容器から非磁性試験媒質を取り除く間も磁気粒子を前記容器内の磁気ワイ ヤ手段に付着させたまま保持する段階が含まれる、請求項２２記載の方法。 ２４．磁気粒子と磁気ワイヤ手段から残留試験媒質を除去するため磁気ワイヤ手 段に付着している磁気粒子を洗浄する段階が含まれる、請求項２３記載の方法。 ２５．磁気粒子が付着した磁気ワイヤ手段を容器から取り出し、磁気ワイヤ手段 を再懸濁媒質に浸し、前記磁気ワイヤ手段から前記再懸濁媒質中に前記磁気粒子 を再懸濁させる段階が含まれる、請求項２４記載の方法。 ２６．標的物質が含まれていると思われる試験媒質中の前記標的物質を測定する ための方法において、 ａ）前記標的物質に対して特異結合能を有するレセプタから構成される、あるい は構成されるよう調製した一定量のコロイド磁気粒子を前記標的物質と前記レセ プタの結合が生じる条件で前記試験媒質と接触させ、標的物質と結合した磁気粒 子を形成すること、 ｂ）磁場が印加される線条材料から成る磁場勾配増強手段を備えた分離区画へ試 験媒質を入れ、それによって前記磁気粒子を前記線条材料へ付着させること、ｃ ）前記分離区画から前記試験媒質を除去すること、ｄ）妨害物質を除去するため に前記磁気粒子を前記線条材料に付着させたまま処理すること、および ｅ）前記磁気粒子または前記除去試験媒質の分析によって標的物質を測定するこ と、の各段階から構成されることを特徴とする測定方法。 ２７．前記線条材料が、前記分離区画内に配置され、４−１５ｋＧの磁場へ配置 する際またはそこから取り出す際に変形しないだけの十分な剛性を有する少なく とも１本の強磁性ワイヤから構成されていることを特徴とする、請求項２６記載 の方法。 ２８．前記ワイヤの直径が約０．８ｍｍから約３ｍｍまでの範囲内であることを 特徴とする、請求項２７記載の方法。 ２９．磁気粒子が前記標的物質結合磁気粒子の大きさにほぼ相当する厚さの事実 上単一層として表面に付着するよう、前記線条材料の露出面積に対する前記磁気 粒子の量と前記露出面の向きを調節することを特徴とする、請求項２６記載の方 法。 ３０．前記磁気粒子を再懸濁させる必要に応じ、利用可能な配位部位を有する生 物機能的ポリマー（重合体）によって実質的に周囲が囲まれた遷移金属酸化物か ら前記磁気粒子が構成されていることを特徴とする、請求項２６記載の方法。 ３１．前記遷移金属酸化物が磁鉄鉱であり、前記生物機能的ポリマーがたんぱく 質またはたんばく質と結合できるポリマーであることを特徴とする、請求項３０ 記載の方法。 ３２．前記磁気粒子を再懸濁させずに行われることを特徴とする、請求項２６記 載の方法。 ３３．バッチ方式で行われることを特徴とする、請求項２６記載の方法。 ３４．前記標的物質を検出する際に磁気粒子とともにあるいは前記除去試験媒質 中でその存在が検出可能な標識が前記試験媒質中に含まれていることを特徴とす る、請求項２６記載の方法。 ３５．前記標的物質のためのエンザイムリンクド（酵素結合）レセプタが前記試 験媒質に含まれていることを特徴とする、請求項３４記載の方法。 ３６．前記標的物質の測定が、検出可能な色を生じる色素形成物質と接触させる ことによって前記酵素の活性を検出することと、前記色の発生または相対的濃度 を基準との対照によって検出することから構成されることを特徴とする、請求項 ３５記載の方法。 ３７．前記酵素の活性を前記線条材料に付着した前記磁気粒子によって検出する ことを特徴とする、請求項３６記載の方法。 ３８．免疫反応性リガンドが含まれていると思われるテストサンプル中の前記リ ガンドを測定するための方法において、ａ）前記リガンドに対する第１のレセプ タと前記リガンドに対する第２のエンザイムリンクドレセプタから構成される、 あるいは構成されるよう調製した一定量のコロイド磁気粒子を前記レセプタと前 記リガンドの結合が生じる条件で前記テストサンプルと接触させ、酵素および標 的物質と結合した磁気粒子を形成すること、 ｂ）４−１５ｋＧの磁場へ配置する際またはそこから取り出す際に変形しないだ けの十分な剛性を有し、磁場が印加される強磁性ワイヤを内部に少なくとも１本 備えた分離区画へ前記テストサンプルを入れ、それによって前記磁気粒子に作用 する磁場勾配を発生させ、前記粒子を前記ワイヤヘ付着させること、ｃ）非結合 物質を除去するために前記磁気粒子を洗浄すること、ｄ）前記テストサンプル中 の前記リガンドの存在または量を調べるために前記粒子と結合した前記酵素の活 性を測定すること。の各段階より構成されることを特徴とする測定方法。 ３９．前記リガンドが抗原であり、前記第１および第２レセプタが前記抗原と特 異的に相互作用可能な抗体であることを特徴とする、請求項３８記載の方法。 ４０．前記抗原が細胞表面抗原であることを特徴とする、請求項３９記載の方法 。 ４１．前記リガンドの測定が、検出可能な色を生じる色素形成物質と前記酵素を 接触させることと、前記色の発生または相対的濃度を基準との対照によって検出 することから構成されることを特徴とする、請求項３８記載の方法。 ４２．前記酵素の活性を前記線条材料に付着した前記磁気粒子によって検出する ことを特徴とする、請求項４１記載の方法。 ４３．磁気粒子が前記標的物質結合磁気粒子の大きさにほぼ相当する厚さの事実 上単一層として表面に付着するよう、前記線条材料の露出面積に対する前記磁気 粒子の量と前記露出面の向きを調節することを特徴とする、請求項３８記載の方 法。 ４４．陰イオン高分子電解質と生理的適合性担体から構成される、遷移金属酸化 物粒子と細胞の非特異結合を抑制するための組成物。 ４５．重量で約０．１−約３．０％の前記陰イオン高分子電解質と約９７％−約 ９９．９％の前記担体から構成されることを特徴とする、請求項４４記載の組成 物。 ４６．前記陰イオン高分子電解質が分子量１２，０００のポリメタクリル酸であ ることを特徴とする、請求項４５記載の組成物。 ４７．前記担体が生理的緩衝液であることを特徴とする、請求項４５記載の組成 物。