TW201311907A - 使用循環內皮細胞的基因診斷 - Google Patents
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Abstract
循環內皮細胞係從病患血液中單離,然後分析該細胞的基因表現,以便評估醫療狀況或該細胞的來源組織。亦提供執行該方法適用的套件。
Description
循環內皮細胞係從病患血液中單離,然後分析該細胞的基因表現,以便評估醫療狀況或該細胞的來源組織。亦提供執行該方法適用的套件。
循環內皮細胞(CEC)在健康人體內的出現數量低,但在多種人類疾病,包括心血管疾病和癌症患者體內已經觀察到其數量增加現象。CEC的特徵將有助於瞭解和監測這些疾病和其他狀況。CEC係可採用各種技術,包括以CD 146抗體和磁分離進行的抗體擷取以及流式細胞儀和其他方式,而將其從外周血液中單離出來。不幸的是,CEC分離和分析因受到白血球大量存在而變得複雜。對CEC識別有幫助的是讓其與重要因子,例如其原始組織有關聯,提供一個基礎進一步對其進行分析,並根據該分析提供相關的醫療訊息。
在本發明一態樣中,CEC係單離的,然後分析CEC基因表現以便評估醫療病症。較佳地,基因表現係採用微陣列分析或例如反轉錄PCR(RTPCR)的放大和識別方法進行。
在本發明另一態樣中,從130個特異基因之族群中選出在外周血液單核細胞(PBMC)中表現低,而在血
管內皮細胞中表現高的基因,然後將該基因裝配成CEC標記。
在本發明又另一態樣中,基因為基礎的CEC標記為與以下一個或多個相關者:細胞運動、細胞遷移、血管生成或細胞附著。較佳是這類標記相對於其他細胞為過度表現。
在本發明又一進一步態樣中,基因為基礎的標記視不同血管類型有不同表現,而能夠識別所擷取CEC的原始血管或組織。較佳為,該標記係從67個基因中選出在CEC上相對於其他細胞為過度表現者。
在本發明又一進一步態樣中,細胞擷取係用來獲得基因表現分析用的CEC。較佳為,利用免疫磁性法進行擷取,然後透過分析提供醫療評估,例如疾病或狀況診斷、預測或預後。
在本發明又一進一步態樣中,提供有CEC分析套件。較佳為,該套件包括CEC基因表現識別和分析用的試劑。此外,該套件可含有單離CEC用的擷取試劑。該套件又可包括機械碼實施例,其中該機械碼實施例將訊息和演算法應用至CEC單離和/或分析實施期間所產生的訊息上,因而產生或促進醫療評估。
本發明提供將內皮細胞快速有效率地從生物樣品中單離和鑑定的組成、方法和套件。該方法描述血液
樣品中CEC的單離和鑑定,同時將非特異性鍵結或截留的細胞選擇性降至最低。
雖然單離、濃縮和分析血液中CEC適用的任何有效機制,係可用來擷取和濃縮分析用的CEC,但是其收集的較佳方法是結合免疫磁性法濃縮技術和免疫螢光標示技術,再搭配適當的分析平台而成。相關測試具有靈敏度和特異性,以檢測全血樣品中的該等稀有細胞,並利用這些稀有細胞進行疾病和狀況的臨床過程分析,以及包括預測和預後之許多相同態樣的相關評估。
較佳實施例中所使用的擷取和分離技術係已廣泛用於分析循環腫瘤細胞(CTC),藉由使用例如一種工具探究癌症患者外周循環中的上皮原始細胞的顯著性而完成。這項技術係如美國專利第6,365,362號和美國專利第6,645,731中所述。使用這種技術的「CellSearch」系統(新澤西州力登的Veridex公司)是一種根據從血液單離之細胞的螢光顯微鏡術之自動系統。這在擷取和單離CEC也是已知的用途。該系統包含一整合的電腦控制螢光顯微鏡和配有磁軛套件的自動化平台,其中該磁軛套件將持有一拋棄式樣品盒。該磁軛係設計成能讓磁性液體所標示的候選稀有細胞位於樣品室內,以對進行樣品盒上方觀測表面進行局部磁化,便於顯微鏡下觀看。軟體會檢測出抗體所標示且含有來自血液中之內皮細胞的細胞。在一較佳實施例中,例
如「CellSave」細胞防腐劑的一種防腐劑,係用在7.5毫升全血中來單離出有興趣的細胞。添加細胞特異性磁性粒子後,較佳為培養約20分鐘。CellSave防腐劑係可設置在例如血液樣品收集的管內,或可作為本發明套件其中一部分。磁分離後,鍵結到免疫磁性連結抗體的細胞係受到磁性而貼附於管壁。接著抽吸出未鍵結的樣品,然後添加等張溶液來再懸浮樣品。讓一種核酸染料、對應於指定標記的單株抗體和CD 45(一種寬光譜白血球標記)連同樣品一起培養。磁分離後,再度抽吸出未鍵結的部份,讓鍵結和標示細胞再懸浮在0.2毫升等張溶液中。讓該樣品懸浮在一細胞展示室中並放置於磁場設備內,其中該磁場設備內的磁場會讓該磁性標示細胞定向成符合CellSearch系統中螢光顯微檢查。採用系統所列舉的對照細胞,和呈現給操作者進行清單列舉以識別這類態樣之形態的候選目標細胞,即可自動識別出細胞。接著即可讓擷取的細胞進行本發明基因為基礎的分析。
進行CEC單離所適用試劑中所包括的較佳磁性粒子為表現成膠體的粒子。這種粒子特點為次微米的粒子大小、這通常為小於約200奈米(0.20微米),和從溶液中重力分離出後維持長時間的穩定性。除許多其他優勢以外,還有,此大小範圍使其在細胞分析所運用的分析技術中幾乎是觀察不到。在90-150 nm範圍內且具有介於70-90%磁質量的粒子,亦被預期可用於
本發明。適合的磁性粒子是由被分子圍著的超順磁性材料之一結晶核心組成,該等分子係被結合,例如被物理吸附或被共價連接至磁心且給予安定膠態性質。塗層材料較佳係應施作達一個數量,才得以有效避免樣品中所發現的生物大分子和磁性核心間發生非特異性相互作用。這種生物大分子可包括例如非目標細胞表面上之唾液酸殘留的碳水化合物、凝集素、醣蛋白和其他膜成分。此外,該材料每奈米粒子應盡可能包含越高的磁性質量。包含核心之磁性結晶的大小為足夠小到不含有一完整的磁域。奈米粒子的尺寸小到足以使其布朗能量超過其磁矩。因此,北極、南極對準以及接著發生之這些膠態磁性粒子的相互吸引/排斥,看來並不像是有發生,即使是在影響其等之溶液安定性之適度的強磁埸中。最後,磁性粒子應該可以在高磁力梯度外場分離器中分離。該特性有助於試樣處理且提供比裝滿鐵磁珠或鋼絲絨的更複雜內梯度管柱更好的經濟優勢。具有上述性質的磁性粒子係可藉由美國專利第4,795,698、5,597,531和5,698,271號中所述之基底材料修正例製成。
免疫磁性樣品的製備,對於減少樣品量和獲得104倍濃縮後目標細胞而言非常重要。本發明較佳套件中所使用的試劑包括:對應於泛白血球抗原CD 45以識別白血球(非目標細胞)的一抗體;能夠排除殘餘紅血球細胞、血小板和其他無核物件的一細胞類型特異
或核酸染料;用在對應於目標細胞結構的一生物特異試劑或抗體,或針對目標膜具有特異性,與用來免疫磁性選擇細胞不同的一抗體。
形態分析係可在各種分析平台上進行,包括例如CELLSPOTTER系統,它是一種採用人工細胞觀測之顯微鏡檢測器的一磁性細胞固定化和分析系統,分別如美國專利第5,876,593、5,985,153和6,136,182號中所述。上述美國專利申請案整體以引用方式併入本文,作為揭露手動或自動定量和定性細胞分析適用的各自儀器和方法。其他分析平台包括但不限於雷射掃描儀(Compucyte)、亮場基成像分析(Chromavision)和毛細管容積法(Biometric Imaging)。
本發明套件較佳包括或係可結合具有試劑的套件使用,以進行所獲得之細胞(CEC)的分子分析。這些包括有助於確定相關細胞之基因表現模式之方法的試劑,以及有助於確定基因表現之蛋白基底之方法的試劑,其中蛋白基底之方法包括有反轉錄PCR(RT-PCR)、競爭性RT-PCR、即時RT-PCR、差異顯示RT-PCR、北方墨點分析和其他相關測試。雖然可能採用個別PCR反應進行這些技術,但是最好是放大從訊息核糖核甘酸(mRNA)所產生的互補去氧核醣核酸(cDNA)或互補核糖核甘酸(cRNA),然後透過微陣列分析。其生產適用的一些不同陣列配置和方法為熟悉該項技術領域者所知,且如下美國專利所述:5,445,934;
5,532,128;5,556,752;5,242,974;5,384,261;5,405,783;5,412,087;5,424,186;5,429,807;5,436,327;5,472,672;5,527,681;5,529,756;5,545,531;5,554,501;5,561,071;5,571,639;5,593,839;5,599,695;5,624,711;5,658,734;和5,700,637;其揭露內容以引用方式併入本文。
微陣列技術能夠同時測量數千個基因的穩定狀態mRNA水平,藉此展現出一種強大工具來識別如細胞增殖失控之開始、遏止或調節的效應。有兩種微陣列技術為目前廣泛使用。第一種是cDNA陣列,第二種則是寡核苷酸陣列。雖然在這些晶片結構中有差異存在,不過基本上所有下游的數據分析和輸出係相同。這些分析的產出通常是用來檢測來自樣品之cDNA序列的標示探針所接收到之信號強度的測量值,其中該樣品會在微陣列上一個已知位置處的核酸序列混合。通常,該信號強度正比於cDNA數量和因而在樣品細胞所表現的mRNA。有大量這種技術可用且有幫助。確定基因表現適用的較佳方法係可發現於美國專利案Linsley等人的第6,271,002號;Friend等人的第6,218,122號;Peck等人的第6,218,114號;和Wang等人的第6,004,755號,各個揭露以引用方式併入本文。進行這些程序適用的成分和試劑係可包括在本發明的套件內。
在本發明最佳實施例中,收集病患的血液,然後使用免疫磁性擷取技術、例如在CellSearch系統中來單離CEC。接著讓CEC接受單獨分析,例如搭配RT-PCR或DNA微陣列使用。基因表現模式係依照模式識別確定和處理,其為要提供給臨床醫生和/或病人的指示性疾病診斷、預測或預後。各種基因或其表現受檢測的基因為基礎之標記的表現,與例如有沒有疾病、疾病過程或發展、染上疾病或病症的可能性以及其他預測和預後判斷之身體狀況,兩者間係可得出相關性。模式識別軟體係可用來執行這些相關性,並表明相關性是否存在。電腦指令包括用來比對檢定結果和相關表現模式,和用來提供醫療評估或在提供醫療評估時有用訊息的執行碼,該電腦指令係可以DVD形式、隨身碟或任何其他方便形式而納入本發明該套件內。
在以下實例中,針對來自9個解剖位置之18個內皮細胞樣品的基因表現譜進行分析。針對在內皮細胞中呈現高表現,但在PBMC中則否的一組130個基因為基礎的標記進行識別。亦針對從CellSearch系統所濃縮之內皮細胞的這些標記進行檢測。基因為基礎的標記係很容易藉由內皮細胞所崁釘之血液樣品中的QRT-PCR進行檢測。此外,針對取自不同血管類型之
內皮細胞中表現不同的一組67個標記進行識別,其中這些標記係可用來檢測欲分析的CEC來源。
凍存的HAEC(人類主動脈內皮細胞)、HUVEC(人類臍靜脈內皮細胞)、HPAEC(人類肺動脈內皮細胞)、HMVEC-ad(人類微血管內皮細胞,成人真皮層)和HASMC(人類動脈平滑肌細胞)係從Invitrogen(加州卡爾斯巴德的Invitrogen公司)取得,而凍存的HCAEC(人類冠狀動脈內皮細胞)、HUAEC(人類臍動脈內皮細胞)、HIAEC(人類髂動脈內皮細胞)、HMVEC-C(人類心臟微血管內皮細胞)細胞則係從Lonza(德國科隆的Lonza公司)取得。凍存的HSaVEC(人類隱靜脈內皮細胞)係從PromoCell(德國海德堡的PromoCell公司)取得。內皮細胞係在37℃培養箱、濕度95%和5%二氧化碳條件下,以EGM®-2內皮細胞生長培養基-2(Lonza)進行培養。平滑肌細胞係以培養基231、補充平滑肌生長補充物(SMGS)(Invitrogen公司)進行培養。HAEC、HUVEC、HPAEC、HMVEC-ad、HCAEC、HUAEC、HMVEC-C、HSaVEC的細胞團塊係從PromoCell購得。人類血液外周白血球(PBMC)總RNA係從Clontech(加州山景城的Clontech公司)購得。
來自健康捐血者的血液係抽吸到含有EDTA的真空採血管內,然後其中4毫升以CellSearch系統(新澤西州力登的Veridex公司)處理,以便單離出CEC。此係使用CEC譜套件(Veridex),根據製造商指南使用。在崁釘實驗中,500或1000個內皮細胞(HAEC、HPAEC、HUVEC或HMVEC-ad)係崁入4毫升健康捐血者的血液中,然後以CellSearch系統進行處理。
對培養過的內皮細胞或細胞團塊而言,約5×105個細胞係應用在採取AllPrep DNA/RNA微套件(德國希爾登的Qiagen公司)的RNA單離上。為了將RNA從CellSearch系統所濃縮後的CEC單離出來,先將350微升RLT plus緩衝液(Qiagen公司)加入裂解的CEC內,然後加入4微升、濃度為5奈克/微升的poly(I)(威斯康辛州麥迪遜的Epicentre公司)當作載體RNA,DNA和RNA係使用AllPrep DNA/RNA微套件、根據製造商指南加以單離。將2個相同的崁釘樣品匯集,以進行接下來的分析。RNA的定量和定性係使用NanoDrop 1000(德拉瓦州威爾明頓的NanoDrop公司)和Agilent Bioanalyzer 2100(加州聖克拉拉的Agilent公司)檢驗。
內皮細胞RNA、平滑肌細胞RNA和PBMC RNA樣品係使用單股RNA放大和Enzo Biotin標示系統,轉換成標示目標反義RNA(cRNA)。目標物係依照供應商(加州聖克拉拉的Affymetrix公司)建議,雜合
到Affymetrix human U133 Plus 2.0陣列後續協議。雜合後,陣列係先使用標準Affymetrix程序進行清洗和染色,再使用Affymetrix GeneChip掃描儀進行掃描並使用Expression控制台進行數據萃取。
對於CellSearch譜套件所處理的EC崁釘和捐贈血液樣品而言,RNA係使用Ovation RNA放大系統V2(加州聖卡洛斯的NuGEN公司)轉換成標示目標基因cDNA。簡言之,50奈克的總RNA係使用適於反轉錄的DNA/RNA嵌合引體,接著等溫放大來轉換成雙股cDNA。該cDNA係使用磁珠純化,並使用光譜法定量。3.75微克純化過的cDNA隨後歷經使用Encore Biotin模塊(NuGEN公司)所進行的兩步驟碎化和標示程序。首先,純化過的cDNA係進行碎化,以產生50至100個基範圍的單股cDNA產物。第二,這個碎化過的產物之標示,係將生物素標示過的核苷酸以酵素貼附至第一步驟中所生成之碎化過cDNA的3-羥基端。針對雜合,雜合雞尾酒係使用陣列所應用的雜合法、清洗和染色套件(Affymetrix公司)進行製備並將其加入碎化過的產物內,然後在45℃下培養18小時。雜合後,陣列係先使用標準Affymetrix程序進行清洗和染色,再使用Affymetrix GeneChip掃描儀進行掃描並使用Expression控制台進行數據萃取。
基因表現強度係使用MAS5演算法,以Affymetrix Expression控制台(1.1版)進行數據萃取。數據分析
前,先進行全球尺度化,以便將晶片的平均信號強度帶入目標值600。為了將雜訊程度降至最低,因此移除隊列中出現呼叫低於兩次的探針。因此,保留31K個探針組,以因應後續分析。觀察到從細胞培養取得的細胞和從細胞團塊取得的樣品間存有來源效應。為了將這種效應降至最低,因此移除在這2個族群間顯示出顯著差異(p<0.05)的探針。因此,獲得23K個探針。為了找到檢測血液中CEC適用的標記,因此移除2個PBMC樣品中出現呼叫一次或2個PBMC樣品任一者中強度超過200的探針,而保留3950個探針,以因應接下來的選擇。
就層級式分群法而言,每個探針組的信號強度係規律化成中等;層級式分群法係使用Partek Genomics Suites(密蘇里州聖路易斯的Partek公司,6.5版)執行。層級式分群法係使用平均連結法,而執行在探針和樣品兩者上。歐幾里德距離係使用來計算相異性。就無監督層級式分群法而言,使用在移除細胞培養和細胞團塊間帶有顯著差異之基因後的23K個探針。監督的分群法係使用130個CEC標記或67個皮膚、動脈和靜脈內皮細胞特異標記加以執行。
功能註釋係藉由使用DAVID軟體(NCIF公司)的Gene Ontology(GO公司)分類系統進行分析。
為了評估微陣列分析所選出的基因,因此從藉由使用CEC譜套件之CellSearch所處理的一組10個捐
贈樣品和8個細胞株崁釘樣品(2個HAEC崁釘、2個HPAEC崁釘、2個HMVEC崁釘和2個HMVEC-ad崁釘樣品)中萃取出RNA。在20微升反應中,使用2微升RNA進行使用高容量cDNA反轉錄套件(加州佛斯特市的Applied Biosystems公司)的cDNA合成。為了能夠進行多個基因分析,因此在20微升反應中,使用5微升cDNA進行使用TaqMan® PreAmp Master(前置放大核心)混合套件(Applied Biosystems公司)的14週期前置放大。前置放大產物係經1:20的稀釋,然後將5微升稀釋後產物使用來作為定量PCR的投入。即時PCR係使用Applied Biosystems基因表現Taqman檢定、在ABI PRISM 7900HT序列檢測儀(Applied Biosystems公司)上執行。
從18個內皮細胞樣品、2個PBMC樣品和2個平滑肌細胞樣品取得的RNA係歷經使用Affymetrix human U133 Plus 2.0陣列的微陣列分析,其中該陣列包含超過54000個探針組,涵蓋有著38,500個賦予良好特徵人類基因的47,000個轉錄和變種。內皮細胞樣品組代表9個不同解剖部位,包括5種不同血管(主動脈、冠狀動脈、肺動脈、髂動脈、臍動脈)、2種不同靜脈(臍靜脈和大隱靜脈)和2個不同組織(皮膚、心臟)。除髂動脈和皮膚之外,包括一個從培養細胞取
得和一個從冷凍細胞團塊取得的2個樣品係由各個來源取得。就髂動脈和皮膚而言,則使用從相同培養過細胞取得的2個樣品並作為技術副本。為了獲得基因表現模式概況,因此使用在至少2個樣品中顯示有出現呼叫的31K個探針組進行基因陣列數據的無監督層級分析。內皮細胞群的初步分析表明,從細胞培養取得的樣品和從細胞團塊取得的樣品,可能因樣品類型差異而形成不同族群。為了消除這種差異,因此在這兩個樣品群組間進行T檢驗。淘汰掉P值<0.05的探針組,結果為23K個探針組。在這些23K個探針組上的無監督分析產生出三個主要族群,分別為PBMC樣品族群、平滑肌細胞樣品族群和內皮細胞樣品族群,反映出內皮細胞與PBMC和平滑肌細胞相較之下、整體相似。在內皮細胞族群之內,從細胞團塊取得和從細胞培養取得的樣品係未分離,表明來源效應消除。然而,從相同解剖位置取得的樣品並非總是聚集在一起,可能是因為相對小的樣品尺寸和細胞培養不同條件所致。
CellSearch系統是用來將CEC從上述崁釘捐贈樣品中單離。對應於最突出內皮細胞膜抗原CD146的抗體係用於免疫擷取試劑。然而,在濃縮過程後,仍有約1000至5000個白血球殘留在濃縮後的CEC群體。
為了識別出潛在的CEC特異標記,內皮細胞中一個特異標記的表現程度必須實質高於其在PBMC中的表現程度。因此,移除2個PBMC樣品任一者中有出現呼叫一次或2個PBMC樣品任一者中強度超過200的探針組。保留3950個探針,以因應進一步分析。在18個樣品中最低強度低於1000的探針,係不考慮作為後續分析之用。因此,選出130個探針套(106個獨特基因)作為CEC標記的候選者。功能註釋和路徑分析係使用DAVID功能註釋軟體而在這些130個探針組上進行。GO(Gene ontology公司)術語和具有顯著過度代表的KEGG(京都基因和基因組百科全書)路徑如表1所示。在130個探針組中過度代表的頂端生物過程,包括參與細胞運動調節(n=11)、細胞遷移調節(n=10)和血管發育(n=11)的基因。該過度代表的細胞成分族群包括質膜(n=44)和集中附著點(n=6)。該過度代表的分子功能族群包括跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性(n=7)和蛋白酪氨酸激酶活性(n=8)。與CEC特異基因相關的主要路徑是集中附著點(n=12)和ECM受體相互作用(n=5)。內皮細胞其中一種功能是血管生成,在此期間細胞和細胞外基質(ECM)間的附著相互作用中發生重大變化,使得內皮細胞遷移。
CEC的特異基因係依照實例2進行識別。這些包括:整合相關基因,整合α2(I TGA2)、AXL受體酪氨酸激酶(AXL)、EPH受體A2(EPHA2)、TEK酪氨酸激酶、內皮(TEK)、原癌基因(MET)、神經纖毛蛋白1(NRP1)、VEGFR2(KDR)和TIE1;血管生成相關基因,激活素A受體類型II類1(ACVRL1)、結締組織生長因子(CTGF)、內皮細胞特異趨化調節器(ECSCR)、內皮素1(EDN1)和迴旋同源體4(ROBO4);透過細胞-細胞相互作用而維持血管完整性的基因CAV1、CAV2、COL4A1、COL5A2、CCND1、FLNB、ITGA2、KDR、LAMA4、LAMB1、PARVA、MET;和獨立的MCAM(CD146)、KDR(VEGFR-2)、TEK(Tie-2)。然而,內皮細胞相關的一些基因並不是目前內文中的標記,因為其在PBMC中的高表現,如PECAM(CD31)、CXCR4,或因為其表現過低而在一個或多個內皮細胞株(例如KIT(SCF R/c-組)和SELE(E-選擇素))中無法見到對於診斷上的幫助。在這些實例中識別的CEC標記過度代表與內皮細胞功能相關的生物過程或路徑。
在2個PBMC樣品中顯示沒有表現或強度小於200的3950個基因,其係用來識別有用於識別CEC來源組織的基因為基礎的標記。該等在從動脈取得之內皮細胞中之中位數信號強度超過500,且在從其他
來源取得之內皮細胞中大於最大表現者係識別為動脈內皮細胞特異基因。同樣,為了識別靜脈內皮細胞特異基因,識別其在從靜脈取得之內皮細胞中的中位數信號強度超過500,且在從其他來源取得之內皮細胞中大於最大表現之基因。共有38個動脈內皮細胞特異基因和14個靜脈內皮細胞特異基因符合這些標準(見表3)。代表性動脈特異基因是先前報告的動脈內皮細胞特異基因HEY2,其是已經暗示小鼠胚胎心血管發育所需之Hairy相關轉錄因子家族的成員。其他動脈特異CEC基因包括CXADR;其是一種緊密接合的成分且經報告在心臟中表現不對稱,其中表現係出現在血管壁的內皮下層中、但不出現在腔內皮細胞表面上。SOX17、一種HMG盒轉錄因子,其係已顯示在內胚層形成和心血管發育兩者中扮演重要角色,而其啟動子活性係已顯現在小鼠模型之心血管系統中的動脈血管內皮細胞內,但不顯現在靜脈內。為了啟動特別適合結合免疫磁性平台,如CellSearch系統使用之組織特異性標記的檢測,因此選定標記的表現程度應明顯高於在PBMC中者。就皮膚內皮細胞特異基因識別而言,則選擇從皮膚取得之內皮細胞中的最低表現,比從所有其他內皮細胞樣品之最高表現高出5倍的基因。此類的基因有15個。
監督分群法係使用67個來源特異基因,在細胞株微陣列數據上進行。該67個基因正確地聚集從不同來
源的內皮細胞,只有一個例外(一個動脈內皮細胞與靜脈內皮細胞聚集在一起)。亦進行基因的交叉驗證。
內皮細胞係崁釘到健康捐贈血液中,然後CEC係使用CellSearch系統,搭配CEC譜套件進行濃縮。每4毫升健康捐贈血液係連同從單一來源取得的500或1000個培養過的內皮細胞進行崁釘。檢測4個選出的培養過的內皮細胞樣品,包括2個從動脈(HAEC和HPAEC)取得、1個從靜脈(HUVEC)取得、1個從皮膚(HMVEC-ad)取得。從崁釘取得的濃縮後CEC和無崁釘的10個健康捐贈樣品係歷經RNA單離和微陣列分析。從10個捐助者取得的CEC數值係確定在4毫升血液中為2至107。在從細胞株基因表現譜微陣列數據所獲得的130個CEC特異標記間,皆顯示在內皮細胞崁釘樣品中的平均表現高於捐贈樣品中者,在內皮細胞崁釘樣品中對捐贈樣品中之平均表現比率介於2到655,且93個基因的比例超過20。使用QRT-PCR,針對崁釘樣品中對捐贈樣品之間比率介於8到654的21個標記進行驗證,PCR檢測結果表明選出的所有標記在崁釘樣品和非崁釘捐贈樣品間皆有良好分離效果。為了驗證動脈、靜脈、皮膚特異性標記,使用67個來源特異標記針對崁釘微陣列數據進行主成分分析。捐贈樣品和動脈、靜脈、皮膚內皮細胞崁釘樣品
係在PCA中明顯地分離。該標記因此適用於區分從不同來源取得的CEC。
將從病患取得的全血直接放到含有CellSave防腐劑的試管內。此步驟係根據適於使用CellSave系統之循環腫瘤細胞(CTC)分析的相同收集血液協議進行。CEC係透過CellSearch系統,搭配CEC細胞擷取套件進行濃縮。在此系統中,首先搭配AUTOPREP分離系統進行免疫磁性濃縮,以便產生出濃縮後餾份。所使用的套件包含CD146磁性液體和利用核酸染料DAPI進行濃縮後細胞染色的試劑、內皮糖蛋白(CD105)-PE和泛-白血球標記CD45APC。將樣品減少到約300微升,並放置到固定在對應於磁單層細胞為內側之磁性「掩體」的分析室中。然後進行CEC的計數和形態分析。
然後將CEC從磁性掩蔽設備中萃取出來。總RNA係利用RNeasy微套件(德國希爾登的Qiagen公司)進行萃取。該RNA係如下轉換成cDNA:首先,萃取過的RNA總量係在65℃下,以300奈克隨機六聚體預培養5分鐘。然後將200 U M-MLV Reverse Transcriptase(反轉錄酶)、RNase H Minus、Point Mutant、M-MLV Reverse Transcriptase 1x Reaction Buffer(反轉錄酶1倍反應緩衝液)、10 U RNasin® Plus
RNase Inhibitor(抑制劑)(均購自威斯康星州麥迪遜的Promega公司),50奈莫耳的dATP、dTTP、dCTP和dGTP等莫耳混合物(德國弗賴堡的Amersham Biosciences公司)和水添加至20微升的最後反應體積內。先在20℃下進行預培養步驟10分鐘後,然後在55℃下進行反應50分鐘。最後,加熱到94℃達5分鐘後,停止反應。
定量反轉錄PCR(qRTPCR)係然後如下執行。基因表現分析係使用表3中動脈標記指定的單獨TaqMan®預開發檢定試劑,進行重複反應。在每一種情況下,由2個未標示的PCR引體和1個搭配上述系統使用的FAMTM染料標示過TaqMan® MGB探針所組成。反應總體積為14 |xl,包含有7微升2倍的TaqMan® Universal PCR Master(通用PCR核心試劑)、0.7 |xl的TaqMan®預開發檢定試劑和4|xl 5倍稀釋的cDNA範本。PCR放大係使用AB 7900HT快速即時PCR系統進行,其由在50℃下初步培養2分鐘,然後在95℃下培養10分鐘、接著50個週期在95℃下變性15秒、然後在60℃下延伸1分鐘等步驟組成。利用AB7900序列檢測軟體2.2.2版,搭配自動基線校正和循環閾值設定進行數據分析。將所產生的循環閾值(Ct)數據匯出,以因應進一步分析。耗材、設備和軟體係購自加州福斯特城的Applied Biosystems公司。
一些動脈CEC來源組織標記顯示出顯著的過度表現。將數據下載到一個程式使用的檔案,該程式會將該表現模式,與藉著將CEC標記表現與已知臨床結果匹配所執行的各種表現模式進行比較。該程式係包含在儲存設備上,而該儲存設備也包含使用統計算法進行比較適用的可執行碼。該模式表明CEC者本質上是動脈,更確切來說是主動脈。連同其他診斷訊息可結論出如果不及時治療,病患很可能招致胸主動脈動脈瘤。
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變體1,訊息核糖核酸
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列。
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>refseq|NM_006169|NM_006169人類菸鹼胺氮甲基轉移?(NNMT),訊息核糖核酸。
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糖核酸。
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訊息核糖核酸。
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核酸。
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酸。
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核酸3’端(人類)
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糖核酸。
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激?,訊息核糖核酸。
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3855754 3',訊息核糖核酸序列。
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糖核酸。
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,訊息核糖核酸。
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糖核酸。
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DKFZp564K1671)
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>ENA|D84109|D84109.1人類RBP-MS/第三類訊息核糖核酸,完整編碼序列。
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隆MGC:5002影像:3451677),完整編碼序列。
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影像:3623597),完整編碼序列。
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克隆****。
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MGC:1645影像:3501794),完整編碼序列。
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類);包含PTR5.t3 TAR1反覆元素,訊息核糖核酸序列。
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酸。
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DKFZp434P1112)
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酸克隆影像:590120 3',訊息核糖核酸序列。
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>ENA|T63524|T63524.1 yc07b04.s1 Stratagene肺(#937210)人類互補型去氧核糖核酸克隆
影像:79951 3',訊息核糖核酸序列。
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氧核糖核酸3’端(人類)
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>ENA|AI623211|AI623211.1 ts78e11.x1 NCI_CGAP_GC6人類互補型去氧核糖核酸克隆影像
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>ENA|AI653117|AI653117.1 wb43b10.x1 NCI_CGAP_GC6人類互補型去氧核糖核酸克隆影像:
2308411 3',訊息核糖核酸序列。
>ENA|BE566894|BE566894.1 601341011F1 NIH_MGC_53人類互補型去氧核糖核酸克隆影像:
3683306 5',訊息核糖核酸序列。
>ENA|AI670852|AI670852.1 wa06a05.x1 NCI_CGAP_Kid11人類互補型去氧核糖核酸克隆影
像:2297264 3',訊息核糖核酸序列。
>ENA|AL035086|AL035086.12人類DNA序列來自6q23.1-24.3染色體上之RP1-44A20克隆,
包含新穎蛋白類似C1-四氫葉酸綜合體(包含DKFZP586G1517蛋白及FLJ21145,包含四氫葉酸
脫氫?/環化水解?區域)部分基因、部分新穎基因(包含FLJ31738及KIAA1209)及一新穎偽基
因類似光導蛋白樣蛋白。包含CpG島。
>ENA|AI657069|AI657069.1 tt55g01.x1 NCI_CGAP_GC6人類互補型去氧核糖核酸克隆影像:
2244720 3'類似SW:KLP1_CHLRE P46870運動素樣蛋白KLP1,訊息核糖核酸序列。
>ENA|AL135787|AL135787.13來自染色體9上RP11-16L21克隆之人類DNA序列,包含KIAA1962
蛋白類似鋅指蛋白HIT-10基因變化之3'端、白三烯B412-羥基去氫?(MGC34943)之LTB4DH基
因、KIAA0563相關基因(LOC286331)之基因、鳥嘌呤核酸結合蛋白(G蛋白)之GNG10基因、γ
10、新穎基因、染色體9開放讀框84之C90rf84基因之3'端及六個CpG島。
>ENA|BG540685|BG540685.1 602570561F1 NIH_MGC_77人類互補型去氧核糖核酸克隆影像:
4694894 5',訊息核糖核酸序列。
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息核糖核酸序列。
>ENA|AI583530|AI583530.1 ts12c08.x1 NCI_CGAP_Pan1人類互補型去氧核糖核酸克隆影
像:2228366 3',訊息核糖核酸序列。
>ENA|BF792126|BF792126.1 602252573F1 NIH_MGC_84人類互補型去氧核糖核酸克隆影像:
4344858 5',訊息核糖核酸序列。
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核糖核酸克隆影像:2711375 3',訊息核糖核酸序列。
>ENA|AW444502|AW444502.1 UI-H-BI3-akb-g-03-0-UI.s1 NCI_CGAP_Sub5人類互補型去氧核
糖核酸克隆影像:2733869 3',訊息核糖核酸序列。
>ENA|BE218803|BE218803.1 hv44h08.x1 NCI_CGAP_Lu24人類互補型去氧核糖核酸克隆影
像:3176319 3'類似SW:RTC0_人類P17081 GTP結合蛋白TC10,訊息核糖核酸序列。
>ENA|BE218803|BE218803.1 hv44h08.x1 NCI_CGAP_Lu24人類互補型去氧核糖核酸克隆影
像:3176319 3'類似SW:RTC0_人類P17081 GTP結合蛋白TC10,訊息核糖核酸序列。
>ENA|AI628689|AI628689.1 ty43a06.x1 NCI_CGAP_Ut2人類互補型去氧核糖核酸克隆影像:
2281810 3'類似包含Alu反覆元素;包含元素MER22反覆元素,訊息核糖核酸序列。
>ENA|W72516|W72516.1 zd64g05.s1 Soares_fetal_heart_NbHH19W人類互補型去氧核糖核酸
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核酸。
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糖核酸。
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>ENA|AL359052|AL359052.1人類訊息核糖核酸全長***互補型去氧核糖核酸克隆EUROIMAGE
1968422。
>ENA|AF095723|AF095723.nu112002年2月15日停止公開檢視。
N
>refseq|NM_012193|NM_012193人類卷曲家族受體4(FZD4),訊息核糖核酸。
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酸。
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>ENA|AK023795|AK023795.1人類互補型去氧核糖核酸FLJ13733 fis,克隆PLACE3000147,
高度類似於具第一類凝血?敏感蛋白ADAMTS1模體(ADAMTS1)人類金屬蛋白?訊息核糖核酸。
>ENA|AF060152|AF060152.1人類METH1蛋白(METH1)訊息核糖核酸,完整編碼序列。
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>ENA|AI049973|AI049973.1 an38g03.x1 Gessler Wilms腫瘤人類互補型去氧核糖核酸克隆
影像:1700980 3',訊息核糖核酸序列。
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糖核酸克隆影像:2367376 3',訊息核糖核酸序列。
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糖核酸克隆影像:3286600 3'類似包含元素MER37反覆元素,訊息核糖核酸序列。
>ENA|AI963304|AI963304.1 wt61d01.x1 NCI_CGAP_Pan1人類互補型去氧核糖核酸克隆影
像:2511937 3'類似gb:J03464 PROCOLLAGEN A2(I)鏈前驅(人類),訊息核糖核酸序列。
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像:2566376 3',訊息核糖核酸序列。
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>ENA|AI912122|AI912122.1 wd63a12.x1 NCI_CGAP_Lu24人類互補型去氧核糖核酸克隆影
像:2336254 3',訊息核糖核酸序列。
>ENA|AI376433|AI376433.1 tc36a08.x1 Soares_total_fetus_Nb2HF8_9w人類互補型去氧核
糖核酸克隆影像:2066678 3',訊息核糖核酸序列。
>ENA|AW960748|AW960748.1 EST372819 MAGE重排序列,MAGF人類互補型去氧核糖核酸,訊
息核糖核酸序列。
>ENA|AW058459|AW058459.1 wx21b12.x1 NCI_CGAP_Kid11人類互補型去氧核糖核酸克隆影
像:2544287 3',訊息核糖核酸序列。
>ENA|AA904430|AA904430.1 ok07f12.s1 Soares_NFL_T_GBC_S1人類互補型去氧核糖核酸克
隆影像:1507151 3'類似TR:000808 Q00808 B轉導蛋白樣蛋白,訊息核糖核酸序列。
>ENA|AF493879|AF493879.1人類鳥嘌呤核酸結合蛋白γ12(GNG12)訊息核糖核酸,完整編
碼序列。
>ENA|AI753143|AI753143.1 cr05h01.x1人類骨髓基質細胞人類互補型去氧核糖核酸克隆
HBMSC_cr05h01 3',訊息核糖核酸序列。
>refseq|NM_015577|NM_015577人類視黃酸誘導14(RAI14),轉錄變體1,訊息核糖核酸。
>refseq|NM_005045|NM_005045人類搖晃素(RELN),轉錄變體1,訊息核糖核酸。
>ENA|AL037401|AL037401.1人類訊息核糖核酸;EST DKFZp564K1671_s1(來自
DKFZp564K1671克隆)
>ENA|BC004241|BC004241.1人類層黏蛋白,α4,訊息核糖核酸(互補型去氧核糖核酸克隆
影像:3623597),完整編碼序列。
>ENA|U77706|U77706.1人類層黏蛋白α4鏈(LAMA4*-1)訊息核糖核酸,完整編碼序列。
>ENA|U56725|U56725.1人類熱休克蛋白訊息核糖核酸,完整編碼序列。
>refseq|NM_018214|NM_018214人類富含白胺酸重複序列1(LRRC1),訊息核糖核酸。
>refseq|NM_005092|NM_005092人類腫瘤壞死因子(配體)總科,成員18(TNFSF18),訊息核
糖核酸。
>ENA|AI279819|AI279819.1 qm26h04.x1 NCI_CGAP_Lu5人類互補型去氧核糖核酸克隆影像:
1882999 3',訊息核糖核酸序列。
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>ENA|AW451115|AW451115.1 UI-H-BI3-alg-g-01-0-UI.s1 NCI_CGAP_Sub5人類互補型去氧核
糖核酸克隆影像:2736936 3',訊息核糖核酸序列。
>ENA|AI472310|AI472310.1 tj87b01.x1 Soares_NSF_F8_9W_OT_PA_P_S1人類互補型去氧核
糖核酸克隆影像:2148457 3',訊息核糖核酸序列。
>gi|18089116|gb|BC020718.1|人類補體因子I,訊息核糖核酸(互補型去氧核糖核酸克隆
MGC:22501影像:4716122),完整編碼序列
>ENA|BF967657|BF967657.1 602287358T1 NIH_MGC_96人類互補型去氧核糖核酸克隆影像:
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酸。
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(PRSS12),訊息核糖核酸。
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像:2500861 3',訊息核糖核酸序列。
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酸(RA)兩週後表達於NT2神經前驅細胞中。
>ENA|AW590196|AW590196.1 hg41a02.x1 NCI_CGAP_GC6人類互補型去氧核糖核酸克隆影像:
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>ENA|AI540210|AI540210.1 te55e07.x1 Soares_NFL_T_GBC_S1人類互補型去氧核糖核酸克
隆影像:2090628 3'類似TR:Q63571 Q63571鼠生長與轉形依靠,訊息核糖核酸序列。
>ENA|BF589515|BF589515.1 naa05c06.x1 NCI_CGAP_Pr28人類互補型去氧核糖核酸克隆影
像:3254002 3',訊息核糖核酸序列。
>gi|11444320|gb|BF432206.1|BF432206 nab81e11.x1 Soares_NSF_F8_9W_OT_PA_P_S1人類
互補型去氧核糖核酸克隆影像:3274101 3',訊息核糖核酸序列
>gi|283806665|ref|NM_153448.3|人類ESX同源框1(ESX1),訊息核糖核酸
Claims (20)
- 一種評估醫療狀況的方法,包含識別CEC中基因為基礎的標記之不同表現(相對於一個正常群體中之相同基因的表現)。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中該標記在PBMC中表現並無不同。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中在該調控基因中的表現至少有2倍差異。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中表示不同調控的p-值低於0.05。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中該標記係從表2所選出。
- 一種識別一CEC來源組織的方法,包含識別CEC中之組織特異基因為基礎的標記不同表現(相對於在一個正常群體中之相同基因的表現)。
- 如申請專利範圍第6項的方法,其中該標記在PBMC中表現並無不同。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中在該調控基因中的表現至少有2倍差異。
- 如申請專利範圍第1項方法,其中表示不同調控的p-值低於0.05。
- 如申請專利範圍第1項的方法,其中該標記係從表3所選出。
- 如申請專利範圍第4項的方法,其中在該調控基因中的表現至少有2倍差異。
- 如申請專利範圍第4項的方法,其中表示不同調控的p-值低於0.05。
- 一種診斷套件,包含適於單離CEC的試劑和適於檢測表2之標記的表現的試劑。
- 如申請專利範圍第13項的診斷套件,其中適於檢測標記的該試劑如表3所列者。
- 如申請專利範圍第13項的套件,進一步包含適於進行一微陣列分析的試劑。
- 如申請專利範圍第13項的套件,進一步包含適於放大該標記的試劑。
- 如申請專利範圍第13項的套件,進一步包含含有可執行指南的一成分,其中該指南利用一模式與表現檢測關聯。
- 如申請專利範圍第13項的套件,其中適於單離CEC的該試劑包括免疫磁性試劑。
- 一種評估醫療狀況的方法,包含單離CEC、放大從該CEC取得的基因表現標記、檢測該標記的該表現,和利用一預測或一預後與該標記的該表現關聯;其中單離和放大係使用如申請專利範圍第13項的該套件執行。
- 一種評估醫療狀況的方法,包含單離CEC、放大從該CEC取得的基因表現標記、檢測該標記的該表現,和利用一預測或一預後與該標記的該表現關聯;其中單離和放大係使用如申請專利範圍第14項的該診斷套件執行。
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