WO2006109529A1 - 磁気ビーズセパレータ - Google Patents

Abstract

　多数の試験液中のナノメートルサイズの微小な磁気ビーズで標識された目的物質を、磁気ビーズとともに高速で磁気分離することができ、少量の試験液からの磁気ビーズの分離を同時に多数種について行うことのできるマイクロアレイ化された磁気ビーズセパレータを提供する。複数の分注器およびピペットチップにより、複数のマイクロベッセルに磁気ビーズで標識された特定の生体物質を含有する各試験液を分注し、複数のマイクロベッセルの各々の内側には強磁性ワイヤを配置し、これに磁石による磁界を印加して磁化し磁場勾配を形成し、この強磁性ワイヤに試験液中の磁気ビーズを吸引させ、他方で磁気ビーズをそれぞれに強磁性ワイヤに吸引させた後の各マイクロベッセル中の残留験液はピペットチップにてそれぞれに吸引し回収する。

Description

明 細 書

磁気ビーズセパレータ

技術分野

[0001] 本発明は、試験液に含まれる磁気ビーズおよび磁気ビーズに吸着した物質の分離 操作を、多数の試験液にっ 、て同時進行にて高速で行うことのできる磁気ビーズセ パレータに関し、特に試験液に含まれるナノメータサイズの微小な磁気ビーズおよび この微小な磁気ビーズに吸着した物質の分離を多数の試験液について同時進行に て高速で行うことのできる磁気ビーズセパレータに関する。

背景技術

[0002] マイクロウェルアレイに多数のマイクロベッセルを配置し、これら多数のマイクロべッ セル内の各試験液中から、それぞれに磁気ビーズで標識された物質を同時にかつ 高速度で検出するために開発された磁気分離システムが従来力 知られている。こ れは試験液を分注したマイクロベッセルの底部の外縁に磁石を配置したものである。 特許文献 1 (特開平 11— 242033)には、分注器の外縁に磁石を配置し、そこに試 験液をマイクロベッセルから吸引して磁気ビーズをマイクロベッセルもしくは分注器内 壁に固定する手法が開示されている。

[0003] このような磁気分離システムで用いる磁気ビーズは、粒子径をできるだけ小さくし、 比表面積を増大させることによって、磁気ビーズに吸着する物質の量を飛躍的に増 大させることができる。ところがこれら従来の方式では、磁気ビーズのブラウン運動に よる擾乱力が。外部に配置された磁石が作る磁場勾配による力を乱すため、磁気ビ ーズの寸法をおよそ lOOnm以下まで微細化すると、磁気分離が極めて困難になる 力 または磁気分離が不可能になってしまうという問題点があった。

[0004] 特許文献 2 (特開平 11一 319628)には、ナノメートルオーダーの粒子サイズの磁 気ビーズを磁気分離する技術として、漏斗状の容器の先端部に多孔質の強磁性体 力 なるフィルタを配置し、外部から磁界を印加することにより多孔質の強磁性体フィ ルタ内に発生する高い磁界勾配を利用し、このフィルタ内に磁気ビーズを固定する 方法が開示されている。 [0005] し力しながら、この磁気ビーズの磁気分離方法は、フィルタ自体を細長!/、構造にし、 試験液を漏斗の上端力 注入し重力によって自由落下させ、細長い構造で高い流 動抵抗を持つフィルタ中を溶液が通過するように設計されたものであるため、フィルタ 中を溶液が通過するのに長い時間を要し、この技術は分注器を用いて多数の試験 液の吸引と吐出を行う高速の磁気分離には適さないものであった。

特許文献 1：特開平 11― 242033号公報

特許文献 2 :特開平 11一 319628号公報

発明の開示

[0006] 本発明の目的は、上記の各問題点を解決し、多数の試験液中のナ粒子サイズがナ ノメートルオーダーの微小な磁気ビーズ、およびこのような微小な磁気ビーズで標識 された目的物質を高速で磁気分離することができ、少量の試験液力ゝらの磁気ビーズ の分離を、多数種について同時進行で行うことのできるマイクロアレイ化された磁気 ビーズセパレータを提供することにある。

[0007] 本発明の磁気ビーズセパレータは、磁気ビーズで標識された検体を含有する各試 験液を収容する複数のマイクロベッセルと、複数のマイクロベッセルの各々に磁場を 発生させる磁石と、複数のマイクロベッセルの各々の内側に配置され、磁石の発生す る磁界によって磁化され磁場勾配を誘起して磁気ビーズを吸引する強磁性ワイヤと、 各試験液を前記複数のマイクロベッセルの各々に分注し、複数のマイクロベッセルの 各々に分注した各試験液の含有する磁気ビーズがそれぞれ強磁性ワイヤに吸引さ れた後に複数のマイクロベッセル中に残留した各試験液をそれぞれ吸引し回収する 複数の分注器およびピペットチップとを備えたことを特徴とする。

[0008] また本発明の検体の磁気分離方法は、検体を含有する試験液に、検体を特異的 吸着する生体活性物質が表面に固定された磁気ビーズを浸漬し、試験液中の検体 が特異的吸着した磁気ビーズを含有する試験液を得る工程と、検体が特異的吸着し た磁気ビーズを含有する試験液を磁ィ匕された強磁性ワイヤを有するマイクロベッセル に分注し、検体が特異的吸着した磁気ビーズを強磁性ワイヤに吸引させ分離するェ 程と、前記検体の特異的吸着した磁気ビーズが分離されて除かれた試験液を吸引 分離する工程と、強磁性ワイヤに吸引されて分離された検体の特異的吸着した磁気 ビーズから、前記検体を解離して回収する工程とを備えたことを特徴とする。

[0009] なお上記の記載にお!、て、検体は検査の対象とする目的の物質であり、また磁気 ビーズで標識された検体は、例えば磁気ビーズには検体を特異的吸着する生体活 性物質が表面に固定されており、検体力 Sこの磁気ビーズにこの生体活性物質を通じ て特異的吸着されている状態にある検体である。なお、本発明の検体の磁気分離方 法は、複数の工程を同時に進行させる場合も含む。

[0010] 本発明の磁気ビーズセパレータは、このような構成により、ナノメートルオーダーの 粒子サイズを有する微小な磁気ビーズの磁気分離を、多数種にっ ヽて平行して同時 進行で行うことができるので、本発明の実施形態の磁気ビーズセパレータにより、効 率的かつ高速な磁気分離が実現できる。

[0011] 本発明の磁気ビーズセパレータの実施形態によれば、以下に述べるように、さまざ まな生体物質を含む溶液から目的とする成分の生体物質の分離抽出を、非常に効 率的に行うことができる。

[0012] すなわち、分離目的の特定の生体物質を特異的に吸着する生体活性物質を表面 に固定した磁気ビーズを、さまざまな生体物質を含む溶液に加えて攪拌することによ り、この特定の生体物質が磁気ビーズに吸着される。この結果、試験液は、磁気ビー ズで標識された特定の生体物質が特異的に吸着した磁気ビーズを含む試験液とな る。この試験液を分注器とこれに接続されたピペットチップを用いてこの磁気ビーズセ パレータのマイクロベッセルに注入すると、マイクロベッセルの内壁周辺部に配置さ れた強磁性金属ワイヤがマイクロベッセルの外側に配置された磁石により磁ィ匕され、 強磁性ワイヤの表面に高い磁場勾配が生じているので、溶液中の磁気ビーズは強磁 性金属ワイヤの表面に固定される。

[0013] 他方、こうして磁気ビーズが除かれた上澄み液は、ピペットチップで吸引され分離さ れて外部に移送される。他方、強磁性ワイヤ表面に固定された磁気ビーズには、特 異的吸着した特定の生体物質がさまざまな生体物質を含む溶液力 分離されて吸 着しているので、この生体物質を解離剤を用いて磁気ビーズから解離させ、回収する 。本発明の磁気ビーズセパレータにおいては、この際に用いる磁気ビーズとして、ナ ノメートルオーダーの粒子サイズを有する微小な磁気ビーズを用いることができ、こう することにより、分離の効率を飛躍的に高めることができる。

[0014] 本発明により、従来は実施が困難であったナノメータサイズの磁気ビーズの高速磁 気分離を行うことができるようになった。ナノメータサイズの磁気ビーズは、従来のマイ クロサイズの磁気ビーズに比べ比表面積が非常に大きいので、 目的物質を特異的吸 着により捕獲し抽出する効率を格段に向上させることができるようになった。

[0015] なお、本発明の磁気ビーズセパレータは、既存の同時複数検体操作システムに用 V、られて 、るマイクロウェルアレイに収納することができ、また従来のマイクロカラムシ ステムで用いるマイクロベッセルの内壁周辺部に強磁性金属ワイヤを配置して構成さ れるので、従来のマイクロカラムシステムが有している分注、吸入、吐出、洗浄などの 機能はそのまま本発明の磁気ビーズセパレータの構成に用いることができる。

図面の簡単な説明

[0016] [図 1]図 1は、本発明の磁気ビーズセパレータの一実施形態を模式的に示した斜視 図である。

[図 2]図 2は、本発明の磁気ビーズセパレータの一実施形態におけるピペットチップ が挿入された状態のマイクロベッセルの詳細を示した図である。

[図 3]図 3は、本発明の磁気ビーズセパレータの一実施形態における方眼状の規則 的な配列をした複数のマイクロベッセルの各々の間を仕切る仕切り板の一部に、強 磁性ワイヤを磁ィ匕する永久磁石を配置した状況を示した図である。

[図 4]図 4は、本発明の磁気ビーズセパレータの一実施形態における縦横に仕切る 仕切り板の縦および横の一方に、仕切り板の厚み方向に着磁された永久磁石を用い

、他方に非磁性体を用いる形に磁石を配置した構成を示した図である。

[図 5]図 5は、本発明の磁気ビーズセパレータの一実施形態における磁気分離の経 過時間と残留 Fe濃度との関係を示した図である。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 次に図面を参照し本発明の実施の形態を述べることにより、本発明についてより詳 細に説明する。

[0018] 1.装置の構成

図 1は本発明の磁気ビーズセパレータの一実施形態を模式的に示した斜視図であ る。図 1の磁気ビーズセパレータ 11には、 8 X 12個のマイクロベッセル 12が方眼状に 規則配列されて 、る。これら複数のマイクロベッセルは 5〜： LOmm間隔で二次元配列 していることが好ましい。一列に配列された複数の分注器 13およびこれらに接続され たピペットチップ 14から、複数のマイクロベッセル 12の各々に同時に各試験液が分 注されると、これらマイクロベッセル 12の各々に分注された各試験液 17は、マイクロ ベッセル 12内で磁化された強磁性金属ワイヤ（例えば直径が 50nm〜lmm、ここに は図示されて 、な 、）の表面に誘起されて 、る高 、磁気勾配よつて磁気ビーズが捉 えられ分離される。また残った上澄み液が一列に配列されたピペットチップ 14および これに接続された分注器 13によって回収される。

[0019] 図 2はマイクロベッセル 12に、ピペットチップ 14が挿入された状態について、その 詳細を示した図である。図 2において、マイクロベッセル 12の内壁周辺部には、強磁 性ワイヤ 15が多孔保持体 18に保持されて配置され、マイクロベッセル 12の外縁には 磁石 16が配置されている。このマイクロベッセル 12に、着脱可能方式で分注器 14に 接続されたピペットチップ 14が挿入され、磁気ビーズで標識された検体を含む溶液 が分注される。試験液 17中の磁気ビーズで標識された特定の生体物質 (検体)は、 磁気ビーズとともに強磁性ワイヤ 15の表面に誘起されている高い磁場勾配によって 強磁性ワイヤ 15の表面に固定される。このあと、非磁性成分をピペットチップに吸引 することによって、磁気ビーズで標識された検体を磁気ビーズとともに試験液力 分 離抽出することができる。

[0020] 2.特定の生体物質の分離抽出

この磁気ビーズセパレータ 11を用い、以下のプロセスを用いることにより、さまざま な生体物質を含む溶液から、目的とする特定の生体物質を分離抽出することができ る。

[0021] まず、さまざまな生体物質を含む溶液に対し、その溶液の中から分離抽出しようと する目的の一成分物質と特異的に吸着する生体活性物質を表面に固定した磁気ビ ーズを用意し、さまざまな生体物質を含む溶液にこの磁気ビーズを加えて攪拌し、こ の磁気ビーズへの特異的結合を促す。こうして目的とする一成分物質を特異的に吸 着させた磁気ビーズを含有し、さまざまな生体物質を含んだ溶液を分注器 13とマイク 口ピペット 14で搬送し、磁気ビーズセパレータ 11のマイクロベッセル 12の強磁性ワイ ャ 15としての Niワイヤ配置部位に完全に吐出する。

[0022] こうしてマイクロベッセル 12に分注された溶液を数分間の短い間静置することにより 、磁気ビーズと、この磁気ビーズと特異的に吸着した生体物質がこの Niワイヤ表面に 磁気力で吸着される。磁気ビーズとこれに特異的に吸着した生体物質磁気分離され た後の上澄み液をマイクロピペット 14で回収する。ここで高 、分離精度を得るために 、新しいマイクロピペット 14で純水を磁気ビーズセパレータ 11に搬送し、マイクロべッ セル 12や強磁性ワイヤ 15の表面に付着した水分に溶存する非目的物質を洗い取る

[0023] 次に Niワイヤの表面に磁気力で吸着した磁気ビーズに特異的に吸着して 、る目的 物質を、解離剤 (特異的結合の種類によって異なる）をマイクロピペット 14で搬送し、 マイクロベッセル 12内に注入して攪拌し、磁気ビーズから目的物質を解離させ、回収 する。この際、分離精度を高めるため、新しいマイクロピペット 14で純水を磁気ビーズ セパレータ 11に搬送し、マイクロベッセル 12や強磁性ワイヤ 15の表面に付着した水 分に溶存する目的物質を洗い取る。

[0024] 最後に強磁性ワイヤ 15に磁界を印加している磁石を取り外す力、あるいはマイクロ ベッセル 12を磁石 16から遠ざけることによって磁界のない状態にし、磁気ビーズセ パレータ 11のマイクロベッセル 12内部にマイクロピペット 14で純水を搬送し、磁気ビ ーズを回収する。

[0025] 3.強磁性ワイヤ

磁気ビーズセパレータのマイクロベッセル 12内部に設ける強磁性ワイヤ 16は、磁 界より磁化され、その表面に高い磁界勾配を発生し、溶液中の磁気ビーズを吸引す る。ここで用いる強磁性ワイヤには、各種の強磁性金属を用いることができるので特 に制限されないが、例えば耐食性に優れた Niワイヤや、軟磁性特性の優れたパーマ ロイを用いることができる。また強磁性非晶質金属のワイヤを用いることもできる。

[0026] この磁気ビーズセパレータ 11を生体物質の分離に用いる際に、強磁性ワイヤ 15に は非特異的吸着を防ぐための薄い被覆を設けたものを用いることができる。この目的 には、例えば非特異的吸着がなぐ親水性のエポキシ基を表面に有するポリマーの 被覆が好ましぐまたポリプロピレンなどの樹脂の被覆を用いることもできる。

[0027] 磁気ビーズの吸引に用いる強磁性ワイヤ 15の直径は、ある径までは細い方が高い 磁界勾配が得られることから望ましいものの、細くなるにつれ、ワイヤの剛性が低下す るとともに磁性が低下するようになる。このため、強磁性ワイヤの直径は 50 m以上 1 mm以下であることが好ましぐ 100 μ m以上 300 μ m以下であることがより好ましい。

[0028] このような強磁性ワイヤ 15は、マイクロベッセル 12の内側の管壁に沿って強磁性ヮ ィャ 15の一端を固定して保持する形に配置することができる。また強磁性ワイヤ 15 の両端を固定した形で配置することもできる。さらにこの強磁性ワイヤの保持には、多 孔保持体を用いることにより、液体の流れをよくすることができ、またマイクロベッセル 内側の周辺部に保持することができる。また強磁性ワイヤはワイヤの長手方向を前記 試験液の流れる方向に向けて配置することにより、溶液の流れをよくすることができる

[0029] 4.磁界勾配発生用磁石

強磁性ワイヤ 15を磁ィ匕し、その表面に高い磁界勾配を発生させる磁石 16は、マイ クロベッセル 12の外側に配置され、マイクロベッセル 12内の強磁性ワイヤ 15に磁界 を印加しこの強磁性ワイヤ 15を磁ィ匕する。

[0030] この磁石は、図 3に示したように、方眼状の規則的な配列をした複数のマイクロべッ セル 12の各々の間を仕切る仕切り板 19を設け、この仕切り板 19の一部に永久磁石

16を配置することができる。

[0031] また、図 4に示したように、複数のマイクロベッセルを仕切る仕切り板 19を縦横に設 け、この縦の仕切り板と横の仕切り板のうち、一方の仕切り板には厚み方向に着磁さ れた永久磁石 16を用い、他方の仕切り板には非磁性体を用 ヽる形に磁石を配置す る構成〖こすることがでさる。

[0032] これらの永久磁石として、エネルギー積が他の磁石に比べて大きいネオジム磁石を 用いれば、より高い磁界を強磁性ワイヤに印加し磁ィ匕することができ、より強い磁気 吸引力が得られるので好ま 、。

実施例

[0033] 1.磁気ビーズセパレータ： 本実施例では、図 2に示した磁気分離セパレータ 11のマイクロベッセル 12として、 内径が 10mmであり、マイクロピペット 14には、外径が 6. 5mmのものを用いた。マイ クロベッセル内周部に直径 200 μ m、長さ 30mmの Ni製強磁性ワイヤ 15を 200本用 意し、これを内径 6. 5mmの中空部を有する外径 10mmのドーナツ状ポリウレタン製 多孔保持体で固定し、マイクロベッセル内部に装着した。

[0034] 2.試験液

平均粒径 20nmのォレイン酸被覆したマグネタイトを磁気ビーズとし、このォレイン 酸被覆マグネタイトの分散液が 5mgZmlとなるように調整し、これを試験液とした。

[0035] 3.磁気分離

この試験液 300 1を、磁気ビーズセパレータのマイクロベッセル 12中に分注し、電 磁石を用いて外部磁場 3kGを印加し、 Niワイヤ表面にォレイン酸被覆マグネタイト粒 子を集めた後、分注ピペットチップにより非回収成分を溶液と共に回収した。

[0036] 磁気分離時間は 1、 3、 5、 10分とし、それぞれ回収された上澄み液に含まれるマグ ネタイトを塩酸で溶解し高周波プラズマ発光分析装置 (ICPS)により上澄み液中の 残留 Fe濃度を測定し、原液の Fe濃度と比較することで Niワイヤに回収されたマグネ タイト量を算出した。

[0037] この結果を図 5に経過時間と残留 Fe濃度との関係として示した。図 5から、磁気分 離時間 3分で全体の 98%にあたるマグネタイトが回収され、以降は実験誤差内の値 を示したため、ォレイン酸被覆マグネタイト粒子の回収に必要な時間は 3分以内であ ることがわかった。

[0038] また、 Niワイヤを配置しな 、マイクロベッセルにて、上記と同様に、試験液に外部磁 場 3kGを印加し磁気回収を試みたところ、有限時間内ではォレイン酸被覆マグネタ イト粒子の回収が確認されな力つたことから、この磁気ビーズセパレータカ 平均粒 径 20nmと粒子サイズが極めて小さ ヽォレイン酸被覆マグネタイトに対して、磁気ビ ーズセパレータとしての磁気分離機能およびその効果が実証された。なお、ここでは データ取得の目的から、磁界の発生に電磁石を用いた場合を示したが、磁界の発生 にネオジム磁石などの永久磁石を用いた場合にも、同様の結果が得られた。

[0039] 本発明は、本発明の技術思想およびその特徴力も逸脱しない範囲で、このほかに もさまざまな形で実施することが可能であって、それらはいずれも本発明の範囲内の ものである。

産業上の利用可能性

本発明により、従来は不可能とされていたナノメータサイズの磁気ビーズの高速磁 気分離が可能になった。本発明のナノメータサイズの磁気ビーズは、従来のマイクロ サイズの磁気ビーズに比べ、比表面積が非常に大きいので， 目的物質を特異的吸 着により捕獲し抽出する効率を格段に向上させることが可能となった。し力もこの磁気 ビーズセパレータは、既存のマイクロカラムシステムが有している分注、吸入、吐出、 洗浄などの機能を活用して用いることができるので、簡便に磁気ビーズセパレータを 構成することができるので、その産業上の利用可能性は大であると考えられる。

Claims

請求の範囲

[1] 磁気ビーズで標識された検体を含有する各試験液を収容する複数のマイクロべッ セノレと、

前記複数のマイクロベッセルの各々に磁場を発生させる磁石と、

前記複数のマイクロベッセルの各々の内側に配置され、前記磁石の発生する磁界 によって磁化され磁場勾配を誘起して前記磁気ビーズを吸引する強磁性ワイヤと、 前記各試験液を前記複数のマイクロベッセルの各々に分注し、前記複数のマイクロ ベッセルの各々に分注した前記各試験液の含有する前記磁気ビーズがそれぞれ前 記強磁性ワイヤに吸引された後に前記複数のマイクロベッセル中に残留した各試験 液をそれぞれ吸引し回収する複数の分注器およびピペットチップと

を備えたことを特徴とする磁気ビーズセパレータ。

[2] 前記強磁性ワイヤが、多孔保持体により前記複数のマイクロベッセルの周辺部に保 持されていることを特徴とする請求項 1記載の磁気ビーズセパレータ。

[3] 前記強磁性ワイヤ力 ニッケルおよびパーマロイ力もなる群力も選ばれる少なくとも 一種であることを特徴とする請求項 1記載の磁気ビーズセパレータ。

[4] 前記強磁性ワイヤが、非特異的吸着を生じな!/、物質で被覆されて 、ることを特徴と する請求項 1記載の磁気ビーズセパレータ。

[5] 前記強磁性ワイヤの長手方向を前記試験液の流れる方向に向けたことを特徴とす る請求項 1記載の磁気ビーズセパレータ。

[6] 前記複数のマイクロベッセルが 5〜： LOmmの間隔で二次元配列して 、ることを特徴 とする請求項 1記載の磁気ビーズセパレータ。

[7] 前記複数のマイクロベッセルの各々の間に仕切り板を設け、この仕切り板の一部に 永久磁石を用いたことを特徴とする請求項 1記載の磁気ビーズセパレータ。

[8] 前記仕切り板は前記複数のマイクロベッセルを縦横に仕切る仕切り板であり、この 縦横に仕切る仕切り板の縦および横のうち、一方が仕切り板の厚み方向に着磁され た永久磁石であり、他方が非磁性体であることを特徴とする請求項 7記載の磁気ビー ズセパレータ。

[9] 前記永久磁石がネオジム磁石であることを特徴とする請求項 7記載の磁気ビーズセ ノ レータ。

検体を含有する試験液に、前記検体を特異的吸着する生体活性物質が表面に固 定された磁気ビーズを浸漬し、試験液中の前記検体が特異的吸着した磁気ビーズを 含有する試験液を得る工程と、

前記検体が特異的吸着した磁気ビーズを含有する試験液を磁化された強磁性ワイ ャを有するマイクロベッセルに分注し、前記検体が特異的吸着した磁気ビーズを前 記強磁性ワイヤに吸引させ分離する工程と、

前記検体の特異的吸着した磁気ビーズが分離されて除かれた前記試験液を吸引 分離する工程と、

前記強磁性ワイヤに吸引されて分離された前記検体の特異的吸着した磁気ビーズ から、前記検体を解離して回収する工程と

を備えたことを特徴とする検体の磁気分離方法。