KR100399475B1 - 순환 중인 암세포의 신속하고 효과적인 분리 방법 및 이를위한 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역자기 농후와 다중매개변수 흐름세포계측법 및 면역세포화학적 분석을 조합 수행하여 혈액 중의 암종 세포를 검출, 계수 및 특징화하는 고감도 분석법에 관한 것이다. 이러한 분석은 혈액 1 ㎖ 중의 1 종 이하의 상피 세포를 측정할 수 있으며, 통상의 PCR 또는 1-2 등급 정도의 면역조직화학보다 훨씬 감도가 높다. 또한, 이러한 분석은 암종 세포의 생물학적 특성화 및 스테이징을 돕는다.

Description

순환 중인 암세포의 신속하고 효과적인 분리 방법 및 이를 위한 제제{METHODS AND REAGENTS FOR THE RAPID AND EFFICIENT ISOLATION OF CIRCULATING CANCER CELLS}

미국에서는 매년 새로이 환자 약 600,000 명이 암 진단을 받고 있으며, 5 명중 1 명꼴로 암으로 인해 또는 암 치료와 관련된 합병증으로 사망하게 된다. 이러한 질병의 치료 및 진단을 개선시키고자 하는 상당한 노력이 끊임없이 이루어지고 있다.

대부분의 암 환자는 1차 종양으로 사망하는 것이 아니다. 그 대신에 이들은 전이, 즉 체내에서 본래의 종양으로부터 떨어져 나가서 종종 원거리의 위치까지 이동하는 악성 세포에 의해 형성된 다발성 광역확산 종양 콜로니에 의해 사망하게 된다. 1차 종양이 초기 단계에서 검출될 경우에는 수술, 방사선, 또는 화학요법 또는 이들 치료의 조합에 의해 제거될 수 있다. 불행하게도, 전이성 콜로니는 검출 및 제거가 더 힘들며, 이들 모두를 성공적으로 치료하기가 불가능하다. 그러므로, 임상적인 면에서, 전이는 암의 자연적인 진행에서의 최종적인 단계인 것으로 간주할 수 있다. 또한, 전이 능력은 악성 종양의 독특한 특징을 이루는 특성이 된다.

암 전이는 일련의 복잡한 순차적인 단계를 포함한다. 1) 1차 위치로부터 주변 조직으로의 확장 단계, 2) 체강 및 혈관 침투 단계, 3) 순환계를 통해 원거리의 위치로 수송하기 위한 종양 세포 방출 단계, 4) 정지 부위로의 조직의 재침습 단계, 및 5) 종양 세포의 생존, 혈관 발달 및 종양 성장을 촉진하도록 새로운 환경에 적응하는 단계가 있다.

암과 암의 전이의 복잡성 및 수년에 걸친 암 환자 치료의 좌절감을 기초로 하여, 치료를 가이드하고, 이러한 전이 또는 재발에 대한 치료 효과를 모니터하는 진단 테스트법을 개발하고자 하는 많은 노력이 있어 왔다. 또한, 이러한 테스트는, 유방 종양의 경우에는 유방조영술, 전립선 암의 경우에는 디지탈 직장 검사와 같은 비교적 초기 단계에 사용되는 테스트 대신에, 암 스크리닝에 사용될 수 있었다. 이러한 목적을 위해 지난 20 년간 다수의 테스트가 개발되어 왔으며, 이들의 효능이 평가되어 왔다. 이러한 시도 중의 하나는 암배 항원(carcinoembryonic antigen, CEA)에 대한 면역분석 제제이었다. 이러한 항원은 태내 세포에서 나타나며, 특정 암의 경우에는 종양 세포상에 다시 나타난다. 다수의 기타의 "종양" 항원, 예컨대 PSA, CA 15.3, CA125, PSMA, CA27.29 뿐 아니라 CEA를 위한 테스트의 유용성을 평가하고자 하는 대대적인 시도가 이루어져 왔었다. 이러한 노력들은 혈액중의 항원이 일반적으로 예측되지 않으나, 환자에게 거의 희망이 없는 경우 종종 검출되기 때문에 실효성이 그다지 없는 것으로 입증되었다. 그러나, 지난 수년 동안 암, 즉 전립선암에 대한 전립선 특이성 항원(PSA)의 조기 검출에 한 테스트 방법이 유용한 것으로 밝혀졌다. 추적 신체 검사 및 생체검사를 사용할 경우, PSA 테스트는 치료 시기가 가장 바람직한 시기인 초기에 전립선암을 검출하는데 있어서 중요한 역할을 한다.

이러한 PSA 테스트의 성공에도 불구하고, 이러한 테스트는 보완하여야할 사항을 여전히 지니고 있다. 예를 들면, 고농도의 PSA는 항상 암과 관련되어 있지 않으며, 종양의 전이 잠재성을 나타내지도 않는다. 이는 부분적으로는 PSA가 정상의 전립선 조직의 성분이면서 기타의 미지의 요인이 될 수도 있기 때문이다. 더욱이 많은 비율의 전립선암 환자들은 생명을 위협하지는 않으나, 국소화된 질환을 지속적으로 지니고 있다. 전이가 될 암환자와 전이되지 않을 환자 사이의 우수한 합치를 얻고자 하는 요구에 의해서, 전립선 세포가 순환 중인지의 여부를 결정하고자 하는 시도가 이루어져 왔다. 고농도의 PSA 및 생체검사 데이타에 순환 중인 종양 세포의 존재가 부가될 경우, 이러한 순환 중인 종양 세포의 존재는 환자를 어느 정도로 강력하게 치료하여야 하는가와 관련한 지시를 얻을 수 있게 된다.

순환 중인 전립선 종양 세포의 존재를 결정하기 위한 접근 방법으로는 혈액 중의 PSA의 메신저 RNA의 형질발현에 대한 테스트로 이루어져 왔었다. 이는 혈액 시료로부터의 mRNA 모두를 분리하고, 역전사 효소 PCR을 수행하는 까다로운 절차를 통해 수행된다. 오늘날까지, 이러한 세포의 혈중 존재와 강력한 치료를 요하는 환자를 예측하는 능력 사이에는 아무런 상관관계가 없다[Gomella LG.J. of Urology, 158:326-337 (1997)]. PCR이 많은 경우에 있어서 불가능하지 않을 경우, PCR은 생물학적 시료의 단위 부피당 종양 세포수의 정량적 측정을 수행하는 것이 어려움에 주목한다. 또한, 이러한 기법을 사용할 경우에는 잘못된 양성 반응이 관찰되기도 한다. 또한, 조사한 시료 크기를 기준으로 한 이러한 기법의 감도에는 유한의 실질적인 한계치가 존재하는 것이 또한 한 단점이 된다. 통상적으로, 테스트는 간섭 적혈구 세포로부터 정제된 세포 10⁵∼10⁶에서 수행한다. 이는 혈액 0.1 ㎖당 하나의 종양 세포 감도의 실질적인 하한에 해당하는 것이다. 그래서, 시그날이 검출될 수 있기 이전에 혈액 1 ㎖당 종양 세포 약 10 개가 필요하게 된다. 추가적인 사항으로서, 종양 세포는 종종 유전적으로 불안정하다. 따라서, 유전적 재배치 및 서열 변화를 지닌 암 세포는 PCR 분석에서 결실될 수 있는데, 이는 PCR 프라이머와 표적 서열의 사이에 필수 서열 상보성이 상실될 수 있기 때문이다.

요컨대, 유용한 진단 테스트는 감도가 매우 높고 그리고 정량적으로 신뢰성이 있어야만 하는 것이다. 혈액 테스트를 실시하여 혈액 1 ㎖중에서 단일의 종양 세포가 존재할 수 있는 것으로 검출되는 경우, 이는 순환 중인 세포가 평균 총 3000∼4000 개에 해당한다. 동물에게서 형성된 종양에 대한 접종 연구에서, 이러한 수의 세포는 사실상 종양의 형성을 초래할 수 있다. 게다가, 3000∼4000 개의 순환 중인 세포가 종양 중의 총 세포의 0.01%에 해당하는 경우, 이는 총 세포수가 약 4×10⁷개가 된다. 이와 같은 수의 세포를 함유하는 종양은 현존하는 어떠한 기법으로도 식별되지 않는다. 그래서, 종양 세포가 암의 초기 단계에 탈락될(shed) 경우, 전술한 감도를 갖는 테스트는 암을 검출하게 된다. 종양 세포가 종양의 크기와 작용적 관련성에서 벗어나는 경우, 정량적인 테스트는 종양 존재를 평가하는데 있어서 이롭게 된다. 지금까지는 아주 초기 단계의 암에서 순환 중인 종양 세포의 존재와 관련하여 어떠한 정보도 존재하지 않았다. 또한, 이러한 세포의 존재 및 이러한 정보의 잠재성과 관련하여서는 의학 문헌에서 상당히 우려스럽다. 일반적인 견해로는, 종양은 초기에는 한 부위에만 한정되어 있으며, 질환의 초기 단계에서는 순환 중인 세포가 거의 없다는 점이다. 또한, 초기 단계에서 암 세포를 검출하는 능력이 임의의 유용한 정보를 줄 것이라는 것에 대해서도 의구심이 존재하였다.

이러한 사실들을 바탕으로 하여, 2차 종양이 형성되기 이전에 전이 가능성을 갖는 순환 중인 종양 세포를 식별하는 방법은 특히 암에서, 특히 초기 단계에서 매우 바람직한 방법이라는 점은 명백하다. 통상의 면역분석에 비해서 이러한 테스트가 지니는 잇점에 대해서는, 매우 민감한 면역분석은 작용성 감도의 하한치가 10^-17물인 점을 고려한다. 한 종양 세포가 혈액 1 ㎖로부터 포착되어 분석될 수 있는 경우, 세포당 수용체 100,000개로 추산되는 표면 수용체의 몰 수는 10^-19몰이 된다. 세포 상에서는 약 300 분자가 검출될 수 있는데, 이러한 분석은 작용성 감도가 10^-22몰 정도가 되며, 이는 상당히 괄목할 만한 것이다. 상기의 희귀 세포 분리에 있어서의 이러한 감도를 얻는 것과 이들의 특성을 손상시키거나 또는 방해하지 않는 방식으로 이들을 분리하는 것은 만만찮은 일이다.

많은 실험실 및 임상적 절차에서는 생물학적 시료로부터 희귀 세포를 분리하기 위한 생체특이성 친화성 반응을 사용한다. 이러한 반응은 통상적으로 진단 테스트에서 사용되거나, 또는 광범위한 표적 물질, 특히 세포, 단백질, 박테리아, 바이러스, 핵산 서열 등과 같은 생물학적 독립체의 분리에 사용된다.

표적 물질이 특이적으로 결합하는 기타의 물질 및 해당 물질의 사이에서 착물의 형성을 기초로 하여 전술한 표적 물질을 분석하거나 또는 분리하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있다. 미결합 물질로부터 착물을 분리하는 것은 침강, 또는 표적 물질에 커플링된 미분 입자 또는 비이드의 원심분리와 같이 중력을 이용하여 수행될 수 있다. 필요할 경우, 이러한 입자 또는 비이드는 결합/유리 분리 단계를 촉진시키도록 자기성을 띨 수도 있다. 자기 입자는 면역 및 기타의 생체특이성 친화성 반응에서의 용도가 당업계에 주지되어 있다. 참고 문헌[미국 특허 제4,554,088호 및Immunoassays for Clinical Chemistry,147-162 페이지, Hunter et al. 편저, 영국 에딘버러 처칠 리빙스턴 (1983)]. 일반적으로, 자기 또는 중력 분리를 돕는 임의의 물질을 이러한 목적에 사용할 수도 있다. 그러나, 이는 자기 분리 방법이 더욱 바람직한 것임은 명백한 사실이다.

자기 입자는 대(1.5∼약 50 미크론), 소(0.7∼1.5 미크론) 또는 콜로이드(<200 ㎚) 등의 크기를 기준으로 하여 분류할 수 있는데, 이는 나노입자로 불리운다. 후자는 또한 철 함유 유체 또는 철 함유 유체 유사 물질로 주지되어 있으며, 이는 통상의 철 함유 유체의 많은 특성을 지니고 있는데, 본 명세서에서는 이를 때때로 콜로이드성 초상자성 입자로 일컫는다.

전술한 유형의 자기 소입자는 생체작용성 중합체(예, 단백질)로 코팅되어 표면적이 크게 되며, 적당한 반응 역학을 제공하기 때문에, 이는 생체특이성 친화성 반응과 관련된 분석에 있어서 매우 유용하게 된다. 0.7∼1.5 미크론인 자기 입자는 예를 들면 미국 특허 제3,970,518호, 동제4,018,886호, 동제4,230,685호, 동제4,267,234호, 동제4,452,773호, 동제4,554,088호, 동제4,659,678호를 비롯한 특허 문헌에 기재되어 있다. 이들 특정의 입자는 면역 제제에 대해 유용한 고형의 지지물인 것으로 개시되어 있다.

전술한 바와 같은 자기 소입자는 일반적으로 2 개의 범주에 속하게 된다. 제1의 범주는 영구 자화성 또는 강자성인 입자를 포함하는 것이고, 제2의 범주는 자장에 노출시에만 벌크 자기 특성을 나타내는 입자를 포함한다. 이 제2의 입자는 자기적 반응성 입자로 불리운다. 자기 반응성 특성을 나타내는 물질은 때때로 초상자성으로 기재된다. 그러나, 예를 들어 자기 산화철과 같이 통상적으로 강자성으로 간주되는 물질은 직경이 약 30 ㎚ 이하인 결정으로 제공되는 경우 초상자성 특징을 띨 수 있다. 반대로, 비교적 크기가 더 큰 강자성 물질의 결정은 자장 노출 후에 영구 자기 특성을 보유하며, 입자간 강한 상호작용으로 인해서 차후에 응집되는 경향이 있다.

전술한 자기 소입자와 마찬가지로, 자기 대입자(>1.5 미크론∼약 50 미크론)는 초상자성을 띨 수 있다. 이러한 물질의 통상의 예는 Ugelstad의 미국 특허 제4,654,267호에 기재되어 있으며, 다이날(노르웨이 오슬로 소재)이 제조하고 있다. Ugelstad의 기법은 중합체 입자가 팽창되며, 이 팽창된 입자에 자철광 결정이 매립되는 것인 중합체 입자의 합성법이 기재되어 있다. 분산된 자철광 결정의 존재하에 중합체 입자를 합성하여 크기가 동일한 기타의 물질을 생성할 수도 있다. 이에 의하면, 중합체 망상구조에 자철광 결정이 포획되며, 그리하여 생성된 물질이 자기성을 띠게 된다. 이 두 경우에 있어서, 생성된 입자는 초상자성 특성을 지니며, 이는 자장의 제거시에 용이하게 분산되는 특징을 나타낸다. 이하에서 후술될 자기 콜로이드 또는 나노입자와는 달리, 자기 소입자 뿐 아니라 이들 입자는 단순한 실험실 자기와는 용이하게 분리되는데, 이는 입자당의 자기 물질의 질량 때문이다. 그래서, 분리는 수백 가우스/㎝ 내지 약 1.5 킬로가우스/㎝ 정도로 낮은 구배로 수행된다. 반대로, 콜로이드 자기 입자(약 200 ㎚ 이하)는 확산 에너지, 입자당 작은 자기 질량 및 스토크스 드랙(Stokes drag)으로 인해서 자기 구배가 실질적으로 더 높다.

Owen 등의 미국 특허 제4,795,698호는 중합체의 존재하에 Fe⁺²/Fe⁺³염으로부터 자철광을 형성하여 생성되는 중합체 코팅된 콜로이드성 초상자성 입자에 관한 것이다. Molday의 미국 특허 제4,452,773호에는 Owen 등의 문헌에 기재된 물성과 유사한 물질이 기재되어 있는데, 이 물질은 고 농도의 덱스트란의 존재하에 염기 첨가 반응에 의해 Fe⁺²/Fe⁺³염으로부터 자철광 및 기타의 산화철을 형성하여 생성된다. 그리하여 이 두 방법으로부터 생성된 입자는 수개월 정도의 관찰 기간 동안 수성 현탁물으로부터 침강되지 않는 뚜렷한 경향이 있다. 그리하여 생성된 물질은 콜로이드 물성을 지니며, 이는 세포 분리에 있어서 매우 유용한 것으로 입증되었다. Molday의 기법은 독일 베르기쉬 글라드바흐에 소재하는 밀테니이 바이오텍 및 카나다 밴쿠버의 테리 토마스가 상품화하였다.

초상자성 콜로이드성 입자에 대한 또다른 제조 기법으로는 미국 특허 제5,597,531호에 기재되어 있다. 전술한 Owen 등 또는 Molday의 특허 문헌과는 달리, 이 문헌에서의 입자는 25∼120 ㎚의 준안정 결정질 클러스터로 고동력 음파 에너지에 의해 분산되어 있는 예비형성된 초상자성 결정에 생체작용성 중합체를 직접 코팅시키므로써 생성된다. 생성된 입자를 본 명세서에서는 직코팅된 입자로 칭하며, 이는 Molbay 또는 Owen 등의 문헌과 동일한 총 크기의 콜로이드성 입자보다 훨씬 더 큰 자기 모멘트를 갖는다.

자기 분리 기법은 이미 주지되어 있는데, 이는 유체 매질로부터 강자성체를 분리하기 위해 유체 매질에 자장을 걸어주는 것이다. 반대로, 자기 반응이 비교적 약한 것과 관련하여 현탁물 중에 잔류하는 콜로이드성 초상자성 입자는 이들이 현탁되어 있는 비-자기 유체 매질로부터 상기 입자를 분리하도록 고구배 자기 분리(HGMS) 기법을 사용할 것을 요하고 있다. HGMS계에서, 자장의 구배, 즉 공간 도함수는 소정의 포인트에서의 장의 세기에 의해 나타나는 것보다 현탁된 입자의 양상에 더 커다란 영향을 미친다.

HGMS계는 2 개의 커다란 범주로 나눌 수 있다. 제1의 범주에는 분리 챔버 또는 용기의 외부에 전적으로 위치하는 자기 회로를 사용하는 자기 분리계가 있다. 이러한 외부 분리기의 예로는 Liberti 등의 미국 특허 제5,186,827호에 기재되어 있다. 이 특허 문헌에 기재된 수개의 실시태양에서, 필수 자기장 구배는 자석의 유사 극이 장 대향 배치에 있도록 비자기 용기의 주변에 영구 자석을 배치하므로써 생성된다. 이러한 시스템에서 얻을 수 있는 테스트 매질내의 자기장 구배의 정도는 자석의 세기 및 자석 사이의 이격 거리에 의해 제한된다. 그래서, 외부 구배계를 사용하여 얻을 수 있는 구배에는 유한의 한계가 존재하게 된다.

또다른 유형의 HGMS 분리기는 1) 적용된 자기장을 강화하고, 2) 테스트 매질 내의 자기장 구배를 생성하도록 테스트 매질내에 배치된 강자성 수집 구조물을 이용한다. 한 공지된 유형의 내부 HGMS계에서, 자석에 이웃하게 배치된 컬럼내에 미세 강철솜 또는 거즈를 충전시킨다. 적용된 자기장은 현탁된 자기 입자가 와이어의 표면을 향해 유인되어 이에 접착되도록 강철 와이어의 부근에 집중된다. 이와 같은 와이어상에서 생성된 구배는 와이어 직경이 증가함에 따라 자기 범위가 감소하도록 와이어의 직경에 역비례하게 된다. 그래서, 매우 큰 구배가 생성될 수 있다.

내부 구배계의 단점으로는 강철솜, 거즈 물질 또는 강철 마이크로비이드를 사용하는 것으로 인해서, 교차 와이어의 부근에서 또는 교차 와이어의 사이의 간극내에서 모세관 작용에 의해 테스트 매질의 비자기 성분을 포획할 수 있다는 것이다. 다양한 코팅 기법이 이러한 내부 구배 컬럼에 사용될 수 있으나[참고 문헌[Miltenyi의 미국 특허 제5,693,539호, Kronick의 미국 특허 제4,375,407호], 이러한 계에서의 커다란 표면적은 흡착으로 인한 회수상의 문제가 생기게 된다. 그래서, 내부 구배계는 바람직하지 못하며, 특히 저주파수 포획된 독립체의 회수가 분리의 목적이 되는 경우에는 더욱 그러하다. 또한, 이들은 자동화가 어렵고 비용 또한 많이 들게 된다. Owen 등의 문헌 및 Molday의 문헌에 기재된 물질 모두는 이러한 고구배 컬럼을 사용하여여만 한다.

반대로, 세포 분리를 위한 외부 구배를 사용한 HGMS 접근법은 많은 편리성을 제공하게 된다. 우선, 단순한 실험실 용기, 예컨대 시험관, 원심 분리관 또는 심지어 진공용기(혈액 채취에 사용됨)를 사용할 수도 있다. 외부 구배가 전술한 미국 특허 제5,186,827호에 기재된 바와 같은 4극자/6극자 장치를 사용하는 경우이거나 또는 Liberti 등의 미국 특허 제5,466,574호에 기재된 대향 쌍극자 배치와 같이 분리된 세포의 단층을 생성하는 유형의 것일 경우, 세포의 세척 또는 차후의 치료가 용이하게 된다. 또한, 이러한 시험관 또는 유사한 용기로부터의 세포의 회수는 간단하며, 효율적인 방법이 된다. 이는 특히 고구배 컬럼으로부터의 회수와 비교하였을 경우에 그러하다. 또한, 이러한 분리 용기는 시료의 부피를 감소시킬 수 있는 능력을 나타내는 기타의 중요한 특성을 제공하게 된다. 예를 들면, 특정의 사람의 혈액 세포 개시(예, 자기 표지된 CD 34⁺세포)가 점도를 감소시키기 위해 완충액을 사용하여 50% 희석된 혈액 시료 10 ㎖로부터 분리될 경우, 15 ㎖의 원추형 시험관을 적절한 4극자 자기 장치내의 분리 용기로서 사용할 수 있다. 15 ㎖의 용액으로부터 제1의 분리를 수행한 후, 회수된 세포를 3 ㎖에 재현탁시킨다. 그후, 제2의 세척/분리를 수행하고, 분리된 세포를 최종 부피 200 ㎕에 재현탁시킨다. 비결합 세포를 제거하기 위해 세척 및/또는 분리 및 재현탁 이후, CD 34⁺세포를 200 ㎕ 부피에 효과적으로 재현탁시킬 수 있다. 이러한 분리기에 대해 최적화되어 있는 직코팅된 철 함유 유체를 사용하여 적절하게 처리된 용기내에서 주의하여 수행할 경우, 세포 회수는 항원 밀도에 따라서 40∼90% 범위내로 효과적으로 수행된다. 이러한 기법 및 제제는 전술한 암 테스트의 유형에 필요한 감도를 얻는데 있어서 필수적이다.

자기 분리가 수행될 수 있는 효율 및 자기 표지된 세포의 회수 및 순도는 많은 요인에 의해 결정된다. 이의 예로는 분리하고자 하는 세포수, 이러한 세포수용체의 밀도, 세포당 자기 부하, 자기 물질의 비특이성 결합(NSB), 사용한 기법, 용기의 특성, 용기 표면의 특성, 매질의 점도 및 사용된 자기 분리 장치 등이 있다. 계의 비특이적 결합 정도가 통상의 경우와 같이 실질적으로 일정할 경우, 표적 집단이 감소할수록 순도도 감소하게 된다. 예로서, 초기의 혼합물 중에서 0.25%로 존재하는 집단의 80%가 회수되는 0.8% NSB를 포함하는 계는 순도가 25%이다. 반면, 초기 집단이 0.01%로 존재할 경우(10⁶개의 방관자 세포 중의 표적 세포 1 개) 그리고, NSB가 0.001%인 경우, 순도는 8%가 된다. 순도가 높을수록 분석이 용이해지고 우수해진다. 그래서, 매우 낮은 비특이성 결합이 중요한 희귀 세포 분석을 수행하는데 필요하게 되는 것이 명백하다.

표적화된 세포의 집단이 작을수록, 자기 표지화 및 회수가 어렵다는 것은 그리 명백하지 않다. 또한, 표지 및 회수는 사용한 자기 입자의 물성에 따라 크게 좌우된다. 예를 들면, 세포를 커다란 자기 입자, 예컨대 Dynal 비이드와 함께 항온배양할 경우, 비이드는 크기가 너무 커서 효과적으로 확산되지 못하기 때문에 계의 혼합에 의해 생성된 충돌에 의해 세포가 표지된다. 그래서, 세포가 혈액 1 ㎖ 당 세포 1 개 이하의 빈도수로 집단 중에 존재할 경우, 아주 초기 단계의 암에서는 종양 세포에서의 경우와 같이, 표적 세포의 표지 가능성이 계에 첨가되는 자기 입자의 수 및 혼합 시간의 길이와 관련을 갖게 된다. 이들 세포와 상기 입자를 상당 시간 동안 혼합하는 것이 해롭기 때문에, 가능한한 입자 농도를 크게 증가시켜야만 한다. 그러나, 기타의 혈액 세포와 혼합된 희귀 세포 대신에, 분리시에 다량의 자기 입자와 혼합된 희귀 세포를 사용할 수 있기 때문에, 자기 입자를 첨가할 수 있는 양은 한정되어 있다. 후자의 조건에서는 해당 세포를 계수하거나 또는 이들을 검사할 수 있는 능력이 크게 향상되지는 않는다.

드문 빈도로 존재하는 세포(혈액 1 ㎖당 세포 1∼50)를 분리하는데 크기가 더 큰 입자를 사용하는 경우에는 단점이 있다. 크기가 더 큰 자기 입자를 사용하므로써 외부 구배의 디자인이 매우 간단해지고 자기 구배가 비교적 낮게 됨에도 불구하고, 커다란 입자는 케이지와 같은 형태로 세포의 주위로 모이게 되어 세포의 관찰 또는 분석이 곤란해진다. 그래서, 자기 입자는 분석 이전에 표적 세포로부터 방출되어야만 하는데, 이러한 입자의 방출은 기타의 합병증을 유발하는 것이 명백하다.

전술한 사항들을 토대로 하면, 높은 자기성, 낮은 비특이성 결합 및 콜로이드성 자기 입자를 사용하는 외부장 장치로 고구배 자기 분리를 수행하는 것은 특히 해당 세브세트가 전체 집단의 작은 분획만을 포함하는 경우, 진핵 세포의 혼합 집단으로부터의 해당 세포 서브세트를 분리하는 방법이 된다. 이러한 물질은 확산 특성을 지니므로 혈액 중의 종양 세포와 같은 희이벤트를 용이하게 발견할 수 있으며, 자기 표지시키게 된다. 이러한 분리는 일반적으로 해당 특이성 세포 서브세트에 대해 독특한 세포 표면 항원의 식별에 따라 결정되며, 이러한 종양 세포의 경우, 적합한 모노클로날 항체 접합체 철 함유 유체가 표적이 될 수 있는 종양 항원이 될 수 있다. 또한, 혈액 시료를 검사시에, 통상적으로 혈액 세포 중에서 발견되지 않는 상피 세포와 같은 세포의 분류 결정인자는 적절한 수용체를 제공할 수 있다.

적합한 자기 부하를 얻을 수 있을 경우, 이러한 분리를 위한 콜로이드성 자기 물질을 사용하는 기타의 타당한 이유가 존재한다. 적합한 부하를 사용할 경우, 적절히 희석된 전혈의 점도 정도의 점도를 갖는 매질 중에서도 분리가 가능할 수 있도록 세포 상에 충분한 힘이 발휘된다. 알려진 바와 같이, 약 200 ㎚ 이하의 콜로이드성 자기 물질은 브라운 운동을 하는데, 이는 희귀 세포와 충돌하여 자기 표지되는 능력을 크게 향상시킨다. 이는 미극 특허 제5,541,072호에 기재되어 있는데, 이 문헌에는 매우 효과적인 종양 세포 제거 실험의 결과가 평균 직경이 100 ㎚인 콜로이드성 자기 입자 또는 철 함유 유체를 사용하는 것으로 기재되어 있다. 이러한 크기 범위의 입자 크기 또는 이 크기 범위 이하의 입자를 포함하는 콜로이드성 물질은 일반적으로 세포의 검사를 방해하지 않는다. 그리하여 복구된 세포는 흐름 세포계측법, 레이저 주사 현미경, 또는 가시 또는 형광 기법을 사용하는 현미경에 의해 조사할 수 있다.

발명의 개요

본 발명은 암의 진단 및 치료에 대한 유의적인 임상적 분지(ramifiction)를 갖는 중요한 수개의 발견을 토대로 한다. 1) 종양 세포는 임상적으로 편재되어 있는 1차 종양을 지닌 것으로 간주되는 환자의 혈액 중에도 존재하며, 2) 순환 중인 종양 세포수는 초기 단계로부터 말기 단계까지 암의 모든 단계와 상호 관련이 있고, 3) 순환시에 존재하는 종양 세포수의 변화는 질환의 진행 정도를 나타내는 것이다. 순환 중인 종양 세포수의 감소는 환자의 상태 또는 치료의 효능의 진전을 나타내는 반면, 종양 세포수의 증가는 질환이 악화되었다는 것을 나타낸다.

본 발명은 종양 세포 뿐 아니라, 희귀 세포 또는 생물학적 시료로부터의 기타의 생물학적 독립체의 특성화를 위한 신속하고 효과적인 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 해당 독립체에 대한 효율적인 농후가 가능한, 감도가 높은 분석 기법을 제공한다. 이러한 2 단계의 방법은 표적 생체독립체의 농후를 제공하면서 분석 전에 상당량의 조직파편 및 기타의 방해 물질을 제거하게 되는데, 이 방법은 그렇지 않으면 실행할 수 없는 시료 크기의 검사를 가능하게 된다. 본 명세서에 기재된 방법은 면역자기 농후물의 성분과 다중매개변수 흐름 세포계측, 현미경 및 면역세포화학적 분석이 독특한 방식으로 혼합되어 있다. 또한, 적절한 표지화에 의한 표적 세포 밀도의 밀도 구배 원심 분리 또는 패닝(panning) 또는 변형과 같은 기타의 농후화 수단을 사용할 수 있다. 바람직한 실시태양에 의하면, 본 발명의 방법은 암의 스테이징, 모니터링 및 스크리닝으로 전혈을 분석할 수 있다. 이러한 분석의 민감한 특성으로 인해서, 잔류 질환의 검출이 가능하게 되며, 이는 암의 재발을 모니터할 수도 있다.

본 발명의 한 실시태양에 있어서, 생물학적 검체는 해당 희귀 세포를 함유할 것으로 추정되는 혼합 세포 집단을 포함하는 것으로, 이 검체는 환자로부터 얻는다. 생물학적 검체를, i) 기타의 시료 성분을 거의 배제한 혈액 세포에서 발견되는 것보다는 희귀 세포 결정인자 또는 상이한 결정인자의 클래스와 특이적으로 반응성을 갖는 생체특이성 리간드에 커플링되는 자기 입자와, ii) 희귀 세포를 표지화하는 1 종 이상의 생체특이성 제제와 혼합하여 면역자기 시료를 생성한다. 생성된 면역자기 시료를 자기장으로 처리하는데, 이 자기장은 시료를 비표지화된 분획, 및 만약 존재할 경우에는 검체 중에 존재할 수 있는 해당 희귀 세포를 포함하는 표지화된 자기 분획으로 분리하는데 효과적이다. 그리하여 분리된 세포 집단을 분석하여 희귀 세포의 존재 및 수를 측정한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 본 방법에 사용된 입자는 콜로이드성 나노입자이다.

본 발명의 또다른 실시태양에 있어서, 생물학적 검체는 환자로부터 얻는다. 그리하여 면역자기 시료가 생성되는데, 여기서 생물학적 검체는 혈액 중에 발견되는 것보다는 희귀 세포 결정인자 또는 상이한 결정인자의 클래스와 반응하는 모노클로날 항체에 커플링되는 콜로이드성 자기 입자와 혼합한다. 모노클로날 항체에 대한 대안으로서, 항체의 단쇄 또는 조작된 분절을 사용할 수도 있다. 제조는 자기장으로 처리하여 검체의 희귀 세포 성분을 농후시킨다. 리포터 분자로 표지된 모노클로날 항체의 제2의 세트를 시료에 첨가하고, 세포를 다시 자기적으로 분리하여 미결합된 제제를 제거하여 배경 염색을 감소시킨다. 또한, 본 명세서에서 세포 특이성 염료로 칭하는, 세포로서 물질을 식별할 수 있는 핵산 염료 또는 기타의 리포터 분자를 시료에 첨가하여 임의의 잔류 비핵화 세포 또는 기타의 시료 성분을 흐름세포계수, 현미경 또는 기타의 분석 플랫폼 분석 이전에 제거한다. 세포 특이성 염료는, 얻은 시그날의 양이 세포에 대해 얻은 것에 대해 전형적이 되거나 또는 얻은 상이 세포 및 핵막, 핵 및 미토콘드리아와 같은 세포의 전형적인 특성을 나타내도록 DNA, RNA, 단백질 또는 리간드와 반응성을 지닐 수 있어야 한다.

본 발명의 추가의 실시태양에 있어서, 분리된 세포는 흐름세포계수 또는 기타의 분석 플랫폼에 의한 면역세포화학적 분석으로 처리한다. 이러한 분석에 의하면, 진단이 더 용이하게 되며, 임상의에게 중요한 정보를 제공하게 된다.

본 발명의 방법은 약제, 방사선 또는 종양을 제거하는 외과적 치료후 순환중인 잔류 암세포를 평가하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 질환의 발병, 재발 및/또는 진행에 대한 표시로서 순환 중인 종양 세포의 존재 및 수에 대해 환자를 검사하도록 수년에 걸쳐서 주기적으로 실시할 수 있다.

본 발명의 또다른 특징으로는, 자기 물질의 나노입자 코어, 및 자기 코어에 생물학적 거대분자의 비특이성 결합을 방해하는데 충분량으로 자기 코어상의 베이스 코팅 물질을 포함하는 코팅된 자기 입자를 제공한다. 이들 자기 입자는 매우 희귀한 세포를 효과적으로 분리하는데 필요한 농후 정도를 얻는데 필수적인 매우 효율적인 표적 포획 뿐 아니라, 매우 낮은 비특이성 결합을 특징으로 한다. 또다른 실시태양에 있어서, i) 자기 물질의 나노입자 코어, ii) 접근 가능할 경우 생물학적 거대분자에 베이스 코팅된 입자를 비특이적으로 결합되도록 하는 불연속의 1 이상의 부위를 제공하는, 자기 코어상의 불연속 코팅을 형성하는 베이스 코팅 물질 및 iii) 생물학적 거대분자에 의한 불연속 부위로의 접근을 방해하는 추가의 코팅 물질을 포함하는 코팅된 자기 입자가 제공된다. 바로 앞에서 기재한 입자의 자기 코어 물질은 1 종 이상의 전이 금속 산화물을 포함할 수 있으며, 적절한 베이스 코팅 물질은 단백질을 포함한다. 코팅 자기 입자에 적절한 단백질의 비제한적인 예로는 소의 혈청 알부민 및 카제인 등이 있다. 추가의 코팅 물질은 초기의 코팅 단백질, 또는 자기 코어상의 베이스 물질에 커플링된 특이성 결합쌍의 한 성분이 될 수 있다. 특이성 결합쌍의 예로는 바이오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉시틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc 및 아비딘-바이오틴이 있다. 한 실시태양에 있어서, 특이성 결합쌍의 일원은 이중작용성 결합 화합물을 통해서 베이스 코팅 물질에 커플링된다. 이중 작용성 결합 화합물의 예로는 숙신이미딜-프로피오노-디티오피리딘(SPDP) 및 설포숙신이미딜-4-[말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)가 있으나, 이와 같은 각종 헤테로이중작용성 링커 화합물은 미국 일리노이주 락포드에 소재하는 피어스에서 시판한다.

본 발명의 코팅된 자기 입자는 70∼90%의 자기 질량을 갖는 것이 바람직하다. 바람직한 실시태양에 있어서, 자기 입자의 대부분은 입자 크기가 90∼150 ㎚ 범위내가 된다. 입자가 좀더 단일분산성이 되도록, 예를 들면 90∼120 ㎚ 또는 120∼150 ㎚ 범위내가 되도록 입자를 합성할 수 있다. 본 발명의 입자는 통상적으로 생물학적 적합성 배지 중에서 현탁된다.

본 발명의 추가의 특징에서, 순환 중인 희귀 세포의 존재에 대해 환자의 시료를 스크리닝하기 위한 테스트 키트가 제공된다. 스크리닝 키트는

i) 희귀 세포상에서의 제1의 특징적인 결정인자에 대한 친화도를 갖는 생체특이성 리간드에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링되는 코팅된 자기 나노입자,

ii) 희귀 세포상에 존재하는 제2의 특징적인 결정인자에 대한 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 생체특이성 제제, 및

iii) 분석으로부터 기타의 비표적 또는 시료 독립체를 배제한 세포 특이성 염료를 포함한다.

특히 바람직한 실시태양에 있어서, 순환 중인 암 세포에 대해 생물학적 시료를 스크리닝하기 위한 키트가 제공된다. 스크리닝 키트는

i) 암 세포상의 제1의 특징적인 결정인자에 대한 친화성을 갖는 생체특이성 리간드에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링되는 코팅된 자기 나노입자,

ii) 암 세포상에 존재하는 제2의 특징적인 결정인자에 대한 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 생체특이성 제제,

iii) 분석으로부터 기타의 비표적 독립체를 배제시키기 위한 세포 특이성 염료를 포함한다. 본 명세서에서 제공된 키트는 추가로 희귀하지 않거나 또는 비종양 세포에 대한 친화성을 갖는 항체, 생물학적 완충제, 투과성 완충제, 프로토콜 및 필요할 경우 정보 시이트를 더 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 콜로이드성 자기 입자는 항-EpCAM(상피 세포 유착 분자에 대해 결합 특이성을 갖는 항체)에 접합되어 있으며, 이 생체특이성 제제는 모노클로날 항체의 패널을 포함하고, 세포 특이성 염료는 핵산을 염색시킨다.

본 발명의 키트는 전이성 암 세포의 전이 잠재성 및 공격성 뿐 아니라, 순환중인 전이성 암 세포의 유형을 진단하기 위한 제제를 함유할 수도 있다. 이러한 실시태양에 있어서, 키트는 전술한 제제를 함유하며, 또한 암 진단을 돕는 추가의 항체 마커를 포함한다. 예로서 유방암의 경우, 이와 같은 항체는 항-MUC-1, 항-에스트로겐 수용체, 항-프로게스테론 수용체, 항-CA27-29, 항-CA15.5, 항-카텝신 D, 항-p53, 항-유로키나제형 플라스미노겐 활성제, 항-표피 성장 인자, 항-표피 성장 인자 수용체, 항-BRCA1, 항-BRCA2, 항-전립선 특이성 항원, 항플라스미노겐 활성제 억제제 및/또는 항-Her2-neu 항체를 포함할 수 있다. 공격성 및 침입성에 대한 추가의 마커는 Lewis a (Lea). 시알릴 Lewis a(sLea), 인테그린(CD49b, CD49c, CD29), 젤라티나제 A 및 B(MMP-2, MMP-9), 조직 콜라게나제(MMP-1), 섬유아세포 활성 단백질(FAP), 구아니디노벤조아타제, CEA, S100족(S100A4, mtsl, 18A2/mtsl, pEL-98, p9Ka, 메타스타신), 사이클린 A 및 E, p27, p53, 혈관 내피 성장 인자(VGEF) 및 E-카드헤린이다.

본 발명의 또다른 실시태양에 있어서, 암의 재발 및/또는 요법에 대한 반응에 대해 환자를 모니터링하기 위한 테스트 키트가 제공된다. 또한, 이러한 특정한 키트는 위험성이 높은 환자를 혈액 중의 특정의 종양 세포의 존재에 대해 평가하는데 사용될 수 있다. 환자를 모니터링하기에 적절한 키트는 용기, 항-EpCAM에 접합된 콜로이드성 자기 입자, 환자를 모니터링하는 특정의 암 세포에 대해 특이성을 갖는 1 종 이상의 모노클로날 항체, 및 핵산 또는 막 염료와 같은 세포로서 물질을 식별할 수 있는 형광 리포터 분자를 포함한다. 유방암 환자를 모니터링하는데 적절한 키트는 특정의 유방암 마커, 예컨대 Her-2-neu에 대한 결합 친화성을 갖는 항체를 포함한다. 전술한 키트는 환자를 유방암에 대해 스크리닝, 진단 및 모니터링하기에 적절하다. 단순히 테스트 키트 중에 제공된 항체를 달리하므로써 본 발명에 의해 각종 암을 스크리닝, 진단 및 모니터링할 수 있다는 것을 당업자라면 알 수 있을 것이다. 예를 들면, 피실험자를 전립선 암의 존재에 대해 테스트하고자 할 경우, 전립선 특이성 항원에 대해 특이성을 갖는 항체를 사용할 수 있을 것이다. 기타의 전립선 암에 대한 마커로는 프로스타트산 포스파타제, 크레아틴 키나제, 티모신 b-15, p53, HPC1 베이직 전립선 유전자 및 전립선 특이성 막 항원 등이 있다.

암 치료의 성공 여부를 판가름하는 것이 초기의 진단이라는 것은 널리 알려진 사실이다. 여기서 제시된 데이타를 기준으로 본 발명의 혈액 테스트를 사용하여 암 진단을 받지 않은 환자의 혈액을 스크리닝함으로써 기타의 현존하는 방법을 사용하였을 때 가능한 것보다 더 초기에 암을 검출할 수 있다. 이러한 환자의 예로는 특정 암의 가계 병력, 암과 관련된 것으로 알려진 특정의 돌연변이를 갖는 환자 등이 될 수 있다.

암 세포는 주변 조직을 침습하여 조직 장벽을 파괴하기 때문에, 종양 세포가 조직 공간 및 모세관에 유입되어 마침내는 고형 종양의 전개 초기, 즉 종양이 10⁴∼10⁶개의 종양 세포를 함유하고 있는 경우에 혈액 중으로 유입된다는 가설을 세울 수 있다. 도 8 참고. 이 시기에, 종양 세포는 아폽토시스성 세포사멸을 겪거나 또는 이들은 각각 이소성(ectopic) 환경내에서 생존하거나 또는 성장할 수가 없기 때문에 휴면 상태가 된다. 현재로서는 이와 같이 작은 1차 종양을 검출해 낼 기술이 존재하지 않는다. 종양이 클 경우에는 특정 유형의 암을 검출할 수 있는 민감한 기법이 있다. 예를 들면, 유방조영술은 많아야 2×10⁸개의 유방암 세포를 검출할 수 있다. 흔히, 유방 종양은 종양 세포가 5×10⁸∼10⁹개로 존재할 경우에 검출된다. 이 초기 단계에서, 대부분의 탈락(shed) 종양 세포는 사멸된다는 가설을 세울수 있다. 그러나, 종양이 10⁶∼ 10^8-9종양 세포로 성장되는 다수의 세대 동안, 종양 세포의 유전적으로 불안정한 클론은 추가의 유전적 변화를 겪게 되어 더 신속한 성장 및 공격적 돌연변이 세포를 생성하게 된다. 이들 세포는 2차 종양 형성을 진행하는 것으로 보인다. 그러나, 대부분의 종양에서, 진단은 매우 늦은 시기에 이루어지며, 예를 들면 췌장, 위장, 난소, 신장, 폐, 결장 등은 일반적으로 10¹⁰∼10¹²개의 종양 세포가 존재하는 경우에 진단된다. 이 시기에, 종양은 주로 주변 조직을 침습하거나 및/또는 전이된다. 전술한 사항을 살펴 보면, 2차 종양의 형성 이전에 순환 중인 암 세포를 효과적으로 검출할 수 있는 임의의 테스트가 암의 진단 및 치료에 있어서 매우 중요하다는 것이 명백하다. 본 명세서에 기재된 혈액 테스트는 이러한 검출이 가능하다.

본 발명은 종양학 분야 및 진단 테스트 분야에 관한 것이다. 본 발명은 화학요법 치료 반응, 암의 재발 등에 대한 암의 스크리닝, 스테이징, 모니터링에 유용하다. 특히, 본 발명은 종양 세포 또는 생물학적 시료로부터 분리된 기타의 희귀 세포의 분석 및 계수를 돕는 제제, 방법 및 테스트 키트를 제공한다.

도 1은 알고 있는 수의 종양 세포를 말초 혈액에 스파이크 처리하고, 면역 자기 선택, 및 현미경(패널 A) 또는 흐름세포계수법(패널 B)에 의한 분석후 회수하는 모델 실험의 결과를 도시한다.

도 2는 환자가 연구에 참여한 48 일째, 175 일째 및 300 일째에 얻은, 유방 암종이 원거리 전이된 환자로부터의 혈액 10 ㎖에서 면역자기 세포 선택후 얻은 세포 현탁물의 흐름세포계수 분석을 도시한다. 면역자기 선택후, 세포를 상피 세포 특이성 피코에리트린(PE) 접합된 모노클로날 항체, 백혈구 특이성 CD45 PerCP 접합된 모노클로날 항체 및 핵산 염료로 염색하였다. 핵산 염료상의 한계치를 통과한 이벤트를 리스트모드로 얻고, 85%의 시료를 분석하였다. 종양 세포를 돋보이도록 강조한 후, 이의 수를 오른쪽 상단에 기재하였으며, 잔류 백혈구 및 조직파편으로 구성된 배경 이벤트는 회색으로 나타냈다.

도 3은 활성 유방 암종을 갖는 8 명의 환자에 대한 여러 시점에서 질환의 임상적 활성 및 혈액 10 ㎖ 중의 상피 세포수를 나타낸다. 질환의 임상적 활성을 하기 표 1에 기재되어 있는 바와 같은 카테고리 1∼4로 분류하였다. 상단의 바아는 화학요법의 시간을 나타낸다. 패널 A는 아드리아마이신(ADR) 90 및 110 ㎎/㎡ 각각, 패널 B는 ADR 30 ㎎/㎡/주, 비노렐빈(Vin) 20 ㎎/㎡/주, ADR 160 ㎎, ADR 20 ㎎/㎡/주, 패널 C는 빈크리스틴(Vinc) 0.7 ㎎/㎡/주, 메토트렉세이트(MTX) 30 ㎎/㎡/주, 패널 D는 빈블라스틴(Vinb) 7 ㎎/㎡/주, ADR 20 ㎎/㎡/주, Vinb 6 ㎎/㎡/주, 5-플루오르우라실(5FU) 700 ㎎/㎡/주, 패널 E는 Vin 20 ㎎/㎡/주, 5FU 800 ㎎/㎡/주+류코보린 50 ㎎/㎡/주, 패널 F는 이포스파미드(IF) 18 ㎎/㎡/주, 5FU 850 ㎎/㎡/주+류코보린 35 ㎎/㎡/주, 5FU 605 ㎎/㎡/주, Vin 20 ㎎/㎡/주+류코보린 30 ㎎/㎡/주, 패널 G는 Vin 20 ㎎/㎡/주, 패널 H는 20 ㎎/㎡/주이다.

도 4A∼4D는 유방 암종의 병력이 있는 환자의 말초 혈액으로부터의 면역자기적으로 선택된 세포의 분석후 얻은 결과의 현미경 사진을 도시한다. 패널 A는 사이토케라틴에 대해 양성으로 염색시킨 수술(T2N1M0)후 3 년이 경과된 환자로부터의 세포이다. 패널 B는 Wright Giemsa로 염색시킨 완전히 완쾌된 수술(T2N1M1)후 8 년이 경과된 환자로부터의 세포이다. 패널 C 및 패널 D는 Wright Giemsa로 염색시킨 수술(T2N0M0)후 2 년이 경과된 환자로부터의 세포이다. 100 배율의 대물 렌즈를 사용하는 Pixera 디지탈 카메라로 영상을 촬영하였다.

도 5A∼5C는 전립선암에 걸린 3 명의 환자에서의 순환 중인 상피 세포수와 질환의 중증도 사이의 관계를 도시하는 일련의 그래프이다.

도 6은 결장암에 걸린 환자에서의 순환 중인 상피 세포수가 종양 제거 수술후 크게 감소한 것을 도시하는 그래프이다.

도 7은 결장의 전이성 질환에 걸린 환자의 순환 중인 상피 세포수가 전이성 질환의 중증도 및 전이 정도에 따라 증가한다는 것을 도시하는 그래프이다.

도 8은 1차 종양으로부터 성장 전이까지의 암 진행을 도시하는 개략도이다.

바람직한 실시태양에 의하면, 본 발명은 조성물, 생물학적 시료로부터 희귀 표적 생체독립체의 신속하고 효과적인 분리를 위한 방법 및 키트를 제공한다. 기재된 방법은 비특이적으로 결합된 세포의 선택을 최소화하는 동시에 혈액 시료 중에 존재하는 종양 세포를 분리 및 특성화하는데 있어서 효과적으로 사용할 수 있다.

다수의 임상의들은 암이란 초기 단계에서 장기에 한정된 질환으로 이해하고 있다. 본 명세서에 제시된 데이타에 의하면, 이러한 개념이 부정확한 것으로 밝혀졌다. 사실상, 데이타에 의하면, 암은 종종 현재 이용가능한 방법을 사용하여 제일 처음 검출될 시점에서 전신성 질환인 것으로 밝혀졌다. 그래서, 순환 중인 종양 세포의 존재를 이용하여 유방조영술 또는 PSA의 측정과 같은 기타의 테스트법 대신에 또는 이와 병행하여 암을 스크리닝할 수 있다. 세포 상에서 또는 세포 중에서 특이성 마커에 대한 적절한 모노클로날 항체를 사용하거나 또는 세포 단백질 형질발현에 대한 기타의 분석을 사용하거나 또는 세포성 mRNA의 분석에 의해, 이러한 세포의 장기 기원, 예컨대 유방, 전립선, 결장, 폐, 난소 또는 기타의 비-조혈성 암을 용이하게 검출해 낼 수가 있게 된다. 그래서, 종양의 임상적 징후를 거의 나타내지 않으면서 암 세포가 검출될 수 있는 경우, 이들의 존재 뿐 아니라, 장기 기원도 식별할 수가 있게 된다. 스크리닝이 본 발명의 비교적 단순하고, 감도가 매우 높은 혈액 테스트를 사용하여 수행될 수 있기 때문에, 이러한 테스트는 "전신 생검"으로 간주될 수 있다. 또한, 전술한 데이타를 토대로 하여, 암은 잠재적으로 매우 해로운 전이성 세포가 존재함을 특징으로 하는 혈액 운반성 질환이어서, 이에 따라 치료되어야 하는 것으로 이해하여야만 한다. 순환 중인 종양 세포의 존재가 검출될 가능성이 전혀 없는, 예컨대 수술 후와 같은 경우에는 추적 치료, 예컨대 방사선 또는 화학 요법이 필요한지에 대해 추가의 임상적 연구로부터 결정이 가능하다. 이러한 요법의 비용을 참고하여 치료할 필요가 없다는 결정을 하는 것은 임상적 정보의 유의적이고 유익한 부분이 된다.

또한, 이러한 데이타로부터 순환중인 종양 세포수는 질환의 개시 단계로부터 질환의 최종 단계까지 질환의 진행 단계와 관련있다.

본 명세서에서 사용한 용어 "표적 생체독립체"라는 것은 각종 해당 생물학적 또는 의학적 물질을 의미한다. 예를 들면, 호르몬, 단백질, 펩티드, 렉틴, 올리고뉴클레오티드, 약물, 화학적 물질, 핵산 분자(예, RNA 및/또는 DNA) 및 생물학적 기원의 특정한 피분석물 등이 있으며, 이들은 세포, 바이러스, 박테리아 등과 같은 생체입자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 희귀 세포, 예컨대 모계 순환에서의 태내 세포 또는 순환 중인 암 세포는 본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 사용하여 비표적 세포 및/또는 기타의 생체독립체로부터 효과적으로 분리될 수 있다. 용어 "생물학적 검체"는 제한된 것은 아니나, 세포 함유 신체상의 유체, 말초 혈액, 조직 균질물, 유두 흡인물, 및 사람 검체로부터 얻을 수 있는 희귀 세포의 기타의 임의의 공급원 등이 있다. 조직 균질물의 예로는 유방암 환자의 전위림프절로부터 얻을 수 있다. 용어 "결정인자"라는 것은 상기의 표적 생체독립체의 임의의 것에 대하여 사용될 경우에는 생체특이성 리간드 또는 생체특이성 제제에 의해 특이적으로 결합될 수 있으며, 이는 특이적 결합 물질에 선택적인 결합과 관련되거나 또는 이에 대한 원인이 되는 표적 생체독립체의 일부를 의미하며, 이의 존재는 선택적 결합이 발생될 것을 필요로 하게 된다. 기본적인 용어 중에서, 결정인자는 특이성 결합쌍 반응에서의 수용체에 의해 인식되는 표적 생체독립체상의 분자 접촉 부위가 된다. 본 명세서에서 사용한 용어 "특이적 결합쌍"의 예로는, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 핵산(RNA 또는 DNA) 하이브리다이징 서열, Fc 수용체 또는 마우스 IgG-단백질 A, 아비딘-바이오틴, 스티렙타비딘-바이오틴 및 바이러스 수용체 상호작용 등이 있다. 기타의 각종 결정인자 특이성 결합 물질 조합물은 당업자에게 명백한 바와 같이 본 발명의 방법을 수행하는데 사용하기 위한 것으로 이해한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "항체"라는 것은 면역글로블린, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 면역반응성 면역글로블린 분절 및 단쇄 항체 등을 포함한다. 통상적으로 생성된 항체와 유사한 특이성을 갖는 결정인자를 특이적으로 인식하는 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 조합물도 본 발명에 사용할 수 있는 것으로 간주한다. 본 발명의 명세서에 사용된 용어 "검출가능한 표지"라는 것은 물리적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 또는 측정이 테스트 시료 중에서의 표적 생체독립체의 존재를 나타내는 것인 임의의 물질을 의미한다. 유용한 검출 가능한 표지의 비제한적인 예로는 흡광도, 형광, 반사율, 광 산란, 인광 또는 발광 특성을 기초로 하여 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 분자 또는 이온, 이의 방사능 특성에 의해 검출가능한 분자 또는 이온, 이의 핵자기 공명 또는 상자성 특성에 의해 검출 가능한 분자 또는 이온 등이 있다. 예컨대 흡광도 또는 형광도를 기준으로 한 간접 검출 가능한 분자의 군 중에는 적합한 기질로 하여금 예컨대 비흡광성에서 흡광성 분자로, 또는 비형광성 분자에서 형광성 분자로 전환되는 각종의 효소가 포함된다. 용어 "실질적으로 배제한다"라는 것은 생체특이성 리간드 또는 생체특이성 제제 및 이의 해당 표적 결정인자 사이의 결합 반응의 특이성을 의미하는 것이다. 생체특이성 리간드 및 제제는 이의 표적 결정인자에 대한 특이성 결합 활성을 지니나, 기타의 시료 성분에 결합되는 비특이적 결합도는 낮은 것으로 나타날 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "초기 단계 암"이라는 것은 암 세포가 장기에 한정되어 있는 것으로 임상적으로 측정된 암을 의미한다. 또한, 종양의 크기가 너무 작아서 유방암 환자에 대한 유방조영술 또는 폐암 환자에 대한 X-선과 같은 종래의 방법으로는 검출될 수 없는 종양도 포함된다. 유방조영술은 약 2×10⁸개의 세포를 갖는 종양을 검출할 수 있으나, 본 발명의 방법은 이와 같은 크기의 종양 또는 이보다 작은 종양으로부터의 순환 중인 암 세포를 검출할 수 있어야 한다. 용어 "농후"라는 것은 생물학적 시료로부터의 단핵 세포가 농축되었다는 것을 의미한다. 말초 혈액을 출발 물질로서 사용하는 경우에 있어서, 적혈구 세포는 이러한 농후의 정도 평가시에 계수에 포함시키지 않는다. 본 발명의 방법을 사용하면, 순환 중인 상피 세포가 백혈구에 비해서 2,500 배 이상, 바람직하게는 5,000 배 및 가장 바람직하게는 10,000 배 정도로 농후될 수 있다. 본 발명을 수행하는데 사용하기 위한 바람직한 자기 입자는 콜로이드와 같이 작용하는 입자이다. 이러한 입자는 이의 입자 크기가 미크론 단위 이하, 일반적으로 약 200 ㎚(0.20 미크론) 미만인 입자 크기 및 장시간 동안 용액으로부터의 중력에 의한 분리에 대해 안정한 것을 특징으로 한다. 기타의 각종 잇점 이외에도, 이러한 크기 범위는 세포 분석에 통상적으로 사용되는 분석 기술에 대해서는 거의 보이지 않게 된다. 입자 크기가 90∼150 ㎚이고 70∼90%의 자기 질량을 갖는 것이 본 발명에 사용하기 위한 것으로 간주된다. 적절한 자기 입자는 자기 코어에 물리적 흡수에 의해 또는 공유적 부착에 의해 결합되고, 안정한 콜로이드성을 제공하는 분자에 의해 둘러싸인 초상자성 물질의 결정질 코어로 구성된다. 코팅 물질은 시료 중에 발견되는 생물학적 거대분자 및 자기 코어의 사이의 비특이적 상호 작용을 방지하는데 있어서의 유효량으로 사용되는 것이 바람직하다. 이러한 생물학적 거대분자는 비표적 세포, 렉틴, 글리프로테인 및 기타의 막 성분의 표면상의 시알산 잔류물을 포함할 수 있다. 또한, 물질은 가능한한 다량의 자기 물질/나노입자를 함유하여야 한다. 코어를 포함하는 자기 결정의 크기는 충분하게 작아서 완전 자기 도메인을 함유하지 않도록 한다. 나노입자의 크기는 충분히 작아서 이들의 브라운 운동 에너지가 자기 모멘트를 초과하도록 한다. 그 결과, 이들 콜로이드성 자기 입자의 북극, 남극 배치 및 추후의 상호 인력/반발력은 적절하게 강한 자기장에서 조차도 나타나지 않게 되어 용액의 안정도에 기여하게 된다. 마지막으로, 자기 입자는 고자기 구배 외부장 분리기 중에서 분리될 수 있어야만 한다. 이러한 특성은 시료의 취급을 도우며, 강자성 비이드 또는 강철 솜으로 충전된 매우 복잡한 내부 구배 컬럼에 비해서 경제적인 잇점을 제공하게 된다. 전술한 특성을 지니는 자기 입자는 미국 특허 제4,795,698호, 동제5,597,531호 및 동제5,698,271호에 기재된 베이스 물질의 변형에 의해 제조될 수 있다. 이러한 베이스 물질로부터의 제조는 후술할 것이다.

악성 종양은 이웃하는 조직을 침습할 수 있는 능력을 특징으로 한다. 일반적으로 직경이 1 ㎜인 종양은 혈관이 분포되어 있으며, 동물 실험에 의하면, 종양 중에 존재하는 세포의 4% 정도가 24 시간 내에 순환으로 탈락될 수 있다. 참고 문헌[Butler, TP Gullino PM, 1975Cancer Research35:512-516]. 종양의 탈락 용량은 주로 종양의 공격성에 따라 결정된다. 종양 세포가 연속적으로 순환으로 탈락될지라도, 원거리 전이가 발생하지 않거나 또는 작은 분획만이 원거리 전이가 발생할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 참고 문헌[Butler Gullino,상동). 하기의 가설을 사용하여 순환 중인 종양 세포의 빈도수를 추정할 수 있다. 1. 직경이 1 ㎜인 종양은 10⁷개의 세포를 포함하며, 4% 또는 4×10⁵개의 세포는 24 시간 내에 순환으로 탈락된다. 2. 종양 세포만이 하나의 순환 사이클에서 생존한다. 3. 혈액 부피가 약 5 ℓ이다. 4. 심박출량이 5,000 ㎖/분이다. 이러한 경우, 직경이 1 ㎜인 종양을 가진 환자의 말초 혈액 중의 종양 세포의 빈도수는 약 6 종양 세포/100 ㎖ 혈액이 된다. 종양 질량의 증가는 순환 중인 종양 세포의 빈도수의 증가에 비례할 것으로 예상된다. 이러한 사항이 발견되는 경우, 이와 같은 감도를 지닌 사용 가능한 방법은 원거리 전이된 환자에서의 종양 부하(load)를 평가하고 국소 질환을 갖는 환자의 종양 부하를 평가하는 것을 돕게 된다. 국소 질환을 갖는 환자의 말초 혈액 중의 종양 세포의 검출은 초기 단계에서의 종양을 검출할 뿐 아니라, 종양의 잠재적인 침습성에 관한 징후도 제공하게 된다.

여러 연구에 의하면, 상동 말초 혈액 간세포(stem cell) 이식에 대해 유방 암종을 갖는 환자로부터 수거한 백혈구성분채집술(leukopheresis) 산물 중의 암종 세포의 존재가 보고되어 있다. 참고 문헌[Brugger W. et al. (1994)Blood83: 636-640, Brockstein BE, et al. (1996)J. of Hematotherapy5:617, Ross AA, et al. (1993)Blood82:2605, Ross AA. (1998)J. of Hematotherapy, 7:9-18, Moss TJ, et al. (1994)J. of Hematotherapy, 3:163-163]. 이러한 발견들은 이식 산물 중의 종양 세포가 전이를 형성하는데 있어서 잠재성을 갖기 때문에 유사 이식에 이러한 방법을 사용하는 것에 대한 비판을 자극하였다. 참고 문헌[Racila E. et al. (1998)PNAS USA.95:4589-4594]. 추가로, 백혈구성분채집술 산물은, 퍼진 질환을 갖는 환자 각각으로부터 얻었을 경우 종양 세포를 함유할 가능성이 더 많은 것으로 알려졌다. 참고 문헌[Brugger et al., 1994 상동]. 그러나, 이러한 연구들은 정량적인 데이타를 보고하지도 않았으며, 종양 세포가 국소화된 질환을 갖는 환자의 말초 혈액에서 발견될 수도 있다고 보고하고 있지도 않다. 이러한 관찰의 경우, 말초 혈액 중의 종양 세포수를 계수하는 매우 민감하고 정량적인 테스트를 사용하여 실제의 종양 부하를 측정할 수가 있다는 가설을 세울 수가 있다. 이러한 테스트의 실행 가능성을 평가하기 위해서는, 민감한 세포 분석을 수행하여 테스트하고자 하는 혈액의 부피만에 의해서만 한정되는 순환 중인 암종 세포의 정확한 계수가 가능케 되는 것이다.

각종의 상이한 세포 분석 플랫폼을 사용하여 농후된 시료를 식별하고, 이를 계수할 수 있다. 이러한 분석 플랫폼의 예로는 Immunicon's CellSpotter 시스템, 세포수동 관찰을 위한 자기 세포 부동화기, 및 CellTracks 시스템, 미국 특허 출원 제08/931,067호 및 제08/867,009호에 기재된 자동 광학 주사 자기 세포 부동화기 등이 있다. 전술한 두 미국 특허 출원은 본 명세서에서 참고로 인용하는 것으로서, 이들 각각은 수동의 또는 자동의 정량적 및 정성적 세포 분석을 위한 장치 및 방법을 개시하고 있다.

기타의 분석 플랫폼으로는 레이저스캐닝 세포계수법(컴퓨사이트), 브라이트 필드 베이스 영상 분석(크로마비젼), 및 모세 용적 측정법(바이오메트릭 이매징) 등이 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양의 방법 및 조성물을 사용하여 혈중 순환 중인 상피 세포의 계수는 혈액으로부터의 상피 세포를 면역자기 선택(농후)한 후, 다중매개변수 흐름세포계수법에 의해 수행한다. 면역자기 시료 제조는 시료의 부피를 감소시키고, 표적(상피) 세포의 10⁴배 농후를 얻는데 있어서 중요하다. 다중매개변수 흐름세포계수 분석법에 사용되는 제제는 2 종의 광산란기 및 3 종의 형광 매개변수의 리스트모드 습득에 의해 형성된 다차원 공간 중에서의 독특한 위치에 배치된다. 이러한 것은 1) 백혈구(비종양 세포)를 식별하는 팬-백혈구 항원, CD45에 대한 항체, 2) 잔류 적혈구 세포, 혈소판 및 기타의 비핵화 이벤트의 제외가 가능하게 되는 세포형의 특이성 또는 핵산 염료, 및 3) 세포를 면역자기적으로 선택하는데 사용되는 것과는 상이한 EpCAM 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항체 또는 사이토케라틴에 대한 항체 또는 생체특이성 제제 등이 있다.

당업자라면, 농후된 종양 세포 집단의 분석 방법이 본 발명의 의도하는 용도에 의해 결정된다는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들면, 후술하는 바와 같이 암을 스크리닝하거나 또는 질환의 재발을 모니터링하는 경우, 순환 중인 상피 세포수는 매우 작을 수 있다, "정상" 범위의 상피 세포가 존재하기 때문에(정맥천자 동안 도입될 수도 있음), 상피 세포를 정상 세포로 또는 종양 세포로 식별하는 분석 방법이 바람직하다. 이러한 경우, 현미경을 사용한 분석이 가장 정확한 것으로 입증되었다. 또한, 이러한 검사는 형태학적 검사, 알고 있는 종양 마커 및/또는 종양유전자의 식별 등이 있다. 또한, 순환 중인 상피 세포의 수가 정상의 집단 중에서 관찰되는 것보다 훨씬 많게 되는 질환 상태의 경우, 이러한 세포를 계수하는 분석적 방법이 충분하여야 한다. 본 명세서에 기재된 방법에 의한 환자의 상태를 측정하는 것은 정상 집단 중에 존재하는 순환 중인 희귀 세포수의 통계학적 평균을 기준으로 이루어진다. 초기 단계의 암 환자 및 공격적인 전이성 암을 갖는 환자에서의 순환 중인 상피 세포의 레벨은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 통계학적으로 측정될 수도 있다.

이하의 방법은 본 발명의 실시를 돕기 위해 제공한다.

환자

대조군, 및 유방 암종, 전립선 암종 및 결장 암종을 갖는 환자에게서 혈액 시료 8∼20 ㎖를 얻었다. 1 년에 걸쳐서 여러 시간에서 이들 환자 중 일부로부터 혈액을 채취하였다. 혈액 시료를 항응고제로서 EDTA를 포함하는 진공용기관(벡턴-디킨슨)으로 채취하였다. 시료를 실온에서 보관하고, 채취후 24 시간 이내에 처리하였다. 유방암, 전립선암, 결장암 환자로부터의 말초 혈액 시료, 및 악성 질환을 갖지 않는 것으로 나타난 정상의 대조군에서 순환 중인 상피 세포를 계수하였다. 진단, 치료적 인터벤션 및 임상 상태를 환자의 차트로부터 얻었다. 협력 기관의 기관 심사국은 이러한 프로토콜을 승인하였다.

시료 제조

상피 세포 유착 분자(EpCAM)에 대해 특이성을 갖는 모노클로날 항체는 상피 세포 기원의 조직과 광범위하게 반응한다. 참고 문헌[Stahel RA, et al.Int. J. Cancer Suppl.8:6-26 (1994), Momburg F et al.Cancer Research47:2883-2891 (1987), Gaffey MJ et al.Am. J. Surg. Path.16:593-599 (1992)]. EpCAM 상의 2 종의 상이한 에피토프{D Herlyn[Herlyn D et al.J. Immunol Methods.73:157-167 (1984)], 미국 펜실베이니아주 필라델피아에 소재하는 위스터 인스티튜트 및 MJ Mattes[De Leij L. et al.Int. J. Cancer Suppl.8:60-63 (1993)], 미국 뉴저지주에 소재하는 센터 포 몰레큘라 메디슨 앤 이뮤놀로지로부터 제공됨}를 인식하는 GA73.3 또는 MJ37 EpCAM 항체는 자기 나노입자(철 함유 유체)[Liberti PA Piccoli SP, 미국 특허 제5,512,332호(1996), 미국 펜실베이니아주에 소재하는 이뮤니콘 헌팅던 밸리]에 커플링된다. 내경이 13 ㎜인 일회용 시험관에서 15 분 동안 혈액을 항-EpCAM 접합된 철 함유 유체와 함께 배양하였다. 4 개의 대향 자석으로 구성된 분리기에 10 분 동안 시험관을 넣었다(QMS13, 미국 펜실베이니아주 헌팅던 밸리에 소재하는 이뮤니콘). 분리후, 혈액을 흡인한 후, 버렸다. 시험관을 자기 분리기로부터 꺼내고, 수집한 분획을 2 ㎖의 FACS 투과성 용액(미국 캘리포니아 새너제이에 소재하는 BDIS)으로 용기의 벽으로부터 재현탁시키고, 자기 분리기내에 5분 동안 두었다. 용액을 흡인한 후 버리고, 피코에리트린(PE) 접합된 항-사이토케라틴(CAM5.2 모노클로날 항체) 및 페리디닌 클로로필 프로테인(PerCP) 표지된 CD45를 포화 상태로 첨가한 150 ㎕의 세포 완충액(PBS, 1% BSA, 50 mM EDTA, 0.1% 나트륨 아지드)중에 세포를 현탁시켰다. 15 분 동안 배양시킨 후, 세포 완충액 2 ㎖를 첨가하고, 세포 현탁물을 5 분간 자기 분리하였다. 분리되지 않은 현탁물을 버린 후, 수집된 세포를 완충액 0.5 ㎖ 중에 재현탁시키고, 이에 미국 캘리포니아주 새너제이에 소재하는 BDIS로부터의 Procount 시스템에 사용한 핵산 염료를 제조업자의 지시 사항에 따라서 첨가하였다. EpCAM 항체 MJ37을 철 함유 유체에 사용하는 경우에 있어서, GA73.3 PE를 사용하여 선택된 상피 세포를 식별하였다. 이러한 경우에 있어서, 세포의 투과성은 필요치 않다. 흐름세포계수법에 사용하기 위한 제제는 미국 캘리포니아주 새너제이에 소재하는 BDIS에 의해 공급된다.

순환 중인 상피 세포의 조직 공급원을 측정하기 위한 예시적인 방법은 세포화학적 및 면역학적 식별 기법을 사용한다. 5%의 BSA를 사용하여 30 분 동안 비특이적 결합 부위를 블록킹시킨 후, 사이토케라틴 5, 6, 8, 18(CK, 5D3, LP34, 노보카스트라), MUC-1 당단백질(MUC-1, Ma695 노보카스트라) 또는 전립선 특이성 항체(PSMA), 나일 밴더 박사(미국 텍사스주 댈러스에 소재하는 유니버시티 오브 텍사스 메디칼 센터)로부터 얻은 클론 J591를 인식하는 1차 모노클로날 항체를 슬라이드에 첨가하였다. 시료를 20 분 동안 실온에서 배양하고, PBS 중에서 5 분 동안 2 회 세척한 후, 2차 토끼 항-마우스 Ig(Z0259, 미국 캘리포니아주 카펜테리아에 소재하는 아코 코포레이션)에 추가의 20 분 동안 노출시켰다. 2회 이상 세척후, 시료를 15분 동안 알칼리-포스파타제-항-알칼리 포스파타제(APAAD) 토끼 Ig 착물과 함께 배양하였다. 마지막으로, 효소-기질(뉴 푸쿠신, 미국 캘리포니아주에 소재하는 다코 코포레이션)을 첨가하여 적색 참강믈이 형성되도록 하였다. 핵을 헤모톡실린으로 대비염색하였다. 광 현미경에 부착된 코닥 디지탈 카메라를 사용하여 데이타를 기록하였다. 데이터를 추후의 참고를 위해 CD에 저장하였다.

시료 분석

85%의 시료를 FACSCalibur 흐름세포계수법(미국 캘리포니아주 새너제이에 소재하는 BDIS)으로 분석하였다. 핵산 염료의 형광의 한계치를 사용하여 데이타를 리스트모드로 얻었다. 다중매개변수 데이타 분석을 Paint-A-Gate^Pro(미국 캘리포니아주 새너제이에 소재하는 BDIS)를 사용하여 수행하였다. 분석의 기준은 전방 광 산란기에 의해 한정되는 크기, 직교 광 산란기에 의해 한정된 입도, PE 표지된 사이토케라틴 모노클로날 항체를 사용한 양성 염색 및 PerCP 표지된 CD45 모노클로날 항체를 사용한 무 염색 등이 있다. 각 시료의 경우, 상피 세포에 대해 전형적인 부위 중에 존재하는 이벤트의 수는 혈액 10 ㎖로 정규화하였다.

이하의 실시예는 본 발명의 실시를 돕고자 하는 것이다. 이러한 실시예는 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해하여서는 안된다.

실시예 1

전혈로부터 희귀 세포의 효율적인 분리를 위한 개선된 자기 나노입자의 제제

희귀 세포(예, 종양에서 유도된 상피를 갖는 환자의 종양 세포, 모계 혈액 중의 태내 세포 등)는 혈액 1 ㎖당 희귀 세포 1 개 미만의 빈도수로 존재할 수 있다. 이러한 희귀 세포를 검출하는데 필요한 혈액 도말의 수는 엄청나게 크다. 혈액 10 ㎖중 희귀 세포 10 개가 존재한다고 가정할 경우, 이는 백혈구 5∼10×10⁷개중 종양 세포 10 개에 해당하는 것으로서, 이 세포는 세포 원심분리에 의해 또는 침강에 의해 현미경 슬라이드에 옮긴 후, 이를 해당 희귀 세포에 대해 특이성을 갖는 항체로 염색하고, 이를 수동으로 또는 자동 판독하였다. 슬라이드 하나에 옮겨질 수 있는 세포의 최대수는 약 500,000 세포이며, 이는 혈액 10 ㎖를 처리할 때 100∼200 슬라이드가 필요하다는 것을 의미한다. 이러한 접근법에 의한 접근에 소요되는 시간은 실제로 도움이 되지 못하며 경제적으로도 실현성이 없다. 결론적으로, 시료 부피를 감소시키고 밀도 구배 분리 또는 적혈구 용해 방법에 의해 적혈구 및 혈소판을 제거하는 농후 방법은 분석하고자 하는 슬라이드의 갯수를 크게 줄이도록 희귀 세포를 분리하는데 사용된다.

전술한 바와 같이, 자기 농후는 세포 분리에 있어서 바람직한 방법이며, 이상적으로는 이러한 목적에 사용된 나노입자는 분석 이전에 제거될 필요는 없다. 따라서, 나노입자는 분석적 측정을 방해하지 않도록 충분히 작아야 하는데, 즉 약 250 ㎚ 이하가 되어야만 한다. 나노입자는 살균 여과가 가능하도록 하기 위해 220 ㎚ 이하인 것이 가장 바람직하다. 또한, 나노입자는 외부 구배 자기 분리기 중에서 단순히 실험실에서 사용하는 시험관, 예컨대 시험관, 원심분리관, 진공용기로부터 세포 분리가 가능하도록 충분히 크고 자기적으로 반응성을 지녀야 한다. 또한, 전술한 바와 같이 내부 구배 장치는 성가시고, 고가이며, 희귀 세포의 회수에 효율적이지가 않다. 또한, 나노입자 및 자기 장치는 회복력이 크고 재생가능하며, 비특이적 결합이 낮아야 한다. 미국 특허 제5,597,531호는 다수의 특성을 갖는 직코팅된(DC) 입자로 칭하는 고자기 입자의 합성법이 기재되어 있다. 이러한 나노입자는 중합체 또는 단백질(코팅된 자기 입자를 주성분으로 함)로 코팅된 결정질 자철광 또는 기타의 자기 산화물의 반구형 응집물로 구성된다. 이러한 구조(코어 직경이 피막 두께보다 >>> 인 중합체 피막 및 자기 코어)로 인해서, 이들은 자기 질량이 약 80∼85%가 된다. 이들 나노입자의 비특이적 결합은 5∼8% 범위내이고, 그래서 이들은 희귀 세포의 분리에 대해 그리 실용적이지가 않다. 1 ㎖당 1 개의 세포로 존재하는 세포로 농후시킬 경우, 포획 효율 80%에서 전혈 10 ㎖(백혈구만 존재하는 것으로 간주함)를 사용하여 예상할 수 있는 최상의 결과는 총 4 백만에서 8 개의 세포로, 즉 16∼17 배의 농후로 회수되는 것이다. 그러나, 미국 특허 제5,597,531호에 기재된 자기 입자는 오픈 필드 분리기를 사용하고 단순 시험관으로부터 분리를 수행하는 적절한 자기 특성을 갖는다. 또한, 이들의 평균 크기는 상기에 제시된 한계치 내에 포함되며, 그리하여 각종의 분석 기법을 방해하지 않게 된다. 이러한 물질을 사용한 광범위한 연구에 의하면, 세포에 비특이적으로 결합하는데 기여하는 주인자는 불완전 피복으로 인해서 나노입자상에 노출된 결정질 철 산화물이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 불완전 피복 결정은 생물학적 거대분자에 강하게 결합할 것으로 예상되는 생리학적 pH에서 충분히 큰 양전하, 예컨대 세포 표면 상의 음으로 하전된 시알산을 포함한다. 이러한 입자의 개선된 제조 방법은 미국 특허 제5,698,271호에 기재되어 있다. 이러한 물질은 전술한 미국 특허 제5,597,531호에 기재되어 있는 것보다 개선되어 있으며, 이 방법은 코팅도를 크게 증가시키는 고온 코팅 단계를 포함한다. 이러한 방법을 사용하여 소혈청 알부민(BSA) 코팅으로 생성된 나노입자는 예를 들면 미국 특허 제5,579,531호의 DC-BSA 물질과 비교시 세포에 대한 비특이적 결합 특성이 3∼5 배 정도 낮다. 이러한 비특이적 결합의 감소는 BSA 코팅 물질의 증가된 농도로 인해서 직접적으로 나타나는 것이다. 이러한 나노입자는 BSA 코팅을 제거하도록 처리할 경우, 비특이적 결합 정도는 다시 높아지게 된다. 그래서, 세포의 비특이성 결합 및 철 산화물 결정 표면상에 피복된 BSA의 함량 사이에는 직접적인 관계가 있는 것으로 측정되었다. 통상적으로, 이러한 입자를 포함하는 전혈로부터의 세포의 비특이적 결합은 0.3%이고, 이는 미국 특허 제5,579,531호에서 생성된 것보다 훨씬 우수한 것이다. 그래서, 10 ㎖의 전혈로부터 농후에 대해 표적화된 세포와 분리되는 약 200,000 개의 비표적 세포가 존재하게 된다.

비특이적 결합의 문제점 이외에도, 후술하는 바와 같이 미국 특허 제5,579,531호 및 제5,698,271호에 기재된 바와 같이 제조된 각종의 다양한 자기 입자를 희귀 세포 소모 또는 농후에 사용되는 경우, 회수는 일정하지가 않게 된다. 때때로, 회수는 85∼95%가 되거나 또는 동일한 모델계를 사용하여 40∼50%가 될 수 있다. 이러한 물질의 제조 방법으로 인해서, 크기 분산이 상당히 넓은 범위(30 ㎚∼220 ㎚)가 되기 때문에, 크기 분포 및 특히 작은 나노입자의 존재는 표적 회수에 커다란 영향을 미치게 되는 것으로 예상되었고, 또한 확인되었다. 작은 나노입자(30 ㎚∼70 ㎚)가 용이하게 확산되기 때문에, 이들은 이의 커다란 대응물에 비해서 세포를 선별적으로 표지하게 된다. 예컨대 내부 구배 컬럼에서와 같이 매우 큰 구배를 사용할 경우, 이들의 크기에도 불구하고, 이들 물질의 성능에는 차이가 거의 없게 된다. 반대로, 외부 구배, 또는 마이크로비이드 또는 강철솜 컬럼상에 생성될 수 있는 더 적은 크기의 구배를 사용할 경우에는, 세포 상의 작은 나노입자의 점유가 커다란 영향을 미치게 된다. 이는 결론적으로 DC 나노입자의 분별화 및 회수시의 효과에 대한 연구에 의한 케이스에 해당되는 것으로 나타났다. 이러한 연구 및 기타의 최적화 실험을 기초로 하여, 자기적으로 또는 컬럼 상에서의 나노입자의 분별화 수단은, 베이스 코팅된 자기 입자가 제조될 수 있으며, 이는 과도하게 작거나 또는 큰 나노 입자를 배제할 수 있게 되도록 확립된다. 예를 들면, 평균 직경이 100 ㎚인 베이스 코팅된 입자가 생성되는데, 이는 기껏해야 80 ㎚ 이하 또는 130 ㎚ 이상인 흔적량의 물질을 함유한다. 유사하게, 약 120 ㎚의 물질은 90∼95 ㎚ 이하 및 160 ㎚ 이상의 감지되지 않는 물질로 제조될 수 있다. 이러한 물질은 회수와 관련하여 최적으로 수행되며, 60∼70 ㎚의 나노 입자의 포함으로 인해서 최적 이하로 제조될 수 있다. 본 발명의 실시에 사용하기 바람직한 입자 크기 범위는 BSA 피복된 자철광과 같은 베이스 코팅된 자기 입자의 경우에는 90∼150 ㎚가 된다. 바람직한 범위내에 포함되는 입자는 참고 문헌[Liberti et al.,In Fine Particles Science and Technology,777-90, E. Pelizzetti 편저 (1996)]에 기재된 방법을 사용하여 얻을 수 있다.

비특이적 결합의 문제점을 추가로 논하기 위해, 항체 접합된 직접 나노입자를 제조하는 다수의 경로를 시도하였다. 희귀 세포에 대해 특이성을 갖는 모노클로날 항체는 예를 들면 표준의 헤테로이중작용성 화학법에 의해 DC 자기 입자상의 BSA 베이스 코팅에 직접 커플링될 수 있다(이하, 직접 커플링 방법으로 칭함). 이러한 목적에 사용되는 헤테로이중작용성 링커의 예로는 설포-MCCC 및 설포숙신이미딜-4-[말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트 등이 있다. 또다른 접근법으로서, 바이오틴화 모노클로날 항체는, 베이스 피복된 입자에 커플링된 스트렙타비딘에 커플링될 수 있다. 이러한 접합 방법은 본 명세서에서 피기백(piggyback) 방법으로 칭한다. 이러한 방법에서, 스트렙타비딘은 직접 커플링 방법과 동일한 화학법으로 베이스 피복된 자기 입자에 커플링된다. 피기백 커플링의 한 방법에 있어서, 모노바이오틴화 항체는 1 시간 동안 스트렙타비딘 자기 입자와 반응하도록 한 후, 잔류 스트렙타비딘 결합 부위를 유리 바이오틴으로 켄칭(quenching)시킨다. 희귀 세포의 분리 단계 동안 또는 세포 분석 단계 동안 자기 입자에 임의의 바이오틴화 항체가 결합되는 것을 방지하기 위해, 항체 커플링후 잔류 스트렙타비딘 부위를 켄칭시키는 것이 중요하다. 또한, 이러한 스트렙타비딘의 켄칭 방법은 비특이적 결합을 방해하는데 있어서 유효하다는 것이 나타났다. 바이오틴화 형광 거대분자를 사용한 각종의 조건하에서의 이러한 물질의 배양에 의해서는 아무런 결합 형광이 형성되지 않는다. 비교를 위해, 항-EpCAM 항체(미국 펜실베이니아주 필라델피아에 소재하는 위스터 인스티튜트에서 구입하는 GA73.3)는 이 두 방법에 의해 자기 입자에 커플링되었다. 백혈구의 비특이적 결합(NSB) 또는 캐리오버(carry-over) 뿐 아니라, 전혈로 스파이크 처리된 결장 종양 세포주(Colo-205)로부터 세포 분리와 비교하였다. 최종 시료 중에 존재하는 백혈구는 세척 단계로부터의 세포의 캐리오버 및 자기 입자에 비특이적으로 결합된 백혈구의 조합이다. 이하의 자기 분리에서, 분리의 개시에서 시험관과 접촉하거나 또는 분리 공정 동안 비자기적으로 수송된 임의의 세포를 세척 제거하여야 한다는 것에 주의한다. 하기의 표에는 2 종의 자기 입자의 비교를 제시한다.

자기 입자	스파이크 처리된Colo-205 세포의회수율(%)	NSB 및 캐리오버백혈구(%)
자기 입자에 직접 커플링된EpCAM 항체(로트 번호 1203251)	78∼82	0.1∼0.3
피기백 방법에 의해자기 입자에 커플링된EpCAM 항체(로트 번호 1206072)	67∼78	0.05∼0.1

우선, 항체 또는 스트렙타비딘의 BSA 베이스 입자로의 단순한 커플링은 비특이적 결합을 크게 감소시킨다는 것을 알 수 있다(데이타는 제시하지 않음). 이는 결합의 경우, 세포로의 "노출된" 결정면의 접근가능성이 감소되었기 때문인 것으로 생각된다. 상기의 표에는 스파이크 처리된 세포의 회수가 2 가지 유형의 자기 입자에 대해 비교가능하다는 것을 예시한다. 그러나, 백혈구의 비특이적 결합은 항체 직접 커플링된 자기 입자를 사용하는 경우보다 3 배 이상이 된다. 이러한 차이는 비교적 작기는 하나, 다량의 혈액을 처리하고 분석하고자 하는 경우에 그 차이가 유의적이게 된다. 2 종의 자기 입자 사이의 차이에 대해 뒷받침되는 많은 관찰을 토대로 하면, 피기백 커플링 방법을 사용하여 합성된 자기 입자 상의 단백질층이 더 많이 존재한다는 타당한 기재가 성립된다. 그래서, 자기 결정의 표면은 다층의 단백질로 더욱 광범위하게 피복되며, 입체적으로 "보호"되는 것으로 나타났다. 이는 자기 입자로의 비표적 세포의 결합을 방해한다.

피기백 커플링 방법에 있어서, 자기 입자 상의 제한된 수의 스트렙타비딘 결합 부위는 바이오틴-항체가 차지하게 되며, 나머지는 전술한 켄칭 공정에 의해 유리 바이오틴으로 포화된다. 또다른 커플링 방법에 있어서, 과량의 스트렙타비딘 결합 부위는 켄칭되고, 유리 바이오틴 대신에 모노바이오틴-BSA으로 포화된다. 이러한 접근법에 대한 근본적인 이유는 모노바이오틴 BSA를 사용한 켄칭은 세포가 나노입자의 미피복 부위와 접촉되는 것을 입체적으로 방해하여, 즉 나노입자의 우수한 적용 범위를 제공하도록 하여야 한다. 이는 탄소 분석에 의하면, 이러한 공정이 입자에 커플링된 단백질양을 증가시킨다는 것을 알 수 있다. 이러한 2 종의 자기 입자 제제는 전혈로부터의 스파이크 처리된 Colo 205의 회수 및 백혈구의 비특이적 결합에 대해 분석하는 실험에서 비교된다. 결과를 하기의 표에 기재하였다.

자기 입자	Colo-205 세포의회수율(%)	NSB 및 캐리오버백혈구(%)
자기 입자에 커플링된EpCAM 항체-유리 바이오틴을 사용하여 과량의 스트렙타비딘 부위를 켄칭함(로트 번호 131022-1)	938785	0.080.10.1
자기 입자에 커플링된EpCAM 항체- 바이오틴-BSA를 사용하여 과량의 스트렙타비딘 부위를 켄칭함(로트 번호 131022-2)	878385	0.010.030.02

모노바이오틴-BSA는 제한량의 바이오틴을 BSA에 접합시켜 생성된 생성물의 30∼40%가 결합되지 않은 바이오틴을 포함하도록 생성될 수 있다.

요약하면, 균질한 크기 분포 및 바이오틴-BSA 켄칭된 스트렙타비딘 결합 부위를 갖는 자기 입자는 본 발명의 분석 방법에서 매우 잘 수행된다. 스파이크 처리된 상피 종양 세포의 우수한 회수 및 비특이적 결합의 감소량은 이러한 입자를 사용하였을 경우 얻었으며, 바이오틴 블록킹된 나노입자와 비교된다. 그래서, 이러한 물질 및 이들을 사용하여 얻은 결과는 추가로 최적화될 수 있는 매우 유용한 생성물을 형성하게 된다. 개선된 철 함유 유체는 가능한한 자기를 띠게 되며, 이는 세포를 포함하는 혈액중의 임의의 물질과 자기 코어와의 가능한한 모든 상호작용을 배제하도록 코팅되며(비다공성 단층으로 코팅됨), 크기 범위 및 분포가 형성된다. 바람직한 경우에 있어서, 생물학적 물질과 상호작용하지 않는 코팅 물질을 사용한다. 이러한 상호작용이 불가피한 것일 경우, 이를 블록킹하기 위한 수단이 필요하게 된다. 가능한한 자기성을 띠도록 하는 물질의 경우, 미국 특허 제5,579,531호 및 제5,698,271호에 기재된 바와 같이 생성된 것이 출발 물질로서 바람직하다. 이러한 물질은 베이스 코팅 물질의 분명한 그러나 완전하지는 않은 단층을 갖는 커다란 자기 코어로 구성되어 있기 때문에 바람직하다. BSA로 코팅된 100 ㎚의 나노입자의 경우, 코어는 자철광과 같은 자기 산화물의 약 90 ㎚가 된다. 코어와 코팅 물질의 상대적인 크기로 인해서 이러한 나노 입자는 가능한한 자기를 띠게 된다. 코팅의 기능이 서로의 바람직하지 않은 상호작용으로부터 나노입자를 유지하고자 하는 것으로 간주될 경우, 이는 육안으로 볼 수 있는 응집을 형성하게 된다. 또한, 이러한 코팅은 콜로이드성 양상을 유지하도록 용매 분자와의 충분한 상호작용을 촉진하며, 커플링을 위한 간편한 화학적 수단을 제공하게 된다. 미국 특허 제5,579,531호 및 동제5,698,271호의 나노입자는, 단층 내의 "홀"이 다수의 방법으로, 즉 입체적으로 그리고 물리적으로 충전될 수 있는 충분한 단층 코팅을 지니기 때문에 출발 물질로서 바람직하다. 기타 임의의 시스템 중에서의 기타 임의의 비특이적 효과 또는 혈액 성분과 코어 물질의 상호작용을 방해하도록 하기 위해 자기 코어의 효과적이고 완전한 적용범위를 돕는 임의의 코팅이 적절하다. 자기 질량 대 나노입자의 질량비가 최대화되도록 질량이 작은 코팅이 나노입자에 첨가될수록 좋다.

실시예 2

전이성 유방암에 대해 치료된 환자에서의 순환 중인 상피 세포의 계수

도 1에는 본 발명의 분석 방법을 사용하여 전혈 세포로 스파이크 처리된 종양 세포를 분리하였을 경우 얻은 결과를 나타낸다. 패널 A는 현미경에 의한 분석을 나타내며, 패널 B는 흐름 세포계수법을 사용하여 얻은 분석 결과를 나타낸다. 도 2는 3 가지의 시점에서 전이성 유방 암종을 갖는 한 환자로부터 얻은 혈액 시료 10㎖의 흐름 세포계수 분석의 3 가지 예를 도시하며, 흐름 세포계수 분석의 항-상피 세포 항체 대 항-백혈구의 상관 관계를 도시한다. 도 2에서, 패널 A에는 14 개의 이벤트가 검출되었으며, 이는 상피 세포에 대해 전형적인 위치에 존재한다. 패널 B에서는 108 개의 상피 세포가 검출되었으며, 패널 C에서는 1,036 개의 상피 세포가 검출되었다.

한계치를 통과한 이벤트의 수는 5,000∼50,000 개의 이벤트로 변화된 10 ㎖의 혈액 시료의 분석에서 핵산 염료상에서 설정하였다. 이들 이벤트는 세포성 조직파편 및 백혈구로 구성된다. 32 개의 대조군 혈액의 분석시에, 상피 세포에 대해 전형적인 부위 내에 존재하는 이벤트의 수는 0∼4/10 ㎖ 혈액(평균값=1.0, SD=1.2)이다.

8 명의 유방암 환자는 실험 시간 동안 활성 전이성 질환을 앓고 있다. 이러한 환자에게서, 10 ㎖ 혈액 중의 상피 세포수는 0∼1,036 범위 내가 된다. 질환의 활성은 골 동통, 호흡곤란 등과 같은 주관적인 기준에 의해, 그리고 X-선, 골 스캔, CT 스캔, MRI 및 림프절 크기와 같은 객관적인 기준에 의해 평가된다. 환자는 하기 표 I에 기재한 바와 같이 카테고리 0∼4로 분류하였다.

외과적 인터벤션 이후 질환의 임상적 활성에 의한환자의 분류
카테고리	기준
0	외과적 인터벤션 이후에 임의의 시점에서의 질환이 존재하지 않음
1	외과적 인터벤션 이후에 한 시점에서의 질환이 존재함
2	조절하의 질환의 존재
3	활성 진행성 질환
4	생명을 위협하는 질환

전이성 질환을 지닌 8 명의 환자의 혈액 중 상피 세포 계수의 역학은 도 3에 도시되어 있다. 이러한 플롯에서 음영으로 나타낸 부위는 양성 이벤트가 대조군에서 검출된 범위를 나타낸다. 또한, 화학요법의 투여의 경우도 도시하였다. 도 3의 패널 A는 환자가 실험에 참가하게 되는 시간에서 생명을 위협하는 질환을 지니며, 200 상피 세포/10 ㎖ 혈액을 갖는 환자를 도시한다. 고 투여량에서의 아드리아마이신은 정상 범위 내에서 수를 감소시키나, 아드리아마이신 투여를 중단한 후에는 그 수치가 다시 상승하였다. 아드리아마이신의 제2의 코스 이후, 상피 세포수는 급감하였으나, 여전히 정상 범위보다는 높다. 도 3에서 패널 B는 43 주에 걸친 환자 1 명의 코스를 나타낸다. 환자는 실험에 참가 당시에는 무증후성이었으나, 과거에 골수 전이가 있었던 환자이다. 상피 세포수는 정상 수치보다 높은 것으로 검출되었으며, 실험 기간 동안 꾸준하게 증가되었다. 고 투여량의 아드리아마이신 코스의 투여후 상피 세포수가 잠시 감소한 것으로 나타났다. 이러한 환자에서의 질환의 활성은 이 기간 동안 뚜렷하게 증가하였다. 도 3의 패널 C 및 D에서는 질환 활성이 약간 적은 환자 2 명을 나타내었다. 이러한 환자에서는, 시간 경과에 따른 상피 세포수의 변화가 질환의 활성 변화를 반영하게 된다. 패널 E 및 F에 도시된 환자의 경우에는 환자는 여전히 증후를 나타내지는 않으나, 실험하는 최종 기간에서는 말초 혈액 상피 세포수가 증가하였다.

패널 G에 도시된 환자의 경우에는, 유방암 수술(T2N1M0)후 3 년이 경과된 시점인 실험 초기에는 상피 세포가 검출되지 않았었다. 4 주 경과후, 10 ㎖ 혈액당 50 개의 상피 세포가 흐름세포계수법에 의해 검출되었다. 이 시기의 환자는 질환재발의 임상적 징후가 나타나지 않았었다. 추가의 혈액 시료를 분석하여 흐름세포계수법에 의해 검출된 세포가 악성 세포의 것과 일치하는 특성을 갖는다는 형태학적 확인을 얻었다.

도 4A에는 핵:세포질의 비가 크고 사이토케라틴으로 양성 염색된 2 종의 세포를 도시하고 있는데, 이들의 두 특성은 상피 세포 기원의 종양 세포의 것과 일치하였다. 이러한 발견 후 4 주 경과시, 환자에게 겨드랑이 림프절 생검을 실시하였다. 생검으로 얻은 세포는 악성 기원을 갖는 것으로 나타났다. 이 시기의 X-선은 폐 전이의 징후가 나타나지는 않았지만, 2 주 경과후 CT 스캔을 수행한 바에 의하면, 폐 전이가 관찰되는 것으로 나타났다. 환자에게서는 폐 전이의 증후가 나타나지 않았다. 환자는 겨드랑이 림프절 침습이 소실된 것으로 측정되었기 때문에 비노렐빈과 잘 반응하였다. 말초 혈액 상피 세포수는 정상 범위보다 약간 높은 정도로 감소하였다. 치료 개시 28 주후, 말초 혈액 상피 세포수는 증가하였으며, 물리적 검사에 의하면, 겨드랑이 림프절은 크기가 증가하였다. 유방 암종의 전이성 질환을 지닌 8 명의 환자에게서 말초 혈액 상피 세포수는 질환의 활성 및 실험 기간 동안 치료에 대한 반응 또는 반응이 나타나지 않았다는 것을 반영하였다.

전술한 실험은 콜로이드성 자기 나노입자를 사용하여 수행하였다. 이러한 예에서, 전술한 바와 같이 비록 나노미터 크기의 자기 입자가 본 발명에 바람직한 것으로 간주되기는 하나, 혈액 중에 낮은 빈도수로 존재하는 종양 세포의 선택에 대해 크기가 더 큰 자기 비이드의 효율을 평가하여 미크론 크기의 비이드가 종양 세포를 선택하는데 사용될 수 있는지 결정하였다.

전술한 바와 같이, 크기가 더 큰 비이드를 사용하는 경우에는 단점이 발생한다. 이러한 단점의 예로는 다음과 같은 것이 있다. (i) 비이드 크기가 너무 커서 확산되지 않아 낮은 빈도수로 존재하는 표적 세포와 비이드의 충돌이 혼합을 필요로 하게 되며, (ii) 비이드가 매우 빠르게 침강하게 되어 지속적인 혼합의 필요성을 조장하게 되고, (iii) 크기가 더 큰 비이드는 세포 주위에 몰려 있게 되어 분석이 불명료하게 된다. 따라서, 가시화 또는 분석 이전에 크기가 더 큰 비이드를 세포 표면으로부터 제거하여야만 한다. 본 발명에 의하면, 크기가 더 큰 비이드를 사용한 세포 선택의 효율은 비이드의 농도를 증가시키고, 표적 희귀 세포에 대한 결합을 촉진시키도록 지속적으로 혼합하면서 배양 시간을 증가시키므로써 개선될 수 있다. 이러한 실시예에서, 2.8 ㎛의 Dynal 항-상피 세포 비이드(미국 뉴욕주에 소재하는 다이날)를 사용하여 크기가 더 큰 비이드에 대한 최적의 조건하에서 모델 실험으로 혈액으로부터 종양 세포 선택의 효율을 테스트하였다. 이러한 비이드를 상피 종양 세포에 대해 모노클로날 항체와 접합시켰다. 기지의 수의 종양 세포(암 세포주)를 정상의 혈액에 스파이크 처리하여 비이드의 선택후 회수를 측정하게 된다. 검출 동안 혈액 세포로부터 이 종양 세포를 분화시키기 위해 형광 염료를 사용하여 종양 세포를 미리 표지화시킨다. 프로토콜은 제조업자가 권장하는 바와 같이 수행하였다.

15 ㎖의 폴리스티렌 원심분리관에 전혈(5 ㎖)을 넣은 후, 20±3 형광 표지된 SKBR-3(유방암 세포주) 세포를 넣는다. SKBR-3 세포를 핵산 염색 염료(획스트)로 미리 염색시켜 비이드에 의한 선택후 검출되도록 한다. 5 mM의 EDTA를 함유하는 둘베코 PBS 5 ㎖로 혈액을 희석하고, 이를 15 분 동안 4℃에서 선광기 상에서의 희석된 혈액과 혼합하였다. 50×10⁶개의 비이드를 포함하는 다이날 항-상피 세포 비이드를 혈액 시료에 첨가하고, 30 분 동안 4℃에서 로커로 혼합하면서 배양하였다. 사용한 비이드의 수는 총 백혈구 세포와 유사하여 백혈구 세포 1 개당 비이드 1 개이었다. 시료 시험관을 6 분 동안 다이날 MPC 자기 분리기에 넣어 자기 표지된 세포를 분리하였다.

상청액을 흡인한 후, 수집한 세포를 0.1%의 BSA를 함유하는 둘베코 PBS 3 ㎖에 재현탁시켰다. 시험관을 다시 다이날 MPC에 6 분 동안 두어 임의의 캐리오버 혈액 세포를 제거하였다. 상청액을 흡인한 후, 0.1%의 BSA를 함유하는 둘베코 PBS 200 ㎕에 재현탁시켰다.

선택된 종양 세포, 비특이적으로 결합된 혈액 세포 및 과량의 유리 자기 비이드를 함유하는 최종 시료를 면역형광 슬라이드 상에 점적하여 종양 세포수를 검출하였다. 시료 200 ㎕를 10 개의 상이한 웰에 점적하여 유리 자기 비이드를 분산시켰다. 각각의 웰에 존재하는 형광 염색된 종양 새포를 형광 현미경을 사용하여 계수하였다. 결과를 하기 표 II에 기재하였다.

실험 번호	회수된 종양 세포	회수율(%)
1	16	80
2	17	85
3	10	50
4	11	54

이러한 결과에 의하면, 스파이크 처리된 종양 세포의 평균 67%가 다이날 자기 비이드에 의해 혈액으로부터 회수된 것으로 나타났다. 이는 혈약 중의 종양 세포가 최적의 조건하에서 크기가 더 큰 자기 비이드를 사용하여 효과적으로 선택될 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 이러한 실시예에서, 혈액으로부터의 종양 세포의 선택은 어떠한 분석을 수행하지 않고도 평가될 수 있다. 추가로, 세포가 강한 형광 염료를 사용하여 예비표지되었기 때문에, 회수 효율을 측정할 수가 있다. 선택된 종양 세포(10∼17) 및 비특이적으로 결합된 백혈구 이외에 최종 시료(200 ㎕)는 50×10⁶개의 비이드를 함유한다. 비이드의 크기(2.8 ㎛)는 특정의 혈액 세포와 유사하며, 이는 슬라이드상에서 대부분의 표면적을 차지한다. 그러므로, 회수 데이타를 얻기 위해서는, 시료를 수개의 웰에 점적하여 회수된 종양 세포의 검출이 가능하도록 유리 자기 비이드를 충분히 분산시켜야만 한다.

또한, 세포 표면상에는 다수의 비이드가 존재하는데, 이는 추가의 분석을 위해 선택된 종양 세포의 관찰 및 염색을 불가능하게 한다. 이러한 실시예에서, 종양 세포는 형광 핵산 염료로 미리 염색하고, 검출을 위해서는 추가의 염색이 필요치 않다. 그러나, 자기 비이드 결합된 세포의 기원의 조직을 식별하는 것이 바람직하다. 이러한 식별은 임상적 시료 중에 존재하는 종양 세포를 검출 및 특성화하기 위해 표지화된 항체를 사용하여 수행한다. 따라서, 비이드는 세포 표면으로부터 제거되어야만 하며, 시료로부터 차후의 표적 세포 선택, 즉 분석 이전에 분리하여야 한다. 이들의 크기는 세포 분석을 방해하지 않기 때문에, 나노크기의 자기 입자를 사용한 경우에 해당하지 않는다.

요약하면, 본 실시예는 순환 중인 종양 세포의 효과적인 분리에 대해서 본 명세서에 개시된 방법에 크기가 더 큰 자기 비이드를 사용한다는 것을 알 수 있다.

분리된 세포를 크게 손상시키지 않는 세포 표면으로부터 비이드를 방출하는데에는 수개의 방법을 이용할 수가 있다. 한 방법으로는 침투된 항원 또는 항체에 대해 친화도가 높은 과량의 특이성 경쟁 제제를 과량으로 첨가하여 세포 표면으로부터 항체를 대체하는 방법이 있다. 이러한 유형의 메카니즘을 사용하여 펩티드(백스터 이소렉스 300)를 사용하는 임상적 적용에 CD34 선택된 세포로부터의 비이드를 방출시킨다. 펩티드는 비이드상에서의 항체에 대한 결합에 대해 CD34 항원과 경쟁하게 되며, 세포로부터 항체-비이드 착물을 방출하게 된다. 또다른 방법은 비이드와 항체 사이의 가역적 화학 링커를 사용하는 방법이 있다.

화학적 링커는 항체가 자기 비이드에 접합 처리되는 동안 삽입될 수 있다. 화학적 링크는 적합한 조건하에서 분열되어 항체로부터 비이드를 방출할 수 있다. 통상적으로 사용되는 방법 중의 하나는 핵산 링커를 사용하여 항체를 자기 비이드에 결합시키는 것이다. 핵산 링커는 폴리뉴클레오티드이며, 이는 DNAse 효소를 사용하여 특이적으로 가수분해될 수 있다. 핵산 링커 중에 존재하는 뉴클레오티드 결합의 가수분해 이후, 세포에 결합된 상태로 잔류하는 항체로부터 비이드가 방출된다. 방출된 비이드는 자기 분리에 의해 세포 현탁물로부터 제거할 수 있다. 비이드가 제거된 세포를 현미경 또는 흐름세포계수법에 의해 추가의 분석에 사용할 수 있다.

본 실시예는 크기가 더 큰 자기 비이드를 사용하여 혈액으로부터 종양 세포를 분리할 수 있으나, 단 이들은 세포를 표지하기에 충분한 농도로 사용되어야 하며, 그후 분석 이전에 세포로부터 방출되어야 한다.

실시예 3

치료 목적의 유방 암종 수술후 질환이 존재하지 않는 환자에게의 순환 중인 상피 세포의 계수

수술후 1∼20 년이 경과한 37 명 환자의 말초 혈액을 흐름세포계수법으로 상피 세포의 존재에 대해 조사하였다. 7 개 이하의 말초 혈액 시료를 이들 환자로부터 1 년에 걸쳐서 채취하였다. 표 III에서, 각각의 환자를 기재하고, 수술 시기에서의 TNM(종양, 결절 및 전이) 단계에 따라 분류하고, 그리고 나서 수술후 수년 경과후 다시 검사하였다. 또한, 표 III는 실험한 기간 동안 환자가 치료(화학요법 또는 호르몬 요법)를 수용하였는지의 여부를 나타낸다. 6 명중 3 명의 환자는 과거에 원거리 전이가 발생한 병력이 있으나, 실험 당시에는 완전히 완쾌되었으며, 대조군에서 발견되는 것보다 더 많은 빈도수로 혈중에 상피 세포가 발견되었다, 또한, 원거리 전이가 발생한 적이 없는 31 명의 환자 중 9 명에게서 순환 중인 상피 세포가 발견되었다.

이러한 9 명의 환자에게서의 흐름세포계수법에 의해 상피 세포에 대해 전형적인 영역내에 존재하는 이벤트의 수가 적은 것이 종양 세포로서 이들 이벤트를 식별하는 근거가 되지는 않는다. 면역 자기적으로 선택된 세포를 슬라이드에 배치하므로써 얻은 세포학에 의해 도 4에 도시된 바와 같은 이들의 식별을 평가하는데 큰 도움이 되었다. 도 4의 패널 A는 혈액 채취 당시의 전이성 질환이 존재하지 않는 환자로부터 얻은 것 및 사이토케라틴에 대해 양성 염색된 2 종의 세포를 나타낸다. 패널 B는 과거에는 전이성 질환이 있었으나, 완전히 완쾌된 환자로부터의 세포를 나타낸다. 패널 C 및 D에서, 2 종의 세포는 시점 6에서 환자 25의 혈액으로부터 분리한 것을 나타낸다. 패널 C에 도시된 세포는 악성에 해당하는 특성을 갖는 반면, 패널 D의 세포는 정상의 비늘 모양 상피 세포의 외관을 갖는다.

TNM= 종양, 결절, 전이

Ys= 1차 수술후 경과된 햇수

Tx= 요법, CT= 화학요법, H= 호르몬 요법, -= 요법 사용하지 않음

1,2,3,4,5,6,7= 상피 세포수를 수년 동안 측정한 차후의 시점

실시예 4

외과적 인터벤션 이전의 유방암으로 진단받은 환자에서의 순환 중인 상피 세포의 계수

하기 표 IV에는 13 명의 대조군 및 30 명의 유방암 환자를 본 발명의 분석을 사용하여 평가한 유사 임상적 실험으로부터 얻은 결과를 요약하였다. 각 대조군에서, 20 ㎖ 혈액 중의 상피 세포수는 0∼5(평균값 1.5±1.8)이었다. 반대로, 유방 암종이 장기에 국한되어 있는 환자(T_xN_oM_o로 분류된 환자) 14 명의 혈액 시료 20 ㎖ 중에서는 상피 세포가 평균 15.9±17.4이었으며, 결절 침습의 경우에는 47.4±52.3이고, 원거리 전이의 경우에는 122±140이었다. 전이의 유무와는 상관없이 유방 암종을 지닌 환자와 대조군 사이의 차이는 큰 것으로 나타났다[P, 0.001, 다중매개변수 분석에 의함(Kruskal-Wallis)]. 장기에 국한된 군과 원거리 전이된 군 사이의 차이는 0.009(t 테스트)이었다. 장기에 국한된 유방암 환자에서의 상피 세포수는 14 종의 케이스 중 12 종의 케이스에서 컷오프 이상(대조군에서 평균값+3 SD=6.9) 이었다. 게다가, 대조군에서는 아무도 상피 세포로서 분류되는 5 개 이상의 이벤트를 갖지 않았으며, 장기에 국한된 유방암을 지닌 환자 14 명중 단 2 명만이 이러한이벤트를 <7로 지닌다.

흐름세포계측법을 사용하여 대조군 개개로부터 그리고 유방 암종을 지닌 여성으로부터의 혈액 20 ㎖에서 얻은 양성의 이벤트를 분석하였다. 대조군의 혈액 중의 상피 세포수는 t-테스트(P≤0.01)에 의해 그리고 유방암 환자의 3 개의 각각으로부터의 Kruskall-Wallis의 비매개변수성 분석(P<0.001)으로 통계학적으로 상이하였다. 이러한 표에서의 데이타를 사용하여 양성 시료에 대한 초기 컷오프값을 설정하였다. 이러한 값은 정상 대조군(n=13) 중에서의 순환 중인 상피 세포수의 평균을 구하고, SD를 3회 더하여 측정한다. 평균값은 1.5이고, SD는 1.8이다. 컷오프:1.5+5.4=6.9. 여성 대조군과 남성 대조군 사이에는 통계학적 차이가 없다.

실시예 5

질환 활성은 전립선암 환자 중에서의 순환 중인 상피 세포수와 상관 관계가 있음

전립선의 전이성 질환을 지닌 3 명의 환자를 차후의 화학요법 치료를 실시한 혈액 중의 순환 중인 상피 세포의 존재에 대해 평가하였다. 결과를 도 5에 도시하였다. 이 결과에 의하면, 혈액 중의 순환 중인 상피 세포의 증가는 질환 활성과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 검출될 만한 퍼짐이 없는 암 환자 3 명에서는 상피 세포가 말포 혈액 20 ㎖ 중에서 발견되었다(16 세포±4). 하기 표 V에 도시한 바와 같이, 전립선암 환자의 혈액 중의 상피 세포수는 정상의 대조군과 통계적으로 상이하다(0.001 미만의 P).

양성 종양을 지닌 것으로 알고 있는 정상의 사람 및 염증성 질환을 지닌 환자에게서 대조군 혈액 시료를 얻었다. 이러한 통계적 데이타를 기초로 하여, 혈액 20 ㎖당 약 6.8 개의 세포의 컷오프점이 전립선암에 대한 진단 마커로서 유용하다는 것을 알 수 있다.

실시예 6

질환 활성이 결장암 환자에게서의 순환 중인 상피 세포수와 상관 관계가 있음

본 발명의 분석 방법은 각종의 다양한 암 유형을 갖는 환자의 평가시에 이롭게 사용될 수 있다. 이를 예시하기 위해, 결장암 환자에게서의 순환 중인 상피 세포를 평가하는데 이 방법을 사용한다. 전이가 이루어지지 않은 결장암 환자를 수술 전후에 순환 중인 상피 세포의 존재에 대해 평가하였다. 도 6에 결과를 도시하였으며, 이를 하기 표 VI에 요약하였다. 데이타에 의하면, 결장암 환자에게서의 순환 중인 상피 세포수는 외과적 인터벤션 이전에 더 큰 것으로 밝혀졌다.

전이가 형성되지 않은 결장암 환자에게서의 순환 중인 상피 세포수
테스트 시점	테스트한 환자수	10 ㎖ 혈액 중의 흐름세포계수법에의해 검출한 순환 중인 상피 세포수
		평균값±SEM	범위
수술전	12	42.3±22.0	0∼234
수술후	25	2.7±0.7	0∼15

하기 표 VII 및 도 7에는 전이가 형성된 결장암 환자를 순환 중인 상피 세포의 존재 및 수에 대해 평가하여 얻은 데이타를 도시한다. 이 결과에 의하면, 말초 혈액 중의 상피 세포수는 수술후 국소 질환과 비교하여 전이성 질환 환자에서 더 크다는 것을 알 수 있다. 또한, 이러한 결과에 의하면, 전이성 질환의 정도는 순환 중인 상피 세포수와 상관관계를 가질 수 있다는 것을 의미한다.

전이가 형성된 결장암 환자에게서의 순환 중인 상피 세포수
테스트한 환자의 전이 상태	테스트한 환자수	10 ㎖ 혈액 중의 흐름세포계수법에의해 검출한 순환 중인 상피 세포수
		평균값±SD	범위
				국소	11	3.7±0.6	1∼6
원거리, 단독	16	7.6±2.0	0∼21
원거리, 다수	8	54.0±25.1	5∼200
정상 대조군	32	1.0±0.2	0∼4

상기의 실시예는 순환 중인 상피 세포수가 건강한 사람과 유방암, 전립선암 및 결장암 환자 사이에서 크게 차이가 있다는 것을 예시한다. 또한, 순환 중인 상피 세포수의 커다란 차이는 검출될 만한 퍼짐이 없는 환자, 국소 림프절로 퍼진 환자 및 원거리 전이된 환자 사이에서 발견된다. 참고 문헌[Racila et al., (1998), 상동]. 또한, 1차 유방 암종의 외과적 제거 후 환자의 혈액 중의 상피 세포수를 1 년 동안 모니터하였다. 이들 몇몇의 환자에게서 잔류 질환이 검출되었다. 도 7을 참고한다. 전이성 질환 환자의 경우, 말초 혈액 종양 세포 계수의 변화는 종양 부하 및 치료에 대한 반응과도 상관 관계를 갖는다. 이러한 실험 결과에 의하면, 악성 질환의 존재 유무를 검출하고, 질환의 활성을 측정하기 위한 객관적인 비침습적인 방법으로서 본 발명의 세포를 기준으로 한 분석의 중요성을 알 수 있다. 세포성 형태학 및 면역표현형에 의하면, 분리된 세포의 악성 특성을 알 수 있다.

실시예 7

분리된 상피 세포의 조직원 식별

전술한 환자의 모든 실험에서, 양성 종양을 포함하여 암 질환을 갖지 않는 정상인 또는 환자에 비해서 암을 갖고 있는 환자에게는 과다한 상피 세포가 존재한다. 그러나, 이러한 과도한 상피 세포는 사실상 암 세포인 것으로 밝혀졌다. 이는 암을 지니거나 또는 지니지 않은 환자로부터의 면역자기적으로 정제된 상피 세포를 유리 슬라이드 상에 세포스핀 처리하고, 항-뮤신 처리하는 실험을 수행하여 이루어진다. 또한, 대조군으로 사용한 정상인의 포피 및 혈액으로부터 얻은 정상의 상피 세포를 세포스핀 처리하였다. 슬라이드를 코드화하고, "맹검" 처리하였으며, 관찰자는 병리학을 수련하였으며, 정상의 상피 세포가 포함되어 있다는 것이 중요하다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 암 세포 대 정상 상피 세포 사이에는 커다란 차이점이 존재한다. 정상의 상피 세포는 핵 대 세포질비가 낮으며, 즉 세포질이 풍부하고, 핵이 비교적 작다. 핵은 크로마틴 분포가 평활한 것으로 나타났다. 세포는 항-뮤신으로 염색하지 않았다. 반대로, 유방암을 지닌 환자 2 명으로부터의 세포는 핵이 비교적 크고 세포질의 림(rim)이 작다. 또한, 크로마틴은 핵 중에서의 어두운 패치로 나타난 바와 같이 조직 붕괴되어 있으며, 세포는 항-뮤신으로 강력하게 염색되어 있다. 이는 전립선암을 갖고 있는 2 명의 환자에게서도 동일하게 관찰된다. 병리학 수련의는 암을 지니거나 또는 지니지 않은 환자로부터 코드화된 슬라이드(총 21 개의 슬라이드)를 제시한다. 병리학 수련의는 암 세포를 갖고 있지 않은 모든 대조군으로부터 혈액을 정확하게 식별할 수 있으며, 슬라이드를 2 회 제시하였을 때 내부관찰된 오차가 나타났다. 전립선 암을 갖고 있는 2 명의 환자의 경우, 종양 세포는 실험에서 나타나지 않았다. 슬라이드 하나를 재검사하여, 종양 세포가 관찰되었다. 이러한 불일치는 세포 도말의 스캐닝에 소요된 시간 때문인 것으로 나타났다. 요약하면, 세포형태학과 면역표현형은 암을 지닌 환자의 혈액 중에 존재하는 과도한 상피 세포가 사실상 암 세포라는 것을 의미한다.

전술한 실험에 의하면, 개시된 방법은 초기 종양을 지닌 환자의 혈액 중의 암 세포의 검출이 가능하다는 것을 나타낸다. 사실상, 장기에 한정된 질환(초기 단계의 암)으로 임상적으로 측정된 환자 27 명중 25 명에서, 혈액 중의 암 세포가 존재하는 것으로 검출되었다. 이는 분석이 정상적인 방법으로 지체되어 검출되는 고형의 종양(10⁹∼10¹⁰종양 세포)에서 훨씬 초기에 암 세포를 검출하여야 한다는 것을 의미한다. 더욱이, 테스트는 통상의 방법에 의해 1차 종양의 검출 이전에 초기 유방암 및 전립선 암을 검출할 수 있어야만 한다. 전립선의 경우 혈액 중의 종양 세포의 장기 기원은 항-전립선 특이성 막 항원(PMSA), 항-PSA(전립선 특이성 항원) 또는 남성의 전립선에 특이성을 갖는 기타의 항체로의 염색에 의해 이루어질 수 있다. 여성 환자의 유방 암종의 경우, 항-유방글로빈, 항-프로게스테론 수용체, 항-에스트로겐 수용체 및 항-유지방 글로불린 항원 I 및 II로의 염색은 종양의 유방 기원을 나타낸다.

본 출원인의 테스트는 기타의 장기, 예를 들면 췌장, 식도, 결장, 위장, 폐, 난소, 신장 등으로부터의 암종 세포를 검출하여야 한다. 하기의 표에는 과도한 상피 세포가 유방암 및 전립선암 이외의 암종을 갖는 여러 환자에게서 관찰되는 예를 도시한다.

혈액 20 ㎖ 당세포수	암 진단
8	자궁 선암(단계 1B)
11	뇌 및 목 선암
15	미분화된 소세포 폐암
14	목 비늘모양 세포 암종

상기의 표에 기재된 각각의 암종은, 해당 항체를 사용하여 순환 중인 종양 세포의 장기 기원을 결정하게 되는 조직 특이성 항원을 형질발현한다.

또한, 본 발명의 혈액 테스트는 과거에 암을 성공적으로 치료하고, 장시간 동안 완전히 완쾌된 환자에게서 암 세포를 검출하는데 사용할 수 있다. 사실상, 순환 중인 상피 세포, 즉 휴면 종양 세포는 과거 5 년 이상 동안 치료되고 임상적으로 종양을 갖고 있지 않는 것으로 밝혀진 환자에게서도 검출된다. 이는 외관상으로 성공적으로 치료된지 10 년 경과 후조차에서도 환자의 재발이 수년간 발생할 수 있는 그 이유를 설명하는 것이다. 사실상, 축적된 증거는 유방암의 재발 속도가 유방절제술후 10∼12 년 경과후 꾸준히 느린 속도로 진행된다는 것을 암시한다.

실시예 8

고 PSA 농도를 지닌 환자의 혈액 중의 종양 세포의 검출 및 음성 생검

상기의 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명은 현재는 증후가 나타나지 않은 환자에게서 암을 진단하는 것에 이롭게 사용할 수 있다. 이러한 점을 예시하기 위해, 고 PSA 농도(>12 ㎍/㎖)의 2 년 병력이 있는 환자는 후술할 분석 2 주 전에 전립선 침생검을 실시하였다. 이러한 생검은 악성의 존재를 밝히지는 못한다. 또한,18 개월 정도 빠르게 수행한 사전 생검은 음성이었다.

혈액 시료 20 ㎖를 얻기 이전에, 환자를 디지탈 직장 검사하고, 혈액 중의 종양 세포의 발견을 증가시키고자 확대된 전립선을 부드럽게 마사지한다. 혈액 시료는 본 발명의 방법을 사용하여 농후되었다. 농후된 분획을 Wrights-Giemsa 염색을 사용하여 현미경으로 검사하였다. 분리된 세포의 형태학적 검사에 의하면 이들이 악성 특성을 갖는 것으로서 밝혀졌다. 이러한 환자에게는 분명히 암이 있다. 고 PSA 농도가 관찰될 경우, 전립선암으로 진단되기가 쉽다. 세포의 기원을 전술한 바와 같은 적절한 제제를 사용하여 측정할 수 있다. 본 실시예에서 제시된 결과는 본 발명의 방법이 검출되지 않을 수도 있는 암을 검출하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

혈액 테스트의 감도 증가의 수단으로서 혈액으로 종양 세포의 탈락을 촉진하도록 국소 마사지를 이용하는 개념은 커다란 장점을 지니는 발상이다. 이러한 접근 방법에 의해 순환되도록 방출되는 세포는 분리후 각종의 여러 목적에 사용할 수 있다. 철 함유 유체를 사용하여 분리된 세포의 경우, 분리된 세포는 용이하게 배양 및/또는 클로닝될 수 있다. 그리하여 생성된 세포주를 사용하여 화학요법적 감도 및 성장 인자 의존성과 같은 각종의 악성 세포 특성을 평가할 수 있다.

실시예 9

각종 암의 특성을 진단하기 위한 테스트 키트

또한, 본 발명의 분석을 수행하는데 사용되는 제제를 포함하는 테스트 키트를 본 발명에 사용하고자 한다. 이러한 키트는 특정의 적용을 위해 디자인된다. 제제는 특정 종양 세포에 국한되지 않으며, 순환 중인 희귀 세포에 대해 환자를 스크리닝하는 것을 돕도록 어셈블리될 수 있다. 이러한 실시태양에 있어서, 키트는 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질, 및 분리시키고자 하는 암 세포상에 존재하는 특징적인 결정인자에 대해 특이적으로 결합하는 생체특이성 리간드를 포함하는 콜로이드성 자기 입자를 함유한다. 또한, 키트는 생체특이성 리간드에 의해 식별되는 결정인자와는 상이한 분리하고자 하는 암 세포에 대한 2차 특징적인 결정인자에 대한 친화성을 갖는 추가의 생체특이성 제제 1 종 이상을 포함한다. 또한, 키트는 분석으로부터 비핵화 세포 및 기타의 비표적 시료 성분을 분석으로부터 배제시키는 세포 특이성 염료를 포함한다.

본 발명에 의한 통상의 키트는 자기 나노입자 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 항-EpCAM 및 모노클로날 항체쌍을 포함할 수 있으며, 1차 항체는 종양 특이성 결정인자를 인식하며, 2차 항체는 비종양 세포 결정인자, 예를 들면 팬 백혈구 항원에 대해 친화성을 갖는다. 또한, 키트는 분석으로부터 비핵화 세포를 배제시키는 핵산 염료를 함유한다. 본 발명의 키트는 임의로 생리학적 완충제, 투과성 완충제, 프로토콜, 분리 용기, 분석 챔버, 양성 세포 또는 적절한 비이드 및 정보 시이트를 포함할 수 있다.

전술한 키트는 순환 중인 특정의 암세포 검출의 진단 및 특성화를 돕도록 생성될 수 있다. 이러한 실시태양에 있어서, 키트는 전술한 품목을 모두 포함하지만, 암 특이성 모노클로날 항체의 패널을 포함하는 것이 바람직하다. 예로서 유방암의 경우, 진단용 키트는 항-MUC-1, 항-에스트로겐, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-CA27.29, 항-CA15.3, 항-카텝신 D, 항-p53, 항-우로키나제형 플라스미노겐 활성제, 항-표피 성장 인자, 항-표피 성장 인자 수용체, 항-BRCA1, 항-BRCA2, 항-전립선 특이성 항원, 항-플라스미노겐 활성제 억제제, 항-Her2-neu 항체 또는 이들의 서브세트를 함유할 수 있다.

또한, 키트는 종양의 제거 후 환자의 질환 및/또는 잔류 세포의 재발을 모니터하기 위한 것으로 제공된다. 이러한 실시태양에 있어서, 암의 유형은 이미 진단되어 있다. 따라서, 키트는 암에 대한 생물학적 시료를 스크리닝하기 위해 사용되는 모든 제제를 함유하며, 또한 과거 환자에게 진단된 유형의 암에 대해 특이성을 갖는 추가의 항체를 함유한다. 또한, 예를 들어 유방암의 경우, 이러한 키트는 항-MUC-1를 함유한다. 또한, 키트는 항-Her2-neu를 함유할 수 있다.

본 발명의 키트는 각종의 여러 암 유형을 스크리닝, 진단 또는 모니터하도록 주문 제작될 수 있다. 예를 들면 키트를 전립선암의 검출에 사용하고자 할 경우, 키트에 포함된 항체는 전립선 조직에 대해 특이성을 갖는다. 이러한 목적에 대해 적절한 항체 또는 마커는 항-전립선 특이성 항원, 유리 PSA, 프로스타트산 포스파타제, 크레아틴 키나제, 티모신 b-15, p53, HPC1 베이직 전립선 유전자 및 전립선 특이성 막 항원 등이 있다. 환자를 결장암의 존재에 대해 스크리닝하고자 할 경우, 암배 항원(CEA)에 대해 특이성을 갖는 항체가 키트에 포함될 수 있다. 방광암에 걸린 환자를 스크리닝하기 위해 사용하는 키트는 핵 매트릭스 단백질(NMP22), 바드(Bard) 방광 종양 항원(BTA) 또는 피브린 분해산물(FDP)에 대한 항체를 함유할 수 있다. 마커는 상이한 암 유형에 대해 공지되어 있다.

본 발명의 키트를 사용하여 분리된 세포는 형태학, 기원의 장기, 관련 RNA 표면 및 세포내 단백질, 특히 악성과 관련된 것에 대해 추가로 연구할 수 있다. 이러한 분자상에 존재하는 정보를 토대로 하여, 분리된 세포상에서의 형질발현, 순환 중인 세포의 분석에 의한 종양의 전이 잠재성으로부터 결정될 수 있어야 한다.

본 발명의 목적은 특이성 마커로 공지된 임의의 암에 대한 키트를 제공하고자 한다. 이러한 시점에서 공지된 마커 및 유용성 및/또는 징후 등을 하기에 제시한다.

I. 종양 기원의 표시

Muc-1 --- 유방

PSA, PSMA --- 전립선

CEA --- 결장

CUPRA 21-1 --- 폐

CA 125 --- 난소

사이토케라틴 --- 리스트 참조

항-HI67

II. 세포 주기

핵산 염료

사이클린 A, C E

p27

III. 세포 생존력/아폽토시스

Fas(CD95)

아멕신 V

항-메탈로프로티나제

IV. 약물 감도

에스트로겐, 프로게스테론 및 안드로겐 수용체

HER-2/neu

V. 약물 내성

P-당단백질(MDR)

t-글루타밀시스테인 신타제

탁솔-내성-관련 유전자-1-5

cis-디암민디클로로백금 II 내성 유전자

티미딜레이트 신테타제

단백질 키나제 C

텔로머라제

VI. 스테이징

루이스 A

C

BRCA-1 BRCA-2

CA 15.3 (Muc-1), CA 27.29, CA 19.9

LASA

p53

카텝신 D

ras 종양유전자

하기의 표 IX에는 본 발명의 방법을 사용하여 분리된 세포의 조직 기원을 평가하는데 사용될 수 있는 각종의 사이토케라틴 마커가 제시되어 있다.

하기는 본 발명 방법의 실시가 순환 중인 유방암 세포의 검출에 사용하기 위한 키트에 의해 얼마나 도움이 되는지를 예시한다.

전술한 바와 같이, 키트는 전혈로부터 종양 세포를 농후시키기 위한 제제, 장치 및 형태학으로 출발한다. 이러한 키트는 6 가지의 인자 또는 지시제를 평가하게 되는 혈액 시료 중의 유방암 세포에 대해 테스트하는 제제를 함유할 수 있다. 분석적 플랫폼은 리포터 분자 DAPi, CY2, CY3, CY3.5, CY5 및 CY5.5가 적절한 여기 및 방출 필터에 의해 식별되도록 구조되어야 한다. 이러한 실시예에서의 분석적 플랫폼은 수은 아크 램프, 사용된 검출 표지의 파장을 평가하기 위한 적절한 필터 세트가 구비된 형광 현미경을 사용한다. 모든 마커는 이러한 방법을 사용하여 동시에 도입된다. DAPi는 UV광으로 여기되고, 핵산을 염색하며, 세포의 핵 형태학을 결정하는데 사용된다. CY2로 표지된 CAM 5.2는 대조군 세포를 염색시키는데 사용된다. C11 표지된 CY3를 사용하여 사이토케라틴 7, 8, 18 및 19를 표지한다. CY3.5로 접합된 항체를 사용하여 HER-2/neu를 표지한다. CY5로 접합된 항체를 사용하여 Muc-1을 표지한다. CY5.5로 접합된 항체는 에스트로겐 수용체를 표지화한다. 적절한 여기 및 방출 필터를 사용하므로써 암 세포를 식별하게 된다.

본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 사용하여 검출될 수 있는 각종의 암 유형으로는 아푸도마, 분리종, 새종, 악성 유암 증후군, 유암 심장 질환, 암종, 예컨대 워커(Walker), 기저세포암, 기저편평암, 브라운-피어스, 도관암, 에를리히 종양, 상피내암, 크렙스 2암, 메르켈 세포암, 점액암, 비소세포폐암, 귀리세포암, 유두암, 경암, 폐포세포암, 기관지암, 편평상피암 및 이행세포 세망내피증, 흑색종, 연골아세포종, 연골종, 연골육종, 섬유종, 섬유육종, 거대 세포 종양, 조직구종, 지방종, 지방육종, 중피종, 점액종, 점액육종, 골종, 골육종, 유잉(Ewing) 육종, 활막종, 선섬유종, 선림프종, 암육종, 척삭종, 간엽종, 중신종, 근육종, 범랑질아세포종, 백악질종, 치아종, 기형종, 트로포블래스틱(throphoblastic) 종양, 선암, 선종, 담관종, 콜레스테린종, 원주종, 낭종암, 낭선종, 과립막 세포종, 남녀아세포종, 간암, 한선종, 도세포종, 라이디히 세포종, 유두종, 세르톨리 세포종, 난포막 세포종, 평활근종, 평활근육종, 근아세포종, 근종, 근육종, 횡문근종, 횡문근육종, 뇌실 상의세포종, 신경절신경종, 신경교종, 수아세포종, 수막종, 신경섬유초종, 신경아세포종, 신경상피종, 신경섬유종, 신경종, 부신경절종, 비크롬친화성부신경절종, 항각화종, 경화성 맥관종, 혈관종, 사구맥관종, 혈관내피종, 혈관종, 혈관외피세포종, 혈관육종, 림프관종, 림프관근종, 림프관육종, 송과체종, 암육종, 연골육종, 엽상 낭육종, 섬유육종, 혈관육종, 평활근육종, 백혈육종, 지방육종, 림프관육종, 근육종, 점액육종, 난소 암종, 횡문근육종, 육종(카포시 및 비만세포), 신생물(예, 골, 소화계, 결장직장, 간, 췌장, 뇌하수체, 고환, 안와, 뇌 및 목, 중추신경계, 청각, 골반, 호흡관 및 뇨생식기), 신경섬유종증 및 경부 형성장애증 등이 있다.

본 발명은 순환 중인 상피 세포만을 검출하는 것에 한정되지 않는다. 심근경색증을 앓고 있는 환자의 혈액중에는 상피 세포가 관찰된다. 내피 세포, 심근 세포 및 바이러스 감염된 세포, 유사 상피세포는 유효한 모노클로날 항체에 의해 인식되는 세포형 특이성 결정인자를 갖는다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 이러한 순환 중인 내피 세포를 검출하는데 적절할 수 있다. 또한, 본 발명은 감염성 질환을 잃고 있는 환자의 말초 혈액 중의 박테리아 세포 부하를 검출하며, 또한 본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 사용하여 평가할 수 있다.

저널 논문, 미국 특허 및 미국 특허 출원에 대한 언급이 상기에 제시되어 있다. 이러한 상기의 인용 각각의 내용은 마치 본 명세서에서 완전하게 설명되는 것과 같이 본 명세서에서 참고로 인용한다.

본 발명의 특정의 바람직한 실시태양이 상기와 같이 예를 들어서 구체적으로 기재되어 있기는 하지만, 이는 본 발명을 이러한 실시태양에 국한시키려는 의도는 아니다. 다양한 수정에는 본 발명의 정신에서 벗어남이 없이 이루어질 수 있을 것이며, 본 발명의 완전한 범위는 이하의 청구의 범위에 의해 정의될 것이다.

Claims (83)

1. a) 피실험자로부터 희귀 세포(rare cell)를 함유할 것으로 의심되는 혼합 세포 집단을 포함하는 생물학적 검체를 얻는 단계,

   b) 기타 시료 성분은 거의 배제하고 희귀 세포와 특이적으로 반응하는 생체특이성 리간드에 결합된 자기 입자와 생물학적 검체를 혼합하여 면역자기 시료를 제조하는 단계,

   c) 희귀 세포를 표지하는 생체특이성 제제 1 종 이상과 면역자기 시료를 접촉시키는 단계,

   d) 표지된 희귀 세포를 분석하여 면역자기 시료 중의 임의의 희귀 세포의 존재 및 수를 측정하는 단계(여기서, 상기 시료 중에 존재하는 희귀 세포수가 클수록 질환 상태의 중증도가 더 커짐)를 포함하는, 혼합 세포 집단 중의 희귀 세포의 존재가 질환 상태를 나타내는 것인 혼합 세포 집단 중의 희귀 세포의 검출 및 계수 방법.
2. 제1항에 있어서, 면역자기 시료의 제조 단계와, 생체특이성 제제 1 종 이상과 면역자기 시료의 접촉 단계 사이의 중간 단계로서, 상기 면역자기 시료를 자기장으로 처리하여 면역자기 시료로서 희귀 세포 농후 세포 현탁물을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 농후 희귀 세포를 함유하는 면역자기 시료의 부피가 감소되는 것인 방법,
4. 제1항에 있어서, 분석 이전에, 상기 면역자기 시료를 표지된 희귀 세포 함유 분획 및 비표지된 분획으로 분리하는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 자기 입자는 콜로이드성이고, 분리는 상기 면역자기 시료를 자기장 구배로 처리하여 수행하는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 희귀 세포는 내피 세포, 태내 순환에서의 태아 세포, 박테리아 세포, 심근 세포, 상피 세포 및 바이러스 감염된 세포로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
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22. 자기 물질의 나노입자 코어, 접근 가능할 경우 생물학적 거대분자에 베이스 코팅된 입자가 비특이적으로 결합되는 것에 기여하게 되는 1 이상의 불연속 부위를 제공하게 되는, 상기 자기 코어 상의 불연속 코팅을 형성하는 단백질을 포함하는 베이스 코팅 물질, 및 단백질 베이스 코팅 물질에 커플링되는 특이적 결합쌍의 한 일원을 포함하는 추가의 코팅 물질을 포함하며, 여기서 상기 특이적 결합쌍의 한 일원의 적어도 일부분은 단백질과 최적으로 접합된 특이적 결합쌍의 다른 일원에 결합되고, 상기 추가의 코팅 물질은 상기 생물학적 거대분자에 의해 1 이상의 불연속 부위로의 접근을 방해하는 것인 코팅된 자기 입자.
23. 제22항에 있어서, 상기 자기 코어 물질은 1 종 이상의 전이 금속 산화물을 포함하며, 상기 베이스 코팅 물질은 단백질을 포함하는 것인 코팅된 자기 입자.
24. 제22항에 있어서, 특이적 결합쌍의 한 일원은 이중작용성 결합 화합물을 통해 베이스 코팅 물질에 커플링되는 것인 코팅된 자기 입자.
25. 제22항에 있어서, 특이적 결합쌍은 바이오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc 및 아비딘-바이오틴으로 구성된 군에서 선택되는 것인 코팅된 자기 입자.
26. 제22항에 있어서, 특이적 결합쌍은 바이오틴-스트렙타비딘이고, 스트렙타비딘은 베이스 코팅 물질에 커플링되는 것인 코팅된 자기 입자.
27. 제26항에 있어서, 베이스 코팅 물질에 커플링된 스트렙타비딘의 분획은 바이오틴화 항체에 결합되고, 스트렙타비딘의 나머지는 미결합되어 있는 것인 코팅된 자기 입자.
28. 제26항에 있어서, 베이스 코팅 물질에 커플링된 스트렙타비딘 분획은 바이오티닐화 항체에 결합되어 있고, 나머지 대부분의 스트렙타비딘의 유리 바이오틴에 결합되어 있는 것인 코팅된 자기 입자.
29. 제26항에 있어서, 베이스 코팅 물질에 커플링된 스트렙타비딘의 분획은 바이오티닐화 항체에 결합되고, 잔류하는 대부분의 스트렙타비딘은 바이오틴-단백질 접합체에 결합되어 있는 것인 코팅된 자기 입자.
30. 제29항에 있어서, 바이오틴-단백질 접합체의 단백질 성분은 소 혈청 알부민을 포함하는 것인 코팅된 자기 입자.
31. 제22항에 있어서, 자기 질량이 70∼90%인 것인 코팅된 자기 입자.
32. 제22항에 있어서, 대부분의 입자는 입자 크기가 90∼120 ㎚ 범위내인 것인 코팅된 자기 입자.
33. 제22항에 있어서, 대부분의 입자는 입자 크기가 120∼150 ㎚ 범위내인 것인 코팅된 자기 입자.
34. 제22항에 있어서, 대부분의 입자는 입자 크기가 90∼150 ㎚ 범위내인 것인 코팅된 자기 입자.
35. 생물학적 적합성 수성 매질 중에 현탁된 제22항에 정의된 다수의 자기 입자를 포함하는 조성물.
36. 자기 전이 금속 산화물의 나노입자 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질 및 이중작용성 결합 화합물을 통해 상기 베이스 코팅 물질에 커플링된 추가의 코팅 물질을 포함하며, 상기 추가의 코팅 물질은 바이오틴-스트렙타비딘, 항원-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용물질-길항물질, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc 및 아비딘-바이오틴으로 구성된 군에서 선택된 특이적 결합쌍의 한 일원이고, 하나의 특이성 결합쌍 일원의 적어도 일부분은 단백질과 최적으로 접합체되어 있는 상기 특이성 결합쌍의 다른 일원에 결합되어 있는 것인 코팅된 자기 입자.
37. 제36항에 있어서, 상기 코어 물질은 자철광이며, 상기 베이스 코팅 물질은 소 혈청 알부민이고, 상기 특이적 결합쌍은 바이오틴-스트렙타비딘이며, 스트렙타비딘은 상기 베이스 코팅물질에 커플링된 것인 코팅된 자기 입자.
38. 제37항에 있어서, 베이스 코팅물질에 커플링된 스트렙타비딘의 분획은 바이오틴화 항체에 결합되어 있고, 잔류하는 대부분의 스트렙타비딘은 바이오틴-소 혈청 알부민 접합체에 결합되어 있는 것인 코팅된 자기 입자.
39. 생물학적 적합성 수성 매질 중에 현탁된 제38항에 정의된 다수의 자기 입자를 포함하는 조성물.
40. a) 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질, 희귀 세포의 1차 특징적인 결정인자에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 이 항체는 상기 베이스 코팅 물질에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링되어 있는 것인 코팅된 자기 나노입자,

    b) 희귀 세포의 2차 특징적인 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 항체,

    c) 분석으로부터 상기 희귀 세포 이외의 시료 성분을 배제시키기 위한 세포 특이성 염료를 포함하는 순환 중인 희귀 세포의 존재에 대해서 환자 시료를 스크리닝하기 위한 테스트 키트.
41. 제40항에 있어서, 상기 키트는 비표적 세포에 대해 결합 친화성을 갖는 항체, 생물학적 완충제, 투과성 완충제, 및 키트를 사용하기 위한 지시사항이 제공된 정보 시이트를 더 포함하는 것인 키트.
42. 제40항에 있어서, 상기 희귀 세포는 내피 세포, 태내 순환에서의 태아 세포, 박테리아 세포, 심근 세포, 상피 세포 및 바이러스 감염된 세포로 구성된 군에서 선택되는 것인 키트.
43. a) 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질, 및 이 베이스 코팅 물질에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 항-상피 세포 유착 분자를 포함하는 코팅된 자기 나노입자,

    b) 암 세포의 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 항체,

    c) 분석으로부터 암 세포 이외의 시료 성분을 배제시키기 위한 세포 특이성 염료를 포함하는, 순환 중인 암 세포의 존재에 대해서 환자 시료를 스크리닝하기 위한 키트.
44. 제43항에 있어서, 상기 키트는 비종양 세포에 대해 결합 친화성을 갖는 항체, 생물학적 완충제, 투과성 완충제, 프로토콜 및 임의로 정보 시이트를 더 포함하는 것인 키트.
45. 제43항에 있어서, 환자의 유방암 스크리닝을 위한 것으로서, 암 세포 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 항체는 유방암 세포 결정인자에 특이적으로 결합되며, 상기 결정인자는 MUC-1, 에스트로겐, 프로게스테론 수용체, 카텝신 D, p53, 유로키나제형 플라스미노겐 활성제, 표피 성장 인자, 표피 성장 인자 수용체, BRCA1, BRCA2, CA27.29, CA15.5, 전립선 특이성 항원, 플라스미노겐 활성제 억제제 및 Her2-neu로 구성된 결정인자 군으로부터 선택되는 것인 키트.
46. 제43항에 있어서, 환자의 전립선암 스크리닝을 위한 것으로서, 암 세포 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 항체는 전립선암 세포 결정인자에 특이적으로 결합되며, 상기 결정인자는 전립선 특이성 항원, 프로스타트산 포스파타제, 티모신 b-15, p53, HPC1 베이직 전립선 유전자, 크레아틴 키나제 및 전립선 특이성 막 항원으로 구성된 결정인자 군으로부터 선택되는 것인 키트.
47. 제43항에 있어서, 환자의 결장암 스크리닝을 위한 것으로서, 암 세포 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 항체는 결장암 세포 결정인자에 특이적으로 결합되며, 상기 결정인자는 암배 항원(carcinoembryonic antigen), C 단백질, APC 유전자, p53 및 매트릭스 메탈로프로테인아제(MMP-9)로 구성된 결정인자 군으로부터 선택되는 것인 키트.
48. 제43항에 있어서, 환자의 방광암 스크리닝을 위한 것으로서, 암 세포 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 항체는 방광암 세포 결정인자에 특이적으로 결합되며, 상기 결정인자는 핵 매트릭스 단백질(NMP22), 바드(Bard) 방광 종양 항원(BTA) 및 피브린 분해 산물(FDP)로 구성된 결정인자 군으로부터 선택되는 것인 키트.
49. 제43항에 있어서, 1 종 이상의 항체는 각각 상이한 암 세포의 특징적인 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 패널을 포함하는 것인 키트.
50. a) 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질, 및 이 베이스 코팅 물질에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 항-상피 세포 유착 분자를 포함하는 코팅된 자기 나노입자,

    b) 유방암 세포 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 항체,

    c) 분석으로부터 상기 유방암 세포 이외의 시료 성분을 배제시키기 위한 세포 특이성 염료를 포함하는, 순환 중인 유방암 세포의 존재에 대해서 환자 시료를 스크리닝하기 위한 키트.
51. a) 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질, 및 이 베이스 코팅 물질에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 항-상피 세포 유착 분자를 포함하는 코팅된 자기 나노입자,

    b) 전립선암 세포 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 항체,

    c) 분석으로부터 상기 전립선암 세포 이외의 시료 성분을 배제시키기 위한 세포 특이성 염료를 포함하는, 순환 중인 전립선 세포의 존재에 대해서 환자 시료를 스크리닝하기 위한 키트.
52. a) 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질, 및 이 베이스 코팅 물질에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 항-상피 세포 유착 분자를 포함하는 코팅된 자기 나노입자,

    b) 결장암 세포 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 항체,

    c) 분석으로부터 상기 결장암 세포 이외의 시료 성분을 배제시키기 위한 세포 특이성 염료를 포함하는, 순환 중인 결장암 세포의 존재에 대해서 환자 시료를 스크리닝하기 위한 키트.
53. a) 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질, 및 이 베이스 코팅 물질에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 항-상피 세포 유착 분자를 포함하는 코팅된 자기 나노입자,

    b) 방광암 세포 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 1 종 이상의 항체,

    c) 분석으로부터 상기 방광암 세포 이외의 시료 성분을 배제시키기 위한 세포 특이성 염료를 포함하는, 순환 중인 방광암 세포의 존재에 대해서 환자 시료를 스크리닝하기 위한 키트.
54. a) 자기 코어 물질, 단백질 베이스 코팅 물질, 및 이 베이스 코팅 물질에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 항-상피 세포 유착 분자를 포함하는 코팅된 자기 나노입자,

    b) 세포내 사이토케라틴 마커에 대해 결합 특이성을 갖는 항체,

    c) 상기 세포내 사이토케라틴 마크와는 상이한 소정의 암 특이성 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 항체, 및

    d) 분석으로부터 상기 암 세포 이외의 시료 성분을 배제시키기 위한 세포 특이성 염료를 포함하는, 암의 재발에 대해서 환자를 모니터링하기 위한 테스트 키트.
55. 제54에 있어서, 상기 키트는 비종양 세포에 대해 특이성을 갖는 항체, 생물학적 완충제, 투과성 완충제, 프로토콜 및 임의로 정보 시이트를 더 포함하는 것인 키트.
56. 제54항에 있어서, 환자의 유방암 모니터를 위한 것으로서, 소정의 암 세포 특이성 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 항체는 유방암 세포 결정인자에 특이적으로 결합되며, 상기 결정인자는 MUC-1, 에스트로겐, 프로게스테론 수용체, 카텝신 D, p53, 유로키나제형 플라스미노겐 활성제, 표피 성장 인자, 표피 성장 인자 수용체, BRCA1, BRCA2, CA27.29, CA15.5, 전립선 특이성 항원, 플라스미노겐 활성제 억제제 및 Her2-neu로 구성된 결정인자 군으로부터 선택되는 것인 키트.
57. 제54항에 있어서, 환자의 전립선암 모니터를 위한 것으로서, 소정의 암 세포 특이성 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 항체는 전립선암 세포 결정인자에 특이적으로 결합되며, 상기 결정인자는 전립선 특이성 항원, 프로스타트산 포스파타제, 티모신 b-15, p53, HPC1 베이직 전립선 유전자, 크레아틴 키나제 및 전립선 특이성 막 항원으로 구성된 결정인자 군으로부터 선택되는 것인 키트.
58. 제54항에 있어서, 환자의 결장암 모니터를 위한 것으로서, 소정의 암 세포 특이성 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 항체는 결장암 세포 결정인자에 특이적으로 결합되며, 상기 결정인자는 암배 항원, 캔드(Cand) 단백질, APC 유전자, p53 및 매트릭스 메탈로프로테인아제(MMP-9)로 구성된 결정인자 군으로부터 선택되는 것인 키트.
59. 제54항에 있어서, 환자의 방광암 모니터를 위한 것으로서, 소정의 암 세포 특이성 결정인자에 대해 결합 특이성을 갖는 항체는 방광암 세포 결정인자에 특이적으로 결합되며, 상기 결정인자는 핵 매트릭스 단백질(NMP22), 바드(Bard) 방광 종양 항원(BTA) 및 피브린 분해 산물(FDP)로 구성된 결정인자 군으로부터 선택되는 것인 키트.
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71. 순환 중인 종양 세포가 분획을 얻은 말초 혈액 시료에 비해서 2,500 배 이상으로 농후한, 제1항의 방법에 의해 분리한 말초 혈액 분획.
72. 순환 중인 신생 세포가 분획을 얻은 말초 혈액 시료에 비해서 5,000 배 이상으로 농후한, 제1항의 방법에 의해 분리한 말초 혈액 분획.
73. 순환 중인 신생 세포가 분획을 얻은 말초 혈액 시료에 비해서 10,000 배 이상으로 농후한, 제1항의 방법에 의해 분리한 말초 혈액 분획.
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75. 혈액 시료를 얻기 이전에 암에 걸린 것으로 의심되는 조직을 마사지하는 것을 포함하는, 혈액 시료 중의 순환 중인 상피 세포수를 증가시키는 방법.
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