JPH03500370A - ペプチドおよびｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドおよびＤＮＡ配列 本発明は、かび（たとえば、酵母５ａｅｃｈａｒｏｉｙｃｅｉＣｅ　Ｉ’　ｅ　 １口１ａｅ）から異種タンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン）の分泌を指 図するために使用できる分泌リーダー配列に関する。

ある細胞区画から他の細胞区画への二重脂質膜を通過するタンパク質分子の移動 は、一般に、タンパク質自体の一次アミノ酸配列内に保持された情報によってい る。

最も広く用いられ、したがって特性が最もよく調べられている配列情報は、原核 生物および真核生物のアミノ末端リーダーまたはシグナル配列である。シグナル 配列を完全にまたは広範囲に欠失させた遺伝子研究により、シグナル配列はタン パク質の移動に必須なことが示されている（Ｂ！ｍ５ｏｎ、　Ｓ、　Ａ、　ら： １９８５．＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　。

５４：１０１〜１３４）、数百種の既知配列（Ｗａｊｓｏｎ。

Ｍ、　Ｅ、　Ｅ、：　１９８４．　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅ５１，１２　：　５ １４５〜５１６４）中に、一致したシグナル配列も、ある与えられた位置でのあ るアミノ酸の絶対的要求といったものも認めることはできないが、多くのリーダ ー配列の共通の特徴には７〜１０個の疎水性アミノ酸のコアがある。この疎水性 コアに、欠失また廿荷電残基の挿入のいずれかによる変化を生じる遺伝子操作を 行うと、一般に、タンパク質の移動の阻止が起こる（Ｂｅｎｓｏｎ、　Ｓ、　Ａ 、ら：１９８５゜Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈ！ｍ、、５４　：　１０１〜１３ ４）　、さらに、ニワトリのりゾチームリーダ配列に対する一連の広範囲の修飾 により一、Ｙａｍａ１１ｏｔｏら、１９８７　（Ｂｉｏｔｈｅ＋ｅ。

Ｂｉｏｐｂｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、　１４９　：　４３１〜４３６）は 、疎水性コアに対する一部の変化は分泌の消失を生じるものの、リーダー配列機 能を増強してタンパク質の分泌レベルの上昇を生じる場合もあることを明らかに した。

リーダー配列は通常、タンパク質の膜を通過する移動に必須であるが、いったん 移動するとこれらの配列は、タンパク質が移動した細胞分画内に含まれる酵素に より、通常、タンパク質の内部ペプチド鎖で切断される。

これらの酵素は、移動したタンパク質の一次構造内の特定のアミノ酸配列を認識 する。さらに、ある種の真核生物タンパク質のその成熟型への完全なプロセッシ ングは、多くの場合、タンパク分解的切断によるものである（Ｂｎｓｓｅｙ、Ｈ ，：１９８８．　Ｙｅａｓｔ、　４　：　１７〜２６）。

最近の組換えＤＮＡ技術の進歩に伴い、多様な範囲のタンパク質の製造に際して のビヒクルとして、かびとくに酵母の工業的に利用に向けられた研究が次第に増 加してきた。

これらのタンパク質の多くはそれ自体自然に分泌される生成物であるから、分泌 経路を通してタンパク質を導くためにはリーダー配列内に含まれた情報を利用す ることができる。しかしながら、この情報は酵母に対して異種のペプチド内に含 まれている。酵母分泌経路によるその認識、それに続くプロセッシングは同種の 酵母リーダー配列の認識、プロセッシングの場合はどは必ずしも効率的ではない 。したがって、別のアプローチとして、リーダー配列を、天然に分泌される酵母 タンパク質由来の配列に置換することが行われてきた。

最も広く用いられる酵母の分泌配列は、α−因子接合フエ口モンの８９個のアミ ノ酸のリーダー配列である。

このリーダーのプロセッシングは広（研究されていて１．９８４）、完全なタン パク分解的切断により１３個のアミノ酸の成熟α−因子フェロモンを遊離するた めには、少なくとも４種の遺伝子産物を要求する。

ａ−因子一次翻訳生成物の完全なタンパク分解的切断には、最初に、小胞体内の シグナルペプチダーゼによるＮ−末端の１９個のアミノ酸のシグナル配列の除去 が必要である。これに続いて、ゴルジ装置内に存在する３種の遺伝子生成物の一 連の作用で大きな前駆体分子が処理され、α−因子フエ口モンの４個のニピーが 遊離する。

これらは、Ｌｙｓ−Ａｒｇ二塩基性アミノ酸対の後を切カルボキシペプチダーゼ β様切断を行い最近ＫＥＸＩ遺子の生成物で成熟α−因子フェロモンに先立つＧ ｌｕ−Ａ、　１　ａまたはＡｓｐ−Ａｌａｌアジノ酸対を続いて除去するジペプ チジルアミノペプチダーゼである。

α−因子プレプロリーダー配列はある範囲の多様なタンパク質およびペプチドを 分泌させるために効果的に使用されてきた。しかしながら、本発明者らは、ヒト 血清アルブミンの分泌を指図するためにα−因子シグナルを使用した場合、生成 した細胞外ＩＳＡの大部分が４５ＫＤ　Ｎ−末端フラグメントの形であることを 見出した。

ＥＰ−Ａ−２５２５６１（Ｓｃｌａｖｏ）には、酵母テノベブチド（プレ配列） の使用が開示されている。

さらに、融合分泌リーダー配列を使用できる可能性がある。これは２種の独立の 配列の融合によって作成することができる。酸ホスファターゼシグナルの最初の アミノ酸がヒトα−インターフェロンのタンパク分解的切断部位に融合させたハ イブリッドシグナルでは、インターフェロンの発現および分泌を生じ（Ｈｔｎｎ ｅｎら：Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　１ ｎｄｕｓｊｒｉａｌ　Ｆｅ＋ｍｅｎ−ｔａｌｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、２２９ 　：　１．２１９〜１２２４．　１９８３）、生成したインターフェロンの１０ ％が培地中に分泌された。同様のアプローチで、α−因子リーダーの最初の２２ 個のアミノ酸をヒトインターフェロンα−２シグナル配列の最後の１２個のアミ ノ酸に融合させると、培養上清へのインターフェロンα−２の分泌を生じた。

（Ｐｉｇｇｏｔｌら：　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｌ、、　１２　：　５６１〜５６７ ．１９８７）。インターフェロンα−２遺伝子をインターフェロンβ遺伝子で置 換した同様の構築体では、培養上清へのヒトインターフェロンβの分泌は起こら なかった。

最後に、ヒトリゾチームの分泌に対するリーダー配列の効果を評価するために計 画された一連の実験において、Ｙｏｓｈｉｍｕ＋ａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ ｐｂＨ，Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｏｎ、、　１４５　ニア１２〜７１８．１９８７） は、ニワトリリゾチームリーダーの最初の９個のアミノ酸とＡｓｐｅ＋ｇｉｌｌ ｎｓ　ａｖａｍｏｒｉグリコアミラーゼリーダーの最後の９個のアミノ酸からな る融合リーダーについて報告している。この融合リーダーは生成した物質の６０ ％を培養上清に分泌させる効果があったが、完全なニワトリリゾチームのわずか １５％の効果しかなかった。しかも、ヒトリゾチーム配列の前に完全なＡｓｐｅ ｒｇｉｌｌｎｓグリコアミラーゼリーダー、またはＡｓｐｅｒｌｉｌｌｕｔグル コアミラーゼリーダーの最初の９個のアミノ酸とニワトリリゾチームリーダーの 最後の９個のアミノ酸から誘導した融合体を配置しても、分泌生成物は検出でき なかった。

本発明者らは、かびに使用するための新規かつ有利なリーダー配列を案出した。

本発明の一態様は、以下のアミノ酸配列、すなわち、（ａ）　ＩＩ２Ｎ−Ｍｅｔ −Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−５ａｒ−Ｐｈｅ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ −Ｐｈｅ−Ｌａｕ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−５＠ｒ−ＡＩａ−’ｒｙｒ−５＠ｒ−Ａｒ ９−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙ８−）Ｘ（ｉ−Ｃｏｏ）！もしくは またはいずれかの配列の保存的に修飾された変異体を提供する。

第１表には、最初のメチオニンを除く各位置の代用可能なアミノ酸を示す。可能 な任意の置換が本発明の範囲内に包含される。最後の２個の位置に対するリジン またはアルギニンの選択にはとくに制限はないが、これらの各位置には常にＬｙ ｓまたはＡｒｇが存在しなければならない。配列（ａ）の位置２０および２１は それぞれＧｌｙおよびＶａｌではないことが好ましい。アミノ酸４個まで短いか または長い配列も、Ｃ末端（Ｌｙｓ。

Ａｒｇ）　、Ｌｙｓ−ＬｙｓまたはＡｒｇ−Ａｒｇの独自性が維持され、Ｎ末端 の５残基内に陽性荷電残基が存在し、配列の中間にまたはそれに隣接して一般に 疎水性の領域が存在することを条件に包含される。

第１表 Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈ＋ｅ工１ｅ　Ｓｅｒ　ＩＪｕ　 Ｉａｕ　Ｐｈｅ　’Ｌ＊ｕ　Ｐｈｅ　ＳｅｒＡｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　 Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ工１ｅ工ｌａ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　ＴｈｒＨｌｓ 　Ｔｙｒ工ｌｅ　Ｇ１７　Ｔｙｒ　Ｖａ工Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｖ ａｌ　Ｔｙｒ　ＧｌｙＧｉｎ　Ｍｅｔλユａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　）ｌｅ ｔ　Ｍｅｔ：　ＡｌａＳ＠ｒ　Ａ１１アｓｓｒ　ｋＸｑ　５ｓｓｒ　Ｌｅｕ　Ａ ！ＩＰ　ＬＹＩＩ　ｋＸｑ艷Ｔｈｒ　Ｐｈ＠Ｔｈｒ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ工ｌｅ　Ｇ ｌｕ　）ｉｑ　Ｌｙｒｃｌｙ　Ｇｌｙ　’Ｉ’ｒｐ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｇａｙ　 ｖａｌ　ＪｕｎＡｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ、　Ｇｉｎ　ＡＬａ　Ｍａｔ　ＧｉｎＡ ！ｓｎ　Ｈｌｓ リーダー（ｂ） ｘ＠ｔ　ＡｊＩｎ　工１ｅ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　工ｌｅ　Ｐｈｅ　’Ｌ＠ｕ　Ｐｈ ｅ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｓｉｒ　Ｐｈｅ　Ｖａ工Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｐｈ＠ Ｌｅｕ　Ｔｒｐ工ｌ＠ＴｒｐＩ１ｍ　Ｉｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　論ｕＧｌｕ　Ｖ ａ工Ｔｙｒ　Ｔｒｐ、Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｖａｎ　Ｔｙｒ　Ｖａ工Ｖａｌ　Ｇｌｙ 　Ｔｙｒ工１ｅＧｉｎ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｍ ｅｔＧｉｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｘ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＡ！ＩＰ　Ｓｅ ｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　ＬｙｓＡｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ 　ＧｌｕＧｌｕ　入１＆　Ａｌａ　Ｍｅｔ　ＧｉｎＨｌｓ　Ｈｉａ 第二の態様では、上記のアミノ酸配列が好ましくは直接、そのカルボキシル末端 で、ポリペプチドのＮ−末端残基に連結してなる融合タンパク質を提供する。ポ リペプチドは任意の所望のポリペプチドであってよく、「ブローポリペプチド」 　（換言すれば、翻訳後切断または他の修飾たとえばグリコジル化を受ける前駆 体）も包含される。「ポリペプチド」の語にはオリゴペプチドを含む。

ポリペプチドは、フィブロネクチンもしくはその部分（たとえば、コラーゲンま たはＥＰ　２０７　７５１に記載されているフィブリン結合タンパク質）、ウロ キナーゼ、ブローウロキナーゼ、ＣＤ４の１−３６８部分（Ｄ、Ｓｍ１ｌｈら： １９８７，５ｃｉｅｎｃｅ、３２８：１７０４〜１７０７）、血小板由来成長因 子（Ｃｏｆｆｉｎｓら：１９８５、Ｎｉｊ、＋＋ｒｅ、３１６　：　７４８〜７ ５０）　、形質転換成長因子β（Ｄｅｒ７ｎｃｋら：１９８５．　）ｉｎｊｕｒ ｅ、３１６　：　７０１〜７０５）、フォノ・ビルプラント因子の１−２７２部 分（Ｂｏｎｌｈａｍら：　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１４　：　７１２ ５〜７１２７）、フィブロネクチンのカテプシンＤ断片（５８５−１５７８）、 αｌ−アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、ＸＩ因子、α−グロビ ン、β−グロビン、ミオグロビンもしくは神経成長因子、またはこれらの保存的 変異体であってよい。ポリペプチドはまた、ＩＳＡまたはそのＮ末端部分と任意 の他のポリペプチドたとえば上に挙げたようなポリペプチドとの融合体であって もよい。好ましくはポリペプチドは天然のヒト血清アルブミン、修飾ヒト血清ア ルブミンまたはそれらの断片であり、このような修飾型または断片は「変異体」 と呼ばれる。これらの変異体には、ＨＳＡの生理的機能の少なくとも１つを保持 し、その構造（とくに三次構造）の点で本技術分野の熟練者によってＩＳＡの型 または断片とみなされるのに十分なＩＳＡとの類似性を有するＨＳＡのすべての 型および断片が包含される。

とくに、例えばビリルビンまたは脂肪酸に関し、そのリガンド結合性の少なくと も５０％（好ましくは８０％、または９５％）を維持するＩ　Ｓ　Ａの変異体ま たは断片が包含されるこのような性質については、Ｅｒ０口、Ｊ、１１．＆５ｈ ｏｃｋｌｅｙ、Ｐ、　（１９８２）　：　Ｌｉｐｉｄ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｎｔ ｅ＋１ｃｔｉｏｎ。

１　：　２６−２８．　Ｊｏｓｔ、Ｐ、Ｃ，＆　Ｇｒｉｆｆｉｌｂ、　０、Ｈ１ 編、に論じられている。

ＥＰ　３２２　０９４に開示されたＨＳＡの部分は、本発明のリーダー配列の使 用によって分泌させることができる有用なＨ３Ａ断片の例である。

第三の態様では、任意の上記アミノ酸配列または上記融合化合物をコードするヌ クレオチド配列が提供される。

ヌクレオチド配列（またはリーダー配列をコードするその部分）は、それぞれ配 列（１）および（ｂ）について第２表および第３表に示す可能性から選択される 。表中、各アミノ酸をコードするコドンはそのアミノ酸の下に掲げる。第２表お よび第３表のコドンは明らかなようにＲＮＡに関するものであるが、相当するＤ ＮＡヌクレオチド配列も本発明のこの態様の範囲内に包含されることを理解すべ きである。

第２表 Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　’ｒｒｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　工１会Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　 Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＳ＠’ｒ：ＡＵＣＡＡＡ　ｔＴＧＧ　ＧＵｖυ ＣυｔＪＵＴＪ　ＡＵＵ　、ｔＴＣ１７ｔＪＵＡ　ＵＵＡ　ＵＵＯＵｔ）Ａ　Ｕ ＵＵ　ｔ）ＣｕｒＡＡＧ　Ｇｔ）ＣＵＣＣＵＯＣＡＴＴＣＵＣＣＵＵＧ　ＵＵＧ 　ＵＵＣ，ＵＵＧ　ＵＵＣｔＪｃｃＧＵＡ　ＵＣＡ　ＡＵＡ　ＵＣＡ　ＣＵｔＪ 　Ｃ凹　圓　ＵユＧＵＧ　ｔｌｃＧ　ＵＣＧ　ＣＵＣＣＵＣＣＵＣＵＣＧＡＧＵ 　ＡＧＵ　ＣＵＡ　ＣＵＡ　ＣＵＡ　ＡＧＯＡＧＣＡＧＣＣＵＧ　ＣＵＧ　ＣＯ Ｇ　ＡＧＣＳｅｒ　Ａユａ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｑ　Ｓｓｒ　Ｌａｕ　λ！５ ｐ　ＬＹＩ！　Ｍｑｔ７ｃＵ　ＧＣＵ　ＵＡｔＴ　ＵＣＵ　ＣＧ’Ｏｔ７ＣＵ　 ｔＪＵＡ　ＧＡＵ　ＡＡＡ　ＣＧＵＵＣＣＧＣＣＵＡＣＵＣＣＣＧＣｔＴＧＧ　 υｔＪＧ　ＧＡＣＡＡＧ　ＣＧＣＵＣＡ　Ｇい　ＵユＣひＵユＣ四　ＣＧＡＵＣ Ｇ　ＧＣＧ　ＵＣＧ　ＣＧＧ　ＵＣＧ　ＣＵＣＣＧＧＡＧＵ　ＡＧＵ　ＡＧＡ　 ＡＧＵ　ＣＵＡ　ＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧ　ＡＧＣＣＵＧ　ＡＧＧ第３表 ｉｅｔ　Ａｓｎ工ｌｅ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ工ｌｅ　Ｐｈｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅ ｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈ、ｅ　ＶａｌＡＵＧ　ＡＡｔＪ　ＡＵＵ　ＵｔＪｔＴ 　ＵＡＵ　ＡＵＵ　ＵＵＵ　％ＴＡ　ＵＯＣ７ＵＵＡ　ＵＵＡ　ＵＣυＵＤ’Ｕ 　ＧＵＵＡＡ、ＣＡＵＣＵＵＣｔ）ＡＣＡＵＣｔ７ＵＣｔｌＴｃＪＧ　ｔＴＵｃ 　ｔ７ＵＧ　ＩＧυＣＣｔＴＵｃ　ＧＵＣＡＵＡ　ＡＵＡ　ＣＯＤ　ＣＵｔＪＣ ＵＵＵＣＡ　ＧＵＡＣｔｌＣＣＵＣＣＵＣＵＣＧ　ＧＵＧ ＣＵＡ　ＣＵＡ　ＣＵＡ　ＡＧＵ ＣｔｌＧ　ＣＵＧ　ＣＵＧ　ＡＧＣ Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＸＪ＠ｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ刈ωＵυＣυ四Ａ 　ＧＡυＡＧＣＵ ＣＡＧ　ＧＧＣＵＣＣＵＵＧ　ＧＡＣＡＡＧ　ＣＧＣＧＱＡ　ＵＣＡ　ＣＵＤ　 ＣＧＡ ＧＧＧ　ＵＣＧ　ＣＵＣＣＧＧ ＡＧＵ　ＣＵＡ　ＡＧＡ ＡＧＣＣＵＧ　ＡＧＧ 第四の態様では、適当な１個または２個以上の制御領域と、その制御領域の制御 下にある上述のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ構築体が提供される。「適当な 制御領域」の語は、その構築体が意図される宿主内での上記ヌクレオチド配列の 発現を可能にするのに必要なりＮＡ領域を意味する。制御領域には通常、転写開 始および停止配列、３′−ポリアデニル化配列、プロモーター、および多くの場 合、プロモーターの上流活性部位が包含される。本技術分野の熟練者には、本技 術分野におＬｌて利用可能な配列から適当な領域を選択し、組立てることは容易 である。しかしながら、適当な発現ベクターおよびその構築の例としてはＥＰ　 １９８　７４５、ＧＢ　２１７１　７０３　（枯草菌の場合）、ＥＰ　２０７　 １６５、ＥＰ　１．１６　２０１、ＥＰ　１２３　２４４、ＥＰ　１２３　５４ ４、ＥＰ　１４７　１９８、ＥＰ２０１　２３９、ＥＰ　２４８　６３７、ＥＰ 　２５１７４４、ＥＰ　２５８　０６７、ＥＰ　２８６　４２４およびＥＰ　３ ２２　０９４に開示されている例を挙げることができる。

第五の態様では、上記ＤＮＡ構築体で形質転換された宿主が提供される。宿主は その構築体がその内部で適切に作動することが明らかにされた任意の宿主であっ て、細菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞が包含される。し かしながら、好ましい宿主は泌シグナルは異種宿主においても有効であるから（ たとえば、酵母における天然のＨ３Ａリーダー配列）、本発明のリーダー配列が 酵母以外の宿主においても機能するであろうと考えることは全く合理的である。

第六の態様は、上記宿主を培養し、それから上記ヌクレオチド配列によって発現 されたポリペプチドまたはその修飾変異体を得ることによるポリペプチドの製造 方法を提供する。「その修飾変異体」の語は、実際に分離されるポリペプチドが 翻訳後に、とくにリーダー配列の切断によって修飾されていることを意味する。

第七の態様では、このような方法で製造されたポリペプチドが提供される。

本発明の理解をさらに容易にするために、本発明の好ましい態様を実施例により 、添付の図面を参照しながら詳細に説明する。

第１図は、プラスミドｐＥＫ１１３の制限酵素地図である。

第２図は、プラスミドｐＥＫ２５の制限酵素地図である。

第３図は、プラスミドｐＡＹＥ２３０の制限酵素地図である。

第４図は、プラスミドｐＡＹＥ２３８の制限酵素地図である。

第５図は、プラスミドｐＡＹＥ３０４の制限酵素地図である。

第６図は、プラスミドｐＡＹＥ３０５の制限酵素地図である。

従来技術型のリーダー配列の例 成熟Ｈ３Ａタンパク質の配列をコードするＤＮＡはα因子プレプロリーダー配列 （８５アミノ酸）のＫＥＸ切断部位をコードするＤＮＡ配列のすぐ下流に配置さ れた。

このタンパク質配列が酵母自律的転写プラスミド上のプロモーターの制御下に置 かれ、酵母５ｘｃｃｂａｒｏｎ＋７ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉｉｅの半数体味にト ランスホームされると、培養上清中に成熟Ｈ８Ａを検出することができる。Ｎ− 末端アミノ酸配列情報は、分泌されたタンパク質が天然のＨ３Ａと同じＮ−末端 アミノ酸組成すなわちＡｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓを有することを示している。これ はまた、分泌されたＨ８Ａの最初の２個のアミノ酸が５ＴＥ１３遺伝子の生成物 、ジペプチジルエンドペプチダーゼに感受性のないことを示している。この酵素 はα因子フェロモンの連続反復配列の間からこのような配列の除去する能力があ るからである。成熟Ｈ３Ａは培養上清中に認められる主生成物であるが、Ｈ８Ａ のＮ−末端断片（４５キロダルトン）も検出され、合成された総Ｈ８Ａの約１５ ％を占めた。この断片成分は、分泌能力の浪費のみでなく、これがＨ３Ａの断片 として完全なＨ３Ａの一部の生化学的および生物物理学的性質をもつ点においで ある種の下流精製の問題を提供するものである。

例１ 本発明者らは、天然のＨ８Ａリーダー配列から最後の５個のアミノ酸を除去し、 α因子プレプロリーダー配列のＫＥＸ２切断部位に先行する５個のアミノ酸、す なわちアミノ酸８１〜８５、Ｓｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　（第 ２表）で置換し、天然のＨ３Ａリーダーとみなされる融合リーダーを構築した。

この融合リーダーを導入した適当なプラスミドベクターで形質転換すると、酵母 は、α因子リーダー配列の場合に認められるレベルに匹敵するレベルで、培養上 清中に成熟Ｈ３Ａを分泌する。Ｎ−末端配列解析によると、成熟Ｈ３Ａは正しい Ｎ−末端アミノ酸組成をもっことが明らかである。

さらに、融合リーダー配列によるα因子リーダーの置換により、培養上溝中に認 められる４５ｋｄ断片のレベルは６分の１に低下することが見出された。すなわ ち、これは、夾雑ポリペプチドの低下という点での有意な改良を提供するもので あり、したがって酵母培養上清からの成熟Ｈ８Ａの精製の助けになる。

詳細 とくに指示のない限りすべての操作はＭａｎｉｘｆｉｓら（１９８２）の記載に 従って実施した。プラスミドｐＥＫ１１３（第１図）（ＥＰ−Ａ−２４８６３７ ）は制限エンドヌクレアーゼＭ　ｓ　ｔ　ＩＩおよびＨｉｎｄｍで完全に消化し た。ＤＮＡはフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿で回収した。

次に線状化されたプラスミドＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩのフ レノウ断片で処理して、プラント末端をもつ線状ＤＮＡ分子を生成させた。

ザーで構築した（製造業者の指示に従って）。

オリゴヌクレオチドエ ＧＧＣＴＴＡ　ＴＡＡ　ＧＧＡ　ＴＣＣＴＴＡ　ＴＡＡ　ＧＣＣＣＣＧ　ＡＡＴ 　ＡＴＴ　ＣＯＴ　ＡＧＧ　ＡＡＴ　ＡＴＴ　ＣＧＧオリゴヌクレオチド二重鎖 を、線状化したプラント末端を有するｐＥＫ１１３の等モル量とリゲートした。

リゲーション混合物でＥ、ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１を形質転換し、ＤＮＡが導入 された細胞をアンピシリン含有培地（５０μｇ　／　ｍｌアンピシリン）上で選 択した。オリゴヌクレオチド二重鎖を含む組換えプラスミドは、個々のコロニー から製造されたＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＭｓｔＩＩおよびＥｃｏＲＩで 消化してスクリーニングした。このようにしてプラスミドｐＥＫ２５が形成され た（第２図）。

プラスミドｐＥＫ２５を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで完 全に消化し、ＤＮＡ断片を１％（Ｗ／マ）アガロースゲルを通して電気泳動する ことにより分離し、ゲルから電気溶出によって６８８塩基対Ｘｂａ　Ｉ　−Ｂａ ｍＨＩ断片を回収した。

プラスミドｍｐ１９．７　（ＥＰ−Ａ−２４８６３７）を制限エンドヌクレアー ゼＸｈｏＩで完全に消化した。

線状化されたＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿さ せた。次に、回収されたＤＮＡで前述のように処理し、ついでＤＮＡをフェノー ル／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。回収されたＤＮＡを次に ＸｂａＩで完全に消化し、消化生成物をアガロースゲル電気泳動で分離した。ゲ ルから電気溶出で１０６７塩基対断片を回収した。前述のようにして、以下のオ リゴヌクレオチド二重鎖（ｎ）が製造された。

オリゴヌクレオチド■ ５′ ＧＡＴＣＣＡ’ｊ’Ｇ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＡ　ＡＧＣ’Ｉ’ｌ’Ｔ　ＡＴＴ 　ＴＣＣＣＴＴ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＣＴＣＴＡＣＴ：ｃ　ＡＣＣ−ｃＡ＋？？Ｃ Ｇ　ＡＡＡ　Ｔ！Ｍ　ＡＧＧ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　にＡＧｔ ＴＴＴ　ＡＧＣＴＣＧ　ＧＣＴ　ＴＪｉ’ｊ　ＴＣＣ嶌ＡＧＣＴＴＧ　ＧＡＴ　 ＡＡＡ　ＡＧＡＡＡＡ　ＴＣＧ　ＡＧＣＣＧＡ　Ａ’Ｘ’Ａ　ＡＧＧ　ＴＣＣＴ ＣＧ　ＡＡＣＣＴＡ　？ｊ’？’　ＴＣＴプラスミドＩ）　Ｕ　Ｃ１９（ＹＨｎ ｉｓｃｈ−Ｐｅ＋＋ｏｎら、１９８５）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで 完全に消化した。

線状化されたＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿さ せた。

ＢａｍＨＩ消化ｐＵｃ１９、オリゴヌクレオチド二重鎖■、ｍｐ１９．７から誘 導された１０６７ｂ、ｐ。

ＤＮＡ断片およびｐＥＫ２５から誘導された６８８ｂ、ｐ、ＤＮＡ断片の等モル 量を一緒にリゲートした。

リゲートされたＤＮＡでＥ、ｃｏよ±ＤＨ５を形質転換し、形質転換体を５０μ ｇ　／　ｍｌアンピシリンし一ブイヨンアガール上で選択した。ｐＡＹＥ２３０ と命名された所望のプラスミド（第３図）を含む組換えコロニーは、個々のコロ ニーから制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで得られた消化ＤＮＡによって選択 された。

プラスミドｐＡＹＥ２３０をＢａｒｎＨＩで完全に消化し、生成物を１％アガロ ースゲルに通して電気泳動によって分離した。Ｈ８Ａをコードする配列を含む１ ８３２塩基対断片を電気油出によって回収した。

プラスミＦ　ｐＭＡ　９１　（Ｍｅ！ｆｏｒら、１９８３）を標準条件下Ｂｇｌ Ｕで完全に消化した。線状化されたプラスミドをフェノール／クロロホルムで抽 出し、エタノールで沈殿させた。

線状化ｐＭＡ９１とｐＡＹＥ２３０から製造されたＤＮＡ断片の等モル量を標準 条件下にリゲートした。このリゲーション混合物でＥ、ｃｏｌｊＤＨ５を形質転 換し、ＤＮＡが導入された細胞を５０　Ｉｌｇ　／　ｍｌアンピシリン含有Ｌ− ブイヨンアガール上で選択した。ｐＡＹＥ２３８と命名された所望のプラスミド （第４図）を含むコロニーは、コロニーからのＤＮＡをＰｖｕｌＩで消化して選 択した。

プラスミドｐＡＹＥ２３８を酵母ＳｘｃｃｈｘｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉＥｉ ａｅ株５１５０−２Ｂに、Ｈｔｎｎｅｎら（１９７８）の記載に従ってトランス ホームした。プラスミドｐＡＹＥ２３８が導入された細胞は、２％（ｗ／ｖ）グ ルコース、２０■／／ヒスチジン、２０■／／トリプトフアンおよび２０■／！ ウラシルを補充した最小培地上で選択した。

形質転換された５１５０−２Ｂ細胞を、２％（ｖ／ｖ）グルコース含有ＹＥＰＤ 培地１０ｍ１に移し、３０℃、２００　ｒｐｍで７２９時間インキュベートした 。細胞を含まない培養上清をＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｂａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ上 、製造業者の指示書の記載に従い、不連続性８〜２５％勾配ポリアクリルアミド ゲル電気泳動によって分析した。細胞を染色し、脱色し、５９５ｍｍ１こおける ゲル走査によって天然ＨＳＡとＨ８Ａ断片の相対量を評価した。

氾 本発明者らはまた、９７．０００ダルトンのＨｙｙｖｅｒｏｍ７ｃｅｓ　Ｉｘｃ ｊｉｓキラー株（ＯＲＦ２）毒素（Ｓｔｓｒｋ　＆　Ｂ＋ｙｄ、１９８６　；　 Ｔｅｋｎｍｍｇｘら、１９８７）の１６アミノ酸プレ領域がα因子プレプロリー ダー配列のＫＥＸ２切断部位に先行する５個のアミノ酸、すなわちアミノ酸８１ 〜８５、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（第３表）に融合させてなる 第二の融合リーダーを構築した。

第３表に記載の融合リーダーを導入したプラスミドベクターで形質転換すると、 酵母は天然のに、１ａｃｔｉｓプレプロキラ一株毒素リーダー配列またはα因子 プレプロリーダー配列のいずれかを用いた場合よりも高レベルで、培養上清中に 成熟Ｈ８Ａを分泌した。Ｎ＝末端配列の解析により、成熟Ｈ８Ａは正しいＮ−末 端アミノ酸組成をもつことが明らかである。

Ｋ、１ａｃｔｉｓキラ一株／α因子融合リーダー配列によるα因子リーダーの置 換により、培養上清中に認められる４５ｋｄ断片のレベルの６分の１−への低下 を生じた。

すなわち、これは、夾雑するポリペプチドの低下という点で有意な改良を提供す るものであり、したがって酵母培養上清からの成熟ＨＳ　Ａの精製の助けになる 。

いて酵母Ｈ８Ａ分泌ベクターを生成させるために使用した実験操作は、オリゴヌ クレオチド二重鎖（ｎ）の代わりに自動化Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢＪｏｓｙｓｔ！ｍ ｓ　Ｉｎｃ、３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザー上で合成した（製造業者の指示に 従って）オリゴヌクレオチド二重鎖（■）を用いたほかは例１−に記載した操作 と同一であった。

オリゴヌクレオチド二重鎖■ ＧＡＴＣＣＡＴＧ　ＡＡＴ入ＴＡ　ｆｆｌ’　ＴＪＪ：　ＪＬＴＡ　Ｔ？！’　 刊Ｃ’Ｉ’Ｔ’Ｔ　ＴＴＧ　ＣＴＧ　ＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＴＡτＡτＡＡＡ　 ＡＴＧＴＡＴ　ＡＡＡ　ＡＡＣＡＡＡ　ＡＡＣＧＡＣＡＧＴ　ＡＡＧＧＴ丁ＣＡ Ａ　ＧＧＡ　ＡＧＣ’！’ＴＧ　ｌａＴ　Ａ入ＡへＱ入ＣＡＡ　ＧＴＴ　Ｃ（Ｔ 　ＴＣＧ　Ｍｅ　ＣＴ’Ａ　ＴＴＴ　’Ｉ’ＣＴ鎖■、ｍｐ１９．７から誘導さ れた１　０６７ｂｐＤＮＡ断片およびｐＥＫ２５から誘導された６８８ｂ、ｐ、 ＤＮＡ断片の等モル量を一緒にリゲートした。

リゲートされたＤＮＡでＥ、ｃｏｌｉＤＨ５を形質転換し、形質転換体を５０μ ｇ　／　０１１アンピシリンＬ−ブイヨンアガール上で選択した。ｐＡＹＥ３０ ４と命名された所望のプラスミド（第５図）を含む組換えコロニーは、個々のコ ロニーから制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで得られた消化ＤＮＡによって選 択された。

プラスミドｐＡＹＥ３０４をＢａｍＨＩで完全に消化シ、生成物を１％アガロー スゲルに通して電気泳動によって分離した。Ｈ３Ａをコードする配列を含む１８ ２３塩基対断片を電気溶出によって回収した。

プラスミドｐＭＡ　９１　（Ｍｅｌｌｏｒら、１９８３）を標準条件下Ｂｇ１ｍ で完全に消化した。線状化されたプラスミドをフェノール／クロロホルムで抽出 し、エタノールで沈殿させた。

線状化ｐＭＡ９１とｐＡＹＥ３０４から製造されたＤＮＡ断片の等モル量を標準 条件下にリゲートした。このリゲーション混合物でＥ、ｃｏｌｉＤＨ５を形質転 換し、ＤＮＡが導入された細胞を５０μｇ　／　ｍｌアンピシリン含有し一ブイ ヨンアガール上で選択した。ｐＡＹＥ３０５と命名された所望のプラスミド（第 ６図）を含むコロニーは、コロニーからのＤＮＡをＰｖｕＩ［で消化することに よって選択した。

プラスミドｐＡＹＥ３０５を酵母Ｓａｃｃｈｘｒｏｍｙｃｅ＠ｃｅｒｅｖｉｓｉ ｘｅ株５１５０−２Ｂに旧ｎｎｅｎら（１９７８）の記載に従ってトランスホー ムした。プラスミドｐＡＹＥ３０５が導入された細胞は、２％（ｖ／マ）グルコ ース、２０■／ｌヒスチジン、２０■／ｌトリプトフアンおよび２０■／Ｉウラ シルを補充した最小培地上で選択した。

形質転換された５１５０−２Ｂ細胞を、２％（ｖ／マ）グルコース含有ＹＥＰＤ 培地１０ｍ１に移し、３０℃、２００　＋ｐｍで７２時間インキュベートした。

細胞を含まない培養上清をＰｈａｒｍａ山Ｐｈａｓｔ　ＳＳ７５ｌｅ上、製造業 者の指示書の記載に従い、不連続性８〜２５％勾配ポリアクリルアミドゲル電気 泳動によって分析した。細胞を染色し、脱色し、５９５ｎｍにおけるゲル走査に よって天然Ｈ３ＡとＨ３Ａ断片の相対量を評価した。

聾ｌ ＥＰ　２８６　４２４の崩壊ベクター（Ｄｅｃａ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ）　、適当なプロモーターおよび上記例１の融合リーダーに基づくベクターを 用いて５ｃｈｉｘｏｔａｃｃｂｘ＋ｏ−ｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　（株Ｌｅａｆ 、３２　ｈ）を形質転換し、０．１Ｍクエン酸／リン酸ナトリウムでｐＨ５，６ に緩衝したＥ　ＭＭ　（Ｅｄｉｎｂｕ＋ｇｈ最小培地、Ｏｇｄｅｎ、Ｊ、Ｅ、　 ＆　Ｆａｎｌｅ＊、Ｐ。

Ａ、：　１９８６．　Ｃｕ＋＋、Ｇｅｎｅｌｉｃｓ、１０　：　５０９〜５１４ ）１０ｍｌ中３０℃で発酵させると、３日後、培養上清中に１０〜１５■／ｌの Ｈ８Ａが得られた。

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Ｈｅ！５ｉｎｋｉ、　Ｃｏｎ１．　Ｐｏｒｔｅｒ）。

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Ｂｉｏｐｂ７ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１４４．６］３−６１９゜Ｔｏｖｂｉｎ、 　Ｈ，、５ｌａｅｈｅｌｉｎ、　Ｔ、　＆　Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｊ、　（１９７９ ）、Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ。

７６、４３５０−４３５４゜ Ｖｏｇ山ｊｅｉｎ、　Ｂ、　（１９ｇ？）、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 １６０．１１５−１１８゜７０ラヌミドｐＥに１１３ −ｐＢＲ３２２ＤＮＡ ロコ　ＭＥＴ−Ｈ５Ａ　ＤＮＡ ｅｌＪｌ！艮エンＦ°ヌクレアープ各Ｔイ立。

フ０ラスミヒ゛ρＥＫ　２５ フＯラスミビ　ｐＡＹＥ　２３０ フ０う又ミド　ｐＡＹＥ　２３８ フロラスＳｌ−″　ｐＡＹＥ　３０４ フ０ラスミド＝　ｐＡＹＥ　３０５ 国際調査報告 国際調査報告　ＰＣＴ／ＧＢ　８９１００８１６Ｔｈ−ｍｗ＋　ｋｍ　＋ｗ　ｐ ＊“−°゛°”゛戸−＋ｍｓ＋ｉ＊ｇ　４１１“１”−“−°−゛−＋１ｗ　＠ ｍ＃、ゴ；７♂３゛九Ｔ”ｗ■■@ｒ” ’Ｔｈｅ　幇−−ｗｅ　Ｍ　…０−ｗ＋　ｌ１ｗ　Ｆ＋ｗ＊ｐｅｍｓ　１ｍ惰１ １ｆｆｉｎ　７＋１１’　伽ｍｒｂｔ　Ｆｗｓｐｎｓ　Ｐ１１１９Ｉ　ｎ勤−瞬 一脅−！ト参陵ｆ吋〜嘴−Ｎ−一＋−１−一格ｉ轢ｌ−晴一「情−１情−輪

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式 （ａ）【配列があります】 もしくは （ｂ）【配列があります】 で示されるアミノ酸配列、またはいずれかの配列の保存的修飾変異体。
2. （２）請求項（１）記載のアミノ酸配列がそのカルボキシル末端でポリペプチド のＮ−末端残基に連結してなる融合化合物。
3. （３）アミノ酸配列はポリペプチドに直接連結している請求項（２）記載の融合 化合物。
4. （４）ポリペプチドは天然のヒト血清アルブミンもしくは修飾ヒト血清アルブミ ンまたはいずれかの断片である請求項（３）記載の融合化合物。
5. （５）請求項（１）記載のアミノ酸配列または請求項（２）記載の融合化合物を コードするヌクレオチド配列。
6. （６）第２表または第３表に示す配列から選ばれる請求項（５）記載のヌクレオ チド配列。
7. （７）１個または複数個の適当な制御領域と請求項（５）または（６）に記載の ヌクレオチド配列からなり、ヌクレオチド配列は制御領域の制御下にあるＤＮＡ 構築体。
8. （８）請求項（７）記載のＤＮＡ構築体で形質転換された宿主。
9. （９）Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｃｉｓｉａｅまたはＳｃｈｉｚｏｓ ａｃｃｊａｒｏｍｕｃｅｓ　ｐｏｍｂｅである請求項（８）記載の宿主。
10. （１０）請求項（８）または（９）に記載の宿主を培養し、ヌクレオチド配列に よって発現されたポリペプチドまたはその修飾異型をそれから得ることを特徴と するポリペプチドの製造方法。
11. （１１）請求項（１０）記載の方法によって製造されたポリペプチド。
12. （１２）請求項（１０）記載の方法によって製造されたヒト血清アルブミンまた はその変異体。