KR20010034305A - 효모에서 원하는 폴리펩티드를 만드는 방법 - Google Patents

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KR20010034305A
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Abstract

본 발명은 효모에서 원하는 폴리펩티드를 만들기 위한 방법을 설명한다. 원하는 산물은 일염기성 프로세싱 부위에 의하여 연결된 리더 결합된 폴리펩티드로서 발현된다. 원하는 폴리펩티드는 효소적인 절단에 의하여 생체내에서 또는 생체외에서 리더로부터 절단된다.

Description

효모에서 원하는 폴리펩티드를 만드는 방법{PROCESS FOR MAKING DESIRED POLYPEPTIDES IN YEAST}
효모 유기체는 세포내에서 합성되지만 세포밖에서 기능하는 많은 단백질을 생산한다. 이러한 세포외 단백질은 분비되는 단백질(secreted proteins)이라고 불린다. 처음에 분비되는 단백질은, 소포체(ER)의 막을 가로질러 (세포의 분비 경로안으로) 발현 산물의 효과적인 방향을 보증하는 전(pre)-펩티드 서열을 가진 전구체 또는 전-단백질의 형태로 세포안에서 발현된다. 보통 신호 펩티드라고 불리는 전-서열은 일반적으로 이동하는 동안 원하는 산물로부터 절단되어 떨어진다. 일단 단백질이 분비 경로로 들어가면, 그 단백질은 골지체로 수송된다. 골지체로부터 단백질은 원형질막, 리소좀 및 분비 소낭으로 분배된다.
효모에 비상동적인 단백질을 효모에서 발현시키고 분비시키기 위하여 몇몇 접근방법이 제안되어 왔다. 유럽의 공개된 특허출원 No. 116201은, 형질전환된 유기체의 배양을 제조하고, 그 배양을 증대시켜 배양배지로부터 단백질을 회수하면서, 원하는 단백질, 리더(leader) 서열 및 프로세싱 신호를 암호화하는 DNA를 품은 발현 매개물(vehicle)에 의해 형질전환된 효모 숙주에 의하여 효모에 비상동적인 단백질이 발현되고 프로세싱되어 분비되는 방법을 설명하는데, 이 때 리더 서열은 효모 α-인자 리더 서열이다.
Saccharomyces cerevisiae MFα1(α-인자)는, (LysArg((Asp/Glu)Ala)2-3α-인자)4로 이어지는 3개의 N-연결된 글리코실화 부위(N-linked glycosylation sites)를 에워싸는, 64개 아미노산의 "리더" 또는 프로펩티드로 이어지는 19개 아미노산의 신호 또는 전펩티드를 포함하는 165개 아미노산의 전-프로(pre-pro) 형태로서 합성된다(Clements 등, Gene, 106, 1991, pp. 267-272). 이 공개는 KEX2 프로세싱을 개선시킬 목적을 가진 KEX2 부위의 일정한 변형을 설명한다.
전-프로 MFα1의 신호-리더 부분은, S. cerevisiae안에서 비상동적인 단백질을 합성하고 분비하는 것을 달성하기 위하여 널리 사용되어 왔다.
유럽의 공개된 특허출원 No. 301 669는, 리더-서열, 특히 α-인자 리더가 효모에서 발현된 비상동적인 폴리펩티드의 분비를 지휘한다는 것을 설명한다. EP 324 274는, 글리코실화된 α-인자 리더 서열을 절단함에 의한 비상동적인 폴리펩티드의 발현과 분비의 효율에 있어서의 개선을 개시한다.
분비되는 폴리펩티드는, 두개의 연속적인 염기성 아미노산 잔기의 카르복시 말단에서 펩티드 결합을 쪼개는 단백분해적 프로세싱 체계에 노출되도록 수송된다. 이러한 효소 활성은 S. cerevisiae안에서 KEX2 유전자에 의하여 암호화된다(Julius, D.A. 등, GENE, 37, 1884b, pp. 1075). KEX2가 S. cerevisiae 교배 인자(mating factor) a의 분비에는 관련되지 않는 반면, KEX2 프로테아제에 의한 산물의 프로세싱은 활성이 있는 S. cerevisiae 교배 인자 α1 (MFα1 또는 α-인자)의 분비를 위해서 필수적이다.
WO 90/10075와 WO 95/35384는 KEX2 부위주위에서의 변형을 설명한다. 게다가, WO 95/34666, WO 92/11378 및 WO 90/13653은, KEX2의 사용이 비실용적인 상황에서 FXa라고 명명된 아미노산 Ile-Glu-Gly-Arg으로 구성되는 2차적인 프로세싱 부위를 사용하는 선택을 설명한다.
Applied Microbiological Biotechnology 35 (1991) 771-776에서 Seeboth 등은, 효모안의 α-리더 결합된 폴리펩티드가 생체외에서의 가용성의 KEX2에 의하여 프로세싱되는 기전을 설명하는데, 이 KEX2는 KEX2 유전자를 변형시킴으로써 가용성으로 만들어졌고, 그것에 의하여 생체외에서의 부위-특이적 프로세싱을 증가시키는 방법을 보여준다. GENE, 170 (1996) 107-112에서 Kjeldsen 등은, 이염기성 KEX2 부위 다음에 이어지는 스페이서 펩티드를 삽입하는 것이, 폴리펩티드 전구체의 N-말단의 신장을 만들어내서 KEX2 프로세싱을 매우 용이하게 하고 이어서 폴리펩티드 전구체의 생산량을 개선시킨다는 것을 설명한다.
상기에 설명된 방법에서 인정된 문제점은 분비의 수준이 매우 낮을 수 있을 것이라는 점과 단백분해적 프로세싱이 부정확하거나 불완전해서 원하는 산물의 생산량이 더 낮아질 수 있을 것이라는 점이다.
본 발명의 목적은 높은 생산량의 원하는 폴리펩티드를 보증하는 효모 발현 방법을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 KEX2 프로세싱 부위를 포함하지 않는 리더 결합된 폴리펩티드의 발현과 분비에 의하여 효모에서 원하는 폴리펩티드를 만들기 위한 방법에 관한 것이다. 리더 결합된 폴리펩티드는 본래의 α-인자 리더 펩티드와, 일염기성 프로세싱 부위와 아마도 스페이서 펩티드에 의하여 연결된 원하는 폴리펩티드를 포함한다.
보다 명확하게 말하면, 본 발명은 다음의 식을 가진 서열을 발현할 수있는 발현 벡터를 가지는 효모 균주를 적당한 배양 배지에서 배양함으로써 효모에서 원하는 폴리펩티드를 만드는 방법에 관련된다:
SP-LP-Xn-PS-*폴리펩티드*
상기 식에서,
SP는 신호 펩티드이고;
LP는 본래의 α-인자 리더 펩티드이거나 본래의 α-인자 리더 펩티드에 적어도 85% 상동물인 리더 펩티드이고;
PS는 일염기성 프로세싱 부위 Lys 또는 Arg이고;
X는 n개의 아미노산을 가진 스페이서 펩티드이고;
n은 0 또는 1에서 10까지의 정수이다; 그리고
*폴리펩티드*는 원하는 폴리펩티드이고;
단, 스페이서 펩티드 X는 Ile-Glu-Gly, Leu-Pro, Lys-Lys-Leu-Ile-Asp, Ile-Asp 또는 Pro-Gly-Asp-Pro가 아니고, 스페이서 펩티드 X가 KEX2 절단부위를 포함하지 않거나 PS 또는 LP와 함께 KEX2 절단부위를 구성하고, n이 0일 때는 리더 펩티드의 C-말단은 Lys, Arg, Ile-Glu-Gly, Leu-Pro, Lys-Lys-leu-Ile-Asp, Ile-Asp 또는 Pro-Gly-Asp-Pro가 아니고, 이때, 리더 결합된 폴리펩티드가 프로세싱 부위 PS에서 절단되어 떨어지는데, 이것은 세포막을 통과하여 지나는 동안 생체내에서 일어나거나 또는 배양 배지안으로의 분비후 생체외에서 일어나서 원하는 폴리펩티드가 분리된다.
본 발명은 또한 상기의 리더 결합된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열, 그런 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터 및 그런 벡터로 형질전환된 효모 균주에 관한 것이기도 하다.
본 발명은 일염기성 프로테아제 프로세싱 부위를 포함하는 융합 폴리펩티드를 발현함으로써 효모에서 원하는 폴리펩티드를 만들기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 설명되는데:
도 1은 효모 발현 플라스미드 pMT742의 도식적인 설명이다. 이 플라스미드는 MFα1전-프로-(1-85)-MI3의 발현을 위한 유전자를 포함한다.
다음의 기호가 이용된다:
Sc TPI 프로모터: Saccharomyces cerevisiae (Sc)로부터의 트리오스 포스페이트 이소머라제(TPI) 유전자 프로모터 서열.
Sc TPI term.: Sc로부터의 TPI 유전자 종료암호(terminator) 서열.
POT 유전자: Schizosaccharomyces Pombe로부터의 TPI 유전자.
POT: S.Pombe로부터의 TPI를 암호화하는 서열.
E. coli 플라스미드: 플라스미드 pBR322와 pUC13로부터 유도된 서열.복제개시점
AMP-R: β-락타마제를 암호화하는 서열(암피실린 저항성 마커).
효모 2μ 플라스미드: 복제개시점을 포함하는 Sc 2μ 플라스미드로부터의 서열.
본 발명에서 사용되는 리더 펩티드(LP)는 바람직하게는 본래의 α-인자 리더 펩티드인데, 이것은 MFα1(1-83)(SEQ ID NO:1)의 프로펩티드이다. MFα1(1-83)에서, 잔기 1-19는 이른바 전 서열 또는 신호 펩티드를 형성하고 잔기 20-83은 이른바 프로 서열 또는 리더 펩티드를 형성한다.
본래의 α-인자 리더 펩티드는 소수의 아미노산 잔기가 삭제되거나 다른 아미노산 잔기로 치환되는 잘 알려진 기술에 의하여 약간 변형될 수 있을 것이다. 그렇게 리더는 C 말단의 끝에서 변형될 수 있을 것인데, 이 말단의 끝에서 2에서 5개의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 치환되어 프로세싱 부위 PS에서의 프로세싱을 개선시킬 수 있을 것이다. 바람직하게는, 변형된 리더 서열은 아미노산 조성에 근거하여 85%가 넘게 본래의 α-인자 리더 펩티드에 대해 상동일 것이고, 더욱 바람직하게는 90%가 넘게 본래의 α-인자 리더 펩티드에 대해 상동일 것이다.
바람직한 구체예에서, α-인자 리더 펩티드의 C-말단의 끝에 있는 마지막 두개의 아미노산 잔기는 Met-Ala로 치환된다.
본 발명에서 사용되는 신호 펩티드는, 분비 경로로 들어갈 때 발현된 폴리펩티드의 안전하고 효과적인 안내를 보증하는 어떠한 펩티드라도 해당될 수 있다. "신호 펩티드"라는 용어는, 신호 펩티드가 이동하는 동안 절단되어 떨어지는 소포체의 막을 가로질러 발현된 단백질을 안전하게 지휘하는 기능을 하는 전-펩티드 서열로서 이해되어야 한다. 신호 펩티드는 효모에 상동적일 수도 있을 것이나, 효모에 비상동적일 수도 있을 것이다. 그것은 자연 발생적인 신호서열이거나 합성 신호서열일 수 있을 것이다. 신호 펩티드는 리더 서열의 N-말단에 위치하고 자연에서는 우세하게는 소수성이다. 바람직하게는 SP는 α-인자 신호 펩티드를 암호화하는 DNA 서열이다. 적당한 다른 신호 펩티드는 효모 아스파틱(aspartic) 프로테아제 3 신호 펩티드, 마우스 타액 아밀라제 신호 펩티드, 카르복시펩티다제 신호 펩티드 및 효모 BAR1 신호 펩티드이다.
본 발명에 따르면, 프로세싱 부위 PS에서의 리더 결합 폴리펩티드의 절단은 일염기성 프로세싱 부위(Lys, Arg)에 특이적인 프로테아제에 의하여 행해진다. 그런 프로테아제의 예는 트립신, Achromobacter lyticus 프로테아제 I, 엔테로키나제, 및, Fusarium oxysporum 트립신-유사 프로테아제이다. 바람직한 프로테아제는 효모 아스파틸 프로테아제 3(YAP3)이다.
리더 펩티드로부터 리더 결합된 폴리펩티드의 절단은 리더 결합된 폴리펩티드의 분비후에 생체외에서 수행될 수 있을 것이다. 그 절단은 적당한 프로테아제를 배양 배지에 첨가하고 이어서 원하는 폴리펩티드를 분리함으로써 수행될 수 있을 것이다. 다른 방도로서, 리더 결합된 폴리펩티드는 배양 배지로부터 분리되고 분리 후에 절단될 수 있을 것이다.
양자택일적으로, 절단은 일염기성 프로테아제 부위 PS에 특이적인 프로테아제의 공동-발현에 의하여 생체내에서 일어난다.
원하는 폴리펩티드는, 효모세포에서 발현될 수 있는 어떤 폴리펩티드라도 가능할 것이고, 아프로티닌, 조직 인자 경로 억제자 또는 다른 프로테아제 억제자, 인슐린-유사 성장 인자 I 또는 II, 인간이나 소의 성장 호르몬, 인터루킨, 조직 플라스미노겐 활성체, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드-1, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 XIII, 혈소판-유도된 성장 인자 및 공업 효소, 및 그것들의 모든 기능적인 유사체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있을 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린과 인슐린 유사체의 전구체, 인슐린 유사 성장 인자, 또는 그것들의 기능적인 유사체가다.
폴리펩티드는 또한 프로글루카곤 패밀리의 보다 작은 인간 펩티드일 수도 있을 것인데, 예를 들어 GLP-1(7-37)과 GLP-1(7-36)과 같은 절단된 형태를 포함하여 글루카곤 GLP-1, GLP-2 및 GRPP, 또는 GLP1*과 같은 그것들의 기능적인 유사체가다.
"기능적인 유사체"이라는 용어는 본래의 폴리펩티드에 기능적으로 등가이지만 본래의 폴리펩티드에 비해서 변형을 가진 폴리펩티드를 가리킨다.
기능적인 유사체는, 하나이상의 아미노산이 삭제, 절단, 치환 또는 삽입됨으로써 본래의 폴리펩티드와 다를 수 있을 것이다. 아미노산은 서열내에서, 또는 C-말단의 끝에서, 또는 N-말단의 끝에서, 또는 둘 모두에서, 또는 상기 모든 부위에서 삭제, 절단, 치환 또는 삽입될 수 있을 것이다.
인슐린 전구체의 예는 구조 B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)를 가진 MI3인데, 이 구조에서 B(1-29)는 위치 B(30)에 아미노산 잔기가 없는 인간 인슐린의 B 사슬이고 A(1-21)은 인간 인슐린의 A 사슬이다.
스페이서 펩티드 X의 기능은 프로세싱 부위 PS에서 원하는 폴리펩티드로부터 리더를 절단하는 것을 최적화하는 것이다. 리더 펩티드(LP)도 스페이서 펩티드(X)도 KEX2 프로세싱을 포함하지 않는 것이 중요하다. 이론에 의해 결합되지 않고도, 리더 펩티드 또는 스페이서 펩티드에서의 KEX2 부위의 존재는 분비 경로에서의 미숙한 절단 때문에 분비되는 산물의 생산량을 감소시키리라 믿어진다.
스페이서 서열 X는, 그것이 KEX2 부위를 포함하지 않거나 일염기성 프로세싱 부위 PS 또는 리더 펩티드 LP와 함께 KEX2 부위를 형성하는 한, 10개까지의 아미노산 잔기(n=10)를 가진 어떤 폴리펩티드 서열이라도 가능할 것이다. X는 바람직하게는 7개(n=7)의 아미노산 잔기를 포함하고 더욱 바람직하게는 2개(n=2)의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, X는 Lys-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala 또는 Lys-Glu이다.
또하나의 바람직한 구체예에서, n은 0으로 리더(LP)와 일염기성 프로세싱 부위(PS)사이에 스페이서 서열이 없다는 것을 의미한다. 그 경우에, 리더 펩티드의 C 말단의 끝은 KEX2 부위 또는 KEX2 유사 부위를 구성하지 않아야 하고, C-말단의 아미노산 잔기가 PS와 함께 KEX2 부위를 형성하지 않아야 한다.
본 방법에서 사용되는 효모 세포는 Saccharomyces uvae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccahromyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp. 및 Geotrichum fermentans로 구성된 군으로부터 선택될 수 있을 것이다. 바람직한 효모 균주는 Saccharomyces cerevisiae이다.
효모 세포는 일염기성 프로세싱 부위에 특이적인 프로테아제를 암호화하는 유전자로 형질전환됨으로써 프로테아제와 원하는 폴리펩티드의 공동-발현을 얻을 수 있을 것이다.
본 발명에 따라서, 당 업계의 기술내에서 전통적인 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있을 것이다. 그러한 기술은 문헌에서 완전히 설명된다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch ＆ Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York을 참고하라. DNA 구성체는, 확립된 표준적인 방법, 예를 들어 S.L. Beaucage와 M.H.Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869에 의하여 설명된 포스포아미디트 방법 또는 Matthes 등, EMBO Journal 3, 1984, pp. 801-805에 의하여 설명된 방법에 의하여 합성적으로 제조될 수 있을 것이다. 포스포아미디트 방법에 따라, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되고, 듀플렉스로 되고, 결찰되어 합성 DNA 구성체를 형성한다. DNA 구성체를 제조하는 일반적으로 바람직한 방법은, 예를 들어 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989에서 설명된 대로의 폴리머라제 연쇄반응(PCR)에 의한 것이다.
선형 또는 원형일 수 있을 발현 벡터는, 전사에 대비하는 추가적인 절편(segments)에 실시가능하게 연결된 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 포함 할 것이다. 그런 추가적인 절편에는 프로모터 및 종료암호 서열, 그리고 선택적으로 하나이상의 복제개시점, 하나이상의 선택가능한 마커(selectable marker), 인핸서(enhancer), 폴리아데닐화 신호 등이 포함될 수 있을 것이다.
적당한 효모 프로모터는 MFα1 프로모터, GAL1, GAL7 및 GAL10 프로모터와 같은 갈락토스 유도할 수 있는 프로모터, TPI와 PGK 프로모터를 포함하는 해당과정의 효소 프로모터, TRP1 프로모터, CYC1 프로모터, CUP1 프로모터, PHO5 프로모터, ADH1 프로모터 및 HSP 프로모터이다. 효모 숙주 세포를 위한 다른 유용한 프로모터는 Romanos 등, 1992, Yeast 8:423-488에 의하여 설명된다.
발현 벡터는 또한 전형적으로, 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 3' 말단에 실시가능하게 연결된 종료암호를 포함할 것이다. 효모 세포안에서 기능적인 어떤 종료암호라도 본 발명에서 사용될 수 있을 것이다. 바람직한 종료암호는 Saccharomyces cerevisiae 에놀라제, Saccharomyces cerevisiae 시토크롬 C(CYC1), 또는 Saccharomyces cerevisiae 글리세랄데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 트리오스포스페이트 이소머라제 및 교배 인자 MFα1을 암호화하는 유전자로부터 유도될 것이거나, S. kluyveri 해당과정의 유전자 및 호흡의 유전자로부터 유도될 것이다. 효모 숙주 세포를 위한 다른 유용한 종료암호는 상기의 Romanos 등, 1992에 의하여 설명된다.
벡터는 바람직하게는 형질전환된 세포의 용이한 선택을 가능하게 하는 하나이상의 선택가능한 마커를 포함할 것이다. 선택가능한 마커는 그 산물이 살균제 (biocide) 또는 바이러스 저항성, 중금속에 대한 저항성, 영양요구체에 대한 원영양성 등을 제공하는 유전자이다. 효모 숙주 세포를 위한 적당한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, URA3, TPI1, PGK 및 KANE.c.유전자에 의한 제네티신 G418R이다.
자율적인 복제를 위하여, 벡터는, 벡터가 효모 숙주안에서 자율적으로 복제할 수 있도록 해주는 복제개시점을 추가로 포함할 것이다. 효모 숙주 세포안에서의 사용을 위한 복제개시점의 예는 2 마이크론 복제개시점, CEN6과 ARS4의 조합, 및 CEN3과 ARS1의 조합이다. 복제개시점은 숙주 세포안에서 그 작용을 온도-민감성으로 만드는 돌연변이를 가진 것일 수 있을 것이다(Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433 참고).
바람직한 효모 발현 벡터는, Schizosaccharomyces pombe 트리오스 포스페이트 이소머라제(POT) 유전자의 존재를 특징으로 하는 플라스미드이다. POT 유전자는 형질전환체의 선택을 위하여 이용되고, 트리오스 포스페이트 이소머라제(TPI) 음성인 Saccharomyces cerevisiae 균주안에 플라스미드가 존재하는 것을 또한 보증할 것이다.
본 발명의 재조합 발현 벡터를 구성하는 상기에 설명된 요소들을 결찰하기 위해 사용되는 절차는 당업계에서 숙련된 사람에게 잘 알려져 있다(상기의 Sambrook 등, 1989을 참고).
효모 스프레인은 Becker와 Guarante, In Abelson, J.N.과 Simon, M.I., 편집자, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito 등, 1983, Journal of Bacteriology 153:163; 및 Hinnen 등, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920에 의하여 설명된 절차를 이용하여 형질전환될 수 있을 것이다.
그리고나서 형질전환된 효모 숙주 세포는, 원하는 산물의 발현과 분비를 가능하게 하기 위하여 본원에서 개시된 가르타액의 관점에서 당업계에서 숙련된 사람에서 알려진 충분한 시간동안 및 적당한 조건하에서 배양된다.
산물을 당업계내에서 잘 알려진 방법에 의하여 분리하고 정제한다. 분비되고 정제된 산물이 인슐린 전구체와 같이 활성이 있는 폴리펩티드를 위한 전구체라면, 그 전구체는 효소적인 변환과 같은 기지의 방법에 의하여 활성이 있는 폴리펩티드로 변환된다.
명세서와 청구항에 걸쳐서, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature에 의하여 승인된(1974) 법칙에 따라 아미노산을 위한 1문자 또는 3문자 코드가 사용되는데, Collected Tentative Rules ＆ Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2nded., Maryland, 1975를 참고하라.
본 발명은 다음의 실시예들에 의하여 추가적으로 예시된다.
실시예 1:
S. cerevisiae안에서의 리더/산물 융합의 클로닝과 발생
본 연구에서, 에피솜적으로 유도된 POT 형태(Thim 등, PNAS 83, 1986, pp. 6766-6770; Kjeldsen 등, Gene 170, 1996, pp.107-112; PCT No. 95/00250과 PCT No. 97/00298)의 효모 발현 플라스미드를 사용하였다.
도 1은 pMT742라고 불리는 효모 플라스미드의 예를 보여준다(Egel-Mitani 등, Gene, 73, 1988, pp.113-120). 그 플라스미드는, S. cerevisiae TPI 유전자의 전사-프로모터와 전사-종료암호사이에서 플라스미드안으로 삽입된 EcoRI-XbaI 단편으로 이루어지는 발현 카세트를 포함한다.
플라스미드 pMT742에서, EcoRI-XbaI 단편은, MFα1 전-프로 리더, 이염기성 프로세싱 엔도펩티다제 KEX2를 위한 Lys-Arg 절단부위, 및 단일-사슬의 소-인슐린 (mini-insulin) 전구체 MI3으로 조성된 융합 산물을 암호화한다.
다양한 리더/산물 융합(표 1 참고)을 암호화하는 플라스미드를 구성하기 위하여, PCR 또는 오버랩 PCR 기술에 의하여, 적당한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 EcoRI과 XbaI 부위사이에 변형을 도입하였고, 이어서 PCT 특허출원 no. 95/00250에서 윤곽이 잡혀있는 대로 표준적인 방법(예를 들어, Sambrook, Fritsch, E.F.과 Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989)을 이용하여 분리하고 클로닝하였다.
표 1은 리더-산물 융합의 다른 플라스미드 구성체들을 보여준다
표 1에서, MFα1(1-83)은 S. cerevisiae로부터의 교배 인자 알파1 전구체의 리더 펩티드를 구성하는 처음 83개의 아미노산이다. 잔기 1-19는 이른바 전-서열(신호 펩티드)을 형성하고, 잔기 20-83은 이른바 프로-서열(리더 펩티드)을 형성한다.
MFα1(1-83)(SEQ ID NO:1)은 아미노산 서열: Met-Arg-Phe-Pro-Ser-Ile-Phe-Thr-Ala-Val-Leu-Phe-Ala-Ala-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala-Ala-Pro-Val-Asn-Thr-Thr-Thr-Glu-Asp-Glu-Thr-Ala-Gln-Ile-Pro-Ala-Glu-Ala-Val-Ile-Gly-Tyr-Ser-Asp-Leu-Glu-Gly-Asp-Phe-Asp-Val-Ala-Val-Leu-Pro-Phe-Ser-Asn-Ser-Thr-Asn-Asn-Gly-Leu-Leu-Phe-Ile-Asn-Thr-Thr-Ile-Ala-Ser-Ile-Ala-Ala-Lys-Glu-Glu-Gly-Val-Ser-Leu-Asp을 가진다.
MFα1(1-81)MA는 마지막 두개의 잔기 (Leu-Asp)가 Met-Ala에 의해 치환된 MFα1(1-83)이다.
MI3은 아미노산 잔기 No. 30(B30)이 없고 인간 인슐린의 B29-Lys과 A1-Gly을 연결하는 Ala-Ala-Lys 다리를 가지는 인간의 인슐린 전구체이다.
MI3(SEQ ID NO:2)은 아미노산 서열: Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-Ala-Lys-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn을 가진다.
GLP1*은 추가적인 C-말단의 리신 잔기을 가지고 위치 26과 34에 있는 리신이 아르기닌으로 치환된 인간의 글루카곤-유사 펩티드 GLP-1(7-37)이다.
GLP1*(SEQ ID NO:3)은 아미노산 서열: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Lys을 가진다.
진정한(authentic) YAP3, 또는 C-말단 절단된 YAP3 상응부분(counterpart) YAP3△18을 공동-발현하는 플라스미드의 구성을 위하여, 특정한 DNA 구성체를 포함하는 DNA 단편을 POT 유전자의 3' 끝에 있는 SalI 부위안으로 삽입하였다(도 1 참고).
진정한 YAP3 유전자는 pME768(Egel-Mitani 등, Yeast, 6, 1990, pp. 127-137)로부터 유도되었고, 0.6 kb의 전사-프로모터 서열과 0.3 kb의 전사-종료암호 서열을 둘러싼다.
YAP3△18유전자 구성체는, YAP3 코딩 영역이 C-말단의 암호화부분에서 절단된 pME927로부터 유도되었다(Egel-Mitani 등, op.cit.). 그 절단은 마지막 18개의 코돈을 삭제시키는데, 그 코돈은 두개의 추가적인 아미노산 코돈(Pro-Ile), 및 UAG 번역-종결 신호에 의하여 대체된다. YAP3 유전자 구성체와 유사하게, YAP3△18유전자 구성체는 진정한 0.6 kb YAP3 유전자 전사-프로모터 서열을 포함하지만 MFα1 유전자로부터 유도된 0.3 kb 전사-종료암호 서열을 운반한다.
발현 벡터를, 표준적인 방법(Sambrook 등, 1989, op.cit.)을 이용하여 E.coli안에서 증식시켰고 암피실린의 존재하에서 배양하였고 분리하였다. 플라스미드 DNA는 적당한 제한엔도뉴클레아제(EcoRI, XbaI 및 SalI)에 의해 삽입물(insert)에 대하여 확인되었고, 서열 분석에 의하여 타당한 리더/산물 융합 구성체를 암호화한다고 보여졌다.
플라스미드 DNA는, PCT 출원 No.95/00250과 97/00298 각각에서 설명된 대로의 S.cerevisiae 균주 MT663 (MATa/MATαpep4-3/pep4-3 HIS4/his4 △tpi::LEU2/△tpi::LEU2) 또는 ME1487 (MATα △yap3::URA3pep4-3 △tpi::LEU leu2 △ura3)안으로 형질전환되었다.
효모 형질전환체는 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코스) 한천(2%) 배지상에서 탄소원으로서의 글루코스 이용에 의하여 선택되었다.
ALP 분해와 HPLC에 의한 분비되는 산물의 정량
형질전환체를 5ml의 YPD 액체 배지안에서 30℃로 3일간 200 rpm으로 흔들어주면서 배양하였다. 2500rpm으로 원심분리한 후에 배양 상청액을 수집하였고, 다음의 방법으로 분비되는 산물을 분석하였다.
각각의 배양에 대하여, 630㎕의 상청액의 표본(A)을 70㎕의 1M Tris 완충용액, pH 8.75과 혼합하였고, 100㎕/ml의 Lys-Xaa 특이적인 Achromobacter lyticus 프로테아제 I(ALP)를 공급하였다.
630㎕의 상청액의 또하나의 표본(B)를 70㎕의 1M Tris 완충용액, pH 8.75과 혼합하였고, ALP는 공급하지 않았다. 두 표본 모두를 37℃에서 2시간동안 인큐베이션하였고, 그 다음에 HPLC에 의하여 분석하였다.
B-표본(ALP 없슴)을 분석함으로써, 부착된 리더가 없는 분비되고 프로세싱된 산물 폴리펩티드(표 2에서의 MI3과 표 3에서의 GLP-1*)의 생산량을 정량할 수 있을 것이다.
ALP-분해된 A-표본를 분석함으로써, 분비되고 프로세싱되지 않은 프로-전 리더/산물 융합(표 2에서의 L-MI3과 표 3에서의 L-GLP-1*)의 생산량을 측정할 수 있을 것이다. ALP는 B29 및 연결하는 Ala-Ala-Lys 다리에 있는 내부의 리신-잔기에서 절단한다. ALP는, 만약 존재한다면, 리더와 MI3을 분리하는 리신-잔기에서 프로세싱되지 않은 리더/MI3 융합을 더욱 절단한다. 그러므로, 프로세싱된 MI3과 프로세싱되지 않은 MI3의 총 생산량을 A-표본안에 있는 desB30 인슐린의 양으로서 측정할 수 있다. 프로세싱되지 않은(리더-결합된) MI3의 생산량은, ALP 프로세싱된 산물의 총 생산량으로부터 리더-없는 산물의 생산량(B-표본으로부터 얻음)을 공제함으로써 간접적으로 측정될 수 있다.
분비되는 리더-결합된 폴리펩티드의 생산량은 표본의 HPLC 분석에 의하여 정량될 수 없을 것이다. 이것은 프로-리더 부분의 글리코실화(초글리코실화 (hyperglycosylation))의 양이 많기 때문이었다.
그러나, MI3-관련된 산물의 기준(reference)-플라스미드, pMT742의 경우에, A-표본안에 있는 프로세싱되지 않은 프로 리더/MI3 융합의 생산량은, B-사슬에 추가적인 N-말단의 아르기닌을 가지는 desB30("B0Arg-desB30")의 양을 정량함으로써 직접적으로 측정되었다. B0Arg-desB30 인슐린은 프로세싱되지 않은 KEX2 프로세싱 부위에 있는 Lys과 Arg사이의 절단으로부터 생긴다.
표 2는 MT663안에서 MI3 관련된 플라스미드 구성체를 이용하여 얻어지는 상대적인 생산량을 보여준다. 효모 균주 MT663은 WO92/11378의 제출과 관련하여 Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen에 기탁되었고 기탁번호 DSM 6278을 받았다. 이 특정한 효모 균주는 플라스미드 구성체의 발현과 그 다음의 폴리펩티드의 분비에 있어서 매우 적당하고 성공적인 것으로 입증되어왔다.
발효 생산량은 pMT742를 이용하여 얻어지는 MI3의 생산량에 상대적이다. MI3의 생산량은 미처리의 상청액안의 MI3을 측정함으로써 측정되었다. 총생산량은, pMT742로부터의 상청액에 ALP 처리하여 얻어진 desB30 인슐린의 생산량에 상대적인, ALP로 처리된 상청액안의 desB30 인슐린의 생산량으로서 측정되었다.
a: pMT742의 경우에, L-MI3은, pMT742로부터의 상청액에 ALP 처리하여 얻어진 desB30 인슐린의 생산량에 상대적인 B0(Arg)-desB30 인슐린으로서 측정되었고, 총 생산량은 이러한 수들의 합으로서 계산되었다.
표 2에서의 결과는, 본 발명에 따른 절단 부위를 가지는 구성체와 함께 공동-발현되는 프로테아제(즉, pJB162, pJB160 및 pIM172)를 처리하지 않는 것이 pMT742보다 더 많은 MI3-관련된 산물을 생산한다는 것을 보여준다(즉, 각각 165%, 125% 및 150%). 게다가, 리더 결합된 MI3은 (리더 결합된 Arg-desB30를 제외하고는) ALP 분해에 의하여 desB30 인슐린으로 변환될 수 있기 때문에, 인간 인슐린의 생산을 위하여 사용될 준비가 된 desB30 인슐린의 생산량은 pMT742 구성체보다 이 구성체들에 대하여 훨씬 더 높다(290%, 220% 및 265%). 이것은 표 2에서 묘사된 여타의 구성체들에 대해서도 사실이다(즉, "총계" = desB30 양).
게다가, YAP3△18을 공동-발현하는 pIM37과 pIM256 둘 모두가 pMT742보다 더 많은 생체내에서 프로세싱된 MI3을 생산한다(각각 140%와 170%). MI3은 정제를 위하여 쉽게 사용되지만, 초글리코실화된 프로세싱되지 않은 프로-리더/MI3 융합 산물은 정제를 위하여 쉽게 사용되지 않는다.
발효 생산량은 pKT231를 이용하여 얻어지는 GLP-1*의 생산량에 상대적이다. GLP-1*의 생산량은 미처리의 상청액안의 GLP-1*을 측정함으로써 측정되었다. (프로-) 리더 결합된 GLP1-1*(L-GLP1-1*)의 생산량은, ALP 처리된 상청액안에서의 GLP-1*의 생산량으로부터 미처리된 상청액안에서의 GLP-1*의 생산량을 공제함으로써 계산되었다.
GLP1*-관련된 산물의 기준-플라스미드, pKV231의 경우에, 추가적인 N-말단의 아르기닌을 가지는 GLP1*은 ALP-분해된 A-표본안에서 탐지될 수 없기 때문에 프로세싱되지 않은 프로리더/GLP1*융합은 존재하지 않았다(표 3). pKV248의 예에서는, GLP-1*의 양은 ALP-분해된 A-표본안에서 pKV231을 이용하여 얻어지는 GLP-1*양의 375%인 것으로 밝혀진 반면, 어떤 프로세싱되지 않은 GLP1*도 B-표본안에서 탐지되지 않았다.
＜110＞ NOVO NORDISK A/S
＜120＞ PROCESS FOR MAKING DESIRED POLYPEPTIDES IN YEAST
＜150＞ DK0098/98
＜151＞ 1998-01-23
＜150＞ US60/076,882
＜151＞ 1998-03-05
＜160＞ 3
＜170＞ KopatentIn 1.55
＜210＞ 1
＜211＞ 83
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 1
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Asp
＜210＞ 2
＜211＞ 53
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys
20 25 30
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
35 40 45
Glu Asn Tyr Cys Asn
50
＜210＞ 3
＜211＞ 32
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 3
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Lys
20 25 30

Claims (10)

  1. 적당한 배양 배지에서 다음의 식을 가진 서열을 발현할 수있는 발현 벡터를 함유하는 효모 균주를 배양함으로써, 효모에서 원하는 폴리펩티드를 만드는 방법으로서:
    SP-LP-Xn-PS-*폴리펩티드*
    상기 식에서
    SP는 신호 펩티드이고;
    LP는 본래의 α-인자 리더 펩티드이거나 본래의 α-인자 리더 펩티드에 적어도 85% 상동물인 리더 펩티드이고;
    PS는 일염기성 프로세싱 부위 Lys 또는 Arg이고;
    X는 n개의 아미노산을 가진 스페이서 펩티드이고;
    n은 0 또는 1에서 10까지의 정수이고;
    *폴리펩티드*는 원하는 폴리펩티드이고;
    단, 스페이서 펩티드 X는 Ile-Glu-Gly, Leu-Pro, Lys-Lys-Leu-Ile-Asp, Ile-Asp 또는 Pro-Gly-Asp-Pro가 아니고, 스페이서 펩티드 X가 KEX2 절단부위를 포함하지 않거나 PS 또는 LP와 함께 KEX2 절단부위를 구성하고, n이 0일 때는 리더 펩티드의 C-말단은 Lys, Arg, Ile-Glu-Gly, Leu-Pro, Lys-Lys-leu-Ile-Asp, Ile-Asp 또는 Pro-Gly-Asp-Pro가 아니고, 이때, 리더 결합된 원하는 폴리펩티드가 프로세싱 부위 PS에서 절단되어 떨어지는데, 이것은 세포막을 통과하여 지나는 동안 생체내에서 일어나거나 또는 배양 배지안으로의 분비후 생체외에서 일어나서 원하는 폴리펩티드가 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, SP가 효모에 상동인 신호 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, SP가 α-인자 신호 펩티드, 효모 아스파틱 프로테아제 3 신호 펩티드, 마우스 타액 아밀라제의 신호 펩티드, 카르복시펩티다제 신호 펩티드, 또는 효모 BAR1 신호 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, PS가 Lys인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, X가 Lys-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala 또는 Lys-Glu인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, n이 1에서 3까지의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, n=0인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 효모 균주가 일염기성 프로세싱 부위에 특이적인 프로테아제를 암호화하는 DNA 서열을 포함하고, 상기 프로테아제가 리더 결합된 폴리펩티드와 함께 공동-발현되고 프로세싱 부위 PS에서 리더 결합된 폴리펩티드를 절단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 공동-발현된 프로테아제가 트립신, Achrobacter lyticus 프로테아제 I, 엔테로키나제, Fusarium oxysporum 트립신-유사 프로테아제 또는 YAP3인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 프로테아제가 YAP3 또는 YAP3△18과 같은 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
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