CN103314296A - 用于检测针对靶抗体的中和抗体的双功能体外靶结合测定 - Google Patents

Abstract

公开了一种体外测定方法。这种非基于细胞的双功能靶结合测定用于检测生物样本(例如，血清样本)中的IgG靶抗体，如生物药物，以及针对所述IgG靶抗体的中和抗体(NAb)的存在。

Description

用于检测针对靶抗体的中和抗体的双功能体外靶结合测定

本申请包含于2010年8月10日经由EFS-WEB递交的ASCII“txt”适用序列表，其作为37C.F.R.第1.821章(c)和1.821章(e)所要求的计算机可读形式(CRF)和纸质拷贝，并且其全文在此通过引用的方式并入。于2010年8月10日创建的“txt”文件的名称是：A-1586-US-PSP-SeqList081010_ST25.txt，大小为25kb。

本申请通篇的各种出版物引用在圆括号或方括号中。这些出版物的公开内容的全文在此以引用的方式并入本申请以便更充分地描述本申请所属领域的现有技术。

发明背景

发明领域

本发明涉及治疗性抗体领域。

相关技术讨论

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是体液免疫应答的机制之一。在ADCC应答中，免疫***的效应细胞，通常为自然杀伤(NK)细胞，主动裂解已由结合至靶细胞表面上的靶蛋白的特异性抗体结合的靶细胞。中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也可以介导ADCC。例如，嗜酸性粒细胞可通过ADCC杀死称为蠕虫肠虫(helminth)的某些寄生蠕虫。

已报道各种IgG同种型的抗体具有某种ADCC活性，但是通常，IgG1和IgG3同种型的特征为具有显著的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。在一项研究中，报道IgG1和IgG3抗体对于介导单核细胞或活性U937细胞ADCC同样有效；在NK细胞介导的ADCC中IgG1比IgG3更具活性。(Rozsnyay等，Distinctive role of IgG1and IgG3isotypes in Fc gamma R-mediated functions，Immunology66(4)：491-498(1989))。据报道，IgG3敏感性红细胞抑制IgG1诱导的裂解，这意味着每种子类参与相同的FcγR受体，但是裂解需要IgG3分子不能递送的另外“信号”。(Rozsnyay等，ibid.)。FcγRIIIa(CD16a)已被鉴定为ADCC效应子功能的相关受体。

研究已揭示从人IgG1抗体的低聚糖去除岩藻糖导致经由与FcγRIIIa结合的IgG1增加使抗体依赖性细胞毒性(ADCC)显著增强，并且可经由NK细胞的有效募集和活化降低ADCC诱导所需的抗原密度。(Niwa等，Enhanced Natural Killer Cell Binding and Activation byLow-Fucose IgG1Antibody Results in Potent Antibody-DependentCellular Cytotoxicity Induction at Lower Antigen Density，ClinicalCancer Research11：2327(2005)；Satoh等，Non-fucosylated therapeuticantibodies as next-generation therapeutic antibodies，Expert Opinion onBiological Therapy6(11)：1161-1173(2006))。这种现象可尤其用于治疗性抗体。治疗性单克隆抗体如利妥昔单抗

和曲妥珠单抗

广泛用于***和/或自身免疫疾病。(Stavenhagen等，Fc Optimization of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability to KillTumor Cells In vitro and Controls Tumor Expansion In vivo viaLow-Affinity Activating FcγReceptors，Cancer Research67(18)：8882-90(2007)；Clynes，RA等，Inhibitory Fc receptors modulatein vivo cytoxicity against tumor targets，Nat Med6(4)：443-46(2000)；Hauser等，B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiplesclerosis，NEJM358：676-88(2008))。

正在开发KW-0761(也称为“莫加木珠单抗(mogamulizumab)”或“AMG761”)用于治疗患有皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)或外周T细胞淋巴瘤(PTCL)的患者。KW-0761是靶向CC趋化因子受体4(CCR4)表达细胞并且已显示经由ADCC耗尽表达CCR4的T淋巴细胞的能力的免疫球蛋白G子类1(IgG1)κ同种型的人源化单克隆抗体。因为在恒定(Fc)区从复合型低聚糖的去岩藻糖基化，KW-0761具有增强的ADCC活性。(Ishii等，Defucosylated Humanized Anti-CCR4MonoclonalAntibody KW-0761as a Novel Immunotherapeutic Agent for Adult T-cellLeukemia/Lymphoma，Clinical Cancer Research16：1520-31(2010)；Shitara等，Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof，美国专利No.7,504,104)。

中和抗体或NAb是与通常诱导其体内合成的特异性抗原反应，并且与相似分子反应的免疫球蛋白分子。根据作用方式，将中和抗体分类为凝集素、溶菌素、溶血素、调理素或沉淀素。通过由抗原与细胞表面受体的结合而激活的B淋巴细胞合成抗体，并且中和抗体能够消除或“中和”可例如在病原体的表面上的抗原的生物效应。遗憾的是，治疗性抗体有时也可在一些患者中诱导NAb的产生，并且为了临床安全性，能够监测接受治疗性抗体药物的患者血清中针对治疗性抗体的NAb的出现是重要的。

用于检测可诱导ADCC的此类治疗性IgG抗体，并且也用于检测针对患者血清中此类治疗性抗体的NAb的可靠的、非基于细胞的体外测定方法，是本发明所提供的期望有益效果。

发明概述

本发明涉及体外双功能靶结合测定，其用于检测生物样本(例如，血清样本)中的IgG靶抗体，如生物药物，以及针对IgG靶抗体的中和抗体(NAb)的存在。

在一个实施方案中，本发明体外测定方法包括在允许生理条件下进行检测的一定体积的新配制缓冲液存在下，通过测量信号来检测抗生物素蛋白涂敷孔中特异性结合多组氨酸的任何抗体，所述抗体已结合多组氨酸标记的重组人CD16a多肽，其中所述抗生物素蛋白涂敷孔已被预先封闭，并且随后已在生理条件下将预培育的反应混合物在封闭的抗生物素蛋白涂敷孔中培育，其中在其预培育过程中，将预培育反应混合物悬浮在含有血清的水性测定缓冲液中，并且预培育反应混合物包含：

(i)包含具有CD16a结合位点的Fc结构域的靶抗原结合蛋白；和

(ii)目标靶蛋白的生物素化多肽部分，靶抗原结合蛋白与该多肽部分特异性结合；并且

其中，在抗生物素蛋白涂敷孔中培育预培育反应混合物之后，在生理条件下将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的多组氨酸标记的重组人CD16a多肽与任何靶抗原结合蛋白一起培育，所述靶抗原结合蛋白已与生物素化多肽部分结合，所述生物素化多肽部分已与抗生物素蛋白涂敷孔的抗生物素蛋白结合；并且其中，在通过测量信号检测之前，在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的特异性结合多组氨酸的抗体与任何多组氨酸标记的重组人CD16a多肽一起在孔中培育，所述多组氨酸标记的重组人CD16a多肽已与靶抗原结合蛋白结合。

该方法的一些实施方案还包括，在检测特异性结合多组氨酸的抗体之前，在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的包含缀合的产生信号的标记的抗体在孔中培育的步骤，其中所述抗体特异性结合所述特异性结合多组氨酸的抗体。

在具体的实施方案中，本发明体外测定方法包括以下步骤：

(a)在生理条件下将悬浮在含有血清的水性测定缓冲液中的预培育反应混合物在封闭的抗生物素蛋白涂敷孔中培育，所述预培育反应混合物包含：

(i)包含具有CD16a结合位点的Fc结构域的IgG靶抗体；和

(ii)目标靶蛋白的生物素化多肽部分，IgG靶抗体与该多肽部分特异性结合；

(b)在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的多组氨酸标记的重组人CD16a多肽与任何IgG靶抗体一起在孔中培育，所述IgG靶抗体已与生物素化多肽部分结合，所述生物素化多肽部分已与(a)中的抗生物素蛋白结合；

(c)在生理条件下，将特异性结合多组氨酸的抗体与任何多组氨酸标记的重组人CD16a多肽一起在孔中培育，所述抗体悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中，所述多组氨酸标记的重组人CD16a多肽已与(b)中的IgG靶抗体结合；以及

(d)在允许生理条件下进行检测的一定体积的新配制缓冲液的存在下，通过测量信号检测孔中特异性结合多组氨酸的任何抗体，所述抗体已与(c)中的多组氨酸标记的重组人CD16a多肽结合。

在本发明的一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(d)之前，在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的包含缀合的产生信号的标记的抗体在孔中培育的步骤，其中所述抗体特异性结合所述特异性结合(c)中的多组氨酸的抗体。

在另一个有用的实施方案中，该体外测定方法包括以下步骤：

(a)在生理条件下，将悬浮在含有血清的水性测定缓冲液中的预培育反应混合物在封闭的抗生物素蛋白涂敷孔中培育，所述预培育反应混合物包含：

(i)包含具有CD16a结合位点的Fc结构域的针对人CCR4的IgG靶抗体；

(ii)待测试中和抗体的存在的血清样本；和

(iii)人CCR4的生物素化多肽部分，IgG靶抗体与所述多肽部分特异性结合；

(b)在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的多组氨酸标记的重组人CD16a多肽与任何IgG靶抗体一起在孔中培育，所述IgG靶抗体已与人CCR4的生物素化多肽部分结合，所述人CCR4的生物素化多肽部分已与(a)中的抗生物素蛋白结合；

(c)在生理条件下，将悬特异性结合多组氨酸的抗体与任何多组氨酸标记的重组人CD16a多肽一起在孔中培育，所述抗体浮在一定体积的新配制测定缓冲液中，所述多组氨酸标记的重组人CD16a多肽已与(b)中的IgG靶抗体结合；

(d)在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的包含缀合的产生信号的标记的抗体在孔中培育，其中所述抗体特异性结合所述特异性结合(c)中的多组氨酸的抗体；以及

(e)在允许生理条件下进行检测的一定体积的新配制缓冲液的存在下，检测孔中所产生的任何信号。

在本发明的各个实施方案中，可通过灵敏电化学发光(ECL)标记***产生信号，但是荧光标记(例如，荧光素、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白[GFP]、增强型GFP[eGFP]、黄色荧光蛋白[YFP]、青色荧光蛋白[CFP]等)、同位素标记(例如，¹²⁵I、¹⁴C、¹³C、³⁵S、³H、²H、¹³N、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O等)或酶联(例如，基于辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或荧光素酶的)标记***也是有用的实施方案。使用适当的仪器来检测信号。

如果生物样本包含针对IgG1靶抗体的中和抗体，那么靶抗体将不能够与捕获在抗生物素蛋白涂敷的固体基质上的目标生物素化靶肽结合。因此，在NAb的存在下产生低(例如，ECL)信号。NAb不存在时，因为IgG1靶抗体能够在生物素化靶肽和多组氨酸标记的重组人FCγRIIIa(CD16a)之间建立桥接，所以产生高(例如，ECL)信号。

在考虑本发明的附图和详细描述后，本发明的许多另外方面和有点将变得显而易见。

附图简述

图1示出本发明双功能测定的实施方案的示意图，其被配置用于检测特异性结合目标生物素化(“B”)靶蛋白(例如，CCR4)的IgG1靶抗体(例如，KW-0761，也称为“莫加木珠单抗”或“AMG761”)，和用于检测血清样本中的中和抗体。在该实施方案中，由用链霉亲和素(“SA”)涂敷的“MSD6000板”(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)代表抗生物素蛋白涂敷板，并且采用SULFO-TAG^TM蛋白缀合物(MesoScale Discovery，Gaithersburg，MD)电化学发光(ECL)抗体标记***用于检测目的。检测中采用

6000酶标仪(“MSD6000”)。

图2示出用于检测针对IgG1靶抗体的中和抗体的本发明体外测定实施方案的步骤的流程图。

图3示出在测定缓冲液(0％PHS)或合并的人血清(“PHS”：5％PHS或20％PHS；(v/v))存在下，本发明测定中KW-0761(也称为“莫加木珠单抗”或“AMG761”)的代表性剂量响应。

图4说明多克隆抗KW-0761中和抗体的存在以剂量依赖性方式抑制KW-0761(也称为“莫加木珠单抗”或“AMG761”)与生物素化CCR4肽的结合。

图5说明在图1和图2中示意性示出的相同测定形式中，利妥昔单抗与生物素化CD20肽以剂量依赖性方式结合，如实施例3所公开和修改。“MBT4736”指SEQ ID NO：7；“MBT4737”指SEQ ID NO：8。

实施方案详述

本文所用的章节标题仅用于组织的目的，并且不应解释为限制所描述的主题。

定义

除非本文另外定义，否则与本发明书相关使用的科技术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。另外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。因此，如本说明书和所附权利要求所用，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指代物。例如，对“一种蛋白质”的提及包括多种蛋白质；对“一个细胞”的提及包括多个细胞的群体。

“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用并且包括通过肽键共价链接的两个或多个氨基酸的分子链。该术语并非指产物的具体长度。因此，“肽”和“寡肽”包括在多肽的定义内。该术语包括多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，蛋白质片段、类似物、突变或变体蛋白、融合蛋白等包括在多肽的含义内。该术语也包括这样的分子，其包括一种或多种氨基酸类似物或非规范或非天然氨基酸的分子，如可使用已知的蛋白质工程技术重组表达。另外，融合蛋白可如本文所述通过熟知的有机化学技术来衍生。

所提及的术语“分离的蛋白质”意指主题蛋白质(1)不含与其一起通常在自然界中发现的至少一些其它蛋白质，(2)基本上不含来自相同来源(例如，来自相同物种)的其它蛋白质，(3)由异源物种或种类的细胞重组表达，(4)与和其在自然界中缔合的至少约50％的多核苷酸、脂质、糖类或其它物质分离，(5)可操作地与和其在自然界中不缔合的多肽(通过共价或非共价相互作用)缔合，和/或(6)不在自然界中出现。通常，“分离的蛋白质”组成给定样本的至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。基因组DNA、cDNA、mRNA或合成起源的其它RNA或其任意组合可编码此类分离的蛋白质。优选地，分离的蛋白质大体上不含在自然环境中发现的可干扰其治疗、诊断、预防、研究或其它用途的蛋白质或多肽或其它污染物。

在本文进一步描述任何一种多肽或蛋白质以及变体时，频繁应用一个字母缩写体系来指定一般并入天然存在的肽和蛋白质的二十种“规范”氨基酸残基的特征(表1)。此类一个字母缩写在含义上与三个字母缩写或非缩写的氨基酸名称可完全互换。

表1：规范氨基酸的一个字母缩写。

圆括号内为三个字母缩写。

氨基酸序列中的氨基酸取代在本文通常用以下形式来指定：具***置的氨基酸残基的一个字母缩写，后面为相对于目标原始序列的数值氨基酸位置，再后面是取代的氨基酸残基的一个字母符号。例如，“T30D”表示在相对于目标原始序列的氨基酸位置30由天冬氨酸残基取代苏氨酸残基。另一个实例，“W101F”表示在相对于目标原始序列的氨基酸位置101由苯丙氨酸残基取代色氨酸残基。通过采用使用重组表达细胞的蛋白质工程的已知技术，可将非规范氨基酸残基并入本发明范围内的肽。(参见例如，Link等，Non-canonical amino acids inprotein engineering，Current Opinion in Biotechnology，14(6)：603-609(2003))。术语“非规范氨基酸残基”指不在一般并入天然存在的蛋白质的20种规范氨基酸之中的D或L形式的氨基酸残基，例如，β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和具有衍生侧链的氨基酸。实例包括(L形式或D形式)β-丙氨酸、β-氨基丙酸、氨基丁酸(哌啶酸)、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁链素(desmosine)、二氨基庚二酸、N^α-乙基甘氨酸、N^α乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、ω-甲基精氨酸、N^α-甲基甘氨酸、N^α-甲基异亮氨酸、N^α-甲基缬氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N^α-乙酰丝氨酸、N^α-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸和其它类似氨基酸，及以下表2列出的那些，以及如本文所述那些中的任何一种的衍生形式。表2包含根据本发明有用的一些示例性非规范氨基酸残基和如本文通常使用的相关缩写，尽管技术人员将理解不同的缩写和术语可适用于相同的物质并且在本文可交换地出现。

表2：根据本发明，用于向肽序列添加、***或取代氨基酸的有用的非规范氨基酸。如果表2列出的缩写不同于本文其它地方公开的相同物质的另一种缩写，两种缩写都理解为是适用的。表2列出的氨基酸可以是L形式或D形式。

由UPAC-IUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission 0nBiochemical Nomenclature)(JCBN)命名的氨基酸和肽的命名和符号已公开在以下文献中：Biochem.J.，1984，219，345-373；Eur.J.Biochem.，1984，138，9-37;1985，152，1；1993，213，2；Internat.J.Pept.Prot.Res.，1984，24，其后的第84页；J.Bi0l.Chem.，1985，260，14-42；Pure Appl.Chem.，1984，56，595-624；Amino Acids and Peptides，1985，16，387-410；Biochemical Nomenclature and Related Documents，第2版，PortlandPress，1992，第39-69页。

多肽(例如，抗原结合蛋白或抗体)的“变体”包含其中相对于另一个多肽序列，一个或多个氨基酸残基***、从中缺失和/或取代的氨基酸序列的氨基酸序列。变体包括融合蛋白。

术语“融合蛋白”表示蛋白质为嵌合体，其包括来源于不止一种亲本蛋白质或多肽，或来源于相同的蛋白质但以不同的次序位于单个融合分子内的多肽组分，所述单个融合分子并非不一起天然发现于相同的蛋白质分子中.通常，融合蛋白由融合基因表达，在所述融合基因中，编码来自一种蛋白质的多肽序列的核苷酸序列与编码来自不同蛋白质的多肽序列的核苷酸序列在框中附加，并任选地由连接子分开。所述融合基因然后可由重组宿主细胞表达为单个蛋白质。

“分泌”蛋白指由于分泌信号肽序列能够被导向ER、分泌囊泡或细胞外间隙的那些蛋白质，以及释放到细胞外间隙而没必要包含信号序列的那些蛋白质。如果分泌蛋白释放到细胞外间隙，那么分泌蛋白可经历细胞外加工以产生“成熟的”蛋白质。释放到细胞外间隙可通过许多机制发生，包括胞吐和蛋白酶裂解。在本发明组合物的一些其它实施方案中，多肽可由宿主细胞合成为分泌蛋白，其然后可从细胞外间隙和/或介质中进一步纯化。

在本发明体外测定方法的若干步骤中，将分子或分子的混合物“悬浮”在水性液体中，例如，在含有血清的测定缓冲液中，或在一定体积的新配制测定缓冲液中。术语“悬浮”意指分子或混合物溶解于、分散于、在其中漂浮、在其中移动或混合于液体中。

如本文所用的“可溶的”当就在宿主细胞中通过重组DNA技术产生的蛋白质而论时，是存在于水性溶液中的蛋白质；如果蛋白质含有成双精氨酸(twin-arginine)信号氨基酸序列，则可溶性蛋白质被输出到革兰氏阴性细菌宿主的周质间隙，或被能够进行分泌的真核宿主细胞或被具有适当基因(例如，kil基因)的细菌宿主分泌到培养基中。因此，可溶性蛋白质是在宿主细胞内的内含体中未发现的蛋白质。或者，根据于上下文，可溶性蛋白质是这样的蛋白质，其在生理条件下未发现整合到细胞膜中，或体外溶解，或能够被溶解在水性缓冲液中，而当其在生理条件下没有其它蛋白质的情况下悬浮于目标水性缓冲液中时，不形成大量的不溶性聚集体(即，形成少于总蛋白的10％，并且通常少于总蛋白的约5％的聚集体)，这种缓冲液不含有清洁剂或离液剂，如尿素、盐酸胍或高氯酸锂。相反，不溶性蛋白质是以变性形式存在于宿主细胞中细胞质颗粒(称为内含体)内部的蛋白质，或再次根据上下文，不溶性蛋白质是这样的蛋白质，其存在于细胞膜，包括但不限于细胞质膜、线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜等，或当其在生理条件下没有其它蛋白质的情况下(在生理上兼容的温度下)悬浮于目标水性缓冲液中时，在生理条件下在体外水性缓冲液中形成大量不溶性聚集体(即，形成等于或大于总蛋白的约10％的聚集体)，这种缓冲液不含有清洁剂或离液剂，如尿素、盐酸胍或高氯酸锂。

术语“重组”表示通过人干涉人工地或合成地(即，非天然地)改变物质(例如，核酸或多肽)。可在其天然环境或状态，或从其天然环境或状态移除对所述物质进行改变。例如，“重组核酸”是例如在克隆、DNA改组或其它已知的分子生物学程序过程中，通过重组核酸而制备的核酸。此类分子生物学程序的实例可在Maniatis等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y(1982)中找到。“重组DNA分子”由通过此类分子生物学技术结合在一起的DNA片段组成。如本文所用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”指使用重组DNA分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸的细胞。

术语“多核苷酸”或“核酸”包括含有两个或多个核苷酸残基的单链和双链核苷酸聚合物。组成多核苷酸的核苷酸残基可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任何一种类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，如2’，3’-二脱氧核糖；和核苷酸间键合修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯、阿尼洛硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、phosphoraniladate和磷酰胺(phosphoroamidate)。

术语“寡核苷酸”意指包含200个或更少核苷酸残基的多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸长度为10至60个碱基。在其它实施方案中，寡核苷酸长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的，例如，用于突变基因的构建。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括标记，包括同位素标记(例如，¹²⁵I、¹⁴C、¹³C、³⁵S、³H、²H、¹³N、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O等)以便于定量或检测；荧光标记、半抗原或抗原标记以用于检测测定。寡核苷酸可例如用作PCR引物，克隆引物或杂交探针。

如本文可交换使用的“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”或“核酸序列”是多核苷酸中核苷酸残基的一级序列，根据上下文，包括寡核苷酸、DNA和RNA、核酸或表示核苷酸残基的一级序列的字符串。从任何指定的多核苷酸序列中，可确定给定的核酸或互补多核苷酸序列。包括可以是单链或双链的基因组或合成起源的DNA或RNA，并且代表有义或反义链。除非另外指定，本文讨论的任何单链多核苷酸序列的左手端是5’端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5’方向。初期RNA转录物的5′至3′添加的方向被称为转录方向；5′至RNA转录物的5′端的具有与RNA转录物相同的序列的DNA链上的序列区被称为“上游序列”；3′至RNA转录物的3′端的具有与RNA转录物相同的序列的DNA链上的序列区被称为“下游序列”。

如本文所用，“分离的核酸分子”或“分离的核酸序列”是这样的核酸分子，其(1)从通常在核酸的天然来源中与其缔合的至少一种污染核酸分子鉴定并分离，或(2)从背景核酸克隆、扩增、标记或另外区分使得可以确定目标核酸的序列。分离的核酸分子不是其在自然界中发现的形式或情况。然而，分离的核酸分子包括包含在通常表达多肽(例如，寡肽或抗体)的细胞中的核酸分子，其中例如，核酸分子在不同于天然细胞中的位置的染色***置。

如本文所用，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”指沿脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的次序或顺序。这些脱氧核糖核苷酸的次序决定沿mRNA链的核糖核苷酸的次序，并且也决定沿多肽(蛋白质)链的氨基酸的次序。因此DNA序列编码RNA序列和氨基酸序列。

广泛使用的术语“基因”指与生物功能相关的任何核酸。基因通常包括编码序列和/或表达此类编码序列所需的调控序列。术语“基因”应用于特定的基因组或重组序列以及应用于由该序列编码的cDNA或mRNA。“融合基因”含有编码具有来不同蛋白质的部分的多肽的编码区，所述不同蛋白质的部分并非天然一起被发现，或并非天然一起发现于与编码的融合蛋白(即，嵌合蛋白)中存在的序列相同的序列中。基因还包括非表达的核酸片段，其例如，形成其它蛋白质的识别序列。非表达的调控序列包括调控蛋白如转录因子与其结合的转录控制元件，导致邻近或附近序列的转录。

“基因的表达”或“核酸的表达”意指将DNA转录成RNA(任选地包括RNA的修饰，例如，剪接)，将RNA翻译成多肽(可能包括随后多肽的翻译后修饰)，或转录和翻译二者，如上下文所指示。

当结合结构基因使用时，如本文所用的术语“编码区”或“编码序列”指编码在由mRNA分子的翻译产生的初生多肽中发现的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，编码区通过编码起始子甲硫氨酸的核苷酸三联体″ATG″结合在5′侧，并且通过指定终止密码子(即，TAA、TAG、TGA)的三个三联体之一结合在3′侧。

术语“控制序列”或“控制信号”指可在特定宿主细胞中影响与其连接的编码序列的表达和加工的多肽序列。此类控制序列的性质可取决于宿主生物。在具体的实施方案中，原核生物的控制序列可包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。真核生物的控制序列可包括包含一个或多个转录因子的识别位点的启动子、转录增强子序列或元件、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。控制序列可包括前导序列和/或融合配偶体序列。启动子和增强子由与参与转录的细胞蛋白质特异性相互作用的短DNA阵列组成(Maniatis等，Science236：1237(1987))。已从多种真核来源分离了启动子和增强子元件，包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞和病毒中的基因(也在原核动物中发现类似的控制元件，即，启动子)。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达目标蛋白质的细胞的类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其它则在有限的细胞类型亚组起作用(综述参见Voss等，Trends Biochem.Sci.，11：287(1986)和Maniatis等，Science236：1237(1987))。

术语“载体”意指用于将蛋白质编码信息转移至宿主细胞的任何分子和或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。

如本文所用的术语“表达载体”或“表达构建体”指含有期望的编码序列和可操作地连接的编码序列在特定宿主细胞中表达所必需的适当的核酸控制序列的重组DNA分子。表达载体可包括但不限于影响或控制转录、翻译和(如果存在内含子)影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。对于在原核生物中表达必需的核酸序列包括启动子、任选地操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其它序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和聚腺苷酸化信号。分泌信号肽序列也可以任选地由表达载体编码，可操作地连接至目标编码序列，以使得表达的多肽可由重组宿主细胞分泌，以更便于目标多肽从细胞的分离(如果需要的话)。此类技术在本领域是熟知的。(例如，Goodey，AndrewR.；等，Peptide and DNA sequences，美国专利No.5,302,697；Weiner等，Compositions and methods for protein secretion，美国专利No.6,022,952和美国专利No.6,335,178；Uemura等，Proteinexpression vector and utilization thereof，美国专利No.7,029,909；Ruben等，27human secreted proteins，US2003/0104400A1)。

如本文所用的术语“以可操作的组合”、“以可操作的次序”和“可操作地连接”指以这样的方式连接核酸序列，产生能够指导给定基因的转录和/或期望蛋白质分子的合成的核酸分子。该术语也指以使得产生功能蛋白质的方式连接氨基酸序列。例如，将“可操作地连接”至蛋白质编码序列的载体中的控制序列连接至该蛋白质编码序列以使得在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。

术语“宿主细胞”意指已用核酸转化或能够被核酸转化并且因此表达目标基因的细胞。该术语包括亲本细胞的子代，而不论该子代与原始亲本细胞在形态学或在基因组成方面相同与否，只要存在目标基因即可。大量可用并且熟知的宿主细胞中的任何一种可用于本发明的实践。特定宿主的选择取决于本领域公认的许多因素。这些包括例如，与所选择表达载体的相容性、由DNA分子编码的肽的毒性、转化速率、肽回收的容易性、表达特征、生物安全性和成本。这些因素的平衡必定受以下理解的影响：并非所有宿主可对特定DNA序列的表达同样有效。根据这些通用指南，培养的有用的微生物宿主细胞包括细菌(如大肠杆菌(Escherichia coli sp.))、酵母(如酵母菌(Saccharomycessp.))和其它真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物(包括人)细胞，例如，CHO细胞和HEK-293细胞。也可在DNA水平进行修饰。可将编码肽的DNA序列改变成与所选择的宿主细胞更相容的密码子。对于大肠杆菌，最佳的密码子在本领域是已知的。密码子可被取代以消除限制位点或以包括沉默限制位点，这可有助于在所选择的宿主细胞中加工DNA。接下来，对转化的宿主进行培养和纯化。可在常规的发酵条件下培养宿主细胞以使得期望的化合物被表达。此类发酵条件在本领域是熟知的。

术语“转染”意指细胞摄取外来或外源性DNA，并且当外源性DNA被引入细胞膜内部时，该细胞被“转染”。许多转染技术是本领域熟知的并且在本文公开。参见例如，Graham等，1973，Virology52：456；Sambrook等，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，同上；Davis等，1986，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier；Chu等，1981，Gene13：197。此类技术可用于将一个或多个外源性DNA部分引入适当的宿主细胞。

术语“转化”指细胞遗传特征的改变，并且当细胞被修饰以包含新DNA或RNA时，该细胞被转化。例如，在细胞通过经由转染、转导或其它技术引入新遗传物质而从其天然状态进行遗传修饰时，该细胞被转化。转染或转导之后，转化DNA可通过生理上整合进细胞的染色体而与细胞的DNA重组，或可短暂地保持为附加体元件不被复制，或可作为质粒而单独地复制。当转化DNA伴随细胞的***被复制时，则认为细胞被“稳定地转化”。

蛋白质的“结构域”或“区”(在本文可交换地使用)是整个蛋白质的任何部分，多至并且包括完整蛋白质，但通常包含小于完整蛋白质。结构域可以但不需要独立于蛋白质链的其余部分而进行折叠，和/或与特定的生物、生物化学或结构功能或位置相关(例如，配体结合结构域或胞质、跨膜或细胞外结构域)。

用于治疗目的的“哺乳动物”指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养和农场动物，以及动物园动物、体育动物或宠物动物，如狗、马、猫、牛、大鼠、小鼠、猴等。

与生物材料如多肽、核酸、宿主细胞等相关在本说明书中通篇使用的术语“天然存在的”指在自然界中发现的材料。

术语“抗体”或可交换地“Ab”以最广泛的含义使用，并且包括完全装配的抗体、单克隆抗体(包括人、人源化或嵌合抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和可结合抗原的抗体片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、单链抗体、双链抗体)，包括前述的互补决定区(CDR)，只要它们表现期望的生物活性。涵盖完整分子和/或片段的多聚体或聚集体，包括化学来源的抗体。涵盖任何同种型类型或子类的抗体，包括IgG、IgM、IgD、IgA和IgE、IgG1、IgG2、gG3、IgG4、IgA1和IgA2，或任何同种异型抗体。不同的同种型具有不同的效应功能；例如，IgG1和IgG3同种型具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。因此，在本发明体外测定方法的一些实施方案中，IgG靶抗体是IgG1(例如，KW-0761(也称为“莫加木珠单抗”或“AMG761”)、利妥昔单抗或曲妥珠单抗)或IgG3抗体。

术语“抗原结合蛋白”(ABP)包括如上定义的抗体或抗体片段，以及重组肽或包含来源于具有期望的抗原结合特性的CDR的序列的其它化合物。

抗体-抗原相互作用可通过结合速率常数M^-1s^-1(k_a)，或解离速率常数s^-1(k_d)，或平衡解离常数M(K_D)来表征。通常，在相似的结合测定条件下，当抗原结合蛋白与其对其它不相关蛋白质的亲和力相比具有对抗原显著更高的结合亲和力并且因此能够区分该抗原时，该抗原结合蛋白，如抗体或抗体片段与该抗原“特异地结合”。期望的是如下特征，如通过K_D(平衡解离常数)测量的结合亲和力在10^-9M或更低的范围，低至10^-12M或更低(较低的值表示较高的结合亲和力)，或通过k_d(解离速率常数)测量的亲合力在10^-4s^-1或更低的范围，或低至10^-10s^-1或更低。通常，当平衡解离常数(K_D)≤10^-8M时，抗原结合蛋白(例如，抗体或抗体片段)被称为“特异性结合”其靶抗原。当K_D≤5×10^-9M时，抗原结合蛋白(例如，抗体或抗体片段)以“高亲和力”特异性结合抗原，并且当K_D≤5×10^-10M时，抗原结合蛋白(例如，抗体或抗体片段)以“非常高的亲和力”特异性结合抗原。在一个实施方案中，抗原结合蛋白(例如，抗体)将以介于约10^-8M和10^-10M之间的K_D结合，并且在另一个实施方案中，抗体将以K_D≤5×10^-9M结合。可使用动力学分析技术如表面等离子共振(例如，Fischer等，A peptide-immunoglobulin-conjugate，WO2007/045463A1，实施例10，其全文以引用的方式并入本文)，或使用由制造商概述的一般程序的KinExA或本领域已知的其它方法，容易地确定结合速率常数、解离速率常数或平衡解离常数。通过

或KinExA获得的动力学数据可通过制造商描述的方法进行分析。

“抗原结合区”或“抗原结合位点”意指特异性结合特定抗原的抗原结合蛋白的一部分(例如，抗体蛋白或抗体片段)。例如，含有与抗原相互作用并且赋予抗体对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗体的部分被称为“抗原结合区”。抗原结合区通常包括一个或多个“互补结合区”(“CDR”)。某些抗原结合区也包括一个或多个“骨架”区(“FR”)。“CDR”是有助于抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“骨架”区可协助维持CDR的合适构型以促进抗原结合区和抗原之间的结合。

“分离的”抗体是从其天然环境或其中其被生产细胞分泌的培养基的一种或多种组分鉴定并分离的抗体。其天然环境或培养基的“污染物”组分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶。激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，抗体(1)被纯化至大于抗体的95重量％，并且最优选地大于99重量％，或(2)在还原或非还原条件下，任选地使用染色剂，例如，考马斯蓝或银染色剂，通过SDS-PAGE纯化至均质。分离的天然存在的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤进行制备。

如本文所用的术语“单克隆抗体”指获自大体上均质的抗体群的抗体，即，除了可微量存在的可能天然存在的突变外，组成该群的单独抗体是相同的。单克隆抗体针对单独抗原位点或表位是高度特异的，与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比。单克隆抗体的非限制性实例包括鼠抗体、兔抗体、大鼠抗体、鸡抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体、完全装配的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、可结合抗原的抗体片段(包括Fab、Fab’、F(ab′)₂、Fv、单链抗体、双链抗体)、大抗体(maxibody)、纳米抗体和包含前述CDR的肽(只要它们表现期望的生物活性)，或其变体或衍生物。

修饰词“单克隆”表示如获自大体上均质的抗体群的抗体的特征，并且不应解释为通过任何具体方法获得该抗体群。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等，Nature，256：495[1975]描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法制备(参见例如，美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson等，Nature，352：624-628[1991]和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术分离自噬菌体抗体文库。

术语“免疫球蛋白”涵盖包含每条共价连接至轻链(LC)的两条二聚化重链(HC)；单条非二聚化疫球蛋白重链和共价连接的轻链(HC+LC)；或嵌合免疫球蛋白(轻链+重链)-Fc异三聚体(所谓的“半抗体(hemibody)”)的完整抗体。

“抗体”是四聚体糖蛋白。在天然存在的抗体中，每个四聚体由每对具有约220个氨基酸(约25kDa)的“轻”链的两对相同的多肽链和一条约440个氨基酸(约50-70kDa)的“重”链组成。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的“可变”(“V”)区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应功能的恒定区。可变区在不同的抗体间不同。恒定区在不同的抗体间相同。在每条重链或轻链的可变区内，存在有助于决定抗体对抗原的特异性的三个高变亚区。高变区之间的可变结构域残基被称为骨架残基并且在不同的抗体之间通常是稍微同源的。根据它们重链的恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为不同的种类。将人轻链分类为kappa(κ)和lambda(λ)轻链。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12或更多个氨基酸的″J″区连接，重链也包括约10或更多个氨基酸的″D″区。一般参见，Fundamental Immunology，第7章(Paul，W.，编著，第2版Raven Press，N.Y.(1989))。在本发明的范畴内，“抗体”还涵盖重组制备的抗体以及缺乏糖基化的抗体。

术语“轻链”或“免疫球蛋白轻链”包括全长轻链和具有足够的可变区序列以赋予结合特异性的全长轻链的片段。全长轻链包括可变区结构域V_L和恒定区结构域C_L。轻链的可变区结构域在多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。

术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括全长重链和具有足够的可变区序列以赋予结合特异性的全长重链的片段。全长重链包括可变区结构域V_H和三个恒定区结构域C_H1、C_H2和C_H3。V_H结构域在多肽的氨基末端，并且C_H结构域在羧基末端，其中C_H3距多肽的羧基末端最近。将重链分类为mu(μ)、delta(Δ)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)，并且将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明单独的实施方案中，重链可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型)、IgA(包括IgA1和IgA2同种型)、IgM和IgE。这些中的许多可进一步分为子类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同的IgG同种型可具有不同的效应功能(由Fc区介导)，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体的Fc区与免疫效应细胞如自然杀伤细胞和巨噬细胞表面上的Fc受体(FcγRs)结合，导致靶向细胞的吞噬或裂解。在CDC中，抗体通过触发细胞表面的补体级联来杀死靶向细胞。

“Fc区”或在本文可交换使用的“Fc结构域”或“免疫球蛋白Fc结构域”含有两个重链片段，所述重链片段在完整抗体中包含抗体的C_H1和C_H2结构域。该两个重链片段由两个或多个二硫键并且由C_H3结构域的疏水相互作用合并在一起。

术语“挽救受体结合表位”指负责增加IgG分子的体内血清半衰期的IgG分子(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)的Fc区的表位。

“同种异型”是抗体序列，通常是恒定区中的变化，其可以是免疫原性的并且由人中的特异等位基因编码。对于人IGHC基因，IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHA2和IGHE基因中的五种，鉴定出同种异型，并且分别指定为G1m、G2m、G3m、A2m和Em同种异型。至少18种Gm同种异型是已知的：nG1m(1)、nG1m(2)、G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)、G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b5、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5)。存在两种A2m同种异型A2m(1)和A2m(2)。

对于抗体的结构和产生的详细描述，参见Roth，D.B.，和Craig，N.L.，Cell，94：411-414(1998)，其全文以引用的方式并入。简言之，产生编码重链和轻链免疫球蛋序列的DNA的过程主要发生在发育的B细胞中。在各种免疫球蛋白基因片段的重排和连接之前，一般在单个染色体上的相对邻近区发现V、D、J和恒定(C)基因片段。在B细胞分化过程中，将V、D、J(或在轻链基因的情况下仅为V和J)基因片段的每个适当的家族成员之一进行重组以形成重链和轻链免疫球蛋白基因的功能上重排的可变区。该基因片段重排过程似乎是连续的。首先，产生重链D-至-J连接，然后是重链V-至-DJ连接和轻链V-至-J连接。除了V、D和J片段的重排外，通过在其中轻链的V和J片段连接和其中重链的D和J片段连接的位置的可变重组，在免疫球蛋白重链和轻链的主要库(repertoire)中产生进一步的多样性。轻链中的这种变化通常发生在V基因片段的最后一个密码子中和J片段的第一个密码子中。连接中的类似不精确发生在D和J_H片段之间的重链染色体上并且可延伸多至10个核苷酸。此外，可在不由基因组DNA编码的D和J_H基因片段之间以及V_H和D基因片段之间***多个核苷酸。这些核苷酸的添加被称为N区多样性。可变区基因片段中的这种重排和可能发生在这种连接的过程中的可变重组的净效应是产生主要抗体库。

术语“高变”区指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自互补决定区或CDR的氨基酸残基[即，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)，如Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，Md.(1991)所述]。即使单独的CDR也可识别并结合抗原，尽管比含有所有CDR的整个抗原结合位点具有较低的亲和力。在典型的抗体中，将CDR嵌入重链和轻链可变区中的骨架中，其中在重链和轻链可变区中CDR组成负责抗原结合和识别的区。可变区在骨架区内(由Kabat等，1991，同上指定骨架区1-4，FR1、FR2、FR3和FR4；也参见Chothia和Lesk，1987，同上)包含至少三个重链或轻链CDR，参见，同上(Kabat等，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Public Health Service N.I.H.，Bethesda，MD；还参见Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等，1989，Nature342：877-883)。

来自高变“环”的残基的可选择定义由Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)描述为轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)。

“骨架”或“FR”残基是那些可变区残基而不是高变区残基。

“抗体片段”包含完整全长抗体的一部分，优选地是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双链抗体；线性抗体(Zapata等，Protein Eng.，8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个具有单个抗原结合位点和剩余的含有恒定区的“Fc”片段。Fab含有所有可变结构域，以及轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fc片段展示糖类并且负责许多抗体效应功能(如结合补体和细胞受体)，这将一种类型的抗体与另一种类型区分开。

胃蛋白酶处理产生具有包含抗体的VH和VL结构域的两个“单链Fv”或“scFv”抗体片段的F(ab′)₂片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通过在重链CH1结构域的羧基末端包含几个另外的残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸，Fab片段与Fab′片段不同。优选地，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得Fv形成用于抗体结合的期望结构。对于scFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。

“Fab片段”由一条轻链和一条重链的C_H1和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

“Fab′片段”含有一条轻链和含有V_H结构域和C_H1结构域以及C_H1和C_H2结构域之间的区的一条重链的一部分，以使得在两个Fab′片段的两条重链之间可形成链间二硫键以形成F(ab′)₂分子。

“F(ab′)₂片段”含有两条轻链和含有C_H1和C_H2结构域之间的恒定区的一部分的两条重链，以使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab′)₂片段由通过两条重链之间的二硫键合并在一起的两个Fab′片段组成。

“Fv”是最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和结合位点。该区由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在这种构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH VL二聚体表面上的抗原结合位点。单个可变结构域(或仅包含三个对抗原特异的CDR的Fv的一半)具有识别并结合抗原的能力，尽管比完整结合位点具有较低的亲和力。

“单链抗体”是其中重链和轻链可变区由柔性接头连接以形成单个多肽链(其形成抗原结合区)的Fv分子。单链抗体详细讨论在国际专利申请公开No.WO88/01649和美国专利No.4,946,778和No.5,260,203，其公开内容的全文以引用的方式并入。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中，并且任选地包含V_H和V_L结构域之间的多肽接头，其使得Fv形成用于抗原结合的期望结构(Bird等，Science242：423-426，1988，和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883，1988)。“Fd”片段由V_H和C_H1结构域构成。

术语“双链抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含与相同的多肽链(VH VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不能使相同链上的两个结构域之间进行配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双链抗体更充分地描述在例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。

“结构域抗体”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能免疫球蛋白片段。在一些实例中，将两个或多个V_H区用肽接头共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个V_H区可靶向相同或不同的抗原。

术语“抗原”指能够由选择性结合物质如抗原结合蛋白(包括例如，抗体或其免疫功能片段)结合并且另外能够用于动物中以产生能够与该抗原结合的抗体的分子或分子的一部分。抗原可具有能够与不同的抗原结合蛋白例如抗体相互作用的一个或多个表位。

术语“表位”是由抗原结合蛋白(例如，抗体)结合的分子的一部分。该术语包括能够与抗原结合蛋白(例如，抗体)特异性结合的任何决定簇。表位可以是连续的或非连续的(例如，在单链多肽中，为在多肽序列中非彼此连续但在分子的情况中由抗体结合的氨基酸残基)。在某些实施方案中，表位可以是模拟的，因为它们包含与用于产生抗原结合蛋白(例如，抗体)的表位相似的三维结构，但是不包含或仅包含在所述用于产生抗原结合蛋白的表位中发现的一些氨基酸残基。更通常，表位驻留在蛋白质上，但是在一些实例中可能驻留在其它类型的分子上，如核酸。表位决定簇可包括分子如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的化学活性表面组群，并且可具有特定的三维结构特征，和/或特异性的电荷特征。一般而言，对特定靶抗原特异的抗体将优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中靶抗原上的表位。

术语“同一性”指如通过序列的比对和比较所测量的，两个或多个多肽分子或两个或多个核酸分子的序列之间的关系。“同一性百分比”意指在所比较的分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比并且根据所比较的分子中最小分子的大小来计算。对于这些计算，必须通过具体的数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决比对中的空位(如果有的话)。用于计算所比对的核酸或多肽的同一性的方法包括描述在以下文献中的那些：Computational Molecular Biology，(Lesk，A.M.，编著)，1988，New York：Oxford University Press；BiocomputingInformatics and Genome Projects，(Smith，D.W.，编著)，1993，New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编著)，1994，New Jersey：HumanaPress；von Heinje，G.，1987，Sequence Analysis in Molecular Biology，New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer，(Gribskov，M和Devereux，J.，编著)，1991，New York：M.Stockton Press；和Carillo等，1988，SIAM J.Applied Math.48：1073。例如，可通过通常用于比较两种多肽的氨基酸位置的相似性的标准方法来测定序列同一性。使用计算机程序如BLAST或FASTA，比对两种多肽或两个多核苷酸序列的其各自残基的最佳匹配(沿一个或两个序列的全长，或沿一个或两个序列的预定部分)。所述程序提供默认开放罚分和默认空位罚分，并且评分矩阵如PAM250[标准评分矩阵；参见Dayhoff等，于Atlas ofProtein Sequence and Structure，第5卷，增刊3(1978)]可与该计算机程序联合使用。例如，然后可将同一性百分比计算为：相同匹配的总数乘以100然后除以匹配跨距内较长序列的长度和引入较长序列以比对该两个序列的空位数的和。在计算同一性百分比时，对所比较的序列以给出序列之间最大匹配的方式进行比对。

GCG程序包是可用于测定同一性百分比的计算机程序，所述程序包包括GAP(Devereux等，1984，Nucl.Acid Res.12：387；GeneticsComputer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)。计算机算法GAP用于比对待测序列同一性百分比的两种多肽或两种多核苷酸。比对所述序列的它们各自氨基酸或核苷酸的最佳匹配(如通过所述算法测定的“匹配跨距”)。空位开放罚分(其计算为平均对角线的3倍，其中“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；所述“对角线”是具体比较矩阵为每个完美的氨基酸匹配指定的分数或数值)和空位扩展罚分(其通常是空位开放罚分的1/10)以及比较矩阵如PAM250或BLOSUM62与所述算法联合使用。在某些实施方案中，所述算法也使用标准比较矩阵(对于PAM250比较矩阵，参见Dayhoff等，1978，Atlas of Protein Sequence and Structure5：345-352；对于BLOSUM62比较矩阵，参见Henikoff等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919)。

使用GAP程序，用于测定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推荐参数包括以下：

算法：Needleman等，1970，J.Mol.Biol.48：443-453；

比较矩阵：BLOSUM62，来自Henikoff等，1992，同上；

空位罚分12(但对末端空位没有罚分)

空位长度罚分：4

相似性阈值：0

用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可产生该两个序列的仅较短区的匹配，并且这种小比对区可能具有非常高的序列同一性，尽管这两个全长序列之间没有显著的关系。因此，如果期望产生跨越靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对，则可调整所选择的比对方法(GAP程序)。

当与多肽相关使用时，术语“修饰”包括但不限于一个或多个氨基酸改变(包括取代、***或缺失)；化学修饰；通过与治疗剂或诊断剂缀合的共价修饰；标记(例如，用荧光标记、电化学发光标记、放射性核素或其它同位素标记，或各种酶)；共价聚合物附着，如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生)和通过非天然氨基酸的化学合成进行的***或取代。修饰的多肽应保留用于本发明方法中的未修饰分子的结合特性。

“缀合”意指至少两个化学部分直接或任选地经由本身与两个部分共价连接的肽基或非肽基接头部分彼此共价连接或结合。例如，共价连接可经由肽或蛋白质的氨基酸残基，包括经由α氨基基团，或经由侧链。

关于本发明测定方法的培育缓冲液或试剂的“在生理条件下”意指在允许生化反应如非共价结合反应发生的温度、pH和离子强度的条件下的培育。通常，温度在室温或环境温度下高达约37℃并且在pH6.5-7.5。

“封闭”意指用测定缓冲液预培育，例如，用于当随后加入反应混合物时将反应混合物与孔表面的非特异性结合减至最低的目的。

“反应混合物”是包含所有试剂和必需因素的水性混合物，其在培育的生理条件下允许发生目标体外生物化学反应，如非共价结合反应。

“抗生物素蛋白”是四聚体生物素结合蛋白，在鸟类、爬行动物和两栖动物的输卵管内天然产生并且通常在其卵的蛋白中沉积，或以其合成或重组产生的形式，和/或以其单体或多聚体(例如，二聚体、三聚体等)形式。在其四聚体、糖基化形式中，估计抗生物素蛋白大小为66-69kDa并且可以以高程度的亲和力和特异性同时结合多至四个生物素分子。(Korpela，J.，Avidin，a high affinity biotin-bindingprotein as a tool and subject of biological research.Med.Bio.62：5-26(1984))。对于本发明的目的，“抗生物素蛋白”可以是糖基化的、去糖基化的或非糖基化的、衍生的或修饰的，只要抗生物素蛋白保持对生物素的高亲和力(量级为10^-14M至10^-16M的平衡解离常数K_D)。包括在“抗生物素蛋白”含义内的有中性抗生物素蛋白(或NeutrAvidin)和链霉亲和素。“链霉亲和素”，由细菌链霉菌(Streptomyces avidinii)天然产生为52,800Da的四聚体生物素结合蛋白，并且包括其纯化或合成或重组产生的形式，和/或其单体或多聚体(例如，二聚体、三聚体等)形式。抗生物素蛋白(或链霉亲和素)的重组工程化单价或多价形式也包括在“抗生物素蛋白”内。(例如，Laitinen等，Geneticallyengineered avidins and streptavidins，Cell Mol Life Sci.63(24)：2992-30177(2006)；Howarth等，A monovalent streptavidin with a singlefemtomolar biotin binding site，Nat Methods3(4)：267-73(2006))。“抗生物素蛋白涂敷”意指将固体表面例如聚苯乙烯板的孔表面与抗生物素蛋白部分缀合以使得抗生物素蛋白仍然能够在生理条件下以高亲和力非共价结合生物素，例如，以量级为10^-14M至10^-16M的平衡解离常数K_D。在本发明体外测定的抗生物素蛋白涂敷孔的一些实施方案中，所采用的抗生物素蛋白是链霉亲和素或中性抗生物素蛋白。

“孔”是能够通过可盖合的开口接受并且容纳水性液体的室。例如，微量滴定板(例如，96-孔或384-孔微量滴定板)的每个单独隔间是一个“孔”；单隔间容器，如培养板、皮氏培养皿(Petri dish)、试管、锥形管或凹玻片的凹陷也是一个“孔”。孔的开口可分别由可移除的单独盖未盖合或盖合，或通过单个可移除的盖共同未盖合或盖合。

“生物素”是水溶性复合维生素B，即，维生素B7，其由与四氢噻吩环稠合的脲基(四氢咪唑啉酮(tetrahydroimidizalone))环组成(参见，式I)。

式I：

戊酸取代基连接至四氢噻吩环的其中一个碳原子上。在自然界中，生物素是脂肪酸和亮氨酸代谢中的辅酶，并且在体内糖异生中发挥作用。生物素以量级为10^-14M至10^-16M的平衡解离常数K_D非常紧密地与四聚体蛋白抗生物素蛋白(例如，鸡抗生物素蛋白、细菌链霉亲和素和中性抗生物素蛋白)结合，这是已知最强的蛋白质-配体相互作用之一，强度上接近共价键。(Laitinen等，Genetically engineeredavidins and streptavidins，Cell Mol Life Sci.63(24)：2992-30177(2006))。生物素-抗生物素蛋白非共价相互作用通常用于不同的生物技术应用中。(参见，Laitinen等，Genetically engineered avidins andstreptavidins，Cell Mol Life Sci.63(24)：2992-30177(2006))。

“生物素化的”意指物质与一种或多种生物素部分缀合。用于实践本发明的生物素化肽可商购(例如，Midwest Bio-Tech Inc.)或可容易地合成和生物素化。化合物如肽的生物素化可通过任何已知的化学技术进行。这些包括伯胺生物素化、巯基生物素化和羧基生物素化。例如，以赖氨酸侧链ε胺和N端α胺存在于肽上的胺基是伯胺生物素化生物素化的一般靶。根据水溶性，可将胺反应性生物素化试剂分成两组。

1)生物素的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-酯在水性溶液中具有低溶解性。对于在水性溶液中的反应，它们必须首先溶解于有机溶剂中，然后稀释至水性反应混合物中。用于此目的的最常用的有机溶剂是二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)，其以低浓度与大多数蛋白质相容。

2)生物素的硫代-NHS-酯在水中更易溶，并且在使用之前溶解于水因为它们容易水解。硫代-NHS-酯的水溶解性来源于它们N-羟基琥珀酰亚胺环上的磺酸基团并且不需要将该试剂溶解于有机溶解中。

NHS-和硫代-NHS-酯的化学反应基本上是相同的：形成酰胺键并且NHS或硫代-NHS变成离去基团。因为酯的靶是去质子伯胺，所以反应普遍在pH7以上。NHS-酯的水解是主要的竞争反应，并且水解的速率随pH增加而增加。NHS-和硫代-NHS-酯的半衰期在pH7时为几个小时，但在pH9时为仅几分钟。将NHS-酯与肽的伯胺缀合的条件包括培育温度在4-37℃的范围内，反应pH值在7-9范围内，并且培育时间从几分钟至约12小时。必须避免含有胺(如Tris或甘氨酸)的缓冲液，因为它们与反应竞争。HABA染料(2-(4-羟基偶氮苯)苯甲酸)方法可用于测定生物素化的程度。简言之，HABA染料与抗生物素蛋白结合并产生特征性吸光度。当引入生物素化蛋白质或其它分子形式的生物素时，其置换染料，导致500nm时吸光度的变化。吸光度变化与样本中生物素的水平正正比。

“FCγRIIIa”，也称为“CD16a”或“FCGR3”或“IGFR3”，这些命名在本文可交换地使用，意指免疫球蛋白G Fc受体III。人CD16a(GenBank登录号AAH17865)包含以下氨基酸序列：

1   mwqlllptal lllvsagmrt edlpkavvfl epqwyrvlek dsvtlkcqga yspednstqw

61  fhneslissq assyfidaat vddsgeyrcq tnlstlsdpv qlevhigwll lqaprwvfke

121 edpihlrchs wkntalhkvt ylqngkgrky fhhnsdfyip katlkdsgsy fcrglvgskn

181 vssetvniti tqglavstis sffppgyqvs fclvmvllfa vdtglyfsvk tnirsstrdw

241 kdhkfkwrkd pqdk//SEQ ID NO：11。

然而，CD16a的多态性序列也由术语“CD16a”所涵盖。这种多态性包括176V(高结合形式)和176F(低结合形式)。CD16a(SEQ ID NO：11)的254个氨基酸残基的序列包括16个残基的信号序列；191个残基的细胞外结构域(ECD)；和22个残基的跨膜结构域和25个残基的C端细胞质结构域。“重组人CD16a多肽”是由重组DNA技术产生的可溶的SEQ ID NO：11片段(或其多态性变体)。这种可溶性片段的实例为SEQ ID NO：11的G17-Q208片段，其包括假定的ECD：

17  gmrt edlpkavvfl epqwyrvlek dsvtlkcqga yspednstqw

61  fhneslissq assyfidaat vddsgeyrcq tnlstlsdpv qlevhigwll lqaprwvfke

121 edpihlrchs wkntalhkvt ylqngkgrky fhhnsdfyip katlkdsgsy fcrglvgskn

181 vssetvniti tqglavstis sffppgyq//SEQ ID NO：12。

“重组人CD16a多肽”的其它实施方案包括保持以小于50nM的估计K_D与人IgG结合的能力的SEQ ID NO：12的较小片段。

“多组氨酸标记的”意指通过合成技术(例如，Peterson，美国专利No.5,840,834，Technique for joining amino acid sequences and novelcomposition useful in immunoassays)或通过重组DNA技术，将重组人CD16a多肽缀合为包含至少5个，但通常为6个(“六组氨酸标签”或“6xHis-标签”)至18个连续组氨酸残基的重组人CD16a多肽的N端或C端延伸。多组氨酸标记的重组人CD16a多肽也可商购获得(例如，R&D***目录号4325-FC)。特异性结合多组氨酸的抗体和其制备方法在本领域是已知的，并且此类抗体可商购获得。(例如，Zentgraf等，Antibodies active against a fusion polypeptide comprising a histidineportion，美国专利No.6,790,940和美国专利No.7,713,712；Sigma-Aldrich Product#H1029；R&D***目录号MAB050)。在本发明体外测定方法的一些实施方案中，特异性结合多组氨酸的抗体，或在其它实施方案中，特异性结合特异性结合多组氨酸的抗体的抗体，还包含与抗体缀合的产生信号的标记，例如但不限于荧光标记、同位素标记、电化学发光标记或酶，所述酶可催化将物质转变成可容易地通过光谱光度测量、比色测量、荧光测量、发光测量或其它仪器(例如，基于辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或荧光素酶的检测***)进行检测的反应物的反应。

“电化学发光”(ECL)或可交换的“电致化学发光”是溶液中电化学反应过程中产生的一种发光。在ECL中，电化学产生的中间物经历高放能反应以产生然后发光的电激发状态。(Forster等，Electrogenerated Chemiluminescence，Annual Review of AnalyticalChemistry2：359-385(2009))。ECL激发由电致物质的高能电子转移(氧化还原)反应引起。这些电子转移反应释放足够的能量以允许产生发光体(包括多环芳香族烃类和金属复合物)的激发状态而没有光致激发。例如，在三丙胺存在下[Ru(bpy)₃]²⁺的氧化产生与由光致激发产生的发射类似的光发射。此类钌络合物可有效地被采用作为用于本发明目的的化学发光标记。例如，Meso Scale Discovery(MSD；Gaithersburg，MD)Sulfo-Tag^TMECL检测***依赖于包含钌络合物的电化学发光标记。在Sulfo-Tag^TM***中，具有以下化学结构(II)的激活的N-羟基琥珀酰亚胺酯用于形成标记：

根据制造商的说明(MSD Sulfo-Tag^TM NHS-Ester，17794-v2-2008May，(2008))，激活的N-羟基琥珀酰亚胺酯与待标记的多肽如抗体反应。如前述所提及的，NHS-和硫代-NHS-酯的反应基本上相同：形成酰胺键并且NHS或硫代-NHS变成离去基团。因为酯的靶是去质子伯胺，所以反应普遍在pH7以上。将NHS-酯与肽的伯胺缀合的条件包括培育温度在4-37℃范围内，反应pH值在7-9的范围内，并且培育时间从几分钟至约12小时。必须避免含有胺(如Tris或甘氨酸)的缓冲液，因为它们与反应竞争。标记反应的标记的多肽产物包括包含具有下式(III)的钌络合物的电化学发光标记，其中从羰基绘出的线显示与分子的其余部分连接：

在本发明体外测定方法的一些实施方案中，预培育反应混合物还含有待测试中和抗体的存在的血清样本。“中和抗体”(NAb)是能够通过在体内或在体外样本特异性结合目标抗原来降低目标抗原的血清效价的抗体，例如IgG靶抗体。在体内，NAb通过与位于治疗性分子的活性位点内的表位直接结合，或通过阻断其活性位点来阻断治疗性分子的生物活性，其中阻断活性位点是由于与可能位于活性位点附近的表位结合而产生的空间位阻。虽然在某些情况中，NAb存在不会产生临床效果，但是在其它情况中，以足够的NAb水平，可观察到功效的降低，这可能需要施用较高剂量的药物产品以达到类似的功效。(参见，例如，Gupta等，Recommendations for the design，optimization，and qualification of cell-based assays used for the detection ofneutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics，Journalof Immunological Methods321(1-2)：1-18(2007))。

在其它情况中，可观察到功效的降低，这可能需要施用较高剂量的药物产品以达到类似的功效。

目标“靶蛋白”是任何蛋白质，例如但不限于人蛋白质，其与抗体的特异性靶一样具有科学、医学、临床或治疗益处。目标靶蛋白的实例是趋化因子受体类型4(CCR4)。人CCR4的氨基酸序列为如下(Genbank登录号P51679)：

1   mnptdiadtt ldesiysnyy lyesipkpct kegikafgel flpplyslvf vfgllgnsvv

61  vlvlfkykrl rsmtdvylln laisdllfvf slpfwgyyaa dqwvfglglc kmiswmylvg

121 fysgiffvml msidrylaiv havfslrart ltygvitsla twsvavfasl pgflfstcyt

181 ernhtycktk yslnsttwkv lssleinilg lviplgimlf cysmiirtlq hcknekknka

241 vkmifavvvl flgfwtpyni vlfletlvel evlqdctfer yldyaiqate tlafvhccln

301 piiyfflgek frkyilqlfk tcrglfylcq ycgllqiysa dtpsssytqs tmdhdlhdal//SEQ ID NO：1。

目标靶蛋白的另一个实例是B淋巴细胞抗原CD20。人CD20的氨基酸序列为如下(Genbank登录号NP_690605)：

1   mttprnsvng tfpaepmkgp iamqsgpkpl frrmsslvgp tqsffmresk tlgavqimng

61  lfhialggll mipagiyapi cvtvwyplwg gimyiisgsl laateknsrk clvkgkmimn

121 slslfaaisg milsimdiln ikishflkme slnfirahtp yiniyncepa npseknspst

181 qycysiqslf lgilsvmlif affqelviag ivenewkrtc srpksnivll saeekkeqti

241 keevvglt etssqpknee dieiipiqee eeeetetnfp eppqdqessp iendssp//SEQ ID NO：2。

目标靶蛋白的另一个实例是HER2。人HER2(也称为致癌基因ERBB2、酪氨酸蛋白激酶erbB-2、致癌基因NGL、NEU或TKR1)的氨基酸序列为如下(Genbank登录号P04626)：

1    melaalcrwg lllallppga astqvctgtd mklrlpaspe thldmlrhly qgcqvvqgnl

61   cltylptnas lsflqdiqev qgyvliahnq vrqvplqrlr ivrgtqlfed nyalavldng

121  dplnnttpvt gaspgglrel qlrslreilk ggvliqrnpq lcyqdtilwk difhknnqla

181  ltlidtnrsr achpcspmck gsrewgesse dcqsltrtvc aggcarckgp lptdccheqc

241  aagctgpkhs dclaclhfnh sgicelhcpa lvtyntdtfe smpnpegryt fgascvtacp

301  ynylstdvgs ctlvcpllmq evtaedgtqr cekcskpear vcyglgmehl revravtsan

361  iqefagckki fgslaflpes fdgdpasnta plqpcqlqvf etleeitgyl yisawpdslp

421  dlsvfqnlqv irgrilhnga ysltlpglgi swlglrslre lgsglalihh nthlcfvhtv

481  pwdqlfrnphedecvgegla chqlcarghc wgpgptqcvn csqflrgqec

541  veecrvlqgl preyvnarhc lpchpecqpq ngsvtcfgpe adqcvacahy kdppfcvarc

601  psgvkpdlsy mpiwkfpdee gacqpcpinc thscvdlddk gcpacqraspltsiisavvg

661  illvvvlgvv fgilikrrqq kirkytmrrl lqetelvcpl tpsgampnqa qmrilketel

721  rkvkvlgsga fgtvykgiwi pdgenvkipv aikvlrents pkankeilde ayvmagvgsp

781  yvsrllgicl tstvqlvtql mpygclldhv renrgrlgsq dllnwcmqia kgmsyledvr

841  lvhrdlaarn vlvkspnhvk itdfglarll didetcyhad ggkvpikwma lesilrrrft

901  hqsdvwsygv tvwelmtfga kpydgipare ipdllekger lpqppictid vymimvkcwm

961  idsecrprfr elvsefsrma rdpqrfvviq nedlgpaspl dstfyrslle dddmgdlvda

1021 eeylvpqqgf fcpdpapgag gmvhhrhrss strsgggdlt lglepseeea prsplapseg

1081 agsdvfdgdl gmgaakglqs lpthdpsplq rysedptvpl psetdgyvap ltcspqpcyv

1141 nqpdvrpqpp spregplpaa rpagatlerp ktlspgkngv vkdvfafgga venpeyltpq

1201 ggaapqphpp pafspafdnl yywdqdpper gappstfkgt ptaenpeylg ldvpv//SEQ ID NO：13。

“多肽部分”是包含靶蛋白的抗原肽基部分的目标靶蛋白的子集。通常，这种“多肽部分”包含至少5至6个连续氨基酸残基并且可大至完整的目标蛋白。更通常，“多肽部分”的长度为10至40个氨基酸残基。“多肽部分”包括靶抗原结合蛋白或IgG靶抗体的至少一个CDR，或在另一个实施方案至少两个CDR，或在又一个实施方案中至少三个CDR与其特异性结合的靶蛋白的氨基酸残基。

“靶抗原结合部分”是与目标靶蛋白的多肽部分特异性结合的抗原结合蛋白，并且也包括具有CD16a结合位点的Fc结构域。IgG靶抗体是“靶抗原结合蛋白”的实例。

“IgG靶抗体”是与目标靶蛋白的多肽部分特异性结合的抗体，并且也包括具有CD16a结合位点的Fc结构域。

抗体的产生

多克隆抗体。多克隆抗体优选地通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而在动物中产生。可选地，可将抗原直接注射至动物的淋巴节(参见Kilpatrick等，Hybridoma，16：381-389，1997)。使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其它试剂，通过将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质缀合可获得改善的抗体响应，所述蛋白质例如，钥孔虫戚血兰素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰岛素抑制剂。

通过将例如100μg蛋白质或缀合物(对于小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)合并并将所述溶液在多个部位皮内注射，对动物针对抗原、免疫缀合物或衍生物进行免疫。一个月后，通过在多个部位皮下注射，用原始量的1/5至1/10的弗氏完全佐剂中的肽或缀合物对动物进行加强。加强注射后的7-14天，使动物流血并测定血清的抗体效价。对动物进行加强直到达到效价停滞期。优选地，用相同抗原但与不同蛋白质缀合和/或通过不同的交联剂的缀合物对动物进行加强。也可在重组细胞培养物中将缀合物制备为蛋白融合物。同样，聚集剂如明矾被适当地用于增强免疫响应。

单克隆抗体。可使用本领域已知的任何技术产生单克隆抗体，例如通过使收获自完成免疫计划的转基因动物的脾细胞永生化。可使用本领域已知的任何技术使脾细胞永生化，例如，通过将它们与骨髓瘤融合以产生杂交瘤。例如，单克隆抗体可使用首先由Kohler等，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法制备(例如，Cabilly等，Methods of producing immunoglobulins，vectors andtransformed host cells for use therein，美国专利No.6,331，415)，包括如下方法，如“分解DHFR”方法，其任选地使用可使抗体糖基化的哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞)促进轻链和重链通常等摩尔产生(参见，例如Page，Antibody production，EP0481790A2和美国专利No.5,545,403)。

单克隆。在所述杂交瘤方法中，如本文所述对小鼠或其它合适的宿主动物如大鼠、仓鼠或猕猴进行免疫以诱导产生或能够产生将与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体的淋巴细胞。可选地，可对淋巴细胞进行体外免疫。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。

将制备好的杂交瘤细胞接种并生长在合适的培养基中，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么所述杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞是有效融合、支持所选择的抗体产生细胞产生稳定的高水平抗体，并且对培养基敏感的那些骨髓瘤细胞。还描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。用于产生杂交瘤的融合程序中的骨髓瘤细胞优选地不产生抗体，具有高融合效率，并且具有使它们不能够在支持仅期望的融合细胞(杂交瘤)的生长的某些选择培养基中生长的酶缺乏。用于小鼠融合的合适的细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XXO Bul；用于大鼠融合的细胞系的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210。用于细胞融合的其它细胞系为U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。

测定其中生长杂交瘤细胞的培养基的针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过免疫沉淀反应或通过体外结合测定，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。例如，可通过

或Scatchard分析测定单克隆抗体的结合亲和力(Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)；Fischer等，A peptide-immunoglobulin-conjugate，WO2007/045463A1，实施例10，其全文通过引用的方式并入本文)。

在鉴定杂交瘤细胞产生具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体后，可通过有限稀释过程对克隆进行亚克隆并使其通过标准方法生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。用于此目的的合适的培养基包括例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，如动物中的腹水瘤，杂交瘤细胞可在体内生长。

可对杂交瘤或mAb进行进一步筛选以鉴定具有特定特性如与特定抗原或靶的结合亲和力的mAb。通过常规的免疫球蛋白纯化程序如，蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、亲和色谱或本领域已知的任何其它合适的纯化技术，将由亚克隆分泌的单克隆抗体适当地与培养基、腹水液或血清分离。

抗体和其它多肽的重组产生。本发明提供编码本文描述的本发明的多肽、融合肽或抗原结合蛋白(如抗体(多克隆和单克隆)并包括抗体片段)中的任何一种的分离的核酸，其任选地与由宿主细胞识别的控制序列可操作地连接，载体和宿主细胞包含所述核酸，以及用于产生抗体的重组技术，所述技术包括培养宿主细胞以使核酸表达，并且任选地从宿主细胞培养物或培养基中回收所述抗体。类似的材料和方法用于产生其它多肽。

可通过直接蛋白质测序来测定来自目标免疫球蛋白或多肽的相关氨基酸序列，并且可根据通用密码子表设计合适的编码核苷酸序列。可选地，使用常规的程序(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)可从产生此类抗体的细胞中分离并测序编码单克隆抗体的基因组或cDNA。

使用标准技术进行DNA的克隆(参见，例如，Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Guide，1-3卷，Cold Spring HarborPress，其以引用的方式并入本文)。例如，可通过polyA+mRNA，优选膜相关mRNA的逆转录来构建cDNA文库，并且使用对人免疫球蛋白多肽基因序列特异的探针对文库进行筛选。然而，在一个实施方案中，使用聚合酶链式反应(PCR)扩增编码目标免疫球蛋白基因片段(例如，轻链或重链可变片段)的cDNA(或全长cDNA的部分)。可将扩增的序列容易地克隆到任何合适的载体，例如，表达载体、小基因载体或噬菌体展示载体。将理解，所使用的具体克隆方法不是关键的，只要有可能测定目标免疫球蛋白多肽的一些部分的序列。

抗体核酸的一种来源是通过以下方式产生的杂交瘤：获得来自用目标抗原免疫的动物的B细胞并且使B细胞与永生细胞融合。可选地，核酸可分离自免疫动物的B细胞(或整个脾脏)。编码抗体的核酸的另一个来源是例如通过噬菌体展示技术产生的此类核酸的文库。可通过标准技术如淘选(panning)鉴定编码目标肽(例如，具有期望结合特性的可变区肽)的多核苷酸。

可测定编码免疫球蛋白多肽的整个可变区的序列；然而，有时仅对可变区的部分(例如，CDR编码部分)进行测序就足够。使用标准的技术进行测序(参见，例如，Sambrook等(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Guide，1-3卷，Cold Spring Harbor Press，和Sanger，F.等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：5463-5467，所述参考以引用的方式并入本文)。通过比较克隆核酸的序列与公开的人免疫球蛋白基因和cDNA的序列，根据所测序的区，技术人员将容易地确定(i)杂交瘤免疫球蛋白多肽(包括重链的同种型)的种系片段使用和(ii)重链和轻链可变区的序列，包括由N区添加和体细胞突变过程产生的序列。免疫球蛋白基因序列信息的一种来源是马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院国家医学图书馆国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，National Library of Medicine，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md)。

可将分离的DNA可操作地连接至控制序列或置入表达载体，然后将表达载体转染进不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，以指导单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。抗体的重组产生在本领域是熟知的。

当将核酸置入与另一种核酸序列的功能关系中时，其被可操作地连接。例如，如果将前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽的分泌的前蛋白，那么将前序列或分泌前导序列的DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，那么将启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点定位以有利于翻译，那么将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接意指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且在阅读相(reading phase)中。然而，增强子不必要是连续的。通过在便利的限制性位点连结来完成连接。如果不存在此类位点，那么根据常规的实践使用合成的寡核苷酸适配子或接头。

许多载体在本领域是已知的。载体组分可包括以下一种或多种：信号序列(其可例如指导抗体的分泌；例如，ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCGCGCTGT//SEQ ID NO：9，其编码VK-1信号肽序列MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC//SEQ ID NO：10)、复制起点、一个或多个选择标记基因(其可例如赋予抗生素或其它药物抗性、补充营养缺陷或供应在培养基中不可获得的关键营养物)、增强子元件、启动子和转录终止序列，所有这些组分在本领域是熟知的。

细胞、细胞系和细胞培养物经常可交换地使用并且本文所有这些命名包括子代。转化株和转化细胞包括原代主题细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移的次数。也应理解，由于有意突变或无意突变，所有子代在DNA内容物方面不是精确相同的。包括如在原始转化细胞中筛选的具有相同功能或生物活性的突变子代。

示例性宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。原核宿主细胞包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏杆菌属(Escherichia)例如，大肠杆菌、肠杆菌(Enterobacter)、欧文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志贺氏杆菌(Shigella)，以及杆菌(Bacillus)如枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌(Pseudomonas)和链霉菌(Streptomyces)。真核微生物如丝状真菌或酵母是重组多肽或抗体的合适的克隆或表达宿主。啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、物种和菌株在本文是普遍可用的且有用的，如毕赤酵母属(Pichia)，例如毕赤酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、亚罗酵母(Yarrowia)；念珠菌(Candida)；里氏木酶(Trichoderma reesia)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌如，例如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)和曲霉菌(Aspergillus)宿主如构巢曲菌(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

用于表达糖基化抗体的宿主细胞可衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了来自宿主如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的许多杆状病毒菌株和变体以及相应的容许昆虫宿主细胞。可公开获得多种用于转染此类细胞的病毒菌株，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm-5菌株。

脊椎动物宿主细胞也是合适的宿主，并且由此类细胞重组产生多肽(包括抗原结合蛋白，例如，抗体和抗体片段)已变成常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例为中国仓鼠卵巢细胞，包括CHOK1细胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(亚克隆以在悬浮培养中生长的293或293细胞，[Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977)]；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝癌细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.YAcad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞或FS4细胞；或哺乳动物骨髓瘤细胞。

用上述核酸或载体转化或转染宿主细胞以产生多肽(包括抗原结合蛋白，如抗体)并且在视情况改良的常规营养培养基中培养以诱导启动子、选择转化株或扩增编码期望序列的基因。另外，具有通过选择标记分离的转录单位的多个拷贝的新型载体和转染的细胞系特别用于表达多肽，如抗体。

用于产生本发明中有用的多肽的宿主细胞可在多种培养基中培养。可商购获得的培养基如Ham′s F10(Sigma)、最低必需培养基(MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)(DMEM)，Sigma)适用于培养宿主细胞。另外，在Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利No.4,767,704；No.4,657,866；No.4,927,762；No.4,560,655；或No.5,122,469；WO90103430；WO87/00195；或美国专利Re.No.30,985中描述的培养基中的任何一种可用作宿主细胞的培养基。根据需要，这些培养基的任何一种可用激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如Gentamycin^TM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等价的能量来源进行补充。也可以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必需补充物。培养条件如温度、pH等是先前与所选择用于表达的宿主细胞使用的那些，并且对普通技术人员将是显而易见的。

培养宿主细胞后，重组多肽可在细胞内、周质间隙产生，或直接分泌到培养基中。如果多肽，如抗原结合蛋白(例如，抗体)在细胞内产生，作为第一个步骤，例如通过离心或超滤除去颗粒碎片，宿主细胞或裂解片段。

可使用例如羟基磷灰石色谱、阳离子或阴离子交换色谱或优选的亲和色谱，使用目标抗原或蛋白A或蛋白G作为亲和配体来纯化抗体或抗体片段。蛋白A可用于纯化包括基于人γ1、γ2或γ4重链的多肽的蛋白质(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。推荐蛋白G用于所有小鼠同种型和用于人γ3(Guss等，EMBO J.5：15671575(1986))。与亲和配体连接的基质最通常是琼脂糖，但是其它基质也是可用的。机械稳定的基质如可控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯使达到比用琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。在蛋白质包含C_H3结构域的情况中，Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)用于纯化。根据待回收的抗体，用于蛋白质纯化的其它技术如乙醇沉淀、反向HPLC、聚焦层析、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可能的。

嵌合、人源化、人Engineered ^TM 、

单克隆抗体。其中啮齿动物单克隆抗体的可变Ig结构域与人恒定Ig结构域融合的嵌合单克隆抗体可使用本领域已知标准程序产生(参见Morrison，S.L.，等(1984)Chimeric Human Antibody Molecules；Mouse Antigen BindingDomains with Human Constant Region Domains，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，6841-6855；和Boulianne，G.L.，等，Nature312，643-646.(1984))。已描述了许多技术用于人源化或修饰抗体序列以使其更类似于人(human-like)，例如，方式为(1)将非人互补决定区(CDR)移植到人骨架和恒定区(在本领域称为通过“CDR移植”的人源化的过程；或(2)移植整个非人可变结构域，但是通过置换表面残基用人类似表面将其“掩盖(cloaking)”(在本领域称为“镶饰(veneering)”的过程)；或(3)根据每个残基参与抗原结合或抗体结构的可能性和其免疫性的可能性，修饰所选择的非人氨基酸残基以使其更人化。参见，例如，Jones等，Nature321：522525(1986)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，81：68516855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：6592(1988)；Verhoeyer等，Science239：15341536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)：169217(1994)；和Kettleborough，C.A.等，Protein Eng.4(7)：77383(1991)；Co，M.S.，等(1994)，J.Immunol.152，2968-2976)；Studnicka等，ProteinEngineering7：805-814(1994)；其每个的全文以引用的方式并入本文。

已描述了许多技术用于人源化或修饰抗体序列以使其更类似于人，例如，方式为(1)将非人互补决定区(CDR)移植到人骨架和恒定区(在本领域称为通过“CDR移植”的人源化的过程；或(2)移植整个非人可变结构域，但是通过置换表面残基用人类似表面将其“掩盖(cloaking)”(在本领域称为“镶饰(veneering)”的过程)；或(3)根据每个残基参与抗原结合或抗体结构的可能性和其免疫性的可能性，修饰所选择的非人氨基酸残基以使其更人化。参见，例如，Jones等，Nature321：522525(1986)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，81：68516855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：6592(1988)；Verhoeyer等，Science239：15341536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)：169217(1994)；和Kettleborough，C.A.等，Protein Eng.4(7)：77383(1991)；Co，M.S.，等(1994)，J.Immunol.152，2968-2976)；Studnicka等，Protein Engineering7：805-814(1994)；其每个的全文以引用的方式并入本文。

也可以使用没有内源性免疫球蛋白产生并且被工程化以含有人免疫球蛋白基因座的转基因动物来产生抗体。(参见，例如，Mendez等，Nat.Genet.15：146-156(1997))。例如，WO98/24893公开了具有人Ig基因座的转基因动物，其中由于内源性重链和轻链基因座的失活，动物不产生功能性内源性免疫球蛋白。WO91/10741也公开了能够增加对免疫原的免疫响应的转基因非灵长类哺乳动物宿主，其中抗体具有灵长类恒定和/或可变区，并且其中内源性免疫球蛋白编码基因座被取代或失活。WO96/30498公开了使用Cre/Lox***修饰哺乳动物中的免疫球蛋白基因座，例如以置换恒定区或可变区的全部或部分以形成修饰的抗体分子。WO94/02602公开了具有失活的内源性Ig基因座和功能性人Ig基因座的非人哺乳动物宿主。美国专利No.5,939,598公开了制备转基因小鼠的方法，其中小鼠缺乏内源性重链，并且表达包含一个或多个异种恒定区的外源性免疫球蛋白基因座。

使用上述转基因动物，可产生对选择的抗原分子的免疫应答，并且抗体产生细胞可从动物移除并用于产生分泌人衍生单克隆抗体的杂交瘤。免疫方案、佐剂等是本领域已知的，并且用于免疫例如WO96/33735中所述的转基因小鼠。可测试单克隆抗体的抑制或中和相应蛋白质的生物活性或生理效应的能力。也参见Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；Mendez等，Nat.Genet.15：146-156(1997)；和美国专利No.5,591,669、美国专利No.5,589,369、美国专利No.5,545,807；和美国专利申请No.20020199213。美国专利申请No.和20030092125描述了用于偏置动物对期望表位的免疫响应的方法。人抗体也可通过体外激活的B细胞来产生(参见美国专利No.5,567,610和No.5,229,275)。

通过噬菌体展示技术产生抗体

用于制备重组人抗体基因库的技术的开发，以及将编码的抗体片段展示在丝状噬菌体的表面，已提供了用于产生人衍生抗体的另一种手段。噬菌体展示描述在例如，Dower等，WO91/17271，McCafferty等，WO92/01047，以及Caton和Koprowski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6450-6454(1990)，其每个的全文以引用的方式并入本文。由噬菌体技术产生的抗体通常产生为抗原结合片段，例如在细菌中为Fv或Fab片段，并且因此缺乏效应功能。可通过一种或两种策略引入效应功能：可将片段工程化为用于在哺乳动物细胞中表达的完整抗体，或工程化为具有能够触发效应功能的第二结合位点的双特异性抗体片段。

通常，抗体的Fd片段(V_H-C_H1)和轻链(V_L-C_L)通过PCR单独克隆，并且在组合的噬菌体展示文库中随机重组，然后可选择其用于与特定抗原结合。抗体片段在噬菌体表面表达，并且通过几轮抗原结合和再扩增完成通过抗原结合的Fv或Fab的选择(并且因此噬菌体含有编码抗体片段的DNA)，称为淘选的程序。富集对抗原特异的抗体片段并最终分离。

噬菌体展示技术也可用在对啮齿类动物单克隆抗体进行人源化的方法中，称为“定向选择(guided selection)”(参见Jespers，L.S.，等，Bio/Technology12，899-903(1994))。对于此，可将小鼠单克隆抗体的Fd片段与人轻链文库组合展示，并且然后可用抗原选择所得的杂交Fab文库。因此小鼠Fd片段提供指导选择的模板。随后，将选择的人轻链与人Fd片段文库组合。选择所得文库产生完全人Fab。

已描述了多种程序用于从噬菌体展示文库衍生人抗体(参见，例如，Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)；美国专利No.5,565,332和No.5,573,905；Clackson，T.，和Wells，J.A.，TIBTECH12，173-184(1994))。具体地，体外选择和进化衍生自噬菌体展示文库的抗体已变成强有力的工具(参见Burton，D.R.，和Barbas III，C.F.，Adv.Immunol.57，191-280(1994)；和Winter，G.，等，Annu.Rev.Immunol.12，433-455(1994)；美国专利申请No.20020004215和WO92/01047；2003年10月9日公开的美国专利申请No.20030190317和美国专利No.6,054,287；美国专利No.5,877,293.Watkins，“Screening of Phage-Expressed AntibodyLibraries by Capture Lift，”Methods in Molecular Biology，AntibodyPhage Display：Methods and Protocols178：187-193，并且2003年3月6日公开的美国专利申请公开No.20030044772描述了用于通过捕获解除法(capture lift)筛选噬菌体表达抗体文库或其它结合分子的方法，一种涉及将候选物结合分子固定在固相支持物上的方法。

抗原结合蛋白的其它实施方案

如上所述，抗体片段包含完整全长抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区，并且包括由抗体片段形成的线性抗体和多特异性抗体。抗体片段的非限制性实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fd、结构域抗体(dAb)、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、大抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、小抗体、线性抗体、螯合重组抗体、三抗体(tribody)或双抗体(bibody)、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体、含有VHH的抗体或其突变蛋白或衍生物，以及含有足以赋予多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分，如CDR序列，只要抗体保留期望的生物活性。此类抗原片段可通过修饰整个抗体来产生或使用重组DNA技术或肽合成来重新合成。

另外的抗体片段包括由VH结构域组成的结构域抗体(dAb)片段(Ward等，Nature341：544-546，1989)。

“线性抗体”包含一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的(Zapata等Protein Eng.8：1057-62(1995))。

由经由肽接头(无铰链)或经由IgG铰链与CH3融合的scFv组成的“小抗体”已描述在Olafsen，等，Protein Eng Des Sel.2004年4月；17(4)：315-23。

术语“大抗体”指与免疫球蛋白的Fc区共价连接的二价scFv，参见，例如，Fredericks等，Protein Engineering，Design&Selection，17：95-106(2004)和Powers等，Journal of Immunological Methods，251：123-135(2001)。

缺乏轻链的功能性重链抗体天然存在于某些动物物种中，如护士鲨、须鲨科和骆驼科，如骆驼、单峰骆驼、羊驼和美洲鸵。在这些动物中，将抗原结合位点减至单个结构域，VHH结构域。这些抗体仅使用重链可变区形成抗原结合区，即，这些功能抗体是仅具有结构H2L2的重链的同二聚体(称为“重链抗体”或″HCAb″)。据报道骆驼化VHH与含有铰链、CH2和CH3结构域并缺乏CH1结构域的IgG2和IgG3恒定区重组。典型的仅VH片段难于以可溶形式产生，但是当将骨架残基改变得更类似VHH时，可获得溶解性和特异性结合的改善。(参见，例如，Reichman，等，J Immunol Methods1999，231：25-38。)已发现骆驼化VHH结构域以高亲和力与抗原结合(Desmyter等，J.Biol.Chem.276：26285-90，2001)并且在溶液中具有高稳定性(Ewert等，Biochemistry41：3628-36，2002)。用于产生具有骆驼化重链的抗体的方法描述于例如，美国专利公开No.2005/0136049和No.2005/0037421。可选择的支架可由与鲨鱼V-NAR支架更紧密匹配的类似人可变结构域制备，并且可提供用于长渗透环结构(longpenetrating loop structure)的骨架。

因为重链抗体的可变结构域是最小的全功能抗原结合片段，分子量仅为15kDa，该实体称为纳米抗体(Cortez-Retamozo等，CancerResearch64：2853-57，2004)。如Conrath等，(Antimicrob AgentsChemother45：2807-12，2001)中所述，可从免疫的单峰骆驼产生纳米抗体文库。

合适的重组方法的其它实例和用于由哺乳动物细胞重组表达抗原结合蛋白(包括与本发明的药理学活性毒素肽类似物缀合的二聚体Fc聚合蛋白(“肽抗体(peptibody)”)或嵌合免疫球蛋白(轻链+重链)-Fc异三聚体(“半抗体(hemibody)”))的实施方案的示例性DNA构建体可见于例如，Sullivan等，Toxin Peptide Therapeutic Agents，US2007/0071764和Sullivan等，Toxin Peptide Therapeutic Agents，PCT/US2007/022831，公开为WO2008/088422，其全文都以引用的方式并入本文。

肽

用于本发明的肽或多肽组合物可使用如本文先前所述的重组DNA技术制备，或通过化学肽合成制备。固相合成是制备单独肽的优选技术，因为其是制备小肽的成本效益最好的方法。例如，熟知的固相合成技术包括使用保护基团、接头和固相支持物，以及特异性保护和去保护反应条件、接头裂解条件、使用清除剂和固相肽合成的其它方面。合适的技术是本领域熟知的。(例如，Merrifield(1973)，Chem.Polypeptides，第335-61页(Katsoyannis and Panayotis编著)；Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.85：2149；Davis等(1985)，Biochem.Intl.10：394-414；Stewart和Young(1969)，Solid Phase Peptide Synthesis；美国专利No.3,941,763；Finn等(1976)，The Proteins(第3版)2：105-253；以及Erickson等(1976)，The Proteins(第3版)2：257-527；″ProtectingGroups in Organic Synthesis，″第3版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，编著，John Wiley&Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog，2000；″Synthetic Peptides，A User′s Guide，″G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman&Company，New York，N.Y.，1992；″Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial&Solid Phase Organic Chemistry，″W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，编著，Advanced Chemtech，1998；″Principles of Peptide Synthesis，第2版，″M.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1993；″The Practice ofPeptide Synthesis，第2版，″M.Bodanszky和A.Bodanszky，编著，Springer-Verlag，1994；″Protecting Groups，″P.J.Kocienski，编著，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994；″Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis，A Practical Approach，″W.C.Chan和P.D.White，编著，Oxford Press，2000，G.B.Fields等，Synthetic Peptides：A User′s Guide，1990，77-183)。对于适用于制备本发明主题组合物的本领域已知的合成和纯化方法的其它实例，参见，例如，Sullivan等，Toxin PeptideTherapeutic Agents，US2007/0071764和Sullivan等，Toxin PeptideTherapeutic Agents，PCT/US2007/022831，公开为WO2008/088422A2，其全文都以引用的方式并入本文。

接头

如本文可交换地使用的“接头”或“接头部分”指生物学上可接受的肽基或非肽基有机基团，其与包含在本发明组合物中的多肽链的氨基酸残基(例如，免疫球蛋白HC或免疫球蛋白LC或免疫球蛋白Fc结构域)共价结合，所述接头部分将多肽链与另一个分子或化学部分共价连接或缀合。许多有用的肽基和非肽基接头在本领域是已知的，并且许多详细描述在Sullivan等，Toxin Peptide Therapeutic Agents，US2007/0071764A1。在本发明中采用的组分或试剂中的任何接头部分的存在是任选的。当存在时，接头的化学结构不是关键的，因为其主要用作间隔子以定位、接合、连接或最优化一个功能部分相对于一个或多个其它功能部分的呈现或位置。

通过以下实施例说明本发明，并且这些实施例不旨在以任何方式进行限制。

实施例

实施例1：用于针对KW-0761的中和抗体的筛选测定

开发中的KW-0761(也称为“莫加木珠单抗”或“AMG761”)治疗性药物是人源化IgG1抗CCR4抗体，其通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的机制在体内起作用。(Ishii等，DefucosylatedHumanized Anti-CCR4Monoclonal Antibody KW-0761as a NovelImmunotherapeutic Agent for Adult T-cell Leukemia/Lymphoma，ClinicalCancer Research16：1520-31(2010)；Shitara等，Human CDR-graftedantibody and antibody fragment thereof，美国专利No.7,504,104)。该药物与靶细胞上的人CCR4趋化因子受体和效应细胞上的人FCγRIIIa(CDl6a)结合。结果是效应细胞能够杀死靶细胞。我们开发了双功能靶结合测定的实施方案，其用于通过利用MSD电化学发光(ECL)检测方法检测针对KW-0761的中和抗体(NAb)。图1示出本发明测定的实施方案的示意图，其配置用于检测特异性结合生物素化目标靶蛋白(例如，CCR4)的IgG1靶抗体(例如，KW-0761)，和用于检测血清样本中的中和抗体。

简言之，在本发明的这个实施方案中，含有IgG靶抗体(治疗性药物，例如，KW-0761；Ishii等，Defucosylated Humanized Anti-CCR4Monoclonal Antibody KW-0761as a Novel Immunotherapeutic Agent forAdult T-cell Leukemia/Lymphoma，Clinical Cancer Research16：1520-31(2010)；Shitara等，Human CDR-grafted antibody and antibody fragmentthereof，美国专利No.7,504,104)、待测试血清样本和靶蛋白的多肽部分(例如，生物素-CCR4肽缀合物)的反应混合物加入到板(例如，96孔链霉亲和素涂覆板，MSD目录号L11SA-1，Meso Scale Discovery[MSD]，Gaithersburg，MD)中的链霉亲和素涂覆孔中。将反应混合物在板上培育后，洗涤板，然后加入多组氨酸标记的重组人FCγRIIIa(CD16a)，之后与抗多组氨酸小鼠单克隆抗体培育；如方便的话，也可使用来自不同动物物种的抗多组氨酸单克隆抗体。最后，通过加入硫代-TAG^TM标记的山羊抗小鼠抗体(MSD目录号R32AC-1；如方便的话，也可使用来自不同动物物种的标记抗体，只要抗体与所使用的抗多组氨酸抗体特异性反应)和获自MSD的读取缓冲液T(ReadBuffer T)(MSD目录号R92TC-1)产生电化学发光(ECL)信号。图2示出本发明的该实施方案中测定方法步骤的流程图。如果血清样本含有针对IgG靶抗体的中和抗体，那么IgG靶抗体将能够与捕获在链霉亲和素涂覆孔表面上的生物素-CCR4肽结合。从而，在NAb存在下产生低ECL信号。在NAb不存在时，产生高ECL信号，因为该药物能够在生物素-CCR4肽和组氨酸标记的重组人FCγRIIIa(CD16a)之间建立桥接。如果筛选测定指示NAb的存在，那么推荐验证性测定，如本文实施例2中所述的测定。

筛选测定方案。进行以下详细的测定方案：

1.对96孔板(MSD目录号L11SA-1，Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)中的链霉亲和素涂覆孔的每个孔在环境温度下用150μL测定缓冲液(杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco′s Phosphate BufferedSaline)[pH7.1±0.1；“DPBS”；获自Invitrogen]+1％(v/v)牛血清白蛋白[“BSA”])封闭至少1小时以确保孔的充足封闭。如方便的话，封闭可进行长于1小时，只要封闭的孔在同一天用于本发明测定。封闭后用200μL/孔DPBS洗涤孔一次。所选择的测定缓冲液为负钙或镁双阳离子，然而不认为这些双阳离子干扰本发明测定。

2.在测定缓冲液中制备含有IgG靶抗体KW-0761(20ng/mL终浓度)、血清样本(10％(v/v)终浓度)和生物素-CCR4肽缀合物(80ng/mL终浓度)的反应混合物(50μL/孔)，其中调整体积以满足用于以下步骤3中反应混合物需要转移到其中的孔的数目。

(a)血清样本：10μL50％(v/v)血清样本+30μL在测定缓冲液中稀释的34ng/mL-KW-0761。

(b)制备以下对照样本：

“N”对照：10μL50％(v/v)合并的人血清[来自正常供体](“PHS”；获自Bioreclamation，Inc.，Long Island，NY)+30μL测定缓冲液；或

“D”对照：10μL50％(v/v)PHS+30μL在测定缓冲液中稀释的34ng/mL KW-0761；或

“P”对照：10μL50％(v/v)PHS加入标准的抗KW-0761抗体(兔抗KW-0761多克隆储备液，浓度为1.02mg/mL，在-70℃下储存)+30μL在测定缓冲液中稀释的34ng/mL KW-0761。

通过与等体积的测定缓冲液组合来完成这些对照或血清样本中50％(v/v)PHS的稀释。将以上#2(a)或#2(b)中的样本在环境温度下，在U-形或V-形底聚丙烯板中伴随适度震荡培育1小时(±15分钟)，然后：

(c)将生物素-CCR4肽缀合物(10μL在由在-70℃储存的1mg/mL储备溶液制备的测定缓冲液中稀释的400ng/mL生物素-CCR4肽；一旦解冻，将储备液保持在4℃不超过1个月)等分成以上#2(a)或#2(b)中的样本以形成反应混合物。CCR4的生物素化多肽部分具有以下氨基酸序列：

MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKPK(BIOTIN)-OH//SEQ IDNO：3(购自Midwest Bio-Tech Inc.，目录号MBT3898)；或可选地，MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKPCTK(生物素)-OH//SEQ IDNO：4，其通过常规化学技术合成且生物素化。

3.将以上步骤#2的反应混合物(包括血清样本或对照样本)转移到以上步骤#1的链霉亲和素涂覆板(MSD目录号L11SA-1，MesoScale Discovery，Gaithersburg，MD)上每个指定的孔中。每个孔接收50μL反应混合物。然后在环境温度下将链霉亲和素涂覆板伴随适度震荡培育1小时(±15分钟)，然后将孔用DPBS洗涤三次，每次洗涤200μL/孔。

4.将在测定缓冲液中稀释的50μL80ng/mL多组氨酸标记的重组FCγRIII(获自R&D Systems，目录号4325-FC)加入到链霉亲和素涂覆板上每个指定的孔中，在环境温度下伴随适度震荡培育1小时(±15分钟)，然后将孔用DPBS洗涤三次，每次洗涤200μL/孔。

5.将在测定缓冲液中稀释的100μL1μg/mL小鼠抗多组氨酸Mab(获自R&D Systems，目录号MAB050)加入到链霉亲和素涂覆板上每个指定的孔中，在环境温度下伴随适度震荡培育45-60分钟，然后将孔用DPBS洗涤三次，每次洗涤200μL/孔。

6.将在测定缓冲液中稀释的100μL1μg/mL山羊抗小鼠硫代-TAG^TM(MSD目录号#R32AC-1)加入到MSD板上每个指定的孔中，在环境温度下伴随适度震荡培育30-45分钟(培育过程中将板用箔覆盖)，然后将孔用DPBS洗涤三次，每次洗涤200μL/孔。

7.将150μL1x读取缓冲液T(MSD目录号R92TC-1；用水从4x储备液稀释至1x)加入到每个孔中，并用

Imager6000reader(“MSD6000”；Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)读数。

图3示出在测定缓冲液(0％PHS)或合并的人血清(PHS：5％PHS或20％PHS；(v/v))存在下，本发明测定中KW-0761的代表性剂量响应。

图4证明多克隆抗KW-0761中和抗体的存在以剂量依赖方式抑制KW-0761与生物素化CCR4肽的结合。

实施例2：用于验证性测定的一般蛋白G/L消耗方案

如果本发明筛选测定，例如，如本文实施例1所述，指示血清样本中存在中和抗体，那么推荐敏感性验证性测定。以下验证性测定方案采用来自本文实施例1中所述的筛选测定方案中蛋白G/L培育的血清样本滤液：

1.将蛋白G琼脂糖树脂(Pierce目录号20520)和蛋白L琼脂糖树脂(Pierce目录号22851)以等部分混合，然后将树脂混合物用杜氏磷酸缓冲液(pH7.1±0.1；“DPBS”；获自Invitrogen)稀释以产生50％珠浆(“蛋白G/L”)。(可预先制备大体积的50％珠浆作为试剂，有效期为3个月并且在2℃至8℃储存。)

2.用DPBS稀释Sepharose6B树脂(Sigma目录号6B100)以产生50％珠浆(“Sepharose6B”)。(可预先制备大体积的50％珠浆作为试剂，有效期为3个月并且在2℃至8℃储存。)对于每个用蛋白G/L树脂处理的样本，进行Sepharose6B处理作为对照。可通过蛋白G/L树脂处理而不是Sepharose6B树脂处理除去存在于血清样本中的NAb。

3.保持树脂珠连续悬浮，将120μL蛋白G/L(在以上#1中制备)或Sepharose6B(在以上#2中制备)加载到多层过滤板(例如，Millipore目录号MSHVS4510)的适当孔中。

4.将受体96孔板放置在过滤板(在以上#3中制备)之下，并且使用离心(1000-2000RPM)用DPBS将过滤板洗涤两次(每次洗涤200μL/孔)。从过滤板收集并弃去所有流过物(flow-through)。最终离心应在孔中留下相对干燥的树脂沉淀。

5.通过将一定体积的每种血清样本与等体积的测定缓冲液(杜氏磷酸缓冲液[pH7.1±0.1；“DPBS”；获自Invitrogen]+1％(v/v)牛血清白蛋白[“BSA”])组合来将待测试的血清样本稀释至50％(v/v)。

6.将每种稀释的血清样本加入到相应的蛋白G/L沉淀和Sepharose6B沉淀中。用盖子或顶部密封将过滤板孔盖合。

7.将新鲜制备的受体96孔板放置在过滤板之下作为受体板，并且使用板震荡仪或类似的装置将受体板/过滤板组合充分混合至少30分钟。30分钟的混合之后，在1000-2000RPM对受体板/过滤板组合进行离心以收集受体板中的滤液。

8.将以上#7中收集的滤液直接用于验证性测定，其步骤与本文实施例1中所述的筛选测定程序的步骤相同。对于每种反应混合物，将来自蛋白G/L处理(或Sepharose6B滤液对照)的10μL滤液应加入到30μL在测定缓冲液中稀释的34ng/mL KW-0761(也称为“莫加木珠单抗”或“AMG761”)。在将过滤的血清样本与药物混合物培育(如上文中实施例1，步骤#2(a))后，加入10μL400ng/mL生物素-CCR4以制备完全反应混合物(如上文中实施例1，步骤#2(c))。进行实施例1中步骤#3-7的剩余部分

实施例3：利妥昔单抗靶结合测定

利妥昔单抗(以

获自Genentech，Roche Group的成员)是选择性靶向CD20⁺B细胞的单克隆IgG1治疗性抗体。(Hauser等，B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis，NEJM358：676-88(2008))。被提议的利妥昔单抗作用的机制之一是ADCC。如本文实施例1中所述的对KW-0761开发的靶结合测定形式可适用于利妥昔单抗(在其Fc结构域具有CD16a结合位点)，方式是：(i)用相似量的利妥昔单抗替代上文实施例1步骤#2(a)-(b)中的KW-0761；(ii)用相似量的兔抗利妥昔单抗抗体替代实施例1步骤#2(b)中的兔抗KW-0761抗体；和(iii)用相似量的生物素-CD20肽缀合物(例如，MBT4736：(生物素)-[Ahx]KGGYNCEPA NPSEKNSPST QYCYSIQSL//SEQ ID NO：7；或MBT4737：YNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLK[Ahx]K(生物素)NH₂//SEQ IDNO：8，二者均购自Midwest Bio-Tech Inc.；在其它实施方案中，作为替代使用(生物素)KGGYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSL//SEQ IDNO：5或YNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLKK(Biotin)//SEQ IDNO：6，其通过常规化学技术合成并生物素化)替代上文实施例1步骤#2(c)中的生物素化CCR4肽缀合物。实施例1(#3-7)中的所有其它步骤不经实质修改而直接适用。

以实施例1中所述的相同测定形式进行试验，但修改在于不存在人血清样本并且任何要求的PHS用测定缓冲液(DPBS[pH7.1±0.1]+1％[v/v]牛血清白蛋白)替代，不存在在测定缓冲液中稀释的PHS的“N”对照，不存在具有抗利妥昔单抗抗体的“P”对照，并且以多种浓度的利妥昔单抗进行“D”对照以便允许测定方法中利妥昔单抗的滴定(参见，图5)。加入多组氨酸标记的重组人FCγRIIIa/CD16a以与捕获在链霉亲和素涂覆板上的生物素-CD20肽(SEQ ID NO：7或SEQID NO：8)/利妥昔单抗复合物结合(参见，实施例1，步骤#1)。在如本文实施例1中所有其它方面进一步进行本发明筛选测定。简言之，如实施例1所述，通过加入抗多组氨酸单克隆抗体，然后加入硫代-TAG^TM-标记的山羊抗小鼠抗体和读取缓冲液T来产生ECL信号，并且用

Imager6000reader(“MSD6000”；Meso ScaleDiscovery，Gaithersburg，MD)检测信号。图5示出来自试验的代表性数据，证明利妥昔单抗与生物素化CD20肽缀合物结合并且中实施例1中所述相同的测定形式但在本实施例3中所述修改的测定形式中以剂量依赖性方式可检测。

Claims (38)

1.一种体外测定方法，包括：

在允许生理条件下进行检测的一定体积的新配制缓冲液存在下通过测量信号来检测抗生物素蛋白涂敷孔中特异性结合多组氨酸的任何抗体，所述抗体已结合多组氨酸标记的重组人CD16a多肽，其中所述抗生物素蛋白涂敷孔已被预先封闭，并且随后已在生理条件下将预培育的反应混合物在所述封闭的抗生物素蛋白涂敷孔中培育，其中在其预培育过程中，将所述预培育反应混合物悬浮在含有血清的水性测定缓冲液中，并且所述预培育反应混合物包含：

(i)包含具有CD16a结合位点的Fc结构域的靶抗原结合蛋白；和

(ii)目标靶蛋白的生物素化多肽部分，所述靶抗原结合蛋白与所述多肽部分特异性结合；并且

其中，在所述抗生物素蛋白涂敷孔中培育所述预培育反应混合物之后，在生理条件下将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的多组氨酸标记的重组人CD16a多肽与任何靶抗原结合蛋白一起培育，所述靶抗原结合蛋白已与生物素化多肽部分结合，所述生物素化多肽部分已与所述抗生物素蛋白涂敷孔的抗生物素蛋白结合；并且其中，在通过测量信号进行检测之前，在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的特异性结合多组氨酸的所述抗体与任何多组氨酸标记的重组人CD16a多肽一起在所述孔中培育，所述多组氨酸标记的重组人CD16a多肽已与所述靶抗原结合蛋白结合。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括在检测特异性结合多组氨酸的抗体之前，在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的包含缀合的产生信号的标记的抗体在所述孔中培育的步骤，其中所述抗体特异性结合所述特异性结合多组氨酸的抗体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述预培育反应混合物进一步包含待测试中和抗体的存在的血清样本。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶抗原结合蛋白是IgG1或IgG3抗体。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标靶蛋白是CCR4。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标靶蛋白是CD20。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标靶蛋白是HER2。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗生物素蛋白是链霉亲和素。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述特异性结合多组氨酸的抗体进一步包含缀合的产生信号的标记。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述产生信号的标记包括荧光标记、同位素标记、电化学发光标记或酶。

11.一种体外测定方法，包括：

(a)在生理条件下，将悬浮在含有血清的水性测定缓冲液中的预培育反应混合物在封闭的抗生物素蛋白涂敷孔中培育，所述预培育反应混合物包含：

(iii)包含具有CD16a结合位点的Fc结构域的IgG靶抗体；和

(iv)目标靶蛋白的生物素化多肽部分，所述IgG靶抗体与所述多肽部分特异性结合；

(b)在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的多组氨酸标记的重组人CD16a多肽与任何IgG靶抗体一起在所述孔中培育，所述IgG靶抗体已与生物素化多肽部分结合，所述生物素化多肽部分已与(a)中的所述抗生物素蛋白结合；

(c)在生理条件下，将特异性结合多组氨酸的抗体与任何多组氨酸标记的重组人CD16a多肽一起在所述孔中培育，所述抗体悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中，所述多组氨酸标记的重组人CD16a多肽已与(b)中的所述IgG靶抗体结合；以及

(d)在允许生理条件下进行检测的一定体积的新配制缓冲液的存在下，通过测量信号来检测所述孔中特异性结合多组氨酸的任何抗体，所述抗体已与(c)中的所述多组氨酸标记的重组人CD16a多肽结合。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述预培育反应混合物进一步含有待测试中和抗体的存在的血清样本。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述IgG靶抗体是IgG1或IgG3抗体。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述目标靶蛋白是CCR4。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述目标靶蛋白是CD20。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述目标靶蛋白是HER2。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗生物素蛋白是链霉亲和素。

18.根据权利要求11所述的方法，其中所述特异性结合多组氨酸的抗体进一步包含缀合的产生信号的标记。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述产生信号的标记包括荧光标记、同位素标记、电化学发光标记或酶。

20.根据权利要求11所述的方法，进一步包括在步骤(d)之前，在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的包含缀合的产生信号的标记的抗体在所述孔中培育的步骤，其中所述抗体特异性结合所述特异性结合(c)中的多组氨酸的抗体。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述产生信号的标记包括电化学发光标记。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述电化学发光标记包含钌络合物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述电化学发光标记由N-羟基琥珀酰亚胺酯形成。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述N-羟基琥珀酰亚胺酯具有以下化学结构：

。

25.根据权利要求22所述的方法，其中所述电化学发光标记包含具有下式的钌络合物，其中从羰基绘出的线显示与所述分子的其余部分连接：

。

26.根据权利要求20所述的方法，其中所述产生信号的标记包括荧光标记、同位素标记或酶。

27.根据权利要求14所述的方法，其中所述IgG靶抗体是莫加木珠单抗。

28.根据权利要求15所述的方法，其中所述IgG靶抗体是利妥昔单抗。

29.根据权利要求16所述的方法，其中所述IgG靶抗体是曲妥珠单抗。

30.一种体外测定方法，包括：

(a)在生理条件下，将悬浮在含有血清的水性测定缓冲液中的预培育反应混合物在封闭的抗生物素蛋白涂敷孔中培育，所述预培育反应混合物包含：

(i)包含具有CD16a结合位点的Fc结构域的针对人CCR4的IgG靶抗体；

(ii)待测试中和抗体的存在的血清样本；和

(iii)人CCR4的生物素化多肽部分，所述IgG靶抗体与所述多肽部分特异性结合；

(b)在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的多组氨酸标记的重组人CD16a多肽与任何IgG靶抗体一起在所述孔中培育，所述IgG靶抗体已与人CCR4的所述生物素化多肽部分结合，所述人CCR4的生物素化多肽部分已与(a)中的所述抗生物素蛋白结合；

(c)在生理条件下，将特异性结合多组氨酸的抗体与任何多组氨酸标记的重组人CD16a多肽一起在所述孔中培育，所述抗体悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中，所述多组氨酸标记的重组人CD16a多肽已与(b)中的所述IgG靶抗体结合；

(d)在生理条件下，将悬浮在一定体积的新配制测定缓冲液中的包含缀合的产生信号的标记的抗体在所述孔中培育，其中所述抗体特异性结合所述特异性结合(c)中的多组氨酸的抗体；以及

(e)在允许生理条件下进行检测的一定体积的新配制缓冲液的存在下，检测所述孔中所产生的任何信号。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述产生信号的标记包括电化学发光标记。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述电化学发光标记包含钌络合物。

33.根据权利要求32所述方法，其中所述电化学发光标记由N-羟基琥珀酰亚胺酯形成。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述N-羟基琥珀酰亚胺酯具有以下化学结构：

。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述电化学发光标记包含具有下式的钌络合物，其中从羰基绘出的线显示与所述分子的其余部分连接：

。

36.根据权利要求30所述的方法，其中所述产生信号的标记包括荧光标记、同位素标记或酶。

37.根据权利要求30所述的方法，其中所述抗生物素蛋白是链霉亲和素。

38.根据权利要求30所述的方法，其中所述IgG靶抗体是莫加木珠单抗。

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