JP4187796B2 - 酵母で発現されたｎ末端伸長タンパク質 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、酵母中で産生されるポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするDNA配列を具備するDNA構築物、このようなDNA断片を担持するベクター、及び該ベクターで形質転換された酵母細胞、並びに酵母で異種タンパク質を産生する方法に関する。
発明の背景
酵母生物は、細胞内で合成されるが、細胞外で機能する多数のタンパク質を産生する。このような細胞外タンパク質は、分泌タンパク質と称される。まず、これらの分泌タンパク質は、発現された産物が小胞体（ER reticulum）の膜を効果的に通過させるためのプレペプチド配列を含有する前駆体又はプレフォームとして細胞内で発現される。通常シグナルペプチドと称されるプレペプチドは、移動中に、所望の産物から切除されるのが一般的である。分泌経路に入ると、該タンパク質はゴルジ体に送られる。ゴルジからは、タンパク質は、細胞液胞若しくは細胞膜のようなコンパートメントに至る種々のルートをたどり、又は細胞から外の培地に分泌されるルートを取り得る（Pfeffer,S.R.及びRothman,J.E.Ann.Rev.Biochem.56（1987）,829〜852）。
酵母にとって異種のタンパク質を酵母で発現して分泌するための幾つかのアプローチが提案されている。欧州特許第0088632Aは、所望のタンパク質とシグナルペプチドをコードするDNAを有する発現ベクターにより、酵母生物を形質転換し、該形質転換された生物の培養を準備し、該培養を増殖させ、培地からタンパク質を回収することによって、酵母にとって異種のタンパク質を発現し、プロセッシングし、分泌させる方法を記載している。シグナルペプチドは、所望のタンパク質自身のシグナルペプチド、すなわち異種のシグナルペプチド、又は同種と異種のシグナルペプチドのハイブリッドであり得る。
酵母にとって異種のシグナルペプチドを使用することに伴う問題点は、異種のシグナルペプチドでは、確実に効率的な移動（translocation）及び/又はシグナルペプチドの後ろでの切断が起こらないということであり得る。
サッカロミセス・セレビシエMFα1（α因子）は、64アミノ酸長の「リーダー」ペプチド又はプロペプチドが続く19アミノ酸長のシグナルペプチド又はプレペプチドを具備し、（LysArg（Asp/Glu,Ala）2-3α因子）4が続く３つのN結合型グリコシル化部位を包含する165アミノ酸のプレプロ型として合成される（Kurjan,J.及びHerskowitz,I.Cell 30（1982）,933-943）。プレプロMFα1のシグナルリーダー部は、サッカロミセス・セレビシエで異種のタンパク質を合成、分泌するために広く利用されてきた。
酵母にとって同種のシグナル／リーダーペプチドの使用は、とりわけ、米国特許第4,546,082号、欧州特許公開第0116201A号、第0123294A号、第0123544A号、第0163529A号、第0123289A号、欧州特許第0100561B、及びPCT公報第WO95/02059号に認められる。
欧州特許第0123289A号には、サッカロミセス・セレビシエα因子前駆体の利用が記載されているのに対し、欧州特許第0100561号は、サッカロミセス・セレビシエPHO5シグナルの利用を記載しており、WO95/02059号は、外来タンパク質を分泌するためのYAP3シグナルペプチドの利用を記載している。
米国特許第4,546,082号、欧州特許公開第0016201A号、第0123294A号、第0123544A号、第0163529A号は、酵母で発現された異種タンパク質の分泌過程において、サッカロミセス・セレビシエ（MFα1又はMFα2）のα因子シグナルリーダーを利用する方法を記載している。所望のタンパク質の遺伝子の5’末端にサッカロミセス・セレビシエMFα1シグナル／リーダーペプチドをコードするDNA配列を融合することによって、所望のタンパク質の分泌及びプロセッシングが実証された。
欧州特許第0206783号は、サッカロミセス・セレビシエからポリペプチドを分泌させるためのシステムであって、ネイティブ配列上に存在する４つのα因子ペプチドを除去するためにα因子シグナル／リーダー配列の末端を切断して、α因子プロセッシング部位Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Alaを介して異種のポリペプチドに融合したシグナル／リーダーペプチド自体は残存せしめるシステムを開示している。該構築物は、より小さいペプチド（50アミノ酸未満）を産生する効率的なプロセスをもたらす。より大きいポリペプチを分泌させ、プロセッシングするためには、リーダーペプチドとポリペプチドの間に１又は２のα因子ペプチドが残るように、ネイティブα因子リーダー配列の末端を切断する。
多くの分泌タンパク質は、連続する２つの塩基性アミノ酸のカルボキシル末端のペプチド結合を切断し得るタンパク質分解プロセッシングシステムに、前駆体が露出されるように輸送される。サッカロミセス・セレビシエでは、該酵素活性は、KEX2遺伝子によってコードされている（Julius,D.A.ら、Cell 37（1984b）,1075）。KEX2プロテアーゼによる産物のプロセッシングは、活性なサッカロミセス・セレビシエ接合因子α1（MFα1（mating factor α1）又はα因子）の分泌には必要とされるが、活性なサッカロミセス・セレビシエ接合因子ａの分泌には関与していない。
あるケースでは、分泌させたいポリペプチドの分泌及び正しいプロセッシングは、上掲の参照文献に示されているように構築したベクターで形質転換した酵母生物を培養すると得られる。しかしながら、多くの場合、分泌レベルは極めて低いか、又は全く分泌されないか、又はタンパク質分解プロセッシングが不正確若しくは不完全であり得る。PCT公開第WO90/10075に記載されているように、これは、ある程度は、リーダーペプチドのC末端と異種タンパク質のN末端の間に存在するプロセッシング部位の露出が不十分であるために、タンパク質分解による切断、とりわけKEX2プロテアーゼによる切断へのアクセスが不能となる、又はアクセスが悪くなることによると考えられている。
WO90/10075は、リーダーペプチドのC末端及び/又はリーダーペプチドに融合された異種ポリペプチドのN末端に存在するプロセッシング部位の近傍にある種の修飾を加えることによって得られる、異種ポリペプチドのプロセッシングが改善された酵母発現システムを記載している。このため、未修飾のリーダーペプチド−異種ポリペプチド構造物を用いた場合に比べて、より高い収率で正しくプロセッシングされたタンパク質を得ることができる。
さらに、WO95/35384は、培地からの精製前に酵母のプロテアーゼによって、又は培地から産物を精製している間若しくはその後のインビトロタンパク質分解によって切除され得る伸長部としてデザインされた異種ポリペプチドのN末端の修飾を有するポリペプチドをコードするDNA構築物を記載している。前記ポリペプチドは、シグナルペプチド−リーダーペプチド-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-異種タンパク質という式であり、ここでX1-X2は、Lys-Argのような２塩基酵母プロテアーゼプロセッシング部位であり、配列X3-X4-X5-X6-X7は、EEGEPKを含んでいない。
発明の概要
本発明は、培地から産物を精製している間若しくは精製後のインビトロタンパク質分解によって切除され得る伸長部としてデザインされた異種ポリペプチドのN末端の修飾の改善であって、高収量の均一な異種タンパク質産物をもたらす改善を記載する。
本発明は、以下の構造を有するポリペプチド配列をコードするDNA構築物に関する。
SP-LP-EEGEPK-★ポリペプチド★
ここで、SPは、シグナルペプチドをコードするDNA配列であり、
LPは、リーダーペプチドをコードするDNA配列であり、
EEGEPKは、タンパク質又は産生すべき他のポリペプチドであり、その後に続く★ポリペプチド★のN末端伸長部として配置されたアミノ酸配列である。
本記載及び請求の範囲を通じて、IUPAC-IUB生物化学命名委員会によって承認された規則（1974）に適合する伝統的な一文字アミノ酸コードを使用する。
本発明のN末端伸長部の作用機序について、何ら特定の理論に拘泥するものではないが、α因子リーダーの反復したGluAlaに比べて、N末端伸長部にグリシン（G）を配置すると、異種タンパク質の収量が改善されることは驚くべきことであり、移動及び／又は分泌が改善され得ることを反映しているが、側鎖として水素原子のみを有するグリシンは、他のアミノ酸残基に比べて、ずっと広範なコンフォメーションをとることができ、このため異常なコンフォメーションの主鎖、及びより不安定な前駆体ポリペプチド及び分泌過程を取り得るためである。
配列EEGEPKは、異種ポリペプチドのN末端に伸長部を形成する。該伸長部は、発酵収率を増加させるのみならず、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（DPAPA）プロセッシングから保護され、ポリペプチドの均一なN末端をもたらす。その後に行われる、例えば、トリプシン又はアクロモバクター・リティカス（Achromobacter lyticus）プロテアーゼIのような塩基性アミノ酸に特異的なプロテアーゼによる、インビトロでのタンパク質分解による成熟化のために、N末端伸長異種タンパク質産物を培地から精製できるようにするため、発酵中のタンパク質分解による切断に耐え得るように該伸長部を構築する。N末端伸長部EEGEPKの望ましいインビトロ除去は、おそらくN末端伸長ペプチドの柔軟性故に、トリプシン又はアクロモバクター・リティカスプロテアーゼIの何れかによって、容易に達成され、成熟した異種タンパク質の収量が改善される。
本明細書において、「シグナルペプチド」とは、酵母で発現される前駆体型の細胞外タンパク質上にN末端配列として存在するプレペプチドを意味するものと理解される。シグナルペプチドの機能は、分泌された異種タンパク質が小胞体中に入れるようにすることである。シグナルペプチドは、通常、このプロセスの間に切除される。シグナルペプチドは、タンパク質を産生する酵母生物にとって、異種又は同種であり得る。本発明において好ましいシグナルペプチドは、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3（YAP3）シグナルペプチド又は任意の機能的なその類縁体である。YAP3は、イーゲル-ミタニらによって、クローニングされ、特性も決定されている（Egel-Mitani,M.et al.,YEAST,6,p.127-137,1990）。
「リーダーペプチド」なる表現は、分泌される異種タンパク質を小胞体からゴルジ装置へ、さらに培地中に分泌するための分泌小胞に誘導することが（すなわち、細胞壁を横切って、又は細胞膜を通過して少なくとも細胞の周辺腔の中に、発現されたタンパク質又はポリペプチドを排出する）、その機能であるポリペプチド配列を指すものと理解される。好ましくは、本発明で用いられるリーダーペプチドは、以下のリーダーペプチド群；
から選択される。
PCT/DK95/00249において配列番号1〜28の表記で開示され、全てLys-Arg配列及び任意の機能的なその類縁体がC末端の後ろに続いており、より好ましくは該リーダーペプチドは、リーダーペプチド（LA19）：
（PCT/DK95/00249で配列番号67と表記され、C末端LysArgプロセッシング部位、又は任意の機能的なその類縁体を含有している）のような、43又はそれ以上のアミノ酸配列を有する。本発明のDNA構築物では、リーダーペプチドは、C末端終末にLys-Arg配列のようなエンドペプチダーゼプロセッシング部位を含有していることが好ましい。
本発明のDNA構築物によってコードされるさらに好ましいリーダーペプチドは、
である。
「異種タンパク質」なる表現は、本来宿主の酵母生物によって産生されないタンパク質又はポリペプチドを示すために用いる。
さらなる側面では、本発明は、酵母に異種タンパク質を産生させる方法であって、異種タンパク質の発現及び分泌を得るために、形質転換された酵母株を適切な培地で培養した後、培地からタンパク質を単離することを具備する方法に関する。
発明の詳細な記述
本発明の方法によって産生されたN末端伸長異種タンパク質は、酵母で有利に産生され得る任意のタンパク質であり得る。このようなタンパク質の例は、アプロチニン、組織因子系凝固インヒビター又は他のプロテアーゼ阻害剤、及びインシュリン又はインシュリン前駆体、インシュリン類縁体、IGFI及びIGFIIのようなインシュリン様増殖因子、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド-1（GLP 1）、グルカゴン様ペプチド-2（GLP 2）、GRPP、第VII因子、第VIII因子、第XIII因子、血小板由来増殖因子、リパーゼのような酵素、又はこれらのタンパク質うちの任意の１つの機能的類縁体である。好ましいタンパク質は、インシュリン及びインシュリン様増殖因子の前駆体、及びGLP-1（1-45）、GLP-1（1-39）、GLP-1（1-38）、GLP-1（1-37）、GLP-1（1-36）、GLP-1（1-35）、GLP-1（1-34）、GLP-1（7-45）、GLP-1（7-39）、GLP-1（7-38）、GLP-1（7-37）、GLP-1（7-36）、GLP-1（7-35）、及びGLP-1（7-34）のような末端切断された型を含むグルカゴン、GLP 1、GLP 2、及びGRPPのようなプログルカゴンファミリーのペプチドである。
本明細書において、「機能的類縁体」なる語は、ネイティブタンパク質と類似の機能を有するポリペプチドを指すものとする（これは、ネイティブタンパク質の生物活性のレベルよりも、性質に関するものとして理解せねばならない）。該ポリペプチドは、ネイティブタンパク質と構造的に類似したものであり得、ネイティブタンパク質のC末端及びN末端の一方又は双方に１以上のアミノ酸を付加することによって、ネイティブアミノ酸配列中の１又は多数の異なる部位のアミノ酸を１以上置換することによって、ネイティブタンパク質の一端若しくは両端のアミノ酸、又は該アミノ酸配列中の１若しくは数個の部位のアミノ酸を１以上欠失させることによって、又はネイティブアミノ酸配列中の１以上の部位にアミノ酸を１以上挿入することによって、ネイティブタンパク質から作出してもよい。このような修飾は、上述した幾つかのタンパク質について周知である。
プロインシュリン並びに末端切断された及び/又は修飾されたCペプチドを有する前駆体、又は完全にCペプチドを欠く前駆体を含むインシュリンの前駆体、インシュリン類縁体の前駆体、及びインシュリン様増殖因子のようなインシュリン関連ペプチドは、ヒト由来、又は他の動物からのもの、及び組換え又は半合成的な入手源のものであり得る。本発明の方法において、インシュリンの前駆体、インシュリン類縁体の前駆体、又はインシュリン関連ペプチドの発現に使用されるcDNAには、酵母での発現用にコドンが最適化された型が含まれる。
「インシュリンの前駆体」又は「インシュリン類縁体の前駆体」とは、その後に行う１以上の化学的及び/又は酵素的プロセスによって、天然のヒトインシュリンに見られるような３つのジスルフィド架橋が正しく確立された二本鎖インシュリン又はインシュリン類縁体分子に転換され得る一本鎖ポリペプチドと理解すべきである。好ましいインシュリン前駆体は、Ml1,B（1-29）-A（1-21）;（例えば、EP 163529に記載されているような）Ml3,B（1-29）-Ala-Ala-Lys-A（1-21）;（例えば、PCT公開番号95/00550に記載されているような）X14,B（1-27-Asp-Lys）-Ala-Ala-Lys-A（1-21）;B（1-27-Asp-Lys）-A（1-21）;B（1-27-Asp-Lys）-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A（1-21）;（例えば、PCT公開番号95/07931に記載されているような）B（1-29）-Ala-Ala-Arg-A（1-21）;Ml5,B（1-29）-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A（1-21）;及びB（1-29）-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A（1-21）、より好ましくはMl1,B（1-29）-A（1-21）、Ml3,B（1-29）-Ala-Ala-Lys-A（1-21）、及びMl5,B（1-29）-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A（1-21）である。
このように作成することが可能なインシュリン又はインシュリン類縁体の例は、ヒトインシュリン、好ましくはdes（B30）ヒトインシュリン、ブタインシュリン；及び少なくとも１つのLys又はArgが存在するインシュリン類縁体、好ましくはPheB1が欠失されたインシュリン類縁体、A鎖及び/又はB鎖がN末端伸長部を有しているインシュリン類縁体、A鎖及び/又はB鎖がC末端伸長部を有しているインシュリン類縁体である。他の好ましいインシュリン類縁体は、１以上のアミノ酸残基、好ましくはそれらの1、2、又は３が、他のコード可能なアミノ酸残基によって置換されているようなものである。このように、親インシュリンのA21位は、Asnの代わりに、Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValを含む群から選択されるアミノ酸残基、特にGly、Ala、Ser、及びThrを含む群から選択されるアミノ酸残基を有し得る。インシュリン類縁体は、先に概説した変化の組み合わせによって修飾してもよい。同様に、親インシュリンのB28位は、Proの代わりに、Asp及びLysを含む群から選択されるアミノ酸残基、好ましくはAspを有してもよく、親インシュリンのB29位は、Lysの代わりにアミノ酸Proを有してもよい。
本明細書において、「コード可能なアミノ酸残基」なる表現は、遺伝子コード、すなわちヌクレオチドのトリプレット（「コドン」）によってコードされ得るアミノ酸残基を指すために用いる。
本発明のポリペプチドをコードする本発明のDNA構築物は、確立された標準的方法、例えばボカージとカルサーによって記載されたホスホアミダイト法（S.L.Beaucage and M.H.Caruthers,Tetrahedron Letters 22,1981,pp.1859-1869）又はマッシュらによって記載された方法（Matthes et al.,EMBO Journal 3,1984,pp,801-805）によって合成的に調製し得る。
ホスホアミダイトによれば、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成装置で合成され、精製して、二重にして、連結させて合成DNA構築物を形成せしめる。DNA構築物を調製する方法として現在好まれているのは、例えば、サンブルックらの分子クローニング：ラボラトリーマニュアル（Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manua1,Cold Spripg Harbor,NY,1989）に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるものである。
本発明のDNA構築物は、例えば、ゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーを調製して、標準的な手法（Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,1989参照）に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションを行うことによって、本発明のポリペプチドの全部又は一部をコードするDNA配列をスクリーニングすることによって、得られるゲノム又はcDNA由来のものでもあり得る。この場合、異種タンパク質をコードするゲノム又はcDNA配列にシグナルペプチド及びリーダーペプチドをコードするゲノム又はcDNA配列を連結してもよく、その後、周知の操作に従って、相同性組換え用の所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入するか、好ましくは適切なオリゴヌクレオチドを用いるPCRによって所望の配列を作成することによって、ポリペプチドのアミノ酸配列EEGEPKに相当する部位で、DNA配列を修飾してもよい。
最後に、該DNA構築物は、標準的な手法で、合成、ゲノム、又はcDNA由来の断片（適切なもの）をアニールすることによって調製した合成とゲノムの混合、合成とcDNAの混合、又はゲノムとcDNAの混合由来のものであり得、該断片は完全なDNA構築物の様々な部分に対応している。このように、異種タンパク質をコードするDNA配列は、ゲノム又はcDNA由来であり得るのに対して、シグナルペプチド及びリーダーペプチドをコードする配列並びにN末端伸長EEGEPKをコードする配列は、合成的に調製し得ることが想像できよう。
さらなる側面では、本発明は、酵母で複製することができ、上述のポリペプチドをコードするDNA構築物を担持する組換え発現ベクターに関する。組換え発現ベクターは、酵母生物中で複製し得る任意のベクターであり得る。ベクター中で、本発明のポリペプチドをコードするDNA配列は、作用可能に適切なプロモーター配列に接続しなければならない。プロモーターは、酵母で転写活性を示す任意のDNA配列であり得、酵母にとって同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来するものであり得る。プロモーターは、同種のタンパク質をコードする遺伝子に由来することが好ましい。適切なプロモーターの例は、サッカロミセス・セレビシエMα1、TPI、ADH、又はPGKプロモーターである。
本発明のポリペプチドをコードするDNA配列は、適切なターミネーター、例えばTPIターミネーター（T.Alber and G.Kawasaki,J.Mol.Appl.Genet.1,1982,pp.419-434）に、作用可能に接続してもよい。
本発明の組換え発現ベクターは、ベクターが酵母で複製できるようにするDNA配列を具備する。このような配列の例は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子REP1-3及び複製起点である。ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、ラッセルによって記載されたスキゾサッカロミセスポンペ（Schizosaccharomyces pompe）noTPI遺伝子を具備してもよい（P.R.Russell,Gene 40,1985,pp.125-130）。
本発明のポリペプチドをコードするDNA配列、プロモーター、及びターミネーターをそれぞれ連結するために用いられる操作、及び酵母の複製に必要な情報を含有する適切な酵母ベクター中にそれらを挿入する操作は、当業者に周知である（例えば、Sambrookら、前掲参照）。ベクターは、まず本発明のポリペプチドをコードする完全なDNA配列を含有するDNA構築物を調製し、続いて適切な発現ベクター中に該断片を挿入するか、又は（シグナル、リーダー、若しくは異種タンパク質等の）各要素に対する遺伝情報を含有するDNA断片を順次挿入した後に連結して構築してもよい。
本発明の方法で用いる酵母生物は、培養したときに、所望の異種タンパク質又はポリペプチドを大量に産生する任意の適切な酵母生物であり得る。適切な酵母生物の例は、酵母種サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、スキゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロミセス・ウバラム（Saccharomyces uvarum）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ハンセニュラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）、ピヒア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピヒア・クルイベリ（Pichia kluyveri）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ種、カンジダ・ユーティリス（Candida utilis）、カンジダ・カカオイ（Candida cacaoi）、ゲオトリカム種、ゲオトリカム・ファーメンタンス（Geotrichum fermentans）から選択される株であり得る。宿主生物として、アスペルギルス属の細胞のような他の任意の真菌細胞を選択することは当業者にとって明らかであると考えられる。
酵母細胞の形質転換は、例えば、プロトプラストを形成させた後に、それ自体は公知の方法で形質転換することによって実施してもよい。該細胞を培養するために用いる培地は、酵母生物を増殖するのに適した任意の従来の培地であり得る。分泌された異種タンパク質（かなりの割合で、正しくプロセッシングされた型として培地中に存在するであろう）は、遠心又はろ過によって培地から酵母細胞を分離し、塩、例えば、硫酸アンモニウムによって上清又はろ液のタンパク質成分を沈殿させた後、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の様々なクロマトグラフィー操作による精製を含む従来の操作によって培地から回収し得る。培地への分泌後、該タンパク質は、配列EEGEPKを除去するための様々な操作にかけることができる。
発酵の間、伸長部は異種タンパク質に安定に接着して、DPAPのような酵母プロテアーゼのタンパク質分解活性から異種タンパク質のN末端を保護することが見出される。異種タンパク質にN末端伸長部が存在していることは、タンパク質の化学的なプロセッシングの間に異種タンパク質のN末端アミノ基を保護する役割、すなわちBOC（t-ブチル-オキシカルボニル）又は類似の保護基の代替物としての役割も果たし得る。このような場合、アミノ酸配列EEGEPKは、末端伸長部がKの位置で切除されるように、塩基性アミノ酸（すなわち、K（Lys））に特異的なタンパク質分解酵素によって、該回収された異種タンパク質から除去し得る。このようなタンパク質分解酵素の例は、トリプシン又はアクロモバクター・リティカスプロテアーゼIである。
以下の例で、本発明をさらに詳細に記載するが、いかなる意味においても、請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
以下の図を参照しながら本発明を記載する。
図１は、本発明のN末端伸長ポリペプチドを発現する遺伝子を含有する発現プラスミドpAK773を示している。図１では、以下の記号が用いられている。
TPIプロモーター：サッカロミセス・セレビシエからのTPI遺伝子プロモーター配列を指す。
2：（例えば、EEGEPKでN末端が伸長されたMl3インシュリン前駆体に連結されたYAP3シグナルペプチド及びLA19リーダーペプチドの）シグナル／リーダーペプチドをコードする領域を指す。
TPIターミネーター：サッカロミセス・セレビシエのTPI遺伝子ターミネーター配列を指す。
TPIポンベ：サッカロミセス・ポンベからのTPI遺伝子を指す。
起点：サッカロミセス・セレビシエのDNA複製起点を含むサッカロミセス・セレビシエ２μプラスミドからの配列を指す。
AMP-R：アンピシリン耐性遺伝子と大腸菌のDNA複製起点を含むpBR322/pUC13からの配列。
図２は、YAP3シグナルペプチド（アミノ酸番号１〜21）LA19リーダーペプチド（アミノ酸番号22〜64）、N末端伸長部EEGEPK（アミノ酸番号65〜70）、Ml3インシュリン前駆体B鎖（1-29）-Ala-Ala-Lys-A鎖（1-21）（アミノ酸番号71〜123）をコードするpAK773のDNA及びアミノ酸配列を示している。
図３は、本発明のN末端伸長ポリペプチドを発現する遺伝子を含有する発現プラスミドpAK729を示し、以下の記号が用いられている。
TPIプロモーター：サッカロミセス・セレビシエからのTPI遺伝子プロモーター配列を指す。
2：（例えば、EEAEPKでN末端が伸長されたMl3インシュリン前駆体に連結されたYAP3シグナルペプチド及びLA19リーダーペプチドの）シグナル／リーダーペプチドをコードする領域を指す。
TPIターミネーター：サッカロミセス・セレビシエのTPI遺伝子ターミネーター配列を指す。
TPIポンベ：サッカロミセス・ポンベからのTPI遺伝子を指す。
起点：サッカロミセス・セレビシエのDNA複製起点を含むサッカロミセス・セレビシエ２μプラスミドからの配列を指す。
AMP-R：アンピシリン耐性遺伝子と大腸菌のDNA複製起点を含むpBR322/pUC13からの配列。
例
EEGEPK-Ml3インシュリン前駆体を発現する酵母株yAK773の構築
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、N末端伸長インシュリン前駆体EEGEPK-Ml3のN末端伸長部をコードする合成遺伝子を構築した。
以下の２つのオリゴヌクレオチドを合成した。
#724 5’-GATCTCCATGGCTAAGAGAGAAGAAXYTGAACCAAAGTTCGTTAACC-3’、ここでXはA又はG、YはT、A、又はG、
オリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイド化学及び市販の試薬を用いて（Beaucage,S.L.and M.H.Caruthers,Tetrahedron letters 22,（1981）,1859-1869）、自動DNA合成装置（アプライド・バイオシステムズ、モデル380A）を用いて合成した。
エキスパンド・ハイ・フィデリティー・エンザイム・ミックス（Expand High Fidelity Enzyme mix）（Boehringer Mannheim GmbH,Sandhoefter Strasse 116,Mannheim,Germany）を用いて、製造者の指示書に従って、以下のPCRを行い、該PCRミックスに、100μLのミネラルオイル（Sigma Chemical Co.,St.Louis MO,USA）を重層した。
PCR
オリゴヌクレオチド#724 ５μL（計100pmol）
オリゴヌクレオチド#2371 ５μL（計100pmol）
10×PCR緩衝液10μL
dNTPミックス８μL
エクスパンド・ハイ・フィデリティー・エンザイム・ミックス0.75μL
テンプレートとしてpAK729プラスミド0.5μL（0.2μg DNA）
蒸留水70.75μL
１サイクルが94℃45秒；37℃1分；72℃1.5分で、合計18サイクル行った。続いて、2.5％アガロースゲル上に、該PCR混合物を載せて、標準的な手法を用いて電気泳動を行った（Sambrook J,Fritsch EI and Maniatis T,Molecular cloning,Cold Spring harbour laboratory press,1989）。アガロースゲルから、得られたDNA断片を切断して、製造者の指示書に従って、ジーン・クリーン・キット（Gene Clean Kit,Bio 101 inc,PO BOX 2284,La Jolla,CA 92038,USA）によって単離した。
該精製したPCR DNA断片を14μLの水と制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に溶かして、標準的な手法に従って（Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T,Molecular cloning,Cold spring Harbour laboratory press,1989）、制限エンドヌクレアーゼNcoI及びXbaIによって切断した。209ヌクレオチド塩基対上のNcoI-XbaI DNA断片をアガロース電気泳動にかけ、既述のようにザ・ジーン・クリーン・キットを用いて精製した。
制限エンドヌクレアーゼBgIII及びXbaIを用いて、プラスミドpAK721（図３参照）を切断し、既述のようにザ・ジーン・クリーン・キットを用いて、10849ヌクレオチド塩基対のベクター断片を単離した。
制限エンドヌクレアーゼBgIII及びNcoIを用いて、プラスミドpAK721を切断し、既述のようにザ・ジーン・クリーン・キットを用いて、160ヌクレオチド塩基対のDNA断片を単離した。
T4 DNAリガーゼと標準的な条件（Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T,Molecular cloning,Cold spring Harbour laboratory press,1989）を用いて、３つのDNA断片を連結した。次に、コンピテント大腸菌株（R-，M+）の中に該連結混合物を形質転換した後、アンピシリン耐性により選別した。
標準的な手法（Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T,Molecular cloning, Cold Spring Harbour laboratory press,1989）を用いて、得られた大腸菌のプラスミドを単離し、適切な制限エンドヌクレアーゼ、すなわちBgIIIとNheIを用いてインサートチェックを行った。DNA配列分析（Sequenase,U.S.Biochemical Corp.,USA）によって、選択したプラスミドが、EEGEPK-Ml3インシュリン前駆体DNAの正しいDNA配列をコードしており、合成LA19リーダーDNAをコードするDNAの後ろに挿入されていることが示された。
該プラスミドは、pAK773と名付けた。
YAP3シグナルペプチド-LA19リーダーEEGEPK-Ml3インシュリン前駆複合体をコードするDNA配列が、図２に示されている。
PCT/DK95/00250に記載されているように、サッカロミセス・セレビシエ株MT663にプラスミドpAK773を形質転換し、得られた株をyAK773と名付けた。
酵母発現プラスミドpAK773は、C-POTタイプであり（図１参照）、プラスミド選択及びサッカロミセス・セレビシエ中での安定化のためのスキゾサッカロミセス・ポンベのトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子（POT）を含有するWO EP 171 142号に記載されているものと類似している。pAK773は、サッカロミセスセレビシエのトリオースホスフェートイソメラーゼプロモーター及びターミネーターも含有している。EcoRIXbaI断片の間の配列を除くプラスミド中の全配列が、YAPeシグナルペプチド−LA19リーダーペプチド−EEGEPK-Ml3インシュリン前駆体をコードしているので、該プロモーターとターミネーターは、プラスミドpKFN1003（WO 90／100075）に記載されているものと似ている。
配列表
本発明は、酵母中で産生されるポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするDNA配列を具備するDNA構築物、このようなDNA断片を担持するベクター、及び該ベクターで形質転換された酵母細胞、並びに酵母で異種タンパク質を産生する方法に関する。
発明の背景
酵母生物は、細胞内で合成されるが、細胞外で機能する多数のタンパク質を産生する。このような細胞外タンパク質は、分泌タンパク質と称される。まず、これらの分泌タンパク質は、発現された産物が小胞体（ER reticulum）の膜を効果的に通過させるためのプレペプチド配列を含有する前駆体又はプレフォームとして細胞内で発現される。通常シグナルペプチドと称されるプレペプチドは、移動中に、所望の産物から切除されるのが一般的である。分泌経路に入ると、該タンパク質はゴルジ体に送られる。ゴルジからは、タンパク質は、細胞液胞若しくは細胞膜のようなコンパートメントに至る種々のルートをたどり、又は細胞から外の培地に分泌されるルートを取り得る（Pfeffer,S.R.及びRothman,J.E.Ann.Rev.Biochem.56（1987）,829〜852）。
酵母にとって異種のタンパク質を酵母で発現して分泌するための幾つかのアプローチが提案されている。欧州特許第0088632Aは、所望のタンパク質とシグナルペプチドをコードするDNAを有する発現ベクターにより、酵母生物を形質転換し、該形質転換された生物の培養を準備し、該培養を増殖させ、培地からタンパク質を回収することによって、酵母にとって異種のタンパク質を発現し、プロセッシングし、分泌させる方法を記載している。シグナルペプチドは、所望のタンパク質自身のシグナルペプチド、すなわち異種のシグナルペプチド、又は同種と異種のシグナルペプチドのハイブリッドであり得る。
酵母にとって異種のシグナルペプチドを使用することに伴う問題点は、異種のシグナルペプチドでは、確実に効率的な移動（translocation）及び/又はシグナルペプチドの後ろでの切断が起こらないということであり得る。
サッカロミセス・セレビシエMFα1（α因子）は、64アミノ酸長の「リーダー」ペプチド又はプロペプチドが続く19アミノ酸長のシグナルペプチド又はプレペプチドを具備し、（LysArg（Asp/Glu,Ala）2-3α因子）4が続く３つのN結合型グリコシル化部位を包含する165アミノ酸のプレプロ型として合成される（Kurjan,J.及びHerskowitz,I.Cell 30（1982）,933-943）。プレプロMFα1のシグナルリーダー部は、サッカロミセス・セレビシエで異種のタンパク質を合成、分泌するために広く利用されてきた。
酵母にとって同種のシグナル／リーダーペプチドの使用は、とりわけ、米国特許第4,546,082号、欧州特許公開第0116201A号、第0123294A号、第0123544A号、第0163529A号、第0123289A号、欧州特許第0100561B、及びPCT公報第WO95/02059号に認められる。
欧州特許第0123289A号には、サッカロミセス・セレビシエα因子前駆体の利用が記載されているのに対し、欧州特許第0100561号は、サッカロミセス・セレビシエPHO5シグナルの利用を記載しており、WO95/02059号は、外来タンパク質を分泌するためのYAP3シグナルペプチドの利用を記載している。
米国特許第4,546,082号、欧州特許公開第0016201A号、第0123294A号、第0123544A号、第0163529A号は、酵母で発現された異種タンパク質の分泌過程において、サッカロミセス・セレビシエ（MFα1又はMFα2）のα因子シグナルリーダーを利用する方法を記載している。所望のタンパク質の遺伝子の5’末端にサッカロミセス・セレビシエMFα1シグナル／リーダーペプチドをコードするDNA配列を融合することによって、所望のタンパク質の分泌及びプロセッシングが実証された。
欧州特許第0206783号は、サッカロミセス・セレビシエからポリペプチドを分泌させるためのシステムであって、ネイティブ配列上に存在する４つのα因子ペプチドを除去するためにα因子シグナル／リーダー配列の末端を切断して、α因子プロセッシング部位Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Alaを介して異種のポリペプチドに融合したシグナル／リーダーペプチド自体は残存せしめるシステムを開示している。該構築物は、より小さいペプチド（50アミノ酸未満）を産生する効率的なプロセスをもたらす。より大きいポリペプチを分泌させ、プロセッシングするためには、リーダーペプチドとポリペプチドの間に１又は２のα因子ペプチドが残るように、ネイティブα因子リーダー配列の末端を切断する。
多くの分泌タンパク質は、連続する２つの塩基性アミノ酸のカルボキシル末端のペプチド結合を切断し得るタンパク質分解プロセッシングシステムに、前駆体が露出されるように輸送される。サッカロミセス・セレビシエでは、該酵素活性は、KEX2遺伝子によってコードされている（Julius,D.A.ら、Cell 37（1984b）,1075）。KEX2プロテアーゼによる産物のプロセッシングは、活性なサッカロミセス・セレビシエ接合因子α1（MFα1（mating factor α1）又はα因子）の分泌には必要とされるが、活性なサッカロミセス・セレビシエ接合因子ａの分泌には関与していない。
あるケースでは、分泌させたいポリペプチドの分泌及び正しいプロセッシングは、上掲の参照文献に示されているように構築したベクターで形質転換した酵母生物を培養すると得られる。しかしながら、多くの場合、分泌レベルは極めて低いか、又は全く分泌されないか、又はタンパク質分解プロセッシングが不正確若しくは不完全であり得る。PCT公開第WO90/10075に記載されているように、これは、ある程度は、リーダーペプチドのC末端と異種タンパク質のN末端の間に存在するプロセッシング部位の露出が不十分であるために、タンパク質分解による切断、とりわけKEX2プロテアーゼによる切断へのアクセスが不能となる、又はアクセスが悪くなることによると考えられている。
WO90/10075は、リーダーペプチドのC末端及び/又はリーダーペプチドに融合された異種ポリペプチドのN末端に存在するプロセッシング部位の近傍にある種の修飾を加えることによって得られる、異種ポリペプチドのプロセッシングが改善された酵母発現システムを記載している。このため、未修飾のリーダーペプチド−異種ポリペプチド構造物を用いた場合に比べて、より高い収率で正しくプロセッシングされたタンパク質を得ることができる。
さらに、WO95/35384は、培地からの精製前に酵母のプロテアーゼによって、又は培地から産物を精製している間若しくはその後のインビトロタンパク質分解によって切除され得る伸長部としてデザインされた異種ポリペプチドのN末端の修飾を有するポリペプチドをコードするDNA構築物を記載している。前記ポリペプチドは、シグナルペプチド−リーダーペプチド-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-異種タンパク質という式であり、ここでX1-X2は、Lys-Argのような２塩基酵母プロテアーゼプロセッシング部位であり、配列X3-X4-X5-X6-X7は、EEGEPKを含んでいない。
発明の概要
本発明は、培地から産物を精製している間若しくは精製後のインビトロタンパク質分解によって切除され得る伸長部としてデザインされた異種ポリペプチドのN末端の修飾の改善であって、高収量の均一な異種タンパク質産物をもたらす改善を記載する。
本発明は、以下の構造を有するポリペプチド配列をコードするDNA構築物に関する。
SP-LP-EEGEPK-★ポリペプチド★
ここで、SPは、シグナルペプチドをコードするDNA配列であり、
LPは、リーダーペプチドをコードするDNA配列であり、
EEGEPKは、タンパク質又は産生すべき他のポリペプチドであり、その後に続く★ポリペプチド★のN末端伸長部として配置されたアミノ酸配列である。
本記載及び請求の範囲を通じて、IUPAC-IUB生物化学命名委員会によって承認された規則（1974）に適合する伝統的な一文字アミノ酸コードを使用する。
本発明のN末端伸長部の作用機序について、何ら特定の理論に拘泥するものではないが、α因子リーダーの反復したGluAlaに比べて、N末端伸長部にグリシン（G）を配置すると、異種タンパク質の収量が改善されることは驚くべきことであり、移動及び／又は分泌が改善され得ることを反映しているが、側鎖として水素原子のみを有するグリシンは、他のアミノ酸残基に比べて、ずっと広範なコンフォメーションをとることができ、このため異常なコンフォメーションの主鎖、及びより不安定な前駆体ポリペプチド及び分泌過程を取り得るためである。
配列EEGEPKは、異種ポリペプチドのN末端に伸長部を形成する。該伸長部は、発酵収率を増加させるのみならず、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（DPAPA）プロセッシングから保護され、ポリペプチドの均一なN末端をもたらす。その後に行われる、例えば、トリプシン又はアクロモバクター・リティカス（Achromobacter lyticus）プロテアーゼIのような塩基性アミノ酸に特異的なプロテアーゼによる、インビトロでのタンパク質分解による成熟化のために、N末端伸長異種タンパク質産物を培地から精製できるようにするため、発酵中のタンパク質分解による切断に耐え得るように該伸長部を構築する。N末端伸長部EEGEPKの望ましいインビトロ除去は、おそらくN末端伸長ペプチドの柔軟性故に、トリプシン又はアクロモバクター・リティカスプロテアーゼIの何れかによって、容易に達成され、成熟した異種タンパク質の収量が改善される。
本明細書において、「シグナルペプチド」とは、酵母で発現される前駆体型の細胞外タンパク質上にN末端配列として存在するプレペプチドを意味するものと理解される。シグナルペプチドの機能は、分泌された異種タンパク質が小胞体中に入れるようにすることである。シグナルペプチドは、通常、このプロセスの間に切除される。シグナルペプチドは、タンパク質を産生する酵母生物にとって、異種又は同種であり得る。本発明において好ましいシグナルペプチドは、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3（YAP3）シグナルペプチド又は任意の機能的なその類縁体である。YAP3は、イーゲル-ミタニらによって、クローニングされ、特性も決定されている（Egel-Mitani,M.et al.,YEAST,6,p.127-137,1990）。
「リーダーペプチド」なる表現は、分泌される異種タンパク質を小胞体からゴルジ装置へ、さらに培地中に分泌するための分泌小胞に誘導することが（すなわち、細胞壁を横切って、又は細胞膜を通過して少なくとも細胞の周辺腔の中に、発現されたタンパク質又はポリペプチドを排出する）、その機能であるポリペプチド配列を指すものと理解される。好ましくは、本発明で用いられるリーダーペプチドは、以下のリーダーペプチド群；
PCT/DK95/00249において配列番号1〜28の表記で開示され、全てLys-Arg配列及び任意の機能的なその類縁体がC末端の後ろに続いており、より好ましくは該リーダーペプチドは、リーダーペプチド（LA19）：
本発明のDNA構築物によってコードされるさらに好ましいリーダーペプチドは、
「異種タンパク質」なる表現は、本来宿主の酵母生物によって産生されないタンパク質又はポリペプチドを示すために用いる。
さらなる側面では、本発明は、酵母に異種タンパク質を産生させる方法であって、異種タンパク質の発現及び分泌を得るために、形質転換された酵母株を適切な培地で培養した後、培地からタンパク質を単離することを具備する方法に関する。
発明の詳細な記述
本発明の方法によって産生されたN末端伸長異種タンパク質は、酵母で有利に産生され得る任意のタンパク質であり得る。このようなタンパク質の例は、アプロチニン、組織因子系凝固インヒビター又は他のプロテアーゼ阻害剤、及びインシュリン又はインシュリン前駆体、インシュリン類縁体、IGFI及びIGFIIのようなインシュリン様増殖因子、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド-1（GLP 1）、グルカゴン様ペプチド-2（GLP 2）、GRPP、第VII因子、第VIII因子、第XIII因子、血小板由来増殖因子、リパーゼのような酵素、又はこれらのタンパク質うちの任意の１つの機能的類縁体である。好ましいタンパク質は、インシュリン及びインシュリン様増殖因子の前駆体、及びGLP-1（1-45）、GLP-1（1-39）、GLP-1（1-38）、GLP-1（1-37）、GLP-1（1-36）、GLP-1（1-35）、GLP-1（1-34）、GLP-1（7-45）、GLP-1（7-39）、GLP-1（7-38）、GLP-1（7-37）、GLP-1（7-36）、GLP-1（7-35）、及びGLP-1（7-34）のような末端切断された型を含むグルカゴン、GLP 1、GLP 2、及びGRPPのようなプログルカゴンファミリーのペプチドである。
本明細書において、「機能的類縁体」なる語は、ネイティブタンパク質と類似の機能を有するポリペプチドを指すものとする（これは、ネイティブタンパク質の生物活性のレベルよりも、性質に関するものとして理解せねばならない）。該ポリペプチドは、ネイティブタンパク質と構造的に類似したものであり得、ネイティブタンパク質のC末端及びN末端の一方又は双方に１以上のアミノ酸を付加することによって、ネイティブアミノ酸配列中の１又は多数の異なる部位のアミノ酸を１以上置換することによって、ネイティブタンパク質の一端若しくは両端のアミノ酸、又は該アミノ酸配列中の１若しくは数個の部位のアミノ酸を１以上欠失させることによって、又はネイティブアミノ酸配列中の１以上の部位にアミノ酸を１以上挿入することによって、ネイティブタンパク質から作出してもよい。このような修飾は、上述した幾つかのタンパク質について周知である。
プロインシュリン並びに末端切断された及び/又は修飾されたCペプチドを有する前駆体、又は完全にCペプチドを欠く前駆体を含むインシュリンの前駆体、インシュリン類縁体の前駆体、及びインシュリン様増殖因子のようなインシュリン関連ペプチドは、ヒト由来、又は他の動物からのもの、及び組換え又は半合成的な入手源のものであり得る。本発明の方法において、インシュリンの前駆体、インシュリン類縁体の前駆体、又はインシュリン関連ペプチドの発現に使用されるcDNAには、酵母での発現用にコドンが最適化された型が含まれる。
「インシュリンの前駆体」又は「インシュリン類縁体の前駆体」とは、その後に行う１以上の化学的及び/又は酵素的プロセスによって、天然のヒトインシュリンに見られるような３つのジスルフィド架橋が正しく確立された二本鎖インシュリン又はインシュリン類縁体分子に転換され得る一本鎖ポリペプチドと理解すべきである。好ましいインシュリン前駆体は、Ml1,B（1-29）-A（1-21）;（例えば、EP 163529に記載されているような）Ml3,B（1-29）-Ala-Ala-Lys-A（1-21）;（例えば、PCT公開番号95/00550に記載されているような）X14,B（1-27-Asp-Lys）-Ala-Ala-Lys-A（1-21）;B（1-27-Asp-Lys）-A（1-21）;B（1-27-Asp-Lys）-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A（1-21）;（例えば、PCT公開番号95/07931に記載されているような）B（1-29）-Ala-Ala-Arg-A（1-21）;Ml5,B（1-29）-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A（1-21）;及びB（1-29）-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A（1-21）、より好ましくはMl1,B（1-29）-A（1-21）、Ml3,B（1-29）-Ala-Ala-Lys-A（1-21）、及びMl5,B（1-29）-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A（1-21）である。
このように作成することが可能なインシュリン又はインシュリン類縁体の例は、ヒトインシュリン、好ましくはdes（B30）ヒトインシュリン、ブタインシュリン；及び少なくとも１つのLys又はArgが存在するインシュリン類縁体、好ましくはPheB1が欠失されたインシュリン類縁体、A鎖及び/又はB鎖がN末端伸長部を有しているインシュリン類縁体、A鎖及び/又はB鎖がC末端伸長部を有しているインシュリン類縁体である。他の好ましいインシュリン類縁体は、１以上のアミノ酸残基、好ましくはそれらの1、2、又は３が、他のコード可能なアミノ酸残基によって置換されているようなものである。このように、親インシュリンのA21位は、Asnの代わりに、Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はValを含む群から選択されるアミノ酸残基、特にGly、Ala、Ser、及びThrを含む群から選択されるアミノ酸残基を有し得る。インシュリン類縁体は、先に概説した変化の組み合わせによって修飾してもよい。同様に、親インシュリンのB28位は、Proの代わりに、Asp及びLysを含む群から選択されるアミノ酸残基、好ましくはAspを有してもよく、親インシュリンのB29位は、Lysの代わりにアミノ酸Proを有してもよい。
本明細書において、「コード可能なアミノ酸残基」なる表現は、遺伝子コード、すなわちヌクレオチドのトリプレット（「コドン」）によってコードされ得るアミノ酸残基を指すために用いる。
本発明のポリペプチドをコードする本発明のDNA構築物は、確立された標準的方法、例えばボカージとカルサーによって記載されたホスホアミダイト法（S.L.Beaucage and M.H.Caruthers,Tetrahedron Letters 22,1981,pp.1859-1869）又はマッシュらによって記載された方法（Matthes et al.,EMBO Journal 3,1984,pp,801-805）によって合成的に調製し得る。
ホスホアミダイトによれば、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成装置で合成され、精製して、二重にして、連結させて合成DNA構築物を形成せしめる。DNA構築物を調製する方法として現在好まれているのは、例えば、サンブルックらの分子クローニング：ラボラトリーマニュアル（Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manua1,Cold Spripg Harbor,NY,1989）に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるものである。
本発明のDNA構築物は、例えば、ゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーを調製して、標準的な手法（Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,1989参照）に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションを行うことによって、本発明のポリペプチドの全部又は一部をコードするDNA配列をスクリーニングすることによって、得られるゲノム又はcDNA由来のものでもあり得る。この場合、異種タンパク質をコードするゲノム又はcDNA配列にシグナルペプチド及びリーダーペプチドをコードするゲノム又はcDNA配列を連結してもよく、その後、周知の操作に従って、相同性組換え用の所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入するか、好ましくは適切なオリゴヌクレオチドを用いるPCRによって所望の配列を作成することによって、ポリペプチドのアミノ酸配列EEGEPKに相当する部位で、DNA配列を修飾してもよい。
最後に、該DNA構築物は、標準的な手法で、合成、ゲノム、又はcDNA由来の断片（適切なもの）をアニールすることによって調製した合成とゲノムの混合、合成とcDNAの混合、又はゲノムとcDNAの混合由来のものであり得、該断片は完全なDNA構築物の様々な部分に対応している。このように、異種タンパク質をコードするDNA配列は、ゲノム又はcDNA由来であり得るのに対して、シグナルペプチド及びリーダーペプチドをコードする配列並びにN末端伸長EEGEPKをコードする配列は、合成的に調製し得ることが想像できよう。
さらなる側面では、本発明は、酵母で複製することができ、上述のポリペプチドをコードするDNA構築物を担持する組換え発現ベクターに関する。組換え発現ベクターは、酵母生物中で複製し得る任意のベクターであり得る。ベクター中で、本発明のポリペプチドをコードするDNA配列は、作用可能に適切なプロモーター配列に接続しなければならない。プロモーターは、酵母で転写活性を示す任意のDNA配列であり得、酵母にとって同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来するものであり得る。プロモーターは、同種のタンパク質をコードする遺伝子に由来することが好ましい。適切なプロモーターの例は、サッカロミセス・セレビシエMα1、TPI、ADH、又はPGKプロモーターである。
本発明のポリペプチドをコードするDNA配列は、適切なターミネーター、例えばTPIターミネーター（T.Alber and G.Kawasaki,J.Mol.Appl.Genet.1,1982,pp.419-434）に、作用可能に接続してもよい。
本発明の組換え発現ベクターは、ベクターが酵母で複製できるようにするDNA配列を具備する。このような配列の例は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子REP1-3及び複製起点である。ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、ラッセルによって記載されたスキゾサッカロミセスポンペ（Schizosaccharomyces pompe）noTPI遺伝子を具備してもよい（P.R.Russell,Gene 40,1985,pp.125-130）。
本発明のポリペプチドをコードするDNA配列、プロモーター、及びターミネーターをそれぞれ連結するために用いられる操作、及び酵母の複製に必要な情報を含有する適切な酵母ベクター中にそれらを挿入する操作は、当業者に周知である（例えば、Sambrookら、前掲参照）。ベクターは、まず本発明のポリペプチドをコードする完全なDNA配列を含有するDNA構築物を調製し、続いて適切な発現ベクター中に該断片を挿入するか、又は（シグナル、リーダー、若しくは異種タンパク質等の）各要素に対する遺伝情報を含有するDNA断片を順次挿入した後に連結して構築してもよい。
本発明の方法で用いる酵母生物は、培養したときに、所望の異種タンパク質又はポリペプチドを大量に産生する任意の適切な酵母生物であり得る。適切な酵母生物の例は、酵母種サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、スキゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロミセス・ウバラム（Saccharomyces uvarum）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ハンセニュラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）、ピヒア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピヒア・クルイベリ（Pichia kluyveri）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ種、カンジダ・ユーティリス（Candida utilis）、カンジダ・カカオイ（Candida cacaoi）、ゲオトリカム種、ゲオトリカム・ファーメンタンス（Geotrichum fermentans）から選択される株であり得る。宿主生物として、アスペルギルス属の細胞のような他の任意の真菌細胞を選択することは当業者にとって明らかであると考えられる。
酵母細胞の形質転換は、例えば、プロトプラストを形成させた後に、それ自体は公知の方法で形質転換することによって実施してもよい。該細胞を培養するために用いる培地は、酵母生物を増殖するのに適した任意の従来の培地であり得る。分泌された異種タンパク質（かなりの割合で、正しくプロセッシングされた型として培地中に存在するであろう）は、遠心又はろ過によって培地から酵母細胞を分離し、塩、例えば、硫酸アンモニウムによって上清又はろ液のタンパク質成分を沈殿させた後、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の様々なクロマトグラフィー操作による精製を含む従来の操作によって培地から回収し得る。培地への分泌後、該タンパク質は、配列EEGEPKを除去するための様々な操作にかけることができる。
発酵の間、伸長部は異種タンパク質に安定に接着して、DPAPのような酵母プロテアーゼのタンパク質分解活性から異種タンパク質のN末端を保護することが見出される。異種タンパク質にN末端伸長部が存在していることは、タンパク質の化学的なプロセッシングの間に異種タンパク質のN末端アミノ基を保護する役割、すなわちBOC（t-ブチル-オキシカルボニル）又は類似の保護基の代替物としての役割も果たし得る。このような場合、アミノ酸配列EEGEPKは、末端伸長部がKの位置で切除されるように、塩基性アミノ酸（すなわち、K（Lys））に特異的なタンパク質分解酵素によって、該回収された異種タンパク質から除去し得る。このようなタンパク質分解酵素の例は、トリプシン又はアクロモバクター・リティカスプロテアーゼIである。
以下の例で、本発明をさらに詳細に記載するが、いかなる意味においても、請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
以下の図を参照しながら本発明を記載する。
図１は、本発明のN末端伸長ポリペプチドを発現する遺伝子を含有する発現プラスミドpAK773を示している。図１では、以下の記号が用いられている。
TPIプロモーター：サッカロミセス・セレビシエからのTPI遺伝子プロモーター配列を指す。
2：（例えば、EEGEPKでN末端が伸長されたMl3インシュリン前駆体に連結されたYAP3シグナルペプチド及びLA19リーダーペプチドの）シグナル／リーダーペプチドをコードする領域を指す。
TPIターミネーター：サッカロミセス・セレビシエのTPI遺伝子ターミネーター配列を指す。
TPIポンベ：サッカロミセス・ポンベからのTPI遺伝子を指す。
起点：サッカロミセス・セレビシエのDNA複製起点を含むサッカロミセス・セレビシエ２μプラスミドからの配列を指す。
AMP-R：アンピシリン耐性遺伝子と大腸菌のDNA複製起点を含むpBR322/pUC13からの配列。
図２は、YAP3シグナルペプチド（アミノ酸番号１〜21）LA19リーダーペプチド（アミノ酸番号22〜64）、N末端伸長部EEGEPK（アミノ酸番号65〜70）、Ml3インシュリン前駆体B鎖（1-29）-Ala-Ala-Lys-A鎖（1-21）（アミノ酸番号71〜123）をコードするpAK773のDNA及びアミノ酸配列を示している。
図３は、本発明のN末端伸長ポリペプチドを発現する遺伝子を含有する発現プラスミドpAK729を示し、以下の記号が用いられている。
TPIプロモーター：サッカロミセス・セレビシエからのTPI遺伝子プロモーター配列を指す。
2：（例えば、EEAEPKでN末端が伸長されたMl3インシュリン前駆体に連結されたYAP3シグナルペプチド及びLA19リーダーペプチドの）シグナル／リーダーペプチドをコードする領域を指す。
TPIターミネーター：サッカロミセス・セレビシエのTPI遺伝子ターミネーター配列を指す。
TPIポンベ：サッカロミセス・ポンベからのTPI遺伝子を指す。
起点：サッカロミセス・セレビシエのDNA複製起点を含むサッカロミセス・セレビシエ２μプラスミドからの配列を指す。
AMP-R：アンピシリン耐性遺伝子と大腸菌のDNA複製起点を含むpBR322/pUC13からの配列。
例
EEGEPK-Ml3インシュリン前駆体を発現する酵母株yAK773の構築
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、N末端伸長インシュリン前駆体EEGEPK-Ml3のN末端伸長部をコードする合成遺伝子を構築した。
以下の２つのオリゴヌクレオチドを合成した。
#724 5’-GATCTCCATGGCTAAGAGAGAAGAAXYTGAACCAAAGTTCGTTAACC-3’、ここでXはA又はG、YはT、A、又はG、
エキスパンド・ハイ・フィデリティー・エンザイム・ミックス（Expand High Fidelity Enzyme mix）（Boehringer Mannheim GmbH,Sandhoefter Strasse 116,Mannheim,Germany）を用いて、製造者の指示書に従って、以下のPCRを行い、該PCRミックスに、100μLのミネラルオイル（Sigma Chemical Co.,St.Louis MO,USA）を重層した。
PCR
オリゴヌクレオチド#724 ５μL（計100pmol）
オリゴヌクレオチド#2371 ５μL（計100pmol）
10×PCR緩衝液10μL
dNTPミックス８μL
エクスパンド・ハイ・フィデリティー・エンザイム・ミックス0.75μL
テンプレートとしてpAK729プラスミド0.5μL（0.2μg DNA）
蒸留水70.75μL
１サイクルが94℃45秒；37℃1分；72℃1.5分で、合計18サイクル行った。続いて、2.5％アガロースゲル上に、該PCR混合物を載せて、標準的な手法を用いて電気泳動を行った（Sambrook J,Fritsch EI and Maniatis T,Molecular cloning,Cold Spring harbour laboratory press,1989）。アガロースゲルから、得られたDNA断片を切断して、製造者の指示書に従って、ジーン・クリーン・キット（Gene Clean Kit,Bio 101 inc,PO BOX 2284,La Jolla,CA 92038,USA）によって単離した。
該精製したPCR DNA断片を14μLの水と制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に溶かして、標準的な手法に従って（Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T,Molecular cloning,Cold spring Harbour laboratory press,1989）、制限エンドヌクレアーゼNcoI及びXbaIによって切断した。209ヌクレオチド塩基対上のNcoI-XbaI DNA断片をアガロース電気泳動にかけ、既述のようにザ・ジーン・クリーン・キットを用いて精製した。
制限エンドヌクレアーゼBgIII及びXbaIを用いて、プラスミドpAK721（図３参照）を切断し、既述のようにザ・ジーン・クリーン・キットを用いて、10849ヌクレオチド塩基対のベクター断片を単離した。
制限エンドヌクレアーゼBgIII及びNcoIを用いて、プラスミドpAK721を切断し、既述のようにザ・ジーン・クリーン・キットを用いて、160ヌクレオチド塩基対のDNA断片を単離した。
T4 DNAリガーゼと標準的な条件（Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T,Molecular cloning,Cold spring Harbour laboratory press,1989）を用いて、３つのDNA断片を連結した。次に、コンピテント大腸菌株（R-，M+）の中に該連結混合物を形質転換した後、アンピシリン耐性により選別した。
標準的な手法（Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T,Molecular cloning, Cold Spring Harbour laboratory press,1989）を用いて、得られた大腸菌のプラスミドを単離し、適切な制限エンドヌクレアーゼ、すなわちBgIIIとNheIを用いてインサートチェックを行った。DNA配列分析（Sequenase,U.S.Biochemical Corp.,USA）によって、選択したプラスミドが、EEGEPK-Ml3インシュリン前駆体DNAの正しいDNA配列をコードしており、合成LA19リーダーDNAをコードするDNAの後ろに挿入されていることが示された。
該プラスミドは、pAK773と名付けた。
YAP3シグナルペプチド-LA19リーダーEEGEPK-Ml3インシュリン前駆複合体をコードするDNA配列が、図２に示されている。
PCT/DK95/00250に記載されているように、サッカロミセス・セレビシエ株MT663にプラスミドpAK773を形質転換し、得られた株をyAK773と名付けた。
酵母発現プラスミドpAK773は、C-POTタイプであり（図１参照）、プラスミド選択及びサッカロミセス・セレビシエ中での安定化のためのスキゾサッカロミセス・ポンベのトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子（POT）を含有するWO EP 171 142号に記載されているものと類似している。pAK773は、サッカロミセスセレビシエのトリオースホスフェートイソメラーゼプロモーター及びターミネーターも含有している。EcoRIXbaI断片の間の配列を除くプラスミド中の全配列が、YAPeシグナルペプチド−LA19リーダーペプチド−EEGEPK-Ml3インシュリン前駆体をコードしているので、該プロモーターとターミネーターは、プラスミドpKFN1003（WO 90／100075）に記載されているものと似ている。
配列表
Claims (13)
- 以下の構造：ＳＰ−ＬＰ−ＥＥＧＥＰＫ−*ポリペプチド*を含むポリペプチド配列をコードするＤＮＡ構築物（ここで、ＳＰはシグナルペプチドであり、ＬＰはリーダーペプチドであり、ＥＥＧＥＰＫはこれらの後ろに続くタンパク質又は産生すべき他のポリペプチドである*ポリペプチド*のＮ末端伸長部として配置されているアミノ酸配列である）。
- 請求項１に記載のＤＮＡ構築物であって、ＳＰが、サッカロミセス・セレビシエのα因子シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、酵母カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド、又は酵母ＢＡＲ１シグナルペプチドであるＤＮＡ構築物。
- ＬＰが、
からなる群から選択される合成リーダーペプチドである請求項１または２に記載のＤＮＡ構築物。 - ＬＰが、合成リーダーペプチド（ＬＡ１９）：
ＧｌｎＰｒｏＩｌｅＡｓｐＡｓｐＴｈｒＧｌｕＳｅｒＡｓｎＴｈｒＴｈｒＳｅｒＶａｌＡｓｎＬｅｕＭｅｔＡｌａＡｓｐＡｓｐＴｈｒＧｌｕＳｅｒＡｒｇＰｈｅＡｌａＴｈｒＡｓｎＴｈｒＴｈｒＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｓｐＶａｌＶａｌＡｓｎＬｅｕＩｌｅＳｅｒＭｅｔＡｌａＬｙｓＡｒｇ
である請求項１または２に記載のＤＮＡ構築物。 - *ポリペプチド*が異種タンパク質である請求項１から４の何れか１項に記載のＤＮＡ構築物。
- 請求項５に記載のＤＮＡ構築物であって、前記異種タンパク質が、アプロチニン、組織因子系凝固インヒビター又は他のプロテアーゼ阻害剤、インシュリン様増殖因子Ｉ又はＩＩ、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プログルカゴン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１、グルカゴン様ペプチド２、ＧＲＰＰ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、血小板由来増殖因子、酵素、インシュリン又はインシュリン前駆体の群から選択されるＤＮＡ構築物。
- 請求項６に記載のＤＮＡ構築物であって、異種タンパク質が、インシュリン又はインシュリン前駆体であり、あるいはＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）；Ｂ（１−２７−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１）；Ｂ（１−２９）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１）；及びＢ（１−２９）−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１）からなる群から選択されるＤＮＡ構築物。
- 酵母で複製することが可能で、プロモーター配列及びターミネーター配列に作用可能に接続された請求項１から７の何れか１項に記載のＤＮＡ構築物を担持し、酵母での発現に適した組換え発現ベクター。
- 前記プロモーターがＴＰＩプロモーターである請求項８に記載の組換え発現ベクター。
- 異種タンパク質を発現することができ、請求項８または９に記載のベクターで形質転換された酵母細胞。
- サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・クルイベリ、スキゾサッカロミセス・ポンベ、ハンセニュラ・ポリモルファ、及びヤロウィア・リポリティカの何れか１種に属する請求項１０に記載の酵母細胞。
- 適切な培地で、ＳＰ−ＬＰ−ＥＥＧＥＰＫ−*ポリペプチド*を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物（ここで、ＳＰはシグナルペプチドであり、ＬＰはリーダーペプチドであり、ＥＥＧＥＰＫはこれらの後ろに続くタンパク質又は産生すべき他のポリペプチドである*ポリペプチド*のＮ末端伸長部として配置されているアミノ酸配列である）を含む酵母細胞を培養して異種タンパク質の発現及び分泌を得た後、該タンパク質を培地から単離することを具備する異種タンパク質の産生方法。
- 塩基性アミノ酸に特異的なタンパク質分解酵素による処理を含む過程によって、アミノ酸配列ＥＥＧＥＰＫが回収された異種タンパク質から除去される請求項１２に記載の方法。
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