PT716705E - Processo para a preparacao por recombinacao de proteinas na levedura hansenula - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO POR RECOMBINAÇÃO DE PROTEÍNAS NA LEVEDURA HANSENULA" A presente invenção refere-se a um processo para a preparação por recombiriação de proteínas estranhas às leveduras na levedura Hansenula. A preparação por recombinação de proteínas na levedura Hansenula é conhecida. Na Patente Europeia EP 173378 é descrita a preparação por recombinação de proteínas mediante a utilização de determinados elementos promotores de MOX ou DAS. No entanto este documento não dá qualquer indicação sobre o modo como se pode alcançar uma secreção efectiva, bem como um processamento correcto da proteína pretendida. / É igualmente conhecido que na Hansenula polymorpha a sequência leader de glucoamilase (GAM1) da Schwanniomyces occidentalis é reconhecida como sequência de sinal e é possível segregar glucoamilase correctamente processada (G. Gellissen et al., Biotechnology 9, 291-295, 1991). Esta sequência de sinal não conduz, no entanto, à secreção de produtos genéticos estranhos à levedura, por exemplo, não é possível a secreção da proteína hirudina. O problema da presente invenção era, por conseguinte, desenvolver um processo para a preparação por recombinação de proteínas, em especial de proteínas estranhas a leveduras, isto é, proteínas heterólogas, na levedura Hansenula, que garantisse a secreção eficiente e o processamento correcto para um grande número de proteínas.

Este problema é solucionado através de um processo para a preparação por recombinação de proteínas estranhas a leveduras na levedura Hansenula, o qual é 2

caracterizado pelo facto de a Hansenula ser transformada com uma "kassete" de expressão que contém codificado o seguinte elemento estrutural:

L-A-P-GEN em que L: representa uma sequência leader, A: representa um adaptador que produz uma estrutura alfa-helix, P: representa um sinal de processamento e GEN: representa um gene de estrutura para a proteína pretendida.

Como sequência leader L podem ser utilizadas as sequências leader de todos os produtos genéticos segregados na levedura, que sejam reconhecidos pela Hansenula. Não é absolutamente necessário que a sequência leader seja proveniente de um gene da Hansenula. São também apropriadas sequências leader de leveduras de outras espécies diferentes de Hansenula, por exemplo, Saccharomyces ou Schwanniomyces. Uma sequência leader bastante apropriada para a invenção é, por exemplo, a sequência leader do factor alfa de Saccharomyces cerevisiae (MATa). São de preferência utilizadas como sequências leader as sequências de enzimas hidrolíticos fortemente expressas e segregadas, como alfa-amilase, invertase, fosfatase ácida e glucoamilase. É utilizada especialmente de preferência a sequência leader de glucoamilase de Schwanniomyces occidéntalis.

Como adaptador A são apropriadas todas as sequências que codificam para um polipeptídeo que contém uma estrutura alfa-helix. A existência de uma estrutura alfa-helix pode ser determinada de acordo com o algoritmo de Gamier et al. (J. Mol. Biol. 120, 97-120, 1978). E determinada de forma particularmente simples com programas de computador susceptíveis de obtenção comercial, que são baseados neste algoritmo, no, caso de uma sequência de polipeptídeo possuir uma estrutura alfa-helix.

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Como regra geral, são bastante apropriadas como adaptador todas aquelas sequências para as quais, com o programa de computador "Microgenie" (Beckmann), na região da posição de processamento A-P-GEN, para uma sequência peptídica de pelo menos quatro aminoácidos, for calculada para ALPHA um valor positivo maior do que para as outras três possibilidades de estrutura (BETA, TURN, COIL).

Para a utilização de acordo com a invenção o comprimento da sequência de adaptador A pode variar dentro de um grande intervalo. Está compreendido, regra geral, entre cinco e cem aminoácidos. É de preferência utilizada como sequência de adaptador uma sequência da glucoamilase de Schwanniomyces occidentalis que contém os aminoácidos 23 a 72 (GAM 23-72; Dohmen et al., Gene, 95,111-121 (1990)).

Esta sequência pode ser usada como sequência de adaptador directamente ou, especialmente de preferência, depois do prolongamento no términus C com um a quatro aminoácidos. São igualmente bastante apropriadas para o processo de acordo com a invenção partes desta sequência, de preferência as que são obtidas por encurtamento do términus N. Cóm base no programa de computador acima descrito, pode-se também, por exemplo, identificar a região da sequência que contribui em especial para a formação da alfa-helix, e optimizá-la ainda, no que se refere à estrutura alfa-helix, através da permuta de aminoácidos individuais.

Para a preparação de inibidores de trombina, em especial de hirudina e de derivados de hirudina, de harmonia com o processo de acordo com a invenção, revelou-se como particularmente bem apropriada como adaptador a seguinte sequência; (SEQ ID NO : 1) GAM 23-72 - His - Pro - Leu - Glu 4

Se esta sequência (= A) for combinada com a sequência leader da gJucamilase (GAM 1-22) (= L), obtém-se uma sequência leader-adaptador com a estrutura GAM 1-72 - His - Pro - Leu - Glu de 76 aminoácidos, que é especialmente vantajosa para o processo de acordo com a invenção. O sinal de processamento P serve para a cisão do propeptídeo na forma madura. Habitualmente é utilizada como sinal de processamento uma sequência de aminoácidos básicos. É bastante apropriada como sinal de processamento a posição de reconhecimento KEX2 da S. cerevisiae, que consiste no dipeptídeo Lys - Arg e que também é reconhecida pela levedura Hansenula. Este dipeptídeo também pode ser utilizado em forma duplicada como sinal de processamento. É preferida como P a sequência Lys - Arg.

Como genes de estrutura GEN para a proteína em preparação podem ser utilizados genes heterólogos e homólogos. Os genes podem ser isolados dos correspondentes organismos ou podem ser preparados sinteticamente. Na síntese química dos genes pode também ser realizada, se desejado, uma adaptação da utilização de códão ao organismo de produção. São de preferência utilizados como genes de estrutura genes eucarióticos. O processo de acordo com a invenção decorre especialmente bem para a preparação de inibidores de trombina, por exemplo, de hirudina. Este processo também é bastante apropriado para a preparação de polipeptídeos humanos, por exemplo, de hormonas peptídicas, factores de crescimento, ou linfoquinas.

Os elementos de estrutura acima citados são dispostos na sequência L - A - P -GEN, de forma conhecida, numa "kassete" de expressão. O acoplamento é efectuado habitualmente por ligação de fragmentos de restrição compatíveis ou por síntese química. 5

As "kassetes" de expressão podem conter ainda uma série de sinais de regulação correntes, tais como promotores, pontos de ligação RBS, terminadores, que são ligados funcionalmente com os elementos de estrutura L - A - P - GEN de acordo com a invenção. A "kassete" de expressão pode ser um constituinte de um vector replicável autonomamente ou também de um vector integrativo. A construção de um vector de expressão mediante a utilização da "kassete" de expressão é descrita no exemplo 1. A levedura Hansenula é transformada com o correspondente vector de expressão, que contém a "kassete" de expressão. Isto pode ser realizado, por exemplo, de acordo com o protocolo descrito no exemplo 2. A partir das leveduras transformadas deste modo são isolados clones de expressão estável, que são apropriados como organismos de produção no processo de acordo com a invenção. Os organismos de produção são cultivados em condições correntes e, consoante os elementos de regulação escolhidos, produzem a proteína pretendida de uma forma constitutiva ou susceptível de indução. A proteína é segregada / pelo organismo de produção para o meio envolvente, de onde pode ser facilmente isolada e purificada. A purificação por isolamento do meio é realizada, como regra geral, depois de o organismo de produção ter sido separado, por meio de processos de purificação que são comuns na química das proteínas. O processo de acordo com a invenção fornece proteínas maduras correctamente ' processadas, sem os defeitos de processamento que de outro modo seriam observados. Por consequência, este processo conduz a um elevado rendimento de proteínas maduras e facilita consideravelmente os passos seguintes da purificação. Por conseguinte, este processo é utilizável de forma particularmente boa na preparação de medicamentos à base de proteínas farmacêuticas. 6

Os exemplos que se seguem servem para uma melhor elucidação da presente invenção.

Exemplo 1

Construção de vectores para a expressão secretórica de proteínas de recombinação a partir da espécie de levedura Hansenula polymorpha

Neste exemplo é descrita a construção de vectores de expressão que têm utilização na preparação, de acordo com a invenção, de proteínas de recombinação na levedura Hansenula polymorpha. A "kassete" de expressão utilizada no presente caso consiste, entre outros, nos seguintes componentes: leader: aminoácidos 1-22 da sequência de glucoamilase de Schwanniomyces occidentalis (Dohmen et al., Gene, 95, 111-121, 1990) adaptador: SEQID NO : 1 sinal de processamento: Lys-Arg GEN: gene de inibidor de trombina

Partindo-se da sequência de glucoamilase de Schwanniomyces occidentalis, acima indicada, foi preparada, com o auxílio de oligonucleótidos sintéticos e de amplificação PCR, a sequência GAM dos pares de bases 1 a 207 (correspondente ao aminoácido 1 (Met) até ao aminoácido 69 (Ala); fig.).

Como primário de amplificação foram preparados dois oligonucleótidos com as sequências SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, e foram utilizados para a PCR. O fragmento parcial GAM leader-adaptador assim resultante foi seccionado na extremidade 5' com EcoRI e na extremidade 3' com PvuII.

Para a preparação secretórica de hirudina, partindo-se do gene de hirudina conhecido e com o auxílio de dois oligonucleótidos sintéticos e de amplificação PCR, 7

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ví. foi preparado um gene adaptador-sinal de processamento-hirudina (A-P-GEN). Os nucleótidos utilizados para este efeito tinham as sequências SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. O fragmento de ADN amplificado foi seccionado na extremidade 5' com PvuII e na extremidade 3' com Sall.

Por ligação da posição PvuII da extremidade 3' do fragmento parcial GAM-/eacfer-adaptador com a posição PvuII da extremidade 5’ do A-P-GEN, assim como por ligação deste fragmento por intermédio de EcoRI/SalI em pUC18, foi terminado o produto construído pretendido. A partir deste produto construído foi de novo isolado o fragmento L-A-P-GEN como fragmento EcoRI/BglII e foi ligado no correspondente vector de expressão de H. polymorpha pFMD 13025, previamente preparado (Gellissen G. et al., TIBTECH, 10, 413-417, 1992). Neste caso a extremidade 5' de L-A-P-GEN está fundida no promotor de H. polymorpha e a extremidade 3' do fragmento está fundida no terminador de H. polymorpha. A "kassete" de expressão está completada a partir deste momento e é um componente de um vector "vai-vém" [shuttle-vector] com o qual a levedura H. polymorpha pode ser transformada, com a finalidade da propagação tanto de E. coli como também com a finalidade da expressão do gene estranho. A mesma construção L-A-P foi fundida com o gene para o inibidor de trombina rhodniina, de Rhodnius prolixus (WO 93/8282), bem como com o gene para o inibidor de trombina moubatina, de Omithodorus moubata (WO 93/9232). As "kassetes" de expressão obtidas nestas condições foram utilizadas analogamente aos produtos da fusão do gene de hirudina, para a construção de vectores de expressão de Hansenula polymorpha.

Exemplo 2

Transformação de Hansenula polymorpha com os vectores de expressão 8

A estirpe hospedeiro para a transformação é um mutante auxotrófico obtido por mutagénese EMS: uma estirpe com uma deficiência para orotidina-5'-fosfato-desidrogenase (ura-). A taxa de inversão deste mutante de uracilo pode. ser desprezada.

As células competentes desta estirpe foram obtidas do seguinte modo (segundo Dohmen et al., Yeast 7, 691-692,1992): 10 ml do meio pleno da levedura (YPD) foram inoculados com a estirpe hospedeiro e cultivados durante a noite a 37°C, mediante agitação. Esta pré-cultura foi sobre-inoculada em 200 ml de meio YPD e foi cultivada a 37°C, mediante agitação, até um valor OD600 nm = 0,6 - 1,0. As células foram lavadas à temperatura ambiente com volumes de 0,5 ml da solução A (1M sorbitol, 10 mM de bicina pH 8,35, 3% de etilenoglicol) e em seguida foram de novo postas em suspensão em volumes de 0,02 ml da solução A.

Depois da adição de 11 μΐ de DMSO as partes alíquotas foram conservadas a -70°C até à transformação.

Para a transformação 10 pg do ADN de plasmídeo e 100 μΐ de solução de cloreto de cálcio 0,1 M fria foram adicionados directamente às células competentes frigorificadas.

Depois de uma rápida descongelação a 37°C cada preparado de transformação foi incubado a 37°C durante uma hora com 1,0 ml da solução B (polietilenoglicol PEG a 40%, 200 mM de bicina pH 8,35). As células foram em seguida lavadas em 1 ml de solução G (150 mM de NaCl, 10 mM de bicina pH 8,35), foram postas de novo em suspensão em 200 μΐ de solução C e foram aplicadas em placas em meio selectivo (YNB-glucose, complementação da deficiência de uracilo por plasmídeo de expressão ura+). A incubação foi realizada durante 3 a 5 dias a 37°C. \ /

Exemplo 3

Isolamento dos clones mitóticos estáveis

Os plasmídeos de expressão, de recombinação, que foram utilizados para a transformação de H. polymorpha, são susceptíveis de replicação autónoma e podem ser integrados espontaneamente no genoma da levedura. Nestas condições formam uma estrutura multímera: os monómeros do plasmídeo são ligados uns aos outros tipo "cabeça com a cauda". \

Para a produção do produto genético de recombinação contribuem, por conseguinte, várias cópias da "kassete" de expressão. A produtividade de uma estirpe de recombinação, dentro de uma vasta margem, é linear relativamente ao número de "kassetes" de expressão integradas. A integração multímera do ADN estranho no genoma da levedura e o isolamento de clones mitóticos estáveis foi alcançada do seguinte modo: os transformandos, a partir das placas de agar, foram inoculados com meio selectivo em 3 ml do correspondente meio líquido, e "passados", isto é, durante um período de tempo de 1 a 2 semanas foram sempre transferidos e inoculados em meio YBN-glucose novo \ (50 μΐ em 3 ml do meio, cultura a 37°C). Durante esta passagem o ADN do plasmídeo integrou-se no genoma da levedura, de modo que foram então obtidos clones mitóticos estáveis. A estabilidade mitótica foi ensaiada da seguinte forma: a partir da última cultura de "passagem" no meio YBN-glucose sobreincubou-se por três vezes, durante 1 a 2 dias, em meio pleno (YPD) e cultivou-se a 37°C. Em seguida a cultura diluída foi aplicada em placas em meio pleno e em meio selectivo. Os transformandos mitóticos estáveis produziram em ambos os meios aproximadamente o mesmo número de colónias. Podem ser isolados deste modo os subtransformandos mitóticos estáveis (Z. A. Janowicz et al., Yeast 7,431-443, 1991). i 10

Exemplo 4

Expressão de genes estranhos

Para os estudos de expressão os transformandos "passados" foram inoculados em 3 ml de meio YNB com 1% de glicerina ou 1% de metanol para induzirem promotores MOX ou FMD, respectivamente. As células, depois de dois dias de cultura a 37°C, foram separadas por centrifugação e o sobrenadante da cultura foi ensaiado quanto a proteínas estranhas (Westem-Blot, ELISA, teste de actividade).

Com transformandos mitóticos estáveis, segregados eficientemente, 50 ml de meio sintético foram inoculados com 1,5% de glicerina em balões de Erlenmeyer de 500 ml com chicana e foram incubados até um valor OD600 nm = 10. As análises por HPLC dos correspondentes sobrenadantes das culturas mostraram que as variantes de hirudina, no caso da utilização da sequência GAM 1-72 - His - Pro - Leu - Glu como leader-adaptador, é processada de forma absolutamente correcta.

Exemplo 5

Fermentação de estirpes de levedura de recombinação

As estirpes de levedura de recombinação foram fermentadas em meio sintético (meio YNB duplamente concentrado 2,8 g/L (Difco) com 10 g/L de sulfato de amónio) que, ou tinha sido introduzido completamente no início da fermentação, ou foi sendo adicionado no decurso da fermentação.

Como fontes de carbono foram utilizados glicerina e metanol ou misturas de glicerina e metanol. A fermentação foi iniciada com glicerina como única fonte de carbono (> 1% de glicerina de concentração final no fermentador durante a fase de crescimento).

Depois da esterilização do meio inoculou-se com 1 L da pré-cultura de modo que se produzisse um valor inicial OD600 nm de cerca de 1. / 0 curso da fermentação deu-se em duas fases: a uma fase de crescimento com uma concentração de glicerina mais elevada (1%) seguiu-se uma fase de produção com uma concentração de glicerina mais baixa (< 0,5%) ou com uma concentração de metanol constante (1%) ou com uma mistura de glicerina e metanol (0,1 a 0,4% de glicerina e 0,2 a 1,0% de metanol). v. A fonte de carbono foi eventualmente realimentada por meio de diversas possibilidades de controle (continuamente ou acoplada a p02).

No decurso da fermentação foram adicionados sulfato de amónio até uma concentração final de 5 g/L, tiamina até uma concentração final de 0,1 g/L e biotina até uma concentração final de 0,3 mg/L. O valor do pH da fermentação foi mantido constante a 4,0 mediante a adição de amónia; a temperatura da fermentação foi de 37°C. 7

As estirpes de leveduras de recombinação assim fermentadas forneceram um produto genético (hirudina) processado correctamente a 100%.

Figura: sequência de ácidos nucleicos do fragmento genético GAM-leader- adaptador-sinal de processamento-hirudina e da sequência polipeptídica codificada pela mesma (quadro de leitura a). A posição do primário PCR está assinalada. 12

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PROTOCOLO DE SEQUÊNCIA

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: (A) NOME: BASF Aktiengesellschafit (B) RUA: Carl-Bosch-Strasse 38 (C) LOCALIDADE: Ludwigshafen (E) PAÍS: Répública da Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: D-67056 (G) TELEFONE: 0621/6048526 (H) TELEFAX: 0621/6043123 (I) TELEX: 1762175170

(A) NOME: Rhein Biotech GmbH (B) RUA: Eichsfelder Strasse 11 (C) LOCALIDADE: Duesseldorf (E) PAÍS: Répública da Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: D-40595 (G) TELEFONE: 0211/970890 (H) TELEFAX: 0211/9708930 (ii) TÍTULO DO PEDIDO: Processo para a preparação por recombinação de proteínas em leveduras (iii) NÚMERO DAS SEQUÊNCIAS: 5 (iv) FORMA A LER PELO COMPUTADOR: (A) SUPORTE DE DADOS: "disquete" (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA DE TRABALHO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE·. Patentln Release #1.0; versão #1.25 (EPA) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: 13

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 aminoácidos (B) NATUREZA: aminoácidos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) NATUREZA DA MOLÉCULA: peptídeo (v) NATUREZA DO FRAGMENTO: interno (vi) PROVENIÊNCIA ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Schwanniomyces occidentalis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Ala Pro Ala Ser Ser Ile Gly Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ser 15 10 15

Glu Ser Ser Gin Ala Thr Ile Pro Asn Asp Vai Thr Leu Gly Vai Lys 20 25 30

Gin Ile Pro Asn Ile Phe Asn Asp Ser Ala Vai Asp Ala Asn Ala Ala 35 40 45

Ala Lys His Pro Leu Glu 50 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) NATUREZA: ácidos nucleicos (C) FORMA DE ESPIRAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) NATUREZA DA MOLÉCULA: ADN (genómico) 14

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: GGGGGGGAAT TCATGATTTT TCTGAAGCTG ATT -(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) NATUREZA: ácidos nucleicos (C) FORMA DE ESPIRAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) NATUREZA DA MOLÉCULA: ADN (genómico) ' (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GGGGGGCAGC TGCATTAGCA TCGACAGCAG A (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO; 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) NATUREZA: ácidos nucleicos (C) FORMA DE ESPIRAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) NATUREZA DA MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: GGGGGGCAGC TGCTAAACAC CCTCTGGAAA AAAGAGTTGT TTACACTGAC TGCACT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5: 5

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) NATUREZA: ácidos nucleicos (C) FORMA DE ESPIRAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) NATUREZA DA MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQIDNO:5:

GGGGGGGTCG ACCCTAGATC TCTATTACTG CAGGTATTCT TCCGG

Lisboa, | 2 JUN. 2000

Dra Maria Silvina Parreira

AgenlÊ Oficiei Q?.o>bõad3 infustriol

b rastilho. 201-2.° E - 1070-051 LISBOA

Claims (4)

1

1. Processo para a preparação, por recombinação, de proteínas estranhas a leveduras na levedura Hansenula, caracterizado por a Hansenula ser transformada com uma "kassete" de expressão que contém codificados os seguintes elementos estruturais: L-A-P-GEN em que L: representa uma sequência leader, A: representa um adaptador que produz uma estrutura alfa-helix, P: representa um sinal de processamento e GEN: representa um gene de estrutura para a proteína pretendida.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser utilizada como sequência leader L a sequência leader da glucoamilase de Schwanniomyces occidentalis.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser utilizada como sinal de processamento P, uma ou mais vezes, a sequência peptídica Lys-Arg.

4. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por se utilizar como adaptador A a sequência de aminoácidos SEQ ID NO : 1. Lisboa· 1 2 JUN. 2000

Dra. Maria Silvina Ferreira Agente ChC'.'. íi . ,O;;riedcd~ Industrial R. Castilho, 201-3.3 1 - 1070-031 LISBOA Teieís. 213 851 339 - 213 854 613