JPH0279977A - γ−エンドルフィン - Google Patents
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Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野コ
本発明は、γ−エンドルフィンの遺伝子組換え法による
新規な製造方法およびそれに係わる組換えプラスミド、
形質転換株、融合タンパク質に間する。
新規な製造方法およびそれに係わる組換えプラスミド、
形質転換株、融合タンパク質に間する。
γ−エンドルフィンは、17個のアミノ酸より構成され
るモルヒネ様生理活性を有するペプチドであり、下記ア
ミノ酸配列を有する。
るモルヒネ様生理活性を有するペプチドであり、下記ア
ミノ酸配列を有する。
γ−エンドルフィン: Tyr−Gly−Gly−Ph
e−Met−Thr−5er−G Iu −Lys−5
er−G I n−Thr−Pro−Leu−Va I
−Thr−Leu 本発明の新規組換えプラスミドpENDC1は。
e−Met−Thr−5er−G Iu −Lys−5
er−G I n−Thr−Pro−Leu−Va I
−Thr−Leu 本発明の新規組換えプラスミドpENDC1は。
第1図において示されるDNA配列を有する。本発明は
2発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。
2発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。
[従来の技術]
γ−エンドルフィンは9モルヒネ様生理活性を示すエン
ドルフィン類に属するペプチドであり。
ドルフィン類に属するペプチドであり。
ロイシンエンケファリンの約5倍、メチオニンエンケフ
ァリンの約3倍の鎮痛活性を示す興味深い生理活性ペプ
チドである。
ァリンの約3倍の鎮痛活性を示す興味深い生理活性ペプ
チドである。
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。しかしながら、遺伝子操作を利用した効率のよ
いγ−エンドルフィンの製造方法に間LrTj、tパ、
)で′″) h 1″I、N * l、t・、I 既に1本発明貴らは、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵
素(J’F、 D HF Rと略す。)遺伝子に間して
、その遺伝子の改変の結果、異種遺伝子発現用プラスミ
ドベクターpTP70−1 (特願昭61−31283
6)と、それを利用した融合遺伝子の作成方法(特願
昭62−302153)を開発している。また、pTP
70−1にメチオニンエンケファリン(以下、MEKと
略す、)を暗号化する化学DNAを組み込んで、MEK
の効率よい生産方法を開発している(特願 昭63−7
9680)、効率のよいMEKの生産方法を開発する際
に得られた組換えプラスミドpMEK2は、制限酵素B
amHIとXho1部位の間の配列を異種DNAと取り
替えるだけで、DHFRとの融合遺伝子を容易に作成で
きる。また、pMEK2を利用して融合遺伝子を作成し
た場合、融合遺伝子の発現の結果得られる融合タンパク
質の大腸菌菌体の蓄積量としては、全菌体タンパク質の
約20%が期待される。しかしながら、γ−エンドルフ
ィンの生産に上記発現ベクターを用いた例はない。
がある。しかしながら、遺伝子操作を利用した効率のよ
いγ−エンドルフィンの製造方法に間LrTj、tパ、
)で′″) h 1″I、N * l、t・、I 既に1本発明貴らは、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵
素(J’F、 D HF Rと略す。)遺伝子に間して
、その遺伝子の改変の結果、異種遺伝子発現用プラスミ
ドベクターpTP70−1 (特願昭61−31283
6)と、それを利用した融合遺伝子の作成方法(特願
昭62−302153)を開発している。また、pTP
70−1にメチオニンエンケファリン(以下、MEKと
略す、)を暗号化する化学DNAを組み込んで、MEK
の効率よい生産方法を開発している(特願 昭63−7
9680)、効率のよいMEKの生産方法を開発する際
に得られた組換えプラスミドpMEK2は、制限酵素B
amHIとXho1部位の間の配列を異種DNAと取り
替えるだけで、DHFRとの融合遺伝子を容易に作成で
きる。また、pMEK2を利用して融合遺伝子を作成し
た場合、融合遺伝子の発現の結果得られる融合タンパク
質の大腸菌菌体の蓄積量としては、全菌体タンパク質の
約20%が期待される。しかしながら、γ−エンドルフ
ィンの生産に上記発現ベクターを用いた例はない。
[発明の目的]
本発明の目的は、遺伝子操作の手法を用いたγ−エンド
ルフィンの大量生産方法を開発することにある。
ルフィンの大量生産方法を開発することにある。
本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究の結果、
γ−エンドルフィンを暗号化する遺伝子を設計・化学合
成し、pMEK2に組み込むことにより、γ−エンドル
フィン遺伝子とDHFR遺伝子との融合遺伝子を作成し
、融合遺伝子を大腸菌で発現させることにより、DHF
R−γ−エンドルフィン融合タンパク質(以下、融合タ
ンパク質と略す、)を大量に生産できることを見いだし
。
γ−エンドルフィンを暗号化する遺伝子を設計・化学合
成し、pMEK2に組み込むことにより、γ−エンドル
フィン遺伝子とDHFR遺伝子との融合遺伝子を作成し
、融合遺伝子を大腸菌で発現させることにより、DHF
R−γ−エンドルフィン融合タンパク質(以下、融合タ
ンパク質と略す、)を大量に生産できることを見いだし
。
さらに、v&合タンパク質を用いることにより効果的に
γ−エンドルフィンを作成できることを明らかにし9本
発明を完成させた。
γ−エンドルフィンを作成できることを明らかにし9本
発明を完成させた。
[発明の構成]
pENDC1を含有する大腸菌が生産する融合タンパク
質、(4)pENDC1を含有する大腸菌からの融合タ
ンパク質の分離精製方法、および(5)融合タンパク質
を用いたγ−エンドルフィンの製造方法、の発明により
構成される。
質、(4)pENDC1を含有する大腸菌からの融合タ
ンパク質の分離精製方法、および(5)融合タンパク質
を用いたγ−エンドルフィンの製造方法、の発明により
構成される。
(1)新規組換えプラスミドpENDc1第1図は1本
発明のpENDC1の全塩基配列を示している0図は、
2本鎖環状DNAのうち片方のDNA鎖配列配列を、プ
ラスミド中に2箇所存在する制限酵素C1aI部位のう
ち制限酵素Hindm部位に近い方の切断認識部位、
5’−ATCGAT−3’、の最初の”A11を1番と
して数えて、5”末端から3′末端の方向に記述してい
る。本発明のpENDCIは、新規な組換えプラスミド
である。
発明のpENDC1の全塩基配列を示している0図は、
2本鎖環状DNAのうち片方のDNA鎖配列配列を、プ
ラスミド中に2箇所存在する制限酵素C1aI部位のう
ち制限酵素Hindm部位に近い方の切断認識部位、
5’−ATCGAT−3’、の最初の”A11を1番と
して数えて、5”末端から3′末端の方向に記述してい
る。本発明のpENDCIは、新規な組換えプラスミド
である。
pENDClは、4676塩基対の大きさであり。
宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシリン
耐性を付与することができる− pENDC1は、p
MEK2 (特願 昭63−79680に記載。)のB
amHIとXho 1部位の間のMEKを暗号化する配
列を含む26塩基対の配列を。
耐性を付与することができる− pENDC1は、p
MEK2 (特願 昭63−79680に記載。)のB
amHIとXho 1部位の間のMEKを暗号化する配
列を含む26塩基対の配列を。
γ−エンドルフィンを暗号化する配列を含む62塩基対
の化学合成りNAと置き換えた構造をしている。第1図
において、53333番目594番目迄の配列が化学合
成りNA由来の配列である。
の化学合成りNAと置き換えた構造をしている。第1図
において、53333番目594番目迄の配列が化学合
成りNA由来の配列である。
それ以外の配列がpMEK2由来の配列である。
第1図の57番目から59090番目配列は。
DHFRのカルボキシ末端側にγ−エンドルフィンがア
ルギニン(Arg)を介して結合した融合タンパク質を
暗号化している。
ルギニン(Arg)を介して結合した融合タンパク質を
暗号化している。
融合タンパク質を暗号化する配列の上流には。
遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する(特願
昭6l−312836)。即ち、43番目から50番
目までの配列がSD配列と呼ばれるもので、効率の良い
翻訳に、また、4634番目から4662番目までが、
コンセンサス転写プロた場合、多量の融嬌タンパク質を
作らせることが’v*a、hい一ρ78ッッ7、つ。、
よ、。。2.ユ溶性の状態で2面体タンパク質の約20
%程度蓄積する。このことによって、pENDC1を含
有する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。
昭6l−312836)。即ち、43番目から50番
目までの配列がSD配列と呼ばれるもので、効率の良い
翻訳に、また、4634番目から4662番目までが、
コンセンサス転写プロた場合、多量の融嬌タンパク質を
作らせることが’v*a、hい一ρ78ッッ7、つ。、
よ、。。2.ユ溶性の状態で2面体タンパク質の約20
%程度蓄積する。このことによって、pENDC1を含
有する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。
また、pENDC1は、pMEK1由来の。
アンピシリン耐性遺伝子を有している。このことから、
pENDC1が導入された大腸菌は、アンピシリン耐性
をも示す。pENDC1は、大腸菌に導入されて安定状
態に保たれ、pENDC1を含有する大腸菌は2wI工
研にFERM BP−2030として寄託されている
。
pENDC1が導入された大腸菌は、アンピシリン耐性
をも示す。pENDC1は、大腸菌に導入されて安定状
態に保たれ、pENDC1を含有する大腸菌は2wI工
研にFERM BP−2030として寄託されている
。
このような特長を有するpENDC1は、実施例1に従
って作成することができるが2組換えプラスミドの作成
方法によって本発明が制限されるものではない。
って作成することができるが2組換えプラスミドの作成
方法によって本発明が制限されるものではない。
(2) pENDCIを含有する大腸菌pENDc1を
含有する大腸菌は、トリメトプリム及びアンピシリンに
対して耐性を示す。pENDC1を含有する大I!菌は
、融合タンパク質遺伝子の効率のよい発現の結果、融合
タンパク質を菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積する。
含有する大腸菌は、トリメトプリム及びアンピシリンに
対して耐性を示す。pENDC1を含有する大I!菌は
、融合タンパク質遺伝子の効率のよい発現の結果、融合
タンパク質を菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積する。
pENDCIを含有する大腸菌をYT+Ap培地(培
地ll中に、5gのNaC1,8gのトリプトン。
地ll中に、5gのNaC1,8gのトリプトン。
5gのイーストエキス、及び50 m gのアンピシリ
ンナトリウムを含む液体培地)を用いて、37℃で定常
期まで培養した場合、蓄積する融合タンパク質は、菌体
タンパク質の約20%に達する。
ンナトリウムを含む液体培地)を用いて、37℃で定常
期まで培養した場合、蓄積する融合タンパク質は、菌体
タンパク質の約20%に達する。
培養菌体を、リンii**衝液などの適当な緩衝液に懸
濁し、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、
これを遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合、全
ての融合タンパク質は上清中に回収される。pENDC
1を含有する大腸菌は、微工研にFERM BP−2
030として寄託されている。
濁し、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、
これを遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合、全
ての融合タンパク質は上清中に回収される。pENDC
1を含有する大腸菌は、微工研にFERM BP−2
030として寄託されている。
(3)融合タンパク質
第2図は、 融合タンパク質を暗号化する部分のDNA
配列とそ、れから作られると予想されるタンパク質のア
ミン酸配列を示している。融合タンパク質は、178ア
ミノ酸よりなる新規なタンパク質である。アミノ末端側
から数えて、1から15959番目の配列が、大113
mmの野生型DHFRに1箇所アミノWAtI置換置換
が起こフた( Cys−152(wild type>
−* Glu−152)配列であり、16262番目
17878番目がγ−エンドルフィンの配列である。γ
−エンドルフィンの配列の直前のアミノ酸はアルギニン
(A r g)である。γ−エンドルフィンはアルギニ
ンを含まない、このことから。
配列とそ、れから作られると予想されるタンパク質のア
ミン酸配列を示している。融合タンパク質は、178ア
ミノ酸よりなる新規なタンパク質である。アミノ末端側
から数えて、1から15959番目の配列が、大113
mmの野生型DHFRに1箇所アミノWAtI置換置換
が起こフた( Cys−152(wild type>
−* Glu−152)配列であり、16262番目
17878番目がγ−エンドルフィンの配列である。γ
−エンドルフィンの配列の直前のアミノ酸はアルギニン
(A r g)である。γ−エンドルフィンはアルギニ
ンを含まない、このことから。
融合タンパク質をアルギニルエンドペプチダーゼ(Ar
ginylendopeptidase、市販品として
入手可能)で処理することにより特異的に切り出すこと
ができる。160と16161番目ソロイシン(lie
)−ロイシン(L e u)の配列は、pMEK2のB
amH1部位にγ−エンドルフィンを暗号化するDNA
を導入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わせるため
に生じた配列である(pMEK2のもとどなったpTP
70−1が作るDHFRは、162個のアミノ酸よりな
り、第2図の融合タンパク質のアミノ酸配列のうち、ア
ミノ末端側から数えて、1から160番目までの配列に
。
ginylendopeptidase、市販品として
入手可能)で処理することにより特異的に切り出すこと
ができる。160と16161番目ソロイシン(lie
)−ロイシン(L e u)の配列は、pMEK2のB
amH1部位にγ−エンドルフィンを暗号化するDNA
を導入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わせるため
に生じた配列である(pMEK2のもとどなったpTP
70−1が作るDHFRは、162個のアミノ酸よりな
り、第2図の融合タンパク質のアミノ酸配列のうち、ア
ミノ末端側から数えて、1から160番目までの配列に
。
Gln−11eの2個のアミノ酸配列が結合した配列を
している。)。融合タンパク質およびγ−エンドルフィ
ンの分子量は、それぞれ20,135およl。
している。)。融合タンパク質およびγ−エンドルフィ
ンの分子量は、それぞれ20,135およl。
859である。
融合タンパク質は、新規なタンパク質である。
融合タンパク質はDHFRのカルボキシ末端側に。
γ−エンドルフィンが融合した構造をしているにもかか
わらず、DHFR酵禦活性を有する。このため、大腸菌
が融合タンパク質を多量につくると。
わらず、DHFR酵禦活性を有する。このため、大腸菌
が融合タンパク質を多量につくると。
DHFRの阻害剤であり抗細菌剤であるトリメトプリム
に対して、耐性を示すようになる。
に対して、耐性を示すようになる。
(4)融合タンパク質の分離精製
本発明の融合タンパク質の分離精製法は、■面体の培養
、■菌体の破砕、■D EAE −トヨパールカラム処
理、■メソトリキセー) (MTX)結合アフィニティ
クロマトグラフィー、および■DE A E −))7
.ヨバール力ラムクロマトグラフィーの、・・、( 過程より成り立っている。
、■菌体の破砕、■D EAE −トヨパールカラム処
理、■メソトリキセー) (MTX)結合アフィニティ
クロマトグラフィー、および■DE A E −))7
.ヨバール力ラムクロマトグラフィーの、・・、( 過程より成り立っている。
■菌体の培養
pENDC1を含有する大腸菌の培養は、YT+AI)
培地(培地11中に、5gのNaC1,8gのトリプト
ン、5gのイーストエキスおよび50mgのアンピシリ
ンナトリウムを含む液体培地。
培地(培地11中に、5gのNaC1,8gのトリプト
ン、5gのイーストエキスおよび50mgのアンピシリ
ンナトリウムを含む液体培地。
アンピシリンナトリウムを含む液体培地。)など。
菌体が成長する培地であれば、どの様な培地でも用いる
ことができるが、調べた限りでは、YT+Ap培地が最
適であった。
ことができるが、調べた限りでは、YT+Ap培地が最
適であった。
pENDC1を含有する大腸菌を、培地に接種し、37
℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する。培
養した菌体は、5,000回転/分の遠心分離により集
める。培地11より湿重量2から5gの菌体が得られる
。
℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する。培
養した菌体は、5,000回転/分の遠心分離により集
める。培地11より湿重量2から5gの菌体が得られる
。
集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
(0から10℃の間、4℃が望ましい)で行う。
(0から10℃の間、4℃が望ましい)で行う。
■菌体の破砕
培養して得られた菌体を、湿重量の3倍の緩衝液1 (
0,1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム(E
DTA)を含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH7
,0)に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕す
る。菌体破砕液を、35゜000回転、1時間超遠心分
離し、上清を得る(無細胞抽出液)。
0,1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム(E
DTA)を含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH7
,0)に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕す
る。菌体破砕液を、35゜000回転、1時間超遠心分
離し、上清を得る(無細胞抽出液)。
■DEAE−)ヨバール力ラム処理
無細胞抽出液を、あらかじめ50mMのKCIを含む緩
衝液1で平衡化したDEAE)ヨバール力ラムにかけ、
カラム容量の50mMのKCIを含む緩衝液1でカラム
を洗う。酵素の溶出は、緩衝液lを用いて0.1Mから
0.3MのKCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液
を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画する
。酵素の溶出は、0.3MのKCIを含む緩衝液lを用
いて行う。溶出液を一定量ずつフラクションコレクター
を用いて分画する。分画した溶出液についてD)(FR
活性を測定し、酵素活性が含まれる画■MTX結合アフ
ィニティクロマトグラフィーアフィニティ力ラムに吸着
させる。吸着後、IMのKCIを含む緩衝液2 (0,
1mMEDTAを含む10mMリン酸カリウム緩衝液、
p)(8,5)で洗う。洗いは、カラムからの溶出液の
280nmの吸光度を測定し、吸光度が0.1以下にな
るまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は、1MのK
CIと3mMの葉酸を含む緩衝液2を用いて行い、溶出
液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画す
る0分画した溶出液についてDHFR活性を測定し、酵
素活性が含まれる両分を集める。得られた酵素液を、緩
衝液1に対して。
衝液1で平衡化したDEAE)ヨバール力ラムにかけ、
カラム容量の50mMのKCIを含む緩衝液1でカラム
を洗う。酵素の溶出は、緩衝液lを用いて0.1Mから
0.3MのKCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液
を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画する
。酵素の溶出は、0.3MのKCIを含む緩衝液lを用
いて行う。溶出液を一定量ずつフラクションコレクター
を用いて分画する。分画した溶出液についてD)(FR
活性を測定し、酵素活性が含まれる画■MTX結合アフ
ィニティクロマトグラフィーアフィニティ力ラムに吸着
させる。吸着後、IMのKCIを含む緩衝液2 (0,
1mMEDTAを含む10mMリン酸カリウム緩衝液、
p)(8,5)で洗う。洗いは、カラムからの溶出液の
280nmの吸光度を測定し、吸光度が0.1以下にな
るまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は、1MのK
CIと3mMの葉酸を含む緩衝液2を用いて行い、溶出
液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画す
る0分画した溶出液についてDHFR活性を測定し、酵
素活性が含まれる両分を集める。得られた酵素液を、緩
衝液1に対して。
3回透析する。この段階で、純度95%以上の融合タン
パク質が得られる。
パク質が得られる。
■DEAE−)ヨパール力ラムク口マトグラフィ透析し
た酵素液を、あらかじめ緩衝液1で平衡化したDEAE
−)ヨバール力ラムに吸着させる。
た酵素液を、あらかじめ緩衝液1で平衡化したDEAE
−)ヨバール力ラムに吸着させる。
吸着後、50mMKCIを含む緩衝液1で洗う。
酵素の溶出は、緩衝液1を用いて50mMから0゜3M
のKCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量
ずつフラクションコレクターを用いて分画する。分画し
た溶出液について280nmの吸光度とDHFRHF上
を測定する。
のKCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量
ずつフラクションコレクターを用いて分画する。分画し
た溶出液について280nmの吸光度とDHFRHF上
を測定する。
酵素活性/280nmの吸光度の値が、一定な両分を集
める。
める。
以上の操作により、融合タンパク質の高度精製均一化を
、再現性良く行うことができる。
、再現性良く行うことができる。
本発明に従うと、融合タンパク質の精製は、菌体の培養
を含めて一週間以内に行うことができ。
を含めて一週間以内に行うことができ。
回収率50%以上で、均一な酵素標品を得ることができ
る。
る。
DHFR酵素活性は9反応液 (0,05mMのン酸緩
衝液(pH7,0))を、1mlのキュベツトとり、こ
れに酵素液を加え、340nmの吸光度の時間変化を測
定することにより行う。酵素1ユニツトは、上記反応条
件において、1分間に1マイクロモルのジヒドロ葉酸を
還元するのに必要な酵素量として定義する。この測定は
1分光光勘−L ンの製造 精製した融合タンパク質からのγ−エンドルフィンの切
断・分離は、アルギニルエンドペプチダーゼ(Argi
nylendopeptidase、市販品として入手
可能)で処理することにより行う。精製した融合タンパ
ク質1重量に対して、アルギニルエンドペプチダーゼ0
.01重量の割合で加え、37℃で50mM Tri
s−HC1il衝液、pH8,5中。
衝液(pH7,0))を、1mlのキュベツトとり、こ
れに酵素液を加え、340nmの吸光度の時間変化を測
定することにより行う。酵素1ユニツトは、上記反応条
件において、1分間に1マイクロモルのジヒドロ葉酸を
還元するのに必要な酵素量として定義する。この測定は
1分光光勘−L ンの製造 精製した融合タンパク質からのγ−エンドルフィンの切
断・分離は、アルギニルエンドペプチダーゼ(Argi
nylendopeptidase、市販品として入手
可能)で処理することにより行う。精製した融合タンパ
ク質1重量に対して、アルギニルエンドペプチダーゼ0
.01重量の割合で加え、37℃で50mM Tri
s−HC1il衝液、pH8,5中。
24時間処理する。反応液に等量の50%酢酸を加える
。この試料を、)IPLc装置(島津LC−リフルオロ
酢酸中、15%から50%のア七トニに11+1./r
1#−Mif;l?FIJlsfa中、n曽+2 −n
山物は、220nmにおける吸光度の測定により検出す
ることができる。第3図は、アルギニルエンドペプチダ
ーゼ処理した融合タンパク質試料の高速液体クロマトグ
ラムを示している。試料注入後約20分後のピークがγ
−エンドルフィンである。
。この試料を、)IPLc装置(島津LC−リフルオロ
酢酸中、15%から50%のア七トニに11+1./r
1#−Mif;l?FIJlsfa中、n曽+2 −n
山物は、220nmにおける吸光度の測定により検出す
ることができる。第3図は、アルギニルエンドペプチダ
ーゼ処理した融合タンパク質試料の高速液体クロマトグ
ラムを示している。試料注入後約20分後のピークがγ
−エンドルフィンである。
このピーク画分を分離する0分離した溶出液をエバボレ
ーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除き
、γ−エンドルフィンを得ることができる。また、得ら
れたペプチドを酸加水分解後。
ーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除き
、γ−エンドルフィンを得ることができる。また、得ら
れたペプチドを酸加水分解後。
アミノ酸分析することによりアミノvi組成を確かめる
ことができる。
ことができる。
本発明の実施例においては、31の培地から湿重量的1
1gの菌体が得られ、この菌体く計算上。
1gの菌体が得られ、この菌体く計算上。
約252mgの融合タンパク質、約23.3mgのγ−
エンドルフィンを含む、)から、約132mgの融合タ
ンパク質(収率、52%、計算上的12mgのγ−エン
ドルフィンを含む、)を精製して得ることができ、この
うち、20mgの融合3mgのγ−エンドルフィンを得
ることができた。
エンドルフィンを含む、)から、約132mgの融合タ
ンパク質(収率、52%、計算上的12mgのγ−エン
ドルフィンを含む、)を精製して得ることができ、この
うち、20mgの融合3mgのγ−エンドルフィンを得
ることができた。
[発明の効果コ
本発明の、新規プラスミドpENDc1およびpEND
C1を含有する大腸菌を用いることにより、融合タンパ
ク質を容易にかつ高収率で分!!精製することが得られ
ること、また、タンパク質分解酵素で処理することによ
り融合タンパク質から効率よくγ−エンドルフィンを切
り出すことができることからモルヒネ様生理活性を有す
ることが知られているγ−エンドルフィンの生産に有効
である。
C1を含有する大腸菌を用いることにより、融合タンパ
ク質を容易にかつ高収率で分!!精製することが得られ
ること、また、タンパク質分解酵素で処理することによ
り融合タンパク質から効率よくγ−エンドルフィンを切
り出すことができることからモルヒネ様生理活性を有す
ることが知られているγ−エンドルフィンの生産に有効
である。
次に本発明の実施例を示す。
実施例1
pENDC1の作成
γ−エンドルフィンを暗号化するDNAとしては。
1、5’−GATCCGCTACGGCGGTTTCA
TGACCTCAG−3’2、5’−AAAAATCA
CAGACCCCGCTG−3’3、5’−TCGAG
TTATTCACCTTTTTTG−3’4、5’−T
ATGCGTTTTTGATGATTG−3’5、5’
−GTGACTCTGTAAC−3’6、5’−TCG
AGTTACAGAGTCACCAGCGGGG−3’
の6本のDNAをホスホアミダイト法に従って化学合成
し、精製後、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、各D
NAの5′末端をリン酸化した。リン酸化したDNAを
約0.1ml (約0.01ggのDNAを含んでいる
。)ずつ取り、これを60℃でインキュベートすること
によって両D N AをアニールさせたくこれをDNA
Iと呼ぶ)。
TGACCTCAG−3’2、5’−AAAAATCA
CAGACCCCGCTG−3’3、5’−TCGAG
TTATTCACCTTTTTTG−3’4、5’−T
ATGCGTTTTTGATGATTG−3’5、5’
−GTGACTCTGTAAC−3’6、5’−TCG
AGTTACAGAGTCACCAGCGGGG−3’
の6本のDNAをホスホアミダイト法に従って化学合成
し、精製後、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、各D
NAの5′末端をリン酸化した。リン酸化したDNAを
約0.1ml (約0.01ggのDNAを含んでいる
。)ずつ取り、これを60℃でインキュベートすること
によって両D N AをアニールさせたくこれをDNA
Iと呼ぶ)。
約1μgのpMIE K 2を、BamHlおよびXh
olで切断した後、アルカリホスファターゼ処理をした
。アルカリホスファターゼ処理したD I’JAをフェ
ノ−ノリ処理することにより、共存する酵素タンパク質
を変性除去し、その後エタノールでDNAを沈澱空寸た
。沈澱したDNAを70%エタノールで洗った後、エタ
ノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥させた。BamHI
およびXho 1によるDNAの切断、アルカリホスフ
ァターゼ処理、フェノール処理、およびエタノール沈澱
の各操作は、いずれも、 ”Mo1ecular CI
oningALoboratory Manual”
(T、Maniatis、 E、F、Fr1tsch、
J、Sambrook、eds、 Co1d Spr
ingHarborLaboratory (19B2
)、以下8文献1と呼ぶ。)に記載している方法に従っ
て行った。乾燥させたDNAを50μmのリガーゼ用反
応液(10mMTris−)ICI。
olで切断した後、アルカリホスファターゼ処理をした
。アルカリホスファターゼ処理したD I’JAをフェ
ノ−ノリ処理することにより、共存する酵素タンパク質
を変性除去し、その後エタノールでDNAを沈澱空寸た
。沈澱したDNAを70%エタノールで洗った後、エタ
ノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥させた。BamHI
およびXho 1によるDNAの切断、アルカリホスフ
ァターゼ処理、フェノール処理、およびエタノール沈澱
の各操作は、いずれも、 ”Mo1ecular CI
oningALoboratory Manual”
(T、Maniatis、 E、F、Fr1tsch、
J、Sambrook、eds、 Co1d Spr
ingHarborLaboratory (19B2
)、以下8文献1と呼ぶ。)に記載している方法に従っ
て行った。乾燥させたDNAを50μmのリガーゼ用反
応液(10mMTris−)ICI。
pH7,4,5mM M3C12,10mMジチオトレ
イトール、5mM ATP)に溶解後、5μmのDNA
Iを加え、これに1ユニツトの74−DNAリガーゼを
加えて。
イトール、5mM ATP)に溶解後、5μmのDNA
Iを加え、これに1ユニツトの74−DNAリガーゼを
加えて。
10℃で、12時間DNAの連結反応を行わせた。
この反応物を、形質転換法(transformati
on method、上記文献1に記載)に従って、大
腸菌H8101株に取り込ませた。この処理をした菌体
を。
on method、上記文献1に記載)に従って、大
腸菌H8101株に取り込ませた。この処理をした菌体
を。
50mg/mlのアンピシリンナトリウムおよび10m
g/mlのトリメトプリムを含む栄養寒天培地(培地1
1中に、2gのグルコース、1gのリン酸2カリウム、
5gのイーストエキス、5gのポリペプトン、15gの
寒天を含む、)上に塗布し、37℃で24時間培養する
ことにより。
g/mlのトリメトプリムを含む栄養寒天培地(培地1
1中に、2gのグルコース、1gのリン酸2カリウム、
5gのイーストエキス、5gのポリペプトン、15gの
寒天を含む、)上に塗布し、37℃で24時間培養する
ことにより。
26個のコロニーを得ることができた。これらのコロニ
ーのうちから適当に8個選び、各々を1゜5mlのYT
+Ap培地(培地Il中に、5gのNaC1,5gのイ
ーストエキス、8gのトリプトン、50mgのアンピシ
リンナトリウムを含む。
ーのうちから適当に8個選び、各々を1゜5mlのYT
+Ap培地(培地Il中に、5gのNaC1,5gのイ
ーストエキス、8gのトリプトン、50mgのアンピシ
リンナトリウムを含む。
)で、37℃、1晩、菌体を培養した。培養液を。
各々エッペンドルフ遠心管にとり、12,000回転/
分で10分間遠心分離し、W体を沈澱として集めた。こ
れに、0.1mlの電気泳動用サンプル調製液(0,0
625MのTris−HCI、 pH6,8,21のラ
ウリル硫酸ナトリウム(SDS)、10χのグリセリン
、 5X02−メルカプトエタノール、 0.001!
のブロムフェノールブルーを含む。)を加え2面体を懸
濁し、こ塾−を沸騰水中に5分間保ち、菌体を溶標準サ
ンプルとしてpMEK2を含有する大腸菌に同様な処理
をしたもの、および分子量マーカーとしてラクトアルブ
ミン(分子量14.200) 、 )リブシンインヒ
ビター(分子f120,100) 、トリプシノーゲン
(分子:124,000) 、カルボニックアンヒドラ
ーゼ(分子j129,000) 、グリセロアルデヒド
3−リン酸デヒドロゲナーゼ(分子量36,000)
、卵アルブミン(分子量45.000) 、および牛血
清アルブミン(分子ft68,000)を含むサンプル
をポリアクリルアミド濃度の10から20%濃度勾配ゲ
ルで泳動した。その結果、すべてのコロニーにおいて。
分で10分間遠心分離し、W体を沈澱として集めた。こ
れに、0.1mlの電気泳動用サンプル調製液(0,0
625MのTris−HCI、 pH6,8,21のラ
ウリル硫酸ナトリウム(SDS)、10χのグリセリン
、 5X02−メルカプトエタノール、 0.001!
のブロムフェノールブルーを含む。)を加え2面体を懸
濁し、こ塾−を沸騰水中に5分間保ち、菌体を溶標準サ
ンプルとしてpMEK2を含有する大腸菌に同様な処理
をしたもの、および分子量マーカーとしてラクトアルブ
ミン(分子量14.200) 、 )リブシンインヒ
ビター(分子f120,100) 、トリプシノーゲン
(分子:124,000) 、カルボニックアンヒドラ
ーゼ(分子j129,000) 、グリセロアルデヒド
3−リン酸デヒドロゲナーゼ(分子量36,000)
、卵アルブミン(分子量45.000) 、および牛血
清アルブミン(分子ft68,000)を含むサンプル
をポリアクリルアミド濃度の10から20%濃度勾配ゲ
ルで泳動した。その結果、すべてのコロニーにおいて。
pMEK2のD HF R−ME K融合タンパク質の
バンドが消失し、それより明らかに分子量が大きくなっ
たタンパク質(分子量約24 、000と推定される。
バンドが消失し、それより明らかに分子量が大きくなっ
たタンパク質(分子量約24 、000と推定される。
)が認められた。pMEK2のDHFR−MEK!合タ
ンパク質(分子fit、18,963)は、この条件で
分子量約22,000のタンパク質として泳動する。
ンパク質(分子fit、18,963)は、この条件で
分子量約22,000のタンパク質として泳動する。
これらのうちから適当に一株を選び、これをYT+Ap
培地で培養し、 TanakaとWe i sb I
1mの方法(T、Tanaka、 B、Weisbl
um; J、 Bacteriology、 vol。
培地で培養し、 TanakaとWe i sb I
1mの方法(T、Tanaka、 B、Weisbl
um; J、 Bacteriology、 vol。
121 、p、354(1975))に従って、プラス
ミドを調製した。得られたプラスミドをpENDC1と
名づけた。pENDC1は、 pMEK2のBam1(
IとXho Iとの間の配列が、化学合成したDNA配
列と置き変わった構造をしているはずである。
ミドを調製した。得られたプラスミドをpENDC1と
名づけた。pENDC1は、 pMEK2のBam1(
IとXho Iとの間の配列が、化学合成したDNA配
列と置き変わった構造をしているはずである。
pENDClのEcoRI (第1図の471−476
76番目列)と5ail(第1図の892−89898
番目列)による切断によって得られる約400ヌクレオ
チド長のDNAについて2M13フアージを用いたジデ
オキシ法(J、Messing;Mehtods in
Enzymology、 vol、101,1)−2
0(1983))に従って、塩基配列を決定した。その
結果、第1図に示す配列の47171番目約898番日
進の配列が確かめられた。塩基配列を検討することによ
り、pENDC1が融合タンパク質を暗号化することが
明らかとなった。
76番目列)と5ail(第1図の892−89898
番目列)による切断によって得られる約400ヌクレオ
チド長のDNAについて2M13フアージを用いたジデ
オキシ法(J、Messing;Mehtods in
Enzymology、 vol、101,1)−2
0(1983))に従って、塩基配列を決定した。その
結果、第1図に示す配列の47171番目約898番日
進の配列が確かめられた。塩基配列を検討することによ
り、pENDC1が融合タンパク質を暗号化することが
明らかとなった。
pMEK2の塩基配列は2本発明者らによりて明らかに
されている(特願 昭63−’79679)は、Pst
l、Hindm、Hpal、Aatll。
されている(特願 昭63−’79679)は、Pst
l、Hindm、Hpal、Aatll。
PvuII、BglII、およびC1alを用いた制限
酵素による切断実験の結果、pMEK2のEcoRI−
Sail切断によって得られる約4.2キロ塩基対のD
NAと全く同一であることが示された。
酵素による切断実験の結果、pMEK2のEcoRI−
Sail切断によって得られる約4.2キロ塩基対のD
NAと全く同一であることが示された。
以上の結果から、pENDC1の全塩基配列が第1図に
示した配列であることが決められた。
示した配列であることが決められた。
実施例2
pENDClを含有する大腸菌が作る融合タンパク質
pENDC1を含有する大ki菌が作る融合タンパク質
のアミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予想すること
ができる。第1図の57番目から59090番目列が融
合タンパク質を暗号化していることから、トリブレット
暗号表を用いて、アミノ酸配列を推定した。その結果第
2図に示すアミノ酸配列が得られた。
のアミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予想すること
ができる。第1図の57番目から59090番目列が融
合タンパク質を暗号化していることから、トリブレット
暗号表を用いて、アミノ酸配列を推定した。その結果第
2図に示すアミノ酸配列が得られた。
pENDC1を含有する大腸菌から、エンドルフィン融
合タンパク質を分離精製し、精製したタンパク質の性質
を調べた。
合タンパク質を分離精製し、精製したタンパク質の性質
を調べた。
融合タンパク質の精製
A、用いた菌体量:湿重量 11g
B、酵素精製表
表における精製過程は■無細胞抽出液、■DEAE−)
ヨパール力うム処理、■メソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフィー、および■DEAE−)ヨパー
ル力ラムクロマトグラフィーを表す。
ヨパール力うム処理、■メソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフィー、および■DEAE−)ヨパー
ル力ラムクロマトグラフィーを表す。
精製 酵素液 回収タンパ 回収酵素 収率過程 の量
(1)り質(mg) 活性(ユニット)(χ)6.
763 5.902 4 、386 3.539 87.3 64.9 52.3 得られた酵Lff’ンパク質をSDS電気泳動法(上記
実施例に記載の方法)により分析したところ。
(1)り質(mg) 活性(ユニット)(χ)6.
763 5.902 4 、386 3.539 87.3 64.9 52.3 得られた酵Lff’ンパク質をSDS電気泳動法(上記
実施例に記載の方法)により分析したところ。
分子量的24 、000の単一なタンパク質バンドが示
され、得られた酵素標品が均一であることが示された。
され、得られた酵素標品が均一であることが示された。
分M精製した融合タンパク質の性質
精製したDHFR活性を示すタンパク質をエンザイムイ
ムノアッセイにより検討したところ、γ−エンドルフィ
ンに対する抗体と反応することが示された。即ち、精製
して得られたタンパク質は免疫学的にγ−エンドルフィ
ンと同等の構造を含んでいることが明らかとなった。
ムノアッセイにより検討したところ、γ−エンドルフィ
ンに対する抗体と反応することが示された。即ち、精製
して得られたタンパク質は免疫学的にγ−エンドルフィ
ンと同等の構造を含んでいることが明らかとなった。
精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端側のアミ
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼYを1M製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量したくカルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定法
)、その結果。
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼYを1M製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量したくカルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定法
)、その結果。
−Vat−Thr−Leu (カルボキシ末端)である
ことが予想された。また、精製して得られたタンパク質
を酸加水分解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配
列の結果予想されるアミノM組成と一致した結果が得ら
れた。
ことが予想された。また、精製して得られたタンパク質
を酸加水分解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配
列の結果予想されるアミノM組成と一致した結果が得ら
れた。
実施例3
精製分離した融合タンパク質からのγ−エンドルフィン
の分離 実施例2で得られた2mlの精製均一化した融合タンパ
ク質の溶液(緩衝液1中、約20 m g 。
の分離 実施例2で得られた2mlの精製均一化した融合タンパ
ク質の溶液(緩衝液1中、約20 m g 。
約1.OOOnmo i eの融合タンパク質を含む)
に、0.2mgのアルギニルエンドペプチダーゼを加え
、37°Cで24時間反応させる。反応後。
に、0.2mgのアルギニルエンドペプチダーゼを加え
、37°Cで24時間反応させる。反応後。
1mlの酢酸を加える。そのうちの、0.5m1(約1
67nmoleの融合タンパク質を含むはず)をとり、
高速液体クロマドグフィー装置(島津LC−4A)を用
いInertsil−0055Bmカラムで分離した。
67nmoleの融合タンパク質を含むはず)をとり、
高速液体クロマドグフィー装置(島津LC−4A)を用
いInertsil−0055Bmカラムで分離した。
溶出は、0.1%トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル
の濃度勾配(15%から50は、15%め゛ナセニトリ
ルを用い、2分から32分までは、15%から50%の
アセトニトリルの直線濃度勾配をかけた。その結果、第
3図に示すような溶出曲線が得られた。試料注入後約2
3分後のピーク画分を分離し2分離した溶出液をエバボ
レーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除
き、ペプチドを得た。得られたペプチドを酸加水分解後
、その10分の1をアミノ酸分析に用いた。その結果、
グルタミン+グルタミン酸。
の濃度勾配(15%から50は、15%め゛ナセニトリ
ルを用い、2分から32分までは、15%から50%の
アセトニトリルの直線濃度勾配をかけた。その結果、第
3図に示すような溶出曲線が得られた。試料注入後約2
3分後のピーク画分を分離し2分離した溶出液をエバボ
レーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除
き、ペプチドを得た。得られたペプチドを酸加水分解後
、その10分の1をアミノ酸分析に用いた。その結果、
グルタミン+グルタミン酸。
ロイシン、グリシン、リジン、メチオニン、フェニルア
ラニン、プロリン、セリン、スレオニン。
ラニン、プロリン、セリン、スレオニン。
チロシン、およびバリンがそれぞれ、23.1゜24.
5,22.0,11.5.10.8,11゜1、12.
4.21.7.33.1.10.5および11.5nm
o I eずつ検出された。アミノM組成は、γ−エン
ドルフィンのそれと一致した。
5,22.0,11.5.10.8,11゜1、12.
4.21.7.33.1.10.5および11.5nm
o I eずつ検出された。アミノM組成は、γ−エン
ドルフィンのそれと一致した。
また、アミノ酸分析に用いた標品は、約11.3nmo
le(約21.0μg)のγ−エンドルフィンを含んで
いたことになる。この結果から、精製均一化した融合タ
ンパク質を用いて、アルギニルエンドペプチダーゼ処理
した標品をHPLCを用いて分離することにより収率的
68%でγ−エンドルフィンを回収できることが明かと
なった。
le(約21.0μg)のγ−エンドルフィンを含んで
いたことになる。この結果から、精製均一化した融合タ
ンパク質を用いて、アルギニルエンドペプチダーゼ処理
した標品をHPLCを用いて分離することにより収率的
68%でγ−エンドルフィンを回収できることが明かと
なった。
融合タンパク質の精製の収率が約52%であり。
融合タンパク質からのγ−エンドルフィンの分離の収率
が約68%であることから、大腸菌がつくるγ−エンド
ルフィンの単離収率が約35%であると計算される。
が約68%であることから、大腸菌がつくるγ−エンド
ルフィンの単離収率が約35%であると計算される。
第1図は、pENDC1の全塩基配列を示した図であり
、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけを、5′
末端から32末端の方向に記述している。図中符号は、
核酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、G
はグアニンを、Tはチミンを示している。図中番号は、
pENDC1に2箇所存在する制限酵素C1al切断認
識部位のうち制限酵素Hind I I I切断部位に
近い方′1 のC1al切断認識部位の、5’ −ATCGAT−3
′、の最初の”A”を1番として数えた番号を示してい
る。 第2図は、pENDC1中に存在する融合タンパク質を
暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸
配列を示す図である。図中符号は。 核酸塩基およびアミノ酸を表し、Aはアデニンを。 Cはシトシンを、Gはグアニンを、Tはチミンを。 Alaはアラニンを、Argはアルギニンを、Asnは
アスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cysは
システィンを、Ginはグルタミンを、Gluはグルタ
ミン酸を、 Gryはグリシンを、)lisはヒスチジ
ンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシンを、
Lysはリジンを。 Metはメチオニンを、Pheはフェニルアラニンを、
Proはプロリンを、Setはセリンを。 Thrはトレオニンを、Trpはトリプトファンを、T
yrはチロシンを、Valはバリンを示している。図中
番号は、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化す
るATGコドンのn A ITを1番として数えた番号
を示している。 第3図は。 アルギニルエンドペプチダーゼ処理 した融合タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを示
している。 横軸は試料注入後の時間を分車 位で。 縦軸は。 220nmの吸光度を任意単位で 表現している。 矢印で示したピークがγ−エンド ルフィンの溶出ピークである。
、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけを、5′
末端から32末端の方向に記述している。図中符号は、
核酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、G
はグアニンを、Tはチミンを示している。図中番号は、
pENDC1に2箇所存在する制限酵素C1al切断認
識部位のうち制限酵素Hind I I I切断部位に
近い方′1 のC1al切断認識部位の、5’ −ATCGAT−3
′、の最初の”A”を1番として数えた番号を示してい
る。 第2図は、pENDC1中に存在する融合タンパク質を
暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸
配列を示す図である。図中符号は。 核酸塩基およびアミノ酸を表し、Aはアデニンを。 Cはシトシンを、Gはグアニンを、Tはチミンを。 Alaはアラニンを、Argはアルギニンを、Asnは
アスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cysは
システィンを、Ginはグルタミンを、Gluはグルタ
ミン酸を、 Gryはグリシンを、)lisはヒスチジ
ンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシンを、
Lysはリジンを。 Metはメチオニンを、Pheはフェニルアラニンを、
Proはプロリンを、Setはセリンを。 Thrはトレオニンを、Trpはトリプトファンを、T
yrはチロシンを、Valはバリンを示している。図中
番号は、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化す
るATGコドンのn A ITを1番として数えた番号
を示している。 第3図は。 アルギニルエンドペプチダーゼ処理 した融合タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを示
している。 横軸は試料注入後の時間を分車 位で。 縦軸は。 220nmの吸光度を任意単位で 表現している。 矢印で示したピークがγ−エンド ルフィンの溶出ピークである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
ことができ、4676塩基対の大きさを有し、第1図に
おいて示されるDNA配列を有する新規組換えプラスミ
ドpENDC1。 2、pENDC1を含有する大腸菌。 3、pENDC1を含有する大腸菌が生産し、第2図に
よって示されるアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元
酵素−γ−エンドルフィン融合タンパク質。 4、pENDC1を含有する大腸菌を培養し、ジヒドロ
葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元酵素−γ
−エンドルフィン融合タンパク質を、培養菌体の無細胞
抽出液から、メソトリキセート結合アフィニティカラム
クロマトグラフィー、および陰イオン交換カラムクロマ
トグラフィーを用いて精製することを特徴とするジヒド
ロ葉酸還元酵素−γ−エンドルフィン融合タンパク質の
分離精製方法。 5、pENDC1を含有する大腸菌の生産するジヒドロ
葉酸還元酵素−γ−エンドルフィン融合タンパク質を分
離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元酵素−γ−エンド
ルフィン融合タンパク質をタンパク質分解酵素で消化し
た後、γ−エンドルフィンを分離精製することを特徴と
するγ−エンドルフィンの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63231247A JPH0279977A (ja) | 1988-09-14 | 1988-09-14 | γ−エンドルフィン |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63231247A JPH0279977A (ja) | 1988-09-14 | 1988-09-14 | γ−エンドルフィン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0279977A true JPH0279977A (ja) | 1990-03-20 |
JPH042234B2 JPH042234B2 (ja) | 1992-01-16 |
Family
ID=16920629
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63231247A Granted JPH0279977A (ja) | 1988-09-14 | 1988-09-14 | γ−エンドルフィン |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0279977A (ja) |
-
1988
- 1988-09-14 JP JP63231247A patent/JPH0279977A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH042234B2 (ja) | 1992-01-16 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |