JPH0279976A - α−エンドルフィン - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野コ
本発明は、α−エンドルフィンの遺伝子組換え法による
新規な製造方法およびそれに係わる組換えプラスミド、
形質転換株、融合タンパク質に間する。
新規な製造方法およびそれに係わる組換えプラスミド、
形質転換株、融合タンパク質に間する。
α−エンドルフィンは、16個のアミノ酸より構成され
るモルヒネ様生理活性を有するペプチドであり、下記ア
ミノ酸配列を有する。
るモルヒネ様生理活性を有するペプチドであり、下記ア
ミノ酸配列を有する。
α−エンドルフィン: Tyr−Gly−Gly−Ph
e−Met−Thr−Ser−Glu−Lys−Ser
−Gl n−Thr−Pro−Leu−Va l −T
hr本発明の新規組換えプラスミドpENDA1は。
e−Met−Thr−Ser−Glu−Lys−Ser
−Gl n−Thr−Pro−Leu−Va l −T
hr本発明の新規組換えプラスミドpENDA1は。
第1図において示されるDNA配列を有する0本発明は
2発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。
2発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。
[従来の技術]
α−エンドルフィンは2モルヒネ様生理活性を示すエン
ドルフィン類に属するペプチドであり。
ドルフィン類に属するペプチドであり。
ロイシンエンケファリンの約8倍、メチオニンエンケフ
ァリンの約5倍の鎮痛活性を示す興味深い生理活性ペプ
チドである。
ァリンの約5倍の鎮痛活性を示す興味深い生理活性ペプ
チドである。
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。しかしながら、遺伝子操作を利用した効率のよ
いα−エンドルフィンの製造方法に関しては、知られて
いない。
がある。しかしながら、遺伝子操作を利用した効率のよ
いα−エンドルフィンの製造方法に関しては、知られて
いない。
既に1本発明者らは、大腸菌由来のジヒドロ葉現用プラ
スミドベクターpTP70−1 (特願昭61−312
836>と、それを利用した融合遺伝子の作成方法(特
願 昭62−302153)を開発している。また、p
TP70−1にメチオニンエンケファリン(、以下、M
EKと略す、)を暗号化する化学DNAを組み込んで、
MEKの効率よい生産方法を開発している(特願 昭6
3−79680)、効率のよいMEKの生産方法を開発
する際に得られた組換えプラスミドpMEK2は、制限
酵素BamHIとXho1部位の間の配列を異種DNA
と取り替えるだけで、DHFRとの融合遺伝子を容易に
作成できる。また、pMEK2を利用して融合遺伝子を
作成した場合、融合遺伝子の発現の結果得られる融合タ
ンパク質の大Ill菌菌体の蓄積量としては、全閉体タ
ンパク質の約20%が期待される。しかしながら、α−
エンドルフィンの生産に上記発現ベクターを用いた例は
ない。
スミドベクターpTP70−1 (特願昭61−312
836>と、それを利用した融合遺伝子の作成方法(特
願 昭62−302153)を開発している。また、p
TP70−1にメチオニンエンケファリン(、以下、M
EKと略す、)を暗号化する化学DNAを組み込んで、
MEKの効率よい生産方法を開発している(特願 昭6
3−79680)、効率のよいMEKの生産方法を開発
する際に得られた組換えプラスミドpMEK2は、制限
酵素BamHIとXho1部位の間の配列を異種DNA
と取り替えるだけで、DHFRとの融合遺伝子を容易に
作成できる。また、pMEK2を利用して融合遺伝子を
作成した場合、融合遺伝子の発現の結果得られる融合タ
ンパク質の大Ill菌菌体の蓄積量としては、全閉体タ
ンパク質の約20%が期待される。しかしながら、α−
エンドルフィンの生産に上記発現ベクターを用いた例は
ない。
[発明の目的コ
本発明の目的は、遺伝子操作の手法を用いたα−エンド
ルフィンの大量生産方法を開発することにある。
ルフィンの大量生産方法を開発することにある。
本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究の結果、
α−エンドルフィンを暗号化する遺伝子を設計・化学合
成し、 pMEK2に組み込むことにより、α−エン
ドルフィン遺伝子とDHFR遺伝子との融合遺伝子を作
成し、融合遺伝子を大腸菌で発現させることにより、D
HFR−α−エンドルフィン融合タンパク質(以下、融
合タンパク質と略す。)を大量に生産できることを見い
だし。
α−エンドルフィンを暗号化する遺伝子を設計・化学合
成し、 pMEK2に組み込むことにより、α−エン
ドルフィン遺伝子とDHFR遺伝子との融合遺伝子を作
成し、融合遺伝子を大腸菌で発現させることにより、D
HFR−α−エンドルフィン融合タンパク質(以下、融
合タンパク質と略す。)を大量に生産できることを見い
だし。
さらに、融合タンパク質を用いることにより効果的にα
−エンドルフィンを作成できることを明らかにし9本発
明を完成させた。
−エンドルフィンを作成できることを明らかにし9本発
明を完成させた。
[発明の構成]
本発明は、(1)融合タンパク質の大量発現を可能にす
る新規組換えプラスミドpENDA1゜p E N D
A−1を含有する大腸菌が生産する融合タンパク質、
(4)pENDAlを含有する大Ill菌からの融合タ
ンパク質の分離精製方法、および(5)融合タンパク質
を用いたα−エンドルフィンの製造方法、の発明により
構成される。
る新規組換えプラスミドpENDA1゜p E N D
A−1を含有する大腸菌が生産する融合タンパク質、
(4)pENDAlを含有する大Ill菌からの融合タ
ンパク質の分離精製方法、および(5)融合タンパク質
を用いたα−エンドルフィンの製造方法、の発明により
構成される。
(1)新規組換えプラスミドp ENDA 1第1図は
2本発明のpENDAlの全塩基配列を示している。図
は、2本鎖環状DNAのうち片方のDNAfi配列だけ
を、プラスミド中に2箇所存在する制限酵素C1a1部
位のうち制限酵素Hindm部位に近い方の切断認識部
位、 5’−ATCGAT−3’、の最初の゛A″を1
番として数えて、5′末端から3”末端の方向に記述し
ている。本発明のpENDAIは、新規な組換えプラス
ミドである。
2本発明のpENDAlの全塩基配列を示している。図
は、2本鎖環状DNAのうち片方のDNAfi配列だけ
を、プラスミド中に2箇所存在する制限酵素C1a1部
位のうち制限酵素Hindm部位に近い方の切断認識部
位、 5’−ATCGAT−3’、の最初の゛A″を1
番として数えて、5′末端から3”末端の方向に記述し
ている。本発明のpENDAIは、新規な組換えプラス
ミドである。
pENDAIは、4873塩基対の大きさであり。
宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシリン
耐性を付与することができる。pENDAlは、pME
K2 (特願 昭63−79680に記載。)のBam
HIとXho1部位の間のMEKを暗号化する配列を含
む26塩基対の配列を。
耐性を付与することができる。pENDAlは、pME
K2 (特願 昭63−79680に記載。)のBam
HIとXho1部位の間のMEKを暗号化する配列を含
む26塩基対の配列を。
α−エンドルフィンを暗号化する配列を含む59塩基対
の化学合成りNAと置き換えた構造をしている。第1図
において、533番目から591番目迄の配列が化学合
成りNA由来の配列である。
の化学合成りNAと置き換えた構造をしている。第1図
において、533番目から591番目迄の配列が化学合
成りNA由来の配列である。
それ以外の配列がpMEK2由来の配列である。
第1図の57番目から588番目まで配列は。
DHFHのカルボキシ末端側にα−エンドルフィンがア
ルギニン(Arg)を介して結合した融合タンパク質を
暗号化している。
ルギニン(Arg)を介して結合した融合タンパク質を
暗号化している。
融合タンパク質を暗号化する配列の上流には。
遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する(特願
昭61−312836> 、即ち、43番目から50
番目までの配列がSD配列と呼ばれるもので、効率の良
い翻訳に、また、4631631番目659659番目
、コンセンサス転写プロモーターであり、効率の良い転
写に貢献する。このことから、pENDAlは、大腸菌
に導入された場合τ、1多量の融合タンパク質を作らせ
ることが11「 積する。このことによって、pENDAlを含有する大
腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。また、p
END八1はへpMEK1由来の。
昭61−312836> 、即ち、43番目から50
番目までの配列がSD配列と呼ばれるもので、効率の良
い翻訳に、また、4631631番目659659番目
、コンセンサス転写プロモーターであり、効率の良い転
写に貢献する。このことから、pENDAlは、大腸菌
に導入された場合τ、1多量の融合タンパク質を作らせ
ることが11「 積する。このことによって、pENDAlを含有する大
腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。また、p
END八1はへpMEK1由来の。
アンピシリン耐性遺伝子を有している。このことから、
pENDAlが導入された大腸菌は、アンピシリン耐性
をも示す、pENDAlは、大腸菌に導入されて安定状
態に保たれ、pENDAlを含有する大!li菌は、微
工研にFERM BP−2028として寄託されてい
る。
pENDAlが導入された大腸菌は、アンピシリン耐性
をも示す、pENDAlは、大腸菌に導入されて安定状
態に保たれ、pENDAlを含有する大!li菌は、微
工研にFERM BP−2028として寄託されてい
る。
このような特長を有するpENDAlは、実施例1に従
って作成することができるが1組換えプラスミドの作成
方法によって本発明が制限されるものではない。
って作成することができるが1組換えプラスミドの作成
方法によって本発明が制限されるものではない。
(2)pENDAlを含有する大腸菌
pENDA1を含有する大腸菌は、トリメトプリム及び
アンピシリンに対して耐性を示す。pENDAIを含有
する大腸菌は、融合タンパク質遺伝子の効率のよい発現
の結果、融合タンパク質を菌体内に可溶性の状態で大量
に蓄積する。pENDAIを含有する大腸菌をY T
+ A p tf!地(培地11中に、5gのNaC1
,8gのトリプトン。
アンピシリンに対して耐性を示す。pENDAIを含有
する大腸菌は、融合タンパク質遺伝子の効率のよい発現
の結果、融合タンパク質を菌体内に可溶性の状態で大量
に蓄積する。pENDAIを含有する大腸菌をY T
+ A p tf!地(培地11中に、5gのNaC1
,8gのトリプトン。
5gのイーストエキス、及び50mgのアンとシリンナ
トリウムを含む液体培地)を用いて、37℃で定常期ま
で培養した場合、蓄積する融合タンパク質は、菌体タン
パク質の約20%に達する。
トリウムを含む液体培地)を用いて、37℃で定常期ま
で培養した場合、蓄積する融合タンパク質は、菌体タン
パク質の約20%に達する。
培養菌体を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液に懸濁し
、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、これ
を遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合、全ての
融合タンパク質は上溝中に回収される。pENDAlを
含有する大腸菌は、微工研にFERM BP−202
8として寄託されている。
、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、これ
を遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合、全ての
融合タンパク質は上溝中に回収される。pENDAlを
含有する大腸菌は、微工研にFERM BP−202
8として寄託されている。
(3)!!に合タンパク質
第2図は、 融合タンパク質を暗号化する部分のDNA
配列とそれから作られると予想されるタン″′It バク質の、アミノ酸配列を示している。融合タンパ9番
目までの配列が、大腸菌の野生型DHFRに1箇所アミ
ノ酸置換置換が起こった( Cys−152(viId
type) →Glu−152)配列であり、162
番目から177番目までがα−エンドルフィンの配列で
ある。α−エンドルフィンの配列の直前のアミノ酸はア
ルギニン(Arg)である、α−エンドルフィンはアル
ギニンを含まない。このことから。
配列とそれから作られると予想されるタン″′It バク質の、アミノ酸配列を示している。融合タンパ9番
目までの配列が、大腸菌の野生型DHFRに1箇所アミ
ノ酸置換置換が起こった( Cys−152(viId
type) →Glu−152)配列であり、162
番目から177番目までがα−エンドルフィンの配列で
ある。α−エンドルフィンの配列の直前のアミノ酸はア
ルギニン(Arg)である、α−エンドルフィンはアル
ギニンを含まない。このことから。
融合タンパク質をフルギニルエンドペブチダーゼ(Ar
ginylendopeptidase、市販品として
人手可能)で処理することにより特異的に切り出すこと
ができる。160と161番目のイソロイシン(Ite
)−ロイシン(Leu)の配列は、pMEK2の9gm
H1部位にα−エンドルフィンを暗号化するDNAを導
入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わせるために生
じた配列である(pMEK2のもとどなったpTP70
−1が作るDHFRは、162個のアミノ酸よりなり、
第2図の融合タンパク質のアミノ酸配列のうち、アミノ
末端側から数えて、lから160番目までの配列に、
Gln−l 1eの2個のアミノ酸配列が結合した配列
をしている。)、融合タンパク質およびα−エンドルフ
ィンの分子量は、それぞれ20,022およびl。
ginylendopeptidase、市販品として
人手可能)で処理することにより特異的に切り出すこと
ができる。160と161番目のイソロイシン(Ite
)−ロイシン(Leu)の配列は、pMEK2の9gm
H1部位にα−エンドルフィンを暗号化するDNAを導
入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わせるために生
じた配列である(pMEK2のもとどなったpTP70
−1が作るDHFRは、162個のアミノ酸よりなり、
第2図の融合タンパク質のアミノ酸配列のうち、アミノ
末端側から数えて、lから160番目までの配列に、
Gln−l 1eの2個のアミノ酸配列が結合した配列
をしている。)、融合タンパク質およびα−エンドルフ
ィンの分子量は、それぞれ20,022およびl。
745である。
融合タンパク質は、新規なタンパク質である。
融合タンパク質はDHFRのカルボキシ末端側に。
α−エンドルフィンが融合した構造をしているにもかか
わらず、DHFR酵素活性を有する。このため、大腸菌
が融合タンパク質を多量につくると。
わらず、DHFR酵素活性を有する。このため、大腸菌
が融合タンパク質を多量につくると。
DHFRの阻害剤であり抗細苗剤であるトリメトプリム
に対して、耐性を示すようになる。
に対して、耐性を示すようになる。
(4)融合タンパク質の分離精製
本発明の融合タンパク質の分離精製法は、■面体の培養
、■菌体の破砕、■DEAE−)ヨパール力うム処理、
■メソトリキセー) (MTX)結合アフィニティクロ
マトグラフィー、および■D■面体の培竺1 pENDAlを含有する大腸菌の培養は、 YT+A
p培地(培地11中に、5gのNaC1,8gのトリプ
トン、5gのイーストエキスおよび50mgのアンピシ
リンナトリウムを含む液体培地。
、■菌体の破砕、■DEAE−)ヨパール力うム処理、
■メソトリキセー) (MTX)結合アフィニティクロ
マトグラフィー、および■D■面体の培竺1 pENDAlを含有する大腸菌の培養は、 YT+A
p培地(培地11中に、5gのNaC1,8gのトリプ
トン、5gのイーストエキスおよび50mgのアンピシ
リンナトリウムを含む液体培地。
)で培養することができる。培地としては、この他にS
T+Ap培地(培地ll中に、2gのグルコース、1g
のリン酸2カリウム、5gのポリペプトン、5gのイー
ストエキスおよび50mgのアンピシリンナトリウムを
含む液体培地。)など。
T+Ap培地(培地ll中に、2gのグルコース、1g
のリン酸2カリウム、5gのポリペプトン、5gのイー
ストエキスおよび50mgのアンピシリンナトリウムを
含む液体培地。)など。
菌体が成長する培地であれば、どの様な培地でも用いる
ことができるが、調べた限りでは、YT+Ap培地が最
適であった。
ことができるが、調べた限りでは、YT+Ap培地が最
適であった。
pENDAlを含有する大腸面を、培地に接種し、37
℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する。培
養した菌体は、5,000回転/分の遠心分離により集
める。培地11より湿重量2から5gの菌体が得られる
。
℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する。培
養した菌体は、5,000回転/分の遠心分離により集
める。培地11より湿重量2から5gの菌体が得られる
。
EAE−)ヨパール力ラムクロマトグラフィーの過程よ
り成り!立っている。
り成り!立っている。
川
て行う。
■菌体の破砕
培養して得られた菌体を、湿重量の3倍の緩衝液1 (
0,1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム(E
DTA)を含む]0mMリン酸カリウム緩衝液、pH7
,0)に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体な破砕す
る。菌体破砕液を、35゜000回転、1時間超遠心分
離し、上清を得る(無細胞抽出液)。
0,1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム(E
DTA)を含む]0mMリン酸カリウム緩衝液、pH7
,0)に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体な破砕す
る。菌体破砕液を、35゜000回転、1時間超遠心分
離し、上清を得る(無細胞抽出液)。
■DEAE−トヨバールカラム処理
無細胞抽出液を、あらかじめ50mMのKCIを含む緩
衝液lで平衡化したDEAE)ヨパール力ラムにかけ、
カラム容量の50mMのKCIを含む緩衝液1でカラム
を洗う、酵素の溶出は、緩衝液1を用いて0.1Mから
0.3MのKCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液
を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画する
。酵素の溶出は、0.3MのKCIを含む緩衝液1を用
いて行う。溶出液を一定量ずつフラクションコレ集菌お
よびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温(0か
ら10℃の間、4℃が望ましい)■MTX結合アフィニ
ティクロマトグラフィー上記の操作により得られた酵素
液を、あらかじめ緩衝液1で平衡化したMTXM合アガ
ロース−7フイニテイカラムに吸着させる。吸着後、I
MのKCIを含む緩衝液2 (0,1mM EDTA
を含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH8゜5)で
洗う、洗いは、カラムからの溶出液の280nmの吸光
度を測定し、吸光度が0.1以下になるまで同緩衝液を
流し続ける。酵素の溶出は。
衝液lで平衡化したDEAE)ヨパール力ラムにかけ、
カラム容量の50mMのKCIを含む緩衝液1でカラム
を洗う、酵素の溶出は、緩衝液1を用いて0.1Mから
0.3MのKCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液
を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画する
。酵素の溶出は、0.3MのKCIを含む緩衝液1を用
いて行う。溶出液を一定量ずつフラクションコレ集菌お
よびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温(0か
ら10℃の間、4℃が望ましい)■MTX結合アフィニ
ティクロマトグラフィー上記の操作により得られた酵素
液を、あらかじめ緩衝液1で平衡化したMTXM合アガ
ロース−7フイニテイカラムに吸着させる。吸着後、I
MのKCIを含む緩衝液2 (0,1mM EDTA
を含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH8゜5)で
洗う、洗いは、カラムからの溶出液の280nmの吸光
度を測定し、吸光度が0.1以下になるまで同緩衝液を
流し続ける。酵素の溶出は。
IMのKCIと3mMの葉酸を含む緩衝液2を用いて行
い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用い
て分画する0分画した溶出液についてDHFR活性を測
定し、酵素活性が含まれる画分を集める。得られた酵素
液を、緩衝液lに対して、3回透析する。この段階で、
純度95%以上の融合タンパク質が得られる。
い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用い
て分画する0分画した溶出液についてDHFR活性を測
定し、酵素活性が含まれる画分を集める。得られた酵素
液を、緩衝液lに対して、3回透析する。この段階で、
純度95%以上の融合タンパク質が得られる。
■DEAE−)ヨバール力ラムク口マトグラフィ透析し
た酵素液を、あらかじめ緩衝液1で平衡化したDEAE
−)ヨパール力ラムに吸着させる。
た酵素液を、あらかじめ緩衝液1で平衡化したDEAE
−)ヨパール力ラムに吸着させる。
吸着後、50mMKCIを含む緩衝液lて洗う。
酵素の溶出は、!1衝液lを用いて50mMから0.3
MのKCIの直線濃度勾配を用いて行い。
MのKCIの直線濃度勾配を用いて行い。
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する0分画した溶出液について280nmの吸光度と
DHFRHF上を測定する。
画する0分画した溶出液について280nmの吸光度と
DHFRHF上を測定する。
酵素活性/280 nmの吸光度の値が、一定な画分を
集める。
集める。
以上の操作により、融合タンパク質の高度精製均一化を
、再現性良く行うことができる。
、再現性良く行うことができる。
本発明に従うと、融合タンパク質の精製は9M体の培養
を含めて一週間以内に行うことができ。
を含めて一週間以内に行うことができ。
回収率50%以上で、均一な酵素標品を得ることができ
る。
る。
DHFR酵素活性は2反応液 (0,05mMのジヒド
ロ葉酸、0.06mMのNADPH,12mMの2−メ
ルカプトエタノール、、50mMのりン酸11衝液(’
可H7,0))を、1mlのキュベ1′;川 トリルの濃度勾配を用いて溶出・分離する。溶出lユニ
ットは、上記反応条件において、1分間に1マイクロモ
ルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素量として定
義する。この測定は9分光光度計を用いて容易に行うこ
とができる。
ロ葉酸、0.06mMのNADPH,12mMの2−メ
ルカプトエタノール、、50mMのりン酸11衝液(’
可H7,0))を、1mlのキュベ1′;川 トリルの濃度勾配を用いて溶出・分離する。溶出lユニ
ットは、上記反応条件において、1分間に1マイクロモ
ルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素量として定
義する。この測定は9分光光度計を用いて容易に行うこ
とができる。
(5)融合タンパク質を用いたα−エンドルフィンの製
造 精製した融合タンパク質からのα−エンドルフィンの切
断・分離は、アルギニルエンドペプチダーゼ(Argi
nylendopeptidase、市販品として入手
可能)で処理することにより行う。精製した融合タンパ
ク質1重量に対して、アルギニルエンドペプチダーゼ0
.01重量の割合で加え、37℃で50mM Tri
s−MCI緩衝液、p)(8,5中。
造 精製した融合タンパク質からのα−エンドルフィンの切
断・分離は、アルギニルエンドペプチダーゼ(Argi
nylendopeptidase、市販品として入手
可能)で処理することにより行う。精製した融合タンパ
ク質1重量に対して、アルギニルエンドペプチダーゼ0
.01重量の割合で加え、37℃で50mM Tri
s−MCI緩衝液、p)(8,5中。
24時間処理する。反応液に等量の60%酢酸を加える
。この試料を、HPLC装置(島津LC−4A、1ne
rtsil−005カラム)を用いて、0.1%トリフ
ルオロ酢酸中、15%から50%のアセトニ後I HP
L 、p、、q分離・精製することにより、約O0出
することができる。第3図は、アルギニルエンドペプチ
ダーゼ処理した融合タンパク質試料の高速液体クロマト
グラムを示している。試料注入後約15分後のピークが
α−エンドルフィンである。
。この試料を、HPLC装置(島津LC−4A、1ne
rtsil−005カラム)を用いて、0.1%トリフ
ルオロ酢酸中、15%から50%のアセトニ後I HP
L 、p、、q分離・精製することにより、約O0出
することができる。第3図は、アルギニルエンドペプチ
ダーゼ処理した融合タンパク質試料の高速液体クロマト
グラムを示している。試料注入後約15分後のピークが
α−エンドルフィンである。
このピーク画分を分離する0分離した溶出液をエバボレ
ーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除き
、α−エンドルフィンを得ることができる。また、得ら
れたペプチドを酸加水分解後。
ーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除き
、α−エンドルフィンを得ることができる。また、得ら
れたペプチドを酸加水分解後。
アミノ酸分析することによりアミノ酸組成を確かめるこ
とができる。
とができる。
本発明の実施例においては、31の培地から湿重量的1
0gの菌体が得られ、この菌体く計算上。
0gの菌体が得られ、この菌体く計算上。
約230mgの融合タンパク質、約20.0mgのα−
エンドルフィンを含む、)から、約126mgの融合タ
ンパク質(収率、55%、計算1約11mgのα−エン
ドルフィンを含む、)を精製して得ることができ、この
うち、20mgの融合た。
エンドルフィンを含む、)から、約126mgの融合タ
ンパク質(収率、55%、計算1約11mgのα−エン
ドルフィンを含む、)を精製して得ることができ、この
うち、20mgの融合た。
[発明の効果コ
本発明の、新規プラスミドpENDA1およびpEND
Alを含有する大腸菌を用いることにより、融合タンパ
ク質を容易にかつ高収率で分離精製することが得られる
こと、また、タンパク質分解酵素で処理することにより
融合タンパク質から効率よくα−エンドルフィンを切り
出すことができることからモルヒネ様生理活性を有する
ことが知られているα−エンドルフィンの生産に有効で
ある。
Alを含有する大腸菌を用いることにより、融合タンパ
ク質を容易にかつ高収率で分離精製することが得られる
こと、また、タンパク質分解酵素で処理することにより
融合タンパク質から効率よくα−エンドルフィンを切り
出すことができることからモルヒネ様生理活性を有する
ことが知られているα−エンドルフィンの生産に有効で
ある。
次に本発明の実施例を示す。
実施例1
pENDAlの作成
α−エンドルフィンを暗号化するDNAとしては。
1、5’−GATCCGCTACGGCGGTTTCA
TGACCTCAG−3’2、5’−AAAAATCA
CAGACCCCGCTG−3’3、5’−TCGAG
TTATTCACCTTTTTTG−3’4、5’−T
ATGCGTTTTTGATGATTG−3’5、5’
−GTGACTTAAC−3’6、5’−TCGAGT
TAAGTCACCAGCGGGG−3’の6本のDN
Aをホスホアミダイト法に従って化学合成い精製後、ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いて、各DNAの5′末端
をリン酸化した。リン酸化したDNAを約0.1ml
(約0.01ggのDNAを含んでいる。)ずつ取り、
これを60°Cでインキュベートすることによって両D
NAをアニールさせた(これをDNAIと呼ぶ)。
TGACCTCAG−3’2、5’−AAAAATCA
CAGACCCCGCTG−3’3、5’−TCGAG
TTATTCACCTTTTTTG−3’4、5’−T
ATGCGTTTTTGATGATTG−3’5、5’
−GTGACTTAAC−3’6、5’−TCGAGT
TAAGTCACCAGCGGGG−3’の6本のDN
Aをホスホアミダイト法に従って化学合成い精製後、ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いて、各DNAの5′末端
をリン酸化した。リン酸化したDNAを約0.1ml
(約0.01ggのDNAを含んでいる。)ずつ取り、
これを60°Cでインキュベートすることによって両D
NAをアニールさせた(これをDNAIと呼ぶ)。
約1μgのpMEK2を、BamHIおよびX素タンパ
ク質を変性除去し、その後エタノールでDNAを沈澱さ
せた。沈澱したDNAを70%エタノールで洗った後、
エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥させたa B
a rn HIおよびXho 1によるDNAの切断、
アルカリホスファターゼ処理、フェノール処理、および
エタノール沈澱の各操作は、いずれも、 ”Mo1ec
ular Cloning ALoboratory
Manual” (T、Maniatis、 E、F、
Fr1tsch、 J、Sambrook、eds、
Co1d Spring Harborしaborat
ory (19B2)+以下2文献lと呼ぶ。)に記載
している方法に従って行った。乾燥させたDNAを50
μmのリガーゼ用反応液(10mM Tris−)1c
I。
ク質を変性除去し、その後エタノールでDNAを沈澱さ
せた。沈澱したDNAを70%エタノールで洗った後、
エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥させたa B
a rn HIおよびXho 1によるDNAの切断、
アルカリホスファターゼ処理、フェノール処理、および
エタノール沈澱の各操作は、いずれも、 ”Mo1ec
ular Cloning ALoboratory
Manual” (T、Maniatis、 E、F、
Fr1tsch、 J、Sambrook、eds、
Co1d Spring Harborしaborat
ory (19B2)+以下2文献lと呼ぶ。)に記載
している方法に従って行った。乾燥させたDNAを50
μmのリガーゼ用反応液(10mM Tris−)1c
I。
pH7,4,5mM MgCl2.10mMジチオトレ
イトール、5mM ATP)に溶解後、5μlのDNA
Iを加え、これに1ユニツトのT4−DNAリガーゼを
加えて。
イトール、5mM ATP)に溶解後、5μlのDNA
Iを加え、これに1ユニツトのT4−DNAリガーゼを
加えて。
10”Cで、12時間DNAの連結反応を行わせた。こ
の反応物を、形質転換法(trans−formati
onmethod、上記文獣1に記載)に従って、大腸
菌H8101株に取り込ませた。この処理をした菌体を
、50mg/mlのアンピシリンナトリウムおよび10
mg/mlのトリメトプリムを含む栄養寒天培地(培地
11中に、2gのグルコース。
の反応物を、形質転換法(trans−formati
onmethod、上記文獣1に記載)に従って、大腸
菌H8101株に取り込ませた。この処理をした菌体を
、50mg/mlのアンピシリンナトリウムおよび10
mg/mlのトリメトプリムを含む栄養寒天培地(培地
11中に、2gのグルコース。
1gのリン酸2カリウム、5gのイーストエキス。
5gのポリペプトン、15gの寒天を含む。)上に塗布
し、37°Cで24時間培養することにより、6個のコ
ロニーを得ることができた。これらのコロニーを、1.
5mlのYT+Ap培地く培地11中に、5gのNaC
1,5gのイーストエキス、8gのトリプトン、50m
gのアンピシリンナトリウムを含む、)で、37℃、1
晩、菌体を培養した。培養液を、各々エッペンドルフ遠
心管にとり、12,000回転/分で10分間遠心分離
し、菌体を沈澱として集めた。これに、0゜1mlの電
気泳動用サンプル調製液(0,0625MのTris−
HCI、 pH6,8,2%のラウリル硫酸ナトリウム
(SDS) 、 10!(7)グリセリン、 5%0)
2−yl)L、カプトエタノール、 O,0OIXのブ
ロムフェノールブルーを含む、)キ珈え1面体を懸濁し
、これを沸騰水気泳動法(U、に、Lamm1i; N
ature、 vol、227. p、680(197
0))に従って分析した。標準サンプルとしてpMEK
2を含有する大腸菌に同様な処理をしたもの、および分
子量マーカーとしてラクトアルブミン(分子量14,2
00) 、 )リブシンインヒビター(分子fi20
,100) 、 )リブシノーゲン(分子量24゜00
0) 、カルボニックアンヒドラーゼ(分子@29,0
00〉、グリセロアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナー
ゼ(分子量36,000) 、卵アルブミン(分子1l
k45.000) 、および牛血清アルブミン(分子j
166 、000)を含むサンプルをポリアクリルアミ
ド濃度の10から20!濃度勾配ゲルで泳動した。その
結果。
し、37°Cで24時間培養することにより、6個のコ
ロニーを得ることができた。これらのコロニーを、1.
5mlのYT+Ap培地く培地11中に、5gのNaC
1,5gのイーストエキス、8gのトリプトン、50m
gのアンピシリンナトリウムを含む、)で、37℃、1
晩、菌体を培養した。培養液を、各々エッペンドルフ遠
心管にとり、12,000回転/分で10分間遠心分離
し、菌体を沈澱として集めた。これに、0゜1mlの電
気泳動用サンプル調製液(0,0625MのTris−
HCI、 pH6,8,2%のラウリル硫酸ナトリウム
(SDS) 、 10!(7)グリセリン、 5%0)
2−yl)L、カプトエタノール、 O,0OIXのブ
ロムフェノールブルーを含む、)キ珈え1面体を懸濁し
、これを沸騰水気泳動法(U、に、Lamm1i; N
ature、 vol、227. p、680(197
0))に従って分析した。標準サンプルとしてpMEK
2を含有する大腸菌に同様な処理をしたもの、および分
子量マーカーとしてラクトアルブミン(分子量14,2
00) 、 )リブシンインヒビター(分子fi20
,100) 、 )リブシノーゲン(分子量24゜00
0) 、カルボニックアンヒドラーゼ(分子@29,0
00〉、グリセロアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナー
ゼ(分子量36,000) 、卵アルブミン(分子1l
k45.000) 、および牛血清アルブミン(分子j
166 、000)を含むサンプルをポリアクリルアミ
ド濃度の10から20!濃度勾配ゲルで泳動した。その
結果。
すべてのコロニーにおいて、pMEK2のDHFR−M
EKd合タンパク質のバンドが消失し、それより明らか
に分子量が大きくなったタンパク質(分子盟約24,0
00と推定される。)が認められた。
EKd合タンパク質のバンドが消失し、それより明らか
に分子量が大きくなったタンパク質(分子盟約24,0
00と推定される。)が認められた。
pMEK2のD HF R−ME K融合タンパク質(
分子量、 18,963)ハ、コ(7)条件で分子盟約
22,000(7)りンバク質として泳動する。得られ
た6個のコロニーから適当に一株を選び、これをYT+
Ap培地で培養し、 TanakaとWe isb l
umの方法(T、Tanaka。
分子量、 18,963)ハ、コ(7)条件で分子盟約
22,000(7)りンバク質として泳動する。得られ
た6個のコロニーから適当に一株を選び、これをYT+
Ap培地で培養し、 TanakaとWe isb l
umの方法(T、Tanaka。
B、Weisblum; J、 Bacteriolo
gy、 vol、I21.p、354(1975))に
従って、プラスミドを調製した。得られたプラスミドを
pENDAlと名づけた。pENDAlは、pMEK2
のBamHIとXho Iとの間の配列が、化学合成し
たDNA配列と置き変わった構造をしているはずである
。pENDAlのEcoRI (第1図の471−47
6番目の配列)と5a1(第1図の889−895番目
の配列)による切断によって得られる約400ヌクレオ
チド長のDNAについて2M13フアージを用いたジデ
オキシ法(J、Messing; Mehtods i
n Enzymology、 vol、101゜p、2
0(1983))に従って、塩基配列を決定した。その
結果、第1図に示す配列の471番目から約895番目
迄の配列が確かめられた。塩基配列を検討することによ
り、pENDAlが融合タンパク質を暗号化することが
明らかとなった。
gy、 vol、I21.p、354(1975))に
従って、プラスミドを調製した。得られたプラスミドを
pENDAlと名づけた。pENDAlは、pMEK2
のBamHIとXho Iとの間の配列が、化学合成し
たDNA配列と置き変わった構造をしているはずである
。pENDAlのEcoRI (第1図の471−47
6番目の配列)と5a1(第1図の889−895番目
の配列)による切断によって得られる約400ヌクレオ
チド長のDNAについて2M13フアージを用いたジデ
オキシ法(J、Messing; Mehtods i
n Enzymology、 vol、101゜p、2
0(1983))に従って、塩基配列を決定した。その
結果、第1図に示す配列の471番目から約895番目
迄の配列が確かめられた。塩基配列を検討することによ
り、pENDAlが融合タンパク質を暗号化することが
明らかとなった。
断によって得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、P
s t I、H7ndl11.Hpal、AatII。
s t I、H7ndl11.Hpal、AatII。
PvuII、Bgl■、およびC1alを用いた制限酵
素による切断実験の結果、pMEK2のEcoRI−3
all切断によって得られる約4.2キロ塩基対のDN
Aと全く同一であることが示された。
素による切断実験の結果、pMEK2のEcoRI−3
all切断によって得られる約4.2キロ塩基対のDN
Aと全く同一であることが示された。
以上の結果から、pENDAlの全塩基配列が第1図に
示した配列であることが決められた。
示した配列であることが決められた。
実施例2
pENDAlを含有する大RMが作る融合タンパク質
pENDAlを含有する大腸菌が作る融合タンパク質の
アミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予想することが
できる。第1図の57番目から588番目の配列が融合
タンパク質を暗号化していることから、トリブレット暗
号表を用いて、アミノ酸配列を推定した。その結果第2
図に示すアミノ酸配列が得られた。
アミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予想することが
できる。第1図の57番目から588番目の配列が融合
タンパク質を暗号化していることから、トリブレット暗
号表を用いて、アミノ酸配列を推定した。その結果第2
図に示すアミノ酸配列が得られた。
pENDAlを含有する大腸菌から、エンドルフィン融
合タンパク質を分離精製し、精製したタンパク質の性質
を調べた。
合タンパク質を分離精製し、精製したタンパク質の性質
を調べた。
融合タンパク質の精製
A、用イタEI体jl : 湿M* 10 gB、酵
素精製表 表における精製過程は■無細胞抽出液、■DEAE−ト
ヨバールカラム処理、■メソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフィー、および■DEAE−)ヨバー
ル力ラムクロマトグラフィーを表す。
素精製表 表における精製過程は■無細胞抽出液、■DEAE−ト
ヨバールカラム処理、■メソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフィー、および■DEAE−)ヨバー
ル力ラムクロマトグラフィーを表す。
精製 酵素液 回収タンパ 回収酵素 収率過程 の量
(ml)り質(mg) 活性(ユニット)(χ)■ 5.631 ■ 56 154 3,986
70.8■ 28 126 3,
090 54.9得られた酵素タンパク質をSDS
電気泳動法(上記実施例に記載の方法)により分析した
ところ。
(ml)り質(mg) 活性(ユニット)(χ)■ 5.631 ■ 56 154 3,986
70.8■ 28 126 3,
090 54.9得られた酵素タンパク質をSDS
電気泳動法(上記実施例に記載の方法)により分析した
ところ。
分子量的24 、000の単一なタンパク質バンドが示
され、得ら、れた酵素標品が均一であることが示された
。
され、得ら、れた酵素標品が均一であることが示された
。
分離精製した融合タンパク質の性質
精製したDHFR活性を示すタンパク質をエンザイムイ
ムノアッセイにより検討したところ、α−エンドルフィ
ンに対する抗体と反応することが示された。即ち、精製
して得られたタンパク質は免疫学的にα−エンドルフィ
ンと同等の構造を含んでいることが明らかとなった。
ムノアッセイにより検討したところ、α−エンドルフィ
ンに対する抗体と反応することが示された。即ち、精製
して得られたタンパク質は免疫学的にα−エンドルフィ
ンと同等の構造を含んでいることが明らかとなった。
精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端側のアミ
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼYを、精製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量した(カルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定法
)。その結果。
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼYを、精製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量した(カルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定法
)。その結果。
−Leu−Vat−Thr (カルボキシ末端)である
ことが予想された。また、精製して得られたタンパク質
を酸加水分解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配
列の結果予想されるアミノ酸組成と一致した結果が得ら
れた。
ことが予想された。また、精製して得られたタンパク質
を酸加水分解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配
列の結果予想されるアミノ酸組成と一致した結果が得ら
れた。
実施例3
精製分離した融合タンパク質からのα−エンドルフィン
の分離 実施例2で得られた2mlの精製均一化した融合タンパ
ク質の溶液(緩衝液1中、約20mg。
の分離 実施例2で得られた2mlの精製均一化した融合タンパ
ク質の溶液(緩衝液1中、約20mg。
約1.OOOnmo 1 eの融合タンパク質を含む)
に、0.2mgのアルギニルエンドペプチダーゼを加え
、37℃で24時間反応させる0反応後。
に、0.2mgのアルギニルエンドペプチダーゼを加え
、37℃で24時間反応させる0反応後。
1mlの酢酸を加える。そのうちの、0.5m1(約1
67nmo l eの融合タンパク質を含むはず)をと
り、高速液体クロマドグフィー装置(島II L C−
4A’+!)を用い1nertsil−00S5.um
カラム、1/1 ノ %)をかけることにより行った。0から2分までは、1
5%のアセニトリルを用い、2分から32分までは、1
5%から50%のアセトニトリルの直線濃度勾配をかけ
た。その結果、第3図に示すような溶出曲線が得られた
。試料注入後約15分後のピーク画分を分離し2分離し
た溶出液をエバボレーターで乾燥後、少量の水を加え凍
結乾燥し溶媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプチ
ドを酸加水分解後、その10分の1をアミノ酸分析に用
いた。その結果、グルタミン+グルタミン酸。
67nmo l eの融合タンパク質を含むはず)をと
り、高速液体クロマドグフィー装置(島II L C−
4A’+!)を用い1nertsil−00S5.um
カラム、1/1 ノ %)をかけることにより行った。0から2分までは、1
5%のアセニトリルを用い、2分から32分までは、1
5%から50%のアセトニトリルの直線濃度勾配をかけ
た。その結果、第3図に示すような溶出曲線が得られた
。試料注入後約15分後のピーク画分を分離し2分離し
た溶出液をエバボレーターで乾燥後、少量の水を加え凍
結乾燥し溶媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプチ
ドを酸加水分解後、その10分の1をアミノ酸分析に用
いた。その結果、グルタミン+グルタミン酸。
ロイシン、グリシン、リジン、メチオニン、フェニルア
ラニン、プロリン、セリン、スレオニン。
ラニン、プロリン、セリン、スレオニン。
チロシン、およびバリンがそれぞれ、20.2゜9.7
,19.0,9.0,8.9,9.0,9゜3.18.
4,26.3,8.8および9.3nmoleずつ検出
された。アミノ酸組成は、α−エンドルフィンのそれと
一致した。また、アミノ酸分析に用いた標品は、約9.
3μmo l e (約16.2μg)のα−エンドル
フィンを含んでいたことになる。この結果から、精製均
一化した融合タンパク質を用いて、アルギニルエンドペ
プチダーゼ処理した標品をHPLCを用いて分離するこ
とにより収率的56%でα−エンドルフィンを回収でき
ることが明かとなった。融合タンパク質の精製の収率が
約55%であり、融合タンパク質からのα−エンドルフ
ィンの分離の収率が約56%であることから、大腸菌が
つくるα−エンドルフィンの単離収率が約31%である
と計算される。
,19.0,9.0,8.9,9.0,9゜3.18.
4,26.3,8.8および9.3nmoleずつ検出
された。アミノ酸組成は、α−エンドルフィンのそれと
一致した。また、アミノ酸分析に用いた標品は、約9.
3μmo l e (約16.2μg)のα−エンドル
フィンを含んでいたことになる。この結果から、精製均
一化した融合タンパク質を用いて、アルギニルエンドペ
プチダーゼ処理した標品をHPLCを用いて分離するこ
とにより収率的56%でα−エンドルフィンを回収でき
ることが明かとなった。融合タンパク質の精製の収率が
約55%であり、融合タンパク質からのα−エンドルフ
ィンの分離の収率が約56%であることから、大腸菌が
つくるα−エンドルフィンの単離収率が約31%である
と計算される。
第1図は、pENDAlの全塩基配列を示した図であり
、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列配列を、5′
末端から3′末端の方向に記述している0図中符号は、
核酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、G
はグアニンを、Tはチミンを示している0図中番号は、
pENDAlに2箇所存在する制限酵素C1aI切断認
識部位を示している。 第2図は、pENDAl中に存在するエンドルフィン融
合タンパク質を暗号化する部分の塩基配列およびタンパ
ク質のアミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸
塩基およびアミノ酸を表し。 Aはアデニンを、Cはシトシンを、Gはグアニンを、T
はチミンを、Alaはアラニンを、Argはアルギニン
を、Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラギン酸
を、Cysはシスティンを。 Glnはグルタミンを、Gluはグルタミン酸を。 Glyはグリシンを、)lisはヒスチジンを、lle
はイソロイシンを、Leuはロイシンを、Lysはリジ
ンを、Metはメチオニンを、Pheはフェニルアラニ
ンを、Proはプロリンを、Serはセリンを、Thr
はトレオニンを、Trpはトリプトファンを、Tyrは
チロシンを、Valはバリンを示している0図中番号は
、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化するAT
GコトンのIT A ++ を1番として数えた番号を示してい 第3図は。 アルギニルエンドペプチダーゼ処理 した融合タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを示
している。 横軸は試料注入後の時間を分車 位で。 縦軸は。 表現している。 220nmの吸光度を任意単位で 矢印で示したピークがα−エンド ルフィンの溶出ピークである。
、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列配列を、5′
末端から3′末端の方向に記述している0図中符号は、
核酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、G
はグアニンを、Tはチミンを示している0図中番号は、
pENDAlに2箇所存在する制限酵素C1aI切断認
識部位を示している。 第2図は、pENDAl中に存在するエンドルフィン融
合タンパク質を暗号化する部分の塩基配列およびタンパ
ク質のアミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸
塩基およびアミノ酸を表し。 Aはアデニンを、Cはシトシンを、Gはグアニンを、T
はチミンを、Alaはアラニンを、Argはアルギニン
を、Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラギン酸
を、Cysはシスティンを。 Glnはグルタミンを、Gluはグルタミン酸を。 Glyはグリシンを、)lisはヒスチジンを、lle
はイソロイシンを、Leuはロイシンを、Lysはリジ
ンを、Metはメチオニンを、Pheはフェニルアラニ
ンを、Proはプロリンを、Serはセリンを、Thr
はトレオニンを、Trpはトリプトファンを、Tyrは
チロシンを、Valはバリンを示している0図中番号は
、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化するAT
GコトンのIT A ++ を1番として数えた番号を示してい 第3図は。 アルギニルエンドペプチダーゼ処理 した融合タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを示
している。 横軸は試料注入後の時間を分車 位で。 縦軸は。 表現している。 220nmの吸光度を任意単位で 矢印で示したピークがα−エンド ルフィンの溶出ピークである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
ことができ、4673塩基対の大きさを有し、第1図に
おいて示されるDNA配列を有する新規組換えプラスミ
ドpENDA1。 2、pENDA1を含有する大腸菌。 3、pENDA1を含有する大腸菌が生産し、第2図に
よって示されるアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元
酵素−α−エンドルフィン融合タンパク質。 4、pENDA1を含有する大腸菌を培養し、ジヒドロ
葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元酵素−α
−エンドルフィン融合タンパク質を、培養菌体の無細胞
抽出液から、メソトリキセート結合アフィニティカラム
クロマトグラフィー、および陰イオン交換カラムクロマ
トグラフィーを用いて精製することを特徴とするジヒド
ロ葉酸還元酵素−α−エンドルフィン融合タンパク質の
分離精製方法。 5、pENDA1を含有する大腸菌の生産するジヒドロ
葉酸還元酵素−α−エンドルフィン融合タンパク質を分
離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元酵素−α−エンド
ルフィン融合タンパク質をタンパク質分解酵素で消化し
た後、α−エンドルフィンを分離精製することを特徴と
するα−エンドルフィンの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63231246A JPH0279976A (ja) | 1988-09-14 | 1988-09-14 | α−エンドルフィン |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63231246A JPH0279976A (ja) | 1988-09-14 | 1988-09-14 | α−エンドルフィン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0279976A true JPH0279976A (ja) | 1990-03-20 |
JPH0355109B2 JPH0355109B2 (ja) | 1991-08-22 |
Family
ID=16920614
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63231246A Granted JPH0279976A (ja) | 1988-09-14 | 1988-09-14 | α−エンドルフィン |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0279976A (ja) |
-
1988
- 1988-09-14 JP JP63231246A patent/JPH0279976A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0355109B2 (ja) | 1991-08-22 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |