JPH02100681A - β−エンドルフイン - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、β−エンドルフィンの遺伝子組換え法による
新規な製造方法およびそれに係わる組換えプラスミド、
形質転換株、融合タンパク質に間する。
新規な製造方法およびそれに係わる組換えプラスミド、
形質転換株、融合タンパク質に間する。
β−エンドルフィンは、31個のアミノ酸より構成され
るモルヒネ様生理活性を有するペプチドであり、下記ア
ミノ酸配列を有する。
るモルヒネ様生理活性を有するペプチドであり、下記ア
ミノ酸配列を有する。
β−エンドルフィン: Tyr−Gly−Gly−Ph
c−Met−Thr−5er−G Iu −Lys−5
er −G l n −Thr −Pro−Leu−V
a I −Thr−Leu−Phe−Lys−Asn−
Ala−11e−l 1e−Lys−Asn−Ala−
Tyr−しys−Lys−Gly−Glu 本発明の新規組換えプラスミドpENDB 15は、第
1図において示されるDNA配列を有する。
c−Met−Thr−5er−G Iu −Lys−5
er −G l n −Thr −Pro−Leu−V
a I −Thr−Leu−Phe−Lys−Asn−
Ala−11e−l 1e−Lys−Asn−Ala−
Tyr−しys−Lys−Gly−Glu 本発明の新規組換えプラスミドpENDB 15は、第
1図において示されるDNA配列を有する。
本発明は2発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である
。
。
[従来の技術]
β−エンドルフィンは2モルヒネ様生理活性を示すエン
ドルフィン類に属するペプチドであり。
ドルフィン類に属するペプチドであり。
ロイシンエンケファリンの約2340倍、メチオニンエ
ンケファリンの約1560倍の鎮痛活性を示す興味深い
生理活性ペプチドである。
ンケファリンの約1560倍の鎮痛活性を示す興味深い
生理活性ペプチドである。
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。遺伝子操作を利用したβ−エン法が公i上ある
(K、Nagahari et at、、 Agric
。
がある。遺伝子操作を利用したβ−エン法が公i上ある
(K、Nagahari et at、、 Agric
。
Biol、 Chem、、 vol、5]、 p、84
5−851(1987))。彼らの方法は、大腸菌のア
ントラニル酸合成酵素のアミン末端から約62%までの
部分と融合させて9面体内に不溶化物としてTt積させ
る方法である。彼らの方法に従えば、効率よくβ−エン
ドルフィンを含む融合タンパク質を生産することができ
るが。
5−851(1987))。彼らの方法は、大腸菌のア
ントラニル酸合成酵素のアミン末端から約62%までの
部分と融合させて9面体内に不溶化物としてTt積させ
る方法である。彼らの方法に従えば、効率よくβ−エン
ドルフィンを含む融合タンパク質を生産することができ
るが。
作られた融合タンパク質が不溶性となるため、融合タン
パク質の可溶化とか、目的融合タンパク質の高度精製な
、どに関して問題が考えられる。
パク質の可溶化とか、目的融合タンパク質の高度精製な
、どに関して問題が考えられる。
既に2本発明者らは、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵
素(以下、DHFRと略す。)遺伝子に間して、その遺
伝子の改変の結果、異種遺伝子発現用プラスミドベクタ
ーpTP70−1 (特願昭61−312836)と、
それを利用した融合遺伝子の作成方法(特願 昭62−
302153)を開発している。また、pTP70−1
にメチオニンエンケファリン(以下、1IEKと略す。
素(以下、DHFRと略す。)遺伝子に間して、その遺
伝子の改変の結果、異種遺伝子発現用プラスミドベクタ
ーpTP70−1 (特願昭61−312836)と、
それを利用した融合遺伝子の作成方法(特願 昭62−
302153)を開発している。また、pTP70−1
にメチオニンエンケファリン(以下、1IEKと略す。
)を暗号化する化学DNAを組み込んで、MEKの効率
よい生産方法を開発している(特願 昭63−7968
0)。効率のよいMEKの生産方法を開発する際に得ら
れた組換えプラスミドpMEK2は、制限酵素BamH
IとX h o I部位の間の配列を異種DNAと取り
替えるだけで、DHFRとの融合遺伝子を容易に作成で
きる。また、pMEK2を利用して融合遺伝子を作成し
た場合、融合遺伝子の発現の結果帯られる融合タンパク
質は。
よい生産方法を開発している(特願 昭63−7968
0)。効率のよいMEKの生産方法を開発する際に得ら
れた組換えプラスミドpMEK2は、制限酵素BamH
IとX h o I部位の間の配列を異種DNAと取り
替えるだけで、DHFRとの融合遺伝子を容易に作成で
きる。また、pMEK2を利用して融合遺伝子を作成し
た場合、融合遺伝子の発現の結果帯られる融合タンパク
質は。
不溶化することなく2かつ大腸菌菌体のZ !、ift
としては全菌体タンパク質の約20%が期待される。
としては全菌体タンパク質の約20%が期待される。
しかしながら、β−エンドルフィンの生産に上記発現ベ
クターを用いた例はない。
クターを用いた例はない。
[発明の目的]
本発明の目的は、DHFRとの融合遺伝子を作製し、β
−エンドルフィンとの融合タンパク質を大腸菌で作らせ
、融合タンパク質の性質を利用い融合タンパク質の分離
精製を効率的に行い、高度精製した融合タンパク質を利
用したβ−エンドルフィン9方法を開発することにある
。
−エンドルフィンとの融合タンパク質を大腸菌で作らせ
、融合タンパク質の性質を利用い融合タンパク質の分離
精製を効率的に行い、高度精製した融合タンパク質を利
用したβ−エンドルフィン9方法を開発することにある
。
−k 、’FJHヮ112オー 8.。■ロ、利用。、
鋭竜研究を設計・化学合成し、pMEK2に組み込むこ
とにより、β−エンドルフィン遺伝子とDHFR遺伝子
との融合遺伝子を作成し、融合遺伝子を大腸菌で発現さ
せることにより、DHFR−β−エンドルフィン融合タ
ンパク質(以下、融合タンパク貿と略す。)を大量に生
産できることを見いだし。
鋭竜研究を設計・化学合成し、pMEK2に組み込むこ
とにより、β−エンドルフィン遺伝子とDHFR遺伝子
との融合遺伝子を作成し、融合遺伝子を大腸菌で発現さ
せることにより、DHFR−β−エンドルフィン融合タ
ンパク質(以下、融合タンパク貿と略す。)を大量に生
産できることを見いだし。
さらに、融合タンパク質を用いることにより効果的にβ
−エンドルフィンを作成できることを明らかにし2本発
明を完成させた。
−エンドルフィンを作成できることを明らかにし2本発
明を完成させた。
[発明の構成]
本発明は、(1)8合タンパク質の天竜発現を可能にす
る新規組換えプラスミドpENDB15゜(2)pEN
DB 15を含有する大腸菌菌体、(3)pENDB1
5を含有する大腸菌が生産する融合タンパク質、 (
4)pENDB15を含有する大腸菌からの融合タンパ
ク質の分離精製方法。
る新規組換えプラスミドpENDB15゜(2)pEN
DB 15を含有する大腸菌菌体、(3)pENDB1
5を含有する大腸菌が生産する融合タンパク質、 (
4)pENDB15を含有する大腸菌からの融合タンパ
ク質の分離精製方法。
および(5)融合タンパク貿を用いたβ−エンドルフィ
ンの製造方法、の発明により構成される。
ンの製造方法、の発明により構成される。
(1)新規組換えプラスミドpENDB15第1図は2
本発明のpENDB 15の全塩基配列を示している。
本発明のpENDB 15の全塩基配列を示している。
図は、2木鎖環状DNAのうち片方のDNA鎖配列配列
を、プラスミド中に2箇所存在する制限酵素CLaI部
位のうち制限酵素)(indlII部位に近い方の切断
認識部位、 5’−ATCGAT−3’、の最初の1j
Allを1番として数えて、5′末端から3゛末端の方
向に記述している。本発明のpENDB 15は、新規
な組換えプラスミドである。pENDBl5は、471
8塩基対の大きさであり、宿主である大腸菌にトリメト
プリムおよびアンピシリン耐性を付与することができる
。pENDBl 5は、pMEK2(特願 昭63−7
9680に記載。)のBamHIとXho I部位の間
のMEKを暗号化する配列を含む26塩基対の配列を、
β−エンドルフィンを暗号化する配列を含む104塩基
対の化学合成りNAと置き換丈配列であ、%lそれ以外
の配列がpMEK2由来の配列である。
を、プラスミド中に2箇所存在する制限酵素CLaI部
位のうち制限酵素)(indlII部位に近い方の切断
認識部位、 5’−ATCGAT−3’、の最初の1j
Allを1番として数えて、5′末端から3゛末端の方
向に記述している。本発明のpENDB 15は、新規
な組換えプラスミドである。pENDBl5は、471
8塩基対の大きさであり、宿主である大腸菌にトリメト
プリムおよびアンピシリン耐性を付与することができる
。pENDBl 5は、pMEK2(特願 昭63−7
9680に記載。)のBamHIとXho I部位の間
のMEKを暗号化する配列を含む26塩基対の配列を、
β−エンドルフィンを暗号化する配列を含む104塩基
対の化学合成りNAと置き換丈配列であ、%lそれ以外
の配列がpMEK2由来の配列である。
第1図の577番目ら632番目まで配列は。
DHFRのカルボキシ末端側にβ−エンドルフィンがア
ルギニン(Arg)を介して結合した融合タンパク質を
暗号化している。
ルギニン(Arg)を介して結合した融合タンパク質を
暗号化している。
融合タンパク質を暗号化する配列の上流には。
遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する(特願
昭6l−312836)。即ち、43番目から500
番目での配列がSD配列と呼ばれるもので、効率の良い
翻訳に、また、4675@目から4704S目までが、
コンセンサス転写プロモーターであり、効率の良い転写
に貢献する。このことから、pENDBl5は、大腸菌
に導入された場合、多量の融合タンパク質を作らせるこ
とができる。作られた融合タンパク質は、菌体内に可溶
性の状態で2面体タンパク質の約20%程度蓄積する。
昭6l−312836)。即ち、43番目から500
番目での配列がSD配列と呼ばれるもので、効率の良い
翻訳に、また、4675@目から4704S目までが、
コンセンサス転写プロモーターであり、効率の良い転写
に貢献する。このことから、pENDBl5は、大腸菌
に導入された場合、多量の融合タンパク質を作らせるこ
とができる。作られた融合タンパク質は、菌体内に可溶
性の状態で2面体タンパク質の約20%程度蓄積する。
このことによって、pENDBl5を含有する大腸菌は
トリメトプリム耐性を示すようになる。また、pEND
Bl5は、pMEK1由来の、アンピシリン耐性遺伝子
を有している。このことから、pENDBl5が導入さ
れた大腸菌は、アンピシリン耐性をも示す。pENDB
15は、大腸菌に導入されて安定状態に保たれ、pE
NDBl5を含有する大腸菌は、徹工研にFERMBP
−2029として寄託されている。
トリメトプリム耐性を示すようになる。また、pEND
Bl5は、pMEK1由来の、アンピシリン耐性遺伝子
を有している。このことから、pENDBl5が導入さ
れた大腸菌は、アンピシリン耐性をも示す。pENDB
15は、大腸菌に導入されて安定状態に保たれ、pE
NDBl5を含有する大腸菌は、徹工研にFERMBP
−2029として寄託されている。
このような特長を有するpENDBl5は、実施例1に
従って作成することができるが、絹換えプラスミドの作
成方法によって本発明が制限されるものではない。
従って作成することができるが、絹換えプラスミドの作
成方法によって本発明が制限されるものではない。
ンピシリ耕トリウムを含む液体培地)を用いて。
37℃で定常期まで培養した場合、蓄積する融合タンパ
ク質は、菌体タンパク質の約20%に達する。培養面体
を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液に懸濁し、フレン
チプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、これを遠心分
離法により上清と沈澱に分離した場合、全ての融合タン
パク質は上清中に回収される。pENDB 15を含有
する大腸菌は、y&工研にFERM BP−2029
として寄託されている。
ク質は、菌体タンパク質の約20%に達する。培養面体
を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液に懸濁し、フレン
チプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、これを遠心分
離法により上清と沈澱に分離した場合、全ての融合タン
パク質は上清中に回収される。pENDB 15を含有
する大腸菌は、y&工研にFERM BP−2029
として寄託されている。
(2)pENDBl5を含有する大腸菌pENDB 1
5を含有する大腸菌は、トリメトプリム及びアンピシリ
ンに対して耐性を示す。pENDBl5を含有する大腸
菌は、融合タンパク質遺伝子の効率のよい発現の結果、
融合タンパク質を菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積す
る。pENDBl5を含有する大腸菌をYT+Ap培地
(培地In中に+ 5gのNaCl、8gのトリプトン
、5」のイーストエキス、及び50 m gのア(3)
融合タンパク質 第2図は、融合タンパク質を暗号化する部分のDNA配
列とそれから作られると予想されるタンパク質のアミノ
酸配列を示している。融合タンパク質は、192アミノ
酸よりなる新規なタンパク質である。アミノ末端側から
数えて、1から159番目までの配列が、大腸菌の野生
型DHFRに1箇所アミノ酸置換置換が起こった( C
ys−152(wild type) −* Glu−
152)配列であり+162@目から192番目までが
β−エンドルフィンの配列である。β−エンドルフィン
の配列の直前のアミノ酸はアルギニン(A r g)で
ある。β−エンドルフィンはアルギニンを含まない。こ
のことから。
5を含有する大腸菌は、トリメトプリム及びアンピシリ
ンに対して耐性を示す。pENDBl5を含有する大腸
菌は、融合タンパク質遺伝子の効率のよい発現の結果、
融合タンパク質を菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積す
る。pENDBl5を含有する大腸菌をYT+Ap培地
(培地In中に+ 5gのNaCl、8gのトリプトン
、5」のイーストエキス、及び50 m gのア(3)
融合タンパク質 第2図は、融合タンパク質を暗号化する部分のDNA配
列とそれから作られると予想されるタンパク質のアミノ
酸配列を示している。融合タンパク質は、192アミノ
酸よりなる新規なタンパク質である。アミノ末端側から
数えて、1から159番目までの配列が、大腸菌の野生
型DHFRに1箇所アミノ酸置換置換が起こった( C
ys−152(wild type) −* Glu−
152)配列であり+162@目から192番目までが
β−エンドルフィンの配列である。β−エンドルフィン
の配列の直前のアミノ酸はアルギニン(A r g)で
ある。β−エンドルフィンはアルギニンを含まない。こ
のことから。
融合タンパク質をアルギニルエンドペプチダーゼ(Ar
ginylendopeptidase、市販品として
人手可能)で処理することにより特異的に切り出すこと
ができる。160と161番目のイソロイシン([1e
)−ロイシン(L e u)の配列は、pMEK2のB
amHI部位にβ−エンドルフィンを暗号化するDNA
を導入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わせるため
に生じた配列である(pMEK2のもとどなったpTP
70−1が作るDHFRは、162個のアミノ酸よりな
り、第2図の融合タンパク質のアミノ酸配列のうち、ア
ミノ末端側から数えて、1から160番目までの配列に
。
ginylendopeptidase、市販品として
人手可能)で処理することにより特異的に切り出すこと
ができる。160と161番目のイソロイシン([1e
)−ロイシン(L e u)の配列は、pMEK2のB
amHI部位にβ−エンドルフィンを暗号化するDNA
を導入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わせるため
に生じた配列である(pMEK2のもとどなったpTP
70−1が作るDHFRは、162個のアミノ酸よりな
り、第2図の融合タンパク質のアミノ酸配列のうち、ア
ミノ末端側から数えて、1から160番目までの配列に
。
Gln−11eの2個のアミノ酸配列が結合した配列を
している。)。融合タンパク質およびβ−エンドルフィ
ンq分子量は、それぞれ21,741および融合タンパ
ク質はDHFRのカルボキシ末端側に。
している。)。融合タンパク質およびβ−エンドルフィ
ンq分子量は、それぞれ21,741および融合タンパ
ク質はDHFRのカルボキシ末端側に。
β−エンドルフィンが融合した構造をしているにもかか
わらず、DHFR酵素活性を有する。このため、大腸菌
が融合タンパク質を多責につくると。
わらず、DHFR酵素活性を有する。このため、大腸菌
が融合タンパク質を多責につくると。
DHFRの阻害剤であり抗細菌剤であるトリメトプリム
に対して、耐性を示すようになる。
に対して、耐性を示すようになる。
(4)融合タンパク質の分離精製
本発明の融合タンパク質の分#Il精製法は、■菌の培
養体、■菌体の破砕、■DEAE−)ヨバール力うム処
理、■メソトリキセート(MTX)結合アフィニティク
ロマトグラフィー、および■DEAE−)ヨパール力ラ
ムクロマトグラフィーの過程より成り立っている。
養体、■菌体の破砕、■DEAE−)ヨバール力うム処
理、■メソトリキセート(MTX)結合アフィニティク
ロマトグラフィー、および■DEAE−)ヨパール力ラ
ムクロマトグラフィーの過程より成り立っている。
■菌体の培養
pENDB 15を含有する大腸菌の培養は、YT+A
p培地(培地ll中に、5gのNaCl。
p培地(培地ll中に、5gのNaCl。
8gのトリプトン、5gのイーストエキスおよび50m
gのアンピシリンナトリウムを含む液体培地。)で培養
することができる。培地としては。
gのアンピシリンナトリウムを含む液体培地。)で培養
することができる。培地としては。
この池にST+Ap培地(培地11中に、2gのグルコ
ース、1gのリン酸2カリウム、5gのポリペプトン、
5gのイーストエキスおよび50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む液体培地。)など、菌体が成長する培地
であれば、どの様な培地でも用いることができるが、調
べた限りでは。
ース、1gのリン酸2カリウム、5gのポリペプトン、
5gのイーストエキスおよび50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む液体培地。)など、菌体が成長する培地
であれば、どの様な培地でも用いることができるが、調
べた限りでは。
YT+Ap培地が最適であった。
pENDB 15を含有する大腸菌を、培地に接種し、
37℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する
。培養した菌体は、5,000回転/分の遠心分離によ
り集める。培地11より湿重量2から5gの菌体が得ら
れる。
37℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する
。培養した菌体は、5,000回転/分の遠心分離によ
り集める。培地11より湿重量2から5gの菌体が得ら
れる。
集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
(0から10℃の間、4℃が望ましい)で行う。
(0から10℃の間、4℃が望ましい)で行う。
■菌体の破砕
培養して得られた面体を、湿重量の3倍の緩衝液l(0
,1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム島D
T A)を含む10mMリン酸カワウを用いて面体を破
砕する。面体破砕液を、35゜000回転、1時間超遠
心分離し、上清を得る(無細胞抽出液)。
,1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム島D
T A)を含む10mMリン酸カワウを用いて面体を破
砕する。面体破砕液を、35゜000回転、1時間超遠
心分離し、上清を得る(無細胞抽出液)。
■DEAE−1ヨバール力ラム処理
無細胞抽出液を、あらかじめ50mMのKCIを含む緩
衝液1で平衡化したDEAE)ヨバール力ラムにかけ、
カラム容量の50mMのKCIを含む緩衝液lでカラム
を洗う。酵素のi容量は、緩(ifri夜1を用いて5
0mMから0.3MのKCIの直線濃度勾配を用いて行
い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用い
て分画する。分画した溶出液についてDHFR活性を測
定し、酵素活性が含まれる両分を集める。
衝液1で平衡化したDEAE)ヨバール力ラムにかけ、
カラム容量の50mMのKCIを含む緩衝液lでカラム
を洗う。酵素のi容量は、緩(ifri夜1を用いて5
0mMから0.3MのKCIの直線濃度勾配を用いて行
い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用い
て分画する。分画した溶出液についてDHFR活性を測
定し、酵素活性が含まれる両分を集める。
■MTX結合アフィニティクロマトグラフィー上記の操
作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝液1で平衡
化したMTX結合アガロース−7フイニテイカラムに吸
着させる。吸着後、IMのKCIを含む緩衝液2 (0
,1mM EDTAを含む10mMリン酸カリウム緩
衝液、I)H8゜5)で洗う。洗いは、カラムからの溶
出液の280nmの吸光度を測定し、吸光度が0.1以
下になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は。
作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝液1で平衡
化したMTX結合アガロース−7フイニテイカラムに吸
着させる。吸着後、IMのKCIを含む緩衝液2 (0
,1mM EDTAを含む10mMリン酸カリウム緩
衝液、I)H8゜5)で洗う。洗いは、カラムからの溶
出液の280nmの吸光度を測定し、吸光度が0.1以
下になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は。
IMのKCIと3mMの葉酸を含む緩衝液2を用いて行
い、溶出??!2を一定量ずつフラクションコレクター
を用いて分画する。分画した溶出液についてDHFR活
性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集めろ。得られ
た酵素液を、緩衝液1に対して、3回透析する。この段
階で、純度95%以上の融合タンパク質が得られる。
い、溶出??!2を一定量ずつフラクションコレクター
を用いて分画する。分画した溶出液についてDHFR活
性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集めろ。得られ
た酵素液を、緩衝液1に対して、3回透析する。この段
階で、純度95%以上の融合タンパク質が得られる。
■DEAE−)ヨバール力ラムクロマトグラフィ透析し
た酵素液を、あらかじめ緩衝液1て平衡化したDEAE
−)ヨパール力ラムに吸着させる。
た酵素液を、あらかじめ緩衝液1て平衡化したDEAE
−)ヨパール力ラムに吸着させる。
吸着後、50mMKClを含む緩衝液1で洗う。
酵素の溶出は、緩衝液1を用いて50mMから0゜3M
のKCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量
ずつフラクションコレクターを用いて以上の操作により
、融合タンパク質の高度精製均一化を、再現性良く行う
ことができる。
のKCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量
ずつフラクションコレクターを用いて以上の操作により
、融合タンパク質の高度精製均一化を、再現性良く行う
ことができる。
本発明に従うと、融合タンパク質の精製は、培養を含め
て一週間以内に行うことができ2回収率40%以上で、
均一な酵素標品を得ることができる。
て一週間以内に行うことができ2回収率40%以上で、
均一な酵素標品を得ることができる。
DHFR酵素活性は2反応液 (0,05mMのジヒド
ロ葉fj、0.06mMのNADPH,12mMの2−
メルカプトエタノール、50mMのリン酸緩衝液(pH
7,0))を、1mlのキュベツトとり、これに酵素液
を加え、340nmの吸光度の時間変化を測定すること
により行う。酵素1ユニツトは、上記反応条件において
、1分間に1マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するの
に必要な酵素量として定義する。この測定は9分光光度
計を用いて容易に行うことができる。
ロ葉fj、0.06mMのNADPH,12mMの2−
メルカプトエタノール、50mMのリン酸緩衝液(pH
7,0))を、1mlのキュベツトとり、これに酵素液
を加え、340nmの吸光度の時間変化を測定すること
により行う。酵素1ユニツトは、上記反応条件において
、1分間に1マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するの
に必要な酵素量として定義する。この測定は9分光光度
計を用いて容易に行うことができる。
(5)融合タンパク質を用いたβ−エンドルフィンの製
造 精製した融合タンパク質からのβ−エンドルフィンの切
断・分離は、アルギニルエンドペプチダーゼ(Argi
nylendopeptidase、市販品として人手
可能)で処理することにより行う。精製した融合タンパ
ク質1重量に対して、アルギニルエンドペプチダーゼ0
.011fiの割合で加え、37℃で50mM Tr
is−HCI緩衝液、pH8,5中。
造 精製した融合タンパク質からのβ−エンドルフィンの切
断・分離は、アルギニルエンドペプチダーゼ(Argi
nylendopeptidase、市販品として人手
可能)で処理することにより行う。精製した融合タンパ
ク質1重量に対して、アルギニルエンドペプチダーゼ0
.011fiの割合で加え、37℃で50mM Tr
is−HCI緩衝液、pH8,5中。
24時間処理する。反応液に等量の50%酢酸を加える
。この試料を、HPLC装置(島津LC−4A 、 1
nertsi l−005カラム)を用いて、0.1%
トリフルオロ酢酸中、15%から50%のアセトニトリ
ルの濃度勾配を用いて溶出・分離する。溶出物は、22
0nmにおける吸光度のi11定により検出することが
できる。第3図は、アルギニルエンドペプチダーゼ処理
したエンドルフィン融合タンパク質試料の高速液体クロ
マトグラムを示している。試料注入後約26分後のピー
クがβ−エンドルフィンである。このピーク画分を分離
する。分離した溶出液をエバホレーターで乾燥後、少量
の水を加イ溝1結乾燥し溶媒を除き、β−エンドルフア
ミノ酸組成を確かめることができる。
。この試料を、HPLC装置(島津LC−4A 、 1
nertsi l−005カラム)を用いて、0.1%
トリフルオロ酢酸中、15%から50%のアセトニトリ
ルの濃度勾配を用いて溶出・分離する。溶出物は、22
0nmにおける吸光度のi11定により検出することが
できる。第3図は、アルギニルエンドペプチダーゼ処理
したエンドルフィン融合タンパク質試料の高速液体クロ
マトグラムを示している。試料注入後約26分後のピー
クがβ−エンドルフィンである。このピーク画分を分離
する。分離した溶出液をエバホレーターで乾燥後、少量
の水を加イ溝1結乾燥し溶媒を除き、β−エンドルフア
ミノ酸組成を確かめることができる。
本発明の実施例においては、31の培地から湿瓜孟約1
0gの菌体が得られ、この面体(計算上。
0gの菌体が得られ、この面体(計算上。
約122mgの融合タンパク質、約19.4mgのβ−
エンドルフィンを含む。)から、約53mgの融合タン
パク質(収率、43%、計算上約8.4mgのβ−エン
ドルフィンを含む。)を精製して得ることができ、この
うち、20mgの融合タンパク質をアルギニルエンドペ
プチダーゼ処理後、HPLCて分離・精製することによ
り、約0.6mgのβ−エンドルフィンを得ることがで
きた。
エンドルフィンを含む。)から、約53mgの融合タン
パク質(収率、43%、計算上約8.4mgのβ−エン
ドルフィンを含む。)を精製して得ることができ、この
うち、20mgの融合タンパク質をアルギニルエンドペ
プチダーゼ処理後、HPLCて分離・精製することによ
り、約0.6mgのβ−エンドルフィンを得ることがで
きた。
[発明の効果コ
本発明の、新規プラスミドpENDB15を含有する大
R菌を用いることにより、融合タンパク質を容易にかつ
高収率で分離精製することが得られること、また、タン
パク質分解酵素で処理することにより融合タンパク質か
ら効率よくβ−エンドルフィンを切り出すことができる
ことからモルヒネ様生理活性を有することが知られてい
るβ−エンドルフィンの生産に有効である。本発明の方
法は、 Nagahariらがすてに報告している方法
に比較して、融合タンパク質が可溶性であること、また
DHFR酵素活性を有していることなど優れた特質を有
しておりはるかに優れている。
R菌を用いることにより、融合タンパク質を容易にかつ
高収率で分離精製することが得られること、また、タン
パク質分解酵素で処理することにより融合タンパク質か
ら効率よくβ−エンドルフィンを切り出すことができる
ことからモルヒネ様生理活性を有することが知られてい
るβ−エンドルフィンの生産に有効である。本発明の方
法は、 Nagahariらがすてに報告している方法
に比較して、融合タンパク質が可溶性であること、また
DHFR酵素活性を有していることなど優れた特質を有
しておりはるかに優れている。
次に本発明の実施例を示す。
pENDBT5の作成
β−エンドルフィンを暗号化するDNAとしては。
1、5’−GATCCGCTACGGCGGTTTCA
TGACCTCAG−3゜2、5’−AAAAATCA
CAGACCCCGCTG−3’3、5’−GTGAC
TCTGTTCAAAAACGCAATCATC−3’
4、5’−AAAAACGCATACAAAAAAGG
TGAATAAC−3’5.5′−TCGAGTTAT
TCACCTTTTTTG−3’6、5’−TATGC
GTTTTTGATGATTG−3’?、 5.’−C
GTTTTTGAACAGAGTCACCAGCGGG
G−3’8、5’−TCTGTGATTTTTCTGA
GGTCATGAAACCGCCGTAGCG−3’の
8本のDNAをホスホアミダイト法に従って化学合成し
、精製後、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、各DN
Aの5′末端をリン酸化した。リン酸化したDNAを約
0.1m1(約0.01ggのDNAを含んでいる。)
ずつ取り、これを6060でインキュベートすることに
よって両DNAをアニールさせた(これをDNA−1と
呼ぶ)。
TGACCTCAG−3゜2、5’−AAAAATCA
CAGACCCCGCTG−3’3、5’−GTGAC
TCTGTTCAAAAACGCAATCATC−3’
4、5’−AAAAACGCATACAAAAAAGG
TGAATAAC−3’5.5′−TCGAGTTAT
TCACCTTTTTTG−3’6、5’−TATGC
GTTTTTGATGATTG−3’?、 5.’−C
GTTTTTGAACAGAGTCACCAGCGGG
G−3’8、5’−TCTGTGATTTTTCTGA
GGTCATGAAACCGCCGTAGCG−3’の
8本のDNAをホスホアミダイト法に従って化学合成し
、精製後、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、各DN
Aの5′末端をリン酸化した。リン酸化したDNAを約
0.1m1(約0.01ggのDNAを含んでいる。)
ずつ取り、これを6060でインキュベートすることに
よって両DNAをアニールさせた(これをDNA−1と
呼ぶ)。
約lμgのpMEK2を、Bam)(IおよびXhor
で切断した後、アルカリホスファターゼ処理をした。ア
ルカリホスファターゼ処理したDNAをフェノール処理
することにより、共存する酵素タンパク質を変性除去し
、その後エタノールでDNAを沈澱させた。沈澱したD
NAを70%エタノールで洗った後、エタノールを除き
、減圧下に沈澱を乾燥させた。BamHIおよびXh。
で切断した後、アルカリホスファターゼ処理をした。ア
ルカリホスファターゼ処理したDNAをフェノール処理
することにより、共存する酵素タンパク質を変性除去し
、その後エタノールでDNAを沈澱させた。沈澱したD
NAを70%エタノールで洗った後、エタノールを除き
、減圧下に沈澱を乾燥させた。BamHIおよびXh。
■によるDNAの切断、アルカリホスファターゼ処理、
フェノール処理、およびエタノール沈澱の各操作は、い
、ずれも、 ”Mo1ecular CloningA
しoboratory Manual” (T、M
aniatis、 E、F、Fr1tsch。
フェノール処理、およびエタノール沈澱の各操作は、い
、ずれも、 ”Mo1ecular CloningA
しoboratory Manual” (T、M
aniatis、 E、F、Fr1tsch。
J、Sambrook、eds、cold Sprin
g )Iarbor Laboratory(+982
)、以下2文献1と呼ぶ。)に記載している方法に従っ
て行った。乾燥させたDNAを50μmのリガーゼ用反
応液(10mM Tris−HCI、p)I 7.4゜
5 mM MgCl2,10mMジチオトレイトール、
5 mM ATP)に溶解後、5μlのDNA−1を加
え、これに1ユニツトのT4−DNAリガーゼを加えて
、10℃mg/mlのアシピシリンナトリウムおよび1
0mg/m1のトリメトプリムを含む栄養寒天培地(培
地ll中に、2gのグルコース、1gのリン酸2カリウ
ム+ 5gのイーストエキス、5gのポリペプトン、1
5gの寒天を含む。)上に塗布し。
g )Iarbor Laboratory(+982
)、以下2文献1と呼ぶ。)に記載している方法に従っ
て行った。乾燥させたDNAを50μmのリガーゼ用反
応液(10mM Tris−HCI、p)I 7.4゜
5 mM MgCl2,10mMジチオトレイトール、
5 mM ATP)に溶解後、5μlのDNA−1を加
え、これに1ユニツトのT4−DNAリガーゼを加えて
、10℃mg/mlのアシピシリンナトリウムおよび1
0mg/m1のトリメトプリムを含む栄養寒天培地(培
地ll中に、2gのグルコース、1gのリン酸2カリウ
ム+ 5gのイーストエキス、5gのポリペプトン、1
5gの寒天を含む。)上に塗布し。
37°Cて24時間培養することにより、6個のコロニ
ーを得ろことができた。これらのコロニーを、1.5m
lのYT+Ap培地(培地ll中に。
ーを得ろことができた。これらのコロニーを、1.5m
lのYT+Ap培地(培地ll中に。
5gのNaC1,5gのイーストエキス、8gのトリプ
トン、!50mgのアンピシリンナトリウムを含む。)
で、37°C,1晩、菌体を培養した。
トン、!50mgのアンピシリンナトリウムを含む。)
で、37°C,1晩、菌体を培養した。
培養液を、各々エッペンドルフ遠心管にとり、12.0
00回転/分て10分間遠心分離し、菌体を沈澱として
集めた。これに、0.1mlの電気泳動用サンプル調製
液(0,0625MのTris−HCI、 pH6,8
,2$のラウリル硫酸ナトリウム(SDS)。
00回転/分て10分間遠心分離し、菌体を沈澱として
集めた。これに、0.1mlの電気泳動用サンプル調製
液(0,0625MのTris−HCI、 pH6,8
,2$のラウリル硫酸ナトリウム(SDS)。
10χのグリセリン、 5Xの2−メルカプトエタノー
ル。
ル。
0、OO1$のブロムフェノールブルーを含む。)を加
え、菌体を懸濁し、これを沸騰水中に5分間保ち。
え、菌体を懸濁し、これを沸騰水中に5分間保ち。
菌体を溶かした。この処理をしたサンプルを5DS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法(U、K。
リアクリルアミドゲル電気泳動法(U、K。
Lamm1i; Nature、 vol、227.
p、680(1970))に従って分析した。標準サン
プルとしてpMEK2を含有する大腸菌に同様な処理を
したもの、および分子量マーカーとしてラクトアルブミ
ン(分子ff114,200)、)リブシンインヒビタ
ー(分子量20,100)、トリプシノーゲン(分子f
f124,000) 、カルボニックアンヒドラーゼ(
分子ff12り、000) 、グリセロアルデヒド3−
リン酸デヒドロゲナーゼ(分子1i36,000)、卵
アルブミン(分子量45,000) 、および牛血清ア
ルブミン(分子量66.000)を含むサンプルをポリ
アクリルアミド濃度の10から20%濃度勾配ゲルで泳
動した。その結果、すべてのコロニーにおいて、pME
K2のD HF R−ME K融合タンパク質のバンド
が消失し、それより明らかに分子量が大きくなったタン
パク質(分子量的26,0−株を選び、これをYT+A
p培地で培養し。
p、680(1970))に従って分析した。標準サン
プルとしてpMEK2を含有する大腸菌に同様な処理を
したもの、および分子量マーカーとしてラクトアルブミ
ン(分子ff114,200)、)リブシンインヒビタ
ー(分子量20,100)、トリプシノーゲン(分子f
f124,000) 、カルボニックアンヒドラーゼ(
分子ff12り、000) 、グリセロアルデヒド3−
リン酸デヒドロゲナーゼ(分子1i36,000)、卵
アルブミン(分子量45,000) 、および牛血清ア
ルブミン(分子量66.000)を含むサンプルをポリ
アクリルアミド濃度の10から20%濃度勾配ゲルで泳
動した。その結果、すべてのコロニーにおいて、pME
K2のD HF R−ME K融合タンパク質のバンド
が消失し、それより明らかに分子量が大きくなったタン
パク質(分子量的26,0−株を選び、これをYT+A
p培地で培養し。
TanakaとWeist)IImの方法(T、Tan
aka、 8.Weisblum;J、 Bacter
iology、 vol、121.p、354(197
5))に従って。
aka、 8.Weisblum;J、 Bacter
iology、 vol、121.p、354(197
5))に従って。
プラスミドを調製した。得られたプラスミドをpEND
B15と名づけた。pENDB 15は、pMEK2の
BamHIとXho Iとの間の配列が。
B15と名づけた。pENDB 15は、pMEK2の
BamHIとXho Iとの間の配列が。
化学合成したDNA配列と置き変わった構造をしている
はずである。pENDB 15のEcoRI(第1図の
471−4768目の配列)と5all(第1図の93
5−940番目の配列)による切断によって得られる約
400ヌクレオチド長のDNAについて。
はずである。pENDB 15のEcoRI(第1図の
471−4768目の配列)と5all(第1図の93
5−940番目の配列)による切断によって得られる約
400ヌクレオチド長のDNAについて。
M13ファージを用いたジデオキシ法(J 、Mess
i ng; Mehtods in Er+zymo
logy、 vol、101.p、20(1983))
に従って、塩基配列を決定した。その結果、第1図に示
す配列の471番目から約940番巨迄の配列が確かめ
られた。塩基配列を検討することにより、pENDB1
!5が融合タンパク質を暗号化することが明らかとなっ
た。
i ng; Mehtods in Er+zymo
logy、 vol、101.p、20(1983))
に従って、塩基配列を決定した。その結果、第1図に示
す配列の471番目から約940番巨迄の配列が確かめ
られた。塩基配列を検討することにより、pENDB1
!5が融合タンパク質を暗号化することが明らかとなっ
た。
pMEK2の塩基配列は1本発明者らによって明らかに
されている(特願 昭63−79679)。また、pE
NDB15のEcoRI−3alI切断によって得られ
る約4.2キロ塩基対のDNAは、Pstf、Hind
[、HpaI、AatU、PvulI、BglII、お
よびC1aIを用いた制限酵素による切断実験の結果、
pMEK2のEcoRI−3al 1切断によって得ら
れる約4゜2キロ塩基対のDNAと全く同一であること
が示された。
されている(特願 昭63−79679)。また、pE
NDB15のEcoRI−3alI切断によって得られ
る約4.2キロ塩基対のDNAは、Pstf、Hind
[、HpaI、AatU、PvulI、BglII、お
よびC1aIを用いた制限酵素による切断実験の結果、
pMEK2のEcoRI−3al 1切断によって得ら
れる約4゜2キロ塩基対のDNAと全く同一であること
が示された。
以上の結果から、pENDB15の全塩基配列が第1図
に示した配列であることが決められた。
に示した配列であることが決められた。
実施例2
pENDB 15を含有する大腸菌が作る融合タンパク
質 pENDB 15を含有する大腸菌が作る融合タンパク
質のアミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列かミノ酸配列を
推定した。その結果第2図に示すアミノ酸配列が得られ
た。
質 pENDB 15を含有する大腸菌が作る融合タンパク
質のアミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列かミノ酸配列を
推定した。その結果第2図に示すアミノ酸配列が得られ
た。
pENDB 15を含有する大腸菌から、融合タンパク
質を分離精製し、精製したタンパク質の性質を調べた。
質を分離精製し、精製したタンパク質の性質を調べた。
融合タンパク質の精製
A、用いた菌体量:湿重孟 10g
B、酵素精製表
表における精製過程は■無細胞抽出液、■DEAE−)
ヨパール力うム処理、■メソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフイー、および■DEAE−)ヨバー
ル力ラムクロマトグラフイーを表す。
ヨパール力うム処理、■メソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフイー、および■DEAE−)ヨバー
ル力ラムクロマトグラフイーを表す。
精製 酵素液 回収タンパ 回収酵素 収率過程 のf
fi(ml)り質(mg) 活性(ユニット)(χ
)■ 4、171 ■ 61 230 3.125
74.9■ 31 64 2
,014 48.3■ 32 5
3 1,805 43.3得られた酵素タンパ
ク質をSDS電気泳動法(上記実施例に記載の方法)に
より分析したところ。
fi(ml)り質(mg) 活性(ユニット)(χ
)■ 4、171 ■ 61 230 3.125
74.9■ 31 64 2
,014 48.3■ 32 5
3 1,805 43.3得られた酵素タンパ
ク質をSDS電気泳動法(上記実施例に記載の方法)に
より分析したところ。
分子置駒26 、000の単一なタンパク質バンドが示
され、得られた酵票漂品が均一であることが示された。
され、得られた酵票漂品が均一であることが示された。
分離精製した融合タンパク質の性質
精製したDHPR活性を示すタンパク質をエンザイムイ
ムノアッセイにより検討したところ、β−エンドルフィ
ンに対する抗体と反応することが示された。即ち、精製
して得られたタンパク質は免疫学的にβ−エンドルフィ
ンと同等の構造を含んでいろことが明らかとなった。
ムノアッセイにより検討したところ、β−エンドルフィ
ンに対する抗体と反応することが示された。即ち、精製
して得られたタンパク質は免疫学的にβ−エンドルフィ
ンと同等の構造を含んでいろことが明らかとなった。
精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端量したく
カルボキシペプチダーゼ法によるカルボキシ末端側のア
ミノ酸配列の決定法)。その結果。
カルボキシペプチダーゼ法によるカルボキシ末端側のア
ミノ酸配列の決定法)。その結果。
Gly−Glu (カルボキシ末端)であることが予想
された。また、精製して得られたタンパク質な酸加水分
解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配列の結果予
想されるアミノ酸組成と一致した結果が得られた。
された。また、精製して得られたタンパク質な酸加水分
解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配列の結果予
想されるアミノ酸組成と一致した結果が得られた。
実施例3
精製分離した融合タンパク質からのβ−エンドルフィン
の分離 実施例2で得られた2mlの精製均一化した融合タンパ
ク質の溶液(緩衝液l中、約20 rn g +約92
0nmo 1 eの融合タンパク質を含む)に。
の分離 実施例2で得られた2mlの精製均一化した融合タンパ
ク質の溶液(緩衝液l中、約20 rn g +約92
0nmo 1 eの融合タンパク質を含む)に。
0゜2mgのアルギニルエンドペプチダーゼを加え、3
7℃で24時間反応させる。反応後、1mlの酢酸を加
える。そのうちの、0.5ml (約153nmole
の融合タンパク質を含むはず)をとり、高速液体クロマ
ドグフィー装置(島津LC−4A)を用い1nerts
il−00S5μmカラムで分離した。溶出は、0.1
%トリフルオロ酢酸中。
7℃で24時間反応させる。反応後、1mlの酢酸を加
える。そのうちの、0.5ml (約153nmole
の融合タンパク質を含むはず)をとり、高速液体クロマ
ドグフィー装置(島津LC−4A)を用い1nerts
il−00S5μmカラムで分離した。溶出は、0.1
%トリフルオロ酢酸中。
アセトニトリルの濃度勾配(15%から50%)をかけ
ることにより行った。0から2分までは。
ることにより行った。0から2分までは。
15%のアセニトリルを用い、2分から32分までは、
15%から50%のアセトニトリルの直線濃度勾配をか
けた。その結果、第3図に示すような溶出曲線が得られ
た。試料注入後約26分後のピーク画分を分離し2分離
した溶出液をエバボレーターで乾燥後、少量の水を加え
凍結乾燥し溶媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプ
チドを酸加水分解後、その5分の1をアミノ酸分析に用
いた。その結果、アスパラギン酸、スレオニン、セリン
、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリ
ン2メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、
フェニルアラニン、およびリジンがそれぞれ、11.4
,16.3,11.0゜1B、2,5.8,17.6,
11.6,5.7゜5.7.Ll、7,12.1,11
.1,11゜4、およτT巻16.5nmoleずつ検
出された。
15%から50%のアセトニトリルの直線濃度勾配をか
けた。その結果、第3図に示すような溶出曲線が得られ
た。試料注入後約26分後のピーク画分を分離し2分離
した溶出液をエバボレーターで乾燥後、少量の水を加え
凍結乾燥し溶媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプ
チドを酸加水分解後、その5分の1をアミノ酸分析に用
いた。その結果、アスパラギン酸、スレオニン、セリン
、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリ
ン2メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、
フェニルアラニン、およびリジンがそれぞれ、11.4
,16.3,11.0゜1B、2,5.8,17.6,
11.6,5.7゜5.7.Ll、7,12.1,11
.1,11゜4、およτT巻16.5nmoleずつ検
出された。
致した。また、アミノ酸分析に用いた標品は、約5.7
μmo l e (約19.7μg)のβ−エンドルフ
ィンを含んでいたことになる。この結果から、精製均一
化した融合タンパク質を用いて、アルギニルエンドペプ
チダーゼ処理した標品をHPLCを用いて分離すること
により収率的19%てβ−エンドルフィンを回収できる
ことが明かとなった。融合タンパク質の精製の収率が約
43%であり、融合タンパク質からのβ−エンドルフィ
ンの分離の収率が約19%であることから、大腸菌がつ
くるβ−エンドルフィンの単離収率が約8%であると計
算される。
μmo l e (約19.7μg)のβ−エンドルフ
ィンを含んでいたことになる。この結果から、精製均一
化した融合タンパク質を用いて、アルギニルエンドペプ
チダーゼ処理した標品をHPLCを用いて分離すること
により収率的19%てβ−エンドルフィンを回収できる
ことが明かとなった。融合タンパク質の精製の収率が約
43%であり、融合タンパク質からのβ−エンドルフィ
ンの分離の収率が約19%であることから、大腸菌がつ
くるβ−エンドルフィンの単離収率が約8%であると計
算される。
第1図は、pENDB15の全塩基配列を示した図であ
り、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列配列を、5
°末端から3′末端の方向に記述している。図中符号は
、核酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、
Gはグアニンを、Tはチミンを示している。国中番号は
、pENDB15に2箇所存在する制限酵素C1al切
断認識部位のうち制限酵素HindllI切断部位に近
い方のC1al切断認識部位の、5’ −ATCGAT
−3’ 、の最初の°′Aパを1番として数えた番号を
示している。 第2図は、pENDB1!5中に存在する融合タンパク
質を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミ
ノ酸配列を示す図である。国中符号は、核酸塩基および
アミノ酸を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、G
はグアニンを、Tはチミンを、Alaはアラニンを、A
rgはアルギニ・ンを、Asnはアスパラギンを、As
pはアスパラギン酸を、Cysはシスティンを、Gln
はグルタミンを、Gluはグルタミン酸を、Glyはグ
リシンを、)(isはヒスチジンを、Ileはイソロイ
シンを+ Leuはロイシンを、Lysはリジンを、M
etはメチオニンを、Pheはフェニンを示している。 図中番号は、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号
化するATGコドンのA ”を1番として数えた番号を
示している。 第3図は、アルギニルエンドペプチダーゼ処理した融合
タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを示している
。横軸は試料注入後の時間を分単位で、縦軸は、220
nmの吸光度を任意単位で表現している。矢印で示した
ピークがβ−エンドルフィンの溶出ピークである。
り、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列配列を、5
°末端から3′末端の方向に記述している。図中符号は
、核酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、
Gはグアニンを、Tはチミンを示している。国中番号は
、pENDB15に2箇所存在する制限酵素C1al切
断認識部位のうち制限酵素HindllI切断部位に近
い方のC1al切断認識部位の、5’ −ATCGAT
−3’ 、の最初の°′Aパを1番として数えた番号を
示している。 第2図は、pENDB1!5中に存在する融合タンパク
質を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミ
ノ酸配列を示す図である。国中符号は、核酸塩基および
アミノ酸を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、G
はグアニンを、Tはチミンを、Alaはアラニンを、A
rgはアルギニ・ンを、Asnはアスパラギンを、As
pはアスパラギン酸を、Cysはシスティンを、Gln
はグルタミンを、Gluはグルタミン酸を、Glyはグ
リシンを、)(isはヒスチジンを、Ileはイソロイ
シンを+ Leuはロイシンを、Lysはリジンを、M
etはメチオニンを、Pheはフェニンを示している。 図中番号は、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号
化するATGコドンのA ”を1番として数えた番号を
示している。 第3図は、アルギニルエンドペプチダーゼ処理した融合
タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを示している
。横軸は試料注入後の時間を分単位で、縦軸は、220
nmの吸光度を任意単位で表現している。矢印で示した
ピークがβ−エンドルフィンの溶出ピークである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸面
にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
ことができ、4718塩基対の大きさを有し、第1図に
おいて示されるDNA配列を有する新規組換えプラスミ
ドpENDB15。 2、pENDB15を含有する大腸菌。 3、pENDB15を含有する大腸菌が生産し、第2図
によって示されるアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還
元酵素−β−エンドルフィン融合タンパク質。 4、pENDB15を含有する大腸菌を培養し、ジヒド
ロ葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元酵素−
β−エンドルフィン融合タンパク質を、培養菌体の無細
胞抽出液から、メソトリキセート結合アフィニティカラ
ムクロマトグラフィー、および陰イオン交換カラムクロ
マトグラフィーを用いて精製することを特徴とするジヒ
ドロ葉酸還元酵素−β−エンドルフィン融合タンパク質
の分離精製方法。 5、pENDB15を含有する大腸菌の生産するジヒド
ロ葉酸還元酵素−β−エンドルフィン融合タンパク質を
分離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元酵素−β−エン
ドルフィン融合タンパク質をタンパク質分解酵素で消化
した後、β−エンドルフィンを分離精製することを特徴
とするβ−エンドルフィンの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25226588A JPH02100681A (ja) | 1988-10-06 | 1988-10-06 | β−エンドルフイン |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25226588A JPH02100681A (ja) | 1988-10-06 | 1988-10-06 | β−エンドルフイン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02100681A true JPH02100681A (ja) | 1990-04-12 |
JPH0355110B2 JPH0355110B2 (ja) | 1991-08-22 |
Family
ID=17234832
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25226588A Granted JPH02100681A (ja) | 1988-10-06 | 1988-10-06 | β−エンドルフイン |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02100681A (ja) |
-
1988
- 1988-10-06 JP JP25226588A patent/JPH02100681A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0355110B2 (ja) | 1991-08-22 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |