JPH02100681A

JPH02100681A - β−エンドルフイン

Info

Publication number: JPH02100681A
Application number: JP25226588A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Izukura; 厳倉　正寛; Tsukasa Sakai; 坂井　士; Yoshio Tanaka; 芳雄田中
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1988-10-06
Filing date: 1988-10-06
Publication date: 1990-04-12
Also published as: JPH0355110B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、β−エンドルフィンの遺伝子組換え法による
新規な製造方法およびそれに係わる組換えプラスミド、
形質転換株、融合タンパク質に間する。

β−エンドルフィンは、３１個のアミノ酸より構成され
るモルヒネ様生理活性を有するペプチドであり、下記ア
ミノ酸配列を有する。

β−エンドルフィン：　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
ｃ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌｙｓ−５
ｅｒ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｔｈｒ　−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａ　Ｉ　−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−
Ａｌａ−１１ｅ−ｌ　１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−
Ｔｙｒ−しｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ本発明の新規組換えプラスミドｐＥＮＤＢ　１５は、第
１図において示されるＤＮＡ配列を有する。

本発明は２発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である
。

［従来の技術］ β−エンドルフィンは２モルヒネ様生理活性を示すエン
ドルフィン類に属するペプチドであり。

ロイシンエンケファリンの約２３４０倍、メチオニンエ
ンケファリンの約１５６０倍の鎮痛活性を示す興味深い
生理活性ペプチドである。

本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。遺伝子操作を利用したβ−エン法が公ｉ上ある
（Ｋ、Ｎａｇａｈａｒｉ　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｇｒｉｃ
。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　ｖｏｌ、５］、　ｐ、８４
５−８５１（１９８７））。彼らの方法は、大腸菌のア
ントラニル酸合成酵素のアミン末端から約６２％までの
部分と融合させて９面体内に不溶化物としてＴｔ積させ
る方法である。彼らの方法に従えば、効率よくβ−エン
ドルフィンを含む融合タンパク質を生産することができ
るが。

作られた融合タンパク質が不溶性となるため、融合タン
パク質の可溶化とか、目的融合タンパク質の高度精製な
、どに関して問題が考えられる。

既に２本発明者らは、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵
素（以下、ＤＨＦＲと略す。）遺伝子に間して、その遺
伝子の改変の結果、異種遺伝子発現用プラスミドベクタ
ーｐＴＰ７０−１　（特願昭６１−３１２８３６）と、
それを利用した融合遺伝子の作成方法（特願　昭６２−
３０２１５３）を開発している。また、ｐＴＰ７０−１
にメチオニンエンケファリン（以下、１ＩＥＫと略す。

）を暗号化する化学ＤＮＡを組み込んで、ＭＥＫの効率
よい生産方法を開発している（特願　昭６３−７９６８
０）。効率のよいＭＥＫの生産方法を開発する際に得ら
れた組換えプラスミドｐＭＥＫ２は、制限酵素ＢａｍＨ
ＩとＸ　ｈ　ｏ　Ｉ部位の間の配列を異種ＤＮＡと取り
替えるだけで、ＤＨＦＲとの融合遺伝子を容易に作成で
きる。また、ｐＭＥＫ２を利用して融合遺伝子を作成し
た場合、融合遺伝子の発現の結果帯られる融合タンパク
質は。

不溶化することなく２かつ大腸菌菌体のＺ　！、ｉｆｔ
としては全菌体タンパク質の約２０％が期待される。

しかしながら、β−エンドルフィンの生産に上記発現ベ
クターを用いた例はない。

［発明の目的］本発明の目的は、ＤＨＦＲとの融合遺伝子を作製し、β
−エンドルフィンとの融合タンパク質を大腸菌で作らせ
、融合タンパク質の性質を利用い融合タンパク質の分離
精製を効率的に行い、高度精製した融合タンパク質を利
用したβ−エンドルフィン９方法を開発することにある
。

−ｋ　、’ＦＪＨヮ１１２オー　８．。■ロ、利用。、
鋭竜研究を設計・化学合成し、ｐＭＥＫ２に組み込むこ
とにより、β−エンドルフィン遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子
との融合遺伝子を作成し、融合遺伝子を大腸菌で発現さ
せることにより、ＤＨＦＲ−β−エンドルフィン融合タ
ンパク質（以下、融合タンパク貿と略す。）を大量に生
産できることを見いだし。

さらに、融合タンパク質を用いることにより効果的にβ
−エンドルフィンを作成できることを明らかにし２本発
明を完成させた。

［発明の構成］本発明は、（１）８合タンパク質の天竜発現を可能にす
る新規組換えプラスミドｐＥＮＤＢ１５゜（２）ｐＥＮ
ＤＢ　１５を含有する大腸菌菌体、（３）ｐＥＮＤＢ１
５を含有する大腸菌が生産する融合タンパク質、　　（
４）ｐＥＮＤＢ１５を含有する大腸菌からの融合タンパ
ク質の分離精製方法。

および（５）融合タンパク貿を用いたβ−エンドルフィ
ンの製造方法、の発明により構成される。

（１）新規組換えプラスミドｐＥＮＤＢ１５第１図は２
本発明のｐＥＮＤＢ　１５の全塩基配列を示している。

図は、２木鎖環状ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列
を、プラスミド中に２箇所存在する制限酵素ＣＬａＩ部
位のうち制限酵素）（ｉｎｄｌＩＩ部位に近い方の切断
認識部位、　５’−ＡＴＣＧＡＴ−３’、の最初の１ｊ
Ａｌｌを１番として数えて、５′末端から３゛末端の方
向に記述している。本発明のｐＥＮＤＢ　１５は、新規
な組換えプラスミドである。ｐＥＮＤＢｌ５は、４７１
８塩基対の大きさであり、宿主である大腸菌にトリメト
プリムおよびアンピシリン耐性を付与することができる
。ｐＥＮＤＢｌ　５は、ｐＭＥＫ２（特願　昭６３−７
９６８０に記載。）のＢａｍＨＩとＸｈｏ　Ｉ部位の間
のＭＥＫを暗号化する配列を含む２６塩基対の配列を、
β−エンドルフィンを暗号化する配列を含む１０４塩基
対の化学合成りＮＡと置き換丈配列であ、％ｌそれ以外
の配列がｐＭＥＫ２由来の配列である。

第１図の５７７番目ら６３２番目まで配列は。

ＤＨＦＲのカルボキシ末端側にβ−エンドルフィンがア
ルギニン（Ａｒｇ）を介して結合した融合タンパク質を
暗号化している。

融合タンパク質を暗号化する配列の上流には。

遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する（特願
　昭６ｌ−３１２８３６）。即ち、４３番目から５００
番目での配列がＳＤ配列と呼ばれるもので、効率の良い
翻訳に、また、４６７５＠目から４７０４Ｓ目までが、
コンセンサス転写プロモーターであり、効率の良い転写
に貢献する。このことから、ｐＥＮＤＢｌ５は、大腸菌
に導入された場合、多量の融合タンパク質を作らせるこ
とができる。作られた融合タンパク質は、菌体内に可溶
性の状態で２面体タンパク質の約２０％程度蓄積する。

このことによって、ｐＥＮＤＢｌ５を含有する大腸菌は
トリメトプリム耐性を示すようになる。また、ｐＥＮＤ
Ｂｌ５は、ｐＭＥＫ１由来の、アンピシリン耐性遺伝子
を有している。このことから、ｐＥＮＤＢｌ５が導入さ
れた大腸菌は、アンピシリン耐性をも示す。ｐＥＮＤＢ
　１５は、大腸菌に導入されて安定状態に保たれ、ｐＥ
ＮＤＢｌ５を含有する大腸菌は、徹工研にＦＥＲＭＢＰ
−２０２９として寄託されている。

このような特長を有するｐＥＮＤＢｌ５は、実施例１に
従って作成することができるが、絹換えプラスミドの作
成方法によって本発明が制限されるものではない。

ンピシリ耕トリウムを含む液体培地）を用いて。

３７℃で定常期まで培養した場合、蓄積する融合タンパ
ク質は、菌体タンパク質の約２０％に達する。培養面体
を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液に懸濁し、フレン
チプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、これを遠心分
離法により上清と沈澱に分離した場合、全ての融合タン
パク質は上清中に回収される。ｐＥＮＤＢ　１５を含有
する大腸菌は、ｙ＆工研にＦＥＲＭ　　ＢＰ−２０２９
として寄託されている。

（２）ｐＥＮＤＢｌ５を含有する大腸菌ｐＥＮＤＢ　１
５を含有する大腸菌は、トリメトプリム及びアンピシリ
ンに対して耐性を示す。ｐＥＮＤＢｌ５を含有する大腸
菌は、融合タンパク質遺伝子の効率のよい発現の結果、
融合タンパク質を菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積す
る。ｐＥＮＤＢｌ５を含有する大腸菌をＹＴ＋Ａｐ培地
（培地Ｉｎ中に＋　５ｇのＮａＣｌ、８ｇのトリプトン
、５」のイーストエキス、及び５０　ｍ　ｇのア（３）
融合タンパク質第２図は、融合タンパク質を暗号化する部分のＤＮＡ配
列とそれから作られると予想されるタンパク質のアミノ
酸配列を示している。融合タンパク質は、１９２アミノ
酸よりなる新規なタンパク質である。アミノ末端側から
数えて、１から１５９番目までの配列が、大腸菌の野生
型ＤＨＦＲに１箇所アミノ酸置換置換が起こった（　Ｃ
ｙｓ−１５２（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）　−＊　Ｇｌｕ−
１５２）配列であり＋１６２＠目から１９２番目までが
β−エンドルフィンの配列である。β−エンドルフィン
の配列の直前のアミノ酸はアルギニン（Ａ　ｒ　ｇ）で
ある。β−エンドルフィンはアルギニンを含まない。こ
のことから。

融合タンパク質をアルギニルエンドペプチダーゼ（Ａｒ
ｇｉｎｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、市販品として
人手可能）で処理することにより特異的に切り出すこと
ができる。１６０と１６１番目のイソロイシン（［１ｅ
）−ロイシン（Ｌ　ｅ　ｕ）の配列は、ｐＭＥＫ２のＢ
ａｍＨＩ部位にβ−エンドルフィンを暗号化するＤＮＡ
を導入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わせるため
に生じた配列である（ｐＭＥＫ２のもとどなったｐＴＰ
７０−１が作るＤＨＦＲは、１６２個のアミノ酸よりな
り、第２図の融合タンパク質のアミノ酸配列のうち、ア
ミノ末端側から数えて、１から１６０番目までの配列に
。

Ｇｌｎ−１１ｅの２個のアミノ酸配列が結合した配列を
している。）。融合タンパク質およびβ−エンドルフィ
ンｑ分子量は、それぞれ２１，７４１および融合タンパ
ク質はＤＨＦＲのカルボキシ末端側に。

β−エンドルフィンが融合した構造をしているにもかか
わらず、ＤＨＦＲ酵素活性を有する。このため、大腸菌
が融合タンパク質を多責につくると。

ＤＨＦＲの阻害剤であり抗細菌剤であるトリメトプリム
に対して、耐性を示すようになる。

（４）融合タンパク質の分離精製本発明の融合タンパク質の分＃Ｉｌ精製法は、■菌の培
養体、■菌体の破砕、■ＤＥＡＥ−）ヨバール力うム処
理、■メソトリキセート（ＭＴＸ）結合アフィニティク
ロマトグラフィー、および■ＤＥＡＥ−）ヨパール力ラ
ムクロマトグラフィーの過程より成り立っている。

■菌体の培養ｐＥＮＤＢ　１５を含有する大腸菌の培養は、ＹＴ＋Ａ
ｐ培地（培地ｌｌ中に、５ｇのＮａＣｌ。

８ｇのトリプトン、５ｇのイーストエキスおよび５０ｍ
ｇのアンピシリンナトリウムを含む液体培地。）で培養
することができる。培地としては。

この池にＳＴ＋Ａｐ培地（培地１１中に、２ｇのグルコ
ース、１ｇのリン酸２カリウム、５ｇのポリペプトン、
５ｇのイーストエキスおよび５０ｍｇのアンピシリンナ
トリウムを含む液体培地。）など、菌体が成長する培地
であれば、どの様な培地でも用いることができるが、調
べた限りでは。

ＹＴ＋Ａｐ培地が最適であった。

ｐＥＮＤＢ　１５を含有する大腸菌を、培地に接種し、
３７℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する
。培養した菌体は、５，０００回転／分の遠心分離によ
り集める。培地１１より湿重量２から５ｇの菌体が得ら
れる。

集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
（０から１０℃の間、４℃が望ましい）で行う。

■菌体の破砕培養して得られた面体を、湿重量の３倍の緩衝液ｌ（０
，１ｍＭ　　エチレンジアミン４酢酸ナトリウム島Ｄ　
Ｔ　Ａ）を含む１０ｍＭリン酸カワウを用いて面体を破
砕する。面体破砕液を、３５゜０００回転、１時間超遠
心分離し、上清を得る（無細胞抽出液）。

■ＤＥＡＥ−１ヨバール力ラム処理無細胞抽出液を、あらかじめ５０ｍＭのＫＣＩを含む緩
衝液１で平衡化したＤＥＡＥ）ヨバール力ラムにかけ、
カラム容量の５０ｍＭのＫＣＩを含む緩衝液ｌでカラム
を洗う。酵素のｉ容量は、緩（ｉｆｒｉ夜１を用いて５
０ｍＭから０．３ＭのＫＣＩの直線濃度勾配を用いて行
い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用い
て分画する。分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性を測
定し、酵素活性が含まれる両分を集める。

■ＭＴＸ結合アフィニティクロマトグラフィー上記の操
作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝液１で平衡
化したＭＴＸ結合アガロース−７フイニテイカラムに吸
着させる。吸着後、ＩＭのＫＣＩを含む緩衝液２　（０
，１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液、Ｉ）Ｈ８゜５）で洗う。洗いは、カラムからの溶
出液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度が０．１以
下になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は。

ＩＭのＫＣＩと３ｍＭの葉酸を含む緩衝液２を用いて行
い、溶出？？！２を一定量ずつフラクションコレクター
を用いて分画する。分画した溶出液についてＤＨＦＲ活
性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集めろ。得られ
た酵素液を、緩衝液１に対して、３回透析する。この段
階で、純度９５％以上の融合タンパク質が得られる。

■ＤＥＡＥ−）ヨバール力ラムクロマトグラフィ透析し
た酵素液を、あらかじめ緩衝液１て平衡化したＤＥＡＥ
−）ヨパール力ラムに吸着させる。

吸着後、５０ｍＭＫＣｌを含む緩衝液１で洗う。

酵素の溶出は、緩衝液１を用いて５０ｍＭから０゜３Ｍ
のＫＣＩの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量
ずつフラクションコレクターを用いて以上の操作により
、融合タンパク質の高度精製均一化を、再現性良く行う
ことができる。

本発明に従うと、融合タンパク質の精製は、培養を含め
て一週間以内に行うことができ２回収率４０％以上で、
均一な酵素標品を得ることができる。

ＤＨＦＲ酵素活性は２反応液　（０，０５ｍＭのジヒド
ロ葉ｆｊ、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ，１２ｍＭの２−
メルカプトエタノール、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０））を、１ｍｌのキュベツトとり、これに酵素液
を加え、３４０ｎｍの吸光度の時間変化を測定すること
により行う。酵素１ユニツトは、上記反応条件において
、１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するの
に必要な酵素量として定義する。この測定は９分光光度
計を用いて容易に行うことができる。

（５）融合タンパク質を用いたβ−エンドルフィンの製
造精製した融合タンパク質からのβ−エンドルフィンの切
断・分離は、アルギニルエンドペプチダーゼ（Ａｒｇｉ
ｎｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、市販品として人手
可能）で処理することにより行う。精製した融合タンパ
ク質１重量に対して、アルギニルエンドペプチダーゼ０
．０１１ｆｉの割合で加え、３７℃で５０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ緩衝液、ｐＨ８，５中。

２４時間処理する。反応液に等量の５０％酢酸を加える
。この試料を、ＨＰＬＣ装置（島津ＬＣ−４Ａ　、　１
ｎｅｒｔｓｉ　ｌ−００５カラム）を用いて、０．１％
トリフルオロ酢酸中、１５％から５０％のアセトニトリ
ルの濃度勾配を用いて溶出・分離する。溶出物は、２２
０ｎｍにおける吸光度のｉ１１定により検出することが
できる。第３図は、アルギニルエンドペプチダーゼ処理
したエンドルフィン融合タンパク質試料の高速液体クロ
マトグラムを示している。試料注入後約２６分後のピー
クがβ−エンドルフィンである。このピーク画分を分離
する。分離した溶出液をエバホレーターで乾燥後、少量
の水を加イ溝１結乾燥し溶媒を除き、β−エンドルフア
ミノ酸組成を確かめることができる。

本発明の実施例においては、３１の培地から湿瓜孟約１
０ｇの菌体が得られ、この面体（計算上。

約１２２ｍｇの融合タンパク質、約１９．４ｍｇのβ−
エンドルフィンを含む。）から、約５３ｍｇの融合タン
パク質（収率、４３％、計算上約８．４ｍｇのβ−エン
ドルフィンを含む。）を精製して得ることができ、この
うち、２０ｍｇの融合タンパク質をアルギニルエンドペ
プチダーゼ処理後、ＨＰＬＣて分離・精製することによ
り、約０．６ｍｇのβ−エンドルフィンを得ることがで
きた。

［発明の効果コ本発明の、新規プラスミドｐＥＮＤＢ１５を含有する大
Ｒ菌を用いることにより、融合タンパク質を容易にかつ
高収率で分離精製することが得られること、また、タン
パク質分解酵素で処理することにより融合タンパク質か
ら効率よくβ−エンドルフィンを切り出すことができる
ことからモルヒネ様生理活性を有することが知られてい
るβ−エンドルフィンの生産に有効である。本発明の方
法は、　Ｎａｇａｈａｒｉらがすてに報告している方法
に比較して、融合タンパク質が可溶性であること、また
ＤＨＦＲ酵素活性を有していることなど優れた特質を有
しておりはるかに優れている。

次に本発明の実施例を示す。

ｐＥＮＤＢＴ５の作成 β−エンドルフィンを暗号化するＤＮＡとしては。

１、５’−ＧＡＴＣＣＧＣＴＡＣＧＧＣＧＧＴＴＴＣＡ
ＴＧＡＣＣＴＣＡＧ−３゜２、５’−ＡＡＡＡＡＴＣＡ
ＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧ−３’３、５’−ＧＴＧＡＣ
ＴＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＴＣＡＴＣ−３’
４、５’−ＡＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＧ
ＴＧＡＡＴＡＡＣ−３’５．５′−ＴＣＧＡＧＴＴＡＴ
ＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧ−３’６、５’−ＴＡＴＧＣ
ＧＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＧ−３’？、　５．’−Ｃ
ＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧ
Ｇ−３’８、５’−ＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＡ
ＧＧＴＣＡＴＧＡＡＡＣＣＧＣＣＧＴＡＧＣＧ−３’の
８本のＤＮＡをホスホアミダイト法に従って化学合成し
、精製後、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、各ＤＮ
Ａの５′末端をリン酸化した。リン酸化したＤＮＡを約
０．１ｍ１（約０．０１ｇｇのＤＮＡを含んでいる。）
ずつ取り、これを６０６０でインキュベートすることに
よって両ＤＮＡをアニールさせた（これをＤＮＡ−１と
呼ぶ）。

約ｌμｇのｐＭＥＫ２を、Ｂａｍ）（ＩおよびＸｈｏｒ
で切断した後、アルカリホスファターゼ処理をした。ア
ルカリホスファターゼ処理したＤＮＡをフェノール処理
することにより、共存する酵素タンパク質を変性除去し
、その後エタノールでＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤ
ＮＡを７０％エタノールで洗った後、エタノールを除き
、減圧下に沈澱を乾燥させた。ＢａｍＨＩおよびＸｈ。

■によるＤＮＡの切断、アルカリホスファターゼ処理、
フェノール処理、およびエタノール沈澱の各操作は、い
、ずれも、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＡ
しｏｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ”　　（Ｔ、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ、　　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ。

Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｄｓ、ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（＋９８２
）、以下２文献１と呼ぶ。）に記載している方法に従っ
て行った。乾燥させたＤＮＡを５０μｍのリガーゼ用反
応液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ）Ｉ　７．４゜
５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオトレイトール、
５　ｍＭ　ＡＴＰ）に溶解後、５μｌのＤＮＡ−１を加
え、これに１ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加えて
、１０℃ｍｇ／ｍｌのアシピシリンナトリウムおよび１
０ｍｇ／ｍ１のトリメトプリムを含む栄養寒天培地（培
地ｌｌ中に、２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウ
ム＋　５ｇのイーストエキス、５ｇのポリペプトン、１
５ｇの寒天を含む。）上に塗布し。

３７°Ｃて２４時間培養することにより、６個のコロニ
ーを得ろことができた。これらのコロニーを、１．５ｍ
ｌのＹＴ＋Ａｐ培地（培地ｌｌ中に。

５ｇのＮａＣ１，５ｇのイーストエキス、８ｇのトリプ
トン、！５０ｍｇのアンピシリンナトリウムを含む。）
で、３７°Ｃ，１晩、菌体を培養した。

培養液を、各々エッペンドルフ遠心管にとり、１２．０
００回転／分て１０分間遠心分離し、菌体を沈澱として
集めた。これに、０．１ｍｌの電気泳動用サンプル調製
液（０，０６２５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ６，８
，２＄のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）。

１０χのグリセリン、　５Ｘの２−メルカプトエタノー
ル。

０、ＯＯ１＄のブロムフェノールブルーを含む。）を加
え、菌体を懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち。

菌体を溶かした。この処理をしたサンプルを５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｕ、Ｋ。

Ｌａｍｍ１ｉ；　Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、２２７．　
ｐ、６８０（１９７０））に従って分析した。標準サン
プルとしてｐＭＥＫ２を含有する大腸菌に同様な処理を
したもの、および分子量マーカーとしてラクトアルブミ
ン（分子ｆｆ１１４，２００）、）リブシンインヒビタ
ー（分子量２０，１００）、トリプシノーゲン（分子ｆ
ｆ１２４，０００）　、カルボニックアンヒドラーゼ（
分子ｆｆ１２り、０００）　、グリセロアルデヒド３−
リン酸デヒドロゲナーゼ（分子１ｉ３６，０００）、卵
アルブミン（分子量４５，０００）　、および牛血清ア
ルブミン（分子量６６．０００）を含むサンプルをポリ
アクリルアミド濃度の１０から２０％濃度勾配ゲルで泳
動した。その結果、すべてのコロニーにおいて、ｐＭＥ
Ｋ２のＤ　ＨＦ　Ｒ−ＭＥ　Ｋ融合タンパク質のバンド
が消失し、それより明らかに分子量が大きくなったタン
パク質（分子量的２６，０−株を選び、これをＹＴ＋Ａ
ｐ培地で培養し。

ＴａｎａｋａとＷｅｉｓｔ）ＩＩｍの方法（Ｔ、Ｔａｎ
ａｋａ、　８．Ｗｅｉｓｂｌｕｍ；Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１２１．ｐ、３５４（１９７
５））に従って。

プラスミドを調製した。得られたプラスミドをｐＥＮＤ
Ｂ１５と名づけた。ｐＥＮＤＢ　１５は、ｐＭＥＫ２の
ＢａｍＨＩとＸｈｏ　Ｉとの間の配列が。

化学合成したＤＮＡ配列と置き変わった構造をしている
はずである。ｐＥＮＤＢ　１５のＥｃｏＲＩ（第１図の
４７１−４７６８目の配列）と５ａｌｌ（第１図の９３
５−９４０番目の配列）による切断によって得られる約
４００ヌクレオチド長のＤＮＡについて。

Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ法（Ｊ　、Ｍｅｓｓ
　ｉ　ｎｇ；　Ｍｅｈｔｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｒ＋ｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１０１．ｐ、２０（１９８３））
に従って、塩基配列を決定した。その結果、第１図に示
す配列の４７１番目から約９４０番巨迄の配列が確かめ
られた。塩基配列を検討することにより、ｐＥＮＤＢ１
！５が融合タンパク質を暗号化することが明らかとなっ
た。

ｐＭＥＫ２の塩基配列は１本発明者らによって明らかに
されている（特願　昭６３−７９６７９）。また、ｐＥ
ＮＤＢ１５のＥｃｏＲＩ−３ａｌＩ切断によって得られ
る約４．２キロ塩基対のＤＮＡは、Ｐｓｔｆ、Ｈｉｎｄ
［、ＨｐａＩ、ＡａｔＵ、ＰｖｕｌＩ、ＢｇｌＩＩ、お
よびＣ１ａＩを用いた制限酵素による切断実験の結果、
ｐＭＥＫ２のＥｃｏＲＩ−３ａｌ　１切断によって得ら
れる約４゜２キロ塩基対のＤＮＡと全く同一であること
が示された。

以上の結果から、ｐＥＮＤＢ１５の全塩基配列が第１図
に示した配列であることが決められた。

実施例２ｐＥＮＤＢ　１５を含有する大腸菌が作る融合タンパク
質ｐＥＮＤＢ　１５を含有する大腸菌が作る融合タンパク
質のアミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列かミノ酸配列を
推定した。その結果第２図に示すアミノ酸配列が得られ
た。

ｐＥＮＤＢ　１５を含有する大腸菌から、融合タンパク
質を分離精製し、精製したタンパク質の性質を調べた。

融合タンパク質の精製Ａ、用いた菌体量：湿重孟　１０ｇＢ、酵素精製表表における精製過程は■無細胞抽出液、■ＤＥＡＥ−）
ヨパール力うム処理、■メソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフイー、および■ＤＥＡＥ−）ヨバー
ル力ラムクロマトグラフイーを表す。

精製　酵素液　回収タンパ　回収酵素　収率過程　のｆ
ｆｉ（ｍｌ）り質（ｍｇ）　　　活性（ユニット）（χ
）■ ４、１７１ ■　　　　６１　　　　　　２３０　　　３．１２５　
　　７４．９■　　　　３１　　　　　　６４　　　２
，０１４　　　４８．３■　　　　３２　　　　　　５
３　　　１，８０５　　　４３．３得られた酵素タンパ
ク質をＳＤＳ電気泳動法（上記実施例に記載の方法）に
より分析したところ。

分子置駒２６　、０００の単一なタンパク質バンドが示
され、得られた酵票漂品が均一であることが示された。

分離精製した融合タンパク質の性質精製したＤＨＰＲ活性を示すタンパク質をエンザイムイ
ムノアッセイにより検討したところ、β−エンドルフィ
ンに対する抗体と反応することが示された。即ち、精製
して得られたタンパク質は免疫学的にβ−エンドルフィ
ンと同等の構造を含んでいろことが明らかとなった。

精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端量したく
カルボキシペプチダーゼ法によるカルボキシ末端側のア
ミノ酸配列の決定法）。その結果。

Ｇｌｙ−Ｇｌｕ　（カルボキシ末端）であることが予想
された。また、精製して得られたタンパク質な酸加水分
解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配列の結果予
想されるアミノ酸組成と一致した結果が得られた。

実施例３精製分離した融合タンパク質からのβ−エンドルフィン
の分離実施例２で得られた２ｍｌの精製均一化した融合タンパ
ク質の溶液（緩衝液ｌ中、約２０　ｒｎ　ｇ　＋約９２
０ｎｍｏ　１　ｅの融合タンパク質を含む）に。

０゜２ｍｇのアルギニルエンドペプチダーゼを加え、３
７℃で２４時間反応させる。反応後、１ｍｌの酢酸を加
える。そのうちの、０．５ｍｌ　（約１５３ｎｍｏｌｅ
の融合タンパク質を含むはず）をとり、高速液体クロマ
ドグフィー装置（島津ＬＣ−４Ａ）を用い１ｎｅｒｔｓ
ｉｌ−００Ｓ５μｍカラムで分離した。溶出は、０．１
％トリフルオロ酢酸中。

アセトニトリルの濃度勾配（１５％から５０％）をかけ
ることにより行った。０から２分までは。

１５％のアセニトリルを用い、２分から３２分までは、
１５％から５０％のアセトニトリルの直線濃度勾配をか
けた。その結果、第３図に示すような溶出曲線が得られ
た。試料注入後約２６分後のピーク画分を分離し２分離
した溶出液をエバボレーターで乾燥後、少量の水を加え
凍結乾燥し溶媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプ
チドを酸加水分解後、その５分の１をアミノ酸分析に用
いた。その結果、アスパラギン酸、スレオニン、セリン
、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリ
ン２メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、
フェニルアラニン、およびリジンがそれぞれ、１１．４
，１６．３，１１．０゜１Ｂ、２，５．８，１７．６，
１１．６，５．７゜５．７．Ｌｌ、７，１２．１，１１
．１，１１゜４、およτＴ巻１６．５ｎｍｏｌｅずつ検
出された。

致した。また、アミノ酸分析に用いた標品は、約５．７
μｍｏ　ｌ　ｅ　（約１９．７μｇ）のβ−エンドルフ
ィンを含んでいたことになる。この結果から、精製均一
化した融合タンパク質を用いて、アルギニルエンドペプ
チダーゼ処理した標品をＨＰＬＣを用いて分離すること
により収率的１９％てβ−エンドルフィンを回収できる
ことが明かとなった。融合タンパク質の精製の収率が約
４３％であり、融合タンパク質からのβ−エンドルフィ
ンの分離の収率が約１９％であることから、大腸菌がつ
くるβ−エンドルフィンの単離収率が約８％であると計
算される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＥＮＤＢ１５の全塩基配列を示した図であ
り、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、５
°末端から３′末端の方向に記述している。図中符号は
、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、
Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示している。国中番号は
、ｐＥＮＤＢ１５に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａｌ切
断認識部位のうち制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩ切断部位に近
い方のＣ１ａｌ切断認識部位の、５’　−ＡＴＣＧＡＴ
−３’　、の最初の°′Ａパを１番として数えた番号を
示している。第２図は、ｐＥＮＤＢ１！５中に存在する融合タンパク
質を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミ
ノ酸配列を示す図である。国中符号は、核酸塩基および
アミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇ
はグアニンを、Ｔはチミンを、Ａｌａはアラニンを、Ａ
ｒｇはアルギニ・ンを、Ａｓｎはアスパラギンを、Ａｓ
ｐはアスパラギン酸を、Ｃｙｓはシスティンを、Ｇｌｎ
はグルタミンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を、Ｇｌｙはグ
リシンを、）（ｉｓはヒスチジンを、Ｉｌｅはイソロイ
シンを＋　Ｌｅｕはロイシンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｍ
ｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニンを示している。図中番号は、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号
化するＡＴＧコドンのＡ　”を１番として数えた番号を
示している。第３図は、アルギニルエンドペプチダーゼ処理した融合
タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを示している
。横軸は試料注入後の時間を分単位で、縦軸は、２２０
ｎｍの吸光度を任意単位で表現している。矢印で示した
ピークがβ−エンドルフィンの溶出ピークである。

Claims

【特許請求の範囲】１、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸面
にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
ことができ、４７１８塩基対の大きさを有し、第１図に
おいて示されるＤＮＡ配列を有する新規組換えプラスミ
ドｐＥＮＤＢ１５。２、ｐＥＮＤＢ１５を含有する大腸菌。３、ｐＥＮＤＢ１５を含有する大腸菌が生産し、第２図
によって示されるアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還
元酵素−β−エンドルフィン融合タンパク質。４、ｐＥＮＤＢ１５を含有する大腸菌を培養し、ジヒド
ロ葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元酵素−
β−エンドルフィン融合タンパク質を、培養菌体の無細
胞抽出液から、メソトリキセート結合アフィニティカラ
ムクロマトグラフィー、および陰イオン交換カラムクロ
マトグラフィーを用いて精製することを特徴とするジヒ
ドロ葉酸還元酵素−β−エンドルフィン融合タンパク質
の分離精製方法。５、ｐＥＮＤＢ１５を含有する大腸菌の生産するジヒド
ロ葉酸還元酵素−β−エンドルフィン融合タンパク質を
分離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元酵素−β−エン
ドルフィン融合タンパク質をタンパク質分解酵素で消化
した後、β−エンドルフィンを分離精製することを特徴
とするβ−エンドルフィンの製造方法。