JPH02142481A - 新規組換えプラスミド、それを含む大腸菌、それを用いて得られるジヒドロ葉酸還元酵素及びその分離精製方法 - Google Patents
新規組換えプラスミド、それを含む大腸菌、それを用いて得られるジヒドロ葉酸還元酵素及びその分離精製方法Info
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- JPH02142481A JPH02142481A JP29551988A JP29551988A JPH02142481A JP H02142481 A JPH02142481 A JP H02142481A JP 29551988 A JP29551988 A JP 29551988A JP 29551988 A JP29551988 A JP 29551988A JP H02142481 A JPH02142481 A JP H02142481A
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素(以下、 DHFRと
略す)が2分子つながったタンパク質(以下、DHFR
ダイマーと称する)およびその生産を可能とする新規組
換えブラスミ)” p D D M 1に関するもので
ある。
略す)が2分子つながったタンパク質(以下、DHFR
ダイマーと称する)およびその生産を可能とする新規組
換えブラスミ)” p D D M 1に関するもので
ある。
本発明の新規組換えプラスミドpDDM1は。
第1図において示されるDNA配列を有する。DHFR
ダイマーは、第2図において示されるアミノ酸配列を有
する。pDDMl、pDDMlを含有する大腸菌、およ
び“DHFRダイマーは1発酵工業、医薬品工業等の分
野に好適である。
ダイマーは、第2図において示されるアミノ酸配列を有
する。pDDMl、pDDMlを含有する大腸菌、およ
び“DHFRダイマーは1発酵工業、医薬品工業等の分
野に好適である。
[従来の技術および問題点コ
大腸菌が生産するDHPRは、アミノ酸159個よりな
る一木のポリペプチド鎖中に一つの酵素活性単位を有す
るモノメリックな酵素である。すでに9本発明者らは9
組換えDNA技術を駆使した大腸菌のD HF Rの大
量発現および生産方法を確立している(特許 昭59−
135889.特開 昭(32−69990,特許 昭
62−302152)。本発明のDHPRダイマーは、
上記モノメリックなりHPRと異なり、−本のポリペプ
チド鎖中に2つの酵素活性単位を有するまったく新規な
タンパク質てあり2本発明が完成するまでには知られて
いなかった物質である。またDHFRダイマーを暗号化
するプラスミドpDDM1も同様に新規なMi換えプラ
スミドである。
る一木のポリペプチド鎖中に一つの酵素活性単位を有す
るモノメリックな酵素である。すでに9本発明者らは9
組換えDNA技術を駆使した大腸菌のD HF Rの大
量発現および生産方法を確立している(特許 昭59−
135889.特開 昭(32−69990,特許 昭
62−302152)。本発明のDHPRダイマーは、
上記モノメリックなりHPRと異なり、−本のポリペプ
チド鎖中に2つの酵素活性単位を有するまったく新規な
タンパク質てあり2本発明が完成するまでには知られて
いなかった物質である。またDHFRダイマーを暗号化
するプラスミドpDDM1も同様に新規なMi換えプラ
スミドである。
本発明のDHFRダイマーを開発するための基礎となる
技術としては9本発明者が発明した融合タンパク質の作
製方法がある(特願 昭62−302153)。
技術としては9本発明者が発明した融合タンパク質の作
製方法がある(特願 昭62−302153)。
[発明の目的コ
本発明のD HF Rダイマーは、−本のポリペプチド
鎖中にDHFR酵素活性を発現する2つの酵素活性単位
を有するタンパク質であり5本発明がなされるまではま
ったく未知の物質であった。
鎖中にDHFR酵素活性を発現する2つの酵素活性単位
を有するタンパク質であり5本発明がなされるまではま
ったく未知の物質であった。
本発明者らは、新規なタンパク質であるDHFRダイマ
ーの作製を目的に鋭意研究した結果2本発明者が開発し
た融合タンパク質の作製方法を利用して、DHPR遺伝
子を結合することによりDHFRを2分子結合すること
を考案し、それに基つき組換えプラスミドp D D
M 1の作製およびpDDMIの大腸菌での発現を行い
、pDDMlを有する大腸菌′か・)のDHFRダイマ
ーの分宿精製に成功し本発明を完成させるに至った。
ーの作製を目的に鋭意研究した結果2本発明者が開発し
た融合タンパク質の作製方法を利用して、DHPR遺伝
子を結合することによりDHFRを2分子結合すること
を考案し、それに基つき組換えプラスミドp D D
M 1の作製およびpDDMIの大腸菌での発現を行い
、pDDMlを有する大腸菌′か・)のDHFRダイマ
ーの分宿精製に成功し本発明を完成させるに至った。
[発明の構成コ
本発明は、(1)新規組換えプラスミドpDDMl、(
2)pDDMIを含有する大腸菌、(3)pDDMlが
暗号化する新規な酵素タンパク質であるDHPRダイマ
ー、および(4) pDDMIを含有する大腸菌からの
DHFRダイマーの分離精製方法から構成される。
2)pDDMIを含有する大腸菌、(3)pDDMlが
暗号化する新規な酵素タンパク質であるDHPRダイマ
ー、および(4) pDDMIを含有する大腸菌からの
DHFRダイマーの分離精製方法から構成される。
(1)新規組換えプラスミドpr’lDM]第1図は9
本発明のpDDMlの全塩基配列を示している。図は、
2本鎖環状DNAのうち片方のDNA鎖配列配列を、プ
ラスミド中に2箇所存在する制限酵素CIaI部位のう
ち制限酵素H1ndm部位に近い方の切断認識部位、
5’−ATCGAT−3°、の最初の”A“′を1番と
して数えて、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。本発明のpDDMI:、t、新規な組換えプラスミ
ドである。pI)DMIは、5779塩基対の大きさで
あり、宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピ
シリン耐性を付与することができる。pDDMlは。
本発明のpDDMlの全塩基配列を示している。図は、
2本鎖環状DNAのうち片方のDNA鎖配列配列を、プ
ラスミド中に2箇所存在する制限酵素CIaI部位のう
ち制限酵素H1ndm部位に近い方の切断認識部位、
5’−ATCGAT−3°、の最初の”A“′を1番と
して数えて、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。本発明のpDDMI:、t、新規な組換えプラスミ
ドである。pI)DMIは、5779塩基対の大きさで
あり、宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピ
シリン耐性を付与することができる。pDDMlは。
実施例において示すように、すてに本発明者らが作製し
ているpTP64−1(時開 昭62−69990に記
載。)の制限酵素BglIrとBc11部位の間に、す
てに本発明者らが開発しているpTP70−1 (特願
昭61−312836)の制限酵素Bgln切断によ
って得られる約500塩基対のDNA断片を挿入するこ
とによって作製することができる。しかしながら、−旦
配列が明らかにされた絽換えプラスミドの作製方法とし
ては2種々の方法が可能であり、従って2組換えプラス
ミドの作製方法によって本発明が制限されるものではな
い。
ているpTP64−1(時開 昭62−69990に記
載。)の制限酵素BglIrとBc11部位の間に、す
てに本発明者らが開発しているpTP70−1 (特願
昭61−312836)の制限酵素Bgln切断によ
って得られる約500塩基対のDNA断片を挿入するこ
とによって作製することができる。しかしながら、−旦
配列が明らかにされた絽換えプラスミドの作製方法とし
ては2種々の方法が可能であり、従って2組換えプラス
ミドの作製方法によって本発明が制限されるものではな
い。
DHFRダイマーを暗号化する配列は、第1図の57番
目から1013@目までの配列である。
目から1013@目までの配列である。
D HF Rダイマーを暗号化する配列の上流には。
遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する(時開
昭62−69990)。即ち、43番目から50番目
までの配列がSD配列と呼ばれるもので、効率の良い翻
訳に、また、5737@目から5765e目までが、コ
ンセンサス転写プロモーターであり、効率の良い転写に
貢献する。このことから、pDDへ41は、大腸菌に導
入された場合、多量のDHFRダイマーを作らせること
ができる。作られたDHFRダイマーは、菌体内に可溶
性の状態で、菌体タンパク質の約20%程度蓄積する。
昭62−69990)。即ち、43番目から50番目
までの配列がSD配列と呼ばれるもので、効率の良い翻
訳に、また、5737@目から5765e目までが、コ
ンセンサス転写プロモーターであり、効率の良い転写に
貢献する。このことから、pDDへ41は、大腸菌に導
入された場合、多量のDHFRダイマーを作らせること
ができる。作られたDHFRダイマーは、菌体内に可溶
性の状態で、菌体タンパク質の約20%程度蓄積する。
このことによって、pDDMlを含有する大腸菌はトリ
メトプリム耐性を示すようになる。
メトプリム耐性を示すようになる。
また、pDDMlは、J)TP64−1由来の、アンピ
シリン耐性遺伝子を有している。このことから、pDD
Mlが導入された大腸菌は、アンピシリン耐性をも示す
。pDDMlは、大腸菌に導入されて安定状態に保たれ
、I)DDへ11を含有する大腸菌は、微工研にFER
M BP−2150として寄託されている。
シリン耐性遺伝子を有している。このことから、pDD
Mlが導入された大腸菌は、アンピシリン耐性をも示す
。pDDMlは、大腸菌に導入されて安定状態に保たれ
、I)DDへ11を含有する大腸菌は、微工研にFER
M BP−2150として寄託されている。
(2)9DDM1を含有する大腸菌
pDDM1を含有する大腸菌は、トリメトプリム及びア
ンピシリンに対して耐性を示す。pDDMlを含有する
大腸菌は、DHPRダイマー遺伝子の効率のよい発現の
結果、DHPRダイマーを菌体内に可溶性の状態で大量
に蓄積する。pDDき41を含有する大腸菌をYT+A
p培地(培地11中に、5gのNaCl、8gのトリプ
トン、5gのイーストエキス、及び50mgのアンピシ
リンナトリウムを含む液体培地)を用いて、37℃で定
常期まで培養した場合、蓄積するDHFRダイマー!i
、M体タンパク質の約20%に達する。
ンピシリンに対して耐性を示す。pDDMlを含有する
大腸菌は、DHPRダイマー遺伝子の効率のよい発現の
結果、DHPRダイマーを菌体内に可溶性の状態で大量
に蓄積する。pDDき41を含有する大腸菌をYT+A
p培地(培地11中に、5gのNaCl、8gのトリプ
トン、5gのイーストエキス、及び50mgのアンピシ
リンナトリウムを含む液体培地)を用いて、37℃で定
常期まで培養した場合、蓄積するDHFRダイマー!i
、M体タンパク質の約20%に達する。
培養菌体を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液に懸濁し
、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、これ
を遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合、全ての
DHFRダイマーは上清中に回収される。pDDMlを
含有する大腸菌は、微工研にFERM BP−215
0として寄託されている。
、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、これ
を遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合、全ての
DHFRダイマーは上清中に回収される。pDDMlを
含有する大腸菌は、微工研にFERM BP−215
0として寄託されている。
(3)DHFRダイマー
第2図は、 DHFRダイマーを暗号化する部分のD
NA配列とそれから作られるタンパク質のアミノ酸配列
を示している。DHFRダイマーは。
NA配列とそれから作られるタンパク質のアミノ酸配列
を示している。DHFRダイマーは。
319アミノ酸よりなる新規なタンパク質である。
DHFRダイマーの分子量は、それぞれ36,116で
ある。DHFRダイマーは、まったく新規なタンパク質
である。DHFRダイマーは、pTP70−1由来のD
HFR(第2図の1番目から162番目までのアミノ酸
配列)と、pTP64−1由来のDHFRからN末端の
メチオニンが取り除かれたタンパク質(第2図の163
番目から319番目までのアミノ酸配列)とが、2分子
直列に結合した構造である。このような構造にもかかわ
らず、DHFRダイマーは、DHFR酵素活性を有する
。DHPRダイマーの1分子当りの酵素活性は、DHF
Rの1分子当りの活性の2倍である。また、ダイマー1
分子当り、阻害剤であるメソトリキセートが2分子量合
したときにDHFRダイマーが完全に阻害される。この
ように9本発明のDHFRダイマーは、−本のポリペプ
チド鎖中にDHFR酵素活性を発現する2つの酵素活性
単位を有するタンパク質である。
ある。DHFRダイマーは、まったく新規なタンパク質
である。DHFRダイマーは、pTP70−1由来のD
HFR(第2図の1番目から162番目までのアミノ酸
配列)と、pTP64−1由来のDHFRからN末端の
メチオニンが取り除かれたタンパク質(第2図の163
番目から319番目までのアミノ酸配列)とが、2分子
直列に結合した構造である。このような構造にもかかわ
らず、DHFRダイマーは、DHFR酵素活性を有する
。DHPRダイマーの1分子当りの酵素活性は、DHF
Rの1分子当りの活性の2倍である。また、ダイマー1
分子当り、阻害剤であるメソトリキセートが2分子量合
したときにDHFRダイマーが完全に阻害される。この
ように9本発明のDHFRダイマーは、−本のポリペプ
チド鎖中にDHFR酵素活性を発現する2つの酵素活性
単位を有するタンパク質である。
また、大腸菌がDHFRダイマーを多量につくると、D
HFRの阻害剤であり抗細菌剤であるトリメトプリムに
対して、耐性を示すようになる。
HFRの阻害剤であり抗細菌剤であるトリメトプリムに
対して、耐性を示すようになる。
(4)、 D li、PRダイマーの分離精製本発明の
融合タンパク質の分離精製法は、■菌体の培養、■菌体
の破砕、■DEAE−)ヨパール力ラムクロマトグラフ
ィー9■トヨパールHW55カラムクロマトグラフィー
、および■DEAE−)ヨバール力ラムクロマトグラフ
ィーの過程より成り立っている。
融合タンパク質の分離精製法は、■菌体の培養、■菌体
の破砕、■DEAE−)ヨパール力ラムクロマトグラフ
ィー9■トヨパールHW55カラムクロマトグラフィー
、および■DEAE−)ヨバール力ラムクロマトグラフ
ィーの過程より成り立っている。
■菌体の培養
pDDMlを含有する大腸菌の培養は、YT+Ap培地
(培地11中に 5gのNaC1,8gのトリプトン、
5gのイーストエキスおよび50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む液体培地、)で培養することができる。
(培地11中に 5gのNaC1,8gのトリプトン、
5gのイーストエキスおよび50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む液体培地、)で培養することができる。
培地としては、この他にST+Ap培地(培地11中に
、2gのグルコース、1gのリン酸2カリウム、5gの
ポリペプトン15gのイーストエキスおよび50mgの
アンピシリンナトリウムを含む液体培地。)など。
、2gのグルコース、1gのリン酸2カリウム、5gの
ポリペプトン15gのイーストエキスおよび50mgの
アンピシリンナトリウムを含む液体培地。)など。
菌体が成長する培地であれば、どの様な培地でも用いる
ことができるが、調べた限りでは、YT+Ap培地が最
適であった。
ことができるが、調べた限りでは、YT+Ap培地が最
適であった。
p D D M )乞含有する大腸菌を、培地に接種し
。
。
37℃で対数成長期の後間もしくは定常期まで培養する
。培養した菌体は、5.000回転/分の遠心分離によ
り集める。培地11より湿重量2から5gの菌体が得ら
れる。
。培養した菌体は、5.000回転/分の遠心分離によ
り集める。培地11より湿重量2から5gの菌体が得ら
れる。
集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
(0から10℃の間、4°Cが望ましい)で行う。
(0から10℃の間、4°Cが望ましい)で行う。
■菌体の破砕
培養して得られた菌体を、湿重量の2倍の緩衝1121
(0,1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム
(EDTA)を含む10mMリン酸カリウム緩衝tff
、pH7,0)に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体
を破砕する。菌体破砕液を、35゜000回転、1時間
超遠心分iuシ、上清を得る(無細胞抽出液)。
(0,1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム
(EDTA)を含む10mMリン酸カリウム緩衝tff
、pH7,0)に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体
を破砕する。菌体破砕液を、35゜000回転、1時間
超遠心分iuシ、上清を得る(無細胞抽出液)。
■DEAE−)ヨバール力ラムクロマトグラフィ無細胞
抽出液を、あらかじめ50mMのKCIを含む緩衝液1
で平衡化したDEAEトヨバールカラムにか′け、カラ
ム容量と同容量の50mMのKCIを含む緩衝液1てカ
ラムを洗う。酵素の溶出は、緩衝液1を用いて0.IM
から0.3MのKCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶
出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画
する。分画した溶出液についてD)(FR活性を測定し
、酵素活性が含まれる両分を集める。
抽出液を、あらかじめ50mMのKCIを含む緩衝液1
で平衡化したDEAEトヨバールカラムにか′け、カラ
ム容量と同容量の50mMのKCIを含む緩衝液1てカ
ラムを洗う。酵素の溶出は、緩衝液1を用いて0.IM
から0.3MのKCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶
出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画
する。分画した溶出液についてD)(FR活性を測定し
、酵素活性が含まれる両分を集める。
■トヨパールHW55カラムクロマトグラフィー上記の
操作により得られた酵素液を、限外濾過膜を用いて1〜
4mlにまで濃縮し、あらかじめ緩衝液lで平衡化した
トヨパールHW 55カラムにかけ、同緩衝液を用いて
酵素を溶出する。溶出液を一定量ずつフラクションコレ
クターを用いて分画する。分画した溶出液についてDH
PR活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。
操作により得られた酵素液を、限外濾過膜を用いて1〜
4mlにまで濃縮し、あらかじめ緩衝液lで平衡化した
トヨパールHW 55カラムにかけ、同緩衝液を用いて
酵素を溶出する。溶出液を一定量ずつフラクションコレ
クターを用いて分画する。分画した溶出液についてDH
PR活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。
■DEAE−)ヨバール力ラムクロマトグラフィ上記の
操作により得られた酵素液を、あらかしめ緩衝液1で平
衡化したDEAE−)ヨバール力ラムに吸着させる。吸
着後、50mMKClを含いて50mMから0.3Mの
KCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量ず
つフラクションコレクターを用いて分画する。分画した
溶出液について280nmの吸光度とDHFRHF上を
測定する。酵素活性/280nmの吸光度の値が。
操作により得られた酵素液を、あらかしめ緩衝液1で平
衡化したDEAE−)ヨバール力ラムに吸着させる。吸
着後、50mMKClを含いて50mMから0.3Mの
KCIの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量ず
つフラクションコレクターを用いて分画する。分画した
溶出液について280nmの吸光度とDHFRHF上を
測定する。酵素活性/280nmの吸光度の値が。
一定な両分を集める。
以上の操作により、融合タンパク質の高度精製均一化を
、再現性良く行うことができる。
、再現性良く行うことができる。
本発明に従うと、融合タンパク質の精製は、菌体の培養
を含めて一週間以内に行うことができ。
を含めて一週間以内に行うことができ。
回収率35%以上で、均一な酵素標品を得ることができ
る。
る。
DHFR酵素活性は9反応i& (0,05mMのジ
ヒドロ葉R,0,06mMのNADPH,12mMの2
−メルカプトエタノール、50mMのリンMltiン夜
(pH7,0))を、1mlのキュヘットとり、これ−
に酵素液を加え、340nmの吸光度の時間変化を測定
することにより行う。酵素1ユニツトは、上記反応条件
において、1分間に要な酵素量として定義する。このi
ll定は9分光光度計を用いて容易に行うことができる
。
ヒドロ葉R,0,06mMのNADPH,12mMの2
−メルカプトエタノール、50mMのリンMltiン夜
(pH7,0))を、1mlのキュヘットとり、これ−
に酵素液を加え、340nmの吸光度の時間変化を測定
することにより行う。酵素1ユニツトは、上記反応条件
において、1分間に要な酵素量として定義する。このi
ll定は9分光光度計を用いて容易に行うことができる
。
次に本発明の実施例を示す。
実施例1
pDDMlの作成
りHFRを2分子直列に結合したタンパク質を暗号化す
るDNA配列を作製するために、p’rp(34−1(
時開 昭82−69990に記載。)の制限酵素Bgl
n(第1図の12@巨から188番目に相当する配列)
とBc11部位(第1図の5388目から5438目に
相当する配列)の間に、pTP70−1 (特許 昭6
l−312836)の制限酵素BglII切断によって
得られる約500塩基対のDNA断片(第1図の14番
目から538番目の間の配列に相当する)を挿入するこ
とを考えた。
るDNA配列を作製するために、p’rp(34−1(
時開 昭82−69990に記載。)の制限酵素Bgl
n(第1図の12@巨から188番目に相当する配列)
とBc11部位(第1図の5388目から5438目に
相当する配列)の間に、pTP70−1 (特許 昭6
l−312836)の制限酵素BglII切断によって
得られる約500塩基対のDNA断片(第1図の14番
目から538番目の間の配列に相当する)を挿入するこ
とを考えた。
約1μgのpTP64−1を制限酵素Be1lターゼ処
理をした。アルカリホスファターゼ処理したDNAをフ
ェノール処理することにより、共存する酵素タンパク質
を変性除去し、その後エタノールでDNAを沈澱させた
。沈澱したDNAを70%エタノールで洗った後、エタ
ノールを除き。
理をした。アルカリホスファターゼ処理したDNAをフ
ェノール処理することにより、共存する酵素タンパク質
を変性除去し、その後エタノールでDNAを沈澱させた
。沈澱したDNAを70%エタノールで洗った後、エタ
ノールを除き。
減圧下に沈澱を乾燥させた。制限酵素によるDNAの切
断、アルカリホスファターゼ処理、フェノール処理、お
よびエタノール沈澱の各操作は、いずれも、”tlol
erular CloningA Loborator
y Manual”(T、Maniatis、 E、F
、Fr1tsch、 J、Sambrook、eds。
断、アルカリホスファターゼ処理、フェノール処理、お
よびエタノール沈澱の各操作は、いずれも、”tlol
erular CloningA Loborator
y Manual”(T、Maniatis、 E、F
、Fr1tsch、 J、Sambrook、eds。
Co1d Spring Harbor Labora
tory (1982)+以下。
tory (1982)+以下。
文献1と呼ぶ)に記載している方法に従って行った。約
1μgのpTP70−1を制限酵素Bgl■で切断した
後、フェノール処理することにより。
1μgのpTP70−1を制限酵素Bgl■で切断した
後、フェノール処理することにより。
共存する酵素タンパク質を変性除去し、その後エタノー
ルでDNAを沈澱させた。沈澱したDNAを70%エタ
ノールで洗った後、エタノールを除き、減圧下に沈澱を
乾燥させた。このように処理した2種類のDNAをそれ
ぞれ25μmのリガーゼff1Mジチオトレイトール、
5 mM ATP)に溶解し9両者を混ぜ合わせ、こ
れに1ユニツトの74−DNAリガーゼを加えて、10
’Cで、12時間DNAの連結反応を行わせた。この反
応物を、形質転換法(trans−formation
method、上記文献lに記載)に従って、大腸r
jIJH8101株に取り込ませた。
ルでDNAを沈澱させた。沈澱したDNAを70%エタ
ノールで洗った後、エタノールを除き、減圧下に沈澱を
乾燥させた。このように処理した2種類のDNAをそれ
ぞれ25μmのリガーゼff1Mジチオトレイトール、
5 mM ATP)に溶解し9両者を混ぜ合わせ、こ
れに1ユニツトの74−DNAリガーゼを加えて、10
’Cで、12時間DNAの連結反応を行わせた。この反
応物を、形質転換法(trans−formation
method、上記文献lに記載)に従って、大腸r
jIJH8101株に取り込ませた。
この処理をした菌体な、50mg/mlのアンピシリン
ナトリウムおよび10mg/mlのトリメトブリ1、を
含む栄養寒天培地(培地11中に、2gのグルコース、
1gのリン酸2カリウム+5gのイーストエキス、5g
のポリペプトン、15gの寒天を含む。)上に塗布し、
37@Cで24時間培養することにより、100個以上
のコロニーを得ることができた。これらのコロニーから
適当に40個選ひ、それぞれを1.5mlのYT+Ap
培地(培地11中に、5gのNaCI、5gのイースト
エキス、8gのトリプトン、50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む。)で、37℃。
ナトリウムおよび10mg/mlのトリメトブリ1、を
含む栄養寒天培地(培地11中に、2gのグルコース、
1gのリン酸2カリウム+5gのイーストエキス、5g
のポリペプトン、15gの寒天を含む。)上に塗布し、
37@Cで24時間培養することにより、100個以上
のコロニーを得ることができた。これらのコロニーから
適当に40個選ひ、それぞれを1.5mlのYT+Ap
培地(培地11中に、5gのNaCI、5gのイースト
エキス、8gのトリプトン、50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む。)で、37℃。
1晩、菌体を培養した。培養液を、各々エラペン0分間
遠心分難し、菌体な沈澱として集めた。これに、0.1
mlの電気泳動用サンプル調製液(0,0625MのT
ris−HcI、 p)! 6.8.2’Xのラウリル
硫酸ナトリウム(Sr)S) 、 10%(7)グリセ
リン、5X(7)2−メルカプトエタノール、 0.0
01χのブロムフェノールブルーを含む。)を加え、菌
体を懸濁し、これを沸騰水中に5分間保ち、菌体を溶か
した。この処理をしたサンプルを5DS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法(tJ、に、Laemmli;N
ature、vol、227゜p、680(+970)
)に従って分析した。標準サンプルとしてpTP64−
1およびpTP70−1をそれぞれ含有する大腸菌に同
様な処理をしたもの、および分子量マーカーとしてラク
トアルブミン(分子ff114,200) 、 )リ
ブシンインヒビター(分子量20.100) 、 )リ
ブシノーゲン(分子量24,000) 、カルボニック
アンヒドラーゼ(分子fi29,000) 、グリセロ
アルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(分子量36,
000) 、卵アルブミン(分子量45,000) 。
遠心分難し、菌体な沈澱として集めた。これに、0.1
mlの電気泳動用サンプル調製液(0,0625MのT
ris−HcI、 p)! 6.8.2’Xのラウリル
硫酸ナトリウム(Sr)S) 、 10%(7)グリセ
リン、5X(7)2−メルカプトエタノール、 0.0
01χのブロムフェノールブルーを含む。)を加え、菌
体を懸濁し、これを沸騰水中に5分間保ち、菌体を溶か
した。この処理をしたサンプルを5DS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法(tJ、に、Laemmli;N
ature、vol、227゜p、680(+970)
)に従って分析した。標準サンプルとしてpTP64−
1およびpTP70−1をそれぞれ含有する大腸菌に同
様な処理をしたもの、および分子量マーカーとしてラク
トアルブミン(分子ff114,200) 、 )リ
ブシンインヒビター(分子量20.100) 、 )リ
ブシノーゲン(分子量24,000) 、カルボニック
アンヒドラーゼ(分子fi29,000) 、グリセロ
アルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(分子量36,
000) 、卵アルブミン(分子量45,000) 。
および牛血清アルブミン(分子量66.000)を含む
0X濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、40個のうち
、2個のコロニーにおいては9分子量約37.000と
推定されるタンパク質を大量に生産することが明かとな
った。得られた2個のコロニーから適当に一株を選び、
これをYT+Ap培地で培養し、 TanakaとWe
isblumの方法(T、Tanaka、 B、Wei
s−blum:J、 Bacteriology、 v
ol、I21.p、354(1975))に従って、プ
ラスミドを調製した。得られたプラスミドをpDDMl
と名づけた。
0X濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、40個のうち
、2個のコロニーにおいては9分子量約37.000と
推定されるタンパク質を大量に生産することが明かとな
った。得られた2個のコロニーから適当に一株を選び、
これをYT+Ap培地で培養し、 TanakaとWe
isblumの方法(T、Tanaka、 B、Wei
s−blum:J、 Bacteriology、 v
ol、I21.p、354(1975))に従って、プ
ラスミドを調製した。得られたプラスミドをpDDMl
と名づけた。
pDDへ41は、pTP64−1にpTP70−1由来
の配列が挿入している構造をとるはずであるので、この
ことを確かめるために、第1図の49548目から49
59番目に位置するPst1部位から第1図の9515
1番目9568目に位置するEcoR1部位に至る。約
1.7キロ塩基対のDNA部分についてM13ファージ
を用いたジデオキシ法(J、Messing;Meht
ods in Enzymology。
の配列が挿入している構造をとるはずであるので、この
ことを確かめるために、第1図の49548目から49
59番目に位置するPst1部位から第1図の9515
1番目9568目に位置するEcoR1部位に至る。約
1.7キロ塩基対のDNA部分についてM13ファージ
を用いたジデオキシ法(J、Messing;Meht
ods in Enzymology。
vol 、+01.p、20(+983))に従って、
塩基配列を決定した。その結果、第1図に示す配列の4
954番目6番目までの配列が確かめられた。また、す
てに。
塩基配列を決定した。その結果、第1図に示す配列の4
954番目6番目までの配列が確かめられた。また、す
てに。
pTP64−1の全塩基配列は明かであり((時開 昭
62−69990に記載)、また、残りの部分は、制限
酵素AatII、PvulI、およびTaqlによる切
断実験の結果、pTP64−1を制限酵素EcoRIお
よびPstI切断によって得られる約4キロ塩基対のD
NA断片と全く同一であることが示された。
62−69990に記載)、また、残りの部分は、制限
酵素AatII、PvulI、およびTaqlによる切
断実験の結果、pTP64−1を制限酵素EcoRIお
よびPstI切断によって得られる約4キロ塩基対のD
NA断片と全く同一であることが示された。
以上の結果から、pDDMlの全塩基配列が第1図に示
した配列であることが決められた。
した配列であることが決められた。
実施例2
pDDMlを含有する大腸菌が作るDHFRダイマー
pDDMlを含有する大腸菌が作るDHFR融合タ融合
タンパクジノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予想する
ことができる。第1図の57番目から1013番目の配
列が融合タンパク質を暗号化していることから、トリブ
レット暗号表を用いて・アミノ酸配列を推定した・そ0
拮果第2東示すアミノ酸配列が得られ、DHFRダイマ
ーは。
タンパクジノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予想する
ことができる。第1図の57番目から1013番目の配
列が融合タンパク質を暗号化していることから、トリブ
レット暗号表を用いて・アミノ酸配列を推定した・そ0
拮果第2東示すアミノ酸配列が得られ、DHFRダイマ
ーは。
319個のアミノ酸よりなり9分子量が36.l16ダ
ルトンであった。
ルトンであった。
pDDへ11を含有する大腸菌から、DHFRダイマー
を分離精製し、タンパク質の性質を調べた。
を分離精製し、タンパク質の性質を調べた。
[DHFRダイマーの精製]
A、用いた菌体量:湿重ffi 10gB、酵素精製
表 表における精製過程は■無細胞抽出液、■DEAE−)
ヨバール力うム力うムクロマトグラフィー■トヨパール
)(W55カラムクロマトグラフィーおよび■DEAE
−)ヨパール力ラムクロマトグラフィーを表す。
表 表における精製過程は■無細胞抽出液、■DEAE−)
ヨバール力うム力うムクロマトグラフィー■トヨパール
)(W55カラムクロマトグラフィーおよび■DEAE
−)ヨパール力ラムクロマトグラフィーを表す。
精製 酵素液 回収タンパ 回収酵素 収率過程 の員
(ml)り質(mg) 活性(]ニット)(2)■
33 661 8.841
+00■ 30 129 6,
777 76.7■ 28 85
3,190 35.7得られた酵素タンパク
質をSDS電気泳動法(上記実施例に記載の方法)によ
り分析したところ。
(ml)り質(mg) 活性(]ニット)(2)■
33 661 8.841
+00■ 30 129 6,
777 76.7■ 28 85
3,190 35.7得られた酵素タンパク
質をSDS電気泳動法(上記実施例に記載の方法)によ
り分析したところ。
分子盟約37 、000の単一なタンパク質バントが示
され、得られた酵素標品が均一であることが示された。
され、得られた酵素標品が均一であることが示された。
[分離精製したD HF Rダイマーの性質コ精製した
DHFRダイマーの活性およびその際に用いた酵素のの
タンパク質濃度をそれぞれ測定し、タンパク質1mg当
りの活性(比活性)を求めたところ、35.2ユニット
/mgタンパク質の1石であった。同様にして、野生型
のDHFR(pTP64−1を含有する大腸菌がつくる
DHFR)の比活性を求めたところ、34.8ユニット
/mgタンパク質の値であり、DHFRダイマーと野生
型DHFRの酵素活性の比活性は同じ値を示した。DH
FRダイマーの分子量は、野生型DHFRの分子量の約
2倍であることから、この結野生型DHFHの2倍であ
ることを示している。
DHFRダイマーの活性およびその際に用いた酵素のの
タンパク質濃度をそれぞれ測定し、タンパク質1mg当
りの活性(比活性)を求めたところ、35.2ユニット
/mgタンパク質の1石であった。同様にして、野生型
のDHFR(pTP64−1を含有する大腸菌がつくる
DHFR)の比活性を求めたところ、34.8ユニット
/mgタンパク質の値であり、DHFRダイマーと野生
型DHFRの酵素活性の比活性は同じ値を示した。DH
FRダイマーの分子量は、野生型DHFRの分子量の約
2倍であることから、この結野生型DHFHの2倍であ
ることを示している。
また、DHFRダイマー0.74μMおよび野生型DH
FR1,02μMの酵素に、DHFHの阻害剤であるメ
ソトリキセートを種々の濃度加えて酵素活性に及ぼす影
響を調べたところ、それぞれDHFRダイマーでは、0
.145μMのメソトリキセートおよび野生型DHFR
では1.19μN1のメソトリキセートによって完全に
阻害されることが明かとなった。この結果はDHFRダ
イマー1分子に2分子のメソトリキセートが、また野生
型DHFR1分子に1分子のメソトリキセートが結合す
ることを示している。以上の結果により。
FR1,02μMの酵素に、DHFHの阻害剤であるメ
ソトリキセートを種々の濃度加えて酵素活性に及ぼす影
響を調べたところ、それぞれDHFRダイマーでは、0
.145μMのメソトリキセートおよび野生型DHFR
では1.19μN1のメソトリキセートによって完全に
阻害されることが明かとなった。この結果はDHFRダ
イマー1分子に2分子のメソトリキセートが、また野生
型DHFR1分子に1分子のメソトリキセートが結合す
ることを示している。以上の結果により。
DHFRダイマーは、−本のポリペプチド鎖中ζこDH
FR酵素活性を発現する2つの酵素活性単位を有するタ
ンパク質であることが示された。
FR酵素活性を発現する2つの酵素活性単位を有するタ
ンパク質であることが示された。
[発明の効果]
上記のように、新規組換えブラスミF’ I) D D
Mlは、 j7i現な酵素タンパク質であるDHFR
ダイマーを暗号化しており、かつpDDMlを有するる
。さらに、生成したDHFRダイマー−本のボノペプチ
ト鎖中に2個の酵素活性単位を有し、新規なりHFR酵
素タンパク質である。このような。
Mlは、 j7i現な酵素タンパク質であるDHFR
ダイマーを暗号化しており、かつpDDMlを有するる
。さらに、生成したDHFRダイマー−本のボノペプチ
ト鎖中に2個の酵素活性単位を有し、新規なりHFR酵
素タンパク質である。このような。
物質は本発明がなされるまでは、存在しなかったもので
あり、これからの用途開発が期待される。
あり、これからの用途開発が期待される。
また、DHFRは9葉酸補酵素合成のための重要な酵素
であり、また、この酵素活性を用いることにより、ジヒ
ドロ葉酸、テトラヒドロ¥酸の定量化も可能であり、少
なくともこのような分野での利用に貢献することは明か
である。
であり、また、この酵素活性を用いることにより、ジヒ
ドロ葉酸、テトラヒドロ¥酸の定量化も可能であり、少
なくともこのような分野での利用に貢献することは明か
である。
第1図は、pDDMlの全塩基配列を示した図であり、
2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列配列を、5′末
端から3′末端の方向に記述している。図中符号は、核
酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、Gは
グアニンを、Tはチミンを示している。図中番号は、p
DDMlに唯一存在する制限酵素C1al切断認識部位
、5′て数えた番号を示している。 第2図は、pDDMl中に存在するDHFRダイマーを
暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸
配列を示す図である。図中符号は。 核酸塩基およびアミノ酸を表し、Aはアデニンを。 Cはシトシンを、Gはグアニンを、Tはチミンな。 Alaはアラニンを、Argはアルギニンを、Asnは
アスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cysは
システィンを、Glnはグルタミンを、GIIJはグル
タミン酸を、cryはグリシンを、Hisはヒスチジン
を、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシンを、L
ysはリジンを。 Metはメチオニンを、Pheはフェニルアラニンを、
Proはプロリンを、Setはセリンを。 Thrはトレオニンを、Trpはトリプトファンを、T
yrはチロシンを、Valはバリンを示している。図中
番号は、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化す
るATGコドンの”A”を1番として数えた番号を示し
ている。 第1図の1 ACTGCTGCTG CAAAACGTCT GCG
ACCTGAG CAACAACATG AATGGT
CTTC2960297029802990300GG
GTTrCCGTG TTTCGTAAAG TCTG
GAAACG CGGAAGTCAG CGCCCTG
CAC第1図の2 第1図の3 αχKiAGCAGA CAAGCCCGTCAGGG
CGCGTCAGCGGGTGrT Gfχ℃α’;T
GTCGGGGCGCAGCCATGACCCAG T
CACGTAGCG ATAGCGGAGT GTAT
ACTα℃nムACTATGCGGCATCAGAG
CAGATTGTACTGAGAGTGCA CCAT
ATGCGGTGTGAAA丁ACCGCACAGAT
G CGTAAGGAGA AAATACCGCA
TCAGGCGCTCrrccαゴTCCTCGCTC
ACTG ACTCGCTGCG CrCIATCGT
T CGGCTGCGGC0AGCGGTATCAGC
rCACTCA AAGGCGGTAA TACGGT
TATCCACAGAATCA3810 38
20 3830 3840、
3850GGGGATAACG CAGGAAAGAA
CATGTGAGCA Al11Aαχ:CAGCA
AAAαffAGGAACCGTAAA AAGGCC
GCGT TGCTαmriゴCCATAGG CTC
CGCCCCCCTGACGAGCA TCACAAA
AAT CGACGCTCAA GTCAGAGGTG
GCGAAACCCGACAGGACTAT AAA
GATACCA GGCGrTTCCCCCrGGAA
GCr CAχゴCGTα℃ACrAmGTr ATA
ATGTATr CATAAGCTT第1図の6
2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列配列を、5′末
端から3′末端の方向に記述している。図中符号は、核
酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、Gは
グアニンを、Tはチミンを示している。図中番号は、p
DDMlに唯一存在する制限酵素C1al切断認識部位
、5′て数えた番号を示している。 第2図は、pDDMl中に存在するDHFRダイマーを
暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸
配列を示す図である。図中符号は。 核酸塩基およびアミノ酸を表し、Aはアデニンを。 Cはシトシンを、Gはグアニンを、Tはチミンな。 Alaはアラニンを、Argはアルギニンを、Asnは
アスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cysは
システィンを、Glnはグルタミンを、GIIJはグル
タミン酸を、cryはグリシンを、Hisはヒスチジン
を、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシンを、L
ysはリジンを。 Metはメチオニンを、Pheはフェニルアラニンを、
Proはプロリンを、Setはセリンを。 Thrはトレオニンを、Trpはトリプトファンを、T
yrはチロシンを、Valはバリンを示している。図中
番号は、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化す
るATGコドンの”A”を1番として数えた番号を示し
ている。 第1図の1 ACTGCTGCTG CAAAACGTCT GCG
ACCTGAG CAACAACATG AATGGT
CTTC2960297029802990300GG
GTTrCCGTG TTTCGTAAAG TCTG
GAAACG CGGAAGTCAG CGCCCTG
CAC第1図の2 第1図の3 αχKiAGCAGA CAAGCCCGTCAGGG
CGCGTCAGCGGGTGrT Gfχ℃α’;T
GTCGGGGCGCAGCCATGACCCAG T
CACGTAGCG ATAGCGGAGT GTAT
ACTα℃nムACTATGCGGCATCAGAG
CAGATTGTACTGAGAGTGCA CCAT
ATGCGGTGTGAAA丁ACCGCACAGAT
G CGTAAGGAGA AAATACCGCA
TCAGGCGCTCrrccαゴTCCTCGCTC
ACTG ACTCGCTGCG CrCIATCGT
T CGGCTGCGGC0AGCGGTATCAGC
rCACTCA AAGGCGGTAA TACGGT
TATCCACAGAATCA3810 38
20 3830 3840、
3850GGGGATAACG CAGGAAAGAA
CATGTGAGCA Al11Aαχ:CAGCA
AAAαffAGGAACCGTAAA AAGGCC
GCGT TGCTαmriゴCCATAGG CTC
CGCCCCCCTGACGAGCA TCACAAA
AAT CGACGCTCAA GTCAGAGGTG
GCGAAACCCGACAGGACTAT AAA
GATACCA GGCGrTTCCCCCrGGAA
GCr CAχゴCGTα℃ACrAmGTr ATA
ATGTATr CATAAGCTT第1図の6
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、第1図において示されるDNA配列を有する新規組
換えプラスミドpDDM1。 2、特許請求範囲第1項記載の新規組換えプラスミドp
DDM1を含有する大腸面。 3、第2図において示されるアミノ酸配列を有するジヒ
ドロ葉酸還元酵素。 4、特許請求範囲第3項記載のジヒドロ葉酸還元酵素の
分離精製方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP29551988A JPH02142481A (ja) | 1988-11-22 | 1988-11-22 | 新規組換えプラスミド、それを含む大腸菌、それを用いて得られるジヒドロ葉酸還元酵素及びその分離精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP29551988A JPH02142481A (ja) | 1988-11-22 | 1988-11-22 | 新規組換えプラスミド、それを含む大腸菌、それを用いて得られるジヒドロ葉酸還元酵素及びその分離精製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02142481A true JPH02142481A (ja) | 1990-05-31 |
JPH0364114B2 JPH0364114B2 (ja) | 1991-10-03 |
Family
ID=17821672
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP29551988A Granted JPH02142481A (ja) | 1988-11-22 | 1988-11-22 | 新規組換えプラスミド、それを含む大腸菌、それを用いて得られるジヒドロ葉酸還元酵素及びその分離精製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02142481A (ja) |
-
1988
- 1988-11-22 JP JP29551988A patent/JPH02142481A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0364114B2 (ja) | 1991-10-03 |
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