JPH01252290A - ロイシンエンケファリン - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は2モルヒネ様鎮痛作用を示すペプチドであるロ
イシンエンケファリン(チロシン(Tyr)−グリシン
(G l y)−グリシン(G l y)−フェニルア
ラニン(P h e)−ロイシン(L e u)の5個
のアミノ酸配列よりなるペプチド、以下。
イシンエンケファリン(チロシン(Tyr)−グリシン
(G l y)−グリシン(G l y)−フェニルア
ラニン(P h e)−ロイシン(L e u)の5個
のアミノ酸配列よりなるペプチド、以下。
LEKと略す。)を含む融合タンパク質を大量に生産可
能とする新規組換えプラスミドpLEK1゜pLEKl
を含有する大腸菌、LEKを酵素のカルボキシ末端側に
有するジヒドロ葉酸還元酵素−LEK融合タンパク質(
以下、DHFR−LEK・ と略す。)、DHFR−
LEKの分離精製方法。
能とする新規組換えプラスミドpLEK1゜pLEKl
を含有する大腸菌、LEKを酵素のカルボキシ末端側に
有するジヒドロ葉酸還元酵素−LEK融合タンパク質(
以下、DHFR−LEK・ と略す。)、DHFR−
LEKの分離精製方法。
およびLEKの製造方法に関するものである。本発明の
新規組換えプラスミドpLEK1は、第1図において示
されるDNA配列を有する。本発明は2発酵工業、医薬
品工業等の分野に好適である。
新規組換えプラスミドpLEK1は、第1図において示
されるDNA配列を有する。本発明は2発酵工業、医薬
品工業等の分野に好適である。
従来の技術
LEKは2モルヒネ様鎮痛作用を示す内因性ペプチドと
して知られ、習慣性のない鎮痛剤または麻酔薬としての
利用が期待される興味深い生理活性ペプチドである。
して知られ、習慣性のない鎮痛剤または麻酔薬としての
利用が期待される興味深い生理活性ペプチドである。
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。遺伝子操作を利用した効率のよいLEKの製造
方法としては2本発明者らが開発した枯草菌のジヒドロ
葉酸還元酵素(以下、 DHFRと略す。)遺伝子を利
用する方法(特願 開方法は、枯草菌由来のDHFR遺
伝子の大腸菌での発現効率を高め、DHFR遺伝子中の
EcoRI切断部位に化学合成LEK遺伝子を導入し、
枯草菌由来のDHFR(以下、DHFRb−と略す。)
のカルボキシ末端側にLEKが融合した融合タンパク質
として、大腸菌に生産させ(特願 昭61−23400
3.6l−249260)、 融合タンパク質を分離
精製した後、カルボキシ末端側のLEKを特異的に切断
し、高速液体クロマドグフィー(以下、HPLCと略す
。)を用いて分離精製することを骨子とする方法である
。この方法の問題点は、大腸菌て作られるDHFRb9
−LEKの菌体内蓄積量が、菌体タンパク質のせいぜい
数パーセントであり、生産効率上改善すべき点があるこ
とである。
がある。遺伝子操作を利用した効率のよいLEKの製造
方法としては2本発明者らが開発した枯草菌のジヒドロ
葉酸還元酵素(以下、 DHFRと略す。)遺伝子を利
用する方法(特願 開方法は、枯草菌由来のDHFR遺
伝子の大腸菌での発現効率を高め、DHFR遺伝子中の
EcoRI切断部位に化学合成LEK遺伝子を導入し、
枯草菌由来のDHFR(以下、DHFRb−と略す。)
のカルボキシ末端側にLEKが融合した融合タンパク質
として、大腸菌に生産させ(特願 昭61−23400
3.6l−249260)、 融合タンパク質を分離
精製した後、カルボキシ末端側のLEKを特異的に切断
し、高速液体クロマドグフィー(以下、HPLCと略す
。)を用いて分離精製することを骨子とする方法である
。この方法の問題点は、大腸菌て作られるDHFRb9
−LEKの菌体内蓄積量が、菌体タンパク質のせいぜい
数パーセントであり、生産効率上改善すべき点があるこ
とである。
一方、既に1本発明者らは、大胆菌由来のDHFR遺伝
子に関しては、その遺伝子の改変の結果。
子に関しては、その遺伝子の改変の結果。
異種遺伝子発現用プラスミドベクターpTP70−1(
特願 昭6l−312836)及びpTP104−4(
特願 昭62−302157)と。
特願 昭6l−312836)及びpTP104−4(
特願 昭62−302157)と。
それら発現ベクターを利用した融合遺伝子の作成方法(
特願 昭62−302153)を開発している。これら
の方法を利用した場合、融合遺伝子の発現の結果得られ
る融合タンパク質の大腸菌菌体の蓄積量は、全菌体タン
パク質の約20%が期待される。しかしながら、LEK
の生産に上記発現ベクターを用いた例はない。
特願 昭62−302153)を開発している。これら
の方法を利用した場合、融合遺伝子の発現の結果得られ
る融合タンパク質の大腸菌菌体の蓄積量は、全菌体タン
パク質の約20%が期待される。しかしながら、LEK
の生産に上記発現ベクターを用いた例はない。
発明の目的
本発明の目的は、生産効率の面で問題のあったDHFR
b5遺伝子を用いたLEKの生産方法を改善し、遺伝子
操作を利用した効率のよいLEKの生産方法を開発する
ことにある。
b5遺伝子を用いたLEKの生産方法を改善し、遺伝子
操作を利用した効率のよいLEKの生産方法を開発する
ことにある。
既に2本発明者らは(1)大腸菌のDHFRのカルボキ
シ末端側の配列を変化させても、枯草菌のDHFRと同
様に酵素活性が失われないこと。
シ末端側の配列を変化させても、枯草菌のDHFRと同
様に酵素活性が失われないこと。
(2)大腸菌のDHFRのカルボキシ末端側に異種ペプ
チドを融合させることを可能とするプラスP104上の
改変DHFR遺伝子は大腸菌で効率良く発現すること、
を明らかにしている。
チドを融合させることを可能とするプラスP104上の
改変DHFR遺伝子は大腸菌で効率良く発現すること、
を明らかにしている。
本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究の結果、
pTP104−4を用いて、LEK遺伝子をDHFRと
融合させて発現することにより。
pTP104−4を用いて、LEK遺伝子をDHFRと
融合させて発現することにより。
効率のよいDHFR−LEKの生産を行うことができる
ことを明らかにし、その結果に従フて2本発明を完成さ
せた。
ことを明らかにし、その結果に従フて2本発明を完成さ
せた。
発明の構成
本発明は、 (1)DHFR−LEKの大量発現を可
能にする新規組換えプラスミドpLEK1゜(2)pL
EKlを含有する大腸菌菌体、 (3)pLEKlを含
有する大腸菌が生産するDHFR−LEK、 (4)
pLEKlを含有する大腸菌からのD HF R−L
EK分離精製、および(5)DHFR−LEKを用いた
LEKの製造方法、の発明により構成される。
能にする新規組換えプラスミドpLEK1゜(2)pL
EKlを含有する大腸菌菌体、 (3)pLEKlを含
有する大腸菌が生産するDHFR−LEK、 (4)
pLEKlを含有する大腸菌からのD HF R−L
EK分離精製、および(5)DHFR−LEKを用いた
LEKの製造方法、の発明により構成される。
(1)新規組換えプラスミドpLEK1第1図は2本発
明のpLEKlの全塩基配列を示している。図は、2本
鎖環状DNAのうち片方のDNA鎖配列だけを、プラス
ミド中に唯一存在する制限酵素C1alの切断認識部位
、 5’−ATCGAT−3’ 、の最初の”A”を1
番として数えて、5′末端から3′末端の方向に記述し
ている。本発明のpLEKIは、新規な組換えプラスミ
ドである。pLEKlは、4207塩基対の大きさであ
り、宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシ
リン耐性を付与することができる。pLEKlは。
明のpLEKlの全塩基配列を示している。図は、2本
鎖環状DNAのうち片方のDNA鎖配列だけを、プラス
ミド中に唯一存在する制限酵素C1alの切断認識部位
、 5’−ATCGAT−3’ 、の最初の”A”を1
番として数えて、5′末端から3′末端の方向に記述し
ている。本発明のpLEKIは、新規な組換えプラスミ
ドである。pLEKlは、4207塩基対の大きさであ
り、宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシ
リン耐性を付与することができる。pLEKlは。
pTP104”−4のBamHI及び5alI切断によ
って得られる大きい方の4173塩基対のDNA断片と
、LEKを暗号化する配列を含む34塩基対の化学合成
りNAが結合した構造をしていてる。第1図において、
533番目から566番目迄の配列が化学合成りNA由
来の配列てあ。それ以外の配列がpTP104−4由来
の配列である。
って得られる大きい方の4173塩基対のDNA断片と
、LEKを暗号化する配列を含む34塩基対の化学合成
りNAが結合した構造をしていてる。第1図において、
533番目から566番目迄の配列が化学合成りNA由
来の配列てあ。それ以外の配列がpTP104−4由来
の配列である。
60番目から565番目までの配列)、を含ませである
。pTP104−4由来の部分には、MluI部位が存
在しない。pLEKlのBamH1部位(第1図の53
2番目から537番目までの配列)からM l u I
部位までの配列を他の配列に置き換えることにより、方
向を定めて異種DNAの導入を行い、DHFR遺伝子と
の融合遺伝子を容易に作成することができる。
。pTP104−4由来の部分には、MluI部位が存
在しない。pLEKlのBamH1部位(第1図の53
2番目から537番目までの配列)からM l u I
部位までの配列を他の配列に置き換えることにより、方
向を定めて異種DNAの導入を行い、DHFR遺伝子と
の融合遺伝子を容易に作成することができる。
第1図の57番目から557番目まで配列は。
DHFRのカルボキシ末端側にLEKがメチオニンを介
して結合したDHFR−LEKを暗号化している。
して結合したDHFR−LEKを暗号化している。
DHFR−LEKを暗号化する配列の上流には。
DHFR−LEK遺伝子の発現を効率良く行わせる配列
が存在する(特願 昭6l−312836)。即ち、4
3番目から50番目までの配列がSD配列と呼ばれるも
ので、効率の良い翻訳に、また。
が存在する(特願 昭6l−312836)。即ち、4
3番目から50番目までの配列がSD配列と呼ばれるも
ので、効率の良い翻訳に、また。
4165165番目193193番目、コンセンサス転
写プロモーターであり、効率の良い転写に貢献する。こ
のことから、pLEKlは、大腸菌に導入された場合、
多量のDHFR−LEKを作る。作られたDHFR−L
EKは、菌体内に可溶性の状態で、菌体タンパク質の約
20%程度蓄積する。このことによって、pLEKlを
有する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。
写プロモーターであり、効率の良い転写に貢献する。こ
のことから、pLEKlは、大腸菌に導入された場合、
多量のDHFR−LEKを作る。作られたDHFR−L
EKは、菌体内に可溶性の状態で、菌体タンパク質の約
20%程度蓄積する。このことによって、pLEKlを
有する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。
また、pLEKlは、pTP104−4由来の、アンピ
シリンに対して耐性を付与する遺伝子を有している。こ
のことから、pLEKlが導入された大腸菌は、アンピ
シリン耐性をも示す。pLEKlは、大腸菌に導入され
て安定状態に保たれ、pLEKlを含有する大腸菌は、
微工研にFERM弗p−1818&IrT?r□ゎ、い
う。
シリンに対して耐性を付与する遺伝子を有している。こ
のことから、pLEKlが導入された大腸菌は、アンピ
シリン耐性をも示す。pLEKlは、大腸菌に導入され
て安定状態に保たれ、pLEKlを含有する大腸菌は、
微工研にFERM弗p−1818&IrT?r□ゎ、い
う。
このような特長を有するpLEKlは、実施例1に従っ
て作成することができるが2組換えプラスミドの作成方
法によって本発明が制限されるものではない。
て作成することができるが2組換えプラスミドの作成方
法によって本発明が制限されるものではない。
(2)pLEKlを含有する大腸菌
に1を含有する大腸菌は、pLEK上のDHFR−LE
K遺伝子の効率のよい発現の結果、DHFR−LEKを
菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積する。pLEKlを
含有する大腸菌をYT+Ap培地(培地11中に、5g
のNaC1,8gのトリプトン、5gのイーストエキス
、及び50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体培
地)を用いて、37℃で定常朋まで培養した場合、蓄積
するDHFR−LEKは、菌体タンパク質の約20%に
達する。培養面体を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液
に懸濁し、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕
し、これを遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合
、はとんど全てのDHFR−LEKは上清中に回収され
る。pLEKlを含有する大腸菌は、微工研にFERM
BP−1818として寄託されている。
K遺伝子の効率のよい発現の結果、DHFR−LEKを
菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積する。pLEKlを
含有する大腸菌をYT+Ap培地(培地11中に、5g
のNaC1,8gのトリプトン、5gのイーストエキス
、及び50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体培
地)を用いて、37℃で定常朋まで培養した場合、蓄積
するDHFR−LEKは、菌体タンパク質の約20%に
達する。培養面体を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液
に懸濁し、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕
し、これを遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合
、はとんど全てのDHFR−LEKは上清中に回収され
る。pLEKlを含有する大腸菌は、微工研にFERM
BP−1818として寄託されている。
(3)DHFR−LEK
第2図は、 DHFR−LEKを暗号化する部分のD
NA配列とそれから作られると予想されるタンパク質の
アミノ酸配列を示している。DHFR−LEKは、16
7アミノ酸よりなる新規なタンパク質である。アミノ末
端側から数えて、1から159番目までの配列が、大腸
菌の野生型I)HFRに1箇所アミノ酸置換置換か起こ
った(Cys−152(wild type) →Gl
u−152)配列であり、162番目から167番目ま
でかLEKの配列である。LEKの配列の直前のアミノ
酸はメチオニン(Met)である。このことにより、D
HFR−LEKをブロムシアン処理することにより、L
EKを特異的に切り出すことができる。160番目のイ
ソロイシン(lle)と161番目のアルギニン(Ar
g)は+ p’rP 104−4のBamHI部位に
LEKを暗号化するDNAを導入する際に、遺伝暗号の
読み取り枠を合わせるために生した配列である。pTP
104−4が作るDHFRは、162個のアミノ酸より
なり、第2図のD HF R−L E Kのアミノ酸6
0番目まテ串配列に、 Gln−11eの2個のアミノ
酸1−ノ 配列が結介゛びた配列をしている。DHFR−LEKの
分子量は、18,963である。
NA配列とそれから作られると予想されるタンパク質の
アミノ酸配列を示している。DHFR−LEKは、16
7アミノ酸よりなる新規なタンパク質である。アミノ末
端側から数えて、1から159番目までの配列が、大腸
菌の野生型I)HFRに1箇所アミノ酸置換置換か起こ
った(Cys−152(wild type) →Gl
u−152)配列であり、162番目から167番目ま
でかLEKの配列である。LEKの配列の直前のアミノ
酸はメチオニン(Met)である。このことにより、D
HFR−LEKをブロムシアン処理することにより、L
EKを特異的に切り出すことができる。160番目のイ
ソロイシン(lle)と161番目のアルギニン(Ar
g)は+ p’rP 104−4のBamHI部位に
LEKを暗号化するDNAを導入する際に、遺伝暗号の
読み取り枠を合わせるために生した配列である。pTP
104−4が作るDHFRは、162個のアミノ酸より
なり、第2図のD HF R−L E Kのアミノ酸6
0番目まテ串配列に、 Gln−11eの2個のアミノ
酸1−ノ 配列が結介゛びた配列をしている。DHFR−LEKの
分子量は、18,963である。
DHFR−LEKは、DHFRのカルボキシ末端側に、
LEKが融合した構造をしているにもかかわらず、DH
FR酵素活性を有する。このため。
LEKが融合した構造をしているにもかかわらず、DH
FR酵素活性を有する。このため。
大腸菌がDHFR−LEKを多量につくると、DHFR
の阻害剤であり、抗細菌剤であるトリメトプリムに対し
て、耐性を示すようになる。
の阻害剤であり、抗細菌剤であるトリメトプリムに対し
て、耐性を示すようになる。
(4)DHFR−LEKの分離精製
本発明のDHFR−LEKの分離精製法は、■面体の培
養、■菌体の破砕、■DEAE−)ヨパール力うム処理
、■メソトリキセート(MTX)結合アフィニティクロ
マトグラフィー、および■DEAE−)ヨバール力ラム
クロマトグラフィーの過程より成り立っている。
養、■菌体の破砕、■DEAE−)ヨパール力うム処理
、■メソトリキセート(MTX)結合アフィニティクロ
マトグラフィー、および■DEAE−)ヨバール力ラム
クロマトグラフィーの過程より成り立っている。
■菌体の培養
pLEKlを含有する大腸菌の培養は、YT+Ap培地
(培地ll中に、5gのNaC1,8gのトリプトン+
5gのイーストエキスおよび50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む液体培地。)で培養することができる。
(培地ll中に、5gのNaC1,8gのトリプトン+
5gのイーストエキスおよび50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む液体培地。)で培養することができる。
培地としては、この他にST+Ap培地(培地11中に
、2gのグルコース+1gのリン酸2カリウム、5gの
ポリペプトン、5gのイーストエキスおよび50mgの
アンピシリンナトリウムを含む液体培地。)など。
、2gのグルコース+1gのリン酸2カリウム、5gの
ポリペプトン、5gのイーストエキスおよび50mgの
アンピシリンナトリウムを含む液体培地。)など。
菌体が成長する培地であれば、どの様な培地でも用いる
ことができるが、調べた限りでは、DHFR−LEKの
生産にはYT+Ap培地が最適であった。
ことができるが、調べた限りでは、DHFR−LEKの
生産にはYT+Ap培地が最適であった。
pLEKIを含有する大腸菌を、培地に接種し。
37°Cて対数成長期の後期もしくは定常期まで培養す
る。培養温度により菌体中のDHFR−LEKの蓄積量
が変動し、調べた限りでは、培養温度が高いほど蓄積量
が大であった。培養した菌体は。
る。培養温度により菌体中のDHFR−LEKの蓄積量
が変動し、調べた限りでは、培養温度が高いほど蓄積量
が大であった。培養した菌体は。
5.000回転/分の遠心分離により集める。培地11
より湿重量2から4gの菌体が得られる。
より湿重量2から4gの菌体が得られる。
集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
(0から10°Cの間、4℃が望ましい)で行う。
(0から10°Cの間、4℃が望ましい)で行う。
■菌体の破砕−
培養して得られた菌体を、湿重量の3倍の緩衝液1 (
0,1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム(E
DTA)を含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH7
,0)に懸濁いフレンチフルスを用いて菌体を破砕する
。菌体破砕液を5,000回転、10分間遠心分離い上
清を得る。さらに、上清を、35,000回転、1時間
超遠心分離し、上清を得る(無細胞抽出液)。
0,1mM エチレンジアミン4酢酸ナトリウム(E
DTA)を含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH7
,0)に懸濁いフレンチフルスを用いて菌体を破砕する
。菌体破砕液を5,000回転、10分間遠心分離い上
清を得る。さらに、上清を、35,000回転、1時間
超遠心分離し、上清を得る(無細胞抽出液)。
■DEAE−)ヨパール力ラム処理
この操作は2次の精製過程の前処理の目的で行う。無細
胞抽出液を、あらかじめ0.1MのKClを含む緩衝液
1て平衡化したDEAE)ヨパール力ラムにかけ、O,
IMのKCIを含む緩衝液1てカラムを洗う。酵素の溶
出は、0.3MのKClを含む緩衝液1を用いて行う。
胞抽出液を、あらかじめ0.1MのKClを含む緩衝液
1て平衡化したDEAE)ヨパール力ラムにかけ、O,
IMのKCIを含む緩衝液1てカラムを洗う。酵素の溶
出は、0.3MのKClを含む緩衝液1を用いて行う。
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する。
画する。
分画した溶出液についてDHFR活性を測定し。
酵素活性が含まれる画分を集める。
■MTX結合アフィニティクロマトグラフィー上記の操
作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝液1て平衡
化したMTX結合5epharOseアフィニティカラ
ムに吸着させる。吸着後、IMのKClを含む緩衝液2
(0,1mM EDTAを含む10mMリン酸カリ
ウム緩衝液、pH8,5)で洗う。洗いは、カラムから
の溶出液の280nmの吸光度を測定し、吸光度が0.
1以下になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は
、IMのKCIと3mMの葉酸を含む緩衝液2を用いて
行い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用
いて分画する。分画した溶出液についてDHFR活性を
測定し、酵素活性が含まれる両分を集める。得られた酵
素液を、緩衝液1に対して。
作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝液1て平衡
化したMTX結合5epharOseアフィニティカラ
ムに吸着させる。吸着後、IMのKClを含む緩衝液2
(0,1mM EDTAを含む10mMリン酸カリ
ウム緩衝液、pH8,5)で洗う。洗いは、カラムから
の溶出液の280nmの吸光度を測定し、吸光度が0.
1以下になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は
、IMのKCIと3mMの葉酸を含む緩衝液2を用いて
行い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用
いて分画する。分画した溶出液についてDHFR活性を
測定し、酵素活性が含まれる両分を集める。得られた酵
素液を、緩衝液1に対して。
3回透析する。この段階で、純度90%以上のDHFR
−LEKが得られる。
−LEKが得られる。
■DEAE−)ヨパール力ラムクロマトグラフィ透析し
た酵素液を、あらかじめ緩衝液1て平衡化したDEAE
−)ヨバール力ラムに吸着させる。
た酵素液を、あらかじめ緩衝液1て平衡化したDEAE
−)ヨバール力ラムに吸着させる。
度を測定し、吸光度が0.01以下になるまで同緩衝液
を流し続ける。酵素の溶出は、緩衝液1を用いて0.1
Mから0.3MのKCIの直線濃度局配を用いて行い、
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する。分画した溶出液について280nmの吸光度と
DHFR活性を測定する。酵素活性/ 280 n m
の吸光度の値が。
を流し続ける。酵素の溶出は、緩衝液1を用いて0.1
Mから0.3MのKCIの直線濃度局配を用いて行い、
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する。分画した溶出液について280nmの吸光度と
DHFR活性を測定する。酵素活性/ 280 n m
の吸光度の値が。
一定な画分を集める。
以上の操作により、DHFR−LEKの高度精製均一化
を、再現性良く行うことができる。
を、再現性良く行うことができる。
本発明に従うと、DHFR−LEKの精製は。
培養を含めて一週間以内に行うことができ2回収率50
%以上で、均一な酵素標品を得ることができる。
%以上で、均一な酵素標品を得ることができる。
DHFR酵素活性は2反応液 (0,05mMのジヒド
ロ葉酸、0.06mMのNADPH,12mMの2−メ
ルカプトエタノール、50mMのリン酸緩衝液(pH7
,0))を、1m1(7)キュへットとり、これに酵素
液を加え、340nmの吸光度の時間変化を測定するこ
とにより行う。 酵素1ユニツトは、上記反応条件にお
いて、1分間に1マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元す
るのに必要な酵素量として定義する。この測定は2分光
光度計を用いて容易に行うことができる。
ロ葉酸、0.06mMのNADPH,12mMの2−メ
ルカプトエタノール、50mMのリン酸緩衝液(pH7
,0))を、1m1(7)キュへットとり、これに酵素
液を加え、340nmの吸光度の時間変化を測定するこ
とにより行う。 酵素1ユニツトは、上記反応条件にお
いて、1分間に1マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元す
るのに必要な酵素量として定義する。この測定は2分光
光度計を用いて容易に行うことができる。
(5)DHFR−LEKを用いたLEKの製造精製した
DHFR−LEKを凍結乾燥し、これに1から10mg
タンパク質/m質量なるように70%蟻酸を加え、溶か
した後、タンパク質量の約20倍量の結晶ブロムシアン
を加え密栓し、窒素雰囲気下、室温で攪拌しながら24
時間反応させる。反応液を10倍の水で希釈した後、凍
結乾燥し過剰の試薬を除く。乾燥試料を1から10mg
タンパク質/m質量なるように30%酢酸に溶かず。溶
かした試料をHPLC装置(品性LC−4A 、 i
nerts i 1−ODSカラム)を用いて、0.1
%トリフルオロ酢酸中、15%から50%のアセトニト
リルの濃度勾配を用いて溶出・分離することがで=16
− は、ブロムシアン処理したDHFR−LEK試料の高速
液体クロマトグラムを示している。試料注入後17分の
ピークがLEKである。このピーク画分を分離する。分
離した溶出液をエバボレーターで乾燥後、少量の水を加
え凍結乾燥し溶媒を除き、LEKを得ることができる。
DHFR−LEKを凍結乾燥し、これに1から10mg
タンパク質/m質量なるように70%蟻酸を加え、溶か
した後、タンパク質量の約20倍量の結晶ブロムシアン
を加え密栓し、窒素雰囲気下、室温で攪拌しながら24
時間反応させる。反応液を10倍の水で希釈した後、凍
結乾燥し過剰の試薬を除く。乾燥試料を1から10mg
タンパク質/m質量なるように30%酢酸に溶かず。溶
かした試料をHPLC装置(品性LC−4A 、 i
nerts i 1−ODSカラム)を用いて、0.1
%トリフルオロ酢酸中、15%から50%のアセトニト
リルの濃度勾配を用いて溶出・分離することがで=16
− は、ブロムシアン処理したDHFR−LEK試料の高速
液体クロマトグラムを示している。試料注入後17分の
ピークがLEKである。このピーク画分を分離する。分
離した溶出液をエバボレーターで乾燥後、少量の水を加
え凍結乾燥し溶媒を除き、LEKを得ることができる。
また、得られたペプチドを酸加水分解後、アミノ酸分析
することによりアミノ酸組成を確かめることができる。
することによりアミノ酸組成を確かめることができる。
本発明の実施例においては、31の培地から湿重量的8
gの面体が得られ、この菌体(計算上。
gの面体が得られ、この菌体(計算上。
約87.3mgのDHFR−LEK、約2.6mgのL
EKを含む。)から、約43 m gのDHFR−LE
K (、収率、50.6%、計算上線1.26mgのL
EKを含む。)を精製して得ることができ、10mgの
DHFR−LEKをブロムシアン分解後、HPLCて分
離・精製することにより。
EKを含む。)から、約43 m gのDHFR−LE
K (、収率、50.6%、計算上線1.26mgのL
EKを含む。)を精製して得ることができ、10mgの
DHFR−LEKをブロムシアン分解後、HPLCて分
離・精製することにより。
約0.16mgのLEKを得ることができた。
次に本発明の実施例および参考例を示す。
実施例1
pLEKlの作成
LEKを暗号化するDNAとしては。
1、5’−GATCCGTATGTACGGTGGTT
TCCTGTAACGCGTG−3’2、 5’−TC
GACACGCGTTACAGGAAACCACCGT
ACATACG−3’の2本の34ヌクレオチドからな
るDNAをホスホアミダイト法に従って化学合成し、精
製後、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、各DNAの
59末端をリン酸化した。リン酸化したDNAを約0゜
1ml (約0.0111gのDNAを含んでいる。
TCCTGTAACGCGTG−3’2、 5’−TC
GACACGCGTTACAGGAAACCACCGT
ACATACG−3’の2本の34ヌクレオチドからな
るDNAをホスホアミダイト法に従って化学合成し、精
製後、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、各DNAの
59末端をリン酸化した。リン酸化したDNAを約0゜
1ml (約0.0111gのDNAを含んでいる。
)ずつ取り、これを60°Cでインキュベートすること
によって両DNAをアニールさせた(これをDNAIと
呼ぶ)。
によって両DNAをアニールさせた(これをDNAIと
呼ぶ)。
約1μgのpTp 104−4を、BamHI及び5a
lIて切断した後、アルカリホスファターゼ処理をした
。アルカリホスファターゼ処理したDNAをフェノール
処理することにより、共存する酵素タンパク質を変性除
去し、その後エタノ−圧下に沈澱を乾燥させた。Bam
HI及びSal■によるDNAの切断、アルカリホスフ
ァターゼ処理、フェノール処理、およびエタノール沈澱
の各操作は、いずれも、”Mo1ecular Clo
ning A Loboratory Manual”
(T、Maniatis、 E、F、Fr1tsch
、J。
lIて切断した後、アルカリホスファターゼ処理をした
。アルカリホスファターゼ処理したDNAをフェノール
処理することにより、共存する酵素タンパク質を変性除
去し、その後エタノ−圧下に沈澱を乾燥させた。Bam
HI及びSal■によるDNAの切断、アルカリホスフ
ァターゼ処理、フェノール処理、およびエタノール沈澱
の各操作は、いずれも、”Mo1ecular Clo
ning A Loboratory Manual”
(T、Maniatis、 E、F、Fr1tsch
、J。
Sambrook、eds、 Co1d Spring
Harbor Laboratory(1982)、
以下2文献1と呼ぶ。)に記載している方法に従って行
った。乾燥させたDNAを50μlのリガーゼ用反応液
(10mM Tris−HCI、pH7,4゜5 mM
MgCl2.10mMジチオトレイトール、5 mM
ATP)に溶解後、5μlのDNAIを加え、これに
1ユニツトのT4−DNAリガーゼを加えて、10°C
て、14時間DNAの連結反応を行わせた。この反応物
を、形質転換法(transformation me
thod、上記文献1に記載)に従って、大腸菌に取り
込ませた。
Harbor Laboratory(1982)、
以下2文献1と呼ぶ。)に記載している方法に従って行
った。乾燥させたDNAを50μlのリガーゼ用反応液
(10mM Tris−HCI、pH7,4゜5 mM
MgCl2.10mMジチオトレイトール、5 mM
ATP)に溶解後、5μlのDNAIを加え、これに
1ユニツトのT4−DNAリガーゼを加えて、10°C
て、14時間DNAの連結反応を行わせた。この反応物
を、形質転換法(transformation me
thod、上記文献1に記載)に従って、大腸菌に取り
込ませた。
この処理をした菌体な、50mg/mlのアンピシリン
ナトリウムおよび10mg/mlのトリメトプリムを含
む栄養寒天培地(培地II中に、2gのグルコース、1
gのリン酸2カリウム、5gのイーストエキス、5gの
ポリペプトン、15gの寒天を含む。)上に塗布し、3
7°Cて24時間培養することにより、約15個のコロ
ニーを得ることができた。これらのコロニーから適当に
8個選び、1.5mlのYT十Ap培地(培地11中に
、5gのNaC1,5gのイーストエキス。
ナトリウムおよび10mg/mlのトリメトプリムを含
む栄養寒天培地(培地II中に、2gのグルコース、1
gのリン酸2カリウム、5gのイーストエキス、5gの
ポリペプトン、15gの寒天を含む。)上に塗布し、3
7°Cて24時間培養することにより、約15個のコロ
ニーを得ることができた。これらのコロニーから適当に
8個選び、1.5mlのYT十Ap培地(培地11中に
、5gのNaC1,5gのイーストエキス。
8gのトリプトン、50mgのアンピシリンナトリウム
を含む。)で、37°C,1晩、菌体を培養した。培養
液を、各々エッペンドルフ遠心管にとり、12,000
回転/分で10分間遠心分離い菌体を沈澱として集めた
。これに、O,1mlの電気泳動用サンプル調製液(0
,0625MのTris−HCI、 pH6,8,2χ
のラウリル硫酸ナトリウム(SDS)、10χのグリセ
リン、5χの2−メルカプトエタノール、 0.001
%のブロムフェノールブルーを含む。
を含む。)で、37°C,1晩、菌体を培養した。培養
液を、各々エッペンドルフ遠心管にとり、12,000
回転/分で10分間遠心分離い菌体を沈澱として集めた
。これに、O,1mlの電気泳動用サンプル調製液(0
,0625MのTris−HCI、 pH6,8,2χ
のラウリル硫酸ナトリウム(SDS)、10χのグリセ
リン、5χの2−メルカプトエタノール、 0.001
%のブロムフェノールブルーを含む。
)を加え、菌体な懸濁いこれを沸騰水中に5分間保ち、
菌体を溶かした。この処理をしたサンプルを5DS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法(U、に、Lamm1
i; Nature、 vol、227. p、680
(1970))におよび分子量マーカーとしてラクトア
ルブミン(分子ff114,200) 、 )リプシ
ンインヒビター(分子fi20,100) 、)リブシ
ノーゲン(分子量24,000) 。
菌体を溶かした。この処理をしたサンプルを5DS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法(U、に、Lamm1
i; Nature、 vol、227. p、680
(1970))におよび分子量マーカーとしてラクトア
ルブミン(分子ff114,200) 、 )リプシ
ンインヒビター(分子fi20,100) 、)リブシ
ノーゲン(分子量24,000) 。
カルボニックアンヒドラーゼ(分子量29,000)
。
。
グリセロアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(分子
量36,000) 、卵アルブミン(分子ji45,0
00)、および牛血清アルブミン(分子量66.000
)を含むサンプルをポリアクリルアミド濃度の10から
20%濃度勾配ゲルで泳動じた。その結果、8個のコロ
ニーのうち、7個ではpTP104−4のDHFRのバ
ンドが消失いそれより明らかに分子量が大きくなったタ
ンパク質(分子量約22,000と推定される。)を新
たに生産していること、残りの1個のコロニーは、pT
P104−4のDHFRとほぼ同じ大きさのタンパク質
を生産すること、pTP104−4のDHFR(分子量
18,379)は、この条件で分子量約21,000の
タンパク質として泳動することが明らかになった。分子
量の太きい新たなタンパク質を生産するコロニーのうち
から適当に一つ選び、これをYT+Ap培地で培養し、
TanakaとWeisblumの方法(T、Tan
aka、 B、Weis−blum; J、Bacte
riology、 vol、121.p、354(19
75))に従って、プラスミドを調製した。得られたプ
ラスミドをpLEKlと名づけた。pLEKlは、pT
P 104−4のBamHIと5aII部位の間の配列
が合成りNAと置き換わった構造をしているはずである
。合成りNAには、制限酵素M l u■で切断認識さ
れる配列、 5’−ACGCGT−3’、が含まれてい
るので、MluIでpLEKlの切断を試みたところ、
確かに切断された。また、pLEKlのEcoRI (
第1図の471−476番目の配列)とPvuIr (
第1図の1563−1568568番目)による切断に
よって得られる約1100ヌクレオチド長のDNAにつ
いて5M13フアージを用いたジデオキシ法(J、Me
ssing; Mehtods in Enzymol
ogy。
量36,000) 、卵アルブミン(分子ji45,0
00)、および牛血清アルブミン(分子量66.000
)を含むサンプルをポリアクリルアミド濃度の10から
20%濃度勾配ゲルで泳動じた。その結果、8個のコロ
ニーのうち、7個ではpTP104−4のDHFRのバ
ンドが消失いそれより明らかに分子量が大きくなったタ
ンパク質(分子量約22,000と推定される。)を新
たに生産していること、残りの1個のコロニーは、pT
P104−4のDHFRとほぼ同じ大きさのタンパク質
を生産すること、pTP104−4のDHFR(分子量
18,379)は、この条件で分子量約21,000の
タンパク質として泳動することが明らかになった。分子
量の太きい新たなタンパク質を生産するコロニーのうち
から適当に一つ選び、これをYT+Ap培地で培養し、
TanakaとWeisblumの方法(T、Tan
aka、 B、Weis−blum; J、Bacte
riology、 vol、121.p、354(19
75))に従って、プラスミドを調製した。得られたプ
ラスミドをpLEKlと名づけた。pLEKlは、pT
P 104−4のBamHIと5aII部位の間の配列
が合成りNAと置き換わった構造をしているはずである
。合成りNAには、制限酵素M l u■で切断認識さ
れる配列、 5’−ACGCGT−3’、が含まれてい
るので、MluIでpLEKlの切断を試みたところ、
確かに切断された。また、pLEKlのEcoRI (
第1図の471−476番目の配列)とPvuIr (
第1図の1563−1568568番目)による切断に
よって得られる約1100ヌクレオチド長のDNAにつ
いて5M13フアージを用いたジデオキシ法(J、Me
ssing; Mehtods in Enzymol
ogy。
vol、101.p、20(1983乃に従〕て、Ec
oRIからPvuI[の方向に塩基配列を決定した。そ
の結果。
oRIからPvuI[の方向に塩基配列を決定した。そ
の結果。
第1図に、示すpLEKlの全塩基配列の471番よっ
て明らかにされている(特願 昭62−302157)
。pLEKlのBamHI−3allの配列は、p’T
P104−4のBamHI−3aIIの間の294ヌク
レオチド長の配列が、 LEKを暗号化する配列として
設計・合成した34ヌクレオチド長の配列に置き換わっ
た配列であった。
て明らかにされている(特願 昭62−302157)
。pLEKlのBamHI−3allの配列は、p’T
P104−4のBamHI−3aIIの間の294ヌク
レオチド長の配列が、 LEKを暗号化する配列として
設計・合成した34ヌクレオチド長の配列に置き換わっ
た配列であった。
また、pLEKlのBamHI−5alI切断によって
得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、EcoRl、
Ps t I、Hindm、Hpal、Aa t n、
P v u n、 B g I U、およびC1a
Iを用いた制限酵素による切断実験の結果、pTP10
4−4のBamHl−5a l I切断によって得られ
る約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一であることが
示された。
得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、EcoRl、
Ps t I、Hindm、Hpal、Aa t n、
P v u n、 B g I U、およびC1a
Iを用いた制限酵素による切断実験の結果、pTP10
4−4のBamHl−5a l I切断によって得られ
る約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一であることが
示された。
以上の結果から、pLEKlの全塩基配列が第1図に示
した配列であることが決められた。
した配列であることが決められた。
実施例2
一23=
pLEKlを含有する大腸菌が作るDHFR−LEK
pLEKlを含有する大腸菌が作るDHFR−LEKの
アミノ酸配列は、DHFR−LEK遺伝子の塩基配列か
ら予恕することができる。第1図の57番目から557
番目の配列がDHFR−LEKを暗号化していることか
ら、トリプレット暗号表を用いて、アミノ酸配列を推定
した。その結果第2図に示すアミノ酸配列が得られた。
アミノ酸配列は、DHFR−LEK遺伝子の塩基配列か
ら予恕することができる。第1図の57番目から557
番目の配列がDHFR−LEKを暗号化していることか
ら、トリプレット暗号表を用いて、アミノ酸配列を推定
した。その結果第2図に示すアミノ酸配列が得られた。
pLEKlを含有する大腸菌から、DHFR−LEKを
分離精製し、精製したタンパク質を用いて、以下のよう
に確認した。
分離精製し、精製したタンパク質を用いて、以下のよう
に確認した。
DHFR−LEKの精製
A、用いた菌体量:湿重量 8g
B、酵素精製表(衷における精製過程は■無細胞抽出液
、■DEAE−)ヨバール力うム処理、■メソトリキセ
ート結合アフイニテイクロマトグラフィー、および■D
EAE−)ヨパールカラムク24一 過程 の量(ml)り質(mg) 活性(ユニット
)(2)■ 45 550 4.417
100■ 33 240 3,425
7?、5■ 56 58 2,864
64.8■ 28 43 2,23
6 50.6DHFR酵素活性は2反応液 (0,0
5mMのジヒドロ葉酸、0.06mMのNADPIi、
12mMの2−メルカプトエタノール、50mMのリン
酸緩衝液(pH7,0))を、1mlのキュベツトとり
、これに酵素液を加え、340nmの吸光度の時間変化
を測定することにより行った。
、■DEAE−)ヨバール力うム処理、■メソトリキセ
ート結合アフイニテイクロマトグラフィー、および■D
EAE−)ヨパールカラムク24一 過程 の量(ml)り質(mg) 活性(ユニット
)(2)■ 45 550 4.417
100■ 33 240 3,425
7?、5■ 56 58 2,864
64.8■ 28 43 2,23
6 50.6DHFR酵素活性は2反応液 (0,0
5mMのジヒドロ葉酸、0.06mMのNADPIi、
12mMの2−メルカプトエタノール、50mMのリン
酸緩衝液(pH7,0))を、1mlのキュベツトとり
、これに酵素液を加え、340nmの吸光度の時間変化
を測定することにより行った。
酵素1ユニツトは、上記反応条件において、1分間に1
マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素
量として定義した。
マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素
量として定義した。
得られた酵素タンパク質をSDS電気泳動法(上記実施
例に記載の方法)により分析したところ。
例に記載の方法)により分析したところ。
約22,000の単一なタンパク質バンドが示され、得
られた酵素標品が均一であることが示された。
られた酵素標品が均一であることが示された。
分離精製したDHFR−LEKの性質
精製したDHFR活性を示すタンパク質をエンザイムイ
ムノアッセイにより検討したところ、LEKに対する抗
体と反応することが示された。即ち、精製して得られた
タンパク質は免疫学的にLEKと同等の構造を有するこ
とが明らかとなった。
ムノアッセイにより検討したところ、LEKに対する抗
体と反応することが示された。即ち、精製して得られた
タンパク質は免疫学的にLEKと同等の構造を有するこ
とが明らかとなった。
精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端側のアミ
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼYを、精製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量したくカルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定法
)。その結果。
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼYを、精製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量したくカルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定法
)。その結果。
−Gly−Gly−Leu (カルボキシ末端)である
ことが予想された。また、精製して得られたタンパク質
を酸加水分解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配
列の結果予想されるアミノ酸組成と一致した結実施例3 精製分離したD HF R−L E KからのL E
Kの分離 実施例2て得られた精製タンパク質(約10mg、約5
30nmo 1 esのDHFR−LEK)を、凍結乾
燥し、これを2mlの70%蟻酸に溶かし、これに約2
00 m gのブロムシアンを加え溶かい窒素雰囲気下
、密栓した後、室温で24時間攪拌しながら反応させた
。反応後、20m1の水を加え、その後凍結乾燥した。
ことが予想された。また、精製して得られたタンパク質
を酸加水分解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配
列の結果予想されるアミノ酸組成と一致した結実施例3 精製分離したD HF R−L E KからのL E
Kの分離 実施例2て得られた精製タンパク質(約10mg、約5
30nmo 1 esのDHFR−LEK)を、凍結乾
燥し、これを2mlの70%蟻酸に溶かし、これに約2
00 m gのブロムシアンを加え溶かい窒素雰囲気下
、密栓した後、室温で24時間攪拌しながら反応させた
。反応後、20m1の水を加え、その後凍結乾燥した。
凍結乾燥して得られた標品な、10m1の30%酢酸に
溶かした。そのうちの、o、5ml (約26nmo
leのDHFR−LEKを含むはず)をとり、高速液体
クロマドグフィー装置(品性LC−4A)を用い1ne
rtsil−ODS 5μmカラムで分離した。溶出は
。
溶かした。そのうちの、o、5ml (約26nmo
leのDHFR−LEKを含むはず)をとり、高速液体
クロマドグフィー装置(品性LC−4A)を用い1ne
rtsil−ODS 5μmカラムで分離した。溶出は
。
0.1%トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾
配(15%から50%)をかけることにより行った。0
から2分までは、15%のアセニトリルを用い、2分か
ら32分までは、15%から50%のアセトニトリルの
直線濃度勾配をかけた。
配(15%から50%)をかけることにより行った。0
から2分までは、15%のアセニトリルを用い、2分か
ら32分までは、15%から50%のアセトニトリルの
直線濃度勾配をかけた。
その結果、第3図に示すような溶出曲線が得られた。試
料注入後17分のピーク画分を分離い分離した溶出液を
エバホレーターて乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶
媒を除き、ペプチドを得た。
料注入後17分のピーク画分を分離い分離した溶出液を
エバホレーターて乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶
媒を除き、ペプチドを得た。
得られたペプチドを酸加水分解後、その1/2の容をア
ミノ酸分析に用いた。その結果、チロシン。
ミノ酸分析に用いた。その結果、チロシン。
グリシン、フェニルアラニン、およびロイシンがそれぞ
れ、7.2,14.6,7.1および7゜6nmole
ずつ検出された。アミノ酸組成は。
れ、7.2,14.6,7.1および7゜6nmole
ずつ検出された。アミノ酸組成は。
LEKのそれと一致した値であり、また分析したヘプチ
トは、約7.4nmo I e (約4.1μg)のL
EKを含んていることが明かとなった。この結果を用い
ると、ブロムシアン処理して得られたサンプル0.5m
lをHPLCを用いて分離することにより、収率約57
%(7゜4x2nmole/26nmole)でLEK
を回収できること。
トは、約7.4nmo I e (約4.1μg)のL
EKを含んていることが明かとなった。この結果を用い
ると、ブロムシアン処理して得られたサンプル0.5m
lをHPLCを用いて分離することにより、収率約57
%(7゜4x2nmole/26nmole)でLEK
を回収できること。
またこの操作を20回繰り返すことにより、10mgの
DHFR−LEKから約164μg(4゜1x2μgx
20)のLEKが得られることが示される。
DHFR−LEKから約164μg(4゜1x2μgx
20)のLEKが得られることが示される。
また、 D HFR−L E Kの精製の収率が約50
%であり、DHFR−LEKからLEKの分離の収率が
約57%であることから、大腸菌がつくるLEKペプチ
ド部分の単離収率が、約29%程度であることが算出さ
れる。
%であり、DHFR−LEKからLEKの分離の収率が
約57%であることから、大腸菌がつくるLEKペプチ
ド部分の単離収率が、約29%程度であることが算出さ
れる。
発明の効果
上記のように、新規組換えプラスミドpLEK1は、D
HFR−LEKを暗号化しており、かつpLEKlを有
する大腸菌は、DHFR−’LEKを可溶性の状態で大
量に蓄積生産する。さらに。
HFR−LEKを暗号化しており、かつpLEKlを有
する大腸菌は、DHFR−’LEKを可溶性の状態で大
量に蓄積生産する。さらに。
生成したD HF R−L E Kは、DHFR酵素活
性を保持しており、精製を容易に行うことができる。
性を保持しており、精製を容易に行うことができる。
本発明の精製法に従うことにより、DHFR−LEKの
精製を迅速に効率よく行うことができる。
精製を迅速に効率よく行うことができる。
また、DHFR−LEKをブロムシアン処理後。
HPLCで分離することにより、LEKを容易に単離す
ることができる。このような性質を有することから1本
発明は、DHFR−LEKとそれを利用したL E K
の生産に有益である。
ることができる。このような性質を有することから1本
発明は、DHFR−LEKとそれを利用したL E K
の生産に有益である。
また、pLEKlには、MluI部位が新たに付は加え
られており、異種遺伝子の発現用ヘクターとして有用で
あると考えられる。
られており、異種遺伝子の発現用ヘクターとして有用で
あると考えられる。
第1図は、pLEKlの全塩基配列を示した図であり、
2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけを、5′末
端から3”末端の方向に記述している。図中符号は、核
酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、Gは
グアニンを、Tはチミンを示している。図中番号は、p
LEKlに1筒所存在する制限酵素C1al切断認識部
位、5’ −ATCGAT−3’ 、の最初の”A I
+を1番として数えた番号を示している。 第2図は、 pLEKl中に存在するDHFR−LE
Kを暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミ
ノ酸配列を示す図である。図中符号は。 核酸塩基およびアミノ酸を表し、Aはアデニンを。 Cはシトシンを、Gはグアニンを、Tはチミンを。 3l− Alaはアラニ、’;、副A r gはアルギニンを、
Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、
Cysはシスティンを、Ginはグルタミンを、Glu
はグルタミン酸を、ctyはグリシンを、Hisはヒス
チジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシン
を、Lysはリジンを。 Metはメチオニンを、Pheはフェニルアラニンを、
Proはプロリンを、Serはセリンを。 Thrはトレオニンを、Trpはトリプトファンを、T
yrはチロシンを、Valはバリンを示している。図中
番号は、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化す
るATGコドンの”A 11を1番として数えた番号を
示している。 第3図は、ブロムシアン処理したDHFR−LEK試料
の高速液体クロマトグラムを示している。 横軸は、試料注入後の時間を分単位で、縦軸は。 220nmの吸光度を任意単位で表現している。 矢印で示したピークがLEKの溶出ピークである。 =32− aa<aa Ol+ ah第 l
し TAAGCTT く の 6
2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけを、5′末
端から3”末端の方向に記述している。図中符号は、核
酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを、Gは
グアニンを、Tはチミンを示している。図中番号は、p
LEKlに1筒所存在する制限酵素C1al切断認識部
位、5’ −ATCGAT−3’ 、の最初の”A I
+を1番として数えた番号を示している。 第2図は、 pLEKl中に存在するDHFR−LE
Kを暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミ
ノ酸配列を示す図である。図中符号は。 核酸塩基およびアミノ酸を表し、Aはアデニンを。 Cはシトシンを、Gはグアニンを、Tはチミンを。 3l− Alaはアラニ、’;、副A r gはアルギニンを、
Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、
Cysはシスティンを、Ginはグルタミンを、Glu
はグルタミン酸を、ctyはグリシンを、Hisはヒス
チジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシン
を、Lysはリジンを。 Metはメチオニンを、Pheはフェニルアラニンを、
Proはプロリンを、Serはセリンを。 Thrはトレオニンを、Trpはトリプトファンを、T
yrはチロシンを、Valはバリンを示している。図中
番号は、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化す
るATGコドンの”A 11を1番として数えた番号を
示している。 第3図は、ブロムシアン処理したDHFR−LEK試料
の高速液体クロマトグラムを示している。 横軸は、試料注入後の時間を分単位で、縦軸は。 220nmの吸光度を任意単位で表現している。 矢印で示したピークがLEKの溶出ピークである。 =32− aa<aa Ol+ ah第 l
し TAAGCTT く の 6
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
ことができ、4207塩基対の大きさを有し、第1図に
おいて示されるDNA配列を有する新規組換えプラスミ
ドpLEK1。 2、pLEK1を含有する大腸菌。 3、pLEK1を含有する大腸菌が生産し、第2図によ
って示されるアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元酵
素−ロイシンエンケフアリン融合タンパク質。 4、pLEK1を含有する大腸菌を培養し、ジヒドロ葉
酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元酵素−ロイ
シンエンケファリン融合タンパク質を、培養菌体の無細
胞抽出液から、イオン交換カラム処理、メソトリキセー
ト結合アフィニティカラムクロマトグラフィー、および
陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製す
ることを特徴とするジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエ
ンケフアリン融合タンパク質の分離精製方法。 5、pLEK1を含有する大腸菌の生産するジヒドロ葉
酸還元酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパク質を
ブロムシアン分解法により分解した後、ロイシンエンケ
フアリンを分離精製することを特徴とするロイシンエン
ケフアリンの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63079681A JPH01252290A (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | ロイシンエンケファリン |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63079681A JPH01252290A (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | ロイシンエンケファリン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01252290A true JPH01252290A (ja) | 1989-10-06 |
JPH0355108B2 JPH0355108B2 (ja) | 1991-08-22 |
Family
ID=13696944
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63079681A Granted JPH01252290A (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | ロイシンエンケファリン |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01252290A (ja) |
-
1988
- 1988-03-31 JP JP63079681A patent/JPH01252290A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0355108B2 (ja) | 1991-08-22 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |