JPH01252290A - ロイシンエンケファリン - Google Patents

ロイシンエンケファリン

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JPH01252290A
JPH01252290A JP63079681A JP7968188A JPH01252290A JP H01252290 A JPH01252290 A JP H01252290A JP 63079681 A JP63079681 A JP 63079681A JP 7968188 A JP7968188 A JP 7968188A JP H01252290 A JPH01252290 A JP H01252290A
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Masahiro Iwakura
正寛 巖倉
Tomokuni Kokubu
国分　友邦
Kiyotaka Furusawa
古澤　清孝
Shinichi Ohashi
信一 大箸
Tsukasa Sakai
坂井　士
Yoshio Tanaka
芳雄 田中
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は２モルヒネ様鎮痛作用を示すペプチドであるロ
イシンエンケファリン（チロシン（Ｔｙｒ）−グリシン
（Ｇ　ｌ　ｙ）−グリシン（Ｇ　ｌ　ｙ）−フェニルア
ラニン（Ｐ　ｈ　ｅ）−ロイシン（Ｌ　ｅ　ｕ）の５個
のアミノ酸配列よりなるペプチド、以下。
ＬＥＫと略す。）を含む融合タンパク質を大量に生産可
能とする新規組換えプラスミドｐＬＥＫ１゜ｐＬＥＫｌ
を含有する大腸菌、ＬＥＫを酵素のカルボキシ末端側に
有するジヒドロ葉酸還元酵素−ＬＥＫ融合タンパク質（
以下、ＤＨＦＲ−ＬＥＫ・　　と略す。）、ＤＨＦＲ−
ＬＥＫの分離精製方法。
およびＬＥＫの製造方法に関するものである。本発明の
新規組換えプラスミドｐＬＥＫ１は、第１図において示
されるＤＮＡ配列を有する。本発明は２発酵工業、医薬
品工業等の分野に好適である。
従来の技術 ＬＥＫは２モルヒネ様鎮痛作用を示す内因性ペプチドと
して知られ、習慣性のない鎮痛剤または麻酔薬としての
利用が期待される興味深い生理活性ペプチドである。
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。遺伝子操作を利用した効率のよいＬＥＫの製造
方法としては２本発明者らが開発した枯草菌のジヒドロ
葉酸還元酵素（以下、　ＤＨＦＲと略す。）遺伝子を利
用する方法（特願　開方法は、枯草菌由来のＤＨＦＲ遺
伝子の大腸菌での発現効率を高め、ＤＨＦＲ遺伝子中の
ＥｃｏＲＩ切断部位に化学合成ＬＥＫ遺伝子を導入し、
枯草菌由来のＤＨＦＲ（以下、ＤＨＦＲｂ−と略す。）
のカルボキシ末端側にＬＥＫが融合した融合タンパク質
として、大腸菌に生産させ（特願　昭６１−２３４００
３．６ｌ−２４９２６０）、　　融合タンパク質を分離
精製した後、カルボキシ末端側のＬＥＫを特異的に切断
し、高速液体クロマドグフィー（以下、ＨＰＬＣと略す
。）を用いて分離精製することを骨子とする方法である
。この方法の問題点は、大腸菌て作られるＤＨＦＲｂ９
−ＬＥＫの菌体内蓄積量が、菌体タンパク質のせいぜい
数パーセントであり、生産効率上改善すべき点があるこ
とである。
一方、既に１本発明者らは、大胆菌由来のＤＨＦＲ遺伝
子に関しては、その遺伝子の改変の結果。
異種遺伝子発現用プラスミドベクターｐＴＰ７０−１（
特願　昭６ｌ−３１２８３６）及びｐＴＰ１０４−４（
特願　昭６２−３０２１５７）と。
それら発現ベクターを利用した融合遺伝子の作成方法（
特願　昭６２−３０２１５３）を開発している。これら
の方法を利用した場合、融合遺伝子の発現の結果得られ
る融合タンパク質の大腸菌菌体の蓄積量は、全菌体タン
パク質の約２０％が期待される。しかしながら、ＬＥＫ
の生産に上記発現ベクターを用いた例はない。
発明の目的 本発明の目的は、生産効率の面で問題のあったＤＨＦＲ
ｂ５遺伝子を用いたＬＥＫの生産方法を改善し、遺伝子
操作を利用した効率のよいＬＥＫの生産方法を開発する
ことにある。
既に２本発明者らは（１）大腸菌のＤＨＦＲのカルボキ
シ末端側の配列を変化させても、枯草菌のＤＨＦＲと同
様に酵素活性が失われないこと。
（２）大腸菌のＤＨＦＲのカルボキシ末端側に異種ペプ
チドを融合させることを可能とするプラスＰ１０４上の
改変ＤＨＦＲ遺伝子は大腸菌で効率良く発現すること、
を明らかにしている。
本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究の結果、
ｐＴＰ１０４−４を用いて、ＬＥＫ遺伝子をＤＨＦＲと
融合させて発現することにより。
効率のよいＤＨＦＲ−ＬＥＫの生産を行うことができる
ことを明らかにし、その結果に従フて２本発明を完成さ
せた。
発明の構成 本発明は、　　（１）ＤＨＦＲ−ＬＥＫの大量発現を可
能にする新規組換えプラスミドｐＬＥＫ１゜（２）ｐＬ
ＥＫｌを含有する大腸菌菌体、　（３）ｐＬＥＫｌを含
有する大腸菌が生産するＤＨＦＲ−ＬＥＫ、　　（４）
ｐＬＥＫｌを含有する大腸菌からのＤ　ＨＦ　Ｒ−Ｌ　
ＥＫ分離精製、および（５）ＤＨＦＲ−ＬＥＫを用いた
ＬＥＫの製造方法、の発明により構成される。
（１）新規組換えプラスミドｐＬＥＫ１第１図は２本発
明のｐＬＥＫｌの全塩基配列を示している。図は、２本
鎖環状ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列だけを、プラス
ミド中に唯一存在する制限酵素Ｃ１ａｌの切断認識部位
、　５’−ＡＴＣＧＡＴ−３’　、の最初の”Ａ”を１
番として数えて、５′末端から３′末端の方向に記述し
ている。本発明のｐＬＥＫＩは、新規な組換えプラスミ
ドである。ｐＬＥＫｌは、４２０７塩基対の大きさであ
り、宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシ
リン耐性を付与することができる。ｐＬＥＫｌは。
ｐＴＰ１０４”−４のＢａｍＨＩ及び５ａｌＩ切断によ
って得られる大きい方の４１７３塩基対のＤＮＡ断片と
、ＬＥＫを暗号化する配列を含む３４塩基対の化学合成
りＮＡが結合した構造をしていてる。第１図において、
５３３番目から５６６番目迄の配列が化学合成りＮＡ由
来の配列てあ。それ以外の配列がｐＴＰ１０４−４由来
の配列である。
６０番目から５６５番目までの配列）、を含ませである
。ｐＴＰ１０４−４由来の部分には、ＭｌｕＩ部位が存
在しない。ｐＬＥＫｌのＢａｍＨ１部位（第１図の５３
２番目から５３７番目までの配列）からＭ　ｌ　ｕ　Ｉ
部位までの配列を他の配列に置き換えることにより、方
向を定めて異種ＤＮＡの導入を行い、ＤＨＦＲ遺伝子と
の融合遺伝子を容易に作成することができる。
第１図の５７番目から５５７番目まで配列は。
ＤＨＦＲのカルボキシ末端側にＬＥＫがメチオニンを介
して結合したＤＨＦＲ−ＬＥＫを暗号化している。
ＤＨＦＲ−ＬＥＫを暗号化する配列の上流には。
ＤＨＦＲ−ＬＥＫ遺伝子の発現を効率良く行わせる配列
が存在する（特願　昭６ｌ−３１２８３６）。即ち、４
３番目から５０番目までの配列がＳＤ配列と呼ばれるも
ので、効率の良い翻訳に、また。
４１６５１６５番目１９３１９３番目、コンセンサス転
写プロモーターであり、効率の良い転写に貢献する。こ
のことから、ｐＬＥＫｌは、大腸菌に導入された場合、
多量のＤＨＦＲ−ＬＥＫを作る。作られたＤＨＦＲ−Ｌ
ＥＫは、菌体内に可溶性の状態で、菌体タンパク質の約
２０％程度蓄積する。このことによって、ｐＬＥＫｌを
有する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。
また、ｐＬＥＫｌは、ｐＴＰ１０４−４由来の、アンピ
シリンに対して耐性を付与する遺伝子を有している。こ
のことから、ｐＬＥＫｌが導入された大腸菌は、アンピ
シリン耐性をも示す。ｐＬＥＫｌは、大腸菌に導入され
て安定状態に保たれ、ｐＬＥＫｌを含有する大腸菌は、
微工研にＦＥＲＭ弗ｐ−１８１８＆ＩｒＴ？ｒ□ゎ、い
う。
このような特長を有するｐＬＥＫｌは、実施例１に従っ
て作成することができるが２組換えプラスミドの作成方
法によって本発明が制限されるものではない。
（２）ｐＬＥＫｌを含有する大腸菌 に１を含有する大腸菌は、ｐＬＥＫ上のＤＨＦＲ−ＬＥ
Ｋ遺伝子の効率のよい発現の結果、ＤＨＦＲ−ＬＥＫを
菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積する。ｐＬＥＫｌを
含有する大腸菌をＹＴ＋Ａｐ培地（培地１１中に、５ｇ
のＮａＣ１，８ｇのトリプトン、５ｇのイーストエキス
、及び５０ｍｇのアンピシリンナトリウムを含む液体培
地）を用いて、３７℃で定常朋まで培養した場合、蓄積
するＤＨＦＲ−ＬＥＫは、菌体タンパク質の約２０％に
達する。培養面体を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液
に懸濁し、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕
し、これを遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合
、はとんど全てのＤＨＦＲ−ＬＥＫは上清中に回収され
る。ｐＬＥＫｌを含有する大腸菌は、微工研にＦＥＲＭ
　ＢＰ−１８１８として寄託されている。
（３）ＤＨＦＲ−ＬＥＫ 第２図は、　　ＤＨＦＲ−ＬＥＫを暗号化する部分のＤ
ＮＡ配列とそれから作られると予想されるタンパク質の
アミノ酸配列を示している。ＤＨＦＲ−ＬＥＫは、１６
７アミノ酸よりなる新規なタンパク質である。アミノ末
端側から数えて、１から１５９番目までの配列が、大腸
菌の野生型Ｉ）ＨＦＲに１箇所アミノ酸置換置換か起こ
った（Ｃｙｓ−１５２（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）　→Ｇｌ
ｕ−１５２）配列であり、１６２番目から１６７番目ま
でかＬＥＫの配列である。ＬＥＫの配列の直前のアミノ
酸はメチオニン（Ｍｅｔ）である。このことにより、Ｄ
ＨＦＲ−ＬＥＫをブロムシアン処理することにより、Ｌ
ＥＫを特異的に切り出すことができる。１６０番目のイ
ソロイシン（ｌｌｅ）と１６１番目のアルギニン（Ａｒ
ｇ）は＋　　ｐ’ｒＰ　１０４−４のＢａｍＨＩ部位に
ＬＥＫを暗号化するＤＮＡを導入する際に、遺伝暗号の
読み取り枠を合わせるために生した配列である。ｐＴＰ
１０４−４が作るＤＨＦＲは、１６２個のアミノ酸より
なり、第２図のＤ　ＨＦ　Ｒ−Ｌ　Ｅ　Ｋのアミノ酸６
０番目まテ串配列に、　Ｇｌｎ−１１ｅの２個のアミノ
酸１−ノ 配列が結介゛びた配列をしている。ＤＨＦＲ−ＬＥＫの
分子量は、１８，９６３である。
ＤＨＦＲ−ＬＥＫは、ＤＨＦＲのカルボキシ末端側に、
ＬＥＫが融合した構造をしているにもかかわらず、ＤＨ
ＦＲ酵素活性を有する。このため。
大腸菌がＤＨＦＲ−ＬＥＫを多量につくると、ＤＨＦＲ
の阻害剤であり、抗細菌剤であるトリメトプリムに対し
て、耐性を示すようになる。
（４）ＤＨＦＲ−ＬＥＫの分離精製 本発明のＤＨＦＲ−ＬＥＫの分離精製法は、■面体の培
養、■菌体の破砕、■ＤＥＡＥ−）ヨパール力うム処理
、■メソトリキセート（ＭＴＸ）結合アフィニティクロ
マトグラフィー、および■ＤＥＡＥ−）ヨバール力ラム
クロマトグラフィーの過程より成り立っている。
■菌体の培養 ｐＬＥＫｌを含有する大腸菌の培養は、ＹＴ＋Ａｐ培地
（培地ｌｌ中に、５ｇのＮａＣ１，８ｇのトリプトン＋
５ｇのイーストエキスおよび５０ｍｇのアンピシリンナ
トリウムを含む液体培地。）で培養することができる。
培地としては、この他にＳＴ＋Ａｐ培地（培地１１中に
、２ｇのグルコース＋１ｇのリン酸２カリウム、５ｇの
ポリペプトン、５ｇのイーストエキスおよび５０ｍｇの
アンピシリンナトリウムを含む液体培地。）など。
菌体が成長する培地であれば、どの様な培地でも用いる
ことができるが、調べた限りでは、ＤＨＦＲ−ＬＥＫの
生産にはＹＴ＋Ａｐ培地が最適であった。
ｐＬＥＫＩを含有する大腸菌を、培地に接種し。
３７°Ｃて対数成長期の後期もしくは定常期まで培養す
る。培養温度により菌体中のＤＨＦＲ−ＬＥＫの蓄積量
が変動し、調べた限りでは、培養温度が高いほど蓄積量
が大であった。培養した菌体は。
５．０００回転／分の遠心分離により集める。培地１１
より湿重量２から４ｇの菌体が得られる。
集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
（０から１０°Ｃの間、４℃が望ましい）で行う。
■菌体の破砕− 培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の緩衝液１　（
０，１ｍＭ　　エチレンジアミン４酢酸ナトリウム（Ｅ
ＤＴＡ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７
，０）に懸濁いフレンチフルスを用いて菌体を破砕する
。菌体破砕液を５，０００回転、１０分間遠心分離い上
清を得る。さらに、上清を、３５，０００回転、１時間
超遠心分離し、上清を得る（無細胞抽出液）。
■ＤＥＡＥ−）ヨパール力ラム処理 この操作は２次の精製過程の前処理の目的で行う。無細
胞抽出液を、あらかじめ０．１ＭのＫＣｌを含む緩衝液
１て平衡化したＤＥＡＥ）ヨパール力ラムにかけ、Ｏ，
ＩＭのＫＣＩを含む緩衝液１てカラムを洗う。酵素の溶
出は、０．３ＭのＫＣｌを含む緩衝液１を用いて行う。
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する。
分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性を測定し。
酵素活性が含まれる画分を集める。
■ＭＴＸ結合アフィニティクロマトグラフィー上記の操
作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝液１て平衡
化したＭＴＸ結合５ｅｐｈａｒＯｓｅアフィニティカラ
ムに吸着させる。吸着後、ＩＭのＫＣｌを含む緩衝液２
　（０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液、ｐＨ８，５）で洗う。洗いは、カラムから
の溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度が０．
１以下になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は
、ＩＭのＫＣＩと３ｍＭの葉酸を含む緩衝液２を用いて
行い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用
いて分画する。分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性を
測定し、酵素活性が含まれる両分を集める。得られた酵
素液を、緩衝液１に対して。
３回透析する。この段階で、純度９０％以上のＤＨＦＲ
−ＬＥＫが得られる。
■ＤＥＡＥ−）ヨパール力ラムクロマトグラフィ透析し
た酵素液を、あらかじめ緩衝液１て平衡化したＤＥＡＥ
−）ヨバール力ラムに吸着させる。
度を測定し、吸光度が０．０１以下になるまで同緩衝液
を流し続ける。酵素の溶出は、緩衝液１を用いて０．１
Ｍから０．３ＭのＫＣＩの直線濃度局配を用いて行い、
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する。分画した溶出液について２８０ｎｍの吸光度と
ＤＨＦＲ活性を測定する。酵素活性／　２８０　ｎ　ｍ
の吸光度の値が。
一定な画分を集める。
以上の操作により、ＤＨＦＲ−ＬＥＫの高度精製均一化
を、再現性良く行うことができる。
本発明に従うと、ＤＨＦＲ−ＬＥＫの精製は。
培養を含めて一週間以内に行うことができ２回収率５０
％以上で、均一な酵素標品を得ることができる。
ＤＨＦＲ酵素活性は２反応液　（０，０５ｍＭのジヒド
ロ葉酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ，１２ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０））を、１ｍ１（７）キュへットとり、これに酵素
液を加え、３４０ｎｍの吸光度の時間変化を測定するこ
とにより行う。　酵素１ユニツトは、上記反応条件にお
いて、１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元す
るのに必要な酵素量として定義する。この測定は２分光
光度計を用いて容易に行うことができる。
（５）ＤＨＦＲ−ＬＥＫを用いたＬＥＫの製造精製した
ＤＨＦＲ−ＬＥＫを凍結乾燥し、これに１から１０ｍｇ
タンパク質／ｍ質量なるように７０％蟻酸を加え、溶か
した後、タンパク質量の約２０倍量の結晶ブロムシアン
を加え密栓し、窒素雰囲気下、室温で攪拌しながら２４
時間反応させる。反応液を１０倍の水で希釈した後、凍
結乾燥し過剰の試薬を除く。乾燥試料を１から１０ｍｇ
タンパク質／ｍ質量なるように３０％酢酸に溶かず。溶
かした試料をＨＰＬＣ装置（品性ＬＣ−４Ａ　、　ｉ　
ｎｅｒｔｓ　ｉ　１−ＯＤＳカラム）を用いて、０．１
％トリフルオロ酢酸中、１５％から５０％のアセトニト
リルの濃度勾配を用いて溶出・分離することがで＝１６
− は、ブロムシアン処理したＤＨＦＲ−ＬＥＫ試料の高速
液体クロマトグラムを示している。試料注入後１７分の
ピークがＬＥＫである。このピーク画分を分離する。分
離した溶出液をエバボレーターで乾燥後、少量の水を加
え凍結乾燥し溶媒を除き、ＬＥＫを得ることができる。
また、得られたペプチドを酸加水分解後、アミノ酸分析
することによりアミノ酸組成を確かめることができる。
本発明の実施例においては、３１の培地から湿重量的８
ｇの面体が得られ、この菌体（計算上。
約８７．３ｍｇのＤＨＦＲ−ＬＥＫ、約２．６ｍｇのＬ
ＥＫを含む。）から、約４３　ｍ　ｇのＤＨＦＲ−ＬＥ
Ｋ　（、収率、５０．６％、計算上線１．２６ｍｇのＬ
ＥＫを含む。）を精製して得ることができ、１０ｍｇの
ＤＨＦＲ−ＬＥＫをブロムシアン分解後、ＨＰＬＣて分
離・精製することにより。
約０．１６ｍｇのＬＥＫを得ることができた。
次に本発明の実施例および参考例を示す。
実施例１ ｐＬＥＫｌの作成 ＬＥＫを暗号化するＤＮＡとしては。
１、５’−ＧＡＴＣＣＧＴＡＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＴＴ
ＴＣＣＴＧＴＡＡＣＧＣＧＴＧ−３’２、　５’−ＴＣ
ＧＡＣＡＣＧＣＧＴＴＡＣＡＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＴ
ＡＣＡＴＡＣＧ−３’の２本の３４ヌクレオチドからな
るＤＮＡをホスホアミダイト法に従って化学合成し、精
製後、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、各ＤＮＡの
５９末端をリン酸化した。リン酸化したＤＮＡを約０゜
１ｍｌ　（約０．０１１１ｇのＤＮＡを含んでいる。
）ずつ取り、これを６０°Ｃでインキュベートすること
によって両ＤＮＡをアニールさせた（これをＤＮＡＩと
呼ぶ）。
約１μｇのｐＴｐ　１０４−４を、ＢａｍＨＩ及び５ａ
ｌＩて切断した後、アルカリホスファターゼ処理をした
。アルカリホスファターゼ処理したＤＮＡをフェノール
処理することにより、共存する酵素タンパク質を変性除
去し、その後エタノ−圧下に沈澱を乾燥させた。Ｂａｍ
ＨＩ及びＳａｌ■によるＤＮＡの切断、アルカリホスフ
ァターゼ処理、フェノール処理、およびエタノール沈澱
の各操作は、いずれも、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　Ａ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”
　（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ
、Ｊ。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｄｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）、
以下２文献１と呼ぶ。）に記載している方法に従って行
った。乾燥させたＤＮＡを５０μｌのリガーゼ用反応液
（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４゜５　ｍＭ
　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオトレイトール、５　ｍＭ
　ＡＴＰ）に溶解後、５μｌのＤＮＡＩを加え、これに
１ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加えて、１０°Ｃ
て、１４時間ＤＮＡの連結反応を行わせた。この反応物
を、形質転換法（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅ
ｔｈｏｄ、上記文献１に記載）に従って、大腸菌に取り
込ませた。
この処理をした菌体な、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリン
ナトリウムおよび１０ｍｇ／ｍｌのトリメトプリムを含
む栄養寒天培地（培地ＩＩ中に、２ｇのグルコース、１
ｇのリン酸２カリウム、５ｇのイーストエキス、５ｇの
ポリペプトン、１５ｇの寒天を含む。）上に塗布し、３
７°Ｃて２４時間培養することにより、約１５個のコロ
ニーを得ることができた。これらのコロニーから適当に
８個選び、１．５ｍｌのＹＴ十Ａｐ培地（培地１１中に
、５ｇのＮａＣ１，５ｇのイーストエキス。
８ｇのトリプトン、５０ｍｇのアンピシリンナトリウム
を含む。）で、３７°Ｃ，１晩、菌体を培養した。培養
液を、各々エッペンドルフ遠心管にとり、１２，０００
回転／分で１０分間遠心分離い菌体を沈澱として集めた
。これに、Ｏ，１ｍｌの電気泳動用サンプル調製液（０
，０６２５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ６，８，２χ
のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０χのグリセ
リン、５χの２−メルカプトエタノール、　０．００１
％のブロムフェノールブルーを含む。
）を加え、菌体な懸濁いこれを沸騰水中に５分間保ち、
菌体を溶かした。この処理をしたサンプルを５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｕ、に、Ｌａｍｍ１
ｉ；　Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、２２７．　ｐ、６８０
（１９７０））におよび分子量マーカーとしてラクトア
ルブミン（分子ｆｆ１１４，２００）　、　　）リプシ
ンインヒビター（分子ｆｉ２０，１００）　、）リブシ
ノーゲン（分子量２４，０００）　。
カルボニックアンヒドラーゼ（分子量２９，０００）　
。
グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子
量３６，０００）　、卵アルブミン（分子ｊｉ４５，０
００）、および牛血清アルブミン（分子量６６．０００
）を含むサンプルをポリアクリルアミド濃度の１０から
２０％濃度勾配ゲルで泳動じた。その結果、８個のコロ
ニーのうち、７個ではｐＴＰ１０４−４のＤＨＦＲのバ
ンドが消失いそれより明らかに分子量が大きくなったタ
ンパク質（分子量約２２，０００と推定される。）を新
たに生産していること、残りの１個のコロニーは、ｐＴ
Ｐ１０４−４のＤＨＦＲとほぼ同じ大きさのタンパク質
を生産すること、ｐＴＰ１０４−４のＤＨＦＲ（分子量
１８，３７９）は、この条件で分子量約２１，０００の
タンパク質として泳動することが明らかになった。分子
量の太きい新たなタンパク質を生産するコロニーのうち
から適当に一つ選び、これをＹＴ＋Ａｐ培地で培養し、
　ＴａｎａｋａとＷｅｉｓｂｌｕｍの方法（Ｔ、Ｔａｎ
ａｋａ、　Ｂ、Ｗｅｉｓ−ｂｌｕｍ；　Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１２１．ｐ、３５４（１９
７５））に従って、プラスミドを調製した。得られたプ
ラスミドをｐＬＥＫｌと名づけた。ｐＬＥＫｌは、ｐＴ
Ｐ　１０４−４のＢａｍＨＩと５ａＩＩ部位の間の配列
が合成りＮＡと置き換わった構造をしているはずである
。合成りＮＡには、制限酵素Ｍ　ｌ　ｕ■で切断認識さ
れる配列、　５’−ＡＣＧＣＧＴ−３’、が含まれてい
るので、ＭｌｕＩでｐＬＥＫｌの切断を試みたところ、
確かに切断された。また、ｐＬＥＫｌのＥｃｏＲＩ　（
第１図の４７１−４７６番目の配列）とＰｖｕＩｒ　（
第１図の１５６３−１５６８５６８番目）による切断に
よって得られる約１１００ヌクレオチド長のＤＮＡにつ
いて５Ｍ１３フアージを用いたジデオキシ法（Ｊ、Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ；　Ｍｅｈｔｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ。
ｖｏｌ、１０１．ｐ、２０（１９８３乃に従〕て、Ｅｃ
ｏＲＩからＰｖｕＩ［の方向に塩基配列を決定した。そ
の結果。
第１図に、示すｐＬＥＫｌの全塩基配列の４７１番よっ
て明らかにされている（特願　昭６２−３０２１５７）
。ｐＬＥＫｌのＢａｍＨＩ−３ａｌｌの配列は、ｐ’Ｔ
Ｐ１０４−４のＢａｍＨＩ−３ａＩＩの間の２９４ヌク
レオチド長の配列が、　ＬＥＫを暗号化する配列として
設計・合成した３４ヌクレオチド長の配列に置き換わっ
た配列であった。
また、ｐＬＥＫｌのＢａｍＨＩ−５ａｌＩ切断によって
得られる約４．２キロ塩基対のＤＮＡは、ＥｃｏＲｌ、
Ｐｓ　ｔ　Ｉ、Ｈｉｎｄｍ、Ｈｐａｌ、Ａａ　ｔ　ｎ、
　Ｐ　ｖ　ｕ　ｎ、　　Ｂ　ｇ　Ｉ　Ｕ、およびＣ１ａ
Ｉを用いた制限酵素による切断実験の結果、ｐＴＰ１０
４−４のＢａｍＨｌ−５ａ　ｌ　Ｉ切断によって得られ
る約４．２キロ塩基対のＤＮＡと全く同一であることが
示された。
以上の結果から、ｐＬＥＫｌの全塩基配列が第１図に示
した配列であることが決められた。
実施例２ 一２３＝ ｐＬＥＫｌを含有する大腸菌が作るＤＨＦＲ−ＬＥＫ ｐＬＥＫｌを含有する大腸菌が作るＤＨＦＲ−ＬＥＫの
アミノ酸配列は、ＤＨＦＲ−ＬＥＫ遺伝子の塩基配列か
ら予恕することができる。第１図の５７番目から５５７
番目の配列がＤＨＦＲ−ＬＥＫを暗号化していることか
ら、トリプレット暗号表を用いて、アミノ酸配列を推定
した。その結果第２図に示すアミノ酸配列が得られた。
ｐＬＥＫｌを含有する大腸菌から、ＤＨＦＲ−ＬＥＫを
分離精製し、精製したタンパク質を用いて、以下のよう
に確認した。
ＤＨＦＲ−ＬＥＫの精製 Ａ、用いた菌体量：湿重量　８ｇ Ｂ、酵素精製表（衷における精製過程は■無細胞抽出液
、■ＤＥＡＥ−）ヨバール力うム処理、■メソトリキセ
ート結合アフイニテイクロマトグラフィー、および■Ｄ
ＥＡＥ−）ヨパールカラムク２４一 過程　の量（ｍｌ）り質（ｍｇ）　　　活性（ユニット
）（２）■　　　４５　　　　５５０　　４．４１７　
　１００■　　　３３　　　　２４０　　３，４２５　
　７？、５■　　　５６　　　　　５８　　２，８６４
　　６４．８■　　　２８　　　　　４３　　２，２３
６　　５０．６ＤＨＦＲ酵素活性は２反応液　（０，０
５ｍＭのジヒドロ葉酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＩｉ、
１２ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０ｍＭのリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０））を、１ｍｌのキュベツトとり
、これに酵素液を加え、３４０ｎｍの吸光度の時間変化
を測定することにより行った。
酵素１ユニツトは、上記反応条件において、１分間に１
マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素
量として定義した。
得られた酵素タンパク質をＳＤＳ電気泳動法（上記実施
例に記載の方法）により分析したところ。
約２２，０００の単一なタンパク質バンドが示され、得
られた酵素標品が均一であることが示された。
分離精製したＤＨＦＲ−ＬＥＫの性質 精製したＤＨＦＲ活性を示すタンパク質をエンザイムイ
ムノアッセイにより検討したところ、ＬＥＫに対する抗
体と反応することが示された。即ち、精製して得られた
タンパク質は免疫学的にＬＥＫと同等の構造を有するこ
とが明らかとなった。
精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端側のアミ
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼＹを、精製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量したくカルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定法
）。その結果。
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　（カルボキシ末端）である
ことが予想された。また、精製して得られたタンパク質
を酸加水分解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配
列の結果予想されるアミノ酸組成と一致した結実施例３ 精製分離したＤ　ＨＦ　Ｒ−Ｌ　Ｅ　ＫからのＬ　Ｅ　
Ｋの分離 実施例２て得られた精製タンパク質（約１０ｍｇ、約５
３０ｎｍｏ　１　ｅｓのＤＨＦＲ−ＬＥＫ）を、凍結乾
燥し、これを２ｍｌの７０％蟻酸に溶かし、これに約２
００　ｍ　ｇのブロムシアンを加え溶かい窒素雰囲気下
、密栓した後、室温で２４時間攪拌しながら反応させた
。反応後、２０ｍ１の水を加え、その後凍結乾燥した。
凍結乾燥して得られた標品な、１０ｍ１の３０％酢酸に
溶かした。そのうちの、ｏ、５ｍｌ　　（約２６ｎｍｏ
ｌｅのＤＨＦＲ−ＬＥＫを含むはず）をとり、高速液体
クロマドグフィー装置（品性ＬＣ−４Ａ）を用い１ｎｅ
ｒｔｓｉｌ−ＯＤＳ　５μｍカラムで分離した。溶出は
。
０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾
配（１５％から５０％）をかけることにより行った。０
から２分までは、１５％のアセニトリルを用い、２分か
ら３２分までは、１５％から５０％のアセトニトリルの
直線濃度勾配をかけた。
その結果、第３図に示すような溶出曲線が得られた。試
料注入後１７分のピーク画分を分離い分離した溶出液を
エバホレーターて乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶
媒を除き、ペプチドを得た。
得られたペプチドを酸加水分解後、その１／２の容をア
ミノ酸分析に用いた。その結果、チロシン。
グリシン、フェニルアラニン、およびロイシンがそれぞ
れ、７．２，１４．６，７．１および７゜６ｎｍｏｌｅ
ずつ検出された。アミノ酸組成は。
ＬＥＫのそれと一致した値であり、また分析したヘプチ
トは、約７．４ｎｍｏ　Ｉ　ｅ　（約４．１μｇ）のＬ
ＥＫを含んていることが明かとなった。この結果を用い
ると、ブロムシアン処理して得られたサンプル０．５ｍ
ｌをＨＰＬＣを用いて分離することにより、収率約５７
％（７゜４ｘ２ｎｍｏｌｅ／２６ｎｍｏｌｅ）でＬＥＫ
を回収できること。
またこの操作を２０回繰り返すことにより、１０ｍｇの
ＤＨＦＲ−ＬＥＫから約１６４μｇ（４゜１ｘ２μｇｘ
２０）のＬＥＫが得られることが示される。
また、　Ｄ　ＨＦＲ−Ｌ　Ｅ　Ｋの精製の収率が約５０
％であり、ＤＨＦＲ−ＬＥＫからＬＥＫの分離の収率が
約５７％であることから、大腸菌がつくるＬＥＫペプチ
ド部分の単離収率が、約２９％程度であることが算出さ
れる。
発明の効果 上記のように、新規組換えプラスミドｐＬＥＫ１は、Ｄ
ＨＦＲ−ＬＥＫを暗号化しており、かつｐＬＥＫｌを有
する大腸菌は、ＤＨＦＲ−’ＬＥＫを可溶性の状態で大
量に蓄積生産する。さらに。
生成したＤ　ＨＦ　Ｒ−Ｌ　Ｅ　Ｋは、ＤＨＦＲ酵素活
性を保持しており、精製を容易に行うことができる。
本発明の精製法に従うことにより、ＤＨＦＲ−ＬＥＫの
精製を迅速に効率よく行うことができる。
また、ＤＨＦＲ−ＬＥＫをブロムシアン処理後。
ＨＰＬＣで分離することにより、ＬＥＫを容易に単離す
ることができる。このような性質を有することから１本
発明は、ＤＨＦＲ−ＬＥＫとそれを利用したＬ　Ｅ　Ｋ
の生産に有益である。
また、ｐＬＥＫｌには、ＭｌｕＩ部位が新たに付は加え
られており、異種遺伝子の発現用ヘクターとして有用で
あると考えられる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ｐＬＥＫｌの全塩基配列を示した図であり、
２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列だけを、５′末
端から３”末端の方向に記述している。図中符号は、核
酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇは
グアニンを、Ｔはチミンを示している。図中番号は、ｐ
ＬＥＫｌに１筒所存在する制限酵素Ｃ１ａｌ切断認識部
位、５’　−ＡＴＣＧＡＴ−３’　、の最初の”Ａ　Ｉ
＋を１番として数えた番号を示している。 第２図は、　　ｐＬＥＫｌ中に存在するＤＨＦＲ−ＬＥ
Ｋを暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミ
ノ酸配列を示す図である。図中符号は。 核酸塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデニンを。 Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを。 ３ｌ− Ａｌａはアラニ、’；、副Ａ　ｒ　ｇはアルギニンを、
Ａｓｎはアスパラギンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、
Ｃｙｓはシスティンを、Ｇｉｎはグルタミンを、Ｇｌｕ
はグルタミン酸を、ｃｔｙはグリシンを、Ｈｉｓはヒス
チジンを、Ｉｌｅはイソロイシンを、Ｌｅｕはロイシン
を、Ｌｙｓはリジンを。 Ｍｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、
Ｐｒｏはプロリンを、Ｓｅｒはセリンを。 Ｔｈｒはトレオニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔ
ｙｒはチロシンを、Ｖａｌはバリンを示している。図中
番号は、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化す
るＡＴＧコドンの”Ａ　１１を１番として数えた番号を
示している。 第３図は、ブロムシアン処理したＤＨＦＲ−ＬＥＫ試料
の高速液体クロマトグラムを示している。 横軸は、試料注入後の時間を分単位で、縦軸は。 ２２０ｎｍの吸光度を任意単位で表現している。 矢印で示したピークがＬＥＫの溶出ピークである。 ＝３２− ａａ＜ａａ　　　　　Ｏｌ＋　　　　ａｈ第　　ｌ　　
し ＴＡＡＧＣＴＴ く　　の　　６

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
    にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
    ことができ、４２０７塩基対の大きさを有し、第１図に
    おいて示されるＤＮＡ配列を有する新規組換えプラスミ
    ドｐＬＥＫ１。 ２、ｐＬＥＫ１を含有する大腸菌。 ３、ｐＬＥＫ１を含有する大腸菌が生産し、第２図によ
    って示されるアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元酵
    素−ロイシンエンケフアリン融合タンパク質。 ４、ｐＬＥＫ１を含有する大腸菌を培養し、ジヒドロ葉
    酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元酵素−ロイ
    シンエンケファリン融合タンパク質を、培養菌体の無細
    胞抽出液から、イオン交換カラム処理、メソトリキセー
    ト結合アフィニティカラムクロマトグラフィー、および
    陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製す
    ることを特徴とするジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエ
    ンケフアリン融合タンパク質の分離精製方法。 ５、ｐＬＥＫ１を含有する大腸菌の生産するジヒドロ葉
    酸還元酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパク質を
    ブロムシアン分解法により分解した後、ロイシンエンケ
    フアリンを分離精製することを特徴とするロイシンエン
    ケフアリンの製造方法。
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