JPH042235B2

JPH042235B2 -

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Publication number: JPH042235B2
Application number: JP63231248A
Authority: JP
Priority date: 1988-09-14
Filing date: 1988-09-14
Publication date: 1992-01-16
Also published as: JPH0279978A

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］本発明は、δ−エンドルフインの遺伝子組換え
法による新規な製造方法およびそれに係わる組換
えプラスミド、形質転換株、融合タンパク質に関
する。 δ−エンドルフインは、19個のアミノ酸より構
成されるモルヒネ様生理活性を有するペプチドで
あり、下記アミノ酸配列を有する。 δ−エンドルフイン：Try−Gly−Gly−Phe−
Met−Thr−Ser−Glu−Lys−Ser−Gln−Thr−
Pro−Leu−Val−Thr−Leu−Phe−Lys 本発明の新規組換えプラスミドpENDD2は、
第１図において示されるDNA配列を有する。本
発明は、発酵工業、医薬品工業等の分野に好適で
ある。［従来の技術］ δ−エンドルフインは、モルヒネ様生理活性を
示すエンドルフイン類に属するペプチドであり、
ロイシンエンケフアリンの約4.4倍、メチオニン
エンケフアリンの約2.9倍の鎮痛活性を示す興味
深い生理活性ペプチドである。本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。しかしながら、遺伝子操作を利
用した効率のよいδ−エンドルフインの製造方法
に関しては、知られていない。既に、本発明者らは、大腸菌由来のジヒドロ葉
酸還元酵素（以下、DHFRと略す。）遺伝子に関
して、その遺伝子の改変の結果、異種遺伝子発現
用プラスミドベクターpTP70−１（特開昭63−
267276号公報）と、それを利用した融合遺伝子の
作成方法（特開平１−144992号公報）を開発して
いる。また、pTP70−１にメチオニンエンケフ
アリン（以下、MEKと略す。）を暗号化する化学
DNAを組み込んで、MEKの効率よい生産方法を
開発している（特開平１−252289号公報）。効率
のよいMEKの生産方法を開発する際に得られた
組換えプラスミドpMEK2は、制限酵素BamH
とXho部位の間の配列を異種DNAと取り替え
るだけで、DHFRとの融合遺伝子を容易に作成
できる。また、pMEK2を利用して融合遺伝子を
作成した場合、融合遺伝子の発現の結果得られる
融合タンパク質の大腸菌菌体の蓄積量としては、
全菌体タンパク質の約20％が期待される。しかし
ながら、δ−エンドルフインの生産に上記発現ベ
クターを用いた例はない。［発明の目的］本発明の目的は、遺伝子操作の手法を用いたδ
−エンドルフインの大量生産方法を開発すること
にある。本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究
の結果、δ−エンドルフインを暗号化する遺伝子
を設計・化学合成し、pMEK2に組み込むことに
より、δ−エンドルフイン遺伝子とDHFR遺伝
子との融合遺伝子を作成し、融合遺伝子を大腸菌
で発現させることにより、DHFR−δ−エンド
ルフイン融合タンパク質（以下、融合タンパク質
と略す。）を大量に生産できることを見いだし、
さらに、融合タンパク質を用いることにより効果
的にδ−エンドルフインを作成できることを明ら
かにし、本発明を完成させた。［発明の構成］本発明は、(1)融合タンパク質の大量発現を可能
にする新規組換えプラスミドpENDD2、(2)
pENDD2を含有する大腸菌菌体、(3)pENDD2を
含有する大腸菌が生産する融合タンパク質、(4)
pENDD2を含有する大腸菌からの融合タンパク
質の分離精製方法、および(5)融合タンパク質を用
いたδ−エンドルフインの製造方法、の発明によ
り構成される。 (1) 新規組換えプラスミドpENDD2 第１図は、本発明のpENDD2の全塩基配列
を示している。図は、２本鎖環状DNAのうち
片方のDNA鎖配列だけを、プラスミド中に２
箇所存在する制限酵素C1a部位のうち制限酵
素Hind部位に近い方の切断認識部位、5′−
ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”を１番として
数えて、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。本発明のpENDD2は、新規な組換えプラ
スミドである。pENDD2は、4682塩基対の大
きさであり、宿主である大腸菌にトリメトプリ
ムおよびアンピシリン耐性を付与することがで
きる。pENDD2は、pMEK2（特開平１−
252289号公報に記載。）のBamHとXho部
位の間のMEKを暗号化する配列を含む26塩基
対の配列を、δ−エンドルフインを暗号化する
配列を含む68塩基対の化学合成DNAと置き換
えた構造をしている。第１図において、533番
目から600番目迄の配列が化学合成DNA由来の
配列である。それ以外の配列がpMEK2由来の
配列である。第１図の57番目から596番目まで配列は、
DHFRのカルボキシ末端側にδ−エンドルフ
インがアルギニン（Arg）を介して結合した融
合タンパク質を暗号化している。融合タンパクを暗号化する配列の上流には、
遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在す
る（特開昭63−267276号公報）。即ち、43番目
から50番目までの配列がSD配列と呼ばれるも
ので、効率の良い翻訳に、また、4640番目から
4668番目までが、コンセンサス転写プロモータ
ーであり、効率の良い転写に貢献する。このこ
とから、pENDD2は、大腸菌に導入された場
合、多量の融合タンパク質を作らせることがで
きる。作られた融合タンパク質は、菌体内に可
溶性の状態で、菌体タンパク質の約20％程度蓄
積する。このことによつて、pENDD2を含有
する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すように
なる。また、pENDD2は、pMEK1由来の、ア
ンピシリン耐性遺伝子を有している。このこと
から、pENDD2が導入された大腸菌は、アン
ピシリン耐性をも示す。pENDD2は、大腸菌
に導入されて安定状態に保たれ、pENDD2を
含有する大腸菌は、微工研にFERM BP−
2031として寄託されている。このような特長を有するpENDD2は、実施
例１に従つて作成することができるが、組換え
プラスミドの作成方法によつて本発明が制限さ
れるものではない。 (2) pENDD2を含有する大腸菌 pENDD2を含有する大腸菌は、トリメトプ
リム及びアンピシリンに対して耐性を示す。
pENDD2を含有する大腸菌は、融合タンパク
質遺伝子の効率のよい発現の結果、融合タンパ
ク質を菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積す
る。pENDD2を含有する大腸菌をYT＋Ap培
地（培地１中に、５ｇのNaCl、８ｇのトリ
プトン、５ｇのイーストエキス、及び50mgのア
ンピシリンナトリウムを含む液体培地）を用い
て、37℃で定常期まで培養した場合、蓄積する
融合タンパク質は、菌体タンパク質の約20％に
達する。培養菌体を、リン散緩衝液などの適当
な緩衝液に懸濁し、フレンチプレス法もしくは
音波破砕法で破砕し、これを遠心分離法により
上清と沈澱に分離した場合、全ての融合タンパ
ク質は上清中に回収される。pENDD2を含有
する大腸菌は、微工研にFERM BP−2031と
して寄託されている。 (3) 融合タンパク質第２図は、融合タンパク質と暗号化する部分
のDNA配列とそれから作られると予想される
タンパク質のアミノ酸配列を示している。融合
タンパク質は、180アミノ酸よりなる新規なタ
ンパク質である。アミノ末端側から数えて、１
から159番目までの配列が、大腸菌の野生型
DHFRに１箇所アミノ酸置換置換が起こつた
（Cys−152（Wild type）→Glu−152）配列で
あり、162番目から180番目までがδ−エンドル
フインの配列である。δ−エンドルフインの配
列の直前のアミノ酸はアルギニン（Arg）であ
る。δ−エンドルフインはアルギニンを含まな
い。このことから、融合タンパク質をアルギニ
ルエンドペプチダーゼ
（Arginylendopeptidase、市販品として入手可
能）で処理することにより特異的に切り出すこ
とができる。160と161番目のイソロイシン
（I1e）−ロイシン（Leu）の配列は、pMEK2の
BamH部位にδ−エンドルフインを暗号化
するDNAを導入する際に、遺伝暗号の読み取
り枠を合わせるために生じた配列である
（pMEK2のもととなつたpTP70−１が作る
DHFRは、162個のアミノ酸よりなり、第２図
の融合タンパク質のアミノ酸配列のうち、アミ
ノ末端側から数えて、１から160番目までの配
列に、Gln−lleの２個のアミノ酸配列が結合し
た配列をしている。）。融合タンパク質およびδ
−エンドルフインの分子量は、それぞれ20、
410および2134である。融合タンパク質は、新規なタンパク質であ
る。融合タンパク質はDHFRのカルボキシ末
端側に、δ−エンドルフインが融合した構造を
しているにもかかわらず、DHFR酵素活性を
有する。このため、大腸菌が融合タンパク質を
多量につくると、DHFRの阻害剤であり抗細
菌剤であるトリメトプリムに対して、耐性を示
すようになる。 (4) 融合タンパク質の分離精製本発明の融合タンパク質の分離精製法は、
菌体の培養、菌体の破砕、DEAE−トヨパ
ールカラム処理、メソトリキセート
（MTX）結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー、およびDEAE−トヨパールカラムクロマ
トグラフイーの過程より成り立つている。菌体の培養 pENDD2を含有する大腸菌の培養は、YT
＋Ap培地（培地１中に、５ｇのNaCl、８
ｇのトリプトン、５ｇのイーストエキスおよ
び50mgをのアンピシリンナトリウムを含む液
体培地。）で培養することができる。培地と
しては、この他にST＋Ap培地（培地１中
に、２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリ
ウム、５ｇのポリペプトン、５ｇのイースト
エキスおよび50mgのアンピシリンナトリウム
を含む液体培地。）など、菌体が成長する培
地であれば、どの様な培地でも用いることが
できるが、調べた限りでは、YT＋Ap培地
が最適であつた。 pENDD2を含有する大腸菌を、培地に接
種し、37℃で対数成長期の後期もしくは定常
期まで培養する。培養した菌体は、5000回
転／分の遠心分離により集める。培地１よ
り湿重量２から５ｇの菌体が得られる。集菌およびこれ以後の操作は、特に断わら
ない限り低温（０から10℃の間、４℃が望ま
しい）で行う。菌体の破砕培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の
緩衝液１（0.1ｍＭエチレンジアミン４酢酸
ナトリウム（EDTA）を含む10ｍＭリン酸
カリウム緩衝液、PH7.0）に懸濁し、フレン
チプレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕
液を、35000回転、１時間超遠心分離し、上
清を得る（無細胞抽出液）。 DEAE−トヨパールカラム処理無細胞抽出液を、あらかじめ50ｍＭのKCl
を含む緩衝液１で平衡化したDEAEトヨパー
ルカラムにかけ、カラム容積を50ｍＭのKCl
を含む緩衝液１でカラムを洗う。酸素の溶出
は、緩衝液１を用いて0.1Mから0.3MのKCl
の直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定
量ずつフラクシヨンコレクターを用いて分画
する。酸素の溶出は、0.3MのKClを含む緩
衝液１を用いて行う。溶出液を一定量ずつフ
ラクシヨンコレクターを用いて分画する。分
画した溶出液についてDHFR活性を測定し、
酵素活性が含まれる画分を集める。 MTX結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー上記の操作により得られた酵素液を、あら
かじめ緩衝液１で平衡化したMTX結合アガ
ロースーアフアニテイカラムに吸着させる。
吸着後、1MのKClを含む緩衝液２（0.1ｍ
MEDTAを含む10ｍＭリン酸カリウム緩衝
液、PH8.5）で洗う。洗いは、カラムからの
溶出液の280nｍの吸光度を測定し、吸光度
が0.1以下になるまで同緩衝液を流し続ける。
酵素の溶出は、1MのKClと３ｍＭの葉酸を
含む緩衝液２を用いて行い、溶出液を一定量
ずつフラクシヨンコレクターを用いて分画す
る。分画した溶出液についてDHFR活性を
測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。
得られた酸素液を、緩衝液１に対して、３回
透析する。この段階で、純度95％以上の融合
タンパク質が得られる。 DEAE−トヨパールカラムクロマトグラフ
イー透析した酸素液を、あらかじめ緩衝液１で
平衡化したDEAE−トヨパールカラムに吸着
させる。吸着後、50ｍMKClを含む緩衝液１
で洗う。酸素の溶出は、緩衝液１を用いて50
ｍＭから0.03MのKClの直線濃度勾配を用い
て行い、溶出液を一定量ずつフランクシヨン
コレクターを用いて分画する。分画した溶出
液について280nｍの吸光度とDHFR活性と
を測定する。酵素活性／280nｍの吸光度の値が、一定
な画分を集める。以上の操作により、融合タンパク質の高度
精製均一化を、再現性良く行うことができ
る。本発明に従うと、融合タンパク質の精製
は、培養を含めて一週間以内に行うことがで
き、回収率45％以上で、均一な酵素槽品を得
ることができる。 DHFR酵素活性は、反応液（0.05ｍＭのジ
ヒドロ葉酸、0.06ｍＭのNADPH、12ｍＭの
２−メルカプトエタノール、50ｍＭのリン酸
緩衝液（PH7.0））を、１mlのキユベツトと
り、これに酵素液を加え、340nｍの吸光度
の時間変化を測定することにより行う。酵素
１ユニツトは、上記反応条件において、１分
間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元す
るのに必要な酸素量として定義する。この測
定は、分光光度計を用いて容易に行うことが
できる。 (5) 融合タンパク質を用いたδ−エンドルフイン
の製造精製した融合タンパク質からのδ−エンドル
フインの切断・分離は、アルギニルエンドペプ
チダーゼ（Arginylendopeptidase、市販品と
して入手可能）で処理することにより行う。精
製した融合タンパク質１重量に対して、アルギ
ニルエンドペプチダーゼ0.01重量の割合で加
え、37℃で50ｍＭ Tris−HCl緩衝液、PH8.5
中、24時間処理する。反応液に等量の50％酢酸
を加える。この試料を、HPLC装置（島津LC
−4A、inertsil−ODSカラム）を用いて、0.1％
トリフルオロ酢酸中、15％から50％のアセトニ
トリルの濃度勾配を用いて溶出・分離する。溶
出物は、220nｍにおける吸光度の測定により
検出することができる。第３図は、アルギニル
エンドペプチダーゼ処理したエンドルフイン融
合タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを
示している。試料注入後約22.5分後のピークが
δ−エンドルフインである。このピーク画分を
分離する。分離した溶出液をエバホレーターで
乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除
き、δ−エンドルフインを得ることができる。
また、得られたペプチドを酸加水分解後、アミ
ノ酸分析することによりアミノ酸組成を確かめ
ることができる。本発明の実施例においては、３の培地から
湿重量約13ｇの菌体が得られ、この菌体（計算
上、約253mgの融合タンパク質、約26.8mgのδ
−エンドルフインを含む。）から、約116mgの融
合タンパク質（収率、46％、計算上約12mgのδ
−エンドルフインを含む。）を精製して得るこ
とができ、このうち、20mgの融合タンパク質を
アルギニルエンドペプチダーゼ処理後、HPLC
で分離・精製することにより、約0.68mgのδ−
エンドルフインを得ることができた。［発明の効果］本発明の、新規プラスミドpENDD2および
pENDD2を含有する大腸菌を用いることにより、
融合タンパク質を容易にかつ高収率で分離精製す
ることが得られること、また、タンパク質分解酵
素で処理することにより融合タンパク質から効率
よくδ−エンドルフインを切り出すことができる
ことからモルヒネ様生理活性を有することが知ら
れているδ−エンドルフインの生産に有効であ
る。次に本発明の実施例を示す。実施例１ pENDD2の作成 δ−エンドルフインを暗号化するDNAとして
は、１ 5′−
GATCCGCTACGGCGGTTTCATGACCTC
ＡＧ−3′ ２ 5′−AAAAATCACAGACCCCGCTG−3′ ３ 5′−TCGAGTTATTCACCTTTTTTG−
3′ ４ 5′−TATGCGTTTTTGATGATTG−3′ ５ 5′−GTGACTCTGTTCAAATAAC−3′ ６ 5′−
TCGAGTTATTTGAACAGAGTCACCAGC
ＧＧＧＧ−3′ の６本のDNAをホスホアミダイト法に従つて化
学合成し、精製後、ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて、各DNAの5′末端をリン酸化した。リン
酸化したDNAを約0.1ml（約0.01μｇのDNAを含
んでいる。）ずつ取り、これを60℃でインキユベ
ートすることによつて両DNAをアニールさせた
（これをDNA1と呼ぶ）。約1μｇのpMEK2を、BamHおよびXhoで
切断した後、アルカリホスフアターゼ処理をし
た。アルカリホスフアターゼ処理したDNAをフ
エノール処理することにより、共存する酵素タン
パク質を変性除去し、その後エタノールでDNA
を沈澱させた。沈澱したDNAを70％エタノール
で洗つた後、エタノールを除き、減圧下に沈澱を
乾燥させた。BamHおよびXhoによるDNA
の切断、アルカリホスフアターゼ処理、フエノー
ル処理、およびエタノール沈澱の各操作は、いず
れも、“Molecular Cloning Ａ Loboratory
Manual”（T.Maniatis、E.F.Fritsch、J.
Sambrook、eds.Cold Spring Harbor
Laboratory（1982）、以下、文献１と呼ぶ。）に記
載している方法に従つて行つた。乾燥させた
DNAを50μのリガーゼ用反応液（10ｍＭ
Tris−HCl、PH7.4、５ｍＭ MgCl₂、10ｍＭジ
チオトレイトール、５ｍＭ ATP）に溶解後、
5μのDNA1を加え、これに１ユニツトのT4−
DNAリガーゼを加えて、10℃で、12時間DNAの
連結反応を行わせた。この反応物を、形質転換法
（transformation method、上記文献１に記載）
に従つて、大腸菌HB101株に取り込ませた。こ
の処理をした菌体を、50mg／mlのアンピシリンナ
トリウムおよび10mg／mlのトリメトプリムを含む
栄養寒天培地（培地１中に、２ｇのグルコー
ス、１ｇのリン酸２カリウム、５ｇのイーストエ
キス、５ｇのポリペプトン、15ｇの寒天を含む。）
上に塗布し、37℃で24時間培養することにより、
６個のコロニーを得ることができた。これらのコ
ロニーを、1.5mlのYT＋Ap培地（培地１中に、
５ｇのNaCl、５ｇのイーストエキス、８ｇのト
リプトン、50mgのアンピシリンナトリウムを含
む。）で、37℃、１晩、菌体を培養した。培養液
を、各々エツペンドルフ遠心管にとり、12000回
転／分で10分間遠心分離し、菌体を沈澱として集
めた。これに、0.1mlの電気泳動用サンプル調製
液（0.0625MのTris−HCl、PH6.8、２％のラウリ
ル硫酸ナトリウム（SDS）、10％のグリセリン、
５％の２−メルカプトエタノール、0.001％のブ
ロムフエノールブルーを含む。）を加え、菌体を
懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶
かした。この処理をしたサンプルをSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（U.K.Lammli；
Nature、vol.227、p.680（1970））に従つて分析し
た。標準サンプルとしてpMEK2を含有する大腸
菌に同様な処理をしたもの、および分子量マーカ
ーとしてラクトアルブミン（分子量14200）、トリ
プシンインヒビター（分子量20100）、トリプシノ
ーゲン（分子量24000）、カルボニツクアンヒドラ
ーゼ（分子量29000）、グリセロアルデヒド３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ（分子量36000）、卵アルブ
ミン（分子量45000）、および牛血清アルブミン
（分子量66000）を含むサンプルをポリアクリルア
ミド濃度の10から20％濃度勾配ゲルで泳動した。
その結果、すべてのコロニーにおいて、pMEK2
のDHFR−MEK融合タンパク質のバンドが消失
し、それより明らかに分子量が大きくなつたタン
パク質（分子量約24000と推定される。）が認めら
れた。pMEK2のDHFR−MEK融合タンパク質
（分子量、18963）は、この条件で分子量約22000
のタンパク質として泳動する。得られた６個のコ
ロニーから適当に一株を選び、これをYT＋Ap
培地で培養し、TanakaとWeisblumの方法（T.
Tanaka、B.Weisblum；J.Bacteriology、
vol.121、p.354（1975））に従つて、プラスミドを
調製した。得られたプラスミドをpENDD2と名
づけた。pENDD2は、pMEK2のBamHとXho
との間の配列が、化学合成したDNA配列と置
き変わつた構造をしているはずである。
pENDD2のEcoR（第１図の471−476番目の配
列）とSal（第１図の899−904番目の配列）に
よる切断によつて得られる約400ヌクレオチド長
のDNAについて、M13フアージを用いたジデオ
キシ法（J.Messing；Mehtods in Enzymology、
vol.101、p.20（1983））に従つて、塩基配列を決
定した。その結果、第１図に示す配列の471番目
から約904番目迄の配列が確かめられた。塩基配
列を検討することにより、pENDD2が融合タン
パク質を暗号化することが明らかとなつた。 pMEK2の塩基配列は、本発明者らによつて明
らかにされている（特開平１−252288号公報）。
また、pENDA2のEcoR−Sal切断によつて
得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、Pst、
Hind、Hpa、Aat、Pvu、Bgl、およ
びClaを用いた制限酵素による切断実験の結
果、pMEK2のEcoR−Sal切断によつて得ら
れる約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一であるこ
とが示された。以上の結果から、pENDD2の全塩基配列が第
１図に示した配列であることが決められた。実施例２ pENDD2を含有する大腸菌が作る融合タン
パク質 pENDD2を含有する大腸菌が作る融合タンパ
ク質のアミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予
想することができる。第１図の57番目から596番
目の配列が融合タンパク質を暗号化していること
から、トリプレツト暗号表を用いて、アミノ酸配
列を推定した。その結果第２図に示すアミノ酸配
列が得られた。 pENDD2を含有する大腸菌から、融合タンパ
ク質を分離精製し、精製したタンパク質の性質を
調べた。融合タンパク質の精製Ａ用いた菌体量：湿重量13ｇＢ酵素精製表表における精製過程は無細胞抽出液、
DEAE−トヨパールカラム処理、メソトリキ
セート結合アフイニテイクロマトグラフイー、
およびDEAE−トヨパールカラムクロマトグ
ラフイーを表す。

【表】得られた酵素タンパク質をSDS電気泳動法（上
記実施例に記載の方法）により分析したところ、
分子量約24000の単一なタンパク質バンド示され、
得られた酵素標品が均一であることが示された。分離精製した融合タンパク質の性質精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端
側のアミノ酸配列を明らかにするために、カルボ
キシペプチダーゼＹを、精製タンパク質に時間を
変化させて作用させ、遊離してくるアミノ酸を定
量した（カルボキシペプチダーゼ法によるカルボ
キシ末端側のアミノ酸配列の決定法）。その結果、
−Thr−Leu−Lys（カルボキシ末端）であること
が予想された。また、精製して得られたタンパク
質を酸加水分解した後、アミノ酸分析したとこ
ろ、塩基配列の結果予想されるアミノ酸組成と一
致した結果が得られた。実施例３精製分離した融合タンパク質からのδ−エンド
ルフインの分離実施例２で得られた２mlの精製均一化した融合
タンパク質の溶液（緩衝液１中、約20mg、約
980nmoleの融合タンパク質を含む）に、0.2mgの
アルギニルエンドペプチダーゼを加え、37℃で24
時間反応させる。反応後、１mlの酢酸を加える。
そのうちの、0.5ml（約109nmoleの融合タンパク
質を含むはず）をとり、高速液体クロマトグラフ
イー装置（島津LC−4A）を用いInertsil−
ODS5μｍカラムで分離した。溶出は、0.1％トリ
フルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾配（15
％から50％）をかけることにより行つた。０から
２分までは、15％のアセニトリルを用い、２分か
ら32分までは、15％から50％のアセトニトリルの
直線濃度勾配をかけた。その結果、第３図に示す
ような溶出曲線が得られた。試料注入後約22.5分
後のピーク画分を分離し、分離した溶出液をエバ
ホレーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し
溶媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプチド
を酸加水分解後、その10分の１をアミノ酸分析に
用いた。その結果、グルタミン＋グルタミン酸、
ロイシン、グリシン、リジン、メチオニン、フエ
ニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、
チロシン、およびバリンがそれぞれ、7.3、7.6、
7.7、7.0、3.3、7.0、3.5、6.9、9.2、3.1および
3.6nmoleずつ検出された。アミノ酸組成は、δ
−エンドルフインのそれと一致した。また、アミ
ノ酸分析に用いた標品は、約3.5nmole（約7.5μｇ）
のδ−エンドルフインを含んでいたことになる。
この結果から、精製均一化した融合タンパク質を
用いて、アルギニルエンドペプチダーゼ処理した
標品をHPLCを用いて分離することにより収率約
32％でδ−エンドルフインを回収できることが明
らかとなつた。融合タンパク質の精製の収率が約
46％であり、融合タンパク質からのδ−エンドル
フインの分離の収率が約32％であることから、大
腸菌がつくるδ−エンドルフインの単離収率が約
15％であると計算される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pENDD2の全塩基配列を示した図
であり、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だ
けを、5′末端から3′末端の方向に記述している。
図中符号は、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、
Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを
示している。図中番号は、pENDD2に２箇所存
在する制限酵素Cla切断認識部位のうち制限酵
素Hind切断部位に近い方のCla切断認識
部位の、5′−ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”を
１番として数えた番号を示している。第２図は、
pENDD2中に存在する融合タンパク質を暗号化
する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸
配列を示す図である。図中符号は、核酸塩基およ
びアミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシ
ンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、Alaはア
ラニンを、Argはアルギニンを、Asnはアスパラ
ギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cysはシステ
インを、Glnはグルタミンを、Gluはグルタミン
酸を、Glyはグリシンを、Hisはヒスチジンを、
Ileはイソロイシンを、Leuはロイシンを、Lysは
リジンを、Metはメチオニンを、Pheはフエニル
アラニンを、Proはプロリンを、Serはセリンを、
Thrはトレオニンを、Trpはトリプトフアンを、
Tyrはチロシンを、Valはバリンを示している。
図中番号は、１番目のアミノ酸であるメチオニン
を暗号化するATGコドンの“Ａ”を１番として
数えた番号を示している。第３図は、アルギニル
エンドペプチダーゼ処理した融合タンパク質試料
の高速液体クロマトグラムを示している。横軸は
試料注入後の時間を分単位で、縦軸は、220nｍ
の吸光度を任意単位で表現している。矢印で示し
たピークがδ−エンドルフインの溶出ピークであ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１大腸菌において安定に複製され、宿主である
大腸菌にトリメトプリム耐性及びアンピシリン耐
性を与えることができ、4682塩基対の大きさを有
し、下記において示されるDNA配列を有する新
規組換えプラスミドpENDD2。【表】【表】【表】【表】【表】２ pENDD2を含有する大腸菌。３ pENDD2を含有する大腸菌が生産し、下記
において示されるアミノ酸配列を有するジヒドロ
葉酸還元酵素−δ−エンドルフイン融合タンパク
質。【表】４ pENDD2を含有する大腸菌を培養し、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還
元酵素−δ−エンドルフイン融合タンパク質を、
培養菌体の無細胞抽出液から、メソトリキセート
結合アフイニテイカラムクロマトグラフイー、お
よび陰イオン交換カラムクロマトグラフイーを用
いて精製することを特徴とするジヒドロ葉酸還元
酵素−δ−エンドルフイン融合タンパク質の分離
精製方法。５ pENDD2を含有する大腸菌の生産するジヒ
ドロ葉酸還元酵素−δ−エンドルフイン融合タン
パク質を分離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元
酵素−δ−エンドルフイン融合タンパク質をタン
パク質分解酵素で消化した後、δ−エンドルフイ
ンを分離精製することを特徴とするδ−エンドル
フインの製造方法。