JPS63102698A - ロイシンエンケフアリンの製造方法 - Google Patents
ロイシンエンケフアリンの製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ペプチドホルモンの一種であるロイシンエン
ケファリン(L−チロシル(Tyr) −クリシル(G
ty )−グリシル(Gly) −L−フェニルアラニ
ル(Phe) −:[、−oイシン(Leu)のアミノ
酸配列より、なるペンタペプタイド)の製造方法に関す
るものである。本発明のロイシンエンケファリンの製造
方法の産業上の利用分野としては。
ケファリン(L−チロシル(Tyr) −クリシル(G
ty )−グリシル(Gly) −L−フェニルアラニ
ル(Phe) −:[、−oイシン(Leu)のアミノ
酸配列より、なるペンタペプタイド)の製造方法に関す
るものである。本発明のロイシンエンケファリンの製造
方法の産業上の利用分野としては。
医薬品工業等の分野に好適である。
従来の技術
ロイシンエンケファリンは9モルヒネ様鎮! 作用を示
す内因性ペプチドとして知られ、習慣性のない鎮痛剤ま
たは麻酔薬としての利用が期待される興味深いポリペプ
チドである。本発明の技術的背景としては、いわゆる遺
伝子操作技術がある。
す内因性ペプチドとして知られ、習慣性のない鎮痛剤ま
たは麻酔薬としての利用が期待される興味深いポリペプ
チドである。本発明の技術的背景としては、いわゆる遺
伝子操作技術がある。
遺伝子操作技術を利用したロイシンエンケファリンの製
造方法は、これまで報告がな(1本発明は全(新規な方
法である。ロイシンエンケファリンは5個のアミノ酸よ
りなるペプチドであることから、これに対応する遺伝子
を化学合成し、これを発現ベクターに導入し組換えプラ
スミドを作成し。
造方法は、これまで報告がな(1本発明は全(新規な方
法である。ロイシンエンケファリンは5個のアミノ酸よ
りなるペプチドであることから、これに対応する遺伝子
を化学合成し、これを発現ベクターに導入し組換えプラ
スミドを作成し。
大腸菌等の宿主に発現生産させることが容易にできるも
のと考えられる。しかしながら、短いペプチド等は、大
腸菌等の宿主自身のタンパク分解酵素により速やかに分
解されることから、遺伝子の発現効率を向上させても宿
主内に蓄積させることができない。このことを避けるた
めに、宿主内で安定に生゛産されるタンパクとの融合タ
ン・ぐりとして発現させることが行われる。この際、生
産された融合タンパクはもとのタンパクの生理活性を失
ってしまうことから分離精製等の上で聞届があった。既
に2本発明者らはこの問題を解消すべく研究を行い、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケファリン(以下、
DHFR−LEKと略す。)融合タンパク遺伝子を有す
る組換えプラスミドpBSFOLEK1を構築し、これ
をE、 coli宿主に導入しその発現に成功している
(昭和61年9月30日特許出願「新規組換えプラスミ
ドpBSFOLEKIJ)。また、プラスミドpBSF
OLEKi中は、 E、coli C600株に導入さ
れて安定状態に保たれ、pBSFOLEKlを含有する
E、coli C600株は微工研にFERM P−8
969として寄託されている。
のと考えられる。しかしながら、短いペプチド等は、大
腸菌等の宿主自身のタンパク分解酵素により速やかに分
解されることから、遺伝子の発現効率を向上させても宿
主内に蓄積させることができない。このことを避けるた
めに、宿主内で安定に生゛産されるタンパクとの融合タ
ン・ぐりとして発現させることが行われる。この際、生
産された融合タンパクはもとのタンパクの生理活性を失
ってしまうことから分離精製等の上で聞届があった。既
に2本発明者らはこの問題を解消すべく研究を行い、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケファリン(以下、
DHFR−LEKと略す。)融合タンパク遺伝子を有す
る組換えプラスミドpBSFOLEK1を構築し、これ
をE、 coli宿主に導入しその発現に成功している
(昭和61年9月30日特許出願「新規組換えプラスミ
ドpBSFOLEKIJ)。また、プラスミドpBSF
OLEKi中は、 E、coli C600株に導入さ
れて安定状態に保たれ、pBSFOLEKlを含有する
E、coli C600株は微工研にFERM P−8
969として寄託されている。
問題点及び発明の目的
しかしながら、プラスミドpBSFOLEK1を含有す
るE、 coliは本発明者らが開発したものであり。
るE、 coliは本発明者らが開発したものであり。
当該菌体を用いるロイシンエンケファリンの製造方法に
関しては全(未知であり、このことが問題であった。本
発明者は、プラスミドpBSFOLEK1を含有するE
、coliを用いることにより、ロイシンエンケファリ
ンを効率的に製造することを目的として、鋭意研究を行
い、プラスミドpBSFOLEK1を含有するE、co
liからまずDHFR−LEK融合タンパクを分離精製
し1次いで、精製して得られたD)(FR−LEK融合
タンパクをブロムシアンで処理し、高速液体クロマトグ
ラフィーによりロイシンエンケファリンを容易に分離精
製できることを明らかにし本発明を完成させた。
関しては全(未知であり、このことが問題であった。本
発明者は、プラスミドpBSFOLEK1を含有するE
、coliを用いることにより、ロイシンエンケファリ
ンを効率的に製造することを目的として、鋭意研究を行
い、プラスミドpBSFOLEK1を含有するE、co
liからまずDHFR−LEK融合タンパクを分離精製
し1次いで、精製して得られたD)(FR−LEK融合
タンパクをブロムシアンで処理し、高速液体クロマトグ
ラフィーによりロイシンエンケファリンを容易に分離精
製できることを明らかにし本発明を完成させた。
発明の構成
本発明に係わるDHFR−LEK融合タンパクは。
第1図に示されるように168個のアミノ酸より構成さ
れる。融合タンパクのアミノ末端側から162番目まで
は、 B、5ubt山Sのジヒドロ葉酸還元酵素の1〜
162番目までのアミノ酸配列と同一であり。
れる。融合タンパクのアミノ末端側から162番目まで
は、 B、5ubt山Sのジヒドロ葉酸還元酵素の1〜
162番目までのアミノ酸配列と同一であり。
164〜168番目の配列がロイシンエンケファリンの
配列である。163番目のアミノ酸はメチオニン(Me
t)であり、ブロムシアンで融合タンパクを処理するこ
とによりロイシンエンケファリンを切り出すことが可能
な構造である。融合タンパクの分子危は19.296で
ある。第1図には、DHFR−LEK融合タンパクを暗
号化するDNA配列も記述している。このDNA配列よ
りアミノ酸配列を決定することができた。
配列である。163番目のアミノ酸はメチオニン(Me
t)であり、ブロムシアンで融合タンパクを処理するこ
とによりロイシンエンケファリンを切り出すことが可能
な構造である。融合タンパクの分子危は19.296で
ある。第1図には、DHFR−LEK融合タンパクを暗
号化するDNA配列も記述している。このDNA配列よ
りアミノ酸配列を決定することができた。
DHFR−LEK融合タンパクは、pBSFOLEKl
を含有するE、coli C600の細胞中に生産され
る。
を含有するE、coli C600の細胞中に生産され
る。
DHFR−LEK融合タンパクは、pBSFOLEKl
を含有するE、coli C600をYT+Ap培地(
培地11中に5gのN a C1* 8 gのバクト
ドリプトン。
を含有するE、coli C600をYT+Ap培地(
培地11中に5gのN a C1* 8 gのバクト
ドリプトン。
5gのイーストエキス、及び50Ilogのアンピシリ
ンナトリウムを含む培地)で37°Cで培養し、対数増
殖期の終わりもしくは定常期に菌体を集め、これを破砕
し上滑(無細胞抽出液)を得て、この上清をイオン交換
カラムクロマトグラフィー及びそれに引き続(ゲルろ過
クロマトグラフィーにかけることにより高度に精製する
ことができる。これらカラムクロマトグラフィーによる
分離の際、溶出液を各フラクションに分け、目的のDH
FR−LEK融合タンパクが何処のフラクションに溶出
されてくるかを調べなければならないが、目的のDHF
R−LEK融合タンパクがジヒドロ葉酸還元酵素活性を
有することから、この酵素活性を測定することによって
溶出位置を知ることができる。ジヒドロ葉酸還元酵素活
性は、 0.05mMのジヒドロ葉酸、0.06mM
のNADPH(還元型ニコチンアミドジヌクレオチドホ
スフェ−) )、 12 rnMの2−メルカプトエ
タノール、50mMリン酸カリウム緩衝液、pH7,0
を含む反応液に酵素を加えて、37°Cで酵素反応に伴
って減少するジヒドロ葉酸とNADPHを、 340
nmの吸光度の減少の時間変化を測定することによって
行うことができる。上記の精製過程によりDHFR−L
EK融合タンパクを均一に精製することができる。
ンナトリウムを含む培地)で37°Cで培養し、対数増
殖期の終わりもしくは定常期に菌体を集め、これを破砕
し上滑(無細胞抽出液)を得て、この上清をイオン交換
カラムクロマトグラフィー及びそれに引き続(ゲルろ過
クロマトグラフィーにかけることにより高度に精製する
ことができる。これらカラムクロマトグラフィーによる
分離の際、溶出液を各フラクションに分け、目的のDH
FR−LEK融合タンパクが何処のフラクションに溶出
されてくるかを調べなければならないが、目的のDHF
R−LEK融合タンパクがジヒドロ葉酸還元酵素活性を
有することから、この酵素活性を測定することによって
溶出位置を知ることができる。ジヒドロ葉酸還元酵素活
性は、 0.05mMのジヒドロ葉酸、0.06mM
のNADPH(還元型ニコチンアミドジヌクレオチドホ
スフェ−) )、 12 rnMの2−メルカプトエ
タノール、50mMリン酸カリウム緩衝液、pH7,0
を含む反応液に酵素を加えて、37°Cで酵素反応に伴
って減少するジヒドロ葉酸とNADPHを、 340
nmの吸光度の減少の時間変化を測定することによって
行うことができる。上記の精製過程によりDHFR−L
EK融合タンパクを均一に精製することができる。
精製したDHFR−LEK融合タンパクを凍結乾燥し、
これを1〜10■タンパク/−となるように7096蟻
偕を加え、溶かした後、タンパクの約20倍量の結晶ブ
ロムシアンを加え密栓し、室温(実施例では37°C)
で24時間反応させる。反応液を凍結乾燥し過剰の試薬
を除(。乾燥試料を1〜10rr@タンパク/dとなる
ように7096蟻酸に溶かす。溶かした試料を逆相高速
液体クロマトグラフィー装置(島原LC−6A)、を用
いて、ヌクレオシル5018カラム(4X 150mm
)にかけ。
これを1〜10■タンパク/−となるように7096蟻
偕を加え、溶かした後、タンパクの約20倍量の結晶ブ
ロムシアンを加え密栓し、室温(実施例では37°C)
で24時間反応させる。反応液を凍結乾燥し過剰の試薬
を除(。乾燥試料を1〜10rr@タンパク/dとなる
ように7096蟻酸に溶かす。溶かした試料を逆相高速
液体クロマトグラフィー装置(島原LC−6A)、を用
いて、ヌクレオシル5018カラム(4X 150mm
)にかけ。
17.5%アセトニトリルを含む0.2Mリン酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液(pH3,0)でl rut
/minの流速で溶出し9分離することができる。溶出
物は220nmにおける吸光度測定することにより検出
することができ、この条件においてロイシンエンケファ
リンは試料注入10分後に単一なピークで溶出される。
チルアンモニウム緩衝液(pH3,0)でl rut
/minの流速で溶出し9分離することができる。溶出
物は220nmにおける吸光度測定することにより検出
することができ、この条件においてロイシンエンケファ
リンは試料注入10分後に単一なピークで溶出される。
ロイシンエンケファリンを融合していないもとのジヒp
口葉酸還元酵素を同様の処理をして、上記逆相高速液体
クロマトグラフィーで分析したところロイシンエンケフ
ァリンの溶出位置には何等の溶出物も検出されない。本
発明の実施例では、31の培地から湿重量的13gの菌
体が得られ、この菌体(計算上約28.6111gのD
HFR−LEK融合タンパク、約0.83mgのロイシ
ンエンケファリンを含む)から約4.8■のDHFR−
LEK融合タンパク(収率16.8%)を精製して得る
ことができ、4.8tOg(7)精製DHFR−LEK
融合タンパクをブロムシアンで分解し、これを逆相高速
液体クロマトグラフィーで精製することにより約0、0
45mgのロイシンエンケファリン(1[15,4%)
を分離することができた。
口葉酸還元酵素を同様の処理をして、上記逆相高速液体
クロマトグラフィーで分析したところロイシンエンケフ
ァリンの溶出位置には何等の溶出物も検出されない。本
発明の実施例では、31の培地から湿重量的13gの菌
体が得られ、この菌体(計算上約28.6111gのD
HFR−LEK融合タンパク、約0.83mgのロイシ
ンエンケファリンを含む)から約4.8■のDHFR−
LEK融合タンパク(収率16.8%)を精製して得る
ことができ、4.8tOg(7)精製DHFR−LEK
融合タンパクをブロムシアンで分解し、これを逆相高速
液体クロマトグラフィーで精製することにより約0、0
45mgのロイシンエンケファリン(1[15,4%)
を分離することができた。
次に本発明の実施例を示す。
実施例
プラスミドpBSFOLEK1を含有するE、(oli
C600株からのDHFR−LEK融合タンパクの精製
及びタンパクの性質。
C600株からのDHFR−LEK融合タンパクの精製
及びタンパクの性質。
プラスミドpBSFOLEK1を含有するE、coli
C600株(FEPM P−8969として微工研に
寄託)を3子の50rng/lのアンピシリンナトリウ
ムを含む栄養培地(ll中に、5gのNaC1,8gの
バクトペプトン、5gのイーストエキスを含む液体培地
、pH7,4)中で37℃で一晩培養後、菌体を遠心分
離により集めた。湿重量的13gの菌体が得られた。菌
体を20−の0.1mMのジチオトレイトール(DTT
)及び0.1mMのエチレンジアミン4酢酸2ナトリウ
ム(EDTA)を含む10mMリン酸カリウム緩衝液p
H7,0に懸濁し、超音波破砕により沸胞を破砕した後
、 20.000回転/分、1時間の遠心分離により上
清25m1を得た。
C600株(FEPM P−8969として微工研に
寄託)を3子の50rng/lのアンピシリンナトリウ
ムを含む栄養培地(ll中に、5gのNaC1,8gの
バクトペプトン、5gのイーストエキスを含む液体培地
、pH7,4)中で37℃で一晩培養後、菌体を遠心分
離により集めた。湿重量的13gの菌体が得られた。菌
体を20−の0.1mMのジチオトレイトール(DTT
)及び0.1mMのエチレンジアミン4酢酸2ナトリウ
ム(EDTA)を含む10mMリン酸カリウム緩衝液p
H7,0に懸濁し、超音波破砕により沸胞を破砕した後
、 20.000回転/分、1時間の遠心分離により上
清25m1を得た。
得られた上滑のジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定したと
ころ、144ユニツト/d (全活性3.600ユニツ
ト)という値であった。上滑を、DEAE−トヨパール
650Mカラム(25cm x 150cm、約7
5cm)に吸着させ、0から100mMのKC1濃度勾
配をかけ溶出した。約11rLlずつフラクションを集
め、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定し、酵素活性を有
する両分を集めた。25ゴの酵素液が得られた(回収活
性1.837ユニツト、収率51%)。
ころ、144ユニツト/d (全活性3.600ユニツ
ト)という値であった。上滑を、DEAE−トヨパール
650Mカラム(25cm x 150cm、約7
5cm)に吸着させ、0から100mMのKC1濃度勾
配をかけ溶出した。約11rLlずつフラクションを集
め、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定し、酵素活性を有
する両分を集めた。25ゴの酵素液が得られた(回収活
性1.837ユニツト、収率51%)。
これをアミコン限外ろ過装置を用いて約1−にまで濃縮
し、トヨパールHW55カラムクロマトグラフィーによ
り分画した。約1 mlずつフラクションを集め、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素活性を測定し。
し、トヨパールHW55カラムクロマトグラフィーによ
り分画した。約1 mlずつフラクションを集め、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素活性を測定し。
酵素活性のピーク画分を集めた(約3,7mJ、回収活
性 605ユニツト、収率16.8%、回収タンパク
4.8■)。得られた酵素タンパクをSDS電気泳動法
により分析したところ、均一であり、ラクトアルブミン
、トリプシンインヒビター、トリプシノーゲン、カーボ
ニックアンヒドラーゼ、グリセルアルデヒド−3リン酸
デヒドロゲナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミ
ンを分子量マーカーとして精製DHFR−LEKrA合
タンパクの分子量を推定したところ19.000であり
、塩基配列から予想される分子量19.296と一致し
た値であった。
性 605ユニツト、収率16.8%、回収タンパク
4.8■)。得られた酵素タンパクをSDS電気泳動法
により分析したところ、均一であり、ラクトアルブミン
、トリプシンインヒビター、トリプシノーゲン、カーボ
ニックアンヒドラーゼ、グリセルアルデヒド−3リン酸
デヒドロゲナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミ
ンを分子量マーカーとして精製DHFR−LEKrA合
タンパクの分子量を推定したところ19.000であり
、塩基配列から予想される分子量19.296と一致し
た値であった。
精製したDHFR−LEK融合タンパクをエンザイムイ
ムノアッセイにより測定したところ、ロイシンエンケフ
ァリンに対する抗体と反応し、化学合成したロイシンエ
ンケファリンによって抗原−抗体反応が競争的に阻害さ
れることが明らかとなった。
ムノアッセイにより測定したところ、ロイシンエンケフ
ァリンに対する抗体と反応し、化学合成したロイシンエ
ンケファリンによって抗原−抗体反応が競争的に阻害さ
れることが明らかとなった。
精製したDHFR−LEK融合タンパク約4.8mgを
凍結乾燥した後、2.QmJの7096蟻酸に溶かした
。これに1001′l11gの結晶ブロムシアンを加え
密封して37°Cで、24時間振とうし反応させた。反
応液を凍結乾燥し、これを1.45m1の70%蟻酸に
溶解した。この溶液を0.05mJとり、逆相高速液体
クロマトグラフィー装置(島原LC−6A)を用い、ヌ
クレオシル5C18カラム(4x 150mm)ニか
1,17.5%アセトニトリルを含む0.2おける吸光
度を測定することにより行ったところ第2図に示すよう
な溶出曲線が得られた。化学合Jfflしたロイシンエ
ンケファリンを同様に分析したところ、約10分の所に
溶出することが示された。
凍結乾燥した後、2.QmJの7096蟻酸に溶かした
。これに1001′l11gの結晶ブロムシアンを加え
密封して37°Cで、24時間振とうし反応させた。反
応液を凍結乾燥し、これを1.45m1の70%蟻酸に
溶解した。この溶液を0.05mJとり、逆相高速液体
クロマトグラフィー装置(島原LC−6A)を用い、ヌ
クレオシル5C18カラム(4x 150mm)ニか
1,17.5%アセトニトリルを含む0.2おける吸光
度を測定することにより行ったところ第2図に示すよう
な溶出曲線が得られた。化学合Jfflしたロイシンエ
ンケファリンを同様に分析したところ、約10分の所に
溶出することが示された。
サラに、ブロムシアン処理したDHFR−LEKM合タ
ンパクと化学合成したロイシンエンケファリンを混合し
て、同様に逆相高速液体クロマトグラフィーで分析した
ところ、第2図と同様の溶出曲線で且つ約10分の所の
溶出ピークが高(なった溶出曲線が得られた。また、ロ
イシンエンケファリンを融合していないものとのジヒド
ロ葉酸還元酵素を同様の処理をして、上記逆相高速液体
クロマトグラフィーで分析したところロイシンエンケフ
ァリンの溶出位置(約10分の位置)には溶出物ピーク
が現われなかった。以上の結果、ブロムシアン処理した
DHFR−LEK融合タンパク溶液中に、ロイシンエン
ケファリンが含まれていることが示された。
ンパクと化学合成したロイシンエンケファリンを混合し
て、同様に逆相高速液体クロマトグラフィーで分析した
ところ、第2図と同様の溶出曲線で且つ約10分の所の
溶出ピークが高(なった溶出曲線が得られた。また、ロ
イシンエンケファリンを融合していないものとのジヒド
ロ葉酸還元酵素を同様の処理をして、上記逆相高速液体
クロマトグラフィーで分析したところロイシンエンケフ
ァリンの溶出位置(約10分の位置)には溶出物ピーク
が現われなかった。以上の結果、ブロムシアン処理した
DHFR−LEK融合タンパク溶液中に、ロイシンエン
ケファリンが含まれていることが示された。
ブロムシアン処理したDHFR−LEK融合タンパク溶
液中のロイシンエンケファリン含量を測定するために、
既知の量(それぞれ0.167μg、0.33μg、
1.67μg、 2.4μg)の化学合成したロイシン
エンケファリンを量を変えて上記逆相高速液体クロマト
グラフィーにかけ、約10分の位置の溶出物ピークの高
さを測定し、検量線を作成した。検量線を用いて、第2
図のロイシンエンケファリンの溶出位置(約10分の位
置)のピークの高さから。
液中のロイシンエンケファリン含量を測定するために、
既知の量(それぞれ0.167μg、0.33μg、
1.67μg、 2.4μg)の化学合成したロイシン
エンケファリンを量を変えて上記逆相高速液体クロマト
グラフィーにかけ、約10分の位置の溶出物ピークの高
さを測定し、検量線を作成した。検量線を用いて、第2
図のロイシンエンケファリンの溶出位置(約10分の位
置)のピークの高さから。
ロイシンエンケファリン含量を測定したところ。
0.05mCの試料あたり1゜55μgのロイシンエン
ケファリンが含まれていることが明らかとなった。
ケファリンが含まれていることが明らかとなった。
この結果より、計算すると、最終的に得られたブロムシ
アン処理したDHFR−LEK 融合タンパク溶液が1
.45m/であることから、この試料中に0.045■
のロイシンエンケファリンが含まれていることが推定さ
れた。DHFR−LEK融合タンパクの精製過程におけ
る収率が16 896であり。
アン処理したDHFR−LEK 融合タンパク溶液が1
.45m/であることから、この試料中に0.045■
のロイシンエンケファリンが含まれていることが推定さ
れた。DHFR−LEK融合タンパクの精製過程におけ
る収率が16 896であり。
収量が4.8■であることから、出発E、coli菌体
。
。
湿重量13 g中にはDHFR−LEK融合タンパクが
約28.6■含まれていた計算になる。DHFR−LE
K融合タンパクの分子量が約19,000. ロイシ
ンエンケファリンの分子量が約550であることから+
E、coli菌体、湿重量13 g中には、ロイシン
エンケファリンに換算して約0.83■が含まれている
計算になる。この値を利用すると、最終的に0.045
■がロイシンエンケファリンとして得られたことから、
収率を5.4%と推定することができた。
約28.6■含まれていた計算になる。DHFR−LE
K融合タンパクの分子量が約19,000. ロイシ
ンエンケファリンの分子量が約550であることから+
E、coli菌体、湿重量13 g中には、ロイシン
エンケファリンに換算して約0.83■が含まれている
計算になる。この値を利用すると、最終的に0.045
■がロイシンエンケファリンとして得られたことから、
収率を5.4%と推定することができた。
第1図は、DHFR−LEK融合タンパクを暗号化する
部分の塩基配列及びタンパクのアミノ酸配列を示す図で
ある。図中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表わし、A
はアデニンを、Cはシトシンを、Gはグアニンを、Tは
チミンを、 Alaはアラニンを+ Argはアルギニ
ンを、Asnはアスパラギンを、 Aspはアスパラギ
ン酸を、 Cysはシスティンをl Ginはグルタミ
ンをl Gluはグルタミン酸を、 Gtyはグリシン
をtH4sはヒスチジンを、 Ileはイソロイシンを
、 I、euはロイシンを、 Lysはリジンを5
Metはメチオニンを、 Pheはフェニルアラニン
を、 proはプロリンを、−8etはセリンを。 Thrはトレオニンを、 Trpはトリプトファンを。 T y rはチロシンを+ Valはバリンを示してい
る。 図中番号は、一番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号
化するATGコドンの′A”を1番として数えた番号を
示している。 第2図は、ブロムシアン処理したDHFR−LEK融合
タンパクの逆相高速液体クロマトグラフィーでの溶出曲
線を示す図である。横軸は時間を分単位で、縦軸は22
0nm吸光度を相対的値で示している。
部分の塩基配列及びタンパクのアミノ酸配列を示す図で
ある。図中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表わし、A
はアデニンを、Cはシトシンを、Gはグアニンを、Tは
チミンを、 Alaはアラニンを+ Argはアルギニ
ンを、Asnはアスパラギンを、 Aspはアスパラギ
ン酸を、 Cysはシスティンをl Ginはグルタミ
ンをl Gluはグルタミン酸を、 Gtyはグリシン
をtH4sはヒスチジンを、 Ileはイソロイシンを
、 I、euはロイシンを、 Lysはリジンを5
Metはメチオニンを、 Pheはフェニルアラニン
を、 proはプロリンを、−8etはセリンを。 Thrはトレオニンを、 Trpはトリプトファンを。 T y rはチロシンを+ Valはバリンを示してい
る。 図中番号は、一番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号
化するATGコドンの′A”を1番として数えた番号を
示している。 第2図は、ブロムシアン処理したDHFR−LEK融合
タンパクの逆相高速液体クロマトグラフィーでの溶出曲
線を示す図である。横軸は時間を分単位で、縦軸は22
0nm吸光度を相対的値で示している。
Claims (1)
- プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coli
の生産するジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケファ
リン融合タンパクを分離精製し、これをブロムシアン分
解法により分解したのちロイシンエンケファリンを分離
精製することを特徴とするロイシンエンケファリンの製
造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61249259A JPS63102698A (ja) | 1986-10-20 | 1986-10-20 | ロイシンエンケフアリンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61249259A JPS63102698A (ja) | 1986-10-20 | 1986-10-20 | ロイシンエンケフアリンの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63102698A true JPS63102698A (ja) | 1988-05-07 |
JPH0370480B2 JPH0370480B2 (ja) | 1991-11-07 |
Family
ID=17190300
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61249259A Granted JPS63102698A (ja) | 1986-10-20 | 1986-10-20 | ロイシンエンケフアリンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63102698A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02258799A (ja) * | 1989-03-30 | 1990-10-19 | Agency Of Ind Science & Technol | 新規ジヒドロ葉酸還元酵素一成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質 |
-
1986
- 1986-10-20 JP JP61249259A patent/JPS63102698A/ja active Granted
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02258799A (ja) * | 1989-03-30 | 1990-10-19 | Agency Of Ind Science & Technol | 新規ジヒドロ葉酸還元酵素一成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0370480B2 (ja) | 1991-11-07 |
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Legal Events
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---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |