JPS63102698A - ロイシンエンケフアリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ペプチドホルモンの一種であるロイシンエン
ケファリン（Ｌ−チロシル（Ｔｙｒ）　−クリシル（Ｇ
ｔｙ　）−グリシル（Ｇｌｙ）　−Ｌ−フェニルアラニ
ル（Ｐｈｅ）　−：［、−ｏイシン（Ｌｅｕ）のアミノ
酸配列より、なるペンタペプタイド）の製造方法に関す
るものである。本発明のロイシンエンケファリンの製造
方法の産業上の利用分野としては。

医薬品工業等の分野に好適である。

従来の技術 ロイシンエンケファリンは９モルヒネ様鎮！　作用を示
す内因性ペプチドとして知られ、習慣性のない鎮痛剤ま
たは麻酔薬としての利用が期待される興味深いポリペプ
チドである。本発明の技術的背景としては、いわゆる遺
伝子操作技術がある。

遺伝子操作技術を利用したロイシンエンケファリンの製
造方法は、これまで報告がな（１本発明は全（新規な方
法である。ロイシンエンケファリンは５個のアミノ酸よ
りなるペプチドであることから、これに対応する遺伝子
を化学合成し、これを発現ベクターに導入し組換えプラ
スミドを作成し。

大腸菌等の宿主に発現生産させることが容易にできるも
のと考えられる。しかしながら、短いペプチド等は、大
腸菌等の宿主自身のタンパク分解酵素により速やかに分
解されることから、遺伝子の発現効率を向上させても宿
主内に蓄積させることができない。このことを避けるた
めに、宿主内で安定に生゛産されるタンパクとの融合タ
ン・ぐりとして発現させることが行われる。この際、生
産された融合タンパクはもとのタンパクの生理活性を失
ってしまうことから分離精製等の上で聞届があった。既
に２本発明者らはこの問題を解消すべく研究を行い、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケファリン（以下、
ＤＨＦＲ−ＬＥＫと略す。）融合タンパク遺伝子を有す
る組換えプラスミドｐＢＳＦＯＬＥＫ１を構築し、これ
をＥ、　ｃｏｌｉ宿主に導入しその発現に成功している
（昭和６１年９月３０日特許出願「新規組換えプラスミ
ドｐＢＳＦＯＬＥＫＩＪ）。また、プラスミドｐＢＳＦ
ＯＬＥＫｉ中は、　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００株に導入さ
れて安定状態に保たれ、ｐＢＳＦＯＬＥＫｌを含有する
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００株は微工研にＦＥＲＭ　Ｐ−８
９６９として寄託されている。

問題点及び発明の目的 しかしながら、プラスミドｐＢＳＦＯＬＥＫ１を含有す
るＥ、　ｃｏｌｉは本発明者らが開発したものであり。

当該菌体を用いるロイシンエンケファリンの製造方法に
関しては全（未知であり、このことが問題であった。本
発明者は、プラスミドｐＢＳＦＯＬＥＫ１を含有するＥ
、ｃｏｌｉを用いることにより、ロイシンエンケファリ
ンを効率的に製造することを目的として、鋭意研究を行
い、プラスミドｐＢＳＦＯＬＥＫ１を含有するＥ、ｃｏ
ｌｉからまずＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクを分離精製
し１次いで、精製して得られたＤ）（ＦＲ−ＬＥＫ融合
タンパクをブロムシアンで処理し、高速液体クロマトグ
ラフィーによりロイシンエンケファリンを容易に分離精
製できることを明らかにし本発明を完成させた。

発明の構成 本発明に係わるＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクは。

第１図に示されるように１６８個のアミノ酸より構成さ
れる。融合タンパクのアミノ末端側から１６２番目まで
は、　Ｂ、５ｕｂｔ山Ｓのジヒドロ葉酸還元酵素の１〜
１６２番目までのアミノ酸配列と同一であり。

１６４〜１６８番目の配列がロイシンエンケファリンの
配列である。１６３番目のアミノ酸はメチオニン（Ｍｅ
ｔ）であり、ブロムシアンで融合タンパクを処理するこ
とによりロイシンエンケファリンを切り出すことが可能
な構造である。融合タンパクの分子危は１９．２９６で
ある。第１図には、ＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクを暗
号化するＤＮＡ配列も記述している。このＤＮＡ配列よ
りアミノ酸配列を決定することができた。

ＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクは、ｐＢＳＦＯＬＥＫｌ
を含有するＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００の細胞中に生産され
る。

ＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクは、ｐＢＳＦＯＬＥＫｌ
を含有するＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００をＹＴ＋Ａｐ培地（
培地１１中に５ｇのＮ　ａ　Ｃ１＊　　８　ｇのバクト
ドリプトン。

５ｇのイーストエキス、及び５０Ｉｌｏｇのアンピシリ
ンナトリウムを含む培地）で３７°Ｃで培養し、対数増
殖期の終わりもしくは定常期に菌体を集め、これを破砕
し上滑（無細胞抽出液）を得て、この上清をイオン交換
カラムクロマトグラフィー及びそれに引き続（ゲルろ過
クロマトグラフィーにかけることにより高度に精製する
ことができる。これらカラムクロマトグラフィーによる
分離の際、溶出液を各フラクションに分け、目的のＤＨ
ＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクが何処のフラクションに溶出
されてくるかを調べなければならないが、目的のＤＨＦ
Ｒ−ＬＥＫ融合タンパクがジヒドロ葉酸還元酵素活性を
有することから、この酵素活性を測定することによって
溶出位置を知ることができる。ジヒドロ葉酸還元酵素活
性は、　　０．０５ｍＭのジヒドロ葉酸、０．０６ｍＭ
のＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドジヌクレオチドホ
スフェ−）　）、　　１２　ｒｎＭの２−メルカプトエ
タノール、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，０
を含む反応液に酵素を加えて、３７°Ｃで酵素反応に伴
って減少するジヒドロ葉酸とＮＡＤＰＨを、　　３４０
ｎｍの吸光度の減少の時間変化を測定することによって
行うことができる。上記の精製過程によりＤＨＦＲ−Ｌ
ＥＫ融合タンパクを均一に精製することができる。

精製したＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクを凍結乾燥し、
これを１〜１０■タンパク／−となるように７０９６蟻
偕を加え、溶かした後、タンパクの約２０倍量の結晶ブ
ロムシアンを加え密栓し、室温（実施例では３７°Ｃ）
で２４時間反応させる。反応液を凍結乾燥し過剰の試薬
を除（。乾燥試料を１〜１０ｒｒ＠タンパク／ｄとなる
ように７０９６蟻酸に溶かす。溶かした試料を逆相高速
液体クロマトグラフィー装置（島原ＬＣ−６Ａ）、を用
いて、ヌクレオシル５０１８カラム（４Ｘ　１５０ｍｍ
）にかけ。

１７．５％アセトニトリルを含む０．２Ｍリン酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液（ｐＨ３，０）でｌ　ｒｕｔ　
／ｍｉｎの流速で溶出し９分離することができる。溶出
物は２２０ｎｍにおける吸光度測定することにより検出
することができ、この条件においてロイシンエンケファ
リンは試料注入１０分後に単一なピークで溶出される。

ロイシンエンケファリンを融合していないもとのジヒｐ
口葉酸還元酵素を同様の処理をして、上記逆相高速液体
クロマトグラフィーで分析したところロイシンエンケフ
ァリンの溶出位置には何等の溶出物も検出されない。本
発明の実施例では、３１の培地から湿重量的１３ｇの菌
体が得られ、この菌体（計算上約２８．６１１１ｇのＤ
ＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパク、約０．８３ｍｇのロイシ
ンエンケファリンを含む）から約４．８■のＤＨＦＲ−
ＬＥＫ融合タンパク（収率１６．８％）を精製して得る
ことができ、４．８ｔＯｇ（７）精製ＤＨＦＲ−ＬＥＫ
融合タンパクをブロムシアンで分解し、これを逆相高速
液体クロマトグラフィーで精製することにより約０、０
４５ｍｇのロイシンエンケファリン（１［１５，４％）
を分離することができた。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 プラスミドｐＢＳＦＯＬＥＫ１を含有するＥ、（ｏｌｉ
Ｃ６００株からのＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクの精製
及びタンパクの性質。

プラスミドｐＢＳＦＯＬＥＫ１を含有するＥ、ｃｏｌｉ
Ｃ６００株（ＦＥＰＭ　　Ｐ−８９６９として微工研に
寄託）を３子の５０ｒｎｇ／ｌのアンピシリンナトリウ
ムを含む栄養培地（ｌｌ中に、５ｇのＮａＣ１，８ｇの
バクトペプトン、５ｇのイーストエキスを含む液体培地
、ｐＨ７，４）中で３７℃で一晩培養後、菌体を遠心分
離により集めた。湿重量的１３ｇの菌体が得られた。菌
体を２０−の０．１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ
）及び０．１ｍＭのエチレンジアミン４酢酸２ナトリウ
ム（ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐ
Ｈ７，０に懸濁し、超音波破砕により沸胞を破砕した後
、　２０．０００回転／分、１時間の遠心分離により上
清２５ｍ１を得た。

得られた上滑のジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定したと
ころ、１４４ユニツト／ｄ　（全活性３．６００ユニツ
ト）という値であった。上滑を、ＤＥＡＥ−トヨパール
６５０Ｍカラム（２５ｃｍ　　ｘ　　１５０ｃｍ、約７
５ｃｍ）に吸着させ、０から１００ｍＭのＫＣ１濃度勾
配をかけ溶出した。約１１ｒＬｌずつフラクションを集
め、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定し、酵素活性を有
する両分を集めた。２５ゴの酵素液が得られた（回収活
性１．８３７ユニツト、収率５１％）。

これをアミコン限外ろ過装置を用いて約１−にまで濃縮
し、トヨパールＨＷ５５カラムクロマトグラフィーによ
り分画した。約１　ｍｌずつフラクションを集め、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素活性を測定し。

酵素活性のピーク画分を集めた（約３，７ｍＪ、回収活
性　６０５ユニツト、収率１６．８％、回収タンパク　
４．８■）。得られた酵素タンパクをＳＤＳ電気泳動法
により分析したところ、均一であり、ラクトアルブミン
、トリプシンインヒビター、トリプシノーゲン、カーボ
ニックアンヒドラーゼ、グリセルアルデヒド−３リン酸
デヒドロゲナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミ
ンを分子量マーカーとして精製ＤＨＦＲ−ＬＥＫｒＡ合
タンパクの分子量を推定したところ１９．０００であり
、塩基配列から予想される分子量１９．２９６と一致し
た値であった。

精製したＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクをエンザイムイ
ムノアッセイにより測定したところ、ロイシンエンケフ
ァリンに対する抗体と反応し、化学合成したロイシンエ
ンケファリンによって抗原−抗体反応が競争的に阻害さ
れることが明らかとなった。

精製したＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパク約４．８ｍｇを
凍結乾燥した後、２．ＱｍＪの７０９６蟻酸に溶かした
。これに１００１′ｌ１１ｇの結晶ブロムシアンを加え
密封して３７°Ｃで、２４時間振とうし反応させた。反
応液を凍結乾燥し、これを１．４５ｍ１の７０％蟻酸に
溶解した。この溶液を０．０５ｍＪとり、逆相高速液体
クロマトグラフィー装置（島原ＬＣ−６Ａ）を用い、ヌ
クレオシル５Ｃ１８カラム（４ｘ　　１５０ｍｍ）ニか
１，１７．５％アセトニトリルを含む０．２おける吸光
度を測定することにより行ったところ第２図に示すよう
な溶出曲線が得られた。化学合Ｊｆｆｌしたロイシンエ
ンケファリンを同様に分析したところ、約１０分の所に
溶出することが示された。

サラに、ブロムシアン処理したＤＨＦＲ−ＬＥＫＭ合タ
ンパクと化学合成したロイシンエンケファリンを混合し
て、同様に逆相高速液体クロマトグラフィーで分析した
ところ、第２図と同様の溶出曲線で且つ約１０分の所の
溶出ピークが高（なった溶出曲線が得られた。また、ロ
イシンエンケファリンを融合していないものとのジヒド
ロ葉酸還元酵素を同様の処理をして、上記逆相高速液体
クロマトグラフィーで分析したところロイシンエンケフ
ァリンの溶出位置（約１０分の位置）には溶出物ピーク
が現われなかった。以上の結果、ブロムシアン処理した
ＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパク溶液中に、ロイシンエン
ケファリンが含まれていることが示された。

ブロムシアン処理したＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパク溶
液中のロイシンエンケファリン含量を測定するために、
既知の量（それぞれ０．１６７μｇ、０．３３μｇ、　
１．６７μｇ、　２．４μｇ）の化学合成したロイシン
エンケファリンを量を変えて上記逆相高速液体クロマト
グラフィーにかけ、約１０分の位置の溶出物ピークの高
さを測定し、検量線を作成した。検量線を用いて、第２
図のロイシンエンケファリンの溶出位置（約１０分の位
置）のピークの高さから。

ロイシンエンケファリン含量を測定したところ。

０．０５ｍＣの試料あたり１゜５５μｇのロイシンエン
ケファリンが含まれていることが明らかとなった。

この結果より、計算すると、最終的に得られたブロムシ
アン処理したＤＨＦＲ−ＬＥＫ　融合タンパク溶液が１
．４５ｍ／であることから、この試料中に０．０４５■
のロイシンエンケファリンが含まれていることが推定さ
れた。ＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクの精製過程におけ
る収率が１６　８９６であり。

収量が４．８■であることから、出発Ｅ、ｃｏｌｉ菌体
。

湿重量１３　ｇ中にはＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクが
約２８．６■含まれていた計算になる。ＤＨＦＲ−ＬＥ
Ｋ融合タンパクの分子量が約１９，０００．　　ロイシ
ンエンケファリンの分子量が約５５０であることから＋
　Ｅ、ｃｏｌｉ菌体、湿重量１３　ｇ中には、ロイシン
エンケファリンに換算して約０．８３■が含まれている
計算になる。この値を利用すると、最終的に０．０４５
■がロイシンエンケファリンとして得られたことから、
収率を５．４％と推定することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパクを暗号化する
部分の塩基配列及びタンパクのアミノ酸配列を示す図で
ある。図中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表わし、Ａ
はアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔは
チミンを、　Ａｌａはアラニンを＋　Ａｒｇはアルギニ
ンを、Ａｓｎはアスパラギンを、　Ａｓｐはアスパラギ
ン酸を、　Ｃｙｓはシスティンをｌ　Ｇｉｎはグルタミ
ンをｌ　Ｇｌｕはグルタミン酸を、　Ｇｔｙはグリシン
をｔＨ４ｓはヒスチジンを、　Ｉｌｅはイソロイシンを
、　　Ｉ、ｅｕはロイシンを、　　Ｌｙｓはリジンを５
Ｍｅｔはメチオニンを、　　Ｐｈｅはフェニルアラニン
を、　　ｐｒｏはプロリンを、−８ｅｔはセリンを。 Ｔｈｒはトレオニンを、　Ｔｒｐはトリプトファンを。 Ｔ　ｙ　ｒはチロシンを＋　Ｖａｌはバリンを示してい
る。 図中番号は、一番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号
化するＡＴＧコドンの′Ａ”を１番として数えた番号を
示している。 第２図は、ブロムシアン処理したＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合
タンパクの逆相高速液体クロマトグラフィーでの溶出曲
線を示す図である。横軸は時間を分単位で、縦軸は２２
０ｎｍ吸光度を相対的値で示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. プラスミドｐＢＳＦＯＬＥＫ１を含有するＥ．ｃｏｌｉ
   の生産するジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケファ
   リン融合タンパクを分離精製し、これをブロムシアン分
   解法により分解したのちロイシンエンケファリンを分離
   精製することを特徴とするロイシンエンケファリンの製
   造方法。