JPH02504588A

JPH02504588A - ウロキナーゼ化合物の回収

Info

Publication number: JPH02504588A
Application number: JP1507108A
Authority: JP
Inventors: エドマンズ，ティモシー; フォレー，スーザン・エフ
Original assignee: デイモン・バイオテック・インコーポレーテッド
Priority date: 1988-06-10
Filing date: 1989-05-25
Publication date: 1990-12-27
Anticipated expiration: 2013-12-09
Also published as: US4920051A; AU618381B2; EP0379545B1; DE68911503D1; WO1989012099A1; AU3839189A; EP0379545A4; DE68911503T2; CA1309961C; EP0379545A1; JP2833811B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ウロキナーゼ化合物の回収〔技術分野〕本発明はクロマトグラフィー樹脂を用いる培養培地または細胞抽出物のごとき溶液からの酵素的に活性なウロキナーゼおよびプロウロキナーゼの回収法に関する。本発明は本来免疫グロブリンを選択的に結合する為に開発された樹脂の一種がプロウロキナーゼおよびウロキナーゼを結合し、および選択的に溶出でき、およびそれ故プロウロキナーゼおよびウロキナーゼを含む溶液からこれらのタンパク質の商業的大規模精・製に有用であることが発見されたことに基づいている。

〔背景技術〕

ウロキナーゼは致死的となりうる血栓症を破壊するカスケード＊楕を開始する為の有用な繊維素溶解剤である。ウロキナーゼは約３２，０００−３４，０００ダルトンの分子量およびｗｇタンパク質当り約２５０，０００　ＣＴＡ単位の比活性を持っ二鎖糖タンパク質である。それは酵素的に不活性なプロウロキナーゼの酵素的に活性な切断生成物である。プロウロキナーゼは約４５．０００−５５　、０００ダルトンの分子量を持つ単鎖糖タンパク質である。ウロキナーゼと異ってプロウロキナーゼは活性ではないが、血栓部位に特異的である。プラスミンがその部位でプロウロキナーゼを酵素的に活性なウロキナーゼへ切断する。

両方の型が尿から多くの方法で単離されている。１つの方法ではウロキナーゼ含有沈殿の形成を起こす試薬（例えばベントナイトまたは他のゲイ酸アルミニウム）で尿を処理し、次に沈殿からウロキナーゼを溶出する。他の方法では尿を吸着剤と接触させ、続いて吸着剤から溶出する。この目的に使用される既知の吸着物質としては例えば炭酸カルシウム、硫酸バリウム。

酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、水酸化亜鉛、活性炭素および水和ケイ酸アルミニウムが挙げられる０種々の陽イオン交換樹脂もまたこの目的に有用である（例えば、Ｕ　Ｓ２，９８３，６４７゜Ｕ　Ｓ　２，９８９，４４０）　。

例えばＤＥＡＥセルロース樹脂またはメタクリル−カルボン酸型の架橋デキストランゲルを使用する排他クロマトグラフィー法も実施されてきた（例えば、Ｕ　Ｓ３，２５６，１５８）。そのような方法においては樹脂は不純物タンパク質および発熱物質を結合し、ウロキナーゼを溶液に残している。

より最近、珪藻土、アガロース、セルロース、コラーゲンおよび他の吸着剤のごとき水不溶性固体支持物に結合または接着したウロキナーゼに親和性を持つ種々の試薬を用いてアフィニティークロマトグラフ法が実行されている。親和性試薬には塩基性アミノ酸、アグマチン、アプロチニン、グアニジンおよびアデニンの誘導体、フィブリンおよび多くの他者の中でウロキナーゼを認識する抗体が含まれる。

種々の電気泳動的およびＨＰＬＣ的手段による精製も試みられている。

臨床的に価値のある量のウロキナーゼ化合物を得る試みにおいては、これらのタンパク質を産生ずることが知られている細胞（例えば腎臓および肺）が丘とトロで培養されている。それらの細胞にはヒトおよびミドリザルまたはアカゲザル胎児および成人腎臓、成人および胎児肺、成人および胎児心臓、胎盤。

成ｌＩ、甲状腺、膵臓および尿管が含まれている。しかしながら、誘導剤（例えば、種々のアミノ酸、サツカリド、ホルモン、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸および／またはグリコール酸）を培養培地に濃厚することによる生成の増加、またはタンパク質分解および変性の減少（例えば金属キレート剤、プロナーゼおよびトリプシンインヒビターにより）の試みにもかかわらずこれらの細胞の培養培地から得られる収量はいまだ多くない。ウロキナーゼ存在下非ヒト、混血動物に前もって移植し繁殖させたウロキナーゼ産生リンパ球ハイブリドーマ細胞の培養により培養細胞のウロキナーゼ産生を増加させるための更なる試みがなさｉｌている（Ｕ　、　Ｓ　、４，５３７，８５２＞。しかしながら、この方法は実行するのに高価で時間がかかる。

組換えＤＮＡ技術の出現により、多量のプロウロキナーゼを産生ずるように遺伝子操作されている細胞株が開発され培養されたやこれらの細胞株には大腸菌、酵母、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびニューロスボ″′″（７）のごとき微生物およびサルおよびヒトの腎臓細胞およびＷ！維芽細胞を含む哺乳類細胞株が含まれる。発現されたプロウロキナーゼは細胞抽出物またはそれが分泌されてきた液体増殖培地から活性型で回収されなければならない。回収は本質的には尿からの精製のために前に説明したものと同じ方法論により達成された。

培養培地からの回収は、そのような培地は典型的には多くの他の閏停ないタンパク質（そのいくつかはタンパク質分解活性を持っている）を含んでいるのでかなりやっかいな仕事となる。

例えば血清補給培地はプロウロキナーゼを容易に分解するプラスミンおよび他の血清プロテアーゼを含んでいることが知られている。金属キレート剤および種々のプロテアーゼ阻害剤の添加による保護の試みにもかかわらず、はとんどの既知の精製法は適切にウロキナーゼ化合物を保護することができない、前に説明したごとく、これらの予防措置はせいぜい部分的保護を与えるだけである。従って既知の回収方法は血清を含まない溶液（それらは役に立たないが）からウロキナーゼ化合物を単離するのに使用した場合最も効果的であり、潜在的に毒要素を導入しているかもしれない、加えて、免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いる精製方法は商業的要求まで規模を拡げた場合全く高価なものになるであろう。

それ故、商業量のウロキナーゼ化合物を酵素的に活性な形で産生するためにはそれが分解される前に培地から効果的、能率的および迅速に回収する大規模精製法が必要とされる。

従って、本発明の目的はウロキナーゼ含有溶液からウロキナーゼ化合物を単離する迅速で単純および商業的に実行可能な方法を提供する事である。別の目的は培養培地からウロキナーゼ化合物を精製する方法を提供することである。さらに別の目的は、ウロキナーゼ化合物含有溶液から実質的に他の非関連タンパク質を含んでいない未分解ウロキナーゼ化合物を回収する方法を提供することである。血清補給培地中に存在する他のタンパク質からウロキナーゼ化合物を分離する方法を提供するのも本発明の目的である。ウロキナーゼ化合物含有医薬処方の大規模商業生産に有用量の未分解ウロキナーゼ化合物を回収する方法を提供するのも更なる目的である。

〔発明の開示〕

ｌ肌へｉ扛免疫グロブリンを精製するのに使用される種類のクロマトグラフィー樹脂がプロウロキナーゼ−およびウロキナーゼ−含有溶液からプロウロキナーゼおよびウロキナーゼを回収するのに有用であることが発見された（“プロウロキナーゼ、“ ウロキナーゼ”およびそれらの混合物をここでは以後“ウロキナーゼ化合物”と称する）、特に、多陰イオン基を持つ共有結合的結合ポリマーを合むシリカ様マトリックスが驚くべきことに溶液中の多くの他のタンパク様成分に優先してウロキナーゼを結合し、ウロキナーゼ化合物に富んだ分画を選択的に溶出することを可能にすることが発見された。そのようなマトリックスの単一バッチまたはクロマトグラフィー法での使用により、゛血清を含まないおよび血清補給液体培養培地、ウロキナーゼを合成し細胞内に蓄積している細胞の抽出物、およびアルブミンプロテアーゼ。

免疫グロブリンおよび種々の他のタンパク質を含むウロキナーゼ分解条件にウロキナーゼ化合物が接触するであろう時間を最短にすることにより、ウロキナーゼ化合物含有溶液からのウロキナーゼ化合物の回収を促進できる。それらの他のタンパク質からのウロキナーゼ化合物の速かな分離はウロキナーゼ化合物がその中の分、解性要素と接触する時間を最短にする。

すべての態様において、本発明はウロキナーゼ化合物含有タンパク様成分からウロキナーゼ化合物を回収する方法を提供する。この方法はウロキナーゼ化合物含有溶液を粒子状のシリカ様マトリックスと接触させ（ウロキナーゼ化合物のマトリックスへの結合の助けとなる条件下）、非結合タンパク質をマトリックスから分離し、それから結合ウロキナーゼ化合物を放出することを含んでいる。マトリックスは多陰イオン基を持つ共有結合性結合ポリマーから成る。

１つの態様において、本発明は血清が補給された培地も含む培養培地からウロキナーゼ化合物を回収する方法を提供する。

血清はこの発明で使用される種類のマトリックスへ結合することが知られている免疫グロブリンおよびウロキナーゼ化合物を分解する能力を持つ血清プロテアーゼを含んでいる。しかしながら本発明で使用されるマトリックス物質は以下に説明する選択的結合および溶出により有害なプロテアーゼ、アルブミンおよび他のタンパク質からウロキナーゼ化合物を容易に分離することを可能にする。

本発明の方法はウロキナーゼ化合物含有溶液をクロマトグラフィー技術を用いてマトリックス上を通過させることにより実施される、即ちカラム中にマトリックスを配置し、試料を詰め、洗浄し、続いて採取する。もしくはマトリックス物質およびウロキナーゼ化合物含有溶液を一緒に混合する固相バッチ抽出技術を用いても本方法を実施できる。

本発明のマトリックスの固体相に共有結合で結合しているポリマーは、例えばカルボン酸基のごときぶらさがった陰イオン基を含むポリエチレンバックボーンである。好適な実施態様においては、ポリマーはカルボキシル化されたポリエチレンイミノアルキルトリアルコジキシランを含み、最も好適にはカルボンキシル化されたポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシランを含む、シラン基は反応活性でシリカマトリックス上の遊離の水酸基と共有結合的に結合するやこの実施態様においてマトリックスは粒子状の細孔のあるガラスまたはシリカと約４００から約１８００ダルトンの範囲の分子量を持つカルボキシル化ポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシランボリマーとの反応生成物である。ガラスは約３５から１８０ミクロンの範囲の平均粒子直径を持ち、約４０から１０００オングストロームの範囲の平均細孔サイズを持っているであろう、もしくはシリカは約３から７０ミクロンの範囲の平均粒子径および約５０から１０００オングストロームの平均細孔サイズを持っているであろう。

本発明の好適な態様においてはマトリックス物質はマトリックス物質ダラム当り、約０．３から１．２ミリ当り当量のカルボキシを含んでいる。

１つの実施態様においては、本発明の接触工程は約４．０から６．０、しかし好適には約５．６のｐＨで実施される。放出工程は６．０以上のｐＨおよび約２５０＠Ｍまたはそれ以上のイオン強度（好適には約５００ｍＭ）で実施される。放出工程はまた約４．０より低いｐＨｒも実施されるであろう、接触および放出の両工程とも本発明の好適な態様においてはイプシロンアミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）および界面活性剤の存在下に実施されるであろう。

本発明の方法を実施することにより、マトリックス物質と接触させたウロキナーゼ化合物含有溶液中のウロキナーゼの９０％またはそれ以上がしばしば回収できる。

区＠１１１に監本発明の前記のおよび他の目的は（発明自身同様にその種々の様相）、付随する図と一緒に以下の説明を読むとより十分に理解されよう。

図１はＡＢｘカラム上条件付け、血清補給増殖培地のクロマトグラフィーにより得られた分画の代表的クーマシープル染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルである。レーン１は低分子量標準品を含み；レーン２は未濾過出発物質を含み；レーン３はカラムに充填した一過出発物質を含み；レーン４はフロースルーを含み；レーン５はｗｔ衝液Ａ洗浄物を含み：レーン６は２０％緩衝液Ｂを含む緩衝液Ａでの洗浄により得られる溶出物を含み；レーン７は１００％緩衝液Ｂでの展開により得られる分画１溶出物を含み；レーン８は同じ１００％緩衝液Ｂでの展開により得られる分画２溶出物を含み；レーン９は同じ１００％緩衝液Ｂでの展開により得られる分画３溶出物を含み；レーン１０は１００％緩衝液Ｃ洗浄により得られる溶出物を含んでいる。

図２はＡＢｘカラム上条件付け、血清無しの増殖培地のクロマトグラフィーにより得られた分画の代表的クーマシーブルー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルである。レーン１は低分子量の標準品を含み；レーン２は未濾過出発物質；レーン３はカラムに充填した一過出発物質を含み；レーン４はフロースルーを含み；レーン５は緩衝液Ａ洗浄物を含み：レーン６は２０％緩衝液Ｂを含む緩衝液Ａによる洗浄で得られる溶出物を含み；レーン７は１００％緩衝液Ｂでの展開による分画１溶出物質を含み；レーン８は同じ１００％緩衝液Ｂでの展開による分画２溶出物を含み；およびレーン９は１００％緩衝液Ｃでの展開により得られる溶出物を含んでいる。

〔発明を実施する為の最良の形態〕

ウロキナーゼ化合物含有溶液から未分解のウロキナーゼ化合物を回収する効率的方法が考案され、それは単純、有効であり費用がかからない。

本方法は免疫グロブリンの精製および分離に以前使用されていた種類の既知の樹脂（米国特許第４，６０６，８２５号参照）がウロキナーゼ化合物の優先的結合、および分離された溶出に使用できるという予期されなかった発見を利用したアフィニティークロマトグラフィーおよび抽出法を使っている。簡単に記すと、本方法はウロキナーゼ化合物含有溶液と樹脂をタンパク質結合を助ける条件下接触させ、未結合タンパク質を樹脂から分離し、およびそれから結合ウロキナーゼ化合物を放出させることを特徴としている。本方法はウロキナーゼ化合物を単独でまたは他のタンパク質との混合物として含んでいる任意の溶液からのウロキナーゼの回収に使用できる９そのような溶液としては、例えばプロウロキナーゼを発現するくしかしそれを分泌はしない）細胞の抽出物および血清が補給されたまたは血清を含まない培養培地が挙げられる９図１および２に示されているＳＤＳポリアクリルアミドゲルは血清アルブミンを含む培地の他のタンパク質構成物からウロキナーゼ化合物をきれいに精製できる本方法の能力を示している。

精製過程に使用するのに適した分離物質の種類はシリカゲルまたはガラスピーズから構成されるごとき粒子状シリカ様マトリックスが挙げられる。これらの成分粒子回収法を実施するのに有用であることが知られている任意の大きさでよい。

しかしながら、約３から約７０ミクロンの範囲の直径を持つシリカ粒子、および約３５から約１８０ミクロンの範囲の直径を持つガラスピーズが好適である。約４０ミクロンの平均粒子径が本発明の実施には最も有用である０粒子はまた多孔性であり、シリカゲルは約５０から１０００オングストロームの範囲の好適な細孔直径を持ち、ガラスピーズは約４０から１０００オングストロームの範囲の好適な細孔直径を持つ。

シリカ様粒子に５陰イオン基を持つ１つまたはそれ以上のポリマーが結合している。好適なポリマーはカルボキシラードで誘導体化されたポリエチレンである。

ポリマーは好適にはシラン基を通してマトリックスへ結合され、それ故末端に反応活性のシラン基を持つカルボキシル化ポリエチレンが分離マトリックスの産生に使用される。好適なポリマーはポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシランのごときカルボキシル化ポリエチレンイミノアルキルシランである。ポリマーの分子量は一般に約３００から約２，０００ダルトンまたはそれ以上の範囲であろう。全体で負の荷電を持つ多くの異った化学側基が有用であろうが、最も好適な陰イオン基はカルボキシラード基である。約０．３から約１．２のカルボキシ当量を含む誘導体化マトリックス物質が本発明の方法を有効に実施するのに最も望ましい樹脂である。

本発明に有用な現在好適なマトリックス物質はＪ、Ａ、ベーカーケミカルカンパニー、フィリップスバーグ、Ｎ、Ｊ、から商標Ｂ　Ａ　Ｋ　Ｅ　ＲＢ　ＯＮ　Ｄ　Ａ　Ｂ　ｘＴ”の名で販売されている。この物質はカルボキシル化ポリエチレンイミンポリマーで誘導化された４０ミクロンの平均粒子径を持つシリカゲルから成っている。

この好適な物質の製造方法およびその構造についての更なる詳細は米国特許第４，５４０，４８６号に記載されており、その記載はここに参照文献として包含されている。

本発明の方法の接触工程は誘導体化マトリックスの荷電基が溶液と接触するようになる任意の方法で実施されるであろう。

接触工程を実施する１つの好適な方法はウロキナーゼ含有溶液がマトリックスを移行するおよび通り抜けるＨＰＬＣまたは伝統的な低圧液体クロマトグラフィーのごときクロマトグラフィー的分離技術を使用することである。このことは結合の助けとなる緩衝液で（平衝緩衝液）で前もって平衡化したマトリックスをクロマトグラフィー用カラムに前もって充填し、ウロキナーゼ含有溶液を注いでそれを通すことにより達成できる。

他の接触工程は固相抽出法を使用し、それによるとウロキナーゼ含有溶液をマトリックスと一緒に混合し、２相混合物を形成させる。液体および固体相を分離し、マトリックス物質を追加の平衡緩衝液中に再懸濁して無関俤に結合したタンパク質をそれから除去する。

両方の場合とも接触工程は溶液中誘導体化マトリックスのウロキナーゼ化合物の結合な可能にする条件下実施しなければならない。係合はマトリックスおよびウロキナーゼ化合物の反対に荷電した基の引力および相互作用の結果であるらしい。それ故、ウロキナーゼ化合物およびマトリックスの荷電された性質と保つ条件が成功の為には重要である。そのような条件はウロキナーゼ化合物およびマトリックスを適したｐＨおよびイオン強度の溶液へさらすことにより達成されるであろう０例えば、プロウロキナーゼ産生細胞の培養に使用されウロキナーゼ化合物を含んでいる増殖培地（条件付は培地）は最終ｐＨがウロキナーゼ結合と一致するように酸で調整される。さらに条件付は培地は細胞破片を除去するため濾過され、タンパク質を凝集させない為に例えばトウィーン−８０（シグマケミカルカンパニー）のごとき界面活性剤を補給される、結合のための好適な条件は約４．０および約６．０の間のｐＨを持つ（約５．６のｐＨが最も好適である）溶液または平衡緩衝液を使用することである。

結合タンパク質を含むマトリックスは次に洗浄しく平衡緩衝液で）無関係のタンパク質および他の夾雑物を除去する。

ウロキナーゼ放出工程はマトリックスからの結合ウロキナーゼ化合物の最も効率良い除去を促進するためイオン強度およびｐＨの特異的条件下実施されねばならない、この工程はマトリックスに結合されているつ６キナ一ゼ化合物をその放出を起こす溶液（即ち溶出緩衝液）にさらすことにより実施されるであろう０例えば、その溶液を結合ウロキナーゼおよびマトリックス物質を含むカラムに注ぐかまたはバルクマトリックス物質との再懸濁に使用する。模範的溶液は約６．０より高いｐＨおよび約２５０５Ｍより高いイオン強度（５００＋＋＋Ｍのイオン強度が好適である）を持つ溶出緩衝液である。もしくは約４．０より低いｐＨを持つ緩衝液を用いてもウロキナーゼ化合物が溶出されるであろう。増加されたイオン強度を持つ１つ以上の溶出緩衝液もまた本発明の放出工程の間連続して使用される。

接触および放出工程の成功を促進するであろう条件下が設定され、例えばプロテアーゼ阻害剤として作用するイプシロンアミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）およびトウイーンー８０（シグマケミカルカンパニー）のごとき界面活性剤のウロキナーゼ化合物含有溶液および溶出液の両方への添加などが含まれる。

本発明の方法により溶液から回収されたウロキナーゼ化合物の量は例えば免疫検定または活性検定を含む多くの既知の検定法により決定されるであろう。

活性を測定するには、最初に不活性なプロウロキナーゼを酵素的に活性なウロキナーゼへ変換しなければならない。このことは例えばプラスミンのごときプロテアーゼにより達成できる。

プロテアーゼの作用は例えばアプロチニンのごとき阻害剤により休止される。残っているタンパク質はウロキナーゼであり、その酵素活性は例えばＳ−２４４４のごとき発色基質を用いて分光学的に測定される。

一般的に本発明の方法は粗抽出物のウロキナーゼ活性の９０％を越える回収が可能であり、その結果溶液は非常に高い酵素活性を持っている。

以下の実施例は例示の為に示されるものであり、本発明の対象を制限するものではない。

Ｋ１匹りこの実施例においては、プロウロキナーゼが１％胎児ウシ血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ）およびＩＯＫ　Ｉ単位／ｍｌのアプロチニンを含む典型的増殖培地から抽出されるやＡ、前処理：ヒトプロウロキナーゼを産生ずるカプセルに入れられた遺伝子工学による細胞が増殖培地中培養される、以後“条件付け”（例えばウロキナーゼ化合物含有）培地と称する０条件付けられた等張培地はＥＤＴＡ　（５餉Ｍ）およびトウィーン８０　（０，０１％）で処理される。培地は６Ｎ　ＨαでｐＨ５，６へ滴定され、−過して細胞破片を除去する。

Ｂ、クロマトグラフィー：７リツトルの前処理された条件付は培地を室温にてＡＢｘ（Ｊ。

Ｔ、ペイカーケミカルカンパニー、フィリプスバーグ、ＮＪ、粒子径４０ミクロン）を含むファルマシアにカラム（容量＝４１ｍｌ）上に注ぎ１０５ｃｙ／ｈｒで流す、カラムを１０カラム容量の平衡緩衝液Ａ　（１０輸Ｍモリホリエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、５ｅｓＭＥＤＴＡおよび０．０１％トウィーン８０．ｐＨ５，６）で洗浄し、次に１０カラム容量の２０％溶出緩衝液Ｂ　（５００ｍＭ　ＮａｏＡｃ、５ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、０．０１％トウィーン８０１ｐＨ７，０）／８０％緩衝液Ａで洗浄する。カラム上のタンパク質は８カラム容量の１００％緩衝液Ｂで溶出する。カラムは続いて１０カラム容量の緩衝液Ｃ（ＩＭＮａＯＡｅ、５重Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０１％トウィーン８０．ｐＨ７，０）で洗浄する。カラム溶出液は２ＳＯｎｅｉのＵＶ吸収によりモニターする。

Ｃ０電気泳動：条件付は培地およびカラム溶出物は精製の間の異った段階でＬａｅｍｍｌｉ（ネーシ−？　−（１９７０）２２７　：６８０−６８５）の方法に従ってドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析された。７．５％−２０，０％勾配ゲルは０．２５％クーマシーブルー、５０％メタノール、１０％酢酸で染色され、５０％メタノール、１０％酢酸で脱色され写真に撮られた。

カラムから溶出されたプロウロキナーゼのほとんどは図１に示したごと（，１００％溶出緩衝液Ｂのビーク２物質を含むカラム分画に見られた。図１はまたプロウロキナーゼが培養培地中の他のタンパク質からきれいに分離され精製されていることも示している。

Ｄ、活性検定：培地および５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析された各々のカラム分画のウロキナーゼ活性が以下のごとき直接ウロキナーゼ（ＵＫ）検定により分析された。プロウロキナーゼは酵素活性を持たないのでプラスミンの作用によりウロキナーゼ（活性）へ変換されなければならない。

１０Ｍ１の検定緩衝液（５０ｍＭ　）リス−Ｈα、ｐＨ７，５，１２ｍＭ　Ｎａ α。

０．１％トリトンＸ−１００）をマイクロタイタープレート（コスタ−＃２７９７）の最初のウェルへ対照試薬として入れる。ウロキナーゼ標準貯蔵溶液（３０００１Ｕ　／ｍｌ検定緩衝液カルビオケム＃６７２０８１）を検定緩衝液で更に希釈して１００．５０．２５．１２．５および６．２５ＴＵ、／ｍｌとする。

希釈ウロキナーゼ標準品または未知試料をウェルに３重に加える。２１１のプラスミン（１２，５力ゼイン単位／　ｗｌ　Ｈ２０ヘレナ＃　５３０３）が適当なウェルに添加される。すべての試料はプラスミンの存在下および不在下検定される。試料は摂氏３７度で１時間インキュベートされる。プラスミンを含むプレートに１０ｙｌ／ウエルのアプロチニン（２０００Ｋ　Ｉ　Ｕ　／　ｍｌ検定緩衝液、シグマ＃Ａ　１１５３）を添加し：プラスミンを含まないプレートには１０１１の検定緩衝液を添加する。プレートを摂氏３７度で１５分間インキュベートする。

９０μｌの１−Ｍ　Ｓ　−２４４４（ヘレナ＃５２８１）検定緩衝液溶液を各々のウェルに加え、プレートは２から３時間３７度にてインキュベートする。プレートリーダー中４０５ｎｍでの光学密度が読み取られる。

未知試料中のプロウロキナーゼの濃度はＯＤ　、、５に対するウェル当りの酵素単位から決定される。プラスミン存在下で検定された試料の活性は存在するプロウロキナーゼおよびウロキナーゼの活性の合計を含んでいる。与えられた試料中のプロウロキナーゼの量はプラスミン存在下および不在下で得られた値の間の差である。

結果は下記の表１に示されている。

前二Ｌウロキナーゼ活性検定分画　　　　　　　　　容量　　　　　　全体に対する％濾過前の原物質　　　　７０００．０　ｙＩ−過後の原物質　　　　７０００．Ｏｘｉ　　　　　　　　　１００％フロースルー　　　　　７０００．Ｏｘ１０洗浄　　　　　　　　　１０００．Ｏｗｌ　　　　　　　　　　０２０％Ｂ　：Ａ　　　　　　　１０００．Ｏｗｌ　　　　　　　　　　０１００％Ｃ１０００，Ｏｘｉ　　　　　　　　　　Ｏカラムから活性の９１．４％が回収されたＵ匹＾Ａ、前処理：本実施例ではＩＯＫ　Ｉ単位／ｍｌアプロチニンを含む典型的な血清を含まない増殖培地からプロウロキナーゼが抽出され、実施例１に記載されたごとく前処理およびＰ通された。

Ｂ、クロマトグラフィｍ：６リツトルの前処理された条件付は等張培地を室温にてＡＢｘ（Ｊ、Ｔ、ベーカーケミカルカンパニー；４０ミクロン粒子直径）を含むファルマシアにカラム（５Ｘ　２．５ｃｍ）上に充填し、カラムは１０７ｃｙ／ｈｒで流す。充填後カラムを２０カラム容量の緩衝液Ａおよび１０カラム容量の２０％緩衝液Ｂ／Ｓｏ％緩衝液Ａで洗浄する。カラム上のタンパク質は６カラム容量の１００％Ｍ１！！液Ｂで溶出する（実施例１参照）９カラムは次に１０カラム容量の１００％緩衝液Ｃで洗浄する。

カラム溶出液は実施例に記載したごとくＵＶ吸収によりモニターされる。１００％緩衝液Ｂでの展開により２つのピークの分画が得られた。

Ｃ１電気泳動：培地およびカラム溶出物は操作の間一般に実施例１に記載されているごと＜５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析される。大多数のウロキナーゼは図２に示したごと＜１００％緩衝液Ｂでカラムから溶出される。

Ｄ、活性検定：操作の同各々の工程での培地およびカラム溶出物中に観察されるウロキナーゼの酵素活性は上記実施例に記載されているごとき直［ＵＫ検定により分析される。

結果は下記の表２に示されている。

前二とウロキナーゼ活性検定分画　　　　　　　　　容量　　　　　全体に対する％濾過前の原物質　　　　６０００．Ｏｘ（！−通過後原物質　　　　６０００．０　ｍｌ　　　　　　　　１００％フロースルー　　　　　６０００．０庸１０洗浄１００％Ａ　　　　　１０００．０　ｍＮ　　　　　　　　　Ｏ洗浄　２０％Ｂ　：Ａ　　　　４９０．０社　　　　　　　　０１００％Ｂ（分画１　）　　　　　６５．ＯｗｌＯ，１％１００％Ｂ（分画２）　　　　２１５．Ｏｘ１９１．０％１００％　Ｃ５００，Ｏｗｅ　　　　　　　　　Ｏカラムから活性の９１．１％が回収された。

ＫＩ匹ｌＡ、前処理：この実施例においてはＩＯＫ　Ｉ単位／ｍｌアプロチニンを含む典型的な血清を含まない増殖培地からプロウロキナーゼが抽出され、実施例１に記載したごとく前処理され？７５通される。

Ｂ、クロマトグラフィー：８リツトルの前処理された条件付は培地を室温にてＡＢｘ（Ｊ。

Ｔ、ベーカーケミカルカンパニー；４０ミクロン粒子直径）を含むファルマジアにカラム（５’Ｘ　２　、０ｃｔ）上に充填し、カラムは１０５Ｃν／ｈｒで流す。充填後、カラムを１０カラム容量の緩衝液Ａおよび１０カラム容量の２０％ｆｆ衝液Ｂ／８０％緩衝液Ａで洗浄する。カラム上のタンパク質は８カラム容量の１００％緩衝液Ｂ（実施例１ｇ照）で溶出される。カラムは次に１０カラム容量の１００％榎衝液Ｃで洗浄される。

カラム溶出液は実施例１に記載されているごとくＵＶ吸収によりモニターする。

１００％緩衝液Ｂによる展開により２つのピークの分画が得られた。

Ｃ１電気泳動：操作の間培地およびカラム溶出物が一般的に実施例１に記載されたごと＜５ＤＳ −ＰＡＧＥにより分析された。ウロキナーゼの大多数は１００％緩衝液Ｂによりカラムから溶出された（分画２）。

Ｄ、活性検定：操作の間の各々の工程で培地およびカラム溶出物中に観察されるウロキナーゼの酵素活性は前記実施例１のごとく直接ＵＫ検定により分析される。

結果は下記の表３に示されている。

轟」しウロキナーゼ活性検定ｒ通前の原物質　　　　８０００．０　ｍｌ濾過後の原物質　　　　８０００．０　ａｌ　　　　　　　　１００％フロースルー　　　　　８０００．０　ｍＩ　　　　　　　　　Ｏ洗浄１００％Ａ　　　　　　４００．０　ｍＩ　　　　　　　　　Ｏ洗浄　２０％　Ｂ　：Ａ　　　　４００．Ｏｄ　　　　　　　　　０１００％Ｂ（分画１）　　　　　２０．Ｏ＊１０１００％Ｂ（分画２）　　　　３００．０　ｍｌ　　　　　　　　９９．５％カラムから９９．５％の活性が回収された。

以上の実施例から評価されるごとく、全部ではないにしてもほとんどのウロキナーゼ関連酵素活性が本発明の方法により血清を含まないおよび血清を補給した両方の培地から回収できる。

ＦＩＧ、　１ＦＩＧ、　２補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１加平成　２年　２月り国特許庁長官　　吉　１）文　毅　殿１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２２９０２、発明の名称ウロキナーゼ化合物の回収３、特許出願人住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号平成　元年１１月　１日請求の範囲（、）ウロキナーゼ化合物含有タンパク質溶液を粒子状のシリカ様マトリックスと前記溶液中のウロキナーゼ化合物が前記マトリックスへ結合する条件下接触させ、前記マトリックスは前記粒子状のシリカ様マトリックスとポリエチレンイミノプロビルトリメトキシシランが共有結合的に結合した反応生成物を含んでおり；（ｂ）前記マトリックスから非結合タンパク質を分離し；および（ｃ）前記マトリックスからウロキナーゼ化合物を放出させる。

２、前記溶液が培養培地を含む請求の範囲第１項記載の方法。

３、前記溶液が細胞抽出液を含む請求の範囲第１項記載の方法９４、前記接触工程がクロマトグラフィー分離技術を用いて前記マトリックス上に前記ウロキナーゼ化合物含有溶液を通過させることを含む請求の範囲第１項記載の方法。

５、前記接触工程が固体相抽出技術を用い、前記マトリックスおよび前記ウロキナーゼ含有溶液を一緒に混合して２相混合物を形成させることを含む請求の範囲第１項記載の方法。

６、前記シリカ様マトリックスがシリカゲルおよび多孔性ガラスピーズから構成される群より選択される粒子を含む請求の範囲第１項記載の方法。

７、前記マトリックス物質が前記マトリックス物質１グラム当り約０．３から約１．２カルボキシルミリ当量を含む請求の範囲第１項記載の方法。

８、前記接触工程が約４．０および約６．０の間のｐＨで実施される請求の範囲第１項記載の方法。

９、前記接触工程が約５．６のｐＨで実施される請求の範囲第８項記載の方法。

１０、前記放出工程が約６．０より高いｐＨおよび約２５０ミリモルより大きなイオン強度で実施される請求の範囲第１項記載の方法。

１１、前記放出工程が約５００ミリモルのイオン強度で実施される請求の範囲第１０項記載の方法。

１２、前記放出工程が約４．０未満のｐＨで実施される請求の範囲第１項記載の方法。

１３、前記接触および放出工程がイプシロンアミノカプロン酸および洗浄剤の存在下実施される請求の範囲第１項記載の方法。

１４、前記放出工程が、ウロキナーゼ化合物が前記マトリックスと接触した前記ウロキナーゼ含有化合物溶液中の少くとも９０％のウロキナーゼ化合物から構成される分画を産生ずる請求の範囲第１項記載の方法。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ウロキナーゼ化合物および他のタンパク質の溶液からウロキナーゼ化合物を抽出する方法で、前記方法は下記の工程（ａ）〜（ｃ）より成る：（ａ）ウロキナーゼ化合物含有タンパク質溶液を粒子状のシリカ様マトリックスと前記溶液中のウロキナーゼ化合物が前記マトリックスに結合する条件下接触させ、前記マトリックスには多陰イオン基を持つ共有結合性結合ポリマーが含まれている；（ｂ）前記マトリックスから非結合タンパク質を分離し；および（ｃ）前記マトリックスからウロキナーゼ化合物を放出させる。
２．前記溶液が培養培地を含む請求の範囲第１項記載の方法。
３．前記溶液が細胞抽出液を含む請求の範囲第１項記載の方法。
４．前記接触工程がクロマトグラフィー分離技術を用い、前記マトリックス上を前記ウロキナーゼ化合物含有溶液が通過することにより実施される請求の範囲第１項記載の方法。
５．前記接触工程が固体相抽出技術を用い、前記マトリックスおよび前記ウロキナーゼ含有溶液を一緒に混合して２相混合物を形成することにより実施される請求の範囲第１項記載の方法。
６．前記シリカ様マトリックスがシリカゲルおよび多孔性ガラスビーズから構成される群より選択される粒子を含む請求の範囲第１項記載の方法。
７．前記ポリマーの前記陰イオン基がカルボキシラート基である請求の範囲第１項記載の方法。
８．前記ポリマーがカルボキシル化ポリエチレンイミンシランから成る請求の範囲第１項記載の方法。
９．前記マトリックス物質が粒子状の制御された細孔サイズのガラスとカルボキシル化ポリエチレンイミノアルキルトリアルコキシシランとの反応生成物を含む請求の範囲第１項記載の方法。
１０．前記マトリックスが粒子状シリカとカルボキシル化ポリエチレンイミノアルキルトリアルコキシシランとの反応生成物を含む請求の範囲第１項記載の方法。
１１．前記マトリックス物質が前記マトリックス物質１グラム当り約０．３から約１．２カルボキシルミリ当量を含む請求の範囲第９または１０項記載の方法。
１２．前記接触工程が約４．０および約６．０の間のｐＨで実施される請求の範囲第１項記載の方法。
１３．前記接触工程が約５．６のｐＨで実施される請求の範囲第１２項記載の方法。
１４．前記放出工程が約６．０より高いｐＨおよび約２５０ミリモルより大きなイオン強度で実施される請求の範囲第１項記載の方法。
１５．前記放出工程が約５００ミリモルのイオン強度で実施される請求の範囲第１４項記載の方法。
１６．前記放出工程が約４．０未満のｐＨで実施される請求の範囲第１項記載の方法。
１７．前記接触および放出工程がイブシロンアミノカブロン酸および界面活性剤の存在下実施される請求の範囲第１項記載の方法。
１８．前記放出工程が前記マトリックスと接触した前記ウロキナーゼ化合物含有溶液中の少くとも９０％のウロキナーゼ化合物から構成されるウロキナーゼ化合物を含有する分画を産生する請求の範囲第１項記載の方法。
１９．前記マトリックス物質が制御された細孔を持つガラスおよびシリカからなる群より選択される固形物とカルボキシル化，ポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシランとの反応生成物を含む請求の範囲第１項記載の方法。