JPH02128688A - 精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はストレプトキナーゼを′Ｗｊｔｌｉ！する方法
に関する。

〔従来の技術〕

ストレプトキナーゼは、連鎖球菌の種々の菌株により生
成される細胞外蛋白である。その活性は。

Ｗ、　Ｓ、　Ｔｉ１ｌｅｔ及びＲ，Ｌ、　Ｇａｒｎｅｒ
　（１９３３）ｒＪ、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、　Ｊ　５８
．４８５〜５０２により初めて報告され、彼等はこの蛋
白が血液の凝固の溶解を生じさせることを見い出した。

ストレプトキナーゼのフィブリン溶解活性が血漿プラス
ミノーゲンを活性させるその能力から生じていることが
現在十分に確証されている。（Ｆ、　Ｊ、　Ｃａ５ｔｅ
ｌｌｉｎ。

（１９７９）　ｒＴｒ＠ｎｄｓ　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　ｓ
ｅｉ、　Ｊ　（Ｐｅｒｓ。

Ｅｄ、）も１−５）。

ストレプトキナーゼは、急性心筋梗塞の治療のための静
脈内血栓溶解剤として臨床上用いられてｉる（Ｇｒｕｐ
ｐｏ　　Ｉｔａｌｉａｎｏ　　ｐｅｒ　　ｌｏ　　５ｔ
ｕｄｉ。

ｄｅｌｌａ　ｓｔｒ＠ｐｔｏｅｈｉｎａｓｅ　ｎｅｌ　
　１ｎｆａｒｔ。

Ｍｉａｃａｒｄｉｅｏ　（ＧＩＳＳＩ）　（１９８６）
　Ｌａｎｃｅｔ、　３８７参照〕。それは、ヨーロッパ
特許公開第００２８４８９号明細書に記載されたＡＰＳ
ＡＣ（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナー
ゼ活性体複合体）として知られている血栓溶解剤の２個
の蛋白成分の一つでもある。

ストレプトキナーゼは、成る３ｔｒｅｐｔｏｅｏｅｃｉ
及び成る細酌Ｑ、ａｎｅ＠ｆｉｅｌｄ群Ａ、　Ｃ又はＧ
の３ｔｒｅｐｔｏｅｏｅｅｉから誘導された適当な遺伝
子物質を含む）により生成する。臨床上の目的に用いら
れるべきストレプトキナーゼは１通常Ｓ。

ｅｑｕｉｍｉｍｉｌｉｓ株Ｈ４６Ａの培！物か株制４６
Ａる。

ストレプトキナーゼを精製する種々の方法が記載されて
きており、それらは溶解度、電荷５分子の大きさ又は形
状又は表面との非特異的物理的相互反応の定量的差異に
基づく。発表された方法は。

しばしばストレプトキナーゼの許容し難い損失又は不純
物の不適切な除去をもたらし、そして高価な反応性の高
い又は可燃性の試薬を用いる。

不純物を構成して−る混在蛋白例えばストレプトリジン
又はストレプトキナーゼとは異なりストレプトキナーゼ
は、アミノ酸であるシスティン又はシスチンを含まない
（Ｅｉｎａｒｓｓｏｎ　ａｔ　ａｌ（１９７９）　Ｂｌ
ｏｅｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｅｔａ　５６８　。

１９−２９　：　Ｄ＠Ｒｅｎｚｏ　ｅｔ　ａｌ（１９６
７）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２４２．５３３−５４２）。この構造上の
差は。

発酵ブロスからストレプトキナーゼを精製するさらに有
効な方法を提供するために用ｉることができる。

〔発明の概要〕

本発明によれば、ストレプトキナーゼ含有混合物中の混
在蛋白からストレプトキナーゼを分離する方法において
、混合物を還元剤により処理して混在蛋白中のジスルフ
ィド架橋を還元して遊離のチオール基とし、混合物とＲ
−Ｘ（ここでＲは遊離チオール基と反応１〜うる基であ
り、−＋＋８！導子Ｘは遊離チオ− ル基と反応しうる基Ｒ１であるか又はチオール含有マト
リックスである）の試薬とを接触させ１次に混合物から
得られた化学的に変性した混在蛋白を分離して混在蛋白
を実質的に含まない形のストレプトキナーゼをもたらす
ことよりなる方法が提供される。

精製したストレプトキナーゼは、好ましくはヨーロッパ
薬局方の純度の明細に適合しておシ、そして好ましくは
１０，０ＯＯＩＵストレプトキナーゼ当＃）Ｉ　ＩＵ　
　よシ少いストレプトキナーゼ及び１．０００，０００
１Ｕストレグトキナーゼ当シ１１Ｕよシ少いストレプト
リジンを含む。

ジスルフィド架橋の還元は、任意の好適な還元剤により
行うことができる。その例は、低いレドックス電位を有
するチオール例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び
ジチオエリスＩＪ）−ル〔その単独又は第二級還元剤例
えばＮＡＤＰＨ（ＬｏμＭ。

Ｆ、　ｒＭｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙＪ１４３．１２４べ−ジ、　Ａｅａｄｅｘｎｉｅ　ｐ
ｒｅｓｓ、　１９８７））にカップリングして〕を含む
。成るほう米水素化物例えば水素化は５素ナトリウム又
はシアノボロヒドリドも電気化学的還元（［ａ、ｄｉｎ
　Ｈ，ｒＭｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
Ｊ　１４３．２５６ページ、Ａｅａｄ。

ｐｒｓｓｓ、　１９８７）　　で用いられるように用−
ることができる。蛋白の還元の他の方法は、　Ｊｏｅｅ
ｌｙｎ。

Ｐ、Ｃ，（ｒＭｅｔｈ、Ｅｎｚ、Ｊ　１４３，２４６ペ
ージ。

Ａｅａｄｅｍｉｅ　ｐｒｅｓｓ、　１９８７）の総説か
ら明らかであろう。これらの方法の中で、ジチオトレイ
トールによる処理が好ましく、好ましくは５〜１００ｍ
Ｍ、さらに好ましくは２５〜１１００ｔｎのＤＴＴ濃度
で、ｐＨ６゜θ〜８．５及び５°〜３５℃の温度で行わ
れる。

基Ｒ及びＲ１の好適な例は。

５−ニトロ−２−ピリジルチオ ５−カルボキシ−２−ピリジルチオ ２−ピリジルチオ ４−ピリジルチオ ２−ペンゾチアゾールチ第 ４−ニドｏ−３−カルボキシフエニＡ〆チオ及び上記の
ピリジル基のＮ−オキシドを含む。

本発明の方法に用ｉて好適なマトリックスは、例えば変
性アガロース、デキスト−ｙ／及びシリカのような種々
の形の蛋白クロマトグラフィーでマトリックスとして用
いられ２例えば英国特許第１５０６４０３又ハ１号９’
Ｔ７５Ｔ号明細書ニ記載ａ　レタようにチオール基をそ
う入するために変性され、又はチオール化合物を含む単
量体の重合によ多形成された粒状の不溶性の親水性物質
を混入する。

これらの物質の例は、　Ｂｒｏｅｋｌｅ　ｈｕｒｓｔ　
、　Ｋ　　ｅｔａｌ（１９７３）ｒＢｉｏｅｈ＠ｍ、　
Ｊ、Ｊ　　１３３．５９３〜５８４により記述され、そ
して１３ｉｏｒａｄ　Ｉｎｃによりムｆｆ１ｇ＠ｌ　４
０１　　スルヒドリル・ゲル並ＫＰｈａｒｍａｅｉａ　
Ｌｔｄ、によｐ　’ｌ’ｈｉｏｐｒｏｐｙｌ　−３＊ｐ
ｈａｒｏｓｅ　　６Ｂ又はＡｇｔｈｉｏｌ　Ａｇａｒｏ
ｓｅ　−Ｅｔｈｅｒ　−Ｔｈ１ｏｌ　の名で売られてい
る。

マトリックス上のチオール基は、還元した蛋白内でチオ
基との接触を促進するスペーサー基によりマトリブロス
に最も有効に結合できる。チオールに隣接するカルボキ
シレート又はアミノ基とのマトリックスリンカ−チオー
ル基が％に適してｉる。このような好ましい物質の例は
、セファロースに不動化されたシスティン又はグルタチ
オンである。

好ましい試薬Ｒ−Ｒ１は、Ａｌｄｒｌｔｈｉｏｌ　−２
Ｑ商標名でＡｌｄｒｉｅｈ　Ｃｈｅｍｉｅａｌ　　Ｃｏ
、によυ売られている２、２′−ジピリジルスルフィド
である。

ストレプトキナーゼの混合物は、好ましくは細菌の細胞
からストレプトキナーゼの分離を行う技術例えば遠心分
離、濾過又は吸着により本発明に従って精製前に発酵ブ
ロスから分離される。このような分離は、好ましくはス
トレプトキナーゼがチオール含有不純物による多大の混
在から免かれる他の精製工程と組合わされる。ブロスの
前処理の好適な技術は１例えば東独特許第１２６３４２
及び１２１５２２号明細書、　ＤＩＳ　　Ｒ＠ｎｚｏ　
Ｅ、　Ｃ。

（１９６７）ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｎｎ、Ｊ　２
４２．５３３又は米国特許第２７８４１４５号明細書に
記載されたような分別沈澱、Ｆｌｏｒｉｓ口及びイオン
交換クロマトグラフィを含む。好ましい処理は、本質的
にクロマトグラフィであシそしてスト１／ブトキナーゼ
を変性する試薬にさらされることを避ける。

化学的ＶＣＷ性された混在蛋白の分離は、物理的及び／
又は化学的に行うことができる。

試薬がＲ−Ｒ’の形のもののとき、それとストレプトキ
ナーゼ混合物との反応は、基Ｒ及びＲ１の混合したジル
スルフィド及び混合物の還元した不純物をもたらす。多
くの条件下反応は得られる化学的に変性した混在蛋白の
沈澱を生ずる。

この沈澱工程の条件は、沈澱の形成を最大にするように
コントロールできる。

特に、試薬Ｒ−Ｒ１の好ましい濃度は１０〜２００　ｍ
Ｍであり、活性化は好ましくはｐ　Ｈ６，０〜８．５及
び温度５〜３５Ｃで行われる。

沈澱は、任意の好適な従来の物理的なやシ方例えば−過
、沈降、遠心分離又はクロマトグラフィーのカラム或−
は他の好適な装置内の沈澱の保持により混合物から除去
できる。

一過は、好ましくはｌ　ｐｍ以下の大きさの粒子を保持
できる任意の好適なフィルターの使用により行うことが
できる。好適な材料は、ガラスフィバ−ポリスルホン、
ポリ二弗化ビニリデン及びナイロンを含む。

沈澱が最適になされたとき、濾過による混合物からの分
離は、所望の純度のストレプトキナーゼを生ずる。必要
な純度が達成されないときには。

ｐ液自体はチオール含有マトリックスに適用されてチオ
ール交換クロマトグラフィにより残存する混在蛋白を除
く。

一方、特に不完全な沈澱が生じたとき、混合物はその前
の濾過なしにチオール含有マトリックスに直接適用され
る◎ 低い混在濃度（例えばｌｓｉ！当り　２５　ＩＵより低
い）では、沈澱は有効ではなくそしてマトリックス法が
有利に用いられる。

試薬が形Ｒ−Ｘ（ここでＲは前記同様であシそしてＸは
チオール含有マトリックスである）のもののとき１本発
明の方法は本質的に還元した混合物と活性化したチオー
ル含有マトリックスとの接触を含む。

チオール含有マトリックスの活性化は、マトリックスを
試薬Ｒ−Ｒ１（ここでＲ及びＲ１は前記同様である）Ｋ
よ多処理して基Ｒ及びＲ１の混合したジスルフィド及び
チオマトリックスを提供することにより達成できる。好
ましい試薬はＡｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２であシ、それは
還元したストレプトキナーゼ混合物との反応に好適なチ
オマトリックス２−ピリジルジスルフィドに製造するの
に用いられる。このようなチオマトリックス２−ピリジ
ルジスルフィドは、又英国特許第１５０６４０９号明細
書に記＊−ｇれたもののような別の手段により製造でき
、そしてチオマトリックスから製造されたものの代υに
用いることができる。

一つの態様において本発明は従ってストレプトキナーゼ
含有混合物中の混在蛋白からストレプトキナーゼを分離
する方法を提供し、その方法は混合物を還元剤によ多処
理して混在蛋白中のジスルフィド架橋を還元して遊離の
チオール基とし、混合物と不動化したチオール含有化合
物を含むマトリックスとを接触させ、このとき還元した
混合物及びマトリックスの一つは接触前に活性化され。

そして混在蛋白が実質的にない形でマトリックスからス
トレプトキナーゼを溶離することよシなる。

ストレプトキナーゼは、好都合にはストレプトキナーゼ
とマトリックスとの間の非共有相互反応を最低にするよ
うにデザインされた水性バッファーにより洗うことＫよ
シ好都合にはマトリックスから分離できる。少くとも２
００ｍＭのナトリウムイオン及び任意にはキレート剤例
えばＥＤＴＡを含むバッファーが好適なことが分った。

ストレプトキナーゼの分離後、マトリックスは、水性バ
ッファーにより洗ってカラムを再使用のため再生する前
Ｋ、前述したよりな還元剤により処理する。

マトリックスは好都合にはカラムの形で提供され、そし
て精製はパッチ式又は連続式で行うことができる。

〔実施例〕

本発明によるストレプトキナーゼの精製は、下記の材料
及び方法を用いて記述される。

材料 セファロース４Ｂをｐｈａｒｍａｅｉａ　ＬＫＢ、ウプ
サラ、スウェーデンから得た。チオヒドロキシプロピル
及びグルタチオンアガロースは、又 ｐｈａｒｍａｅ　ｉ　ａから得られたか又はＤｅａｎ　
ｅｔ、　ａｌ（１９８５）の方法に従って合成した。２
．２′−ジピリジル　ジス／Ｉ／　フィト（Ａｌｄｒｉ
ｔｈｉｏｌ−２）　頃Ａｌｄｒｉｅｈ　Ｃｈｅａｎｉｅ
ａｌ　（’ｏｍｐａｎｙ、ギリンガム。

ドーセットから得られた。他の化学品は。

Ｓｉｇｍａ　（ｏ　／ド：ｙ　）　Ｃｈｅｍｉｅａｌ　
Ｃｏ　、プール。

ドーセット、英国又はＦｉｓｏｎｓ、ローボローライジ
ス。英国から得られた。

方法 （１）蛋白溶液を２５ｍＭのＤＴＴにより還元し、そし
て３０分間３０℃でインキエベートしたＯ過剰のＤＴＴ
を、　ｐｈａｒｍａｅｉａ　ＰＤ−１０カラムのＧ−２
５クロマトグラフイーを用いるバッファー交換によるか
又はＡｍ１ｃｏｎ攪拌セル限外濾過システ弘の透析濾過
によるバッファー交換によるかの何れかにより除いた。

両者の場合、蛋白溶液を脱気した１　５０ｍＭ　　Ｎａ
Ｃｌ、１００ｍＭ　　ＮａＨｘＰＯ４，１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、　ｐＨ７，０バツフアーに交換した。

（１０蛋白溶液を２５　ｍＭのＤＴＴにより還元しそし
て緩やかに攪拌しつつ３０分間３０℃でインキュベート
した。（蛋白溶液はこの点で１０ｍＭＮａＨ’　鵞ＰＯ
４、２００ｍＭＮａＣｌ　ｐＨ７，０バフ７アー中にあ
った。）　Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２（２，２’ジピリ
ジルジスルフイド）を加えて最終濃度を５０　ｍＭとし
た。過剰のＡｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２を次に前述の二つ
の方法の一つＫよシ除いた。

（ｂ）　　クロマトグラフィー 共有結合クロマトグラフィーを二つの以下の方法の一つ
により行った。方法囚（ストレプトキナーゼ前処理法（
１）の場合）又は方法＠（前処理（１１）の場合）。

（Ａ）　　２０−のグルタチオンアガロース又はヒドロ
キシチオプロピルアガロースを５０％スラリーとしてｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　Ｃ−１６りＯｆグラフィーカラムに
加えた。安定な充填したベツドが得られるまで。

カラムを次に２０ｍ／時の流速で１５０ｍＭＮａＣ１，
１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１００ｍＭ　ＮａＨ＊ＰＯｎ　Ｐ
Ｈ７，０（バッファーＡ）により洗った。１００ｗｄの
５０ｍＭ　ＤＴＴを次に１０ｗ／時の見かけの流速でカ
ラムを通してチオールアガロースの全還元を確実にした
。カラムを次にＤＴＴが完全になくなるまで脱気したバ
ッファーＡにより洗った。（カラムの１０容量）。カラ
ムを次に１０ｃＰＲ／時の見かけの流速でＡｌｄｒｉｔ
ｈｉｏｌ−２の飽和溶液により洗い（１００ｄ）、そし
て再びＡｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２がなくなるまで脱気し
たバッファーＡにより洗った。

方法中により製造した蛋白溶液（容量１０〜２０−）を
１０６Ｉｌ／時の流速でカラムに加えそしてバッファー
Ａにより洗った。カラムを２８０’ＭＭでモニターしそ
して洗った蛋白のピークを保持しそしてアッセイした。

カラムは次に前述した方法により再生できた。

■　２０ｍｇのグルタチオンアガロース又はヒドロキシ
チオプロピルアガロースを５０チスラリーとしてＰｈａ
ｒｍ凰ｅｉａ　Ｃ−１６クロマトグラフィーカラムに加
えた。カラムを次に安定な充填したベツドが得られるま
で、２０α／時の流速で１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭ　
ＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＨｇＰＯ４ＰＨ７，０（、＜
ッファー人）により洗った。１００−の５０ｍＭＤＴＴ
　　を次に１０ｅＭ／時の流速でカラムに通してチオー
ルアガロースの全還元を確実にした。カラムを次にＤＴ
Ｔが完全になくなるまで脱気したバッファーＡＩ’（よ
シ洗った。（カラムの１０倍容量）。

方法（ｉＤにより製造した蛋白溶液（容量２０〜ｔｏｏ
ｋ）を１０ｃ＊／時の流速でカラムに加えそしてバッフ
ァーＡにより洗りた。カラムを２８０ｎｍでモニターし
そして洗った蛋白のピークを保持しそしてアッセイした
。カラムは次に前述の方法により再生できた。

２、共有結合沈澱（方法Ｃ） 蛋白溶液を１００ｍＭのＤＴＴにより還元しそして３０
分間３０℃でインキュベートした。１５０ｍＭの最終濃
度になるようＫ　Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２を次に加え
そして溶液（ＰＨ７，５）を攪拌しつつ３０℃で２０分
間次に３５℃で１５分間インキエペートした。溶液を次
に５℃に冷却しそして２０分間保った。

（ｂ）　　沈澱の除去 残存するＡｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２及び沈澱した蛋白混
在物を次の何れかの方法にょシ除いた。

（１）　　Ｗｈａｔｍａｎガラスマイクロファイバー〇
Ｆ／Ａプレフィルタ−（孔径１．６ｐｍ）を通して濾過
し次にブックナーフルター系で真空下′ｗｈａｔｍａｎ
ガラスマイクロファイバーＧ　Ｆ／Ｆ　　ファイナルフ
ィルター（孔径０．７ｐｍ）を通してＦ遇し、Ｐ液を保
持しアッセイした。

（ｉｏ　　５℃で２０分間６０００Ｘｆ　で遠心分離。

上澄み液を次に沈澱からデカンテーションし、保持しア
ッセイした。

アッセイ テストするサンプルを燐酸緩衝生理食塩水にょシ１０倍
に段階的に希釈して下記の希釈物を得た。

１、０．１．０．０１及び０．００１゜これらの希釈し
たサンプルを次にヨーロッパ薬局方の方法の変法によリ
ストレグトリシンー０についてアッセイし、それは見容
量のサンプル及び試薬（ヨーロッパ薬局方、第２版、３
５６〜３．１９８４に引用された）の使用を含む。方法
をサンプルの中間の希釈物について繰返した。

結果を次の表に要約する。

結論 すべての方法（方法Ａ、　　Ｂ及びＣ）は高収率（８０
〜１００５６）でストレプトキナーゼを生成し。

そしてすべてはストレプトリジンの量をかなす減少させ
る。

方法人は、溶液中に検出可能な量のストレグトリジ／を
残す。方法Ｂの場合、ストレプトキナーゼの低濃度のた
めに、ストレプトリジンの量はアッセイの感度より低く
、従って結果は「より少〈」と表示される。方法８例１
の場合、ストレプトキナーゼの量は、サンプルがヨーロ
ッパ薬局方の標準を通るか又は通らないかを決めるには
不十分であった。低い量のストレプトリジンは、方法Ｃ
により生成した材料中で検出可能であるが、これらはヨ
ーロッパ薬局方の明細の中にある。方法Ｃは、チオール
マトリックスを利用するコストなしにヨーロッパ薬局方
の標準の純度に材料を生成することが要求されると１！
、好ましい。

代理人　弁理士　秋　沢　政　光 他１名

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトキナーゼ含有混合物中の混在蛋白から
   ストレプトキナーゼを分離する方法において、混合物を
   還元剤により処理して混在蛋白中のジスルフィド架橋を
   還元して遊離のチオール基とし、混合物とＲ−Ｘ（ここ
   でＲは遊離チオール基と反応しうる基であり、Ｘは遊離
   チオール基と反応しうる基Ｒ＾１であるか又はチオール
   含有マトリックスである）の試薬とを接触させ、次に混
   合物から得られた化学的に変性した混在蛋白を分離して
   混在蛋白を実質的に含まない形のストレプトキナーゼを
   もたらすことよりなる前記方法。
2. （２）還元剤がジチオトレイトールである請求項１記載
   の方法。
3. （３）基Ｒ及びＲ＾１が ５−ニトロ−２−ピリジルチオ ５−カルボキシ−２−ピリジルチオ ２−ピリジルチオ ４−ピリジルチオ ２−ベンゾチアゾリルチオ ４−ニトロ−３−カルボキシフェニルチオ 及び上記のピリジル基のＮ−オキシド から選ばれる請求項１又は２記載の方法。
4. （４）試薬Ｒ−ＸがＲ−Ｒ＾１の形のものである請求項
   １〜３の何れか一つの項記載の方法。
5. （５）試薬Ｒ−Ｒ＾１が２，２′−ジピリジルジルスル
   フイドである請求項４記載の方法。
6. （６）試薬Ｒ−Ｒ＾１の濃度が１０〜２００ｍＭである
   請求項４又は５記載の方法。
7. （７）還元された混合物と試薬Ｒ−Ｒ＾１との反応がｐ
   Ｈ６．０〜８．５で行われる請求項４〜６の何れか一つ
   の項記載の方法。
8. （８）還元された混合物と試薬Ｒ−Ｒ＾１との反応が５
   〜３５℃の温度で行われる請求項４〜７の何れか一つの
   項記載の方法。
9. （９）生じた化学的に変性された混在蛋白が、濾過、沈
   降、遠心分離により又はクラマトグラフイーのカラム内
   の保持により分離される沈澱を形成する請求項４〜８の
   何れか一つの項記載の方法。
10. （１０）残存する化学的に変性された混在蛋白がチオー
    ル交換クロマトグラフィーにより除去される請求項９記
    載の方法。