JPH02128688A - 精製方法 - Google Patents
精製方法Info
- Publication number
- JPH02128688A JPH02128688A JP1269272A JP26927289A JPH02128688A JP H02128688 A JPH02128688 A JP H02128688A JP 1269272 A JP1269272 A JP 1269272A JP 26927289 A JP26927289 A JP 26927289A JP H02128688 A JPH02128688 A JP H02128688A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- streptokinase
- mixture
- reagent
- thiol
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 5
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 claims abstract description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 20
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims abstract description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 claims description 15
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical group SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 9
- -1 5-nitro-2-pyridylthio 5-carboxy-2-pyridylthio 2-pyridylthio 4-pyridylthio 2-Benzothiazolylthio 4-nitro-3-carboxyphenylthio Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 150000001204 N-oxides Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical group C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 6
- 108010011834 Streptolysins Proteins 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 108010058207 Anistreplase Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 125000004149 thio group Chemical group *S* 0.000 description 2
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102220489870 Cofilin-1_H46A_mutation Human genes 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000981375 Homo sapiens Nuclear cap-binding protein subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 102100024372 Nuclear cap-binding protein subunit 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241001483078 Phyto Species 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 240000008104 Stachytarpheta jamaicensis Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3153—Streptokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/885—Streptococcus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
- Iron Core Of Rotating Electric Machines (AREA)
- Removal Of Specific Substances (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はストレプトキナーゼを′Wjtli!する方法
に関する。
に関する。
ストレプトキナーゼは、連鎖球菌の種々の菌株により生
成される細胞外蛋白である。その活性は。
成される細胞外蛋白である。その活性は。
W、 S、 Ti1let及びR,L、 Garner
(1933)rJ、 Exp、 Mad、 J 58
.485〜502により初めて報告され、彼等はこの蛋
白が血液の凝固の溶解を生じさせることを見い出した。
(1933)rJ、 Exp、 Mad、 J 58
.485〜502により初めて報告され、彼等はこの蛋
白が血液の凝固の溶解を生じさせることを見い出した。
ストレプトキナーゼのフィブリン溶解活性が血漿プラス
ミノーゲンを活性させるその能力から生じていることが
現在十分に確証されている。(F、 J、 Ca5te
llin。
ミノーゲンを活性させるその能力から生じていることが
現在十分に確証されている。(F、 J、 Ca5te
llin。
(1979) rTr@nds Bioehem、 s
ei、 J (Pers。
ei、 J (Pers。
Ed、)も1−5)。
ストレプトキナーゼは、急性心筋梗塞の治療のための静
脈内血栓溶解剤として臨床上用いられてiる(Grup
po Italiano per lo 5t
udi。
脈内血栓溶解剤として臨床上用いられてiる(Grup
po Italiano per lo 5t
udi。
della str@ptoehinase nel
1nfart。
1nfart。
Miacardieo (GISSI) (1986)
Lancet、 387参照〕。それは、ヨーロッパ
特許公開第0028489号明細書に記載されたAPS
AC(アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナー
ゼ活性体複合体)として知られている血栓溶解剤の2個
の蛋白成分の一つでもある。
Lancet、 387参照〕。それは、ヨーロッパ
特許公開第0028489号明細書に記載されたAPS
AC(アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナー
ゼ活性体複合体)として知られている血栓溶解剤の2個
の蛋白成分の一つでもある。
ストレプトキナーゼは、成る3treptoeoeci
及び成る細酌Q、ane@field群A、 C又はG
の3treptoeoeeiから誘導された適当な遺伝
子物質を含む)により生成する。臨床上の目的に用いら
れるべきストレプトキナーゼは1通常S。
及び成る細酌Q、ane@field群A、 C又はG
の3treptoeoeeiから誘導された適当な遺伝
子物質を含む)により生成する。臨床上の目的に用いら
れるべきストレプトキナーゼは1通常S。
equimimilis株H46Aの培!物か株制46
Aる。
Aる。
ストレプトキナーゼを精製する種々の方法が記載されて
きており、それらは溶解度、電荷5分子の大きさ又は形
状又は表面との非特異的物理的相互反応の定量的差異に
基づく。発表された方法は。
きており、それらは溶解度、電荷5分子の大きさ又は形
状又は表面との非特異的物理的相互反応の定量的差異に
基づく。発表された方法は。
しばしばストレプトキナーゼの許容し難い損失又は不純
物の不適切な除去をもたらし、そして高価な反応性の高
い又は可燃性の試薬を用いる。
物の不適切な除去をもたらし、そして高価な反応性の高
い又は可燃性の試薬を用いる。
不純物を構成して−る混在蛋白例えばストレプトリジン
又はストレプトキナーゼとは異なりストレプトキナーゼ
は、アミノ酸であるシスティン又はシスチンを含まない
(Einarsson at al(1979) Bl
oehim、 Biophys、Aeta 568 。
又はストレプトキナーゼとは異なりストレプトキナーゼ
は、アミノ酸であるシスティン又はシスチンを含まない
(Einarsson at al(1979) Bl
oehim、 Biophys、Aeta 568 。
19−29 : D@Renzo et al(196
7) J、 Biol。
7) J、 Biol。
Chew、 242.533−542)。この構造上の
差は。
差は。
発酵ブロスからストレプトキナーゼを精製するさらに有
効な方法を提供するために用iることができる。
効な方法を提供するために用iることができる。
本発明によれば、ストレプトキナーゼ含有混合物中の混
在蛋白からストレプトキナーゼを分離する方法において
、混合物を還元剤により処理して混在蛋白中のジスルフ
ィド架橋を還元して遊離のチオール基とし、混合物とR
−X(ここでRは遊離チオール基と反応1〜うる基であ
り、−++8!導子Xは遊離チオ− ル基と反応しうる基R1であるか又はチオール含有マト
リックスである)の試薬とを接触させ1次に混合物から
得られた化学的に変性した混在蛋白を分離して混在蛋白
を実質的に含まない形のストレプトキナーゼをもたらす
ことよりなる方法が提供される。
在蛋白からストレプトキナーゼを分離する方法において
、混合物を還元剤により処理して混在蛋白中のジスルフ
ィド架橋を還元して遊離のチオール基とし、混合物とR
−X(ここでRは遊離チオール基と反応1〜うる基であ
り、−++8!導子Xは遊離チオ− ル基と反応しうる基R1であるか又はチオール含有マト
リックスである)の試薬とを接触させ1次に混合物から
得られた化学的に変性した混在蛋白を分離して混在蛋白
を実質的に含まない形のストレプトキナーゼをもたらす
ことよりなる方法が提供される。
精製したストレプトキナーゼは、好ましくはヨーロッパ
薬局方の純度の明細に適合しておシ、そして好ましくは
10,0OOIUストレプトキナーゼ当#)I IU
よシ少いストレプトキナーゼ及び1.000,000
1Uストレグトキナーゼ当シ11Uよシ少いストレプト
リジンを含む。
薬局方の純度の明細に適合しておシ、そして好ましくは
10,0OOIUストレプトキナーゼ当#)I IU
よシ少いストレプトキナーゼ及び1.000,000
1Uストレグトキナーゼ当シ11Uよシ少いストレプト
リジンを含む。
ジスルフィド架橋の還元は、任意の好適な還元剤により
行うことができる。その例は、低いレドックス電位を有
するチオール例えばジチオトレイトール(DTT)及び
ジチオエリスIJ)−ル〔その単独又は第二級還元剤例
えばNADPH(LoμM。
行うことができる。その例は、低いレドックス電位を有
するチオール例えばジチオトレイトール(DTT)及び
ジチオエリスIJ)−ル〔その単独又は第二級還元剤例
えばNADPH(LoμM。
F、 rMethods in Enzymolog
yJ143.124べ−ジ、 Aeadexnie p
ress、 1987))にカップリングして〕を含む
。成るほう米水素化物例えば水素化は5素ナトリウム又
はシアノボロヒドリドも電気化学的還元([a、din
H,rMethods inEnzymology
J 143.256ページ、Aead。
yJ143.124べ−ジ、 Aeadexnie p
ress、 1987))にカップリングして〕を含む
。成るほう米水素化物例えば水素化は5素ナトリウム又
はシアノボロヒドリドも電気化学的還元([a、din
H,rMethods inEnzymology
J 143.256ページ、Aead。
prsss、 1987) で用いられるように用−
ることができる。蛋白の還元の他の方法は、 Joee
lyn。
ることができる。蛋白の還元の他の方法は、 Joee
lyn。
P、C,(rMeth、Enz、J 143,246ペ
ージ。
ージ。
Aeademie press、 1987)の総説か
ら明らかであろう。これらの方法の中で、ジチオトレイ
トールによる処理が好ましく、好ましくは5〜100m
M、さらに好ましくは25〜1100tnのDTT濃度
で、pH6゜θ〜8.5及び5°〜35℃の温度で行わ
れる。
ら明らかであろう。これらの方法の中で、ジチオトレイ
トールによる処理が好ましく、好ましくは5〜100m
M、さらに好ましくは25〜1100tnのDTT濃度
で、pH6゜θ〜8.5及び5°〜35℃の温度で行わ
れる。
基R及びR1の好適な例は。
5−ニトロ−2−ピリジルチオ
5−カルボキシ−2−ピリジルチオ
2−ピリジルチオ
4−ピリジルチオ
2−ペンゾチアゾールチ第
4−ニドo−3−カルボキシフエニA〆チオ及び上記の
ピリジル基のN−オキシドを含む。
ピリジル基のN−オキシドを含む。
本発明の方法に用iて好適なマトリックスは、例えば変
性アガロース、デキスト−y/及びシリカのような種々
の形の蛋白クロマトグラフィーでマトリックスとして用
いられ2例えば英国特許第1506403又ハ1号9’
T75T号明細書ニ記載a レタようにチオール基をそ
う入するために変性され、又はチオール化合物を含む単
量体の重合によ多形成された粒状の不溶性の親水性物質
を混入する。
性アガロース、デキスト−y/及びシリカのような種々
の形の蛋白クロマトグラフィーでマトリックスとして用
いられ2例えば英国特許第1506403又ハ1号9’
T75T号明細書ニ記載a レタようにチオール基をそ
う入するために変性され、又はチオール化合物を含む単
量体の重合によ多形成された粒状の不溶性の親水性物質
を混入する。
これらの物質の例は、 Broekle hurst
、 K etal(1973)rBioeh@m、
J、J 133.593〜584により記述され、そ
して13iorad Incによりムff1g@l 4
01 スルヒドリル・ゲル並KPharmaeia
Ltd、によp ’l’hiopropyl −3*p
harose 6B又はAgthiol Agaro
se −Ether −Th1ol の名で売られてい
る。
、 K etal(1973)rBioeh@m、
J、J 133.593〜584により記述され、そ
して13iorad Incによりムff1g@l 4
01 スルヒドリル・ゲル並KPharmaeia
Ltd、によp ’l’hiopropyl −3*p
harose 6B又はAgthiol Agaro
se −Ether −Th1ol の名で売られてい
る。
マトリックス上のチオール基は、還元した蛋白内でチオ
基との接触を促進するスペーサー基によりマトリブロス
に最も有効に結合できる。チオールに隣接するカルボキ
シレート又はアミノ基とのマトリックスリンカ−チオー
ル基が%に適してiる。このような好ましい物質の例は
、セファロースに不動化されたシスティン又はグルタチ
オンである。
基との接触を促進するスペーサー基によりマトリブロス
に最も有効に結合できる。チオールに隣接するカルボキ
シレート又はアミノ基とのマトリックスリンカ−チオー
ル基が%に適してiる。このような好ましい物質の例は
、セファロースに不動化されたシスティン又はグルタチ
オンである。
好ましい試薬R−R1は、Aldrlthiol −2
Q商標名でAldrieh Chemieal Co
、によυ売られている2、2′−ジピリジルスルフィド
である。
Q商標名でAldrieh Chemieal Co
、によυ売られている2、2′−ジピリジルスルフィド
である。
ストレプトキナーゼの混合物は、好ましくは細菌の細胞
からストレプトキナーゼの分離を行う技術例えば遠心分
離、濾過又は吸着により本発明に従って精製前に発酵ブ
ロスから分離される。このような分離は、好ましくはス
トレプトキナーゼがチオール含有不純物による多大の混
在から免かれる他の精製工程と組合わされる。ブロスの
前処理の好適な技術は1例えば東独特許第126342
及び121522号明細書、 DIS R@nzo
E、 C。
からストレプトキナーゼの分離を行う技術例えば遠心分
離、濾過又は吸着により本発明に従って精製前に発酵ブ
ロスから分離される。このような分離は、好ましくはス
トレプトキナーゼがチオール含有不純物による多大の混
在から免かれる他の精製工程と組合わされる。ブロスの
前処理の好適な技術は1例えば東独特許第126342
及び121522号明細書、 DIS R@nzo
E、 C。
(1967)rJ、 Biol、 Chenn、J 2
42.533又は米国特許第2784145号明細書に
記載されたような分別沈澱、Floris口及びイオン
交換クロマトグラフィを含む。好ましい処理は、本質的
にクロマトグラフィであシそしてスト1/ブトキナーゼ
を変性する試薬にさらされることを避ける。
42.533又は米国特許第2784145号明細書に
記載されたような分別沈澱、Floris口及びイオン
交換クロマトグラフィを含む。好ましい処理は、本質的
にクロマトグラフィであシそしてスト1/ブトキナーゼ
を変性する試薬にさらされることを避ける。
化学的VCW性された混在蛋白の分離は、物理的及び/
又は化学的に行うことができる。
又は化学的に行うことができる。
試薬がR−R’の形のもののとき、それとストレプトキ
ナーゼ混合物との反応は、基R及びR1の混合したジル
スルフィド及び混合物の還元した不純物をもたらす。多
くの条件下反応は得られる化学的に変性した混在蛋白の
沈澱を生ずる。
ナーゼ混合物との反応は、基R及びR1の混合したジル
スルフィド及び混合物の還元した不純物をもたらす。多
くの条件下反応は得られる化学的に変性した混在蛋白の
沈澱を生ずる。
この沈澱工程の条件は、沈澱の形成を最大にするように
コントロールできる。
コントロールできる。
特に、試薬R−R1の好ましい濃度は10〜200 m
Mであり、活性化は好ましくはp H6,0〜8.5及
び温度5〜35Cで行われる。
Mであり、活性化は好ましくはp H6,0〜8.5及
び温度5〜35Cで行われる。
沈澱は、任意の好適な従来の物理的なやシ方例えば−過
、沈降、遠心分離又はクロマトグラフィーのカラム或−
は他の好適な装置内の沈澱の保持により混合物から除去
できる。
、沈降、遠心分離又はクロマトグラフィーのカラム或−
は他の好適な装置内の沈澱の保持により混合物から除去
できる。
一過は、好ましくはl pm以下の大きさの粒子を保持
できる任意の好適なフィルターの使用により行うことが
できる。好適な材料は、ガラスフィバ−ポリスルホン、
ポリ二弗化ビニリデン及びナイロンを含む。
できる任意の好適なフィルターの使用により行うことが
できる。好適な材料は、ガラスフィバ−ポリスルホン、
ポリ二弗化ビニリデン及びナイロンを含む。
沈澱が最適になされたとき、濾過による混合物からの分
離は、所望の純度のストレプトキナーゼを生ずる。必要
な純度が達成されないときには。
離は、所望の純度のストレプトキナーゼを生ずる。必要
な純度が達成されないときには。
p液自体はチオール含有マトリックスに適用されてチオ
ール交換クロマトグラフィにより残存する混在蛋白を除
く。
ール交換クロマトグラフィにより残存する混在蛋白を除
く。
一方、特に不完全な沈澱が生じたとき、混合物はその前
の濾過なしにチオール含有マトリックスに直接適用され
る◎ 低い混在濃度(例えばlsi!当り 25 IUより低
い)では、沈澱は有効ではなくそしてマトリックス法が
有利に用いられる。
の濾過なしにチオール含有マトリックスに直接適用され
る◎ 低い混在濃度(例えばlsi!当り 25 IUより低
い)では、沈澱は有効ではなくそしてマトリックス法が
有利に用いられる。
試薬が形R−X(ここでRは前記同様であシそしてXは
チオール含有マトリックスである)のもののとき1本発
明の方法は本質的に還元した混合物と活性化したチオー
ル含有マトリックスとの接触を含む。
チオール含有マトリックスである)のもののとき1本発
明の方法は本質的に還元した混合物と活性化したチオー
ル含有マトリックスとの接触を含む。
チオール含有マトリックスの活性化は、マトリックスを
試薬R−R1(ここでR及びR1は前記同様である)K
よ多処理して基R及びR1の混合したジスルフィド及び
チオマトリックスを提供することにより達成できる。好
ましい試薬はAldrithiol−2であシ、それは
還元したストレプトキナーゼ混合物との反応に好適なチ
オマトリックス2−ピリジルジスルフィドに製造するの
に用いられる。このようなチオマトリックス2−ピリジ
ルジスルフィドは、又英国特許第1506409号明細
書に記*−gれたもののような別の手段により製造でき
、そしてチオマトリックスから製造されたものの代υに
用いることができる。
試薬R−R1(ここでR及びR1は前記同様である)K
よ多処理して基R及びR1の混合したジスルフィド及び
チオマトリックスを提供することにより達成できる。好
ましい試薬はAldrithiol−2であシ、それは
還元したストレプトキナーゼ混合物との反応に好適なチ
オマトリックス2−ピリジルジスルフィドに製造するの
に用いられる。このようなチオマトリックス2−ピリジ
ルジスルフィドは、又英国特許第1506409号明細
書に記*−gれたもののような別の手段により製造でき
、そしてチオマトリックスから製造されたものの代υに
用いることができる。
一つの態様において本発明は従ってストレプトキナーゼ
含有混合物中の混在蛋白からストレプトキナーゼを分離
する方法を提供し、その方法は混合物を還元剤によ多処
理して混在蛋白中のジスルフィド架橋を還元して遊離の
チオール基とし、混合物と不動化したチオール含有化合
物を含むマトリックスとを接触させ、このとき還元した
混合物及びマトリックスの一つは接触前に活性化され。
含有混合物中の混在蛋白からストレプトキナーゼを分離
する方法を提供し、その方法は混合物を還元剤によ多処
理して混在蛋白中のジスルフィド架橋を還元して遊離の
チオール基とし、混合物と不動化したチオール含有化合
物を含むマトリックスとを接触させ、このとき還元した
混合物及びマトリックスの一つは接触前に活性化され。
そして混在蛋白が実質的にない形でマトリックスからス
トレプトキナーゼを溶離することよシなる。
トレプトキナーゼを溶離することよシなる。
ストレプトキナーゼは、好都合にはストレプトキナーゼ
とマトリックスとの間の非共有相互反応を最低にするよ
うにデザインされた水性バッファーにより洗うことKよ
シ好都合にはマトリックスから分離できる。少くとも2
00mMのナトリウムイオン及び任意にはキレート剤例
えばEDTAを含むバッファーが好適なことが分った。
とマトリックスとの間の非共有相互反応を最低にするよ
うにデザインされた水性バッファーにより洗うことKよ
シ好都合にはマトリックスから分離できる。少くとも2
00mMのナトリウムイオン及び任意にはキレート剤例
えばEDTAを含むバッファーが好適なことが分った。
ストレプトキナーゼの分離後、マトリックスは、水性バ
ッファーにより洗ってカラムを再使用のため再生する前
K、前述したよりな還元剤により処理する。
ッファーにより洗ってカラムを再使用のため再生する前
K、前述したよりな還元剤により処理する。
マトリックスは好都合にはカラムの形で提供され、そし
て精製はパッチ式又は連続式で行うことができる。
て精製はパッチ式又は連続式で行うことができる。
本発明によるストレプトキナーゼの精製は、下記の材料
及び方法を用いて記述される。
及び方法を用いて記述される。
材料
セファロース4Bをpharmaeia LKB、ウプ
サラ、スウェーデンから得た。チオヒドロキシプロピル
及びグルタチオンアガロースは、又 pharmae i aから得られたか又はDean
et、 al(1985)の方法に従って合成した。2
.2′−ジピリジル ジス/I/ フィト(Aldri
thiol−2) 頃Aldrieh Cheanie
al (’ompany、ギリンガム。
サラ、スウェーデンから得た。チオヒドロキシプロピル
及びグルタチオンアガロースは、又 pharmae i aから得られたか又はDean
et、 al(1985)の方法に従って合成した。2
.2′−ジピリジル ジス/I/ フィト(Aldri
thiol−2) 頃Aldrieh Cheanie
al (’ompany、ギリンガム。
ドーセットから得られた。他の化学品は。
Sigma (o /ド:y ) Chemieal
Co 、プール。
Co 、プール。
ドーセット、英国又はFisons、ローボローライジ
ス。英国から得られた。
ス。英国から得られた。
方法
(1)蛋白溶液を25mMのDTTにより還元し、そし
て30分間30℃でインキエベートしたO過剰のDTT
を、 pharmaeia PD−10カラムのG−2
5クロマトグラフイーを用いるバッファー交換によるか
又はAm1con攪拌セル限外濾過システ弘の透析濾過
によるバッファー交換によるかの何れかにより除いた。
て30分間30℃でインキエベートしたO過剰のDTT
を、 pharmaeia PD−10カラムのG−2
5クロマトグラフイーを用いるバッファー交換によるか
又はAm1con攪拌セル限外濾過システ弘の透析濾過
によるバッファー交換によるかの何れかにより除いた。
両者の場合、蛋白溶液を脱気した1 50mM Na
Cl、100mM NaHxPO4,1mM EDT
A、 pH7,0バツフアーに交換した。
Cl、100mM NaHxPO4,1mM EDT
A、 pH7,0バツフアーに交換した。
(10蛋白溶液を25 mMのDTTにより還元しそし
て緩やかに攪拌しつつ30分間30℃でインキュベート
した。(蛋白溶液はこの点で10mMNaH’ 鵞PO
4、200mMNaCl pH7,0バフ7アー中にあ
った。) Aldrithiol−2(2,2’ジピリ
ジルジスルフイド)を加えて最終濃度を50 mMとし
た。過剰のAldrithiol−2を次に前述の二つ
の方法の一つKよシ除いた。
て緩やかに攪拌しつつ30分間30℃でインキュベート
した。(蛋白溶液はこの点で10mMNaH’ 鵞PO
4、200mMNaCl pH7,0バフ7アー中にあ
った。) Aldrithiol−2(2,2’ジピリ
ジルジスルフイド)を加えて最終濃度を50 mMとし
た。過剰のAldrithiol−2を次に前述の二つ
の方法の一つKよシ除いた。
(b) クロマトグラフィー
共有結合クロマトグラフィーを二つの以下の方法の一つ
により行った。方法囚(ストレプトキナーゼ前処理法(
1)の場合)又は方法@(前処理(11)の場合)。
により行った。方法囚(ストレプトキナーゼ前処理法(
1)の場合)又は方法@(前処理(11)の場合)。
(A) 20−のグルタチオンアガロース又はヒドロ
キシチオプロピルアガロースを50%スラリーとしてp
harmacia C−16りOfグラフィーカラムに
加えた。安定な充填したベツドが得られるまで。
キシチオプロピルアガロースを50%スラリーとしてp
harmacia C−16りOfグラフィーカラムに
加えた。安定な充填したベツドが得られるまで。
カラムを次に20m/時の流速で150mMNaC1,
1mM EDTA、 100mM NaH*POn P
H7,0(バッファーA)により洗った。100wdの
50mM DTTを次に10w/時の見かけの流速でカ
ラムを通してチオールアガロースの全還元を確実にした
。カラムを次にDTTが完全になくなるまで脱気したバ
ッファーAにより洗った。(カラムの10容量)。カラ
ムを次に10cPR/時の見かけの流速でAldrit
hiol−2の飽和溶液により洗い(100d)、そし
て再びAldrithiol−2がなくなるまで脱気し
たバッファーAにより洗った。
1mM EDTA、 100mM NaH*POn P
H7,0(バッファーA)により洗った。100wdの
50mM DTTを次に10w/時の見かけの流速でカ
ラムを通してチオールアガロースの全還元を確実にした
。カラムを次にDTTが完全になくなるまで脱気したバ
ッファーAにより洗った。(カラムの10容量)。カラ
ムを次に10cPR/時の見かけの流速でAldrit
hiol−2の飽和溶液により洗い(100d)、そし
て再びAldrithiol−2がなくなるまで脱気し
たバッファーAにより洗った。
方法中により製造した蛋白溶液(容量10〜20−)を
106Il/時の流速でカラムに加えそしてバッファー
Aにより洗った。カラムを280’MMでモニターしそ
して洗った蛋白のピークを保持しそしてアッセイした。
106Il/時の流速でカラムに加えそしてバッファー
Aにより洗った。カラムを280’MMでモニターしそ
して洗った蛋白のピークを保持しそしてアッセイした。
カラムは次に前述した方法により再生できた。
■ 20mgのグルタチオンアガロース又はヒドロキシ
チオプロピルアガロースを50チスラリーとしてPha
rm凰eia C−16クロマトグラフィーカラムに加
えた。カラムを次に安定な充填したベツドが得られるま
で、20α/時の流速で150mMNaCl、1mM
EDTA、100mMNaHgPO4PH7,0(、<
ッファー人)により洗った。100−の50mMDTT
を次に10eM/時の流速でカラムに通してチオー
ルアガロースの全還元を確実にした。カラムを次にDT
Tが完全になくなるまで脱気したバッファーAI’(よ
シ洗った。(カラムの10倍容量)。
チオプロピルアガロースを50チスラリーとしてPha
rm凰eia C−16クロマトグラフィーカラムに加
えた。カラムを次に安定な充填したベツドが得られるま
で、20α/時の流速で150mMNaCl、1mM
EDTA、100mMNaHgPO4PH7,0(、<
ッファー人)により洗った。100−の50mMDTT
を次に10eM/時の流速でカラムに通してチオー
ルアガロースの全還元を確実にした。カラムを次にDT
Tが完全になくなるまで脱気したバッファーAI’(よ
シ洗った。(カラムの10倍容量)。
方法(iDにより製造した蛋白溶液(容量20〜too
k)を10c*/時の流速でカラムに加えそしてバッフ
ァーAにより洗りた。カラムを280nmでモニターし
そして洗った蛋白のピークを保持しそしてアッセイした
。カラムは次に前述の方法により再生できた。
k)を10c*/時の流速でカラムに加えそしてバッフ
ァーAにより洗りた。カラムを280nmでモニターし
そして洗った蛋白のピークを保持しそしてアッセイした
。カラムは次に前述の方法により再生できた。
2、共有結合沈澱(方法C)
蛋白溶液を100mMのDTTにより還元しそして30
分間30℃でインキュベートした。150mMの最終濃
度になるようK Aldrithiol−2を次に加え
そして溶液(PH7,5)を攪拌しつつ30℃で20分
間次に35℃で15分間インキエペートした。溶液を次
に5℃に冷却しそして20分間保った。
分間30℃でインキュベートした。150mMの最終濃
度になるようK Aldrithiol−2を次に加え
そして溶液(PH7,5)を攪拌しつつ30℃で20分
間次に35℃で15分間インキエペートした。溶液を次
に5℃に冷却しそして20分間保った。
(b) 沈澱の除去
残存するAldrithiol−2及び沈澱した蛋白混
在物を次の何れかの方法にょシ除いた。
在物を次の何れかの方法にょシ除いた。
(1) Whatmanガラスマイクロファイバー〇
F/Aプレフィルタ−(孔径1.6pm)を通して濾過
し次にブックナーフルター系で真空下′whatman
ガラスマイクロファイバーG F/F ファイナルフ
ィルター(孔径0.7pm)を通してF遇し、P液を保
持しアッセイした。
F/Aプレフィルタ−(孔径1.6pm)を通して濾過
し次にブックナーフルター系で真空下′whatman
ガラスマイクロファイバーG F/F ファイナルフ
ィルター(孔径0.7pm)を通してF遇し、P液を保
持しアッセイした。
(io 5℃で20分間6000Xf で遠心分離。
上澄み液を次に沈澱からデカンテーションし、保持しア
ッセイした。
ッセイした。
アッセイ
テストするサンプルを燐酸緩衝生理食塩水にょシ10倍
に段階的に希釈して下記の希釈物を得た。
に段階的に希釈して下記の希釈物を得た。
1、0.1.0.01及び0.001゜これらの希釈し
たサンプルを次にヨーロッパ薬局方の方法の変法によリ
ストレグトリシンー0についてアッセイし、それは見容
量のサンプル及び試薬(ヨーロッパ薬局方、第2版、3
56〜3.1984に引用された)の使用を含む。方法
をサンプルの中間の希釈物について繰返した。
たサンプルを次にヨーロッパ薬局方の方法の変法によリ
ストレグトリシンー0についてアッセイし、それは見容
量のサンプル及び試薬(ヨーロッパ薬局方、第2版、3
56〜3.1984に引用された)の使用を含む。方法
をサンプルの中間の希釈物について繰返した。
結果を次の表に要約する。
結論
すべての方法(方法A、 B及びC)は高収率(80
〜10056)でストレプトキナーゼを生成し。
〜10056)でストレプトキナーゼを生成し。
そしてすべてはストレプトリジンの量をかなす減少させ
る。
る。
方法人は、溶液中に検出可能な量のストレグトリジ/を
残す。方法Bの場合、ストレプトキナーゼの低濃度のた
めに、ストレプトリジンの量はアッセイの感度より低く
、従って結果は「より少〈」と表示される。方法8例1
の場合、ストレプトキナーゼの量は、サンプルがヨーロ
ッパ薬局方の標準を通るか又は通らないかを決めるには
不十分であった。低い量のストレプトリジンは、方法C
により生成した材料中で検出可能であるが、これらはヨ
ーロッパ薬局方の明細の中にある。方法Cは、チオール
マトリックスを利用するコストなしにヨーロッパ薬局方
の標準の純度に材料を生成することが要求されると1!
、好ましい。
残す。方法Bの場合、ストレプトキナーゼの低濃度のた
めに、ストレプトリジンの量はアッセイの感度より低く
、従って結果は「より少〈」と表示される。方法8例1
の場合、ストレプトキナーゼの量は、サンプルがヨーロ
ッパ薬局方の標準を通るか又は通らないかを決めるには
不十分であった。低い量のストレプトリジンは、方法C
により生成した材料中で検出可能であるが、これらはヨ
ーロッパ薬局方の明細の中にある。方法Cは、チオール
マトリックスを利用するコストなしにヨーロッパ薬局方
の標準の純度に材料を生成することが要求されると1!
、好ましい。
代理人 弁理士 秋 沢 政 光
他1名
Claims (10)
- (1)ストレプトキナーゼ含有混合物中の混在蛋白から
ストレプトキナーゼを分離する方法において、混合物を
還元剤により処理して混在蛋白中のジスルフィド架橋を
還元して遊離のチオール基とし、混合物とR−X(ここ
でRは遊離チオール基と反応しうる基であり、Xは遊離
チオール基と反応しうる基R^1であるか又はチオール
含有マトリックスである)の試薬とを接触させ、次に混
合物から得られた化学的に変性した混在蛋白を分離して
混在蛋白を実質的に含まない形のストレプトキナーゼを
もたらすことよりなる前記方法。 - (2)還元剤がジチオトレイトールである請求項1記載
の方法。 - (3)基R及びR^1が 5−ニトロ−2−ピリジルチオ 5−カルボキシ−2−ピリジルチオ 2−ピリジルチオ 4−ピリジルチオ 2−ベンゾチアゾリルチオ 4−ニトロ−3−カルボキシフェニルチオ 及び上記のピリジル基のN−オキシド から選ばれる請求項1又は2記載の方法。
- (4)試薬R−XがR−R^1の形のものである請求項
1〜3の何れか一つの項記載の方法。 - (5)試薬R−R^1が2,2′−ジピリジルジルスル
フイドである請求項4記載の方法。 - (6)試薬R−R^1の濃度が10〜200mMである
請求項4又は5記載の方法。 - (7)還元された混合物と試薬R−R^1との反応がp
H6.0〜8.5で行われる請求項4〜6の何れか一つ
の項記載の方法。 - (8)還元された混合物と試薬R−R^1との反応が5
〜35℃の温度で行われる請求項4〜7の何れか一つの
項記載の方法。 - (9)生じた化学的に変性された混在蛋白が、濾過、沈
降、遠心分離により又はクラマトグラフイーのカラム内
の保持により分離される沈澱を形成する請求項4〜8の
何れか一つの項記載の方法。 - (10)残存する化学的に変性された混在蛋白がチオー
ル交換クロマトグラフィーにより除去される請求項9記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8824496.7 | 1988-10-19 | ||
GB888824496A GB8824496D0 (en) | 1988-10-19 | 1988-10-19 | Process |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02128688A true JPH02128688A (ja) | 1990-05-17 |
JP2837467B2 JP2837467B2 (ja) | 1998-12-16 |
Family
ID=10645453
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1269272A Expired - Lifetime JP2837467B2 (ja) | 1988-10-19 | 1989-10-18 | 精製方法 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5334384A (ja) |
EP (1) | EP0365278B1 (ja) |
JP (1) | JP2837467B2 (ja) |
KR (1) | KR0136613B1 (ja) |
AT (1) | ATE103633T1 (ja) |
AU (1) | AU622492B2 (ja) |
CA (1) | CA2000850A1 (ja) |
DE (1) | DE68914242T2 (ja) |
DK (1) | DK515889A (ja) |
ES (1) | ES2062029T3 (ja) |
GB (1) | GB8824496D0 (ja) |
IE (1) | IE63478B1 (ja) |
NZ (1) | NZ231039A (ja) |
PT (1) | PT92024B (ja) |
ZA (1) | ZA897849B (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SI1659178T1 (sl) | 1998-02-05 | 2010-07-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Postopek za čiščenje ali proizvodnjo MAGE proteina |
US6388073B1 (en) | 2000-07-26 | 2002-05-14 | Shire Us Inc. | Method for the manufacture of anagrelide |
WO2002030542A2 (en) | 2000-10-12 | 2002-04-18 | Robert Corcoran | Purification of substance by reaction affinity chromatography |
KR20020007231A (ko) * | 2001-08-01 | 2002-01-26 | 이병철 | 스트렙토키나제의 정제방법 |
US7700608B2 (en) * | 2004-08-04 | 2010-04-20 | Shire Holdings Ag | Quinazoline derivatives and their use in the treatment of thrombocythemia |
US20060030574A1 (en) * | 2004-08-04 | 2006-02-09 | Shire Holdings Ag | Quinazoline derivatives useful for the treatment of peripheral arterial disease and as phosphodiesterase inhibitors |
US8304420B2 (en) | 2006-11-28 | 2012-11-06 | Shire Llc | Substituted quinazolines for reducing platelet count |
US7910597B2 (en) * | 2006-11-28 | 2011-03-22 | Shire Llc | Substituted quinazolines |
NZ589557A (en) * | 2008-06-04 | 2012-08-31 | Talecris Biotherapeutics Inc | Immobilised streptokinase, method and kit for preparing plasmin |
PL2403865T3 (pl) | 2009-03-03 | 2016-01-29 | Grifols Therapeutics Inc | Sposoby wytwarzania plazminogenu |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2784145A (en) * | 1955-11-22 | 1957-03-05 | American Cyanamid Co | Recovery of streptokinase |
US3226304A (en) * | 1960-10-24 | 1965-12-28 | American Cyanamid Co | High purity streptokinase and process for preparing same |
US3419472A (en) * | 1960-10-24 | 1968-12-31 | American Cyanamid Co | Process for preparing streptokinaserich material |
US3255094A (en) * | 1963-01-10 | 1966-06-07 | Baxter Laboratories Inc | Method for purification of streptokinase |
US3444045A (en) * | 1966-09-20 | 1969-05-13 | American Cyanamid Co | Process for purifying streptokinase |
US4381346A (en) * | 1979-11-13 | 1983-04-26 | Huasin Syed S | Isolation of plasminogen activators useful as therapeutic and diagnostic agents |
-
1988
- 1988-10-19 GB GB888824496A patent/GB8824496D0/en active Pending
-
1989
- 1989-10-17 DK DK515889A patent/DK515889A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-10-17 NZ NZ231039A patent/NZ231039A/en unknown
- 1989-10-17 DE DE68914242T patent/DE68914242T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-10-17 AT AT89310648T patent/ATE103633T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-10-17 IE IE333889A patent/IE63478B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-10-17 CA CA002000850A patent/CA2000850A1/en not_active Abandoned
- 1989-10-17 ES ES89310648T patent/ES2062029T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-17 AU AU42964/89A patent/AU622492B2/en not_active Ceased
- 1989-10-17 EP EP89310648A patent/EP0365278B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-17 ZA ZA897849A patent/ZA897849B/xx unknown
- 1989-10-17 US US07/422,430 patent/US5334384A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-18 PT PT92024A patent/PT92024B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-10-18 JP JP1269272A patent/JP2837467B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-18 KR KR1019890015025A patent/KR0136613B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2837467B2 (ja) | 1998-12-16 |
NZ231039A (en) | 1991-07-26 |
US5334384A (en) | 1994-08-02 |
IE893338L (en) | 1990-04-19 |
AU622492B2 (en) | 1992-04-09 |
ATE103633T1 (de) | 1994-04-15 |
DE68914242T2 (de) | 1994-07-07 |
EP0365278A2 (en) | 1990-04-25 |
KR0136613B1 (ko) | 1998-04-25 |
EP0365278A3 (en) | 1991-08-28 |
DK515889A (da) | 1990-04-20 |
PT92024B (pt) | 1995-08-09 |
IE63478B1 (en) | 1995-04-19 |
GB8824496D0 (en) | 1988-11-23 |
KR900006512A (ko) | 1990-05-08 |
DE68914242D1 (de) | 1994-05-05 |
PT92024A (pt) | 1990-04-30 |
EP0365278B1 (en) | 1994-03-30 |
AU4296489A (en) | 1990-04-26 |
DK515889D0 (da) | 1989-10-17 |
CA2000850A1 (en) | 1990-04-19 |
ES2062029T3 (es) | 1994-12-16 |
ZA897849B (en) | 1990-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6355792B1 (en) | Method for isolating and purifying nucleic acids | |
US6969603B2 (en) | Method for isolating DNA | |
JP3662020B2 (ja) | コラゲナーゼを精製する方法 | |
JPH02128688A (ja) | 精製方法 | |
JPS6348515B2 (ja) | ||
Gabay et al. | Interaction of the lamB protein with the peptidoglycan layer in Escherichia coli K12 | |
JPH11146783A (ja) | リボ核酸の抽出方法 | |
JPS63275600A (ja) | 高純度プロテインa製剤の製法 | |
DE68911503T2 (de) | Wiedergewinnung von urokinaseverbindungen. | |
DE68919360T2 (de) | Verfahren zur reinigung hochreiner heparinase in grosser menge. | |
JPS60224491A (ja) | 酵素精製法 | |
WO1995029187A1 (en) | Chromatographic process for the copurification of chondroitinase i and ii proteins | |
US4650760A (en) | Modified alkaline phosphatase | |
US4656128A (en) | Modified alkaline phosphatase | |
KR970002903B1 (ko) | 스트렙토키나제의 정제방법 | |
JPH03164172A (ja) | ウロキナーゼ前駆体様蛋白質の精製方法 | |
CN115261345A (zh) | 一种原核表达hi0854蛋白的纯化方法 | |
JPH09187274A (ja) | ウロキナーゼ前駆体の精製方法 | |
JPH0217153B2 (ja) | ||
JPH07173189A (ja) | リガンド存在下で二段階に分けて行うヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの用法 | |
JPS6391400A (ja) | リンホトキシンの疎水性クロマトグラフイ−による精製法 | |
JPH01137999A (ja) | 微生物含有生体試料の処理方法 | |
JPS63281051A (ja) | Dnaを含む試料の処理方法 | |
JPH02128687A (ja) | 限外濾過膜を用いた不活性形蛋白質の処理方法 | |
SK419391A3 (sk) | Spôsob izolácie plazminogénových aktivátorov použiteľných ako terapeutické a diagnostické činidlá |