JPS61291527A - ヒトα２―プラスミンインヒビターの分離回収法 - Google Patents
ヒトα２―プラスミンインヒビターの分離回収法Info
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- JPS61291527A JPS61291527A JP60131991A JP13199185A JPS61291527A JP S61291527 A JPS61291527 A JP S61291527A JP 60131991 A JP60131991 A JP 60131991A JP 13199185 A JP13199185 A JP 13199185A JP S61291527 A JPS61291527 A JP S61291527A
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- plasmin
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ａ、産業上の利用分野
本発明は、ヒトα２−プラスミンインヒビターに対する
選択的吸着体およびその吸着体を用いるヒトαオープラ
スミンインヒビタ−含有液体からのヒトα２−プラスミ
ンインヒビターの分離回収法に関するものである。
選択的吸着体およびその吸着体を用いるヒトαオープラ
スミンインヒビタ−含有液体からのヒトα２−プラスミ
ンインヒビターの分離回収法に関するものである。
ヒトの一−プラスミンインヒビターは青水と諸井によっ
て、最初に単離・精製され、ｍ雑木溶解＃累のプラスミ
ン（ｐｌａａｍｉｎ）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻
害する強力なプラスミンインヒビタ−であり、１１．７
９６の糖を含む分子量約６ ＬＯＧ ００１本鎖０糖蛋
白質であることが知られている（ Ｍｏｒｏｉ ＆ Ａ
ｏｋｉ ；Ｔｈ＠Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＋２５１ｔ５９５６−
５９６５（１９７６）参照〕。
て、最初に単離・精製され、ｍ雑木溶解＃累のプラスミ
ン（ｐｌａａｍｉｎ）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻
害する強力なプラスミンインヒビタ−であり、１１．７
９６の糖を含む分子量約６ ＬＯＧ ００１本鎖０糖蛋
白質であることが知られている（ Ｍｏｒｏｉ ＆ Ａ
ｏｋｉ ；Ｔｈ＠Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＋２５１ｔ５９５６−
５９６５（１９７６）参照〕。
一方、ヒトα２−プラスミンインヒビターには、３ｆ！
１類の活性部位があることが知られている。第１は、プ
ラスミンの線維素溶解作用阻害部位（以下これを１リア
クテイプサイビということがある。） ＣＢ、Ｗｉｍａ
ｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１＠ｎ；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙｓ２
５４ ＄９２９１−９２９７（１９７９）参照〕であり
、第２はカルボキシル基未満側のプラスミン結合部位（
Ｂ、Ｗｌｍａｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ； Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｌｏｅｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ＋ ８ ４ ＋ ５ ７ ３−５ ７８
（１９７８）参照〕であり、ｗ、３はアミ７基末端のフ
ィブリン結合部位である（ Ｙ、５ａｋａｔａ＋ｅｔａ
１．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｌｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋
１ ６ ｖ ２７９−２ ８２（１９７９）参照〕
。
１類の活性部位があることが知られている。第１は、プ
ラスミンの線維素溶解作用阻害部位（以下これを１リア
クテイプサイビということがある。） ＣＢ、Ｗｉｍａ
ｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１＠ｎ；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙｓ２
５４ ＄９２９１−９２９７（１９７９）参照〕であり
、第２はカルボキシル基未満側のプラスミン結合部位（
Ｂ、Ｗｌｍａｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ； Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｌｏｅｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ＋ ８ ４ ＋ ５ ７ ３−５ ７８
（１９７８）参照〕であり、ｗ、３はアミ７基末端のフ
ィブリン結合部位である（ Ｙ、５ａｋａｔａ＋ｅｔａ
１．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｌｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋
１ ６ ｖ ２７９−２ ８２（１９７９）参照〕
。
従来、ヒト血漿中からの侑−プラスミンインヒビタ−の
精製には、このインヒビターのプラスミノーゲンへの親
和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーが用
いられている（ Ｍｏｒｏｉ ＆ Ａｏｋｉ ；Ｔｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙｓ ２５１ ＋ ５９５６−５９６５（１
９７６）参照〕。
精製には、このインヒビターのプラスミノーゲンへの親
和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーが用
いられている（ Ｍｏｒｏｉ ＆ Ａｏｋｉ ；Ｔｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙｓ ２５１ ＋ ５９５６−５９６５（１
９７６）参照〕。
しかし、この方法は、精製ＫｉＦするステップが多く、
且つ時間も長くかかるという欠点があった。
且つ時間も長くかかるという欠点があった。
一方ｓａ、−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロ
ーナル抗体をリガンドとして不溶性担体（例えばセファ
ロース）Ｋ結合させた吸海体を用いれば、ヒトα、−α
、プラスミンインヒビタ−含有液体１例えばヒト血漿中
のα！−プラスミンインヒビターを容易に、短時間で分
離または精製することができると考えられる。
ーナル抗体をリガンドとして不溶性担体（例えばセファ
ロース）Ｋ結合させた吸海体を用いれば、ヒトα、−α
、プラスミンインヒビタ−含有液体１例えばヒト血漿中
のα！−プラスミンインヒビターを容易に、短時間で分
離または精製することができると考えられる。
ｂ０発明の構底
そこで１本発明者らは、ヒトａ雪−プラスミンインヒビ
ターに対する七ツクローナル抗体について研究を１ねた
ところ、ヒトα會−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミンの線維素溶解作用阻止部位を特異的にｇ識し、
ヒトａ茸−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻止作
用を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を見出し
、またこのモノクローナル抗体を産生ずるハイプリドー
マ細胞を創作し得、既に提案した。
ターに対する七ツクローナル抗体について研究を１ねた
ところ、ヒトα會−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミンの線維素溶解作用阻止部位を特異的にｇ識し、
ヒトａ茸−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻止作
用を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を見出し
、またこのモノクローナル抗体を産生ずるハイプリドー
マ細胞を創作し得、既に提案した。
本発明者らは、かくして得られたモノクローナル抗体の
特異的な作用の利用について叉に研究を進めた結果、ヒ
ト偽−プラスミンインヒビターを特異的に吸着し得る吸
着体およびそれを用いると、ヒトα２−プラスミンイン
ヒビター含有液体からヒト偽−プラスミンインヒビター
を選択的に分離・回収することができることを見出し本
発明圧到達した。
特異的な作用の利用について叉に研究を進めた結果、ヒ
ト偽−プラスミンインヒビターを特異的に吸着し得る吸
着体およびそれを用いると、ヒトα２−プラスミンイン
ヒビター含有液体からヒト偽−プラスミンインヒビター
を選択的に分離・回収することができることを見出し本
発明圧到達した。
すなわち２本発明はヒトα２−プラスミンインヒビター
におけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異
的に＆！繊して結合し得るヒト偽−プラスミンインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体またはそのＦａｂ部分
を少（とも含有する該モノクローナル抗体の断片を不溶
性固体担体に固定化させたヒトα２−プラスミンインヒ
ビターに対する選択的吸着体であり、またこの選択的吸
着体を、ヒトα２−プラスミンインヒビターを含有する
液体と接触させて、紋担体にヒトα２−プラスミンイン
ヒビターを吸着させた後、該液体から該担体を分離し、
そして必！！により該担体からヒトａ、−プラスミンイ
ンヒビタ−を脱着させて討ヒトα、−プラスミンインヒ
ビタ−を回収することを特徴とするヒトαオープラスミ
ンインヒビタ−含有液体からの該ヒトα、−プラスミン
インヒビターの分離回収方法である。
におけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異
的に＆！繊して結合し得るヒト偽−プラスミンインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体またはそのＦａｂ部分
を少（とも含有する該モノクローナル抗体の断片を不溶
性固体担体に固定化させたヒトα２−プラスミンインヒ
ビターに対する選択的吸着体であり、またこの選択的吸
着体を、ヒトα２−プラスミンインヒビターを含有する
液体と接触させて、紋担体にヒトα２−プラスミンイン
ヒビターを吸着させた後、該液体から該担体を分離し、
そして必！！により該担体からヒトａ、−プラスミンイ
ンヒビタ−を脱着させて討ヒトα、−プラスミンインヒ
ビタ−を回収することを特徴とするヒトαオープラスミ
ンインヒビタ−含有液体からの該ヒトα、−プラスミン
インヒビターの分離回収方法である。
一般に、吸着体の生物学的親和力を生体物質の分離・精
製に利用するクロマトグラフィーは、アフィニティーク
ロマトグラフィーと呼ばれている〔例えば、千畑一部、
土佐哲也。
製に利用するクロマトグラフィーは、アフィニティーク
ロマトグラフィーと呼ばれている〔例えば、千畑一部、
土佐哲也。
松尾雄志著「実験と応用アフィニティークロマトグラフ
ィー」購餘社サイエンティフィック参照〕。
ィー」購餘社サイエンティフィック参照〕。
本発明におけるアフィニティー、リガンド９不溶性担体
、吸着体なる飴は、それぞれ下記に意味に解するものと
する。
、吸着体なる飴は、それぞれ下記に意味に解するものと
する。
アフィニティー；
２種物質問に存在する巷異的観和カ
リガント；
吸着あるいは精製を目的とする物質と７フイニテイーを
有する物質 不溶性固体担体： 水に不溶性の支持体（これにはりガントは含まれない） 吸 着 体 ： リガンドを不溶性固体担体に固定化したもの 次に本発明におけるヒトαオープラスミンインヒビタ−
に対する選択的吸着体およびヒトαオープラスミンイン
ヒビタ−含有液体よりヒト丙−プラスミンインヒビター
を分離回収する方法について絆ｍく説明する。
有する物質 不溶性固体担体： 水に不溶性の支持体（これにはりガントは含まれない） 吸 着 体 ： リガンドを不溶性固体担体に固定化したもの 次に本発明におけるヒトαオープラスミンインヒビタ−
に対する選択的吸着体およびヒトαオープラスミンイン
ヒビタ−含有液体よりヒト丙−プラスミンインヒビター
を分離回収する方法について絆ｍく説明する。
ヒトαオープラスミンインヒビタ−に対スルモノクロー
ナル抗体またはそのＦａｂ部分を少くとも含有する断片
を適当な不溶性担体（例えばセファ０−ス）に化学的に
リガンドとして結合させ、これをカラムに詰め適当な緩
衝浴＊（例えば５０ ｍ Ｍ ）リス緩衝液ｐＨ７，４
ｗ０．１５ Ｍ ＮａＣｌ ）によって平衝化する。こ
の吸着体に検体試料（例えばヒト血秦）を添加して検体
試料中のヒトαオープラスミンインヒビタ−を吸着させ
る。次に適当な洗浄浴液（例えば、５０ｍＭ）リス緩衝
液、ｐＨ７，４＋０．１５ ＭＮａＣＪ ） Ｋよって
、不純物を吸着体から除去する。最後に吸着体に存在す
るα、−プラスミンインヒビタ−を適当な溶液（例えば
５０％エチレングリコールｐＨ１１，５）で吸着体から
溶出させる。溶出画分中のα、−プラスミンインヒビタ
−の抗原量及び活性な測定゛すれば溶出したα、−プラ
スミンインヒビタ−の割合を算出することができる。
ナル抗体またはそのＦａｂ部分を少くとも含有する断片
を適当な不溶性担体（例えばセファ０−ス）に化学的に
リガンドとして結合させ、これをカラムに詰め適当な緩
衝浴＊（例えば５０ ｍ Ｍ ）リス緩衝液ｐＨ７，４
ｗ０．１５ Ｍ ＮａＣｌ ）によって平衝化する。こ
の吸着体に検体試料（例えばヒト血秦）を添加して検体
試料中のヒトαオープラスミンインヒビタ−を吸着させ
る。次に適当な洗浄浴液（例えば、５０ｍＭ）リス緩衝
液、ｐＨ７，４＋０．１５ ＭＮａＣＪ ） Ｋよって
、不純物を吸着体から除去する。最後に吸着体に存在す
るα、−プラスミンインヒビタ−を適当な溶液（例えば
５０％エチレングリコールｐＨ１１，５）で吸着体から
溶出させる。溶出画分中のα、−プラスミンインヒビタ
−の抗原量及び活性な測定゛すれば溶出したα、−プラ
スミンインヒビタ−の割合を算出することができる。
本発明における選択的吸着体に用いられる不溶性固体担
体とし【は１種々のものが使用できるが、例えば材質と
してアガロース、ポリアクリルアミド、セルロース、デ
キストラン、またはマレイン酸ポリマー或いはこれらの
混合物が好ましく用いられる。これら不溶性固体担体の
形状としては、粉末状９粒状。
体とし【は１種々のものが使用できるが、例えば材質と
してアガロース、ポリアクリルアミド、セルロース、デ
キストラン、またはマレイン酸ポリマー或いはこれらの
混合物が好ましく用いられる。これら不溶性固体担体の
形状としては、粉末状９粒状。
ペレット状、ビーズ状、フィルム状、＊繊状など麺々の
形態であることができる。
形態であることができる。
本発明の吸着体に使用されるヒトαオープラスミンイン
ヒビタ−に対するモノクローナル抗体は、本発明者らに
よって見出され、先に特許出願された（昭和５９年４月
１７日付出願昭５９−７５７７８号；発明の名称１モノ
クー−ナル抗体の製造方法′）。
ヒビタ−に対するモノクローナル抗体は、本発明者らに
よって見出され、先に特許出願された（昭和５９年４月
１７日付出願昭５９−７５７７８号；発明の名称１モノ
クー−ナル抗体の製造方法′）。
本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造方法につ
いては前記特許出願明細書く詳細に説明されているが、
以下にその内容を簡単に説明する。
いては前記特許出願明細書く詳細に説明されているが、
以下にその内容を簡単に説明する。
（モノクローナル抗体及びその製造方法）抗ｆｆ１Ｋ用
いるヒトαオープラスミンインヒビタ−は、＃記青水と
諸井の方法によりヒト血漿中より単離精泉された。
いるヒトαオープラスミンインヒビタ−は、＃記青水と
諸井の方法によりヒト血漿中より単離精泉された。
１１ｉ−Ｂａ １ ｂ／ｃマウスを用いるが、他の系（
５ｔｒａｉｎｓ ）の、マウスを使用することもできる
。その際、免疫計−及びヒトαオープラスミンインヒビ
タ−の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形
成されるよう選ばれるべきである。例えばマウスに少量
のヒトα、−プラスミンインヒビタ−で成る間隔で腹腔
に数回免疫の後、さらに数回静脈に投与した。最終免疫
の数日後に融合の為に膵臓細胞を取り出す。
５ｔｒａｉｎｓ ）の、マウスを使用することもできる
。その際、免疫計−及びヒトαオープラスミンインヒビ
タ−の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形
成されるよう選ばれるべきである。例えばマウスに少量
のヒトα、−プラスミンインヒビタ−で成る間隔で腹腔
に数回免疫の後、さらに数回静脈に投与した。最終免疫
の数日後に融合の為に膵臓細胞を取り出す。
膵臓を無菌的に取り出し、それから単
細胞懸濁液を調製する。それらの牌ａｍ胞を適当なライ
ンからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用に
より細胞融合させる。膵臓細胞対骨髄朧細胞の好ましい
比率は約２０：１〜約２：１の範囲である。約１０’個
の膵臓細胞について０．５〜１．５紅の融合媒体の使用
が適当である。
ンからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用に
より細胞融合させる。膵臓細胞対骨髄朧細胞の好ましい
比率は約２０：１〜約２：１の範囲である。約１０’個
の膵臓細胞について０．５〜１．５紅の融合媒体の使用
が適当である。
細胞融合に用いる骨髄Ｗ１１細胞は多く知られているが
、本発明では、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ＵＩＩＩａ胞（
以下Ｐ３−Ｕｌと略記する） （Ｙｅｌｔｏｎ＋ Ｄ、
Ｅ ｅｔａｌ、、ｃｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ８１１１（１９７８）参照〕を用いた。これは８−７
ザグアニン耐性の細胞ラインであり、酵素ヒポキサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ （ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ）が
欠失しており、それゆえにＨＡＴ（ヒポキサンチン！ア
ミノプテリン！チミジン）培地中では生存しない。
、本発明では、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ＵＩＩＩａ胞（
以下Ｐ３−Ｕｌと略記する） （Ｙｅｌｔｏｎ＋ Ｄ、
Ｅ ｅｔａｌ、、ｃｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ８１１１（１９７８）参照〕を用いた。これは８−７
ザグアニン耐性の細胞ラインであり、酵素ヒポキサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ （ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ）が
欠失しており、それゆえにＨＡＴ（ヒポキサンチン！ア
ミノプテリン！チミジン）培地中では生存しない。
また、この細胞ラインはそれ自体抗体を分泌しない、い
わゆる非分泌製である。
わゆる非分泌製である。
好ましい融合促進剤としては、例えば
平均分子量が１０００〜４０００のポリエチレングリコ
ールを有利に使用できるが。
ールを有利に使用できるが。
この分野で知られている他の融合促進剤を使用すること
もできる。
もできる。
別の容器内（例えばマイクロタイター
プレート）で未融合の牌ｌ１１１１ｍ胞、未融合の骨髄
腫細胞および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのく十分な時間（約１週間）培養する。培地は
薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未融合
の骨髄腫細胞を支持しないもの（例えば的紀ＨＡＴ培地
）が使用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫細
胞は死滅する。また未融合の膵臓細胞は非腫瘍性細胞な
のである一定期間後（約１週間後）死滅する。
腫細胞および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのく十分な時間（約１週間）培養する。培地は
薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未融合
の骨髄腫細胞を支持しないもの（例えば的紀ＨＡＴ培地
）が使用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫細
胞は死滅する。また未融合の膵臓細胞は非腫瘍性細胞な
のである一定期間後（約１週間後）死滅する。
これらに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍性
と観牌臓細胞の性質をあわせ持つために選択培地中で生
存できろ。
と観牌臓細胞の性質をあわせ持つために選択培地中で生
存できろ。
かくしてハイプリドーマ細胞が検出さ
れた後、その培養上清を採取し、ヒト偽−プラスミンイ
ンヒビターに対する抗体について酵素免疫定量法（Ｅｎ
ｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ ５ｏｒｂｅｎｔ
Ａｓ５ａｙ ） Ｋよりスクリーニングする。
ンヒビターに対する抗体について酵素免疫定量法（Ｅｎ
ｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ ５ｏｒｂｅｎｔ
Ａｓ５ａｙ ） Ｋよりスクリーニングする。
目的の抗体を産出するハイプリドーマ
細胞を適当な方法（例えば限定希釈法）でクローン化す
ると、抗体は２つの異なった方法で産生される。その第
１の方法によればハイプリドーマ細胞を一定時間適当な
培地で培養することによりその培養上清から、そのハイ
プリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を得るこ
とができる。第２の方法によればノ１イプリドーマ細胞
は同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注
射することができる。一定時間後の宿主動物の血液中及
び腹水中より、そのハイプリドーマ細胞の産生するモノ
クローナル抗体を得ることができる。
ると、抗体は２つの異なった方法で産生される。その第
１の方法によればハイプリドーマ細胞を一定時間適当な
培地で培養することによりその培養上清から、そのハイ
プリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を得るこ
とができる。第２の方法によればノ１イプリドーマ細胞
は同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注
射することができる。一定時間後の宿主動物の血液中及
び腹水中より、そのハイプリドーマ細胞の産生するモノ
クローナル抗体を得ることができる。
本発明においては、上記の如（して得たモノクローナル
抗体自体を使用することもでき。
抗体自体を使用することもでき。
また七〇Ｆａｂ部分を少くとも含有する該モノクローナ
ル抗体の断片も同様に使用することができる。
ル抗体の断片も同様に使用することができる。
か〜る断片としては、上記モノクローナル抗体を蛋白分
解酵素であるパパインを用いて切断したＦａｂ部分を少
くとも含むものであればよく、その他ヘプシン、トリプ
シンまたはプラスミンなどの酵素で分解した後に得られ
るＦａｂ部分を少くとも含する断片であっても差支えが
ない。抗体をパパインを用いて分解しＦａｂ部分を得る
ことに関してはそれ自体ポーターらによって既に知られ
ている方法である（ Ｒ，Ｒ，Ｐｏｒｔｅｒ＊Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ７３ ＋１１９〜１
２６（１９５９）参照〕。
解酵素であるパパインを用いて切断したＦａｂ部分を少
くとも含むものであればよく、その他ヘプシン、トリプ
シンまたはプラスミンなどの酵素で分解した後に得られ
るＦａｂ部分を少くとも含する断片であっても差支えが
ない。抗体をパパインを用いて分解しＦａｂ部分を得る
ことに関してはそれ自体ポーターらによって既に知られ
ている方法である（ Ｒ，Ｒ，Ｐｏｒｔｅｒ＊Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ７３ ＋１１９〜１
２６（１９５９）参照〕。
これらの不溶性固体担体へのモノクローナル抗体又はそ
の断片の固定化は、一般ＫＭモノクローナル抗体ヌは断
片を該不溶性固体担体に化学的に結合することＫより行
なわれる。
の断片の固定化は、一般ＫＭモノクローナル抗体ヌは断
片を該不溶性固体担体に化学的に結合することＫより行
なわれる。
例えば、上記の如く、ヒトａ、−プラスミンインヒビタ
−含有液体との接触によりヒトα２−プラスミンインヒ
ビターを吸着した吸着体は。
−含有液体との接触によりヒトα２−プラスミンインヒ
ビターを吸着した吸着体は。
該液体から分離すれば、該液体中のヒトα２−プラスミ
ンインヒビターは除去される。これＫより、＃液体とし
てヒト血漿又はヒト血清を用いた場合には、ヒトα２−
プラスミンインヒビターを実質的に含まないヒト血漿又
はヒト血清が得られ、このようなヒトら一プラスミンイ
ンヒビターを含まないヒト血漿又はヒト血清は、例えば
血漿交換又は血清交換療法に有利に用いることができる
。
ンインヒビターは除去される。これＫより、＃液体とし
てヒト血漿又はヒト血清を用いた場合には、ヒトα２−
プラスミンインヒビターを実質的に含まないヒト血漿又
はヒト血清が得られ、このようなヒトら一プラスミンイ
ンヒビターを含まないヒト血漿又はヒト血清は、例えば
血漿交換又は血清交換療法に有利に用いることができる
。
一方、皺液体から分離したヒトα２−プラスミンインヒ
ビターを吸着した吸着体は、脱着処理に付すことにより
、吸着体からヒトα２−プラスミンインヒビターを溶離
させて、ヒトα２−プラスミンインヒビターを回収する
ことができる。回収されたヒトα２−プラスミンインヒ
ビターは１例えば先天性α２−プラスミンインヒビター
欠損症、肝疾患等に於ける補充剤、或いは止血剤等とし
て使用することができる。
ビターを吸着した吸着体は、脱着処理に付すことにより
、吸着体からヒトα２−プラスミンインヒビターを溶離
させて、ヒトα２−プラスミンインヒビターを回収する
ことができる。回収されたヒトα２−プラスミンインヒ
ビターは１例えば先天性α２−プラスミンインヒビター
欠損症、肝疾患等に於ける補充剤、或いは止血剤等とし
て使用することができる。
上記の脱着処理は、ヒトα２−プラスミンインヒビター
を吸着した吸着体を溶離液で処理することＫより行なう
ことができる。用いうる溶離液としては、ｐＨが２．５
〜１２．５ 、好ましくは５．θ〜１１．５のエチレン
グリコール水浴液が有利に用いられるが、この他に、グ
リセリン水浴液、グリシン水溶液、プロピオン酸水溶液
、チオシアン酸塩溶液、グアニジン水溶液等を使用する
こともできる。
を吸着した吸着体を溶離液で処理することＫより行なう
ことができる。用いうる溶離液としては、ｐＨが２．５
〜１２．５ 、好ましくは５．θ〜１１．５のエチレン
グリコール水浴液が有利に用いられるが、この他に、グ
リセリン水浴液、グリシン水溶液、プロピオン酸水溶液
、チオシアン酸塩溶液、グアニジン水溶液等を使用する
こともできる。
上記エチレングリコール水浴液中のエチレングリコール
の濃度は２０〜８０％、好ましくは４０〜６０５＋６が
有利に用いられる。またこの水溶液にはｐＨの調整のた
めに適宜、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸
塩、 ＩＴｒｉｇ塩、リン酸塩、ペロナール塩等の塩
類、塩ｍ、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸等の
酸類、エタノールアミン等のアミン類。
の濃度は２０〜８０％、好ましくは４０〜６０５＋６が
有利に用いられる。またこの水溶液にはｐＨの調整のた
めに適宜、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸
塩、 ＩＴｒｉｇ塩、リン酸塩、ペロナール塩等の塩
類、塩ｍ、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸等の
酸類、エタノールアミン等のアミン類。
７ンモニ７９尿素等を含ませることができる。
脱着処理は、氷点以上３７℃以下でおこなわれ、好まし
くは２〜１０℃がより有利に行われる。脱着処理はカラ
ム法、バッチ法等の方法によりおこない、溶出Ｋｉｔ’
する時間は短かい事が望ましいが、２日問程要してもよ
い。
くは２〜１０℃がより有利に行われる。脱着処理はカラ
ム法、バッチ法等の方法によりおこない、溶出Ｋｉｔ’
する時間は短かい事が望ましいが、２日問程要してもよ
い。
ｋｍされたヒトα２−プラスミンインヒビターの分離回
収はそれ自体既知の方法１例えば透析＊’ａ１Ｍ液体ク
ロマトグラフィーなどにより行なうことができる。
収はそれ自体既知の方法１例えば透析＊’ａ１Ｍ液体ク
ロマトグラフィーなどにより行なうことができる。
以上本発明によればヒトα２−プラスミンインヒビター
含有液体からヒトα２−プラスミンインヒビターを簡単
な手段で短時間に分離・回収することができる。
含有液体からヒトα２−プラスミンインヒビターを簡単
な手段で短時間に分離・回収することができる。
以下実施例を掲げて本発明を詳述する。
屹施例１
α、−プラスミンインヒビタ−に対するモノクローナル
抗体 をリガンドとして化学的に結合させた
吸着体（１，０１ｊ）をカラムに結め過当な緩衝液（０
，０１Ｍ ！Ｊン酸ナトリウム緩衝液＊ ０．１５ Ｍ
ＮａＣｌ ｐＨ７，２３で平衡化後、ヒト血漿２．０
１をａ着体をつめたカラムに添加した。吸着体に吸着さ
れずに溶出した画分を集め「素通り画分」とした。次に
上記緩衝液１０１１７を添加し、吸着体に非特異的に吸
着（結合）している物質を溶出し、築め、「洗浄画分」
とした。
抗体 をリガンドとして化学的に結合させた
吸着体（１，０１ｊ）をカラムに結め過当な緩衝液（０
，０１Ｍ ！Ｊン酸ナトリウム緩衝液＊ ０．１５ Ｍ
ＮａＣｌ ｐＨ７，２３で平衡化後、ヒト血漿２．０
１をａ着体をつめたカラムに添加した。吸着体に吸着さ
れずに溶出した画分を集め「素通り画分」とした。次に
上記緩衝液１０１１７を添加し、吸着体に非特異的に吸
着（結合）している物質を溶出し、築め、「洗浄画分」
とした。
最後に通用な溶出液を用いて吸着体に結合したヒトα２
−プラスミンインヒビターを溶出し、「溶出画分コとし
た。
−プラスミンインヒビターを溶出し、「溶出画分コとし
た。
溶出液としては、仏）〜（ｅ） ３ ｍ如月いた。
（ａ） ５．Ｏｊ６＋Ｖ／ｖ工＋し７グ！Ｊ”−ル
ｐＨ１１，５（ｃ） ５０Ｘ＋Ｖ／Ｖｚ＋しｙグ’
） ＝ −ルーＰ Ｂ Ｓ ＋０．０５ Ｘ Ｔｗｅａ
ｎ ８０ ｐＨ７，４それぞれ溶出が終わるごとに、
カラム（吸着体）を再生、平衡化し、上記と同じ操作で
ヒトα２−プラスミンインヒビターを吸着体に結合させ
２次の溶出液で溶出し、これら３種類の溶出液を用いた
時の「溶出画分」中のα。
ｐＨ１１，５（ｃ） ５０Ｘ＋Ｖ／Ｖｚ＋しｙグ’
） ＝ −ルーＰ Ｂ Ｓ ＋０．０５ Ｘ Ｔｗｅａ
ｎ ８０ ｐＨ７，４それぞれ溶出が終わるごとに、
カラム（吸着体）を再生、平衡化し、上記と同じ操作で
ヒトα２−プラスミンインヒビターを吸着体に結合させ
２次の溶出液で溶出し、これら３種類の溶出液を用いた
時の「溶出画分」中のα。
−プラスミンインヒビタ−の抗原量を＃嵩免疫定量法Ｃ
ＥＬＩＳＡ ）で、偽−プラスミンインヒビタ−の活性
は、合成基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイ
シル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトクアニリド・二塩酸塩）を
用いた残存プラスミン活性の測定により求め、結果をま
とめて表ＩＫ示す。尚、上記、酵素免疫定量法は、ヒト
α２−プラスミンインヒビターに対するモノクー−ナル
抗体を用いたサンドインチ法であり、本発明者らが先に
提案した（昭和５９年５月１日付出願、！！＃願昭５９
−８６１０１、発明の名称１ヒトα、−プラスミンイン
ヒビタ−に対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的
測定試薬及びキット”）。
ＥＬＩＳＡ ）で、偽−プラスミンインヒビタ−の活性
は、合成基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイ
シル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトクアニリド・二塩酸塩）を
用いた残存プラスミン活性の測定により求め、結果をま
とめて表ＩＫ示す。尚、上記、酵素免疫定量法は、ヒト
α２−プラスミンインヒビターに対するモノクー−ナル
抗体を用いたサンドインチ法であり、本発明者らが先に
提案した（昭和５９年５月１日付出願、！！＃願昭５９
−８６１０１、発明の名称１ヒトα、−プラスミンイン
ヒビタ−に対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的
測定試薬及びキット”）。
表１に、この測定法を用いて求めた各画分中のα１−プ
ラスミンインヒビタ−抗原量を、表２には、合成基質を
用いて求めた活性を有する一−プラスミンインヒビター
量をまとめて示す。
ラスミンインヒビタ−抗原量を、表２には、合成基質を
用いて求めた活性を有する一−プラスミンインヒビター
量をまとめて示す。
これらの結果から、（ａ）〜（ｃ）の溶出液を吸着体に
添加することによってヒトα２−プラスミンインヒビタ
ーを溶出、精製することができ、特に、溶出液として（
ｅ）を用いた時、ヒト血漿２、Ｏｍ 中の一−プラスミ
ンインヒビター１２６μＩのうち、 ２９．７％に轟た
る３７．４ ｓｌが溶出し活性を有するα、−ＰＩ量は
３７．２μＩで、溶出したα、−プラスミンインヒビタ
−は約１００９６活性を有していた。
添加することによってヒトα２−プラスミンインヒビタ
ーを溶出、精製することができ、特に、溶出液として（
ｅ）を用いた時、ヒト血漿２、Ｏｍ 中の一−プラスミ
ンインヒビター１２６μＩのうち、 ２９．７％に轟た
る３７．４ ｓｌが溶出し活性を有するα、−ＰＩ量は
３７．２μＩで、溶出したα、−プラスミンインヒビタ
−は約１００９６活性を有していた。
表１ 各画分中に含まれる
α、−プラス雫ミンインヒビター抗原量表２ 各画分中
に含まれる活性を有する一−プラスミンインヒビター量 実施例２ 精製 実施例１で記載した吸着体（２，０１１７’）を詰めた
カラムを使用し、ヒト血漿４．０ＩＩＪｆｔ添加し、同
様に洗浄後、溶出液（ｃ）、すなわち５゜Ｘ ｅ Ｖ／
Ｖ ｘ−＋ Ｌ／ ７ ｆ ！ｊ ：ｌ −ルー Ｐ
Ｂ Ｓ ｔＯ，０５Ｘ Ｔｗｅｅｎ ８０ ｐＨ７，４
を用いて、ヒト血漿中より偽−プラスミンインヒビタ−
画分を得た。この画分を濃縮後、高液液体クロマトグラ
フィー（東洋曹達■ＨＬＣ−８０３Ｄ）を用いてさらＫ
１１ｔｌ製を行なった。０．１ Ｍ ）リフルオロ酢酸
−５０％アセトニトリル溶媒系でｍ−プラスミンインヒ
ビターを分離９分取した。
に含まれる活性を有する一−プラスミンインヒビター量 実施例２ 精製 実施例１で記載した吸着体（２，０１１７’）を詰めた
カラムを使用し、ヒト血漿４．０ＩＩＪｆｔ添加し、同
様に洗浄後、溶出液（ｃ）、すなわち５゜Ｘ ｅ Ｖ／
Ｖ ｘ−＋ Ｌ／ ７ ｆ ！ｊ ：ｌ −ルー Ｐ
Ｂ Ｓ ｔＯ，０５Ｘ Ｔｗｅｅｎ ８０ ｐＨ７，４
を用いて、ヒト血漿中より偽−プラスミンインヒビタ−
画分を得た。この画分を濃縮後、高液液体クロマトグラ
フィー（東洋曹達■ＨＬＣ−８０３Ｄ）を用いてさらＫ
１１ｔｌ製を行なった。０．１ Ｍ ）リフルオロ酢酸
−５０％アセトニトリル溶媒系でｍ−プラスミンインヒ
ビターを分離９分取した。
濃縮し、溶媒を水で置換後凍結乾燥し、７０．４ＩｊＪ
Ｉのα！−プラスミンインヒビター精製標品を得た。こ
の標品の１０％ゲル濃度の５ＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動を行なった結果、その結果から分子量６７．０
００のα鵞−プラスミンインヒビターが精製できたこと
が確められた。
Ｉのα！−プラスミンインヒビター精製標品を得た。こ
の標品の１０％ゲル濃度の５ＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動を行なった結果、その結果から分子量６７．０
００のα鵞−プラスミンインヒビターが精製できたこと
が確められた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトα＿２−プラスミンインヒビターにおけるプラ
スミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して
結合し得るヒトα＿２−プラスミンインヒビターに対す
るモノクローナル抗体またはそのＦａｂ部分を少くとも
含有する該モノクローナル抗体の断片を不溶性固体担体
に固定化させたヒトα＿２−プラスミンインヒビターに
対する選択的吸着体。 ２、該不溶性固体担体がアガロース、ポリアクリルアミ
ド、セルロース、デキストラン、マレイン酸ポリマーお
よびこれらの混合物からなる群から選ばれたものである
第１項記載の選択的吸着体。 ３、ヒトα＿２−プラスミンインヒビターにおけるプラ
スミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して
結合し得るヒトα＿２−プラスミンインヒビターに対す
るモノクローナル抗体またはそのＦａｂ部分を少くとも
含有する該モノクローナル抗体の断片を不溶性固体担体
に固定化させたヒトα＿２−プラスミンインヒビターに
対する選択的吸着体を、ヒトα＿２−プラスミンインヒ
ビターを含有する液体と接触させて、該担体にヒトα＿
２−プラスミンインヒビターを吸着させた後、該液体か
ら該担体を分離し、そして必要により、該担体からヒト
α＿２−プラスミンインヒビターを脱着させて該ヒトα
＿２−プラスミンインヒビターを回収することを特徴と
するヒトα＿２−プラスミンインヒビター含有液体から
の該ヒトα＿２−プラスミンインヒビターの分離回収法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60131991A JPH0643440B2 (ja) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | ヒトα２―プラスミンインヒビターの分離回収法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60131991A JPH0643440B2 (ja) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | ヒトα２―プラスミンインヒビターの分離回収法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61291527A true JPS61291527A (ja) | 1986-12-22 |
| JPH0643440B2 JPH0643440B2 (ja) | 1994-06-08 |
Family
ID=15070997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60131991A Expired - Fee Related JPH0643440B2 (ja) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | ヒトα２―プラスミンインヒビターの分離回収法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0643440B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0455200A (ja) * | 1990-06-21 | 1992-02-21 | Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd | 宇宙機における機器固定装置 |
-
1985
- 1985-06-19 JP JP60131991A patent/JPH0643440B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0455200A (ja) * | 1990-06-21 | 1992-02-21 | Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd | 宇宙機における機器固定装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0643440B2 (ja) | 1994-06-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |