JP2833811B2 - ウロキナーゼ化合物の回収 - Google Patents
ウロキナーゼ化合物の回収Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明はクロマトグラフィー樹脂を用いる培養培地ま
たは細胞抽出物のごとき溶液からの酵素的に活性なウロ
キナーゼおよびプロウロキナーゼの回収法に関する。本
発明は本来免疫グロブリンを選択的に結合する為に開発
された樹脂の一種がプロウロキナーゼおよびウロキナー
ゼを結合し、および選択的に溶出でき、およびそれ故プ
ロウロキナーゼおよびウロキナーゼを含む溶液からこれ
らのタンパク質の商業的大規模精製に有用であることが
発見されたことに基づいている。
たは細胞抽出物のごとき溶液からの酵素的に活性なウロ
キナーゼおよびプロウロキナーゼの回収法に関する。本
発明は本来免疫グロブリンを選択的に結合する為に開発
された樹脂の一種がプロウロキナーゼおよびウロキナー
ゼを結合し、および選択的に溶出でき、およびそれ故プ
ロウロキナーゼおよびウロキナーゼを含む溶液からこれ
らのタンパク質の商業的大規模精製に有用であることが
発見されたことに基づいている。
ウロキナーゼは致死的となりうる血栓症を破壊するカ
スケード機構を開始する為の有用な繊維素溶解剤であ
る。ウロキナーゼは約32,000−34,000ダルトンの分子量
およびmgタンパク質当り約250,000CTA単位の比活性を持
つ二鎖糖タンパク質である。それは酵素的に不活性なプ
ロウロキナーゼの酵素的に活性な切断生成物である。プ
ロウロキナーゼは約45,000−55,000ダルトンの分子量を
持つ単鎖糖タンパク質である。ウロキナーゼと異ってプ
ロウロキナーゼは活性ではないが、血栓部位に特異的で
ある。プラスミンがその部位でプロウロキナーゼを酵素
的に活性なウロキナーゼへ切断する。
スケード機構を開始する為の有用な繊維素溶解剤であ
る。ウロキナーゼは約32,000−34,000ダルトンの分子量
およびmgタンパク質当り約250,000CTA単位の比活性を持
つ二鎖糖タンパク質である。それは酵素的に不活性なプ
ロウロキナーゼの酵素的に活性な切断生成物である。プ
ロウロキナーゼは約45,000−55,000ダルトンの分子量を
持つ単鎖糖タンパク質である。ウロキナーゼと異ってプ
ロウロキナーゼは活性ではないが、血栓部位に特異的で
ある。プラスミンがその部位でプロウロキナーゼを酵素
的に活性なウロキナーゼへ切断する。
両方の型が尿から多くの方法で単離されている。１つ
の方法ではウロキナーゼ含有沈殿の形成を起こす試薬
（例えばベントナイトまたは他のケイ酸アルミニウム）
で尿を処理し、次に沈殿からウロキナーゼを溶出する。
他の方法では尿を吸着剤と接触させ、続いて吸着剤から
溶出する。この目的に使用される既知の吸着物質として
は例えば炭酸カルシウム，硫酸バリウム，酸化アルミニ
ウム，リン酸カルシウム，水酸化亜鉛，活性炭素および
水和ケイ酸アルミニウムが挙げられる。種々の陽イオン
交換樹脂もまたこの目的に有用である（例えば、US2,98
3,647;US2,989,440）。
の方法ではウロキナーゼ含有沈殿の形成を起こす試薬
（例えばベントナイトまたは他のケイ酸アルミニウム）
で尿を処理し、次に沈殿からウロキナーゼを溶出する。
他の方法では尿を吸着剤と接触させ、続いて吸着剤から
溶出する。この目的に使用される既知の吸着物質として
は例えば炭酸カルシウム，硫酸バリウム，酸化アルミニ
ウム，リン酸カルシウム，水酸化亜鉛，活性炭素および
水和ケイ酸アルミニウムが挙げられる。種々の陽イオン
交換樹脂もまたこの目的に有用である（例えば、US2,98
3,647;US2,989,440）。
例えばDEAEセルロース樹脂またはメタクリル−カルボ
ン酸型の架橋デキストランゲルを使用する排他クロマト
グラフィー法も実施されてきた（例えば、US3,256,15
8）。そのような方法においては樹脂は不純物タンパク
質および発熱物質を結合し、ウロキナーゼを溶液に残し
ている。
ン酸型の架橋デキストランゲルを使用する排他クロマト
グラフィー法も実施されてきた（例えば、US3,256,15
8）。そのような方法においては樹脂は不純物タンパク
質および発熱物質を結合し、ウロキナーゼを溶液に残し
ている。
より最近、珪藻土，アガロース，セルロース，コラー
ゲンおよび他の吸着剤のごとき水不溶性固体支持物に結
合または接着したウロキナーゼに親和性を持つ種々の試
薬を用いてアフィニティークロマトグラフ法が実行され
ている。親和性試薬には塩基性アミノ酸，アグマチン，
アプロチニン，グアニジンおよびアデニンの誘導体，フ
ィブリンおよび多くの他者の中でウロキナーゼを認識す
る抗体が含まれる。
ゲンおよび他の吸着剤のごとき水不溶性固体支持物に結
合または接着したウロキナーゼに親和性を持つ種々の試
薬を用いてアフィニティークロマトグラフ法が実行され
ている。親和性試薬には塩基性アミノ酸，アグマチン，
アプロチニン，グアニジンおよびアデニンの誘導体，フ
ィブリンおよび多くの他者の中でウロキナーゼを認識す
る抗体が含まれる。
種々の電気泳動的およびHPLC的手段による精製も試み
られている。
られている。
臨床的に価値のある量のウロキナーゼ化合物を得る試
みにおいては、これらのタンパク質を産生することが知
られている細胞（例えば腎臓および肺）がイン ビトロ
で培養されている。それらの細胞にはヒトおよびミドリ
ザルまたはアカゲザル胎児および成人腎臓，成人および
胎児肺，成人および胎児心臓，胎盤，成人甲状腺，脾臓
および尿管が含まれている。しかしながら、誘導剤（例
えば、種々のアミノ酸，サッカリド，ホルモン，フマル
酸，リンゴ酸，コハク酸および／またはグリコール酸）
を培養培地に濃厚することによる生成の増加、またはタ
ンパク質分解および変性の減少（例えば金属キレート
剤，プロナーゼおよびトリプシン インヒビターによ
り）の試みにもかかわらずこれらの細胞の培養培地から
得られる収量はいまだ多くない。ウロキナーゼ存在下非
ヒト、温血動物に前もって移植し繁殖させたウロキナー
ゼ産生リンパ球ハイブリドーマ細胞の培養により培養細
胞のウロキナーゼ産生を増加させるための更なる試みが
なされている（U.S.4,537,852）。しかしながら、この
方法は実行するのに高価で時間がかかる。
みにおいては、これらのタンパク質を産生することが知
られている細胞（例えば腎臓および肺）がイン ビトロ
で培養されている。それらの細胞にはヒトおよびミドリ
ザルまたはアカゲザル胎児および成人腎臓，成人および
胎児肺，成人および胎児心臓，胎盤，成人甲状腺，脾臓
および尿管が含まれている。しかしながら、誘導剤（例
えば、種々のアミノ酸，サッカリド，ホルモン，フマル
酸，リンゴ酸，コハク酸および／またはグリコール酸）
を培養培地に濃厚することによる生成の増加、またはタ
ンパク質分解および変性の減少（例えば金属キレート
剤，プロナーゼおよびトリプシン インヒビターによ
り）の試みにもかかわらずこれらの細胞の培養培地から
得られる収量はいまだ多くない。ウロキナーゼ存在下非
ヒト、温血動物に前もって移植し繁殖させたウロキナー
ゼ産生リンパ球ハイブリドーマ細胞の培養により培養細
胞のウロキナーゼ産生を増加させるための更なる試みが
なされている（U.S.4,537,852）。しかしながら、この
方法は実行するのに高価で時間がかかる。
組換えDNA技術の出現により、多量のプロウロキナー
ゼを産生するように遺伝子操作されている細胞株が開発
され培養された。これらの細胞株には大腸菌，酵母，バ
シラス（Bacillus）およびニューロスポラ（Neurospor
a）のごとき微生物およびサルおよびヒトの腎臓細胞お
よび繊維芽細胞を含む哺乳類細胞株が含まれる。発現さ
れたプロウロキナーゼは細胞抽出物またはそれが分泌さ
れてきた液体増殖培地から活性型で回収されなければな
らない。回収は本質的には尿からの精製のために前に説
明したものと同じ方法論により達成された。
ゼを産生するように遺伝子操作されている細胞株が開発
され培養された。これらの細胞株には大腸菌，酵母，バ
シラス（Bacillus）およびニューロスポラ（Neurospor
a）のごとき微生物およびサルおよびヒトの腎臓細胞お
よび繊維芽細胞を含む哺乳類細胞株が含まれる。発現さ
れたプロウロキナーゼは細胞抽出物またはそれが分泌さ
れてきた液体増殖培地から活性型で回収されなければな
らない。回収は本質的には尿からの精製のために前に説
明したものと同じ方法論により達成された。
培養培地からの回収は、そのような培地は典型的には
多くの他の関係ないタンパク質（そのいくつかはタンパ
ク質分解活性を持っている）を含んでいるのでかなりや
っかいな仕事となる。例えば血清補給培地はプロウロキ
ナーゼを容易に分解するプラスミンおよび他の血清プロ
テアーゼを含んでいることが知られている。金属キレー
ト剤および種々のプロテアーゼ阻害剤の添加による保護
の試みにもかかわらず、ほとんどの既知の精製法は適切
にウロキナーゼ化合物を保護することができない。前に
説明したごとく、これらの予防措置はせいぜい部分的保
護を与えるだけである。従って既知の回収方法は血清を
含まない溶液（それらは役に立たないが）からウロキナ
ーゼ化合物を単離するのに使用した場合最も効果的であ
り、潜在的に毒要素を導入しているかもしれない。加え
て、免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いる精
製方法は商業的要求まで規模を拡げた場合全く高価なも
のになるであろう。
多くの他の関係ないタンパク質（そのいくつかはタンパ
ク質分解活性を持っている）を含んでいるのでかなりや
っかいな仕事となる。例えば血清補給培地はプロウロキ
ナーゼを容易に分解するプラスミンおよび他の血清プロ
テアーゼを含んでいることが知られている。金属キレー
ト剤および種々のプロテアーゼ阻害剤の添加による保護
の試みにもかかわらず、ほとんどの既知の精製法は適切
にウロキナーゼ化合物を保護することができない。前に
説明したごとく、これらの予防措置はせいぜい部分的保
護を与えるだけである。従って既知の回収方法は血清を
含まない溶液（それらは役に立たないが）からウロキナ
ーゼ化合物を単離するのに使用した場合最も効果的であ
り、潜在的に毒要素を導入しているかもしれない。加え
て、免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いる精
製方法は商業的要求まで規模を拡げた場合全く高価なも
のになるであろう。
それ故、商業量のウロキナーゼ化合物を酵素的に活性
な形で産生するためにはそれが分解される前に培地から
効果的、能率的および迅速に回収する大規模精製法が必
要とされる。
な形で産生するためにはそれが分解される前に培地から
効果的、能率的および迅速に回収する大規模精製法が必
要とされる。
従って、本発明の目的はウロキナーゼ含有溶液からウ
ロキナーゼ化合物を単離する迅速で単純および商業的に
実行可能な方法を提供する事である。別の目的は培養培
地からウロキナーゼ化合物を精製する方法を提供するこ
とである。さらに別の目的は、ウロキナーゼ化合物含有
溶液から実質的に他の非関連タンパク質を含んでいない
未分解ウロキナーゼ化合物を回収する方法を提供するこ
とである。血清補給培地中に存在する他のタンパク質か
らウロキナーゼ化合物を分離する方法を提供するのも本
発明の目的である。ウロキナーゼ化合物含有医薬処方の
大規模商業生産に有用量の未分解ウロキナーゼ化合物を
回収する方法を提供するのも更なる目的である。
ロキナーゼ化合物を単離する迅速で単純および商業的に
実行可能な方法を提供する事である。別の目的は培養培
地からウロキナーゼ化合物を精製する方法を提供するこ
とである。さらに別の目的は、ウロキナーゼ化合物含有
溶液から実質的に他の非関連タンパク質を含んでいない
未分解ウロキナーゼ化合物を回収する方法を提供するこ
とである。血清補給培地中に存在する他のタンパク質か
らウロキナーゼ化合物を分離する方法を提供するのも本
発明の目的である。ウロキナーゼ化合物含有医薬処方の
大規模商業生産に有用量の未分解ウロキナーゼ化合物を
回収する方法を提供するのも更なる目的である。
発明の要約 免疫グロブリンを精製するのに使用される種類のクロ
マトグラフィー樹脂がプロウロキナーゼおよびウロキナ
ーゼ−含有溶液からプロウロキナーゼおよびウロキナー
ゼを回収するのに有用であることが発見された（“プロ
ウロキナーゼ”、“ウロキナーゼ”およびそれらの混合
物をここでは以後“ウロキナーゼ化合物”と称する）。
特に、多陰イオン基を持つ共有結合的結合ポリマーを含
むシリカ様マトリックスが驚くべきことに溶液中の多く
の他のタンパク様成分に優先してウロキナーゼを結合
し、ウロキナーゼ化合物に富んだ分画を選択的に溶出す
ることを可能にすることが発見された。そのようなマト
リックスの単一バッチまたはクロマトグラフィー法での
使用により、血清を含まないおよび血清補給液体培養培
地、ウロキナーゼを合成し細胞内に蓄積している細胞の
抽出物、およびアルブミンプロテアーゼ，免疫グロブリ
ンおよび種々の他のタンパク質を含むウロキナーゼ分解
条件にウロキナーゼ化合物が接触するであろう時間を最
短にすることにより、ウロキナーゼ化合物含有溶液から
のウロキナーゼ化合物の回収を促進できる。それらの他
のタンパク質からウロキナーゼ化合物の速かな分離はウ
ロキナーゼ化合物がその中の分解性要素と接触する時間
を最短にする。
マトグラフィー樹脂がプロウロキナーゼおよびウロキナ
ーゼ−含有溶液からプロウロキナーゼおよびウロキナー
ゼを回収するのに有用であることが発見された（“プロ
ウロキナーゼ”、“ウロキナーゼ”およびそれらの混合
物をここでは以後“ウロキナーゼ化合物”と称する）。
特に、多陰イオン基を持つ共有結合的結合ポリマーを含
むシリカ様マトリックスが驚くべきことに溶液中の多く
の他のタンパク様成分に優先してウロキナーゼを結合
し、ウロキナーゼ化合物に富んだ分画を選択的に溶出す
ることを可能にすることが発見された。そのようなマト
リックスの単一バッチまたはクロマトグラフィー法での
使用により、血清を含まないおよび血清補給液体培養培
地、ウロキナーゼを合成し細胞内に蓄積している細胞の
抽出物、およびアルブミンプロテアーゼ，免疫グロブリ
ンおよび種々の他のタンパク質を含むウロキナーゼ分解
条件にウロキナーゼ化合物が接触するであろう時間を最
短にすることにより、ウロキナーゼ化合物含有溶液から
のウロキナーゼ化合物の回収を促進できる。それらの他
のタンパク質からウロキナーゼ化合物の速かな分離はウ
ロキナーゼ化合物がその中の分解性要素と接触する時間
を最短にする。
すべての態様において、本発明はウロキナーゼ化合物
含有タンパク質溶液からウロキナーゼ化合物を回収する
方法を提供する。この方法はウロキナーゼ化合物含有溶
液を粒子状のシリカ様マトリックスと接触させ（ウロキ
ナーゼ化合物のマトリックスへの結合の助けとなる条件
下）、非結合タンパク質をマトリックスから分離し、そ
れから結合ウロキナーゼ化合物を放出することを含んで
いる。マトリックスは多陰イオン基を持つ共有結合性結
合ポリマーから成る。
含有タンパク質溶液からウロキナーゼ化合物を回収する
方法を提供する。この方法はウロキナーゼ化合物含有溶
液を粒子状のシリカ様マトリックスと接触させ（ウロキ
ナーゼ化合物のマトリックスへの結合の助けとなる条件
下）、非結合タンパク質をマトリックスから分離し、そ
れから結合ウロキナーゼ化合物を放出することを含んで
いる。マトリックスは多陰イオン基を持つ共有結合性結
合ポリマーから成る。
１つの態様において、本発明は血清が補給された培地
も含む培養培地からウロキナーゼ化合物を回収する方法
を提供する。血清はこの発明で使用される種類のマトリ
ックスへ結合することが知られている免疫グロブリンお
よびウロキナーゼ化合物を分解する能力を持つ血清プロ
テアーゼを含んでいる。しかしながら本発明で使用され
るマトリックス物質は以下に説明する選択的結合および
溶出により有害なプロテアーゼ，アルブミンおよび他の
タンパク質からウロキナーゼ化合物を容易に分解するこ
とを可能にする。
も含む培養培地からウロキナーゼ化合物を回収する方法
を提供する。血清はこの発明で使用される種類のマトリ
ックスへ結合することが知られている免疫グロブリンお
よびウロキナーゼ化合物を分解する能力を持つ血清プロ
テアーゼを含んでいる。しかしながら本発明で使用され
るマトリックス物質は以下に説明する選択的結合および
溶出により有害なプロテアーゼ，アルブミンおよび他の
タンパク質からウロキナーゼ化合物を容易に分解するこ
とを可能にする。
本発明の方法はウロキナーゼ化合物含有溶液をクロマ
トグラフィー技術を用いてマトリックス上を通過させる
ことにより実施される、即ちカラム中にマトリックスを
配置し、試料を詰め、洗浄し、続いて採取する。もしく
はマトリックス物質およびウロキナーゼ化合物含有溶液
を一緒に混合する固相バッチ抽出技術を用いても本方法
を実施できる。
トグラフィー技術を用いてマトリックス上を通過させる
ことにより実施される、即ちカラム中にマトリックスを
配置し、試料を詰め、洗浄し、続いて採取する。もしく
はマトリックス物質およびウロキナーゼ化合物含有溶液
を一緒に混合する固相バッチ抽出技術を用いても本方法
を実施できる。
本発明のマトリックスの固体相に共有結合で結合して
いるポリマーは、例えばカルボン酸基のごときぶらさが
った陰イオン基を含むポリエチレン バックボーンであ
る。好適な実施態様においては、ポリマーはカルボキシ
ル化されたポリエチレンイミノアルキル トリアルコシ
キ シランを含み、最も好適にはカルボンキシル化され
たポリエチレン イミノプロピル トリメトキシシラン
を含む。シラン基は反応活性でシリカ マトリックス上
の遊離の水酸基と共有結合的に結合する。この実施態様
においてマトリックスは粒子状の細孔のあるガラスまた
はシリカと約400から約1800ダルトンの範囲の分子量を
持つカルボキシル化ポリエチレン イミノプロピル ト
リメトキシ シラン ポリマーとの反応生成物である。
ガラスは約35から180ミクロンの範囲の平均粒子直径を
持ち、約40から1000オングストロームの範囲の平均細孔
サイズを持っているであろう。もしくはシリカは約３か
ら70ミクロンの範囲の平均粒子径および約50から1000オ
ングストロームの平均細孔サイズを持っているであろ
う。
いるポリマーは、例えばカルボン酸基のごときぶらさが
った陰イオン基を含むポリエチレン バックボーンであ
る。好適な実施態様においては、ポリマーはカルボキシ
ル化されたポリエチレンイミノアルキル トリアルコシ
キ シランを含み、最も好適にはカルボンキシル化され
たポリエチレン イミノプロピル トリメトキシシラン
を含む。シラン基は反応活性でシリカ マトリックス上
の遊離の水酸基と共有結合的に結合する。この実施態様
においてマトリックスは粒子状の細孔のあるガラスまた
はシリカと約400から約1800ダルトンの範囲の分子量を
持つカルボキシル化ポリエチレン イミノプロピル ト
リメトキシ シラン ポリマーとの反応生成物である。
ガラスは約35から180ミクロンの範囲の平均粒子直径を
持ち、約40から1000オングストロームの範囲の平均細孔
サイズを持っているであろう。もしくはシリカは約３か
ら70ミクロンの範囲の平均粒子径および約50から1000オ
ングストロームの平均細孔サイズを持っているであろ
う。
本発明の好適な態様においてはマトリックス物質はマ
トリックス物質グラム当り、約0.3から1.2ミリ当り当量
のカルボキシを含んでいる。
トリックス物質グラム当り、約0.3から1.2ミリ当り当量
のカルボキシを含んでいる。
１つの実施態様においては、本発明の接触工程は約4.
0から6.0、しかし好適には約5.6のpHで実施される。放
出工程は6.0以上のpHおよび約250mMまたはそれ以上のイ
オン強度（好適には約500mM）で実施される。放出工程
はまた約4.0より低いpHでも実施されるであろう。接触
および放出の両工程とも本発明の好適な態様においては
イプシロン アミノ カプロン酸（EACA）および界面活
性剤の存在下に実施されるであろう。
0から6.0、しかし好適には約5.6のpHで実施される。放
出工程は6.0以上のpHおよび約250mMまたはそれ以上のイ
オン強度（好適には約500mM）で実施される。放出工程
はまた約4.0より低いpHでも実施されるであろう。接触
および放出の両工程とも本発明の好適な態様においては
イプシロン アミノ カプロン酸（EACA）および界面活
性剤の存在下に実施されるであろう。
本発明の方法を実施することにより、マトリックス物
質と接触させたウロキナーゼ化合物含有溶液中のウロキ
ナーゼの90％またはそれ以上がしばしば回収できる。
質と接触させたウロキナーゼ化合物含有溶液中のウロキ
ナーゼの90％またはそれ以上がしばしば回収できる。
図の簡単な説明 本発明の前記のおよび他の目的は（発明自身同様にそ
の種々の様相）、付随する図と一緒に以下の説明を読む
とより十分に理解されよう。
の種々の様相）、付随する図と一緒に以下の説明を読む
とより十分に理解されよう。
図１はABxカラム上条件付け、血清補給増殖培地のク
ロマトグラフィーにより得られた分画の代表的クーマシ
ーブル染色SDSポリアクリルアミド ゲルである。レー
ン１は低分子量標準品を含み；レーン２は未過出発物
質を含み；レーン３はカラムに充填した過出発物質を
含み；レーン４はフロースルーを含み；レーン５は緩衝
液Ａ洗浄物を含み；レーン６は20％緩衝液Ｂを含む緩衝
液Ａでの洗浄により得られる溶出物を含み；レーン７は
100％緩衝液Ｂでの展開により得られる分画１溶出物を
含み；レーン８は同じ100％緩衝液Ｂでの展開により得
られる分画２溶出物を含み；レーン９は同じ100％緩衝
液Ｂでの展開により得られる分画３溶出物を含み；レー
ン10は100％緩衝液Ｃ洗浄により得られる溶出物を含ん
でいる。
ロマトグラフィーにより得られた分画の代表的クーマシ
ーブル染色SDSポリアクリルアミド ゲルである。レー
ン１は低分子量標準品を含み；レーン２は未過出発物
質を含み；レーン３はカラムに充填した過出発物質を
含み；レーン４はフロースルーを含み；レーン５は緩衝
液Ａ洗浄物を含み；レーン６は20％緩衝液Ｂを含む緩衝
液Ａでの洗浄により得られる溶出物を含み；レーン７は
100％緩衝液Ｂでの展開により得られる分画１溶出物を
含み；レーン８は同じ100％緩衝液Ｂでの展開により得
られる分画２溶出物を含み；レーン９は同じ100％緩衝
液Ｂでの展開により得られる分画３溶出物を含み；レー
ン10は100％緩衝液Ｃ洗浄により得られる溶出物を含ん
でいる。
図２はABxカラム上条件付け、血清無しの増殖培地の
クロマトグラフィーにより得られた分画の代表的クーマ
シーブルー染色SDSポリアクリルアミド ゲルである。
レーン１は低分子量の標準品を含み；レーン２は未過
出発物質；レーン３はカラムに充填した過出発物質を
含み；レーン４はフロースルーを含み；レーン５は緩衝
液Ａ洗浄物を含み；レーン６は20％緩衝液Ｂを含む緩衝
液Ａによる洗浄で得られる溶出物を含み；レーン７は10
0％緩衝液Ｂでの展開による分画１溶出物質を含み；レ
ーン８は同じ100％緩衝液Ｂでの展開による分画２溶出
物を含み；およびレーン９は100％緩衝液Ｃでの展開に
より得られる溶出物を含んでいる。
クロマトグラフィーにより得られた分画の代表的クーマ
シーブルー染色SDSポリアクリルアミド ゲルである。
レーン１は低分子量の標準品を含み；レーン２は未過
出発物質；レーン３はカラムに充填した過出発物質を
含み；レーン４はフロースルーを含み；レーン５は緩衝
液Ａ洗浄物を含み；レーン６は20％緩衝液Ｂを含む緩衝
液Ａによる洗浄で得られる溶出物を含み；レーン７は10
0％緩衝液Ｂでの展開による分画１溶出物質を含み；レ
ーン８は同じ100％緩衝液Ｂでの展開による分画２溶出
物を含み；およびレーン９は100％緩衝液Ｃでの展開に
より得られる溶出物を含んでいる。
ウロキナーゼ化合物含有溶液から未分解のウロキナー
ゼ化合物を回収する効率的方法が考案され、それは単
純、有効であり費用がかからない。
ゼ化合物を回収する効率的方法が考案され、それは単
純、有効であり費用がかからない。
本方法は免疫グロブリンの精製および分離に以前使用
されていた種類の既知の樹脂（米国特許第4,606,825号
参照）がウロキナーゼ化合物の優先的結合、および分離
された溶出に使用できるという予期されなかった発見を
利用したアフィニティークロマトグラフィーおよび抽出
法を使っている。簡単に記すと、本方法はウロキナーゼ
化合物含有溶液と樹脂をタンパク質結合を助ける条件下
接触させ、未結合タンパク質を樹脂から分離し、および
それから結合ウロキナーゼ化合物を放出させることを特
徴としている。本方法はウロキナーゼ化合物を単独でま
たは他のタンパク質との混合物として含んでいる任意の
溶液からウロキナーゼの回収に使用できる。そのような
溶液としては、例えばプロウロキナーゼを発現する（し
かしそれを分泌はしない）細胞の抽出物および血清が補
給されたまたは血清を含まない培養培地が挙げられる。
図１および２に示されているSDSポリアクリルアミド
ゲルは血清アルブミンを含む培地の他のタンパク質構成
物からウロキナーゼ化合物をきれいに精製できる本方法
の能力を示している。
されていた種類の既知の樹脂（米国特許第4,606,825号
参照）がウロキナーゼ化合物の優先的結合、および分離
された溶出に使用できるという予期されなかった発見を
利用したアフィニティークロマトグラフィーおよび抽出
法を使っている。簡単に記すと、本方法はウロキナーゼ
化合物含有溶液と樹脂をタンパク質結合を助ける条件下
接触させ、未結合タンパク質を樹脂から分離し、および
それから結合ウロキナーゼ化合物を放出させることを特
徴としている。本方法はウロキナーゼ化合物を単独でま
たは他のタンパク質との混合物として含んでいる任意の
溶液からウロキナーゼの回収に使用できる。そのような
溶液としては、例えばプロウロキナーゼを発現する（し
かしそれを分泌はしない）細胞の抽出物および血清が補
給されたまたは血清を含まない培養培地が挙げられる。
図１および２に示されているSDSポリアクリルアミド
ゲルは血清アルブミンを含む培地の他のタンパク質構成
物からウロキナーゼ化合物をきれいに精製できる本方法
の能力を示している。
精製過程に使用するのに適した分離物質の種類はシリ
カゲルまたはガラスビーズから構成されるごとき粒子状
シリカ様マトリックスが挙げられる。これらの成分粒子
回収法を実施するのに有用であることが知られている任
意の大きさでよい。しかしながら、約３から約70ミクロ
ンの範囲の直径を持つシリカ粒子、および約35から約18
0ミクロンの範囲の直径を持つガラスビーズが好適であ
る。約40ミクロンの平均粒子径が本発明の実施には最も
有用である。粒子はまた多孔性であり、シリカゲルは約
50から1000オングストロームの範囲の好適な細孔直径を
持ち、ガラスビーズは約40から1000オングストロームの
範囲の好適な細孔直径を持つ。
カゲルまたはガラスビーズから構成されるごとき粒子状
シリカ様マトリックスが挙げられる。これらの成分粒子
回収法を実施するのに有用であることが知られている任
意の大きさでよい。しかしながら、約３から約70ミクロ
ンの範囲の直径を持つシリカ粒子、および約35から約18
0ミクロンの範囲の直径を持つガラスビーズが好適であ
る。約40ミクロンの平均粒子径が本発明の実施には最も
有用である。粒子はまた多孔性であり、シリカゲルは約
50から1000オングストロームの範囲の好適な細孔直径を
持ち、ガラスビーズは約40から1000オングストロームの
範囲の好適な細孔直径を持つ。
シリカ様粒子に多陰イオン基を持つ１つまたはそれ以
上のポリマーが結合している。好適なポリマーはカルボ
キシラートで誘導体化されたポリエチレンである。ポリ
マーは好適にはシラン基を通してマトリックスへ結合さ
れ、それ故末端に反応活性のシラン基を持つカルボキシ
ル化ポリエチレンが分離マトリックスの産生に使用され
る。好適なポリマーはポリエチレンイミノプロピル ト
リメトキシ シランのごときカルボキシル化ポリエチレ
ンイミノアルキル シランである。ポリマーの分子量は
一般に約300から約2,000ダルトンまたはそれ以上の範囲
であろう。全体で負の荷電を持つ多くの異った化学側基
が有用であろうが、基も好適な陰イオン基はカルボキシ
ラート基である。約0.3から約1.2のカルボキシ当量を含
む誘導体化マトリックス物質が本発明の方法を有効に実
施するのに最も望ましい樹脂である。
上のポリマーが結合している。好適なポリマーはカルボ
キシラートで誘導体化されたポリエチレンである。ポリ
マーは好適にはシラン基を通してマトリックスへ結合さ
れ、それ故末端に反応活性のシラン基を持つカルボキシ
ル化ポリエチレンが分離マトリックスの産生に使用され
る。好適なポリマーはポリエチレンイミノプロピル ト
リメトキシ シランのごときカルボキシル化ポリエチレ
ンイミノアルキル シランである。ポリマーの分子量は
一般に約300から約2,000ダルトンまたはそれ以上の範囲
であろう。全体で負の荷電を持つ多くの異った化学側基
が有用であろうが、基も好適な陰イオン基はカルボキシ
ラート基である。約0.3から約1.2のカルボキシ当量を含
む誘導体化マトリックス物質が本発明の方法を有効に実
施するのに最も望ましい樹脂である。
本発明に有用な現在好適なマトリックス物質はJ.A.ベ
ーカー ケミカル カンパニー，フィリップスバーグ,
N.J.から商標BAKERBOND ABxTMの名で販売されている。
この物質はカルボキシル化ポリエチレンイミン ポリマ
ーで誘導化された40ミクロンの平均粒子径を持つシリカ
ゲルから成っている。この好適な物質の製造方法および
その構造についての更なる詳細は米国特許第4,540,486
号に記載されており、その記載はここに参照文献として
包含されている。
ーカー ケミカル カンパニー，フィリップスバーグ,
N.J.から商標BAKERBOND ABxTMの名で販売されている。
この物質はカルボキシル化ポリエチレンイミン ポリマ
ーで誘導化された40ミクロンの平均粒子径を持つシリカ
ゲルから成っている。この好適な物質の製造方法および
その構造についての更なる詳細は米国特許第4,540,486
号に記載されており、その記載はここに参照文献として
包含されている。
本発明の方法の接触工程は誘導体化マトリックスの荷
電基が溶液と接触するようになる任意の方法で実施され
るであろう。接触工程を実施する１つの好適な方法はウ
ロキナーゼ含有溶液がマトリックスを移行するおよび通
り抜けるHPLCまたは伝統的な低圧液体クロマトグラフィ
ーのごときクロマトグラフィー的分離技術を使用するこ
とである。このことは結合の助けとなる緩衝液で（平衝
緩衝液）で前もって平衝化したマトリックスをクロマト
グラフィー用カラムに前もって充填し、ウロキナーゼ含
有溶液を注いでそれを通すことにより達成できる。
電基が溶液と接触するようになる任意の方法で実施され
るであろう。接触工程を実施する１つの好適な方法はウ
ロキナーゼ含有溶液がマトリックスを移行するおよび通
り抜けるHPLCまたは伝統的な低圧液体クロマトグラフィ
ーのごときクロマトグラフィー的分離技術を使用するこ
とである。このことは結合の助けとなる緩衝液で（平衝
緩衝液）で前もって平衝化したマトリックスをクロマト
グラフィー用カラムに前もって充填し、ウロキナーゼ含
有溶液を注いでそれを通すことにより達成できる。
他の接触工程は固相抽出法を使用し、それによるとウ
ロキナーゼ含有溶液をマトリックスと一緒に混合し、２
相混合物を形成させる。液体および固体相を分離し、マ
トリックス物質を追加の平衝緩衝液中に再懸濁して無関
係に結合したタンパク質をそれから除去する。
ロキナーゼ含有溶液をマトリックスと一緒に混合し、２
相混合物を形成させる。液体および固体相を分離し、マ
トリックス物質を追加の平衝緩衝液中に再懸濁して無関
係に結合したタンパク質をそれから除去する。
両方の場合とも接触工程は溶液中誘導体化マトリック
スのウロキナーゼ化合物の結合を可能にする条件下実施
しなければならない。係合はマトリックスおよびウロキ
ナーゼ化合物の反対に荷電した基の引力および相互作用
の結果であるらしい。それ故、ウロキナーゼ化合物およ
びマトリックスの荷電された性質を保つ条件が成功の為
には重要である。そのような条件はウロキナーゼ化合物
およびマトリックスを適したpHおよびイオン強度の溶液
へさらすことにより達成されるであろう。例えば、プロ
ウロキナーゼ産生細胞の培養に使用されウロキナーゼ化
合物を含んでいる増殖培地（条件付け培地）は最終pHが
ウロキナーゼ結合と一致するように酸で調整される。さ
らに条件付け培地は細胞破片を除去するため過され、
タンパク質を凝集させない為に例えばトウィーン−80
（シグマ ケミカル カンパニー）のごとき界面活性剤
を補給される。結合のための好適な条件は約4.0および
約6.0の間のpHを持つ（約5.6のpHが最も好適である）溶
液または平衝緩衝液を使用することである。
スのウロキナーゼ化合物の結合を可能にする条件下実施
しなければならない。係合はマトリックスおよびウロキ
ナーゼ化合物の反対に荷電した基の引力および相互作用
の結果であるらしい。それ故、ウロキナーゼ化合物およ
びマトリックスの荷電された性質を保つ条件が成功の為
には重要である。そのような条件はウロキナーゼ化合物
およびマトリックスを適したpHおよびイオン強度の溶液
へさらすことにより達成されるであろう。例えば、プロ
ウロキナーゼ産生細胞の培養に使用されウロキナーゼ化
合物を含んでいる増殖培地（条件付け培地）は最終pHが
ウロキナーゼ結合と一致するように酸で調整される。さ
らに条件付け培地は細胞破片を除去するため過され、
タンパク質を凝集させない為に例えばトウィーン−80
（シグマ ケミカル カンパニー）のごとき界面活性剤
を補給される。結合のための好適な条件は約4.0および
約6.0の間のpHを持つ（約5.6のpHが最も好適である）溶
液または平衝緩衝液を使用することである。
結合タンパク質を含むマトリックスは次に洗浄し（平
衝緩衝液で）無関係のタンパク質および他の夾雑物を除
去する。
衝緩衝液で）無関係のタンパク質および他の夾雑物を除
去する。
ウロキナーゼ放出工程はマトリックスからの結合ウロ
キナーゼ化合物の最も効率良い除去を促進するためのイ
オン強度およびpHの特異的条件下実施されねばならな
い。この工程はマトリックスに結合されているウロキナ
ーゼ化合物をその放出を起こす溶液（即ち溶出緩衝液）
にさらすことにより実施されるであろう。例えば、その
溶液を結合ウロキナーゼおよびマトリックス物質を含む
カラムに注ぐかまたはバルクマトリックス物質との再懸
濁に使用する。模範的溶液は約6.0より高いpHおよび約2
50mMより高いイオン強度（500mMのイオン強度が好適で
ある）を持つ溶出緩衝液である。もしくは約4.0より低
いpHを持つ緩衝液を用いてもウロキナーゼ化合物が溶出
されるであろう。増加されたイオン強度を持つ１つ以上
の溶出緩衝液もまた本発明の放出工程の間連続して使用
される。
キナーゼ化合物の最も効率良い除去を促進するためのイ
オン強度およびpHの特異的条件下実施されねばならな
い。この工程はマトリックスに結合されているウロキナ
ーゼ化合物をその放出を起こす溶液（即ち溶出緩衝液）
にさらすことにより実施されるであろう。例えば、その
溶液を結合ウロキナーゼおよびマトリックス物質を含む
カラムに注ぐかまたはバルクマトリックス物質との再懸
濁に使用する。模範的溶液は約6.0より高いpHおよび約2
50mMより高いイオン強度（500mMのイオン強度が好適で
ある）を持つ溶出緩衝液である。もしくは約4.0より低
いpHを持つ緩衝液を用いてもウロキナーゼ化合物が溶出
されるであろう。増加されたイオン強度を持つ１つ以上
の溶出緩衝液もまた本発明の放出工程の間連続して使用
される。
接触および放出工程の成功を促進するであろう条件下
が設定され、例えばプロテアーゼ阻害剤として作用する
イプシロン アミノ カプロン酸（EACA）およびトウィ
ーン−80（シグマケミカル カンパニー）のごとき界面
活性剤のウロキナーゼ化合物含有溶液および溶出液の両
方への添加などが含まれる。
が設定され、例えばプロテアーゼ阻害剤として作用する
イプシロン アミノ カプロン酸（EACA）およびトウィ
ーン−80（シグマケミカル カンパニー）のごとき界面
活性剤のウロキナーゼ化合物含有溶液および溶出液の両
方への添加などが含まれる。
本発明の方法により溶液から回収されたウロキナーゼ
化合物の量は例えば免疫検定または活性検定を含む多く
の既知の検定法により決定されるであろう。
化合物の量は例えば免疫検定または活性検定を含む多く
の既知の検定法により決定されるであろう。
活性を測定するには、最初に不活性なプロウロキナー
ゼを酵素的に活性なウロキナーゼへ変換しなければなら
ない。このことは例えばプラスミンのごときプロテアー
ゼにより達成できる。プロテアーゼの作用は例えばアプ
ロチニンのごとき阻害剤により休止される。残っている
タンパク質はウロキナーゼであり、その酵素活性は例え
ばＳ−2444のごとき発色基質を用いて分光学的に測定さ
れる。
ゼを酵素的に活性なウロキナーゼへ変換しなければなら
ない。このことは例えばプラスミンのごときプロテアー
ゼにより達成できる。プロテアーゼの作用は例えばアプ
ロチニンのごとき阻害剤により休止される。残っている
タンパク質はウロキナーゼであり、その酵素活性は例え
ばＳ−2444のごとき発色基質を用いて分光学的に測定さ
れる。
一般的に本発明の方法は粗抽出物のウロキナーゼ活性
の90％を越える回収が可能であり、その結果溶液は非常
に高い酵素活性を持っている。
の90％を越える回収が可能であり、その結果溶液は非常
に高い酵素活性を持っている。
以下の実施例は例示の為に示されるものであり、本発
明の対象を制限するものではない。
明の対象を制限するものではない。
実施例１ この実施例においては、プロウロキナーゼが１％胎児
ウシ血清（FBS）および10K I単位/mlのアプロチニンを
含む典型的増殖培地から抽出される。
ウシ血清（FBS）および10K I単位/mlのアプロチニンを
含む典型的増殖培地から抽出される。
A.前処理： ヒトプロウロキナーゼを産生するカプセルに入れられ
た遺伝子工学による細胞が増殖培地中培養される、以後
“条件付け”（例えばウロキナーゼ化合物含有）培地と
称する。条件付けられた等張培地はEDTA（5mM）および
トウィーン80（0.01％）で処理される。培地は6N HClで
pH5.6へ滴定され、過して細胞破片を除去する。
た遺伝子工学による細胞が増殖培地中培養される、以後
“条件付け”（例えばウロキナーゼ化合物含有）培地と
称する。条件付けられた等張培地はEDTA（5mM）および
トウィーン80（0.01％）で処理される。培地は6N HClで
pH5.6へ滴定され、過して細胞破片を除去する。
B.クロマトグラフィー： ７リットルの前処理された条件付け培地を室温にてAB
x（J.T.ベイカー ケミカル カンパニー，フィリプス
バーグ,NJ;粒子径40ミクロン）を含むファルマシアＫカ
ラム（容量＝41ml）上に注ぎ105cm/hrで流す。カラムを
10カラム容量の平衝緩衝液Ａ（10mMモリホリ エタン
スルホン酸（MES）,5mM EDTAおよび0.01％トウィーン8
0,pH5.6）で洗浄し、、次に10カラム容量の20％溶出緩
衝液Ｂ（500mM NaoAc,5mM EDTA,0.01％トウィーン80,pH
7.0）/80％緩衝液Ａで洗浄する。カラム上のタンパク質
は８カラム容量の100％緩衝液Ｂで溶出する。カラムは
続いて10カラム容量の緩衝液Ｃ（1MNaOAc,5mM EDTA,0.0
1％トウィーン80,pH7.0）で洗浄する。カラム溶出液は2
80nmのUV吸収によりモニターする。
x（J.T.ベイカー ケミカル カンパニー，フィリプス
バーグ,NJ;粒子径40ミクロン）を含むファルマシアＫカ
ラム（容量＝41ml）上に注ぎ105cm/hrで流す。カラムを
10カラム容量の平衝緩衝液Ａ（10mMモリホリ エタン
スルホン酸（MES）,5mM EDTAおよび0.01％トウィーン8
0,pH5.6）で洗浄し、、次に10カラム容量の20％溶出緩
衝液Ｂ（500mM NaoAc,5mM EDTA,0.01％トウィーン80,pH
7.0）/80％緩衝液Ａで洗浄する。カラム上のタンパク質
は８カラム容量の100％緩衝液Ｂで溶出する。カラムは
続いて10カラム容量の緩衝液Ｃ（1MNaOAc,5mM EDTA,0.0
1％トウィーン80,pH7.0）で洗浄する。カラム溶出液は2
80nmのUV吸収によりモニターする。
C.電気泳動： 条件付け培地およびカラム溶出物は精製の間の異った
段階でLaemmli（ネーシャー（1970）227:680−685）の
方法に従ってドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミド ゲル電気泳動（SDS−PAGE）により分析された。
7.5％−20.0％勾配ゲルは0.25％クーマシーブルー,50％
メタノール,10％酢酸で染色され、50％メタノール,10％
酢酸で脱色され写真に撮られた。
段階でLaemmli（ネーシャー（1970）227:680−685）の
方法に従ってドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミド ゲル電気泳動（SDS−PAGE）により分析された。
7.5％−20.0％勾配ゲルは0.25％クーマシーブルー,50％
メタノール,10％酢酸で染色され、50％メタノール,10％
酢酸で脱色され写真に撮られた。
カラムから溶出されたプロウロキナーゼのほとんどは
図１に示したごとく、100％溶出緩衝液Ｂのピーク２物
質を含むカラム分画に見られた。図１はまたプロウロキ
ナーゼが培養培地中の他のタンパク質からきれいに分離
され精製されていることも示している。
図１に示したごとく、100％溶出緩衝液Ｂのピーク２物
質を含むカラム分画に見られた。図１はまたプロウロキ
ナーゼが培養培地中の他のタンパク質からきれいに分離
され精製されていることも示している。
D.活性検定： 培地およびSDS−PAGEで分析された各々のカラム分画
のウロキナーゼ活性が以下のごとき直接ウロキナーゼ
（UK）検定により分析された。プロウロキナーゼは酵素
活性を持たないのでプラスミンの作用によりウロキナー
ゼ（活性）へ変換されなければならない。
のウロキナーゼ活性が以下のごとき直接ウロキナーゼ
（UK）検定により分析された。プロウロキナーゼは酵素
活性を持たないのでプラスミンの作用によりウロキナー
ゼ（活性）へ変換されなければならない。
10mlの検定緩衝液（50mMトリス−HCl,pH7.5,12mM NaC
l,0.1％トリトンＸ−100）をマイクロタイタ−プレート
（コスター＃2797）の最初のウェルへ対照試薬として入
れる。ウロキナーゼ標準貯蔵溶液（3000IU/ml検定緩衝
液カルビオケム＃672081）を検定緩衝液で更に希釈して
100,50,25,12.5および6.25IU/mlとする。
l,0.1％トリトンＸ−100）をマイクロタイタ−プレート
（コスター＃2797）の最初のウェルへ対照試薬として入
れる。ウロキナーゼ標準貯蔵溶液（3000IU/ml検定緩衝
液カルビオケム＃672081）を検定緩衝液で更に希釈して
100,50,25,12.5および6.25IU/mlとする。
希釈ウロキナーゼ標準品または未知試料をウェルに３
重に加える。2mlのプラスミン（12.5カゼイン単位/mlH2
Oヘレナ＃5303）が適当なウェルに添加される。すべて
の試料はプラスミンの存在下および不在下検定される。
試料は摂氏37度で１時間インキュベートされる。プラス
ミンを含むプレートに10ml/ウェルのアプロチニン（200
0K IU/ml検定緩衝液，シグマ＃A1153）を添加し：プラ
スミンを含まないプレートには10mlの検定緩衝液を添加
する。プレートを摂氏37度で15分間インキュベートす
る。
重に加える。2mlのプラスミン（12.5カゼイン単位/mlH2
Oヘレナ＃5303）が適当なウェルに添加される。すべて
の試料はプラスミンの存在下および不在下検定される。
試料は摂氏37度で１時間インキュベートされる。プラス
ミンを含むプレートに10ml/ウェルのアプロチニン（200
0K IU/ml検定緩衝液，シグマ＃A1153）を添加し：プラ
スミンを含まないプレートには10mlの検定緩衝液を添加
する。プレートを摂氏37度で15分間インキュベートす
る。
90μｌの1mMS−2444（ヘレナ＃5281）検定緩衝液溶液
を各々のウェルに加え、プレートは２から３時間37度に
てインキュベートする。プレートリーダー中405nmでの
光学密度が読み取られる。
を各々のウェルに加え、プレートは２から３時間37度に
てインキュベートする。プレートリーダー中405nmでの
光学密度が読み取られる。
未知試料中のプロウロキナーゼの濃度はOD405に対す
るウェル当りの酵素単位から決定される。プラスミン存
在下で検定された試料の活性は存在するプロウロキナー
ゼおよびウロキナーゼの活性の合計を含んでいる。与え
られた試料中のプロウロキナーゼの量はプラスミン存在
下および不在下で得られた値の間の差である。
るウェル当りの酵素単位から決定される。プラスミン存
在下で検定された試料の活性は存在するプロウロキナー
ゼおよびウロキナーゼの活性の合計を含んでいる。与え
られた試料中のプロウロキナーゼの量はプラスミン存在
下および不在下で得られた値の間の差である。
結果は下記の表１に示されている。
実施例２ A.前処理： 本実施例では10K I単位/mlアプロチニンを含む典型的
な血清を含まない増殖培地からプロウロキナーゼが抽出
され、実施例１に記載されたごとく前処理および過さ
れた。
な血清を含まない増殖培地からプロウロキナーゼが抽出
され、実施例１に記載されたごとく前処理および過さ
れた。
B.クロマトグラフィー： ６リットルの前処理された条件付け等張培地を室温に
てABx（J.T.ベーカー ケミカル カンパニー;40ミクロ
ン粒子直径）を含むファルマシアＫカラム（５×2.5c
m）上に充填し、カラムは107cm/hrで流す。充填後カラ
ムを20カラム容量の緩衝液Ａおよび10カラム容量の20％
緩衝液B/80％緩衝液Ａで洗浄する。カラム上のタンパク
質は６カラム容量の100％緩衝液Ｂで溶出する（実施例
１参照）。カラムは次に10カラム容量の100％緩衝液Ｃ
で洗浄する。
てABx（J.T.ベーカー ケミカル カンパニー;40ミクロ
ン粒子直径）を含むファルマシアＫカラム（５×2.5c
m）上に充填し、カラムは107cm/hrで流す。充填後カラ
ムを20カラム容量の緩衝液Ａおよび10カラム容量の20％
緩衝液B/80％緩衝液Ａで洗浄する。カラム上のタンパク
質は６カラム容量の100％緩衝液Ｂで溶出する（実施例
１参照）。カラムは次に10カラム容量の100％緩衝液Ｃ
で洗浄する。
カラム溶出液は実施例に記載したごとくUV吸収により
モニターされる。100％緩衝液Ｂでの展開により２つの
ピークの分画が得られた。
モニターされる。100％緩衝液Ｂでの展開により２つの
ピークの分画が得られた。
C.電気泳動： 培地およびカラム溶出物は操作の間一般に実施例１に
記載されているごとくSDS−PAGEにより分析される。大
多数のウロキナーゼは図２に示したごとく100％緩衝液
Ｂでカラムから溶出される。
記載されているごとくSDS−PAGEにより分析される。大
多数のウロキナーゼは図２に示したごとく100％緩衝液
Ｂでカラムから溶出される。
D.活性検定： 操作の間各々の工程での培地およびカラム溶出物中に
観察されるウロキナーゼの酵素活性は上記実施例に記載
されているごとき直接UK検定により分析される。
観察されるウロキナーゼの酵素活性は上記実施例に記載
されているごとき直接UK検定により分析される。
結果は下記の表２に示されている。
実施例３ A.前処理： この実施例においては10K I単位/mlアプロチニンを含
む典型的な血清を含まない増殖培地からプロウロキナー
ゼが抽出され、実施例１に記載したごとく前処理され
過される。
む典型的な血清を含まない増殖培地からプロウロキナー
ゼが抽出され、実施例１に記載したごとく前処理され
過される。
B.クロマトグラフィー： ８リットルの前処理された条件付け培地を室温にてAB
x（J.T.ベーカー ケミカル カンパニー;40ミクロン粒
子直径）を含むファルマシアＫカラム（５×2.0cm）上
に充填し、カラムは105cm/hrで流す。充填後、カラムを
10カラム容量の緩衝液Ａおよび10カラム容量の20％緩衝
液B/80％緩衝液Ａで洗浄する。カラム上のタンパク質は
８カラム容量の100％緩衝液Ｂ（実施例１参照）で溶出
される。カラムは次に10カラム容量の100％緩衝液Ｃで
洗浄される。
x（J.T.ベーカー ケミカル カンパニー;40ミクロン粒
子直径）を含むファルマシアＫカラム（５×2.0cm）上
に充填し、カラムは105cm/hrで流す。充填後、カラムを
10カラム容量の緩衝液Ａおよび10カラム容量の20％緩衝
液B/80％緩衝液Ａで洗浄する。カラム上のタンパク質は
８カラム容量の100％緩衝液Ｂ（実施例１参照）で溶出
される。カラムは次に10カラム容量の100％緩衝液Ｃで
洗浄される。
カラム溶出液は実施例１に記載されているごとくUV吸
収によりモニターする。100％緩衝液Ｂによる展開によ
り２つのピークの分画が得られた。
収によりモニターする。100％緩衝液Ｂによる展開によ
り２つのピークの分画が得られた。
C.電気泳動： 操作の間培地およびカラム溶出物が一般的に実施例１
に記載されたごとくSDS−PAGEにより分析された。ウロ
キナーゼの大多数は100％緩衝液Ｂによりカラムから溶
出された（分画２）。
に記載されたごとくSDS−PAGEにより分析された。ウロ
キナーゼの大多数は100％緩衝液Ｂによりカラムから溶
出された（分画２）。
D.活性検定： 操作の間の各々の工程で培地およびカラム溶出物中に
観察されるウロキナーゼの酵素活性は前記実施例１のご
とく直接UK検定により分析される。
観察されるウロキナーゼの酵素活性は前記実施例１のご
とく直接UK検定により分析される。
結果は下記の表３に示されている。
以上の実施例から評価されるごとく、全部ではないに
してもほとんどのウロキナーゼ関連酵素活性が本発明の
方法により血清を含まないおよび血清を補給した両方の
培地から回収できる。
してもほとんどのウロキナーゼ関連酵素活性が本発明の
方法により血清を含まないおよび血清を補給した両方の
培地から回収できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−162881（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/72 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (14)
- 【請求項１】ウロキナーゼ化合物および他のタンパク質
の溶液からウロキナーゼ化合物を抽出する方法であっ
て、 （ａ）ウロキナーゼ化合物含有タンパク質溶液を、粒子
状のシリカ様マトリックスと、前記溶液中のウロキナー
ゼ化合物が前記マトリックスに結合する条件下で接触さ
せ、前記マトリックスは、前記粒子状のシリカ様マトリ
ックスとポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシラ
ンとの、共有結合的に結合したカルボキシル化反応生成
物を含み； （ｂ）前記マトリックスから非結合タンパク質を分離
し；そして （ｃ）前記マトリックスからウロキナーゼ化合物を放出
させる； の各工程を含む方法。 - 【請求項２】前記溶液が培養培地を含む、請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】前記溶液が細胞抽出物を含む、請求項１記
載の方法。 - 【請求項４】前記接触工程が、クロマトグラフィー分離
技術を用いて前記マトリックス上に前記ウロキナーゼ化
合物含有溶液を通過させることを含む、請求項１記載の
方法。 - 【請求項５】前記接触工程が、固相抽出技術を用いて、
前記マトリックスおよび前記ウロキナーゼ化合物含有溶
液を一緒に混合して２相混合物を形成させることを含
む、請求項１記載の方法。 - 【請求項６】前記シリカ様マトリックスが、シリカゲル
および多孔性ガラスビーズから構成される群より選択さ
れる粒子を含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項７】前記マトリックス物質が、前記マトリック
ス物質１グラム当たり約0.3から約1.2ミリ当量のカルボ
キシルを含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項８】前記接触工程が、約4.0と約6.0との間のpH
で実施される、請求項１記載の方法。 - 【請求項９】前記接触工程が、約5.6のpHで実施され
る、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】前記放出工程が、約6.0より高いpHおよ
び約250ミリモルより高いイオン強度で実施される、請
求項１記載の方法。 - 【請求項１１】前記放出工程が、約500ミリモルのイオ
ン強度で実施される、請求項10記載の方法。 - 【請求項１２】前記放出工程が、約4.0より低いpHで実
施される、請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】前記接触工程および放出工程が、イプシ
ロンアミノカプロン酸および界面活性剤の存在下で実施
される、請求項１記載の方法。 - 【請求項１４】前記放出工程が、ウロキナーゼ化合物が
前記マトリックスと接触した前記ウロキナーゼ化合物含
有溶液中の少なくとも90％のウロキナーゼ化合物から構
成される画分を生成する、請求項１記載の方法。
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| US205,437 | 1988-06-10 | ||
| US07/205,437 US4920051A (en) | 1988-02-03 | 1988-06-10 | Recovery of urokinase compounds |
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Country Status (7)
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| CN115197926A (zh) * | 2022-05-25 | 2022-10-18 | 山东邦凯新材料有限公司 | 一种利用改性树脂提取尿激酶的制备方法 |
| CN115624959B (zh) * | 2022-09-30 | 2023-11-24 | 河南省尤里卡生物科技有限公司 | 一种尿激酶吸附材料及其制备方法和应用 |
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| US4106992A (en) * | 1971-09-24 | 1978-08-15 | Choay S.A. | Purification of urokinase |
| US3930944A (en) * | 1975-03-31 | 1976-01-06 | Abbott Laboratories | Urokinase production |
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| WO1988000242A1 (en) * | 1986-06-26 | 1988-01-14 | Damon Biotech, Inc. | Recombinant human tissue plasminogen activator composition |
-
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- 1988-06-10 US US07/205,437 patent/US4920051A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-05-25 DE DE68911503T patent/DE68911503T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-25 JP JP1507108A patent/JP2833811B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-25 AU AU38391/89A patent/AU618381B2/en not_active Ceased
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