CH643297A5 - Verfahren zur reindarstellung von urokinase. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Urokinase hoher Konzentration und Aktivität, ausgehend von einer vorgereinigten und aufkonzentrierten Urokinase-Rohlösung, dadurch gekennzeichnet, dass diese Urokinase-Rohlösung mit einer porösen Feststoffmatrix mit hoher spezifischer Oberfläche, an deren Oberfläche Aprotinin mittels kovalenter, chemischer Bindungen immobilisiert ist, in einem Milieu bei pH ^ 6 kontaktiert wird, die Trägerlösung abgetrennt und die adsorbierte Urokinase anschliessend mittels eines Eluationsmittels bei pH =% 4,5 eluiert wird.

2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Urokinase-Rohlösung über die poröse Feststoffmatrix in einem Milieu bei pH > 6 affinitäts-chromato-graphisch getrennt wird und anschliessend die derart adsorbierte Urokinase mittels einer Eluationslösung bei pH < 4,5 eluiert wird.

3. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Urokinase-Rohlösung eine Konzentration von 2 000 bis 10 000 IE Urokinase pro ml Lösung, vorzugsweise eine solche von 3 000 bis 5 000 IE Urokinase pro ml Lösung, und eine Reinheit von 200 bis 2 000 IE Urokinase pro mg vorliegender Proteine, vorteilhafterweise eine solche von 300 bis 1.000 IE Urokinase pro mg vorliegender Proteine, aufweist.

4". Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die poröse Feststoffmatrix ein Harz auf der Basis von Polysacchariden, von Cellulose, von Agarose, R von Dextranen, R oder auf Basis von copolymeren Additionsprodukten von Polyacrylamiden mit Agarose R ist.

5. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1,2 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Aprotinin über kovalente Bindungen entweder direkt oder über Bindungsvermittler an die Feststoffmatrix gebunden ist, wobei als Bindungsvermitt-ler beispielsweise s-Aminocapronsäure, Divinylsulfon oder bis-Oxirane eingesetzt werden.

6. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1,2,4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Feststoffmatrix vorgängig aktiviert wird, beispielsweise mittels BrCN.

7.Verfahren gemäss Patentansprüchen 4,5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kolonne vor der eigentlichen Adsorption der Urokinase in der affmitäts-chromatographi-schen Trennung mittels eines flüssigen Milieus bei pH 6 bis 9 und einer Gesamtsalzkonzentration von 0,5 bis 1 m konditioniert wird, wobei als Puffersubstanzen z.B. Phosphatmischungen oder Tris und als Salze NaCl oder KCl eingesetzt werden.

8. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Urokinase-Rohlösung auf eine gesamte Salzkonzentration von 0,5 bis 1 m eingestellt wird, beispielsweise mittels Zusatz von NaCl oder KCl.

9. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach der eigentlichen Adsorption der Urokinase an der mittels Aprotinin oberflächenaktivierten Feststoffmatrix und vor der eigentlichen Eluation eine Zwischenspülung der Kolonne mittels einer 0,5 bis 1 m NaCl-Lö-sung zwecks Entfernung von unerwünschten Proteinen aus der Trennkolonne ausgeführt wird, wobei die genannte Zwischenspülung bis zur optischen Reinheit des Spülmittels ausgeführt wird.

10. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Eluation mittels eines Eluationsmittels mit einem pH von 2 bis 4,5 und einer Salzkonzentration von 0,5 bis 1 m z.B. an NaCl oder KCl, ausgeführt wird, wobei der pH mittels Essigsäure oder HCl eingestellt wird.

11. Verfahren gemäss Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass dem Eluationsmittel Eluationshilfsmittel wie Aminosäuren, z.B. Lysin oder Arginin zugegeben werden.

12. Urokinase hoher Konzentration und Aktivität, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 und 2.

Die vorliegend beschriebene Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Reindarstellung von Urokinase, io Urokinase ist bekanntlich ein Enzym, das in kleinen Mengen im Harn von Säugetieren und dementsprechend auch im menschlichen Harn vorkommt. Urokinase ist ein Aktivator und dient der Umwandlung von Plasminogen in Plasmin. Dieses Enzym wiederum kann Fibringerinnsel auflösen. Da-15 her sind Urokinase-Präparate in der pharmazeutischen Medizin wertvolle Produkte zur Behandlung von beispielsweise Thromboembolien.

Zur Isolierung von Urokinase aus menschlichem Urin und anschliessender Reinigung und Konzentrierung zu einem 20 hochwirksamen Produkt sind eine Anzahl von Verfahren bekannt, die darin bestehen, den Urin mit einem Adsorptionsmittel in Kontakt zu bringen und das Adsorbat anschliessend zu eluieren. Im Extrakt liegt dann die rohe Urokinase in erhöhter Konzentration vor. Dieser Extrakt wird wiederum 25 mittels verschiedener Adsorptions-Eluierungs- und anderer Trennungs-Verfahren aufgearbeitet, sodass schliesslich eine hoch-konzentrierte und -gereinigte Urokinaselösung erhalten wird.

Bekannte Adsorptionsmittel sind beispielsweise Calciumcarbonat, Bariumsulfat, Aluminiumoxyd, Calciumphosphat, Zinkhydroxyd, Aktivkohle, hydrierte Aluminiumsilikate wie Bentonit und Kaolin, Ionenaustauschsilikate, Molekularsiebe sowie eine Anzahl anderer, organischer und anorganischer Stoffe.

35 Es sind, in der Zwischenzeit, verschiedene affinitäts-chro-matographische Methoden für die Konzentrierung und Reinigung von Urokinase vorgeschlagen worden. Die meisten dieser Verfahren verwenden für die affinitive Adsorption Feststoffmatrixes, z.B. die folgenden Verbindungen ober-40 flächlich immobilisiert enthalten: s-Aminocapronsäure und p-Aminobenzamidin, auf Sepharose®, Antikörper zur Urokinase auf Sepharose, Arginin auf Polyacrylamidharzen, Ag-matin-e-aminocapronsäure auf Sepharose®, Trypsininhibitor auf Agarose, Lysin oder Arginin auf Agarose, Trypsininhibi-45 tor auf Sepharose, Urokinaseinhibitor aus menschlicher Plazenta auf Sepharose und ähnliche Kombinationen.

Andererseits ist es bekannt, Aprotinin an der Oberfläche von Feststoffmatrix zu immobilisieren und die derart vorbereiteten Harze für die affinitäts-chromatographische Tren-30 nung und Konzentration von verschiedenen Verbindungen, nicht jedoch von Urokinase, zu verwenden. Beispielsweise wird in der Zeitschrift Biochemie, 55, Seite 1323 (1973) eine affinitäts-chromatographisches Verfahren zur Konzentrierung von Trypsinen an derartigen Harzen beschrieben. Eine 55 ähnliche Arbeit wird in der gleichen Zeitschrift in Band 15, Seite 4 (1976) beschrieben. Weiter wird im Journal of Physio-logical Chemistry, 357, Seite 1153 ff (1976), ein Verfahren zur Reinigung und Charakterisierung von menschlicher Pankrea-selastase angegeben. Schliesslich sei noch auf die Arbeit im 60 Journal of Clinical Chemistry/Clinical Biochemistry, 15, Seiten 479 ff (1977) hingewiesen, wo ein Verfahren für die Isolierung von menschlichem Kallikrein angegeben wird.

Währenddem also im beschriebenen Stand der Technik einmal bekannt ist, Urokinase mittels verschiedener, oberflächlich gebundener Verbindungen - jedoch ausdrücklich Aprotinin ausgenommen-und währenddem ebenso bekannt ist, Aprotinin an Feststoffmatrixen immobilisiert für die Konzentrierung und Reinigung verschiedenster Verbindun65

gen - hier ausdrücklich aufgenommen Urokinase -, wurde nun überraschenderweise gefunden, dass eine Trennung und Konzentrierung von Urokinase an Aprotinin, welches an Feststoffen immobilisiert ist, zu ausgezeichneten und wirtschaftlich äusserst günstigen Verfahrensresultaten führt.

Vor der eigentlichen Erfindungsbeschreibung soll noch daraufhingewiesen werden, dass in den bekannten Darstellungsverfahren die Urokinase im allgemeinen in zwei Verbindungsformen anzufallen scheint, wobei die höher molekularere ein mittleres Molekulargewicht um 54 000 und die niedrig molekularere ein solches um 33 000 aufweist. Überraschenderweise hat es sich nun gezeigt, dass mit den weiter unten zu beschreibenden, erfindungsgemässen Verfahren eine Urokinase erhalten wird, deren Molekulargewicht nur um einen mittleren Wert von ungefähr 54 000 variiert. Gründe für diese Verbesserung der Produktequalität können hier noch nicht eindeutig aufgeführt werden, es wird zurzeit untersucht, ob die Urokinase mit dem tieferen, mittleren Molekulargewicht ein Abbauprodukt der höher molekularerem ist.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Reindarstellung von Urokinase hohe Konzentration und Aktivität, ausgehend von einer vorgereinigten und aufkonzentrierten Urokinase-Rohlösung, ist im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert.

Die Wirkung des immobilisierten Aprotinins zur spezifischen Adsorption von Urokinase ist vor allem deswegen erstaunlich, weil Aprotinin in Lösung, bei den üblichen Konzentrationen bekanntlich die Urokinase-Wirkung nicht inhibiert.

Zudem zeigten mit Aprotinin oberflächen-aktivierte Harze, verglichen mit heute üblichen Chromatographiesäulen eine längere und konstantere Betriebsdauer.

Die eingesetzte Urokinase-Rohlösung sollte eine Konzentration von 2 0000 bis 10 000 IE Urokinase pro ml Lösung, vorteilhafterweise eine solche von 3 000 bis 5 000 IE Urokinase pro ml Lösung sowie eine Reinheit von 200 bsi 2 000 IE Urokinase pro mg vorliegender Proteine, vorteilhafterweise eine solche von 300 bis 1 000 IE Urokinase pro mg vorliegender Proteine aufweisen.

Als poröse Feststoffmatrix können verschiedene Harze eingesetzt werden, beispielsweise solche auf der Basis von Polysacchariden, von Cellulose, von Agarose wie Sepharose® der Pharmacia AB, Schweden, von Dextranen wie beispielsweise Sephadex® der Pharmacia AB Schweden, oder auf Basis von copolymeren Additionsprodukten auf der Basis von Polyacrylamiden mit Agarose wie Sephacryl® der Pharmacia AB Schweden, oder Ultrogel® der LKB. Selbstverständlich können auch andere Feststoffmatrixes eingesetzt werden, die Hauptvoraussetzung ist deren Fähigkeit, mit dem Aprotinin entweder direkt oder über Bindungsvermittler kovalente Bindungen einzugehen. Solche Bindungsvermittler oder spacer sind beispielsweise die s-Amincapronsäure, in der internationalen Literatur oft mit EACA (6-Aminohexanonsäure) bezeichnet, das Divinylsulfon, verschiedene bis-Oxirane oder andere Verbindungen.

Die Feststoffmatrix kann, wie dies bei der Affinitäts-Chromatographie oft geschieht, vorgängig aktiviert werden. Beispielsweise kann das mittels BrCN oder anderer bekannter Aktivierungsmittel geschehen.

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Es muss hier nochmals darauf hingewiesen werden, dass das erfindungsgemässe Verfahren nicht zur Aufarbeitung von Rohurin geeignet ist, die Konzentration an Urokinase in dieser Lösung ist zu tief. Die genannte Urokinase-Rohlösung 5 kann mit Zugabe von verschiedenen Salzen, beispielsweise NaCl oder KCl, auf eine gesamte Salzkonzentration von 0,5 bis 1 m gebracht werden.

Ebenfalls vor der eigentlichen Adsorption kann das Adsorptionsmittel, speziell wenn es in einer Kolonne vorliegt, îomit einem flüssigen Milieu bei einem pH von 6 bis 9 und einer Gesamtsalzkonzentration von 0,5 bis 1 m konditioniert werden. Als Puffersubstanzen können die bekannten Phosphatpuffer oder Trispuffer, aber auch andere, eingesetzt werden. Als Salze für die Konditionierung können NaCl oder KCl i5 oder andere ähnliche Verbindungen eingesetzt werden.

Nach der eigentlichen Adsorption der Urokinase an der Feststoffmatrix mit dem Aprotinin und vor der eigentlichen Eluation der Urokinase kann die beladene Feststoffmatrix einer Zwischenprüfung unterworfen werden. Dazu kann ein 20 flüssiges Mittel mit einer 0,5 bis 1 m NaCl-Lösung verwendet werden.

Diese Zwischenspülung dient vor allem der Entfernung von unerwünschten Proteinen aus der Feststoffmatrix. Ge-25 spült werden kann mit dem Mittel so lange, bis das austretende Mittel bei einer Wellenlänge von 280 nm optisch inaktiv ist, d.h. praktisch keine Proteinkonzentration mehr anzeigt.

Als Eluationsmittel kann eine Lösung von 0,5 bis 1 m NaCl oder KCl dienen. Da die Eluation erfindungsgemäss bei 30 einem pH < 4,5 ausgeführt werden muss, können z.B. Lösungen der oben genannten Salze und Konzentrationen bei einem pH von 2 bis 4,5 eingesetzt werden. Solche Lösungen können z.B. durch Zugabe von Essigsäure oder HCl, aber auch von anderen Verbindungen, eingestellt werden.

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Dem Eluationsmittel können auch die an und für sich bekannten Eluationshilfsmittel, wie Aminosäuren, beispielsweise Lysin oder Arginin oder andere, zugegeben werden.

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren werden Lösun-40 gen von Urokinasen erreicht, die sowohl hohe Konzentrationen wie auch hohe Reinheiten an, bzw. der Urokinase zeigen. Es ist z.B. nicht ausgeschlossen, dass mit dem erfindungsgemässen Verfahren entweder inbezug auf die Konzentration und/oder inbezug auf die Reinheit der Urokinase eine Verbes-45 serung, gegenüber der Ausgangssubstanz, um einen Faktor von 100 erreicht wird. Es können mittels des erfindungsgemässen Verfahrens Urokinase-Lösungen erhalten werden, die Reinheiten von über 50 000 IE Urokinase pro mg vorliegender Proteine erhalten werden. Solche Reinheiten gelten heute 50 allgemein als genügend hoch, um das Produkt direkt bei klinischen Einsätzen verwenden zu können. Zu den genannten Vorteilen kommt noch die weiter vorn erwähnte Tatsache hinzu, dass die erfindungsgemäss rein dargestellte Urokinase ein einheitliches Molekulargewicht um 50 000 aufweist.

55

Als Illustration der Mengen und Konzentrationswerte bei der Urokinase-Herstellung allgemein, werden im folgenden in Form einer Tabelle die verschiedenen Werte zur Illustration dargestellt.

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Tabelle Material

Urin

Urokinase-Rohlösung

Reinkonzentrat

Verfahrensschritte

Adsorption erfindungsge mässes Verfahren

Reinheit IE Urokinase pro mg Proteine

300 bis 1 000

30 000 bis 100 000

Depyrogenation,

andere Verfahren

Das erfindungsgemässe Verfahren wird nun anhand von Beispielen erläutert und illustriert.

Ausbeuten [IE Urokinase (bezogen auf 1 Liter Ausgangslösung)

8 000

8 000

5 000

Volumina [Liter]

10 000 25

abhängig von Verfahren

Beispiel 1

500 ml einer Urokinase-Rohlösung, enthaltend 12-106 IE Urokinase, d.h. mit einer Konzentration von 24 000 EE Urokinase pro ml Lösung und einer Reinheit von 630 IE Urokinase pro mg Proteine, wurden über eine Sepharose-Aproti-nin-Kolonne von einem Liter Volumen perkoliert. Die Kolonne war vorgängig mit einem Tris-Puffer von 0,1 m auf pH 8 konditioniert worden. Die genannte Konditionierflüssigkeit enthielt zudem 0,5 m NaCl. Nach der Adsorption ist die gleiche Kolonne mit der gleichen Konditionierflüssigkeit gespült worden, bis die auslaufende Spüllösung bei 280 nm eine optische Dichte von weniger als 0,100 aufwies. Anschliessend wurde die Kolonne mit einem Liter 0,5 m NaCl-Lösung gespült.

Die adsorbierte Urokinase wurde schliesslich mit einer Lösung von 0,5 m NaCl, welche mit HCl auf einen pH von 2,5 eingestellt worden war, eluiert.

Es wurden 1,5 Liter Eluat erhalten, die im ganzen 8 160 000 IE Urokinase enthielt (Ausbeute 68%). Die Reinheit der so erhaltenen Lösung betrug 53 000 IE Urokinase pro mg vorliegender Proteine.

Beispiel 2

2s 4,2 Liter einer Urokinase-Rohlösung, enthaltend gesamthaft 22 260 000 IE Urokinase, d.h. mit einer Konzentration von 5 200 IE Urokinase pro ml Lösung und mit einer Reinheit von 370 IE Urokinase pro mg vorliegender Proteine wurden über eine Kolonne aus SepharoseR -EACA-Aprotinin 3o perkoliert. Das Kolonnenvolumen betrug 1,5 Liter. Die Kolonne war vorgängig mit einem Phosphat-Puffer von 0.02 m bei pH 7,2 equilibriert worden. Die Puffer-Lösung enthielt zudem 1,0 m NaCl. Das beladene Harz wurde anschliessend mit 3 Litern der genannten Puffer-Lösung und darauf mit 2 35 Litern einer 1,0 m NaCl-Lösung gespült. Eluiert wurde anschliessend die adsorbierte Urokinase mittels einer Lösung von 1,0 m NaCl, welche mit Essigsäure auf einen pH von 3,9 eingestellt worden war.

2 Liter Lösung von Urokinase wurden erhalten, die im ge-4o samten 15 915 000 IE Urokinasen enthielten, was einer Ausbeute von 71,5% entspricht. Die Reinheit der erhaltenen Lösung war 61 500 IE Urokinase pro mg vorliegender Proteine.

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