JPH09187274A - ウロキナーゼ前駆体の精製方法 - Google Patents
ウロキナーゼ前駆体の精製方法Info
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- JPH09187274A JPH09187274A JP290696A JP290696A JPH09187274A JP H09187274 A JPH09187274 A JP H09187274A JP 290696 A JP290696 A JP 290696A JP 290696 A JP290696 A JP 290696A JP H09187274 A JPH09187274 A JP H09187274A
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- Japan
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- precursor
- urokinase
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- adsorbed
- urokinase precursor
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ウロキナーゼ前駆体を簡易かつ高収率で精製
する方法、特にウロキナーゼ前駆体の培養液をそのまま
供することができる精製方法の提供。 【解決手段】 ウロキナーゼ前駆体およびその産生細胞
を含有する培養液を、流動層中に浮遊する吸着粒子に接
触させ、その吸着画分を回収する工程、特に該培養液を
吸着粒子が浮遊する流動層に上方送液することにより該
吸着粒子に接触させた後、溶出用緩衝液を下方送液する
ことによりその吸着画分を溶出、回収する工程を含むこ
とを特徴とするウロキナーゼ前駆体の精製方法である。
する方法、特にウロキナーゼ前駆体の培養液をそのまま
供することができる精製方法の提供。 【解決手段】 ウロキナーゼ前駆体およびその産生細胞
を含有する培養液を、流動層中に浮遊する吸着粒子に接
触させ、その吸着画分を回収する工程、特に該培養液を
吸着粒子が浮遊する流動層に上方送液することにより該
吸着粒子に接触させた後、溶出用緩衝液を下方送液する
ことによりその吸着画分を溶出、回収する工程を含むこ
とを特徴とするウロキナーゼ前駆体の精製方法である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は細胞培養あるいは遺
伝子工学由来により得られるウロキナーゼ（ＵＫ）前駆
体の簡易かつ高収率な精製方法に関する。
伝子工学由来により得られるウロキナーゼ（ＵＫ）前駆
体の簡易かつ高収率な精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＵＫ前駆体は、それ自身では線溶作用を
発現しないものであり、またフィブリンに対する親和性
が高く、血漿中のフィブリノーゲンに作用（分解）する
ことなく、血栓を構成するフィブリンに到達し、血栓中
の微量のプラスミンの作用により線溶活性を発現する
（特開昭６０−６２９８１号公報参照）。即ち、ＵＫ前
駆体は血栓部位に限定した線溶を惹起させ、選択的かつ
効率的に血栓を溶解する特性を有するため、血管栓塞疾
患の治療剤として有望視され、既に一部の適応症におい
て臨床使用されている。
発現しないものであり、またフィブリンに対する親和性
が高く、血漿中のフィブリノーゲンに作用（分解）する
ことなく、血栓を構成するフィブリンに到達し、血栓中
の微量のプラスミンの作用により線溶活性を発現する
（特開昭６０−６２９８１号公報参照）。即ち、ＵＫ前
駆体は血栓部位に限定した線溶を惹起させ、選択的かつ
効率的に血栓を溶解する特性を有するため、血管栓塞疾
患の治療剤として有望視され、既に一部の適応症におい
て臨床使用されている。
【０００３】その精製方法としては、培養上清を陽イオ
ン交換体処理後に抗体アフィニティクロマトグラフィー
処理する方法（特開昭６０−６２９８１号公報）、固定
化ベンズアミジン処理する方法（特開平１−３０４８８
１号公報）、キレート樹脂による処理（特開昭６３−１
４６７８９号公報）等が知られている。
ン交換体処理後に抗体アフィニティクロマトグラフィー
処理する方法（特開昭６０−６２９８１号公報）、固定
化ベンズアミジン処理する方法（特開平１−３０４８８
１号公報）、キレート樹脂による処理（特開昭６３−１
４６７８９号公報）等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、大量に
産生したＵＫ前駆体を含有する培養液を精製するに際
し、培養液をバッチ方式で処理する場合は、大量処理が
容易で、精製効率も良好であるが、操作性が悪く、自動
化工程の導入が困難である。また、カラム方式で処理す
る場合は逆に、自動化工程の導入が容易であるが、大量
処理には不向きであり、精製効率も若干劣る等の問題点
がある。さらに、培養液にはＵＫ前駆体産生細胞／宿
主、その破砕物を含む不溶性物質が多数混入しており、
上記処理を妨げる原因となっている。
産生したＵＫ前駆体を含有する培養液を精製するに際
し、培養液をバッチ方式で処理する場合は、大量処理が
容易で、精製効率も良好であるが、操作性が悪く、自動
化工程の導入が困難である。また、カラム方式で処理す
る場合は逆に、自動化工程の導入が容易であるが、大量
処理には不向きであり、精製効率も若干劣る等の問題点
がある。さらに、培養液にはＵＫ前駆体産生細胞／宿
主、その破砕物を含む不溶性物質が多数混入しており、
上記処理を妨げる原因となっている。
【０００５】また、最近、培養後の菌体細胞の除去や濃
縮操作等の前処理を行わず、培養原液から直接目的のタ
ンパク質を回収する方法が開発されている〔ファルマシ
ア社が開発している吸着流動床技術（Expanded Bed Ads
orption)を用いたストリームライン法等、特表平６−５
０００５０号公報〕。今までこのような吸着流動床技術
がＵＫ前駆体の精製、特にヒト腎細胞培養液からＵＫ前
駆体を回収・精製するために応用された例はなく、実際
にこの方法がＵＫ前駆体精製の合理化、収量アップを図
るのに有用であるか、また品質を損なうことなく、短時
間に精製できる等についてはまったく知られていない。
縮操作等の前処理を行わず、培養原液から直接目的のタ
ンパク質を回収する方法が開発されている〔ファルマシ
ア社が開発している吸着流動床技術（Expanded Bed Ads
orption)を用いたストリームライン法等、特表平６−５
０００５０号公報〕。今までこのような吸着流動床技術
がＵＫ前駆体の精製、特にヒト腎細胞培養液からＵＫ前
駆体を回収・精製するために応用された例はなく、実際
にこの方法がＵＫ前駆体精製の合理化、収量アップを図
るのに有用であるか、また品質を損なうことなく、短時
間に精製できる等についてはまったく知られていない。
【０００６】本発明の目的は、ＵＫ前駆体を簡易かつ高
収率で精製する方法を提供することにある。
収率で精製する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討を行った結果、ＵＫ前駆体を含有
する培養液をＵＫ前駆体産生細胞／宿主を含んだままの
状態で、即ちこれらを含む不溶性物質等を予め除去操作
を行うことなく、高収率でしかも簡潔にＵＫ前駆体を精
製できることを見出して、本発明を完成した。
を達成すべく鋭意検討を行った結果、ＵＫ前駆体を含有
する培養液をＵＫ前駆体産生細胞／宿主を含んだままの
状態で、即ちこれらを含む不溶性物質等を予め除去操作
を行うことなく、高収率でしかも簡潔にＵＫ前駆体を精
製できることを見出して、本発明を完成した。
【０００８】即ち本発明は、(1) ＵＫ前駆体およびその
産生細胞を含有する培養液を、流動層中に浮遊する吸着
粒子に接触させ、その吸着画分を回収する工程を含むこ
とを特徴とするＵＫ前駆体の精製方法、(2) ＵＫ前駆体
およびその産生細胞を含有する培養液を、吸着粒子が浮
遊する流動層に上方送液することにより該吸着粒子に接
触させた後、溶出用緩衝液を下方送液することによりそ
の吸着画分を溶出、回収する工程を含むことを特徴とす
るＵＫ前駆体の精製方法に関する。
産生細胞を含有する培養液を、流動層中に浮遊する吸着
粒子に接触させ、その吸着画分を回収する工程を含むこ
とを特徴とするＵＫ前駆体の精製方法、(2) ＵＫ前駆体
およびその産生細胞を含有する培養液を、吸着粒子が浮
遊する流動層に上方送液することにより該吸着粒子に接
触させた後、溶出用緩衝液を下方送液することによりそ
の吸着画分を溶出、回収する工程を含むことを特徴とす
るＵＫ前駆体の精製方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明においてＵＫ前駆体とは、
そのままではほとんど線溶活性を有しないが、プラスミ
ン等の酵素処理により、ＵＫに変換されて線溶活性を示
すものである。また、フィブリン存在下でも若干の線溶
活性を示すものである。例えば、その分子量は５０，０
００〜５５，０００で、一本鎖のペプチド結合構造を有
するものである。このようなＵＫ前駆体としては、例え
ば構成アミノ酸４１１個のものが挙げられる（アミノ酸
配列は特開昭６０−６２９８１号公報参照）。
そのままではほとんど線溶活性を有しないが、プラスミ
ン等の酵素処理により、ＵＫに変換されて線溶活性を示
すものである。また、フィブリン存在下でも若干の線溶
活性を示すものである。例えば、その分子量は５０，０
００〜５５，０００で、一本鎖のペプチド結合構造を有
するものである。このようなＵＫ前駆体としては、例え
ば構成アミノ酸４１１個のものが挙げられる（アミノ酸
配列は特開昭６０−６２９８１号公報参照）。
【００１０】本発明の精製に供せられるＵＫ前駆体の調
製方法は特に制限されず、例えば細胞培養法、遺伝子工
学法等により調製される。細胞培養法は特開昭６０−６
２９８１号公報等に、遺伝子工学法は特開昭６０−１８
０５９１号公報、特開昭６１−１７７９８７号公報、特
開昭６２−１４９６２５号公報、特開昭６３−１０５６
７５号公報等に開示されている。
製方法は特に制限されず、例えば細胞培養法、遺伝子工
学法等により調製される。細胞培養法は特開昭６０−６
２９８１号公報等に、遺伝子工学法は特開昭６０−１８
０５９１号公報、特開昭６１−１７７９８７号公報、特
開昭６２−１４９６２５号公報、特開昭６３−１０５６
７５号公報等に開示されている。
【００１１】本発明でいうＵＫ前駆体は上記のものに限
定されず、その誘導体をも包含する。かかる誘導体とし
ては、ＵＫ前駆体のエピダーマルグロースファクタード
メインの全領域もしくはその一部を欠失、または該全領
域もしくはその一部を他のアミノ酸残基で置換されてい
る蛋白質分子等が挙げられる（特開昭６３−１４６７８
９号公報、特開平３−８７１８０号公報、特開平３−８
７１８１号公報、特開平５−９５７８６号公報、特開平
５−１９２１４２号公報等）。従って、特に言及しない
限り、本明細書においてＵＫ前駆体とはＵＫ前駆体自体
および上記のごときＵＫ前駆体誘導体をも意味するもの
である。
定されず、その誘導体をも包含する。かかる誘導体とし
ては、ＵＫ前駆体のエピダーマルグロースファクタード
メインの全領域もしくはその一部を欠失、または該全領
域もしくはその一部を他のアミノ酸残基で置換されてい
る蛋白質分子等が挙げられる（特開昭６３−１４６７８
９号公報、特開平３−８７１８０号公報、特開平３−８
７１８１号公報、特開平５−９５７８６号公報、特開平
５−１９２１４２号公報等）。従って、特に言及しない
限り、本明細書においてＵＫ前駆体とはＵＫ前駆体自体
および上記のごときＵＫ前駆体誘導体をも意味するもの
である。
【００１２】このＵＫ前駆体誘導体は通常、分子量４
０，０００〜５５，０００程度で、ＵＫ前駆体自体と同
様に一本鎖ペプチド結合構造を有する。また、その線溶
活性の発現様式も上記ＵＫ前駆体自体と同じである。こ
の誘導体は、例えば遺伝子工学的な手法により調製され
る（特開昭６０−１４６７８９号公報参照）。また、Ｕ
Ｋ前駆体誘導体にはＵＫ前駆体とアネキシンＶとの複合
体も含まれる。この複合体の調製方法もまた、公知であ
る（特表平５−５０８６６４号公報）。
０，０００〜５５，０００程度で、ＵＫ前駆体自体と同
様に一本鎖ペプチド結合構造を有する。また、その線溶
活性の発現様式も上記ＵＫ前駆体自体と同じである。こ
の誘導体は、例えば遺伝子工学的な手法により調製され
る（特開昭６０−１４６７８９号公報参照）。また、Ｕ
Ｋ前駆体誘導体にはＵＫ前駆体とアネキシンＶとの複合
体も含まれる。この複合体の調製方法もまた、公知であ
る（特表平５−５０８６６４号公報）。
【００１３】本発明に用いられる吸着粒子は、ＵＫ前駆
体を吸着するものであり、陽イオン交換基を有する担体
（陽イオン吸着体）が挙げられる。具体的には、スルホ
基型、カルボキシル基型等の吸着粒子が例示される。ス
ルホ基型としては、スルホ−アガロース〔商品名：スト
リームラインＳＰ，Ｓ−セファロース（共にファルマシ
ア社製）〕、スルホ−セルロース〔商品名：Ｓ−セルロ
ファイン（チッソ社製）〕、スルホプロピル−アガロー
ス〔商品名：ＳＰ−セファロース（ファルマシア社
製），ＳＰ−セルスル−ビッグビーズ（ステロジーン社
製）〕、スルホプロピル−デキストラン〔商品名：ＳＰ
−セファデックス（ファルマシア社製）〕、スルホプロ
ピル−ポリビニル〔商品名：ＳＰ−トヨパール（東ソー
社製）〕等が例示される。また、カルボキシル基型とし
ては、カルボキシメチル−アガロース〔商品名：ＣＭセ
ルスル−ビッグビーズ（ステロジーン社製）〕、カルボ
キシメチル−デキストラン〔商品名：ＣＭ−セファデッ
クス（ファルマシア社製）〕、カルボキシメチル−セル
ロース〔商品名：ＣＭ−セルロファイン（チッソ社
製）〕等が例示される。好ましくは、スルホ基型の強陽
イオン吸着粒子であり、より好ましくは、ストリームラ
インＳＰ（ファルマシア社製）である。また用いられる
吸着粒子の粒子径としては、通常３０〜１１００μｍ、
好ましくは１００〜３００μｍが例示される。
体を吸着するものであり、陽イオン交換基を有する担体
（陽イオン吸着体）が挙げられる。具体的には、スルホ
基型、カルボキシル基型等の吸着粒子が例示される。ス
ルホ基型としては、スルホ−アガロース〔商品名：スト
リームラインＳＰ，Ｓ−セファロース（共にファルマシ
ア社製）〕、スルホ−セルロース〔商品名：Ｓ−セルロ
ファイン（チッソ社製）〕、スルホプロピル−アガロー
ス〔商品名：ＳＰ−セファロース（ファルマシア社
製），ＳＰ−セルスル−ビッグビーズ（ステロジーン社
製）〕、スルホプロピル−デキストラン〔商品名：ＳＰ
−セファデックス（ファルマシア社製）〕、スルホプロ
ピル−ポリビニル〔商品名：ＳＰ−トヨパール（東ソー
社製）〕等が例示される。また、カルボキシル基型とし
ては、カルボキシメチル−アガロース〔商品名：ＣＭセ
ルスル−ビッグビーズ（ステロジーン社製）〕、カルボ
キシメチル−デキストラン〔商品名：ＣＭ−セファデッ
クス（ファルマシア社製）〕、カルボキシメチル−セル
ロース〔商品名：ＣＭ−セルロファイン（チッソ社
製）〕等が例示される。好ましくは、スルホ基型の強陽
イオン吸着粒子であり、より好ましくは、ストリームラ
インＳＰ（ファルマシア社製）である。また用いられる
吸着粒子の粒子径としては、通常３０〜１１００μｍ、
好ましくは１００〜３００μｍが例示される。
【００１４】接触条件としては、ｐＨ４．５〜６．５程
度、好ましくはｐＨ５〜６程度、塩濃度０．０１〜０．
３Ｍ程度、好ましくは０．１〜０．２Ｍ程度が例示され
る。吸着粒子は、予め上記のような接触条件で平衡化し
ておくことが好ましい。具体的には、０．１６Ｍのリン
酸緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化しておくことが好まし
い。
度、好ましくはｐＨ５〜６程度、塩濃度０．０１〜０．
３Ｍ程度、好ましくは０．１〜０．２Ｍ程度が例示され
る。吸着粒子は、予め上記のような接触条件で平衡化し
ておくことが好ましい。具体的には、０．１６Ｍのリン
酸緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化しておくことが好まし
い。
【００１５】吸着粒子の平衡化、吸着層への試料の注
入、吸着粒子への接触および吸着層からの溶出は、通常
下記の方法に従って行われる。即ち、まず前述の吸着粒
子を適当なカラムに充填し沈降させた後、当該カラム下
部出口から上方向に平衡化緩衝液を送液し、吸着粒子を
浮遊させる。この際、カラム内では、カラム下から上昇
する緩衝液の流速と重力により沈降する吸着粒子が互い
の力を打ち消しあって、吸着粒子による均一な浮遊平衡
状態が形成される（これを流動層という）。ついで、か
かる流動層が形成されたカラム内に、前述のようにして
調製されたＵＫ前駆体を含有する培養液をカラム下部出
口から上方送液により添加する。この際、目的のＵＫ前
駆体は吸着粒子と結合し、一方、ＵＫ前駆体産生細胞／
宿主、その破砕物や培養液に由来する微粒子および夾雑
物は流動層の吸着粒子を素通りしてカラム上部出口から
排出除去され、また吸着粒子にゆるく結合した夾雑成分
も、引き続いて上方送液される洗浄用緩衝液で洗い流さ
れる。好ましくは、吸着流動床技術に従って行われる
〔Journal of Chromatography, 597 (1992), 129-14
5〕。
入、吸着粒子への接触および吸着層からの溶出は、通常
下記の方法に従って行われる。即ち、まず前述の吸着粒
子を適当なカラムに充填し沈降させた後、当該カラム下
部出口から上方向に平衡化緩衝液を送液し、吸着粒子を
浮遊させる。この際、カラム内では、カラム下から上昇
する緩衝液の流速と重力により沈降する吸着粒子が互い
の力を打ち消しあって、吸着粒子による均一な浮遊平衡
状態が形成される（これを流動層という）。ついで、か
かる流動層が形成されたカラム内に、前述のようにして
調製されたＵＫ前駆体を含有する培養液をカラム下部出
口から上方送液により添加する。この際、目的のＵＫ前
駆体は吸着粒子と結合し、一方、ＵＫ前駆体産生細胞／
宿主、その破砕物や培養液に由来する微粒子および夾雑
物は流動層の吸着粒子を素通りしてカラム上部出口から
排出除去され、また吸着粒子にゆるく結合した夾雑成分
も、引き続いて上方送液される洗浄用緩衝液で洗い流さ
れる。好ましくは、吸着流動床技術に従って行われる
〔Journal of Chromatography, 597 (1992), 129-14
5〕。
【００１６】溶出用緩衝液としては、平衡化緩衝液が用
いられる。目的タンパク質であるＵＫ前駆体の回収は、
送液方向を逆転し、溶出用緩衝液をカラム上部出口から
下方向に送液することにより行われる。ＵＫ前駆体の溶
出条件としては、ｐＨ７．５〜９．５程度、好ましくは
ｐＨ８〜９程度、塩濃度０．０１〜０．３Ｍ程度、好ま
しくは０．１〜０．２Ｍ程度が例示される。溶出用緩衝
液としてより具体的には、０．１６Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ８．５）が例示される。上記の吸着粒子の平衡
化、吸着体への試料の注入、接触および溶出等の操作
は、ストリームラインカラム（吸着体：ストリームライ
ンＳＰ、ファルマシア社製）を備したストリームライン
システム（ファルマシア社製）を用いることにより、よ
り簡便に効率よく、かつ再現性よく行うことができる。
いられる。目的タンパク質であるＵＫ前駆体の回収は、
送液方向を逆転し、溶出用緩衝液をカラム上部出口から
下方向に送液することにより行われる。ＵＫ前駆体の溶
出条件としては、ｐＨ７．５〜９．５程度、好ましくは
ｐＨ８〜９程度、塩濃度０．０１〜０．３Ｍ程度、好ま
しくは０．１〜０．２Ｍ程度が例示される。溶出用緩衝
液としてより具体的には、０．１６Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ８．５）が例示される。上記の吸着粒子の平衡
化、吸着体への試料の注入、接触および溶出等の操作
は、ストリームラインカラム（吸着体：ストリームライ
ンＳＰ、ファルマシア社製）を備したストリームライン
システム（ファルマシア社製）を用いることにより、よ
り簡便に効率よく、かつ再現性よく行うことができる。
【００１７】本発明の方法により得られたＵＫ前駆体は
引き続き、通常の精製方法を施すことにより、さらに高
度に精製することができる。用いられる精製方法として
は、抗体アフィニティクロマトグラフィーによる処理
（特開昭６０−６２９８１号公報）、固定化ベンズアミ
ジン処理（特開平１−３０４８８１号公報）、キレート
樹脂による処理（特開昭６３−１４６７８９号公報）等
が例示される。こうして得られた精製ＵＫ前駆体は生化
学用、薬学用、医学用の試薬として用いてもよい。医薬
品として用いる場合は医薬品製造の通常の技術に従って
行われる。例えば、加熱処理、除菌濾過、凍結乾燥、小
分け分注、製剤化等が挙げられる。また、精製工程中ま
たは精製後において、ＵＫ前駆体含有溶液中に公知の安
定化剤を添加することもできる。これら安定化剤として
は、例えばアルブミン、ゼラチン、アミノ酸（特に塩基
性アミノ酸）、有機酸またはその塩、無機酸またはその
塩、非イオン系界面活性剤、デキストラン等が挙げられ
る。
引き続き、通常の精製方法を施すことにより、さらに高
度に精製することができる。用いられる精製方法として
は、抗体アフィニティクロマトグラフィーによる処理
（特開昭６０−６２９８１号公報）、固定化ベンズアミ
ジン処理（特開平１−３０４８８１号公報）、キレート
樹脂による処理（特開昭６３−１４６７８９号公報）等
が例示される。こうして得られた精製ＵＫ前駆体は生化
学用、薬学用、医学用の試薬として用いてもよい。医薬
品として用いる場合は医薬品製造の通常の技術に従って
行われる。例えば、加熱処理、除菌濾過、凍結乾燥、小
分け分注、製剤化等が挙げられる。また、精製工程中ま
たは精製後において、ＵＫ前駆体含有溶液中に公知の安
定化剤を添加することもできる。これら安定化剤として
は、例えばアルブミン、ゼラチン、アミノ酸（特に塩基
性アミノ酸）、有機酸またはその塩、無機酸またはその
塩、非イオン系界面活性剤、デキストラン等が挙げられ
る。
【００１８】
【実施例】以下、本発明をより詳細に説明するため、実
施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例によってなん
ら限定されるものではない。
施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例によってなん
ら限定されるものではない。
【００１９】実施例１ 培養液の調製 培養ヒト腎細胞を０．１％ヒト血清アルブミンを添加し
た無血清培地に３日間培養し、培養液を遠心分離し、そ
の上清を回収した。この培養上清をｐＨ５．５に調整し
た。
た無血清培地に３日間培養し、培養液を遠心分離し、そ
の上清を回収した。この培養上清をｐＨ５．５に調整し
た。
【００２０】吸着粒子処理（ストリームラインＳＰ処
理） ０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したス
トリームラインＳＰカラム（Ｃ５０、５×１００ｃｍ：
ゲル量３００ｍｌ、ファルマシア社製）に、培養液（上
清）を上方送液することにより添加した（攪拌しながら
流速３００〜５００ｃｍ／ｈで添加）。次にカラムを、
平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液を上昇法で送液する
ことにより洗浄し（条件：流速３００〜５００ｃｍ／
ｈ）、ついで送液方向を逆転させて、溶出用緩衝液
〔０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）〕を送液（流
速：１００ｃｍ／ｈ）して、ＵＫ前駆体を含有する画分
を得た。なお、溶出するＵＫ前駆体含有画分の検出は２
８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって行っ
た。アプライ線流速３００ｃｍ／ｈの場合を表１に、５
００ｃｍ／ｈの場合を表２に示す。
理） ０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したス
トリームラインＳＰカラム（Ｃ５０、５×１００ｃｍ：
ゲル量３００ｍｌ、ファルマシア社製）に、培養液（上
清）を上方送液することにより添加した（攪拌しながら
流速３００〜５００ｃｍ／ｈで添加）。次にカラムを、
平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液を上昇法で送液する
ことにより洗浄し（条件：流速３００〜５００ｃｍ／
ｈ）、ついで送液方向を逆転させて、溶出用緩衝液
〔０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）〕を送液（流
速：１００ｃｍ／ｈ）して、ＵＫ前駆体を含有する画分
を得た。なお、溶出するＵＫ前駆体含有画分の検出は２
８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって行っ
た。アプライ線流速３００ｃｍ／ｈの場合を表１に、５
００ｃｍ／ｈの場合を表２に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
【発明の効果】本発明によれば、ＵＫ前駆体を含有する
培養液をＵＫ前駆体産生細胞／宿主、その破砕物を含ん
だままの状態で、即ちこれらを含む不溶性物質等を予め
除去操作を行うことなく、高収率でしかも簡潔にＵＫ前
駆体を精製できる。
培養液をＵＫ前駆体産生細胞／宿主、その破砕物を含ん
だままの状態で、即ちこれらを含む不溶性物質等を予め
除去操作を行うことなく、高収率でしかも簡潔にＵＫ前
駆体を精製できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大野 和雅 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 天辻 康夫 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 三宅 正一 大阪府大阪市都島区都島中通３−５−44 株式会社ミドリ十字都島工場内
Claims (2)
- 【請求項１】 ウロキナーゼ前駆体およびその産生細胞
を含有する培養液を、流動層中に浮遊する吸着粒子に接
触させ、その吸着画分を回収する工程を含むことを特徴
とするウロキナーゼ前駆体の精製方法。 - 【請求項２】 ウロキナーゼ前駆体およびその産生細胞
を含有する培養液を、吸着粒子が浮遊する流動層に上方
送液することにより該吸着粒子に接触させた後、溶出用
緩衝液を下方送液することによりその吸着画分を溶出、
回収する工程を含むことを特徴とするウロキナーゼ前駆
体の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP290696A JPH09187274A (ja) | 1996-01-11 | 1996-01-11 | ウロキナーゼ前駆体の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP290696A JPH09187274A (ja) | 1996-01-11 | 1996-01-11 | ウロキナーゼ前駆体の精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09187274A true JPH09187274A (ja) | 1997-07-22 |
Family
ID=11542411
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP290696A Pending JPH09187274A (ja) | 1996-01-11 | 1996-01-11 | ウロキナーゼ前駆体の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09187274A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002315596A (ja) * | 2000-05-25 | 2002-10-29 | Takeda Chem Ind Ltd | 精製抗原の製造法 |
| JP2010515441A (ja) * | 2007-01-15 | 2010-05-13 | アップフロント・クロマトグラフィ・アクティーゼルスカブ | 原材料からのバイオ燃料およびタンパク質の製造 |
-
1996
- 1996-01-11 JP JP290696A patent/JPH09187274A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002315596A (ja) * | 2000-05-25 | 2002-10-29 | Takeda Chem Ind Ltd | 精製抗原の製造法 |
| JP2010515441A (ja) * | 2007-01-15 | 2010-05-13 | アップフロント・クロマトグラフィ・アクティーゼルスカブ | 原材料からのバイオ燃料およびタンパク質の製造 |
| US8815551B2 (en) | 2007-01-15 | 2014-08-26 | Upfront Chromatography A/S | Production of biofuel and protein from a raw material |
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