JPH07126183A - ビタミンk依存性タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物 - Google Patents
ビタミンk依存性タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血漿または濃縮物から活性で高い純度で精製
され濃縮されたかたちのタンパク質Aを含有する治療用
途に適した薬剤的組成物を提供すること。 【構成】 (a).ビタミンK依存性タンパク質からなる群
から選ばれるタンパク質Aに特異的なモノクローナル抗
体に結合した吸着体粒子上に、前記タンパク質Aと1種
またはそれ以上の他のタンパク質Bとの混合物からなる
源物質から前記タンパク質Aを吸着し、(b).カオトロピ
ック試薬を含有する緩衝水溶液を用いて、吸着体粒子か
ら前記タンパク質Aを欠いた源物質を除去し、さらに、
(c).溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着したタンパ
ク質Aを溶離することにより、濃縮されたかたちのタン
パク質Aの組成物を回収する、各ステップを具備してプ
ロテアーゼインヒビターの介在なくして実行される方
法、により得られる活性で高い純度で精製され濃縮され
たかたちのタンパク質Aを含有する治療用途に適した薬
剤的組成物。
され濃縮されたかたちのタンパク質Aを含有する治療用
途に適した薬剤的組成物を提供すること。 【構成】 (a).ビタミンK依存性タンパク質からなる群
から選ばれるタンパク質Aに特異的なモノクローナル抗
体に結合した吸着体粒子上に、前記タンパク質Aと1種
またはそれ以上の他のタンパク質Bとの混合物からなる
源物質から前記タンパク質Aを吸着し、(b).カオトロピ
ック試薬を含有する緩衝水溶液を用いて、吸着体粒子か
ら前記タンパク質Aを欠いた源物質を除去し、さらに、
(c).溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着したタンパ
ク質Aを溶離することにより、濃縮されたかたちのタン
パク質Aの組成物を回収する、各ステップを具備してプ
ロテアーゼインヒビターの介在なくして実行される方
法、により得られる活性で高い純度で精製され濃縮され
たかたちのタンパク質Aを含有する治療用途に適した薬
剤的組成物。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、第IX因子および他のビ
タミンK依存性タンパク質である第II因子、第VII 因
子、第X因子、プロトロビン、タンパク質C並びにタン
パク質Sの分離および精製により得られる治療用途に適
した薬剤的組成物に関する。特には、高純度タンパク質
を血漿または濃縮物からクロマトグラフ吸着および濃縮
技術により分離して得られる治療用途に適した薬剤的組
成物に関する。
タミンK依存性タンパク質である第II因子、第VII 因
子、第X因子、プロトロビン、タンパク質C並びにタン
パク質Sの分離および精製により得られる治療用途に適
した薬剤的組成物に関する。特には、高純度タンパク質
を血漿または濃縮物からクロマトグラフ吸着および濃縮
技術により分離して得られる治療用途に適した薬剤的組
成物に関する。
【0002】
【従来の技術】血液凝固因子は正常な凝固機構におい
て、生命の維持に必要な役割を果たしている。例えば、
第IX因子欠乏症の患者は重大な出血問題を示している
(血友病B)。従って、科学研究用だけでなく、治療に
用いる量の第IX因子および他のビタミンK依存性タンパ
ク質の単離を可能にすることが望まれていた。この目的
に対して種々の方法が文献に記載されている。本発明に
係る薬剤的組成物ないしタンパク質は、高純度でかつ高
収率で得られ、特に他の血漿因子による汚染の比較的低
い点において従来技術より優れているものである。さら
に、多くの工程を必要とする従来技術では、時間がかか
るのと全工程でのタンパク質の損失が避けられない。
て、生命の維持に必要な役割を果たしている。例えば、
第IX因子欠乏症の患者は重大な出血問題を示している
(血友病B)。従って、科学研究用だけでなく、治療に
用いる量の第IX因子および他のビタミンK依存性タンパ
ク質の単離を可能にすることが望まれていた。この目的
に対して種々の方法が文献に記載されている。本発明に
係る薬剤的組成物ないしタンパク質は、高純度でかつ高
収率で得られ、特に他の血漿因子による汚染の比較的低
い点において従来技術より優れているものである。さら
に、多くの工程を必要とする従来技術では、時間がかか
るのと全工程でのタンパク質の損失が避けられない。
【0003】従来方法の一つとして、S.P.Baja
j等による「人間のプロトロビン、第IX因子および第X
因子の精製のための簡単化した処理方法」、Prepa
rative Biochemisty,11(4),
397〜412(1981年)がある。この方法では、
血漿をクエン酸バリウムへの吸着およびそれからの溶
離、硫酸アンモニウム分画、DEAE−セフアデックス
クロマトグラフィー、そして、pH7.5のクエン酸ナ
トリウム緩衝液の中でのヘパリン−アガロースクロマト
グラフィーによってプロトロビン、第X因子および第IX
因子を分離するものである。第IX因子の報告された収率
は、80〜220ユニット/mgの比活性で約35%であ
った。他の方法として、J.P.Miletich等に
よる「硫酸塩化したデキストラン球体を用いての人間の
血液凝固因子の第II、第IXおよび第Xの精製」、Met
hods in Enzymology,第80巻、頁
221〜228に記載のものがある。この方法では、新
鮮な冷凍血漿を解凍し、クエン酸バリウムにより沈澱、
ジイソプロピルフルオロリン塩酸とトリス−塩酸中での
再懸濁、硫酸アンモニウムによる沈澱、DE−52セル
ロースへのクロマトグラフィー、そして得られた分画の
選択的な硫酸塩化したデキストラン球体への適用の手順
で行うものである。第IX因子を含む分画の濃度は第V因
子1wt%と同じ程度に不純物が混じっているとされて
いる。B.Osterud等による「人間の血液凝固因
子IX」、J.Biological Chemistr
y、253巻、No.17、頁5946〜5951(19
78年)、では、第IX因子の精製を以下の手順、硫酸バ
リウムへの吸着およびそれからの溶離、DEAE−セル
ロースバツチクロマトグラフィー、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、そしてヘパリン−アガロースのアフイニ
テイ−クロマトグラフで行っている。第IX因子活性は、
207ユニット/mgであり、収率は記載されていない。
j等による「人間のプロトロビン、第IX因子および第X
因子の精製のための簡単化した処理方法」、Prepa
rative Biochemisty,11(4),
397〜412(1981年)がある。この方法では、
血漿をクエン酸バリウムへの吸着およびそれからの溶
離、硫酸アンモニウム分画、DEAE−セフアデックス
クロマトグラフィー、そして、pH7.5のクエン酸ナ
トリウム緩衝液の中でのヘパリン−アガロースクロマト
グラフィーによってプロトロビン、第X因子および第IX
因子を分離するものである。第IX因子の報告された収率
は、80〜220ユニット/mgの比活性で約35%であ
った。他の方法として、J.P.Miletich等に
よる「硫酸塩化したデキストラン球体を用いての人間の
血液凝固因子の第II、第IXおよび第Xの精製」、Met
hods in Enzymology,第80巻、頁
221〜228に記載のものがある。この方法では、新
鮮な冷凍血漿を解凍し、クエン酸バリウムにより沈澱、
ジイソプロピルフルオロリン塩酸とトリス−塩酸中での
再懸濁、硫酸アンモニウムによる沈澱、DE−52セル
ロースへのクロマトグラフィー、そして得られた分画の
選択的な硫酸塩化したデキストラン球体への適用の手順
で行うものである。第IX因子を含む分画の濃度は第V因
子1wt%と同じ程度に不純物が混じっているとされて
いる。B.Osterud等による「人間の血液凝固因
子IX」、J.Biological Chemistr
y、253巻、No.17、頁5946〜5951(19
78年)、では、第IX因子の精製を以下の手順、硫酸バ
リウムへの吸着およびそれからの溶離、DEAE−セル
ロースバツチクロマトグラフィー、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、そしてヘパリン−アガロースのアフイニ
テイ−クロマトグラフで行っている。第IX因子活性は、
207ユニット/mgであり、収率は記載されていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】以上のことから、改良
された方法で得られる活性で高い純度で精製され濃縮さ
れたかたちのタンパク質Aを含有する治療用途に適した
薬剤的組成物を提供することを目的としている。
された方法で得られる活性で高い純度で精製され濃縮さ
れたかたちのタンパク質Aを含有する治療用途に適した
薬剤的組成物を提供することを目的としている。
【0005】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明に係る活性で高い純度で精製され濃縮されたか
たちのタンパク質Aを含有する治療用途に適した薬剤的
組成物は、(a).ビタミンK依存性タンパク質からなる群
から選ばれるタンパク質Aに特異的なモノクローナル抗
体に結合した吸着体粒子上に、前記タンパク質Aと1種
またはそれ以上の他のタンパク質Bとの混合物からなる
源物質から前記タンパク質Aを吸着し、(b).カオトロピ
ック試薬を含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着体粒
子から前記タンパク質Aを欠いた源物質を除去し、さら
に、(c).溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着したタ
ンパク質Aを溶離することにより、変性されておらず高
い純度で濃縮されたかたちのタンパク質Aの組成物を回
収する、各ステップを具備してプロテアーゼインヒビタ
ーの介在なくして実行される方法、により得ることがで
きることを特徴とする。
に本発明に係る活性で高い純度で精製され濃縮されたか
たちのタンパク質Aを含有する治療用途に適した薬剤的
組成物は、(a).ビタミンK依存性タンパク質からなる群
から選ばれるタンパク質Aに特異的なモノクローナル抗
体に結合した吸着体粒子上に、前記タンパク質Aと1種
またはそれ以上の他のタンパク質Bとの混合物からなる
源物質から前記タンパク質Aを吸着し、(b).カオトロピ
ック試薬を含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着体粒
子から前記タンパク質Aを欠いた源物質を除去し、さら
に、(c).溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着したタ
ンパク質Aを溶離することにより、変性されておらず高
い純度で濃縮されたかたちのタンパク質Aの組成物を回
収する、各ステップを具備してプロテアーゼインヒビタ
ーの介在なくして実行される方法、により得ることがで
きることを特徴とする。
【0006】ここで、前記源物質が血漿、血漿分画また
は血漿濃縮であること、あるいは、前記タンパク質Aを
生産するための遺伝子を含む細胞により表わせるもので
あること、を特徴とすることができる。
は血漿濃縮であること、あるいは、前記タンパク質Aを
生産するための遺伝子を含む細胞により表わせるもので
あること、を特徴とすることができる。
【0007】また、別の本発明に係る活性で高い純度で
精製され濃縮されたかたちの第IX因子を含有する治療用
途に適した薬剤的組成物は、(a).第IX因子に特異的なモ
ノクローナル抗体に結合した吸着体粒子上に、前記第IX
因子と1種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物
からなる源物質から前記第IX因子を吸着し、(b).カオト
ロピック試薬を含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着
体粒子から前記第IX因子を欠いた源物質を除去し、さら
に、(c).溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着した第
IX因子を溶離することにより、変性されておらず高い純
度で濃縮されたかたちの第IX因子を回収する、各ステッ
プを具備してプロテアーゼインヒビターの介在なくして
実行される方法、により得ることができることを特徴と
している。
精製され濃縮されたかたちの第IX因子を含有する治療用
途に適した薬剤的組成物は、(a).第IX因子に特異的なモ
ノクローナル抗体に結合した吸着体粒子上に、前記第IX
因子と1種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物
からなる源物質から前記第IX因子を吸着し、(b).カオト
ロピック試薬を含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着
体粒子から前記第IX因子を欠いた源物質を除去し、さら
に、(c).溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着した第
IX因子を溶離することにより、変性されておらず高い純
度で濃縮されたかたちの第IX因子を回収する、各ステッ
プを具備してプロテアーゼインヒビターの介在なくして
実行される方法、により得ることができることを特徴と
している。
【0008】また、別の本発明に係る活性で高い純度で
精製され濃縮されたかたちで得られるタンパク質Aを含
有する治療用途に適した薬剤的組成物は、(a).ビタミン
K依存性タンパク質からなる群から選ばれるタンパク質
Aに特異的なモノクローナル抗体に結合した吸着体粒子
上に、前記タンパク質Aと1種またはそれ以上の他のタ
ンパク質Bとの混合物である血漿、血漿分画または血漿
濃縮の源物質から前記タンパク質Aを吸着し、(b).塩化
リチウムを含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着体粒
子から前記タンパク質Aを欠いた源物質を除去し、さら
に、(c).溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着したタ
ンパク質Aを溶離することにより、変性されておらず高
い純度で濃縮されたかたちのタンパク質Aの組成物を回
収する、各ステップを具備して、4℃で、キレ−ト化合
物の存在下で、プロテア−ゼインヒビタ−の介在なくし
て実行されることを特徴とする。
精製され濃縮されたかたちで得られるタンパク質Aを含
有する治療用途に適した薬剤的組成物は、(a).ビタミン
K依存性タンパク質からなる群から選ばれるタンパク質
Aに特異的なモノクローナル抗体に結合した吸着体粒子
上に、前記タンパク質Aと1種またはそれ以上の他のタ
ンパク質Bとの混合物である血漿、血漿分画または血漿
濃縮の源物質から前記タンパク質Aを吸着し、(b).塩化
リチウムを含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着体粒
子から前記タンパク質Aを欠いた源物質を除去し、さら
に、(c).溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着したタ
ンパク質Aを溶離することにより、変性されておらず高
い純度で濃縮されたかたちのタンパク質Aの組成物を回
収する、各ステップを具備して、4℃で、キレ−ト化合
物の存在下で、プロテア−ゼインヒビタ−の介在なくし
て実行されることを特徴とする。
【0009】本発明によれば、タンパク質に特異的な抗
体を用いての吸着操作でタンパク質を高度に精製された
かたちで得られる。
体を用いての吸着操作でタンパク質を高度に精製された
かたちで得られる。
【0010】上記構成において、ステップ(a) の段階
は、血漿または濃縮物のような源物質からのタンパク質
の免疫吸着を含む。ここで用いられる吸着体はタンパク
質に特異的なモノクローナル抗体であり、そのモノクロ
ーナル抗体は適当な基質、例えばアガロース球体に結合
されている。タンパク質を吸着した後、基質粒子を非吸
着タンパク質を除去するために大量の緩衝溶液で洗浄す
る。吸着したタンパク質を溶液で処理し溶離させる。回
収されたタンパク質は高純度、即ち不純物はほとんどな
く、治療に用いることも更に精製することもできる。
は、血漿または濃縮物のような源物質からのタンパク質
の免疫吸着を含む。ここで用いられる吸着体はタンパク
質に特異的なモノクローナル抗体であり、そのモノクロ
ーナル抗体は適当な基質、例えばアガロース球体に結合
されている。タンパク質を吸着した後、基質粒子を非吸
着タンパク質を除去するために大量の緩衝溶液で洗浄す
る。吸着したタンパク質を溶液で処理し溶離させる。回
収されたタンパク質は高純度、即ち不純物はほとんどな
く、治療に用いることも更に精製することもできる。
【0011】本発明に係るプロセスでは第IX因子の精製
が1500倍の程度で得られ、これは従来技術を通じて
大きな改良である。比活性は約34.8ユニット/mgで
あり、さらに第IX因子の収率はこの新規な方法において
平均約50%、高くて約70%である。
が1500倍の程度で得られ、これは従来技術を通じて
大きな改良である。比活性は約34.8ユニット/mgで
あり、さらに第IX因子の収率はこの新規な方法において
平均約50%、高くて約70%である。
【0012】本発明は、ビタミンK依存性タンパク質と
して知られている第II因子、第VII因子、第IX因子、第V
因子、プロトロンロビン、タンパク質Cおよびタンパ
ク質Sのあらゆるタンパク質精製フオームにおける回収
に容易に適用できる。血漿、血漿分画、血漿濃縮物が典
型的な源物質として含まれる。タンパク質はまた、DN
A組み換え技術、即ち、バクテリア、酵母または他の細
胞の中へタンパク質を生産するための遺伝子を組み入れ
たタンパク質の混合物からも精製することができる。こ
のような遺伝子組み込み技術は当該技術分野に通常の技
術を有するものであれば公知のことであり、また、示さ
れたタンパク質が1種またはそれ以上のタンパク質、細
胞の残骸等の混合状態であることは理解される。
して知られている第II因子、第VII因子、第IX因子、第V
因子、プロトロンロビン、タンパク質Cおよびタンパ
ク質Sのあらゆるタンパク質精製フオームにおける回収
に容易に適用できる。血漿、血漿分画、血漿濃縮物が典
型的な源物質として含まれる。タンパク質はまた、DN
A組み換え技術、即ち、バクテリア、酵母または他の細
胞の中へタンパク質を生産するための遺伝子を組み入れ
たタンパク質の混合物からも精製することができる。こ
のような遺伝子組み込み技術は当該技術分野に通常の技
術を有するものであれば公知のことであり、また、示さ
れたタンパク質が1種またはそれ以上のタンパク質、細
胞の残骸等の混合状態であることは理解される。
【0013】
【実施例】以下の説明は、従来一つの操作で達成される
とは知られていなかった純度と濃度にまで第IX因子の分
離と精製を達成するためになされ、用いられる本発明の
具体例の詳細を提供するものである。この説明は、第IX
因子の精製に適用される本発明の好適例であり、本発明
を限定するものでなく、当該技術分野の領域内にある変
化応用は本発明の範囲に属すると考えるべきである。そ
の他のビタミンK依存性タンパク質は同様の操作により
精製されるが、その操作は用いられる抗体を生じさせる
第IX因子に代わる他のタンパク質を用いる範囲で改変さ
れる。
とは知られていなかった純度と濃度にまで第IX因子の分
離と精製を達成するためになされ、用いられる本発明の
具体例の詳細を提供するものである。この説明は、第IX
因子の精製に適用される本発明の好適例であり、本発明
を限定するものでなく、当該技術分野の領域内にある変
化応用は本発明の範囲に属すると考えるべきである。そ
の他のビタミンK依存性タンパク質は同様の操作により
精製されるが、その操作は用いられる抗体を生じさせる
第IX因子に代わる他のタンパク質を用いる範囲で改変さ
れる。
【0014】A.第IX因子に対するモノクローナル抗体
の調製 第IX因子に吸着するモノクローナル抗体は、続いて分離
基質に結合されるが、そのモノクローナル抗体は種々の
公開されている方法により高度に精製される第IX因子の
調製することに始まる段階的手順により調製される。第
IX因子の精製は血漿源から得られる物質を用いて達成さ
れるが、純度が充分に高くないものは高濃度で用いられ
る。
の調製 第IX因子に吸着するモノクローナル抗体は、続いて分離
基質に結合されるが、そのモノクローナル抗体は種々の
公開されている方法により高度に精製される第IX因子の
調製することに始まる段階的手順により調製される。第
IX因子の精製は血漿源から得られる物質を用いて達成さ
れるが、純度が充分に高くないものは高濃度で用いられ
る。
【0015】抗凝血性の正常な血漿の精製はOster
ud等により示された方法、硫酸バリウムへの吸着およ
び溶離、DEAE−セルロースバツチクロマトグラフィ
ー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、そしてヘパリン
−アガロースカラムによるアフイニテイ−クロマトグラ
フイーの順序で行なわれた。この方法による順序は、高
度に精製された第IX因子を提供する。
ud等により示された方法、硫酸バリウムへの吸着およ
び溶離、DEAE−セルロースバツチクロマトグラフィ
ー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、そしてヘパリン
−アガロースカラムによるアフイニテイ−クロマトグラ
フイーの順序で行なわれた。この方法による順序は、高
度に精製された第IX因子を提供する。
【0016】以下の手順に従って、血漿から得られた高
度に精製された第IX因子をマウスに注射した。他の手順
でも同様の効果を期待できる。第0日目、前記タンパク
質100μg を0.05Mトリス、0.15M塩化ナト
リウムを含むpH7.3の緩衝液0.1mlに溶解(また
は懸濁)させ、完全なフロインド補佐剤の同容量で振と
うして調製した組成物をマウスの腹膜を通して注射し
た。第15日目、完全なフロインド補佐剤を不完全なフ
ロインドの補佐剤に代えた以外は同様のタンパク質56
μg を再び注射した。第22、30、38および124
日目、第15日目の注射を繰り返した。第239日目、
マウスに精製した第IX因子のみを注射した。第243日
目、マウスの脾臓を取り出し、値法に従って溶かした。
この方法はJ.P.Brown等による「モノクローナ
ル抗体との免疫沈降反応により同定される正常および悪
性の人細胞のタンパク質抗源」、JOURNAL OF
BIOLOGICAL CHEMISTRY,225
巻、頁4980〜4983(1980年)に記載されて
いる。この標準的手法は35%ポリエチレングリコール
1000を50%ポリエチレングリコールに代える程度
おいて変化させられる。
度に精製された第IX因子をマウスに注射した。他の手順
でも同様の効果を期待できる。第0日目、前記タンパク
質100μg を0.05Mトリス、0.15M塩化ナト
リウムを含むpH7.3の緩衝液0.1mlに溶解(また
は懸濁)させ、完全なフロインド補佐剤の同容量で振と
うして調製した組成物をマウスの腹膜を通して注射し
た。第15日目、完全なフロインド補佐剤を不完全なフ
ロインドの補佐剤に代えた以外は同様のタンパク質56
μg を再び注射した。第22、30、38および124
日目、第15日目の注射を繰り返した。第239日目、
マウスに精製した第IX因子のみを注射した。第243日
目、マウスの脾臓を取り出し、値法に従って溶かした。
この方法はJ.P.Brown等による「モノクローナ
ル抗体との免疫沈降反応により同定される正常および悪
性の人細胞のタンパク質抗源」、JOURNAL OF
BIOLOGICAL CHEMISTRY,225
巻、頁4980〜4983(1980年)に記載されて
いる。この標準的手法は35%ポリエチレングリコール
1000を50%ポリエチレングリコールに代える程度
おいて変化させられる。
【0017】陽性クローンは、正常人血漿の等量と各ク
ロークからの上清液を培養し、第IX因子活性を分析する
ことにより同定される。クローンは、上清液が実質的に
第IX因子凝血活性を中和したならば陽性と見なされる。
クローンが陽性であると決定した後、それらは少なくと
も2度ザブクローン化し、第IX因子に対する抗体を生産
する安定なクローンを得、少なくとも細胞の注入4日目
に0.5mlのプリスタン(pristane)で腹膜を
通じて前もって処理したBalb/cマウスの腹腔中に
注射した。ハイブリドーム細胞を牛の胎児の血清を含ま
ないDelbeccoで修飾されたEagle媒質0.
5mlにおいて、マウス1匹当り約5×106 細胞の濃度
になるように注射した。マウスの腹が膨れるのを確認し
て、腹水液をヘパリン中に約10ユニット/mlで集め
た。多数のマウスからの腹水液は次のモノクローナル免
疫グロブリン(IgG)の単離のために適当な容量に分
けて貯蔵した。ヘパリン処理腹水液をすぐに使用しない
場合には、−70℃で貯蔵し、使用直前に解凍するのが
よい。腹水液からのIgGの最終収率は、腹水液100
ml当たり約1gのIgGである。
ロークからの上清液を培養し、第IX因子活性を分析する
ことにより同定される。クローンは、上清液が実質的に
第IX因子凝血活性を中和したならば陽性と見なされる。
クローンが陽性であると決定した後、それらは少なくと
も2度ザブクローン化し、第IX因子に対する抗体を生産
する安定なクローンを得、少なくとも細胞の注入4日目
に0.5mlのプリスタン(pristane)で腹膜を
通じて前もって処理したBalb/cマウスの腹腔中に
注射した。ハイブリドーム細胞を牛の胎児の血清を含ま
ないDelbeccoで修飾されたEagle媒質0.
5mlにおいて、マウス1匹当り約5×106 細胞の濃度
になるように注射した。マウスの腹が膨れるのを確認し
て、腹水液をヘパリン中に約10ユニット/mlで集め
た。多数のマウスからの腹水液は次のモノクローナル免
疫グロブリン(IgG)の単離のために適当な容量に分
けて貯蔵した。ヘパリン処理腹水液をすぐに使用しない
場合には、−70℃で貯蔵し、使用直前に解凍するのが
よい。腹水液からのIgGの最終収率は、腹水液100
ml当たり約1gのIgGである。
【0018】第IX因子を精製する目的のためのモノクロ
ーナルIgGの特異性は、後述するようにモノクローナ
ルIgGが分離基質体にカップリングすることにより、
そして、分離基質に結合したIgGが血漿から第IX因子
を除きその第IX因子が続くチオシアン酸ナトリウムを含
む溶液で溶離されることを示すことにより評価される。
ーナルIgGの特異性は、後述するようにモノクローナ
ルIgGが分離基質体にカップリングすることにより、
そして、分離基質に結合したIgGが血漿から第IX因子
を除きその第IX因子が続くチオシアン酸ナトリウムを含
む溶液で溶離されることを示すことにより評価される。
【0019】モノクローナルIgGは、続く免疫吸着体
を調整するのに用いられ、採取後すぐまたは貯蔵溶液の
冷凍部分を解凍したヘパリン処理した腹水液から単離さ
れる。新鮮または凍結物に関わりなく使用され、溶液を
4℃とし、等容量のリン酸緩衝液の塩溶液(PBS)で
処理し、以下に示す組成物とする。希釈腹水を4℃で撹
拌しながら等容量の飽和硫酸アンモニウム(SAS)
(水中に過剰の硫酸アンモニウムを入れ沸とうさせ、4
℃に冷却し、不溶の結晶をろ過し水酸化アンモニウムで
pH7.0に調整して得る)を滴下しながら加え沈澱さ
せた。沈澱物と上清液を2時間以上撹拌し、4℃にて遠
心分離した。遠心分離は好ましくは、60分間、14,
000rpm (30,000×g)で行なう。腹水の上清
液はSASでさらに2回沈澱させ、その沈澱物と上清液
を第1回目と同様に撹拌し、遠心分離した。3回目の沈
澱から得られたペレットを希釈した腹水液と等量のPB
Sで再懸濁した後、PBSに対し充分に透析した。透析
袋に凝固物が現われた時、20℃で遠心分離により除い
た。透析されたIgGを室温で5%の水酸化アルミニウ
ム水溶液と共に撹拌して吸着させ、吸着後20℃で遠心
分離した。吸着処理は第1回目の後少なくとも3回以
上、それぞれ2.5%水酸化アルミニウム溶液を用いて
繰り返される。吸着されたIgGは4℃にして、上記の
如くSASで再沈澱させた。沈澱させたペレットは使用
するまで−20℃で貯蔵される。モノクローナルIgG
精製の他の方法は、ここで用いた方法と同様にもしくは
よりよいものであり、例えば、Bruck,C.,Po
rtetelle,D.,Glimeur,C.,Bo
llen,A.の記述による「DEAEアフイニテイ−
ゲルブル−クロマトグラフイ−による腹水液からのマウ
スモノクローナル抗体の一段階精製」がJournal
of Immunological Mcthod
s,53巻、頁313〜319(1982年)に記載さ
れている。
を調整するのに用いられ、採取後すぐまたは貯蔵溶液の
冷凍部分を解凍したヘパリン処理した腹水液から単離さ
れる。新鮮または凍結物に関わりなく使用され、溶液を
4℃とし、等容量のリン酸緩衝液の塩溶液(PBS)で
処理し、以下に示す組成物とする。希釈腹水を4℃で撹
拌しながら等容量の飽和硫酸アンモニウム(SAS)
(水中に過剰の硫酸アンモニウムを入れ沸とうさせ、4
℃に冷却し、不溶の結晶をろ過し水酸化アンモニウムで
pH7.0に調整して得る)を滴下しながら加え沈澱さ
せた。沈澱物と上清液を2時間以上撹拌し、4℃にて遠
心分離した。遠心分離は好ましくは、60分間、14,
000rpm (30,000×g)で行なう。腹水の上清
液はSASでさらに2回沈澱させ、その沈澱物と上清液
を第1回目と同様に撹拌し、遠心分離した。3回目の沈
澱から得られたペレットを希釈した腹水液と等量のPB
Sで再懸濁した後、PBSに対し充分に透析した。透析
袋に凝固物が現われた時、20℃で遠心分離により除い
た。透析されたIgGを室温で5%の水酸化アルミニウ
ム水溶液と共に撹拌して吸着させ、吸着後20℃で遠心
分離した。吸着処理は第1回目の後少なくとも3回以
上、それぞれ2.5%水酸化アルミニウム溶液を用いて
繰り返される。吸着されたIgGは4℃にして、上記の
如くSASで再沈澱させた。沈澱させたペレットは使用
するまで−20℃で貯蔵される。モノクローナルIgG
精製の他の方法は、ここで用いた方法と同様にもしくは
よりよいものであり、例えば、Bruck,C.,Po
rtetelle,D.,Glimeur,C.,Bo
llen,A.の記述による「DEAEアフイニテイ−
ゲルブル−クロマトグラフイ−による腹水液からのマウ
スモノクローナル抗体の一段階精製」がJournal
of Immunological Mcthod
s,53巻、頁313〜319(1982年)に記載さ
れている。
【0020】B.免疫吸着体の調製 免疫吸着体は、フカップリングのためのモノクローナル
IgGを調製し、カップリングのための固体基質を調製
し、モノクローナルIgGを固体基質に結合させるため
2つの成分を反応させることにより好適に調製される。
IgGを調製し、カップリングのための固体基質を調製
し、モノクローナルIgGを固体基質に結合させるため
2つの成分を反応させることにより好適に調製される。
【0021】(i) カップリングのためのIgGの調製 新しく沈澱させたIgGまたは以前に冷凍した沈澱を解
凍したものを用いることができる。その物質をPBSに
対して透析し、PBS中にある間に、IgGの容量と濃
度(A280 /1.4=mg/ml IgG)を決定する。次
いで、IgG溶液50ml当たり、ジイソプロピルフルオ
ロリン酸塩の10〜30μl 、好ましくは20μl で処
理した。得られた溶液を30分間、ドラフト中室温で撹
拌し、その処理したIgGを使用直前にカップリング緩
衝液に対し一晩透析した。見い出されている最も好適な
カップリング用緩衝液は、好ましくは水酸化ナトリウム
でpH9に調整された0.25M重炭酸ナトリウム溶液
である。
凍したものを用いることができる。その物質をPBSに
対して透析し、PBS中にある間に、IgGの容量と濃
度(A280 /1.4=mg/ml IgG)を決定する。次
いで、IgG溶液50ml当たり、ジイソプロピルフルオ
ロリン酸塩の10〜30μl 、好ましくは20μl で処
理した。得られた溶液を30分間、ドラフト中室温で撹
拌し、その処理したIgGを使用直前にカップリング緩
衝液に対し一晩透析した。見い出されている最も好適な
カップリング用緩衝液は、好ましくは水酸化ナトリウム
でpH9に調整された0.25M重炭酸ナトリウム溶液
である。
【0022】(ii) カップリングのための固体基質の調
製 モノクローナル抗体はタンパク質、特には第IX因子自体
に高い親和性を有するものでなければあらゆる物質に結
合されるが、そのような物質として、ガラズビーズ、ア
ガロースおよびそれらの誘導体が好ましい。最も好まし
くは、架橋結合されたアガロースで、セフアロース4B
(Pharmacia Fine Chemical
s,Piscataway,N.J.の登録商標)とし
て知られたゲル市で市販されている。
製 モノクローナル抗体はタンパク質、特には第IX因子自体
に高い親和性を有するものでなければあらゆる物質に結
合されるが、そのような物質として、ガラズビーズ、ア
ガロースおよびそれらの誘導体が好ましい。最も好まし
くは、架橋結合されたアガロースで、セフアロース4B
(Pharmacia Fine Chemical
s,Piscataway,N.J.の登録商標)とし
て知られたゲル市で市販されている。
【0023】好ましい免疫吸着体樹脂を調製する方法
は、一般に文献に記載の方法と同様であり、例えば、
J.Porath等による方法、Journal of
Chromatography、86巻、頁53〜5
6(1973年)がある。見い出された最も好適な方法
は、以下の如くである。即ち、容量約2リットルのセフ
アロース4Bを酸で洗浄した2リットル用の焼結グラス
フィルターロートに入れた。樹脂を水洗し、ろ過して水
気のある状態にした。水洗した樹脂を回転子を入れた大
容量(約4リットル)のガラスビーカーに移した。次い
で、5Mの3塩基性リン酸カリウム溶液の1部と5Mの
3塩性リン酸カリウム溶液の2部を混合して調製した7
50mlの冷リン酸カリウム緩衝溶液を樹脂に加えた。充
分に冷却した水を加えて最終容量を3リットルとした。
次に、この混合物を4℃に冷却し、マグネチックスター
ラ上の水−水浴中で4〜10℃に保持した。ドラフト内
で、臭化シアンを回転子を入れた栓付きガラスビンの3
0mlの水中に加えた。混合物を溶液になるまで迅速に撹
拌した。この臭化シアン溶液を先の冷セフアロース混合
物に2分間以上撹拌しなが加えた。撹拌を続けて8分間
行ない、その溶液を4リットルの耐圧ビンに固定した冷
2リットル焼結ガラスフィルターロートに移した。次い
で、臭化シアン処理した樹脂を約20リットルの冷水で
(ろ液のpHが中性になるまで)洗浄した。水洗した樹
脂は冷却したカップリング用緩衝液と速やかに平衝状態
とし、大きな回転子を入れた4リットルのプラスチック
ビーカーに移した。
は、一般に文献に記載の方法と同様であり、例えば、
J.Porath等による方法、Journal of
Chromatography、86巻、頁53〜5
6(1973年)がある。見い出された最も好適な方法
は、以下の如くである。即ち、容量約2リットルのセフ
アロース4Bを酸で洗浄した2リットル用の焼結グラス
フィルターロートに入れた。樹脂を水洗し、ろ過して水
気のある状態にした。水洗した樹脂を回転子を入れた大
容量(約4リットル)のガラスビーカーに移した。次い
で、5Mの3塩基性リン酸カリウム溶液の1部と5Mの
3塩性リン酸カリウム溶液の2部を混合して調製した7
50mlの冷リン酸カリウム緩衝溶液を樹脂に加えた。充
分に冷却した水を加えて最終容量を3リットルとした。
次に、この混合物を4℃に冷却し、マグネチックスター
ラ上の水−水浴中で4〜10℃に保持した。ドラフト内
で、臭化シアンを回転子を入れた栓付きガラスビンの3
0mlの水中に加えた。混合物を溶液になるまで迅速に撹
拌した。この臭化シアン溶液を先の冷セフアロース混合
物に2分間以上撹拌しなが加えた。撹拌を続けて8分間
行ない、その溶液を4リットルの耐圧ビンに固定した冷
2リットル焼結ガラスフィルターロートに移した。次い
で、臭化シアン処理した樹脂を約20リットルの冷水で
(ろ液のpHが中性になるまで)洗浄した。水洗した樹
脂は冷却したカップリング用緩衝液と速やかに平衝状態
とし、大きな回転子を入れた4リットルのプラスチック
ビーカーに移した。
【0024】(iii) モノクローナル抗体の固体基質への
カップリング 上記の如く調製した固体基質樹脂は、PBSと平衝状態
にある時は使用できる状態にあり、それ以後は貯蔵され
るべきではない。従って、樹脂混合物は、カップリング
反応用緩衝液に対して前もって1晩透析したIgGと結
合させた。この結合した樹脂/HgG懸濁混合物を24
時間4℃で撹拌した。カップリング時の上清液の無希釈
サンプルのA280 は、標準試料として牛の血清アルブミ
ン(BSA)を用いてまたは標準試料としてBSAと共
にバイオ−ラド(Bio−Rad)タンパク質分析(ブ
ラッドフオード試薬)により決定される。次に、カップ
リングしたリガンドのパーセンテージを計算する。上記
した手順が行なわれる時、この値は通常約95%であ
る。抗体とカップリングしなかった樹脂上に残っている
活性サイトは、0.1Mグリシンを含有する冷カップリ
ング用緩衝液で焼結ガラスフイルターロート上の樹脂を
洗浄することによりブロックされる。次いで、この樹脂
を樹脂と抗体を結合させた時のそれぞれのカップリング
用緩衝液と等容量になるように上記溶液で再懸濁した。
懸濁液をゆっくり4℃で1晩撹拌した。次いで、この樹
脂をPBSで充分に洗浄した。その組成を以下に示す。
カップリングし、ブロックされた上記樹脂は、付加的に
0.5Mカルシウムイオン、好ましくは塩化カルシウム
を含むPBSで予備溶離される。樹脂を再びPBSのみ
で洗浄し、4℃で貯蔵するかまたは使用できる用意がで
きるまで、室温で連続したポンプの働いているカラム内
におかれる。セフアロースに対するIgGのカップリン
グ密度は、セフアロース球体1リットル当り2〜5gI
gG、好ましくは、3〜4gIgGであろう。
カップリング 上記の如く調製した固体基質樹脂は、PBSと平衝状態
にある時は使用できる状態にあり、それ以後は貯蔵され
るべきではない。従って、樹脂混合物は、カップリング
反応用緩衝液に対して前もって1晩透析したIgGと結
合させた。この結合した樹脂/HgG懸濁混合物を24
時間4℃で撹拌した。カップリング時の上清液の無希釈
サンプルのA280 は、標準試料として牛の血清アルブミ
ン(BSA)を用いてまたは標準試料としてBSAと共
にバイオ−ラド(Bio−Rad)タンパク質分析(ブ
ラッドフオード試薬)により決定される。次に、カップ
リングしたリガンドのパーセンテージを計算する。上記
した手順が行なわれる時、この値は通常約95%であ
る。抗体とカップリングしなかった樹脂上に残っている
活性サイトは、0.1Mグリシンを含有する冷カップリ
ング用緩衝液で焼結ガラスフイルターロート上の樹脂を
洗浄することによりブロックされる。次いで、この樹脂
を樹脂と抗体を結合させた時のそれぞれのカップリング
用緩衝液と等容量になるように上記溶液で再懸濁した。
懸濁液をゆっくり4℃で1晩撹拌した。次いで、この樹
脂をPBSで充分に洗浄した。その組成を以下に示す。
カップリングし、ブロックされた上記樹脂は、付加的に
0.5Mカルシウムイオン、好ましくは塩化カルシウム
を含むPBSで予備溶離される。樹脂を再びPBSのみ
で洗浄し、4℃で貯蔵するかまたは使用できる用意がで
きるまで、室温で連続したポンプの働いているカラム内
におかれる。セフアロースに対するIgGのカップリン
グ密度は、セフアロース球体1リットル当り2〜5gI
gG、好ましくは、3〜4gIgGであろう。
【0025】C.第IX因子の分離と精製 人や動物の血漿および市販の第IX因子の濃縮物のような
第IX因子の試料調製は、本発明の方法を用いることがで
き、本方法は物質の特定のタイプに限定されない。好適
な物質、成功した結果を与えたものとしては、それぞれ
目的とするタンパク質を含む人の血漿、血漿分画および
濃縮物、市販または一部実験室で精製されたものであ
る。以下の記載では、正常な人の血漿を用いたもので詳
細を説明する。 新しく採取したものでない血漿は通常
の手段でクエン酸塩化され冷凍保存される。使用基準が
できた時、35〜40℃、好ましくは37℃の温度で解
凍し、カラムに直接入れる。
第IX因子の試料調製は、本発明の方法を用いることがで
き、本方法は物質の特定のタイプに限定されない。好適
な物質、成功した結果を与えたものとしては、それぞれ
目的とするタンパク質を含む人の血漿、血漿分画および
濃縮物、市販または一部実験室で精製されたものであ
る。以下の記載では、正常な人の血漿を用いたもので詳
細を説明する。 新しく採取したものでない血漿は通常
の手段でクエン酸塩化され冷凍保存される。使用基準が
できた時、35〜40℃、好ましくは37℃の温度で解
凍し、カラムに直接入れる。
【0026】本発明の説明では最初に直接にクロマトグ
ラフ用カラムに免疫吸着体とカップリングする粒子を入
れて使用したが、適当な容器の中へ抗体と結合する樹脂
粒子を入れてバツチ法で分離し、その後再構成した濃縮
物または血漿を加え、上記で概要を示したように目的と
するタンパク質を回収する方法も本発明の範囲にあるも
のである。以下、さらに詳細に説明する。
ラフ用カラムに免疫吸着体とカップリングする粒子を入
れて使用したが、適当な容器の中へ抗体と結合する樹脂
粒子を入れてバツチ法で分離し、その後再構成した濃縮
物または血漿を加え、上記で概要を示したように目的と
するタンパク質を回収する方法も本発明の範囲にあるも
のである。以下、さらに詳細に説明する。
【0027】クロマトグラフ工程を遂行するには、以下
の具体例が好ましい。
の具体例が好ましい。
【0028】カラムに充填した、例えばAmicon
86001(Amicon Corp., Lexig
ton,Mass.の登録商標)樹脂を、ぜん動性ポン
プで速やかに流れるようにする。人の血漿を第IX因子源
として使用する時、抗体を保持する球体の各容量に対し
約3〜7、好ましくは5部の血漿が処理される。血漿は
ゆっくりとカラムに注がれ、流速は免疫吸着体上に血漿
からの第IX因子の望ましい量が吸着される接触時間を与
えるものである。より長い接触時間がタンパク質の少な
くとも約50%、好ましくは75%、より好ましくは、
95%以上を吸着させるのに必要であり、その時間は1
〜6時間、好ましくは2〜4時間で一般的に満足され
る。
86001(Amicon Corp., Lexig
ton,Mass.の登録商標)樹脂を、ぜん動性ポン
プで速やかに流れるようにする。人の血漿を第IX因子源
として使用する時、抗体を保持する球体の各容量に対し
約3〜7、好ましくは5部の血漿が処理される。血漿は
ゆっくりとカラムに注がれ、流速は免疫吸着体上に血漿
からの第IX因子の望ましい量が吸着される接触時間を与
えるものである。より長い接触時間がタンパク質の少な
くとも約50%、好ましくは75%、より好ましくは、
95%以上を吸着させるのに必要であり、その時間は1
〜6時間、好ましくは2〜4時間で一般的に満足され
る。
【0029】源物質をカラムに入れた後、50部のトリ
ス−塩化リチウム緩衝液(0.1Mリジン塩基と0.5
M塩化リチウム、pH8)で洗浄し、溶離タンパク質を
有効に除去する。除去率は好ましくは少なくとも90
%、より好ましくは最大の除去である。次いで、第2の
洗浄をトリス−塩酸緩衝液(0.05Mトリス−塩酸、
pH8)でカラムからリチウムイオンを最大限に除去す
る条件で行なう。約2〜4時間の接触時間で満足され
る。
ス−塩化リチウム緩衝液(0.1Mリジン塩基と0.5
M塩化リチウム、pH8)で洗浄し、溶離タンパク質を
有効に除去する。除去率は好ましくは少なくとも90
%、より好ましくは最大の除去である。次いで、第2の
洗浄をトリス−塩酸緩衝液(0.05Mトリス−塩酸、
pH8)でカラムからリチウムイオンを最大限に除去す
る条件で行なう。約2〜4時間の接触時間で満足され
る。
【0030】精製第IX因子の溶離は、ジエチルアミン、
塩化カルシウム、チオシアン酸ナトリウム塩、臭化カリ
ウム、酢酸(好ましくは濃度約0.1〜1.0M)また
はpH2〜3、好ましくは約2.2の塩酸−グリシン混
合物の如き溶離液を含む緩衝液で行なわれる。他の適当
な溶離剤は、当該技術分野の通常の技術で簡単に同定す
ることができる。直線的な濃度勾配の溶離液が良い結果
を与えるが、本発明の目的を達成するためには必要はな
く、一定のイオン濃度を有する溶液がさらに適当であ
る。流出速度はセフアロースの充填によりカラム内の圧
力を上げないでタンパク質の溶離を効果的に行うべきで
ある。このように、第IX因子をチオシアン酸ナトリウム
で溶離する時、チオシアン酸ナトリウムの溶離液を2M
〜4M、好ましくは3Mを流し、その流速は3リットル
カラムにおいて平方インチ当たり9ポンド以上の導入部
の圧力を与え、圧力の上昇をしないように行なう。ジエ
チルアミンの溶離では、0.3〜0.7M、好ましくは
0.5Mの濃度で行なわれる。ジエチルアミンを溶離液
として用いた場合、分画はジエチルアミンを中和するた
めに1Mグラシン中に集められるべきである。続いて、
そのカラムはPBSまたは中性緩衝液で洗浄される。
塩化カルシウム、チオシアン酸ナトリウム塩、臭化カリ
ウム、酢酸(好ましくは濃度約0.1〜1.0M)また
はpH2〜3、好ましくは約2.2の塩酸−グリシン混
合物の如き溶離液を含む緩衝液で行なわれる。他の適当
な溶離剤は、当該技術分野の通常の技術で簡単に同定す
ることができる。直線的な濃度勾配の溶離液が良い結果
を与えるが、本発明の目的を達成するためには必要はな
く、一定のイオン濃度を有する溶液がさらに適当であ
る。流出速度はセフアロースの充填によりカラム内の圧
力を上げないでタンパク質の溶離を効果的に行うべきで
ある。このように、第IX因子をチオシアン酸ナトリウム
で溶離する時、チオシアン酸ナトリウムの溶離液を2M
〜4M、好ましくは3Mを流し、その流速は3リットル
カラムにおいて平方インチ当たり9ポンド以上の導入部
の圧力を与え、圧力の上昇をしないように行なう。ジエ
チルアミンの溶離では、0.3〜0.7M、好ましくは
0.5Mの濃度で行なわれる。ジエチルアミンを溶離液
として用いた場合、分画はジエチルアミンを中和するた
めに1Mグラシン中に集められるべきである。続いて、
そのカラムはPBSまたは中性緩衝液で洗浄される。
【0031】第IX因子活性を含む分画を貯蔵し、その全
容量および活性を決定する。溶離された第IX因子を溶液
のイオンを除くためにPBSに対して透析し、次いで分
析する。溶離された第IX因子は濃度約10〜30ユニッ
ト/mlであり、治療または分析に用いることができる。
容量および活性を決定する。溶離された第IX因子を溶液
のイオンを除くためにPBSに対して透析し、次いで分
析する。溶離された第IX因子は濃度約10〜30ユニッ
ト/mlであり、治療または分析に用いることができる。
【0032】第IX因子を集めた液は限外ろ過のような通
常の方法により10〜20mlに濃縮することができる。
この目的のためには、窒素圧50psi下でYM−10
メンブランとアミコン撹拌セル(Amicon sti
rred cell)がよいことがわかった。ゆっくり
とした撹拌を窒素圧を低下した後30分間続け、濃縮液
の容量と活性を決定した。ために液は温度を4℃に保つ
ならば短期間、例えば1晩貯蔵してもよい。
常の方法により10〜20mlに濃縮することができる。
この目的のためには、窒素圧50psi下でYM−10
メンブランとアミコン撹拌セル(Amicon sti
rred cell)がよいことがわかった。ゆっくり
とした撹拌を窒素圧を低下した後30分間続け、濃縮液
の容量と活性を決定した。ために液は温度を4℃に保つ
ならば短期間、例えば1晩貯蔵してもよい。
【0033】上記した免疫吸着体カラムはカラムから精
製しタンパク質を除く溶離により再生される。カラムは
このように何回でも繰り返し使用できる。
製しタンパク質を除く溶離により再生される。カラムは
このように何回でも繰り返し使用できる。
【0034】分析は通常の部分トロンボプラスチン時間
分析(Partial thromboplastin
time assay)で行なわれる。
分析(Partial thromboplastin
time assay)で行なわれる。
【0035】すべての緩衝液において、EDTA 4ナ
トリウム塩の10mMを含んだもの、および/またはす
べての処理行程を4℃で行なうことは、第IX因子の活性
およびタンパク質分解を最小にする。
トリウム塩の10mMを含んだもの、および/またはす
べての処理行程を4℃で行なうことは、第IX因子の活性
およびタンパク質分解を最小にする。
【0036】緩衝液の組成を以下に示す。
【0037】リン酸緩衝塩溶液 1.6gのリン酸ナトリウム1塩基性1水和物 8.4gのリン酸ナトリウム2塩基性無水物 61.4gの塩化ナトリウム 水を加えて7リットルとする。pHを7.2に調整。
【0038】上記で説明した手順で7回の実験を行な
い、平均回収率52%、その範囲32%〜71%であっ
た。精製度は平均2400倍、比活性は34.8ユニッ
ト/mgであった。以下の実施例1で示すデータは、上で
述べた本発明で得られたものの代表である。冷凍された
正常人の血漿を37℃で解凍し、次いで4℃で処理した
ものである。
い、平均回収率52%、その範囲32%〜71%であっ
た。精製度は平均2400倍、比活性は34.8ユニッ
ト/mgであった。以下の実施例1で示すデータは、上で
述べた本発明で得られたものの代表である。冷凍された
正常人の血漿を37℃で解凍し、次いで4℃で処理した
ものである。
【0039】実施例1 実験A: 第IX因子活性の1.5ユニット/ml、0.0
21ユニット/mgを含む人の血漿100mlを免疫吸着体
カラムに入れ、最初に血漿を次いで第IX因子を上述した
方法に従って溶離した。溶離された第IX因子は31ユニ
ット/mgの比活性を有しており、約1500倍の精製度
を示した。第IX因子の回収率63.3%。溶離分画のピ
ークにおいては、第IX因子の濃度の12倍であった。
21ユニット/mgを含む人の血漿100mlを免疫吸着体
カラムに入れ、最初に血漿を次いで第IX因子を上述した
方法に従って溶離した。溶離された第IX因子は31ユニ
ット/mgの比活性を有しており、約1500倍の精製度
を示した。第IX因子の回収率63.3%。溶離分画のピ
ークにおいては、第IX因子の濃度の12倍であった。
【0040】実験B: 第IX因子活性の0.94ユニッ
ト/ml、0.013ユニット/mgを含む人の血漿100
mlを、すべての緩衝液にEDTA 4ナトリウム塩の1
0mMを含ませた以外は上記手順と同様にして回収し
た。溶離した第IX因子は17ユニット/mgの比活性を有
し、約1300倍の精製度を示した。回収率は61%、
溶離分画のピークにおいては、第IX因子の濃度の8倍で
あった。
ト/ml、0.013ユニット/mgを含む人の血漿100
mlを、すべての緩衝液にEDTA 4ナトリウム塩の1
0mMを含ませた以外は上記手順と同様にして回収し
た。溶離した第IX因子は17ユニット/mgの比活性を有
し、約1300倍の精製度を示した。回収率は61%、
溶離分画のピークにおいては、第IX因子の濃度の8倍で
あった。
【0041】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
血漿または濃縮物から、平均回収率52%、その範囲3
2%〜71%、精製度平均2400倍、比活性34.8
ユニット/mgの、すなわち、活性で高い純度で精製され
濃縮されたかたちの、タンパク質Aを含有する治療用途
に適した薬剤的組成物を得ることができた。
血漿または濃縮物から、平均回収率52%、その範囲3
2%〜71%、精製度平均2400倍、比活性34.8
ユニット/mgの、すなわち、活性で高い純度で精製され
濃縮されたかたちの、タンパク質Aを含有する治療用途
に適した薬剤的組成物を得ることができた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C07K 16/36 8318−4H 17/02 8318−4H
Claims (5)
- 【請求項1】 (a).ビタミンK依存性タンパク質からな
る群から選ばれるタンパク質Aに特異的なモノクローナ
ル抗体に結合した吸着体粒子上に、前記タンパク質Aと
1種またはそれ以上の他のタンパク質Bとの混合物から
なる源物質から前記タンパク質Aを吸着し、(b).カオト
ロピック試薬を含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着
体粒子から前記タンパク質Aを欠いた源物質を除去し、
さらに、(c).溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着し
たタンパク質Aを溶離することにより、変性されておら
ず高い純度で濃縮されたかたちのタンパク質Aの組成物
を回収する、各ステップを具備してプロテアーゼインヒ
ビターの介在なくして実行される方法、により得ること
ができることを特徴とする、活性で高い純度で精製され
濃縮されたかたちのタンパク質Aを含有する治療用途に
適した薬剤的組成物。 - 【請求項2】 前記源物質が血漿、血漿分画または血漿
濃縮であることを特徴とする請求項1に記載の薬剤的組
成物。 - 【請求項3】 前記源物質が前記タンパク質Aを生産す
るための遺伝子を含む細胞により表わせるものであるこ
とを特徴とする請求項1に記載の薬剤的組成物。 - 【請求項4】 (a).第IX因子に特異的なモノクローナル
抗体に結合した吸着体粒子上に、前記第IX因子と1種ま
たはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物
質から前記第IX因子を吸着し、(b).カオトロピック試薬
を含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着体粒子から前
記第IX因子を欠いた源物質を除去し、さらに、(c).溶離
液を用いて前記吸着体粒子から吸着した第IX因子を溶離
することにより、変性されておらず高い純度で濃縮され
たかたちの第IX因子を回収する、各ステップを具備して
プロテアーゼインヒビターの介在なくして実行される方
法、により得ることができることを特徴とする、活性で
高い純度で精製され濃縮されたかたちの第IX因子を含有
する治療用途に適した薬剤的組成物。 - 【請求項5】 (a).ビタミンK依存性タンパク質からな
る群から選ばれるタンパク質Aに特異的なモノクローナ
ル抗体に結合した吸着体粒子上に、前記タンパク質Aと
1種またはそれ以上の他のタンパク質Bとの混合物であ
る血漿、血漿分画または血漿濃縮の源物質から前記タン
パク質Aを吸着し、(b).塩化リチウムを含有する緩衝水
溶液を用いて、前記吸着体粒子から前記タンパク質Aを
欠いた源物質を除去し、さらに、(c).溶離液を用いて前
記吸着体粒子から吸着したタンパク質Aを溶離すること
により、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたち
のタンパク質Aの組成物を回収する、各ステップを具備
して、4℃で、キレ−ト化合物の存在下で、プロテア−
ゼインヒビタ−の介在なくして実行されることを特徴と
する方法、により得ることができることを特徴とする、
活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちのタンパク
質Aを含有する治療用途に適した薬剤的組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US47241383A | 1983-03-04 | 1983-03-04 | |
US472413 | 1983-03-04 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59038886A Division JPH0794478B2 (ja) | 1983-03-04 | 1984-03-02 | ビタミンk依存性タンパク質を含む薬剤組成物を調整する方法及びそれに用いる免疫吸着体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07126183A true JPH07126183A (ja) | 1995-05-16 |
JP2573467B2 JP2573467B2 (ja) | 1997-01-22 |
Family
ID=23875410
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59038886A Expired - Lifetime JPH0794478B2 (ja) | 1983-03-04 | 1984-03-02 | ビタミンk依存性タンパク質を含む薬剤組成物を調整する方法及びそれに用いる免疫吸着体 |
JP6019626A Expired - Lifetime JP2573467B2 (ja) | 1983-03-04 | 1994-02-16 | 第ix因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59038886A Expired - Lifetime JPH0794478B2 (ja) | 1983-03-04 | 1984-03-02 | ビタミンk依存性タンパク質を含む薬剤組成物を調整する方法及びそれに用いる免疫吸着体 |
Country Status (7)
Country | Link |
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EP (1) | EP0118256B1 (ja) |
JP (2) | JPH0794478B2 (ja) |
AU (2) | AU2529584A (ja) |
CA (1) | CA1252744A (ja) |
DE (1) | DE3485711D1 (ja) |
DK (1) | DK170806B1 (ja) |
NL (1) | NL930143I2 (ja) |
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US4902614A (en) * | 1984-12-03 | 1990-02-20 | Teijin Limited | Monoclonal antibody to human protein C |
JPH0619352B2 (ja) * | 1985-06-10 | 1994-03-16 | 帝人株式会社 | ヒト・プロテインcの測定方法 |
DE3751605D1 (de) * | 1986-01-06 | 1996-01-04 | Blood Systems Inc | Therapeutisches Blutprodukt, Mittel und Verfahren zu dessen Erzeugung. |
USH1148H (en) | 1987-04-17 | 1993-03-02 | Method of separating activated human protein C | |
DE3882411T2 (de) * | 1987-04-17 | 1993-12-16 | Teijin Ltd | Verfahren zur Trennung von aktiviertem menschlichem Protein C. |
DK0573605T3 (da) | 1991-03-01 | 2001-01-02 | Rhone Poulenc Rorer Int | Fremstilling af faktor IX |
DE19549262C2 (de) * | 1995-02-08 | 1997-10-09 | Martin Dr Kohlmeier | Präparat zur Abschätzung des Entstehungsrisikos eines beschleunigten Verlustes kognitiver Fähigkeiten |
CN1209548A (zh) * | 1998-06-08 | 1999-03-03 | 南开大学 | 碳化树脂dna免疫吸附剂的制备方法 |
KR101364001B1 (ko) * | 2004-12-23 | 2014-02-17 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | 관심있는 비타민 k-의존성 단백질을 포함한 조성물 중의단백질 오염물질의 양의 감소 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4361509A (en) * | 1981-12-14 | 1982-11-30 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
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- 1984-02-23 EP EP84301162A patent/EP0118256B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-02-23 DE DE8484301162T patent/DE3485711D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-03-02 JP JP59038886A patent/JPH0794478B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-03-02 AU AU25295/84A patent/AU2529584A/en not_active Abandoned
- 1984-03-02 CA CA000448706A patent/CA1252744A/en not_active Expired
- 1984-03-05 DK DK151784A patent/DK170806B1/da not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-12-19 AU AU27057/88A patent/AU641119B2/en not_active Expired
-
1993
- 1993-11-24 NL NL930143C patent/NL930143I2/nl unknown
-
1994
- 1994-02-16 JP JP6019626A patent/JP2573467B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
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