JPH02195888A - ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えｄｎａ体および該組換えｄｎａ体により形質転換された原核生物細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターロイキン２活性を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ体、
および該組換えＤＮＡ体により形質転換された原核生物
細胞に関する。

インターロイキン２（以下、ｒｌＬ−２Ｊと略記する。

）は、以前はＴ細胞増殖因子と呼ばれており、レクチン
あるいは抗原で活性化されたＴ細胞より産生される可溶
性たんばく（一般には「リンホカイン」として知られて
いる）である（Ｍｏｒｇａｎ　ら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　１９３．１（１０７〜１（１０８（
１９７６）、　Ｇ１１ｌｉｓら、Ｊ。

Ｊｍｍｕｎｏｌ、、　　１２０．２０２７〜２０３３（
１９７Ｂ））、ＩＬ−２はリンパ球の反応性を調節でき
、抗原特異的なエフェクターニーリンパ球のｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏにおける長期培養を可能ならしめることができる
（Ｇ　ｉ　ｌ　ｌ　ｉ　ｓら、　１１ａｔｕｒｅ。

酋８＋　１５４〜１５６（１９７７））。またＩＬ−２
は、胸腺細胞の***の促進（Ｃｈｅｎら、　Ｃｅ１ｌ　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋２２＋　２２１〜２２４（１９７７
）、　５ｈａ−ら、　Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、、　１２
０．１９６７〜１９７３（１９７８））、ヌードマウス
の肺細胞の培養系での細胞障害性Ｔリンパ球活性（Ｗａ
ｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ＋２８４゜２７８〜２８０．
　（１９８０）　）や抗−３ＲＢＣプラ一ク形成細胞反
応の誘導（Ｇｉｌｌｉｓら、　　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅ
ｄ、　ｌｉ坦、１９６０〜１９６８　（１９７９））等
の関連する他の生物活性をもつことが明らかにされてい
る。従って、このリンパ球調節因子は液体免疫や細胞性
免疫反応を増強したり免疫不全状態を正常な液体や細胞
性免疫の状態に回復させるのに有用である。これらの明
らかにされたＩＬ−２の免疫学的活性は、ＩＬ−２が悪
性腫瘍、細菌またはウィルス感染、免疫不全、自己免疫
疾患等（Ｐａｐｅｒｍａｓ　ｔｅｒら、　Ａｄｖ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ、。

５０７、　（１，９８０））に対する医科免疫療法に有
用であることを示している。インターフェロンと同様に
、ＴＬ−２はナチュラルキラー細胞活性を増強すること
が示されてきたが、これは悪性腫瘍治療への有用性を強
く示唆している。更に、ＩＬ−２は単クローン性の活性
化Ｔ細胞の保持を可能とし、この事は、Ｔ細胞分化の分
子機構、Ｔ細胞機能の分化機構、Ｔ細胞の抗原リセブタ
ーの機構を研究する上で重要な役割を担っていることを
示している。また、ＩＬ−２は単りローン性Ｔ細胞を長
期培養することにより、他の種々の分野で有用な様々な
Ｔ細胞由来のリンホカインを製造するためにも使用でき
る。更に、ＩＬ−２の産生とリンパ球のＩＬ−２に対す
る応答性は、免疫学的機能の重要なパラメーターであり
、免疫異常の臨床診断に有用である。

ＩＬ−２は従来の技術では、マイトジェンでマウス、ラ
ットあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製造
されてきた（Ｇｉｌｌｉｓら＋　Ｎａｔｕｒｅ、　２６
８＋１５４〜１５６．　（１９７７））、　Ｆａｒｒａ
ｒら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋１２Ｌ１３５３〜１
３６０．　（１９７８）　、　Ｇ１１ｌｉｓら、　Ｊ、
　１Ｈｕｎｏ１．、月題。

２０２７〜２０３３．　（１９７８））。ヒトの末梢血
リンパ球をマイトジェンで刺激することにより（Ｇｉｌ
ｌｉｓら、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１２４．１９５４〜１９６２．
　（１９８０））、Ｇ１１ｌｉｓらはＴリンホーマ細胞
株からのマウスＩＬ−２の製造（Ｇｉｔｌｉｓら、　Ｊ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１２５．２５７０〜２５７８
（１９８０））とヒト白血病細胞株からのヒトＩＬ−２
の製造（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、
、　１５２．１７０９〜１７１９．　　（１９８０））
を報告している。

Ｇ１１ｌｉｓらによる上記の技法は、細胞培養法を用い
てマイトジェンで活性化されたＴ白血病細胞株からヒト
１Ｌ−２を製造する方法に関するものである。しかしな
がら、この方法では低濃度のヒトＩＬ−２しか産生され
ないのが難点で、大量の培養液から微量のＩＬ−２を得
るために、複雑な精製工程を必要とする。更に、ヒ）Ｔ
白血病細胞株は少量のヒ１−ＩＬ−２に酷似した他の生
理活性物質も産生ずるので、ＩＬ−２をこれらの他の免
疫活性を有する分子と分離、あるいは時として共存する
細胞毒物’Ｊｉ（ｔｏｘｉｃ　１ｅｃｔｉｎ）と分離す
るにはかなりの困難が伴う。

ＩＬ−２を製造する他の方法として、インターフェロン
のような他の生理活性ヒト由来たんばくを製造するため
に用いられた組換えＤＮＡ　（デオキシリポ核酸の略）
法（Ｇｒａｙら、　Ｎａｔｕｒｅ　２９５．５０３〜５
０８（１９８１）、　Ｎａｇａｔａら、　Ｎａｔｕｒｅ
　２８４．３１６〜３２０　（１９８０）。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、　ｃｅｎｅ皿、　１１〜１５．
　　（１９８０））が好ましいと思われる。しかしなが
ら、本発明の以前には組換えＤＮＡ法によってＩＬ−２
を製造する試みは成功していなかった０例えば、組換え
ＤＮＡ体によってＩＬ−２を産生ずる生命体を作成しよ
うとする試みは、恐ら（ＩＬ−２ポリペプチドをコード
する遺伝子が未だクローン化されていなかったために成
功していないという事が、“日経バイオテクノロジー、
第１９号、　１９８２年７月５日°゛に報告されていた
。

従って、ＩＬ−２をコードするクローン化遺伝子とその
遺伝子を持った組換えＤＮＡ体が渇望されてきた。また
、組換えＤＮＡ体を有する生細胞株と、その細胞株を使
ってＩＬ−２を製造する方法が渇望されてきた。

本発明の要旨は以下の記述から更に容易に明白となる。

本発明の目的はＩＬ−２活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ体を創出したこ
と、および該組換えＤＮＡ体によってＩＬ−２を産出す
べく形質転換させた原核生物の細胞を創出したことにあ
る。

すなわち、本発明はヒトインターロイキン２活性を有す
るポリペプチドをコードする遺伝子を含有する原核生物
を形質転換するための組換えＤＮＮ棒体ヒトインターロ
イキン２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
を含有するエシェリヒア・コリを形質転換するための組
換えＤＮＡ体、ヒトインターロイキン２活性を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ
体により形質転換された原核生物の細胞およびヒトイン
ターロイキン２活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子を含有する組換えＤＮＡ体により形質転換された
エシェリヒア・コリを提供するものである。

上記ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプチド
としては、ヒトインターロイキン２活性を有するもので
あればいずれでもよい。

上記において、ヒトインターロイキン２活性を有するポ
リペプチドの具体例としては、たとえば分子中に次のア
ミノ酸配列を含むポリペプチド（１）が挙げられる。

Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＧＩＮ　ＬｅｕＧＩＮ　Ｌｅｕ
　Ｇｌｕ　１ｌｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ
　Ｌｅｕ　ＧＩＮ　Ｍｅｔｌｉｅ　Ｌｅｕ　ＡｓＮ　Ｇ
ｌｙ　Ｔｉｅ　ＡｓＮ　ＡｓＮ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓ
Ｎ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　Ｍｅｔ　　
Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　ｌ、ｙｓ　　Ｐｈｅ　
　ＴｙｒＭｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　ＬｅｕＧＩＮ
　Ｃｙｓ　Ｌ、ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ
　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＧｌｕ　　Ｖａｌ、
Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　ＧＩＮ　　
Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　ＡｓＮ　　Ｐｈｅ旧ｓ　　Ｌｅｕ
　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　八ｒｇ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ
　　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　　ＡＳＮ　ｌ１ｅＡｓＮ　Ｖａ
ｌ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ
　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｍ
ｅｔ　Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ
　Ｇｌｕ　ＴｈｒＡｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　Ｖａ
ｌ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ａｒ
ｇ　　Ｔｒｐ　　ＴｉｅＴｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＧＩ
Ｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ月ｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔ
ｈｒ当該ポリペプチド（１）の具体例としては例えば、
下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド（■）； 八Ｉａ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　
Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　
ＧＩＮＬｅｕ　ＧＩＮ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＧＩＮＭｅｔ　
　Ｉｌｅ　　Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　
　ＡｓＮ　　ＡｓＮ　　Ｔｙｒ　　Ｌｙｓ　　ＡｓＮＰ
ｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｌｅ
ｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＰｈｅＴｙｒ　　Ｍｅｔ
　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ
　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　旧５Ｌｅｕ　　Ｇ
ＩＮ　　Ｃｙｓ　　［＋ｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　
Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　ＬｅｕＧｌ
ｕ　　Ｇｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ｌｅ
ｕ　　Ａｌａ　　ＧＩＮ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ａｓ
ＮＰｈｅ　　ｔｌｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ
　　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　ｌｉｅ　　Ｓｅｒ
　　ＡｓＮ１１ｅ　ＡｓＮ　Ｖａｔ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　５ｅｒＧｌ
ｕ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｍｅｔ　　Ｃｙ
ｓ　　Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ａｈａ　　Ａｓｐ　　Ｇｌ
ｕＴｈｒ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　Ｖａｌ　
　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ａｒｇ　
　Ｔｒｐｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＧＩＮ　Ｓ
ｅｒ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕｈｒ 下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｉ［［）；
Ｍｅｔ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　
Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　ＴｈｒＧＩＮ　　Ｌｅｕ　　ＧＩ
Ｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅ
ｕＧＩＮ　　Ｍｅｔ　　Ｉｌｅ　　Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　
　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　ＡｓＮ八ｓへ　　Ｐｒｏ　　Ｌ
ｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　Ｍｅｔ　　Ｌ
ｅｕＰｈｅ　　Ｔｙｒ　　Ｍｅｔ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ
　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒｔｌｉｓ　　Ｌｅｕ　
ＧＩＮ　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ
Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｖａｔ　　Ｌｅｕ　　
ＡｓＮ　　Ｌｅｕ　　ＡｌａＡｓＮ　　Ｐｈｅ　　１ｌ
ｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　　Ａ
ｓｐＡｓＮ　　ｌｉｅ　　ＡｓＮ　　Ｖａｌ　　ｌｉｅ
　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　ＧｌｕＳｅｒ　Ｇｉｕ　　Ｔ
ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　　ＧｌｕＧｌ
ｕ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　ｌｉｅ　　Ｖａ
ｌ　　Ｇｌｕ　　ＰｈｅＴｒｐ　　ｌｉｅ　　Ｔｈｒ　
　Ｐｈｅ　　Ｃｙｓ　　（＋ＩＮ　　Ｓｅｒ　　ｌ１ｅ
Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ 下記のアミノ酸配列を有するポリ （■）； Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｙｓ　ＬｙｓＧＩＮ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｈｉｓ　
　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐｌｉｅ　　Ｌ
ｅｕ　　ＡｓＮ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　ＡｓＮ　　Ａ
ｓＮ　　ＴｙｒＬｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅ
ｔ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＰｈｅＭｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　
Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕｙｓ Ｌｅｕ ＡＳＮ Ｔｈｒ ｌｕｔ Ｌｅｕ ＧＩＮ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌ　ｙ　ｓ　　Ｔ　ｈ　ｒ Ａｓｐ　　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　　Ｌｙｓ Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　　Ｉ、ｙｓ １１ｅ　　５ｅｒ Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ Ａｌａ　　Ａｓｐ ＡｓＮ　　Ａｒｇ Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ ペプチド Ｔｈｒ　　ＧＩＮ Ｌｅｕ　　ＧＩＮ Ｌｙｓ　　ＡｓＮ Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ Ｌｙｓ　Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｐｒ。

Ｔｙｒ ｅｕ ＧＩＮ　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　
Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＧｌｕ　　Ｖ
ａｌ　　Ｌｅａ　　ＡｓＮ　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　ＧＩＮ
　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　　ＡｓＮ　　ＰｈｅＨｉｓ　Ｌｅｕ
　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　
Ｓｅｒ　ＡｓＮ　１ｉｅＡＳＮ　Ｖａｌ　　ｌｉｅ　Ｖ
ａｌ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　
Ｓｅｒ　ＧｌｕＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙ
ｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ
Ａｈａ　　Ｔｈｒ　　Ｉｃｅ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　
Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ａｒｇ　　Ｔｒｐ　　ｌ
１ｅＴｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＧＩＮ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ
　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ下記のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド（Ｖ）などが挙げられる
。

Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＧＩＮＬｅｕ　　ＧＩ
Ｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　旧ｓ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ
　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　ＧＩＮＭｅｔ　Ｉ
ｌｅ　Ｌｅｕ　ＡｓＮ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　ＡｓＮ　Ａｓ
Ｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　ＡｓＮＰｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　
Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｙｓ　ＰｈｅＴｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｉ、ｙ
ｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ
Ｌｅｕ　ＧＩＮ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇ
ｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＬｅｕＧｌｕ　Ｇｌｕ
　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＡｓＮ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＧＩＮ　
Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ＡｓＮＰｈｅ　）Ｉｔｓ　Ｌｅｕ　Ａ
ｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｉｅ　Ｓｅ
ｒ　ＡｓＮ１１ｅ　ＡｓＮ　Ｖａｔ　Ｉｌｅ　Ｖａｔ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　５ｅｒＧｌ
ｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ
　Ｔｙｒ＾ｌａ　Ａｓｐ　ＧｌｕＴｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈ
ｒ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　ＡｓＮ
　Ａｒｇ　Ｔｒｐｌｌｅ　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　
　ＧＩＮ　Ｓｅｒ　　ｌｉｅ　　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈ
ｒ　　Ｌｅｕｈｒ 上記ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ体の具体例
としては、たとえば上記ポリペプチド（ＩＩＩ）をコー
ドする下記の塩基配列を有する組換えＤＮＡ体： ＡＡＴ　　ＡＴＣＡＡＣＧＴＡ　　ＡＴＡ　　ＧＴＴ　
　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　　ＣＴＡ　　ＡＡＧ　　ＧＧＡＣ
ＴＡ　　ＡＣＴ　　。

もしくは 上記ポリペプチド（Ｖ）をコードする下記の塩基配列を
有する組換えＤＮＡ体などが挙げられる。

八ＣＴ 本発明におけるポリペプチドとしては、上記アミノ酸配
列の中で１個ないしそれ以上のアミノ酸を欠くポリペプ
チド；上記アミノ酸配列の中の１個ないしそれ以上アミ
ノ酸が１個ないしそれ以上のアミノ酸で置換されたポリ
ペプチド；上記アミノ酸配列に対して１個ないしそれ以
上のアミノ酸が追加されたポリペプチドであってもよい
。

本発明における原核生物の細胞としてはエシェリヒア属
に属するものが好ましく、さらにエシェリヒア・コリに
属するものが好ましい。

本発明の組換えＤＮＡ体を利用することによって、ＩＬ
−２はＩＬ−２活性を有するポリペプチドを産生ずべく
コードされた遺伝子の挿入と、細胞の中で複製され得る
ベクターＤＮＡの挿入で組換え法により修飾され、該遺
伝子のコードシーケンスが、プロモーターシーケンスの
下流に位置するＤＮＡによってＩＬ−２を産生ずべく形
質転換させた本発明の原核生物細胞あるいはエシェリヒ
ア・コリを培地に浮遊培養（好気的）することによって
製造される。

ＩＬ−２ポリペプチドをコードしたクローン化遺伝子は
、ＩＬ−２活性を有するポリペプチドを産生ずる能力を
もつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞に由来す
るＩＬ−２に相当するメツセンジャーＲＮＡ（ａ＋ＲＮ
Ａ；”ＲＮＡ″はリボ核酸の略、以下”ＩＬ−２ｍＲＮ
Ａ”という）を相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）に逆転写す
ることによって得られる。得られた一重１ｌｃＤＮＡ（
ｓｓ−ｃＤＮＡ）は２重鎖ｃＤＮＡ　（ｄｓ−ｃＤＮＡ
）に変換させることができる。

ｃＤＮＡを調製するための鋳型として用いるａ＋ＲＮ＾
は、ＩＬ−２ポリペプチドを産生ずる哺乳動物細胞から
単離することができる。単離されたＲＮＡはポリアデニ
ル化され（ＧｉＬＬｉｓら、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｒｅｖ、、　６３＋１６７〜２０９　（１９８２
））　、ポリアデニル化されたＲＮＡは、例えばショ糖
密度勾配遠心法によって１１〜１２Ｓ画分に分画するこ
とができる。１３ｓのｍＲＮＡにＩＬ−２ｍＲＮＡ活性
が現われることがあるが、この場合は１１〜１２　Ｓｍ
ＲＮＡの凝集物であることが考えられる。

ｍＲＮＡの供給源となるＩＬ−２を産生ずることができ
る哺乳動物細胞は、哺乳動物より摘出できる末梢血単核
球、扁桃腺細胞、肺臓細胞のようなＴリンパ球で良い。

細胞にＩＬ−２産生能を与えたり、またはＩＬ−２活性
を増強するために、ナイロンカラム処理、抗血清と補体
処理、密度勾配分画、ノイラミニダーゼとガラクトース
オキシダーゼの組合せ処理、トリプシン処理のような様
々な酵素処理、Ｘ線照射など従来知られた方法で前処理
しても良い。上記哺乳動物細胞をＴ細胞増殖因子存在下
で培養後得られるクローン化Ｔリンパ球もｍＲＮＡの供
給源として用いることができ、これはより好ましいＴ−
リンパ球である。白血病やリンパ腫細胞株に由来するＴ
リンパ球それ自体または上記の方法で前処理または変異
したそれらの誘導体などの形質転換されたリンパ球細胞
株またはクローニングされた形質転換細胞株もｍＲＮＡ
の供給源として好ましい。明らかに、クローン化した細
胞株は通常クローン化前の親株に比較して多量のＩＬ　
−２ｍＲＮＡを含んでいる。上記したリンパ球由来細胞
とＣＥＭ。

Ｍｏ１ｔ　４Ｆ、　ＢＷ５１４７のごとき腫瘍細胞株を
融合することによって得られたＴ細胞ハイプリドーマも
また本発明に使用するのに好ましい哺乳動物細胞である
。この場合のリンパ球由来細胞は、０）ＩＬ−２の自発
産生細胞および（２）ＩＬ−２産生を補助する他の細胞
の存在下または非存在下に培養液中にマイトジェンが導
入され存在している時のみＩＬ−２を産生する細胞を含
む。

ＩＬ−２自発産生細胞においてＩＬ−２ｍＲＮＡを誘導
するために、ＩＬ−２自発産生細胞は、細胞培養の分野
でよく知られた方法で培養される。マイトジェン存在下
のみでＩＬ−２を産生ずる細胞においてｍＲＮＡを産生
ずる場合は、培養した細胞は培地で良く洗った後、血清
を含むかまたは含まないローズウエルパークメモリアル
インスティテニート１６４０（以下、”ＲＰ旧１６４０
’と略す。）、ダルベラコラ変法イーグル培地（以下“
ＤＭＥＭ”と略す。）またはクリック培地のごとき培地
に再び浮遊する。これらの細胞培養培地には、ペニシリ
ン、ストレプトマイシンまたは他の抗生物質、Ｌ−グル
タミン。

ヘペス緩衝液、または炭酸水素ナトリウムのような種々
の添加物を細胞培養の分野で一般に使われる濃度で加え
ても良い。好ましい細胞濃度は０．５〜４Ｘ１０”細胞
／ｄである。ｍＲＮＡの活性化とＩＬ−２の産生を誘導
するために適当な刺激剤が加えられる。この適当な刺激
剤の中には、マイトジェン、ノイラミニダーゼ、ガラク
トースオキシダーゼ、塩化亜鉛の如き亜鉛化合物または
プロティンＡ、ストレプトリジン−〇の如き細菌由来の
リンパ球活性化因子が含まれる。刺激された細胞は回収
され、洗浄される。マイトジェン刺激の際、マクロファ
ージまたはプントリティック細胞を共存させるとやはり
ｍＲＮＡを活性化し、あるいは活性化ｍＲＮＡの収量を
増大させ得る。同様にＲａｊｉ、　Ｄａｕｄｉ。

Ｋ５６２．　ＢＡＬＬ−１の如き８９２３球またはＢリ
ンパ球細胞株に由来する細胞株を共存させてもｍＲＮＡ
は活性化され、または活性化ｍＲＮＡの収量を増大させ
得る。

哺乳動物細胞を増殖させるために、細胞は通常の条件下
でｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞培養により、または組織適合
動物の体内で維持される。ｍＲＮＡの供給源を調製する
ためにｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養による継代を行なう場合に
は、従来Ｔ細胞の生育を促進することが知られている培
地であればどのような培地にもこれら細胞は生育する。

これらの培地には哺乳動物の血清５血清成分または血清
アルブミンを添加しても良い。ｍＲＮＡの活性化のだめ
の培養時間は、ｍＲＮＡを生成するための活性化に必要
な時間に対応する。

この時間は５通常ＩＬ−２の培地中への産生が開始され
るまでに必要な時間と対応している。好ましい時間は、
マイトジェン等の刺激剤を添加してから３〜１２時間で
ある。培養時間が長すぎる場合、生成したＩＬ−２ｍＲ
ＮＡが分解されることがある。ＩＬ２産生細胞の活性化
に際し、ＰＭＡまたはＴＰＡの如きホルボールエステル
類を１０〜５０　ｎ　ｇ　／　ｍｌ添加して活性化レベ
ルを上昇させることもできる。

ＩＬ−２ｍＲＮＡ活性化のための上記工程はｐＨ７，０
〜７．４．温度範囲３２〜３８°Ｃの飽和水蒸気の環境
下で行なわれる。

ＩＬ−２を産生ずる哺乳動物細胞を取得し培養する方法
を以下に述べる。

（イ）ＩＬ−２自発産生株の取得 とトＴリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細胞
（フレッド・ハッチンソン・癌研究所／シアトル／アメ
リカ、ソータ研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ
国立癌センター／ハイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）を１×１０６個／　ｍｌの細胞密度でクリ
ック培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速
度で合計８．（１００レントゲンのＸ線照射を行なう。

この後、本細胞を０．１細胞／２（１０μ！培地の細胞
密度で９６穴の平底マイクロタイタープレート（「ファ
ルコン３０７２Ｊ）に添加し、５％牛脂児血清を含むク
リック培地中で３週間３７°Ｃにて５％ＣＯｔインキュ
ベーター中にて培養する（限界希釈法によるクローニン
グ）。細胞の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、
細胞が底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌ
ンク社製培養プレートに移し、クリック培地中にて５日
間細胞を増殖させる。さらに、本細胞を１〜２　Ｘ　］
、　０　″個／　ａｉｌの細胞密度にて血清も血清由来
アルブミンも含まない無血清合成培地に懸濁して２日間
培養し、本培養上清を遠心分離操作で分離し、次いで０
．２２μのミリポアフィルタ−にてデブリス除去と無菌
化を行なった。このようにして得た培養上清のＩＬ−２
活性を測定することによってＩＬ−２を自発産生ずるＸ
線処理変異株が選択され、かつクローニングされた。

（１１）ヒト末梢血単核細胞より■Ｌ−２産生株の取得
ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球（以下、Ｐ肛と略す）
。を採取する。本ＰＢＬをｌＸｌ０６個／成の細胞密度
で５％ＦＣＳを含むクリック培地に懸濁し、各２減宛２
４穴のヌンクの培養プレートに接種する。ここにフィト
ヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ社製）を５μｇ　／　ｒｔ
ｔｆｌの終末濃度になるように１（１０μ！添加し、上
述の条件下に４８時間培養し、次いで細胞を培養液で洗
浄し、再び】×１０’個／　ｒｎｆｌの細胞密度でクリ
ック培地１　ｍｌｌに接種する。さらに、コンカナバリ
ンＡ（以下、ＣｏｎＡと略す。）２．５７１ｇ／ｍで４
８時間刺激したヒト牌細胞から調製したコンディショニ
ングした培地１ｍｌを加え、該コンディショニングした
培地５０％を含む培地を３日毎に取り換えて、ＰＢＬか
らのヒトＴリンパ球を長期継代培養する。このように長
ｇ継代培養して得たＴリンパ球を、前述と同様の限界希
釈法でコンディショニングした培地に由来するヒト牌細
胞の存在下、クローニングを行ない、かつ同様に細胞増
殖を行なう。こうして得られた、クローン化Ｔリンパ球
をｌＸｌ０’個／　ｍｌの細胞密度に１０μｇ　／　ｍ
ｆｌのフィトヘマグルチニン（以下、ＰＨＡと略す。）
の存在下、２４穴のヌンク培養プレート中のＲＰＭＩ　
１６４０培地１　ｍＩｌに接種し、２４時間、３７°Ｃ
で７．５％ＣＯ□インキュベーター中にて培養した。本
培養上清を遠心分離操作で分離し、次いで０．２２μの
ミリポアフィルタ−で無菌化を行なった後、ＩＬ−２産
生ヒト正常下リンパ球クローンを同定するために、ＩＬ
−２活性検定を行なった。

（ハ）マイトジェン刺激でＩＬ−２を生産するヒトリン
パ球由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法によりク
ローン化されたＪ−１１１株は、前記の無血清培地や血
清１〜２％を含むＢＰＭＩ　１６４０培地中にてＣｏｎ
Ａ　　１０　ｕ　ｇ／ｍｌやＰＨＡ　２．５　ｕ　ｇ　
／　ｍｌ−の存在下に２４時間培養すると、１０〜４，
（１００単位／緘のＩＬ−２を産生ずることができる。

また、これらヒト悪性化細胞は塩化亜鉛、プロティンＡ
。

ピシバニール存在下に培養しても、ＩＬ−２を産生ずる
。

（ニ）他の細胞もしくはその細胞の産生ずる因子の存在
下にマイトジェンで刺激することによりＩＬ−２を産生
ずる細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１ｔ　４　Ｆや前述の限界
希釈法でクローン化されたジュルカット細胞の１つのク
ローン、ジェルカット９９株は、上述のごときレクチン
やマイトジェンを広い濃度範囲で加えて２４〜７２時間
培養してもＩＬ−２を産生しない。ところが、この間モ
ノカインの１種であるインターロイキンｌを５〜１０ｕ
／ｄまたは５０％のに５６２やラージ（Ｒａｊｉ）細胞
を共存させて３７”Ｃ，２４時間培養すると、ＩＬ−２
を確認しうる蓋（１０〜１（１０ｕ／ｍＲ）産生する。

このようにして活性化された細胞よりＴＬ　−２ｍＲＮ
Ａを抽出するには、細胞の種類を問わず常法によって行
なえばよい。たとえば、ＮＰ　　４０　、　ＳＤＳ、Ｔ
ｒｉｔｏｎ−Ｘ１（１０．デオキシコール酸などの界面
活性剤を添加して細胞を部分的または完全に分解するか
、ホモゲナイザーや凍結融解などの物理的方法を用いて
、細胞を部分的あるいは完全に破壊、可溶化する。その
際にＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出
液中にＲＮａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポ
リビニル硫酸、ベントナイト、”ンカロイド、ジエチル
ピロカーボネート、バナジウム複合体などを添加してお
くのが好ましい。また、場合に応じては、抗ＴＬ−２抗
体を用いてＩＬ−２合成途上のポリゾームを沈降せしめ
、これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も
行ない得る。

また、ｐｏｌｉＡを含むｍＲＮＡの精製についてはオリ
ゴｄＴ−セルロース、セファロース２Ｂを７８体とする
ポリＵ−セファロースなどのアフィニティ・カラムある
いはバッチ法による精製法、　ＳＤＧ遠心法による分画
、アガロースゲル電気泳動法等によって行なうことがで
きる。

上記の如くして得られたｍＲＮＡがＩＬ−２１１＋ＲＮ
八活性を有するものであることを確認するためには、ｍ
ＲＮＡを蛋白に翻訳させ、その生理活性を調べるか、抗
ＩＬ−２ペプチド単りローン性抗体を用い該翻訳蛋白を
同定する等の方法を行なえばよい。たとえばｍＲＮＡは
通常、アフリカッメガエル（ｋμｍ眩１ａｅｖｉｓ）の
卵にマイクロインジェクションすることにより（Ｇｕｒ
ｄｏｎら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２３３．１７７〜１８２
（１９７２））あるいは網状赤血球または小麦胚無細胞
翻訳システムを使用することにより対応する蛋白に翻訳
される。

ＩＬ−２活性は、先にＧ１１１ｉｓら（Ｇｉｌｌｉｓら
、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２０．２０２７〜２０３３（１
９７８））によって基本的には述べられているミクロ検
定法によって確認できる。この検定法では、Ｇ１１ｌｉ
ｓらによって確立された方法に従って作成した細胞障害
性Ｔリンパ球細胞株（以下、ＣＴＬＬと略す、）のＩＬ
−２に依存細胞のＤＮＡ合成上昇（ＩＬ　−２ｄｅｐｅ
ｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉ
ｏｎ）を指標としている。即ち、４Ｘ１０３個０ＣＴＬ
Ｌ細胞を２％のｐｃｓを含むＲＰＭＩ−１６４０培地１
（１０μｌに懸濁し、１（１０μｌの連続希釈した翻訳
産物と共に９６穴の平底マイクロプレートに接種する。

３７°Ｃ，５％ＣＣｈ下で２０時間培養した後、細胞を
０．５μＣｉ／ウエルの３Ｈ−ＴｄＲで４時間ラベルし
、自動細胞ハーベスタ−を用いて帯状ガラス繊維上に細
胞を回収し、細胞が取り込んだ放射能を液体シンチレー
ション法で測定する。

この検定により、ＩＬ−２存在下に培養されたＣＴＬＬ
細胞が投与量に依存して３Ｈ−ＴｄＲを取込むことが判
明し、このことから検体中に含まれるＩＬ−２量を明確
に計算することができる。

ＩＬ−２は１９７８球の増殖を促す活性を有するので、
ＩＬ−２活性を１９７８球の増殖を指標として測定する
ことができる。即ち、５個のＣＴＬＬ細胞を２％のＦｅ
２を含むＤＭＥＭ　　１（１０μｌに懸濁し、１（１０
μ２の連続希釈した翻訳産物と共に９６穴の平底マイク
ロプレートに接種する。７２〜９６時間、３７°Ｃ，５
％ＣＯＺ下で培養した後、活性化し増殖した細胞の数を
顕微鏡下で計測する。対照群として１（１０Ｕ／ｆｆ１
ｊ！、ＩＯＵ／−のＩＬ−２を用い、この対照群の増殖
した生細胞数と比較して検体の１シー２活性を求める。

このようにして最も高活性の両分から得られた１１、−
２１１１ＲＮＡはｄｓ−ｃＤＮＡを合成するための鋳型
として用い、ｄｓ　−ｃＤＮＡはベクターＤＮＡと結合
させる。

ｃＤＮＡの合成は従来の方法によって行なう。

まず、ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをブライマーと
してｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰの
存在下で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的な５ｓ−ｃ
ＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解除
去した後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写酵素
あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いてｄｓ　−ｃＤＮＡ
を合成する。

このようにして得られたｄｓ−ｃＤＮＡと原核生物ある
いはエシェリヒア・コリで複製できるレプリコンを含む
ベクターＤＮＡから本発明の組換えＤＮＡ体が作られる
。しかる後、この組み換えＤＮＡ体は宿主細胞に組み込
まれる。

このｄｓ　−ｃＤＮＡ及び原核生物で増殖し得るベクタ
ー　ＤＮＡは、これらを結合させる前にエキソヌクレア
ーゼ処理、化学合成りＮＡ断片の追加、　ｄｓ　−ｃＤ
ＮＡやベクターＤＮＡの末端に連結可能な端末をつける
ためにＧ、Ｃ−鎖を伸ばすなど各種処理によって修飾さ
れる。これらの連結可能なりＮＡは、例えばＡＴＰ共存
下にＴ４ファージのＤＮＡライゲースによってつぎ合せ
ることが出来る。

このようにして調製された本発明の組換えＤＮＡ体によ
ってクローン化されたｃＤＮＡを増１Ｊさせるため又は
ＩＬ−２ポリペプチドを製造するために原核生物細胞あ
るいはエシェリヒア・コリを形質転換することにより、
本発明の組換えＤＮＡ体により形質転換された原核生物
細胞あるいはエシェリヒア・コリが得られる。

ＩＬ−２生産のための適当な原核生物宿主としてはバチ
ルス・ズブチリスなどあるいはエシェリヒア・コリが含
まれる。宿主細胞中での口Ｎ＾増中のためにはエシェリ
ヒア・コリを宿主とすることが出来るが、その他の宿主
細胞とすることも出来る。

適当なエシェリヒア・コリ用ベクターとしてはＥＫ型プ
ラスミドベクター（ストリンゼント型）としてｐｓｃｌ
ｏｌ、　ｐＲＫ３５３．　ｐＲＫ６４６．　ｐＲＫ２４
８．　ｐＤＦ４１など、、ＥＫタイププラスミドベクタ
ー（リラックスドタイブ）　　：　Ｃｏ１Ｅ１．　ｐＶ
Ｈ５１，ｐＡｃ１０５．　Ｒ５Ｆ２１２４゜ｐｃＲｌ、
　ｐＭ８９．　ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３
２４，ｐＢＲ３２５゜ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８，ｐ
ＫＶ２２８９．　ｐＫＹ２７（１０．　ｐＫＮ８０．　
ｐＫＣ？。

ｐＫＢ１５８．　ｐＭＫ２（１０４．　ｐＡｃＹｃｌ、
　ｐＡｃＹｃ１８４．　ｄｕｌ等、、λｇｔタイプファ
ージベクター：λｇｔ、λＣ９λｇｔ、λＢ。

λＷＥＳ、λＣ１λ−ＥＳ、λＢ、λＺＪｖｉｒ、　＋
　　λＢｌ、λＡＬＯ，λＢ。

λ−ＥＳ、Ｔｓ６２２．λＤａｍ等が含まれている。一
般に、ｐＢＲ３２２はエシェリヒア・コリ用ベクターと
してしばしば利用されてきたが、この場合量も良いクロ
ニング部位はＰｓ　ｔｌならびにＥｃｏＲ１部位である
。

組換えＤＮＡ体を用いた宿主細胞の形質転換には、通常
よく用いられる次の方法がある。ニジエリ゛ヒア・コリ
が宿主の場合、このＤＮＡを取り込むことの出来るコン
ピテント細胞は対数増殖期における細胞を回収後、良く
知られているＣａＣ１ｔ法によって形質転換出来る。形
質転換反応液中にＭｇＣ１ｚ又はＲｂＣｌを共存させれ
ば形質転換効率は向上する。

また、宿主細胞のプロトプラスト調製後形質転換させる
ことも可能である。

ＩＬ−２遺伝子を保有する細胞は、次の２つの方法の何
れかを用いて形質転換後分離可能である。

（１）　　プラス−マイナス法：抗原刺激した哺乳動物
細胞抽出液より蔗糖密度勾配遠心分離にて１１１２ｓ画
分として部分精製したＩＬ−２ｍＲＮＡを調製し、この
部分精製ｍＲＮＡを鋳型としてｆｆｇｐ−放射性５ｓ−
ｃＤＮＡを合成する。アルカリ処理に”ζ鋳型ｍＲＮＡ
を除去後、単離されたｃＤＮＡは、抗原刺激しない哺乳
動物細胞から抽出され、部分精製した１ｌ−１２ＳｍＲ
ＮＡでハイブリダイズする。引続いてハイブリダイズし
なかったｃＤＮＡとハイブリダイズしたｃＤＮＡはハイ
ドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画す
る。ハイブリダイズしなかったｃＤＮＡとハイブリダイ
ズしたｃＤＮＡをそれぞれプローブＡ、及びプローブＢ
と呼ぶ。何れの組換え体も同一の方法によりそれぞれニ
トロセルロース濾紙上で生育させる。そして、細胞のＤ
ＮＡをアルカリ処理にて濾紙上に固定する。プローブＡ
及びＢをそれぞれ、二つの異った濾紙上でＤＮＡとハイ
ブリダイズさせる。その後、オートラジオグラフィーを
行ってプローブＡと陽性に反応する組換え体（プラス）
、プローブＢと僅か又は全熱反応しない組換え体（マイ
ナス）を選別する（呑口ら；　Ｐｒｏｃ。

Ｊａｐ、　　Ａｃａｄ、、　　Ｖ１５５Ｂ　　４６４〜
４６９（１９７９）。

（２）第２の方法は、例えば１（１００〜１０．（１０
０の組換体クローンを２〜３０ないし２〜３（１０クロ
ーン宛のクローングループに大別し、それぞれのクロー
ングループをそれぞれ常法によって培養しプラスミドＤ
ＮＡ５を調製する。次いで、これらプラスミドＤＮＡ５
を例えば熱変性して５ｓ−ｃＤＮＡをニトロセルロース
濾紙上に固定し、活性化ＩＬ−２−ｍＲＮＡを含有する
哺乳動物細胞から調製されたｍＲＮＡと相補的にハイブ
リダイゼーションを行う。あるいはまた、ＩＬ−２ｍＲ
ＮＡを含有するｍＲＮＡ　（混合物）を熱変性したプラ
スミドＤＮＡ（混合物）とハイブリダイズさせるとＤＮ
Ａ　−ｍＲＮＡハイブリッドがニトロセルロース濾紙上
に固定される。この濾紙を１ｍＭの１−ＩＥＰＥＳ、あ
るいは１０ｎ＋Ｍの食塩水のごとき低塩類緩衝液で洗浄
し、濾紙上に吸着されたｍＲＮＡを０．５ｍＭ　ＥＤＴ
ＡＨｏ、　１χＳＤＳ溶液含有液で例えば９５°Ｃ１１
分間処理して抽出する。精製ｍＲＮＡはこれをｏｌｉｇ
。

ｄＴ−セルロースカラムクロマトグラフィーにて？吉用
回収する。次いで、ｍＲＮＡをアフリカッメガエル卵母
細胞にマイクロインジエクシツンして蛋白質に翻訳して
ＩＬ−２活性を確認する。あるいはｍＲＮＡに依存性の
網状赤血球系又は小麦胚のｉｎ　ｖｉｔｒｏ無細胞合成
系を用いてこのｍＲＮＡを蛋白に翻訳させ、抗ＩＬ−２
抗体を用いてＩＬ−２＝活性を分析することが出来る。

これらの方法によってＩＬ−２活性が検出されたグルー
プをさらに少数の組換え体クローンを含有する群に類別
し最終的にはＩＬ−２ＯＮ＾を有する単一クローンが得
られるまで繰返し実施する。

ＩＬ−２産生能のある組換え体よりＩＬ−２ポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡを得るには、先ずトランスフォ
ーマント中の組換えＤＮＡ体を分離し、これを制限酵素
エンドヌクレアーゼで切断する。切断によって得られる
ＤＮＡ分画より組込まれたｃＤＮＡ画分を分離する。

ｐＩＬ−２−５０Ａを組換えたＤＮＡよりルー２ポリペ
プチドをコードするＰｓｔｌ　ＤＮＡインサートの全ヌ
クレオチド配列は、Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒ
ｔ法（Ｍｅ　ｔｈ　。

Ｅｎｚｙ＋ｎ、　６５．４９９〜５６０．（１９８０）
）；ならびにニブオキシヌクレオチド鎖末端法（Ｓｍｉ
ｔｈ、　Ａ、　Ｊ、　Ｍ、　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍ、　６５．５６０〜５８０．　（１９８０）
　）にて決定された。

ｃＤＮＡインサートの制限酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断図を第１図及び第２図（ａ）に示す。第２図（ａ
）に示すごとく、このｃＤＮＡはそれぞれＢｓｔＮｌ、
　Ｘｂａ　Ｉ　、　ＢｓＬＮ　Ｉなる制限酵素エンドヌ
クレアーゼで切断される構造を有する。

本ｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列は一つの大きなオー
プンリーディングフレームを保有する。真核生物の読み
取り開始配列となることの多い第一のＡＴＧ配列（Ｋｏ
ｚａｋ、　Ｍ、　Ｃｅ１ｌ、■、　１１０９〜１１２３
（１９７８）　）は、５゛一端から４８−５０ヌクレオ
チド位に存在し、読み終り配列ＴＧＡが存在するヌクレ
オチド位５０７−５０９迄１５２の配列がこのＡＴＧに
つながっている。１ＩＲＮＡの３’−ｐｏｌｙ（Ａ）末
端に相当するＡのつながりがｃＤＮＡ末端に見出され、
通常真核生物ｍＲＮＡのほとんどに見出される６個から
なるヌクレオチドＡＡＴＡＡＡ　（７７１−７７６位）
が先に位置する。

（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、　Ｎ、Ｊ、　＆　Ｂｒｏｗｎｌ
ｅｅ　Ｃ，Ｇ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２６３゜２１１−２
１４．　（１９７６）） ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列は第２図（
ｂ）（アミノ酸配列ｌ）のどと（演えきでき、しかもア
ミノ酸配列Ｉのポリペプチドは１５３個のアミノ酸から
なり、その分子量は１７６３１．７ダルトンと計算され
る。今日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると
報告されているように（ＢｌｏｂｅｌＧ、　ｅｔ　ａｌ
、　５ｙｎｉ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　’
４．９〜３６（１９７９））、上記演えきＩＬ−２ポリ
ペプチドのＮ末端領域はやはり疎水性である。本領域は
成７ｆｉｌｌ、−２の分泌時に切断されるシグナルペプ
チドの役割を果しているであろう。切断は２０−２１位
のＳｅｒとＡｌａ間で起るか２１−２２位間のＡｌａ−
Ｐｒｏ間で切断され、アミノ酸配列■および■を有する
ポリペプチドを生成する。何故ならば同様な切断位置は
今迄知られたその他の分泌蛋白にもしばしば見出されて
いるからである（Ｂｌｏｂｅｌ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、
　Ｓｙｍｐ、　Ｓｏｃ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、　３３．９〜３６（１９７９））、従って、
成熟ＩＬ−２ポリペプチドは１３３ないし１３２個のア
ミノ酸から成り、分子量は１５４２０．５または１５３
４９．４ダルトンと算出される。本分子量値はジュルカ
ット細胞から得られたヒトＩＬ−２蛋白の分子１　（１
５（１００ダルトン）として報告されたものを対比され
る（Ｇｉｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ、、　６３＋　６７〜２０９　（１
９８２）　）。また実施例３に示すごとく塩基配列１１
１〜１１３位にあるＣＣＴ配列から始まるＤＮＡ画分、
即ち、２２位に位置するＰｒｏから始まるポリペプチド
に対するコード（第２（ｂ）図中のアミノ酸配列■）は
■シー２活性を有するポリペプチドを表現していること
が確認された。塩基配列１０７〜１１０位にあるＧＣＡ
から始まるＤＮＡ画分、即ち第２（ｂ）図のアミノ酸配
列■に示すごとく、２１位に位置するＡｌａから始まる
ポリペプチドをコードするＤＮＡ画分は、実施例６に示
すごと＜　ＴＬ−２活性を有するポリペプチドを表現し
ていることが確認された。

有核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子でも知
られている様に多形現象を示すことが知られている（呑
口ら、　Ｇｅｎｅ　ＪＪｌ、　１１〜１５（１９８０）
、大野、呑口、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　７７＋５３０５〜５３０９（
１９８１）；　Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ
　釘匝、　５０１〜５０８　（１９８１））　、この多
形現象によって、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置
換される場合もあれば、塩基配列の変化はあっても全く
変らない場合もある。ヒトＩＬ−２・ｃＤＮＡの場合、
ｐｌＬ−２−５０Ａ　ｃＤＮＡの５０３位のＡ残基がＧ
残基で置き換えられた他のｃＤＮＡクローン（ｐｌＬ−
２−５０３）も検出できる。ｐ　Ｉ　Ｌ２−５０Ａ　ｃ
ＤＮＡとは塩基配列が異なるその他のｃＤＮＡクローン
の存在も期待できる。

上記説明からも明らかなごとく、本発明に係る遺伝子は
、第２（ａ）図に示された塩基配列を有するＤＮＡ、４
８−５０位のＡＴＧ配列から始まり、５０４〜５０６位
にある少くともＡＣＴ配列に至る連続塩基配列を有する
ＤＮＡ５．１０８−１１０位のＧＣＡ配列から始まり、
ＧＣＡ配列から少くとも、Ａ（、ＴＩＦ己刊に至る連続
塩基配列を有するＤＮＡ、また１１１−１．１３位のＣ
ＣＴ配列から少くともＡＣＴ配列に至る連続塩基配列を
有するＤＮＡを包含する。本発明に係る遺伝子はまた、
５０４〜５０６位のＡＣＴ配列に終り、１位のＡに始ま
るＤＮＡ、４８−５０位のＡＴＧで始まるＤＮＡ、　１
０Ｂ−１１０位のＧＣＡ配列で始まるＤＮＡ又は１１１
−１１３位のＣＣＴ配列で始まるＤＮ＾を包含する。更
に本発明に係る遺伝子は、５０７〜５０９位のＴＧＡ配
列に終り、１位のＡに始まるＤＮＡ、４８〜５０位のＡ
ＴＧ配列で始まるＤＮＡ、　１０８〜１１０位のＧＣ八
へ列で始まるＤＮＡまたは１１１〜１１３位のＣＣＴ配
列で始まるＤＮ＾を包含する。更に本発明に係る遺伝子
は、８０１位のＣで終り、１位のＡで始まるＤＮＡ、　
４８−５０位のＡＴＧで始まるＤＮＡ、　１０８−１１
０位のＧｅ八で始まるＤＮＡまたは１１１−１１３位の
ＣＣＴ配列で始まるＤＮＡを包含する。

本発明に係る遺伝子はまたｐｏｌｙ（Ａ）で終り、４８
−５０位のＡＴＧ配列から始まるＤＮＡ、　１０Ｂ−１
１０位のＧＣΔ配列で始まるＤＮＡまたは１１１−１１
３位のＣＣＴ配列で始まるＤＮＡを含む。また、本発明
は、アミノ酸配列１．ＴＩ。

ｍに相当する塩基配列を有する遺伝子を含む。アミノ酸
配列■の中で１個ないしそれ以上のアミノ酸を欠くポリ
ペプチド、あるいはアミノ酸配列Ｉの中の１個ないしそ
れ以上のアミノ酸が１個ないしそれ以上のアミノ酸で置
換されたポリペプチドはＩＬ−２活性を有することもあ
り、従ってこの様なポリペプチドをコードする遺伝子は
本発明に係る遺伝子として使える。同様にアミノ酸配列
１．ＩＩまたは■に対して１個ないしそれ以上のアミノ
酸を表現し得る１個ないしそれ以上の塩基を余分に結合
した遺伝子であっても追加されたアミノ酸が、ポリペプ
チドのＩＬ−２活性発現に都度しない限り本発明の中に
包含される。ＩＬ−２としてのポリペプチド機能を阻害
する追加アミノ酸配列を有する修飾領域であっても新た
に追加された領域が容易に除去出来るものならば本発明
に係る遺伝子として利用出来る。同じことはアミノ酸配
列１．ＩＩおよび■に対応する遺伝子のアミノ酸配列Ｉ
、■および■のＣ−末端にアミノ酸追加をコードするＤ
ＮＡが３゛−末端に追加結合せしめたＤＮＡの場合にも
言える。従って、この様なポリペプチドをコードする遺
伝子の利用は、本発明に包含される。

宿主生細胞中でＩＬ−２産生をする組換えＤＮＡ体によ
り形質転換された原核生物細胞あるいはエシェリヒア・
コリは、次の各種方法で作られる。例えば、ＩＬ−２・
ｃＤＮＡをコードする配列を発現ベクターのプロモータ
ー配列下流に挿入する。あるいはプロモーター配列を持
つｃＤＮＡ片を発現ベクターのｃＤＮＡ挿入の前あるい
は後にＩＬ−２をコードする配列の上流に挿入すること
が出来る。

ＩＬ−２−ｃＤＮＡを発現し、ＩＬ−２−ポリペプチド
を産生ずる原核生物あるいはエシェリヒア・コリの造成
法を詳述すれば以下の通りである。

（１）　　エシェリヒア・コリによるＩＬ　　２−ｃＤ
ＮＡの発現 エシェリヒア・コリ中でＩＬ−２−ｃＤＮＡを発現させ
るには、先ずｃＤＮＡを各種細菌プロモーターと結合せ
しめた後、プロモーター下流にｃＤＮＡを含有するバイ
ブリドプラスミドを作る。このプラスミドを、例えばエ
シェリヒア・コリＨｎ１０１に感染させ、ヒ１−ＩＬ−
２活性を有する蛋白を生合成する細菌がクローンされる
。本来細菌のプロモーターならば如何なるものでもｃＤ
ＮＡに適当に接続されていればＴＬ−２−ｃＤＮＡを発
現する。この様なｃＤＮＡの発現例は以下のとおりであ
る。

ＩＬ−２をコードするクローン化ｃＤＮＡは第２図に示
される様な１５３個のアミノ酸からなるポリペプチドを
コードする。本ポリペプチドの２０個のアミノ酸に相当
するＮ−・末端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分
泌蛋白の特徴でもある。この様な疎水性配列はシグナル
配列と称し分泌過程で切断される。故に、成熟ＩＬ−２
ポリペプチドは、１５３個のアミノ酸より少ない筈であ
る。このことから、成熟ＩＬ−２ポリペプチドをコード
するｃＤＮＡ部分を発現させることが望ましく、ＩＬ−
２シグナル配列相当部分を発現させるのは望ましくはな
い。

（ｉ）　　プラスミドベクターｐＴｒＳ−３の構築ｐＴ
ｒＳ−３は、エシェリヒア・コリＴｒｐプロモーターを
含み、ｐＴｒＳ−３のリーダーペプチドのためのリポソ
ーム結合部位（ＳＯ配列）は既に報告されている（Ｇ、
　Ｍｉｏｚｚａｒｉ　ａｎｄ　Ｙａｎｏｆｓｋｙ　Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３３゜１４５７〜１４６６
　（１９７８）　）、ＳＤ配列の下流１３塩基対にある
ＡＴＧコードンの存在も報告されている（Ｎｉｓｈｉ　
ｅｔａｌ、生化学５４．　Ｎｏ、８．６７６　（１９Ｂ
２））。このプラスミドベクターはまた、ＡＴＧ開始配
列（第３図）の下流に一つのＳｐｈ　　ｒ部位を含んで
いる。

ＩＬ−２・ｃＤＮＡを発現させるため、先ずプラスミド
をｓｐｈ　　Ｉで消化しエシェリヒア・コリＤＮＡポリ
メラーゼＩ　（フレノウ（Ｋ１．ｅｎｏｗ）フラグメン
ト）または、バクテリオファージＴ４　ＤＮΔポリメラ
ーゼ■で処理し３゛−位突き出し末端を除去する（第４
図（ａ））。プラスミドｐｌＬ−２−５ＯＡをＰｓｔ　
　ＩおよびＨｇ１ＡＩで２回消化し、より大きいｃＤＮ
Ａ画分を単離する。

次いでＤＮＡをエシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ　（フレノウフラグメント）又はバクテリオファージ
Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理して３゛−突き出し末
端を切りはなす。この処理°をしたｃＤＮＡは１３２個
のアミノ酸のＩＬ−２ポリペプチドをコードする（第４
（ａ）図）。このｃＤＮ＾を上述のごとく前処理したｐ
ＴｒＳ　　３プラスミドＤＮＡに結合せしめ、ＡＴＧ開
始コードンをＩＬ−２ｃＤＮ＾のＣＣＴ　（Ｐｒｏ）配
列につなぎ合せる。こうしてプラスミドｐｒ　ＩＬ−２
−２２が得られる。　Ｔｒｐプロモーター配列とｐＴ　
ＩＬ−２−２２のＩＬ−２ｃＤＮＡ配列の結合は第４（
ａ）図に示す。

プラスミドｐＴ　ＩＬ−２−２２はエシェリヒア・コリ
によりプロリンから始まる１３２個のアミノ酸からなる
ＩＬ−２ポリペプチド合成を指令する。

（ｉｉ　）成熟ＩＬ−２はプロリンの代りにＮ−末端ア
ミノ酸としてアラニン（２１位）を含むこともあり、１
３３個のアミノ酸から成るＩＬ−２ポリペプチド合成を
指示するプラスミドを以下の如く作ることができる。

プラスミドｐＴｒＳ−３はＳＤ配列とＡＴＧ配列との間
に１つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位がある（第３図）。本プ
ラスミドはＣ１ａ　　ＴとＳａｌ　　！で切断される。

プラスミドｐｌＬ−２−５ＯＡをＰｓｔ　　Ｉで部分分
解し、エシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼｒで処理
し、最も長いＤＮＡを単離する。次いでＤＮＡを制限酵
素Ｘｈｏ　　Ｉ切断部位を含む合成りＮＡリンカ−と結
合させ、ＩＬ−２をコードする配列の３゛−側下流にＤ
ＮＡリンカ−を導入したプラスミドｐｌＬ−２−５ＯＡ
　（Ｘｈｏ）を含むクローンを単離する。プラスミドｐ
ｌＬ−２−５ＯＡ　（Ｘｈｏ）を先ｆｌ１ｇｉＡｌで切
断し、エシェリヒア・コリ　フレノウフラグメントまた
はＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、Ｘｈｏ　　Ｉで
消化すればｃＤＮ八両へが単離できる。

このｃＤＮＡフラグメントをＣ１ａ　　ＩおよびＳａｌ
　　Ｉで前処理したｐＴｒＳ−３ＤＮＡに結合させ第４
（ｂ）図の如（合成りＮＡにつなげる。かくしてＡｌａ
からスタートする１３３個のアミノ酸から成るＩＬ−２
ポリペプチドをエシェリヒア・コリ中で合成させるプラ
スミドｐＴＩＬ−２−２１が得られる。（第４（ｂ）図
）。同様なことはＸｈｏ　　ｌリンカ−を使用しなくと
も作られる。

（ｉｉｉ　）異ったＮ−末端アミノ酸を有する異った大
きさのＩＬ−２ポリペプチドはｐＴｒＳ−３発現プラス
ミドベクターを用いても作られる。以下に示すごと＜　
、ｐＩＬ−２−５ＯＡにクローンされたＩＬ−２ｃＤＮ
Ａはヌクレオチド結合部位８１−８５に唯一つだけＤｄ
ｅ　　１部分を有する。プラスミドｐｌＬ−２−５０八
（Ｘｈｏ）を、Ｄｂｅ　　Ｉで切断し、ｃＤＮＡのより
大きい区分を含有するＤＮＡ画分を単離する。本画分は
ｐＢ１２３２２より３（１００塩基対を有するＤＮＡを
含んでいる（第４（ｃ）図）。

ＤＮＡ画分をエクソヌクレアーゼＢａｌ　３１で処理し
、次いでＸｈｏ　　ｒで切断する。ここで得られたＤＮ
Ａをｓｐｈ　　Ｉで切断したｐＴｒＳ−３と結合せしめ
、Ｋｌｅｎｏ−フラグメントまたはＴ４　ＤＮＡポリメ
ラーゼで処理し次いでＳａｌ　　ｌで消化する（第４（
ｃ）図）。つなぎ合せたＤＮＡをエシェリヒア・コリＪ
ＩＢ　１０１に感染させ、ヒトＩＬ−２を発現するクロ
ーンを検索する。これらのクローンは偽色な大きさのヒ
目Ｌ−２を発現する筈である。何故ならばヒトＩＬ−２
のＮ−末端領域に相当するＤＮＡは種々切断除去される
からである。か（してＩＬ２　ｃＤＮＡを含有するｐＴ
ＩＬ−２−１４と１５が得られる。

（ｉｖ）　ＩＬ　−２ｃＤＮＡはまたｐＫＴ　２１８　
（Ｔａｌｍａｇｅより提供を受けた；　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

？？、　Ｐ、３３６９〜３３７３　（１９８０）　）を
用いても発現可能である。プラスミドＰＫＴ　２１８は
Ｐｓｔ　　Ｉで切断し、ｐＩＬ２−５０Ａをｌｌ５ｉＡ
　Ｉ　、ｌ！：Ｐｓｔ　１で切断（第５図）して得たＩ
Ｌ−２ｃＤＮＡ挿入部分とつなぎ合わせる。出来上った
プラスミドｐＫＩＬ−２−２１は第５図に示したように
、蛋白合成開始の始発位に配列を有している。

したがって、このプラスミドｐＫＩＬ−２−２１はｒＬ
−２の１３３個のアミノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ
酸からなる両者が融合したポリペプチドからなり、これ
をエシェリヒア・コリ中で合成することが出来る筈であ
る（最初のメチオニンはエシェリヒア・コリでは切断除
去される）。

（ｖ　）　ｐ−ＢＲ・３２２にｔｕｆＢに対するプロモ
ーター配列を挿入したプラスミドｐＴｕＢＩｐ−５の発
現は既に行なわれている（呑口ら、生化学５３９６６（
１９８１））。

このプラスミドは一つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位を含み、
第６図に示すごとく本切断部位はＳＤ配列の２塩基対だ
け下流に位置する。ｐＴｒＳ−３もまたＳＯ配列とＡＴ
Ｇ始発配列の間にある一つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位を含
み、同時にこのＣ１ａ　　Ｉ部位はｐＴｒＳ−３とＩＬ
−２ｃＤＮＡを用いて発現用プラスミドを作る過程で壊
されないので細菌ＴｒｐプロモーターをｔｕｆＢプロモ
ーターで置き換えることは極めて簡単である。従ってヒ
トＩＬ−２ｃＤＮＡはｔｕｆＢプロモーターの制御下で
発現される。例えばｐＴＩＬ−２−２２をＣ１ａ　　ｒ
とＰｖｕ　Ｉ［で切断し、ＩＬ−２ｃＤＮＡを含むＤＮ
Ａ画分を分離する。

次いでこの両分をｐＴｕＢＩＰ−５でつなぎ合わせ、Ｃ
１ａ　　ＩとＰνｕＩＩで予め切断後、第６図に図示さ
れる様にプラスミドｐＴｕＩＬ−２−２２が造成される
。ＩＬ−２活性はプラスミドｐＴｕｌＬ−２−２２を含
むエシェリヒア・３１月ＩＢＩＯＩの抽出液に検出でき
る。

（ｖｉ）例えばｐＴＩＬ−２−２１を使っても、また基
本的にはｐＴｒＳ−３を用いて達成したすべての発現用
プラスミドを用いることによっても同様に造成できる。

また例えばｐＴｕｌＬ−２−２２をＣ１ａ　　Ｉで切断
し、Ｂａ１３１またはＳＩまたはＤＮ＾ポリメラーゼ■
　（エシェリヒア・コリ）にてＤＮＡの塩基対２−３個
を除去または補充し再度プラスミドをつなげることによ
ってＳＤおよびＡＴＧ配列の距離を至適の長さにするこ
とも可能である。

本発明の組換えＤＮＡ体により形質転換された原核生物
細胞、あるいはエシェリヒア・コリを培養して、組換え
ＤＮＡ体を増巾し、またはＩＬ−２ポリペプチドを生産
することができる。この培養は通常の方法で行なわれる
。

細胞内または細胞外に生産されたＩＬ−２は硫安沈澱、
塩類除去のための透析（常圧または減圧下）ゲル濾過、
クロマトグラフィー、等電点平板上濃縮、ゲル電気泳動
、高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記）
、（イオン交換、ゲル濾過並びに逆相クロマトグラフィ
ー）、及び色素結合担体、ＩＬ−２に対するモノクロー
ナル抗体を結合した活性化セファロース４Ｂ又はレクチ
ン結合セファロース４Ｂ等によるアフィニティクロマト
グラフィー等、公知の方法によって回収することができ
る。

ＩＬ−２の単離精製法はＷａ　ｔｓｏｎら（Ｊ、　Ｅｘ
ｐ、　Ｍｅｄ、。

１５０、８４９−８６０１９７９）、　Ｇ１１ｌｉｓ　
ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１２４、１９５４−１９６２（１９８０）、　Ｍｏｃｈ
ｉｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３９．１８５−２
０１（１９８０）、　Ｗｅｌｔｅ。

Ｋ　ｅｔ　ａｌ＋　Ｊ、　Ｋｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１５
６．４５４−４６４（１９８２））によって報告されて
いる。

かくして得られたポリペプチドはマイトジェン刺激によ
って哺乳動物細胞から作られるＩＬ−２について知られ
ているものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し
ＩＬ−２活性を有する。分子量は約１５（１００ダルト
ンでありＩＬ−２活性は、Ｉｇｓｏｒｂ（Ｅｎｚｙｍｅ
　Ｃｅｎｔｅｒ）の様な免疫吸着剤の有無にかかわらず
完全に中和され、またはモノクローナル抗ＩＬ−２抗体
で沈澱した。免疫電気泳動において、ＩＬ−２ポリペプ
チドは、対応する抗ＩＬ−２抗体に対して唯１個の沈降
線を示す。ＩＬ−２活性は２メルカプトエタノールで還
元後も安定であり、口ＮＡｓｅ及びＲＮＡ５ｅ処理して
も、又５６°Ｃ１３０分熱処理しても安定である。活性
はｐＨ２〜９で安定である。この様にして生産されたＩ
Ｌ−２はモノクローナルな機能を有するＴ細胞（細胞障
害性Ｔリンパ球）の増殖を促進し、胸腺細胞の***を強
め、更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特異的細
胞障害Ｔリンパ球への分化を惹き起こす。また、ＹＡＣ
−１細胞やＲＬ　　１細胞に対するナチュラルキラー細
胞の活性化の増強に役立つ。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１ （１）　　ヒｌ−Ｔ細胞系白血病細胞株であるジュルカ
ット細胞（日本、***および米国では自由に入手可能で
ある）を１０％ｐｃｓを含むＲＰ旧１６４０培地にけん
濁し、Ｘ線照射装置Ｅｘｓ　１５０／３（１０−４（東
芝・日本）により５０秒間、室温で１０．（１００レン
トゲンに達するまで照射した。その後照射された細胞は
上述の培地中、初期細胞密度ｌＸｌ０’個／ｄで５％炭
酸ガス、３７°Ｃのインキュベーター中で５日間培養し
た。

この変異細胞（０，２個／穴）を９６穴の平底のマイク
ロプレートの１０穴にまき、５％炭酸ガス、３７°Ｃの
インキュベーター中で２１日間培養した。

生育してくる穴から得られるクローンはクローン量を増
加させるため新たな培地へ移し、その増加したクローン
はＣｏｎＡ　　５０μｇ／ｄ存在下で初期細胞密度ｌＸ
ｌ０”個／　ｍｌで２４時間培養した。そしてＩＬ−２
活性は前述の方法に従って測定した。

この結果、ジュルカット−１１１（ＡＴＣＣＣＲＬ８１
２９）　（以後゛″Ｊ−１１１”と称する）と命名され
たヒトＴ細胞株が親株のシェルカットからクローン化、
選択され、この細胞のＩＬ−２産生能は親株の４０倍に
増加していた。

このクローン化したＪ−１１１細胞株は通常条件下で増
殖し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとん
ど同じであった。

（２）Ｊ−１１１細胞（ＩＸＩＯ５個／ｄ）を無血清合
成培地ＲＩＴ　Ｃ５５−９（Ｓａｔｏ、　Ｔ、　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｅｘｐ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　１３８．１２７−１３４．　（
１９８２））　１０１（１０Ｏ！に接種し、ローラー培
養ボトル（ファルコン３０２７）内で３７°Ｃ１４日間
培養し、増殖した細胞を遠心分離により取得した。この
細胞を再び４　Ｘ　Ｉ　Ｏ’個／戚となるよう上述のＣ
ｏｎ＾２５μｇ／Ｉｄ含有培地に接種した。ローラー培
養ボトル（ファルコン）４バツチの各々に細胞を接種し
た培養液１（１０ｄを入れ、６時間回転培養した。

（３）　　このようにＣｏｎＡ　２５ｕｇ／１ａｉｌで
６時間刺激したジュルカット細胞（１，２Ｘ１０６）は
生理食塩−リン酸緩衝液（以後ＰＢＳと略す）　８．（
１００ｒｒｄｌに懸濁した。この細胞は遠心操作により
２回洗浄し、ヌクレアーゼ阻害剤であるリボヌクレオシ
ドーバナデイル複合体（１０ｍＭ）を含有するＲＳＢ溶
液（１０ｄトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，５、Ｌ　Ｏｍ
Ｍ　ＮａＣ１，１、５ｍＭ　ＭｇＣｌ　２）　８（１０
ｍ１に再懸濁した。その後、界面活性剤ＮＰ−４０を最
終濃度０．０５％となるように加え、ゆっくり混合し、
細胞核を３．（１００ｒｐｍ、５分、４　’Ｃ下で遠心
し分離した。５ＯＳ（０，５％）及びＥＤＴＡ　（５ｍ
Ｍ）を上清液へ加え、細胞質ＲＮＡを上清液と同量のフ
ェノールを加え抽出した。フェノールによる抽出を３回
繰返した後、ＲＮＡは２倍量のエタノールにより沈澱さ
れ、本沈澱物を遠心により集め、ｐＨ７，５の１１０１
１Ｉトリス−塩酸に溶解した。得られたＲＮＡ量は１９
６■であった。

ｍＲＮＡの分画はオリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｐ、　
Ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ＋　Ｔｙｐｅ　？）のアフィ
ニティークロマトグラフィーを使用し行った。吸着液は
２０＋ｉＭトリスー塩酸、０．５ＭＮａＣｊ！、１　ｓ
＋Ｍ　　Ｅ！ＤＴＡ及び０．５％ＳＯＳを含むｐＨ７，
５の溶液であり、？８出はカラムを緩衝液（２０ｍＭｌ
−リス−塩酸、ｐＨ７，５，０、５Ｍ　ＮａＣ／！、　
　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で洗浄後、水と１０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７，５）で交互に行った。溶出により得られ
たｍＲＮＡは３．６■であった。次にこの得られたｍＲ
ＮＡ　２．４■を蔗糖密度勾配遠心法（５０ｍＭ）リス
−塩酸、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２　Ｍ　ＮａＣｆを
含むｐＨ７，５の溶液中で蔗糖密度勾配５−２５％、２
６，（１００ｒｐｎ＋で４°Ｃ下２４時間）により分画
した。ｍＲＮＡの１１から１２３が分画Ｎｏ、　１２．
１３．１４へ分画され、各々５９μｇ、４６μｇ１６０
μｇであった。

（４）Ｎα１３の分画に得られたｍＲＮＡをアフリカツ
メガエルバ並並旦畑μ匡吐の卵母細胞へ注入した（　５
０　ｎｇ　ｍＲＮＡ／卵母細胞）、この卵母細胞の培養
液をＩＬ−２活性測定した。表１に示す如く、３Ｈ−チ
ミジンＣＨ−ＴｄＲ）の取込みの上昇及び活性化Ｔリン
パ球数の増加が確認され、明らかにこの分画中のｍＲＮ
ＡはヒトＩＬ　　２　ｍＲＮＡを含んでいる事が立証さ
れた。

表１ （ａ） 分画１３の翻 訳生成物 ×　　８ ×３２ １４．６８３ １０．１６５ （ｂ） 分画１３の翻 訳生成吻 ×　　２ ＊　単位は標準ＩＬ−２（１０単位／成）の″ＩＩ−Ｔ
ｄＲ取込み量と比較する事により算出した。

（５）その後ＩＬ−２ｎ＋ＲＮＡを含む１１〜１２Ｓ　
ｍＲＮＡのＮα１３分画からｉｎ　ｖｉｔｒｏでｃＤＮ
Ａを合成した。

組換え体ＤＮＡはプラスミドベクターｐＨＲ３２２と構
成した。岨換え体ＤＮＡをエシェリヒア・コリに形質転
換し、ＩＬ−２ｃＤＮＡクローンを獲得したクローンを
以下に示す如き方法により選択した。

（５−１）　５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
５）、３０ｍＭ　ＮａＣｊ！、６ｎ＋Ｍ　ＭｇＣｊ２．
　、５ｉＭジチオスレイトール（以後ＤＴＴと略す）、
０．５ｍＭの各ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、　ｄ
ＴＴＰ　（ｄＣＴＰはｚｚｐ放射標識したものを含む）
、０．１μｇ　オリゴ（ｄＴ）　＋　ｏ、１０ｄｇｍＲ
Ｎ＾及び１５単位＾ＭＶ逆転写酵素（Ｊ、　’Ａ、　Ｂ
ｅａｒｄ）を混合し、４１゛Ｃ下で９０分保った。反応
終了後、ＤＮＡはフェノール処理後エタノール沈澱物と
して回収し、このＤＮＡを２０１１ＩＭトリスおよび１
　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むｐＨ７，５の溶液に溶解した。

５ｓ−ｃＤＮＡ　２．５μｇが合成された。本反応液よ
り５ＲＮＡを除くために反応液にＮａ０Ｈｉ液を加え′
て０、３３　Ｎ　ＮａＯＨ溶液とし、室温にて１５時間
置き、次いでｐＨ７，５のＬＭ）リス−塩酸緩衝液を同
量加えて中和しセファデックスＧ−５０カラムをカラム
を通した。回収されたｃＤＮＡは１．８μｇであった。

（５−２）５０ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
１０ｍＭ　ＭｇＣｆｚ　、１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．７５
ｎ＋Ｍの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴ
Ｐ　（ｄＣＴＰはＨで標識したものを含む）、１．８μ
ｇ　５ｓ−ｃＤＮ八および８単位ポリメレースｌ　（Ｂ
ＲＬ、米国）を混ぜ１５時間、１５°Ｃで反応を行った
。反応終了後ＤＮＡをフェノール及びクロロホルム処理
後エタノール沈澱物として回収した。１．１０ｄｇのｄ
ｓ　−ｃＤＮＡが生成した。５０ｍＭ酢酸ソーダ（ｐ）
Ｉ　４．５）　、０．２Ｍ　ＮａＣｆ、　１ｍＭ　Ｚｎ
Ｃｆｚおよび１．１０ｄｇ二木鎖ｃＤＮへの混合物を３
７゛Ｃで３０分間インキュベートした後０．２５単位の
ヌクレアーゼＳ、（三井、日本）を加え、さらに１５分
間インキュベートした。反応終了後、フェノール処理を
２回行った反応生成物をセファデックスＧ−５０へ供し
、二本鎖ｃＤＮ八〇、５５μｇを得た。

（５−３）０．１４Ｍカコジル酸カリウム、３０１　ト
リス塩基、０．１＋Ｍ　ＤＴＴ、　　１ｍＭ　ＣｏＣｊ
２ｚ、０．６４ｍＭ　”Ｐ−ｄＣＴＰ　（比活性２．７
　Ｘ　１０　’　ｃｐｍ／ｎ　ｍｏｌ）、０、５５１１
　ｇ　ｄｓ−ｃＤＮＡおよび５単位のターミナルトラン
スフェラーゼ（ＢＲＬ）を混合し、３７°Ｃで７分間イ
ンキュベートした後フェノール処理し、次いでセファデ
ックスＧ−５０カラムに供し、エタノール沈澱物として
０．５０ｄｇ　ＤＮＡを得た。回収したこのＤＮＡは約
５０個のｄＣＭＰ残基が両３″末端に付加されている事
が判明した。

ｐＢＲ３２２ＤＮＡ　Ｉ　０８ｇを制限酵素匡Ｉで切断
したのちｄＣＴＰのかわりにｄＧＴＰを用いたこと以外
は前述のｄｓ−ｃＤＮＡにｄＣＭＰ鎖を付加したときに
用いた方法と全く同じ条件により、切断したＤＮＡの両
３゛末端にｄＧＭＰ鎖を付加した。

（５−４）５０ＩＩＩＭトリスー塩酸（ｐＨ７，５＞０
、１　Ｍ　ＮａＣ！！、、５　ｍＭ　ＤＥＴＡ、　０．
０５　ｕ　ｇ　ｄＧＭＰ残基付加ｐＢＲ３２２および０
．０１ｄｇ　ｄＣＭＰ残基付加ｃＤＮＡをまず６５°Ｃ
で２時間、次いで４６°Ｃで１２０分間、さらに３７°
Ｃで６０分間、そして室温で６０分間インキュベートし
た。

エシェリヒア・コリｚ　１７７６（Ｃｕｒｔｉｓｓ　ｍ
　、　Ｒ，ｅｔａｌ、、　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　ｏｆ　　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ　　ＤＮＡ。

（−６八、　　５ｃｏｔｔ　　＆　　Ｒ６Ｗｅｒｎｅｒ
　　ｅｄ、）　　八ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ。

（１９７７）’）を５０ｄのし培地（１（１０ｇ　ｇ　
／　ｍｆｌのジアミノピメリン酸、５０ｄｇ／１ｒｄｌ
のチミジン、１％トリプトファン、０．５％酵母エキス
、０．５％ＮａＣ１および０．１％グルコースを含む）
に接種し培養液の吸光度が５６２ｎｍで０．３付近にな
るまで３７°Ｃで振とう培養した。培養終了後、培養液
を３０分間Ｏ′Ｃに保持し、菌体を遠心分離により集め
、５ｍＭ）リス−塩酸（ｐｌ＋　７．６　）　、０．１
　Ｍ　ＮａＣ１，５ｍＭＭｇＣｊ！ｚおよびＬ　ＯｍＭ
　Ｒｈ（、ｅを含む溶液２５ｍ２で２回洗浄した。

得られた菌体を５ｒａＭトリスー塩酸（ｐＨ７，６）、
０．２５　Ｍ　　ＫＣｊ２．５ｍＭ　ＭｇＣｆｚ　、０
．１　Ｍ　ＣａＣ１ｚおよび１０ｍＭ　ＲｂＣｆｆ１を
含む溶液２０ｍ１に懸濁し、０゛Ｃで２５分間静置後、
菌体を集め上記と同じ溶液１ｍｉ！に菌体を再懸濁し、
得られた菌体懸濁液の０．２７に上記組換え体ＤＮＡを
入れ、０°Ｃで６０分間装置した。その後り培地０．１
ｍｌを加え３７゛Ｃで３０分間振とう培養した。こうし
て得られた培養液（０，１ｍ）をｉ　ｏ　ｏ　ｔｔ　ｇ
／ｌｎｌジアミノピメリン酸、５０μｇ／ｍ１チミジン
および１５μｇ／戚テトラサイクリンを含むし培地の１
．５％寒天培地上に一面に塗抹し、３７°Ｃで２日間イ
ンキユベートシた。

（５−５）出現した４３２のコロニーを１８のグループ
に分け、（その各グループは２４の異なるバクテリアク
ローンを含む）１（１０μｇ／−のジアミノピメリン酸
、５０μｓ／ｄのチミジンおよび１０μｇのテトラサイ
クリンを含むＬ培地２（１０　ｔｎｌに接種し、３７°
Ｃで５〜７時間振とう培養した。次に最終濃度１７０μ
ｇ／ｒｔｄｌとなるように加えられたクロラムフェニコ
ールを含む新たなし培地２（１０−を加え、さらに−晩
培養した。

このようにして増強されたプラスミドＤＮＡを常法に従
い精製した。

ｒＬ−２ｃＤＮＡを有するクローンはｌｌｌＲＮＡハイ
ブリダイゼーションートランスレーシゴンアッセイ（以
後Ｈ−Ｔアッセイと略称する）により選択した。

ここで用いられたＨ−Ｔアッセイは以下に示す如く行っ
た。

純化したＤＮＡ（２５Ｈｇ）を制限酵素旧ｎｄＩＩ［に
より開裂しフェノールで３回、フェノール−クロロホル
ムおよびクロロホルムで各々処理し、エタノールで沈澱
させ８０％エタノールで洗浄し、８０％ホルムアミド４
０ｄに溶解した。

反応液を変性させるため９０°Ｃで５分間加熱後１０　
Ｘ５ＳＣ（１，５Ｍ　ＮａＣ１，０，１５Ｍ　　クエン
酸ソーダ）で１．３ｍｌに希釈した。その後、零〇Ｎ＾
をニトロセルロース濾紙上に固定し、これを８０°Ｃで
３時間乾燥させ、５０％ホルムアミド、２０ｍＭ　Ｐｉ
ｐｅｓ（ｐＨ６，５）、０．７５　Ｍ　ＮａＣｌ！、、
５１１＋Ｍ　ＥＤＴＡ、０．２％ＳＤＳ及びＪ−１１１
細胞由来のｐｏｌｙ　（Ａ）　ｍＲＮＡ２５０μｇを含
む溶液中で３７°Ｃ１１８時間インキュベートし、濾紙
上に固定されたＤＮＡとＩＬ−２ｍＲＮＡをハイブリダ
イズした。

次にその濾紙を６５°Ｃで３回ｐ）１６．５の１０ｍＭ
Ｐｉｐｅｓ＋　０．１５　Ｍ　ＮａＣ１溶液、１ｍＭ　
Ｐｉｐｅｓ、　　１０ｅｉＭＮａ（／！ｉ液で洗浄し０
．５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％ＳＯ３溶液で９５°
Ｃ１１分間処理し濾紙からハイブリダイズしたｍＲＮＡ
を回収した。

このようにして抽出したｍＲＮ＾を常法に従ってオリゴ
ｄＴ−セルロースカラム上で精製し、アフリカッメガエ
ル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のＩＬ−２活性を
測定した。

各々２４クローンからなる１８グループのうちの１グル
ープが前述の３Ｈ−ＴｄＲ取込みによるアッセイで４８
単位／ｌｌ１１のＩＬ−２活性陽性を示した。

一方他のグループは明らかに陰性であった。

次に、陽性のグループに属する２４の各単一コロニーを
既述と同じ組成のし培地２（１０＋ｄへ接種し、３７”
Ｃで５〜７時間好気的に培養し、同様にクロラムフェニ
コール含有のＬ培地をさらに添加した。

一晩培養して、プラスミドＤＮＡを増強後、プラスミド
ＤＮＡを同様に標準法に従って精製した。■ｍｌ旦で各
プラスミドＤＮＡ約５μｇを開裂後、各プラスミドを同
様にニトロセルロース濾紙へ固定した。

その濾紙をＩＬ−２ｎ＋ＲＮＡとハイブリダイズし、ハ
イブリダイズしたｍＲＮＡをアフリカッメガエル卵母細
胞へ注入し、翻訳された蛋白のＩＬ−２活性を測定する
ため回収した。

表２に示す如く、ｐ３τ１６と表示した単一コロニーか
ら精製されたプラスミドＤＮＡのみが陽性のｒＬ−２活
性を示した。それ故、本クローンがＩＬ−２ｃＤＮＡを
有するクローン（旦、　ｃｏｌｉ　　ｚ　１？７６／ｐ
３　１６ＡＪ１１９９５　（ＦＥＲＭ−ＢＰ−２２５）
）と同定された。このようにプラスミドＤＮＡ、　ｐ３
−１６はＩＬ−２ｒｓＲＮＡと特異的ハイブリッドを形
成する能力のあるＤＮＡ（ＩＬ−２遺伝子）を確かに有
している事が確認された。

表２ （ａ） ｍＲＮＡの翻訳 生成物 ×　　２ Ｘ３２ ２０．９６１ （ｂ） ｍＲＮＡ”の翻訳　　Ｘ２　　　　　８８３２生成物　
　　　　Ｘ３２　　　　　４２＊　プラスミドｐ３−１
６からのｃＤＮＡとハイブリダイズしたｍＲＮＡ プラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡインサートは制限酵素
Ｘｂａ　　Ｉにより１部位で、又Ｂｓｔ　ＮＩにより２
部位（Ｘｂａ　Ｉ開裂部位の上流及び下流）で切断され
るという特徴を示した。しかしながら、プラスミドｐ３
−１６は約６５０塩基対より構成されるｃＤＮ＾インサ
ートを含んでおり、これは明らかに１１〜１２Ｓの大き
さのＩＬ　　２　ｍＲＮ＾の一部分に相当するものであ
る。それ故、他のｃＤＮＡライブラリーを、鋳型として
ＴＬ−２ｍＲＮ八を用い、Ｌａｎｄ等の方法（Ｌａｎｄ
ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、＋　ｖｏｌ　９＋　ｐ２５５１．（１９８１））に従
って作製した。−本ＩＪｃＤＮＡ　（１，６μｇ）を、
ｄＣＭＰ残基を付加したＩＬ−２ａ＋ＲＮＡ　４μｇを
用いて合成し、そしてｄｓ−ｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメ
ラーゼ■（Ｋｌｅｎｏ−断片）によりプライマーとして
オリゴ（ｄＧ）１２＝１８を用いる事により合成した。

６８０塩基対ＤＮＡサイズマーカー（ｓｉｚｅ　ｍａｒ
ｋｅｒ）より長いｃＤＮＡ（０，６μｇ）は蔗糖密度勾
配遠心法によって得られ、標準的なＧ−Ｃティリング法
によりｐＢＲ３２２のＰｓｔ　　Ｉ部位へ挿入出来た。

組換えＤＮＡ体によるエシェリヒア・コリ　χ１７７６
の形質転換後、その場所でプローブとしてニック翻訳さ
れた（ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）ｐ３−１６　
ｃＤＮ＾インサートを用いたＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏ
ｇｎｅｓｓのハイブリダイゼーション法により約２（１
００コロニーを選別し、およそ８５０塩基対を含むプラ
スミドｐｒｔ、　２−５０八を含有するコロニー及び形
質転換されたクローン（エシェリヒア・コリ　χ　１７
７６／ｐｌＬ　２−５０八、八Ｊ１１９９６（ＦＥＲＭ
−ＢＰ−２２６）　）を同定した。ｐｒＬ２−５ＯＡの
ｃＤＮＡインサートの制限酵素切断図を第１図に示した
。

形質転換されたエシェリヒア・コリ　χ１７７６／ｐｌ
Ｌ２−５ＯＡからのＩＬ−２ペプタイドをコードしてい
る遺伝子を単離するため、プラスミドＤＮＡを通常法に
従い、菌体からＤＮ＾を単離後制限酵素Ｐｓｔ　　Ｉに
より切断した。この処理により生成する２つのＤＮＡ断
片のうちより小さな断片はＩＬ−２ベプタイドをコード
しているＤＮＡ遺伝子であった。ｐｌＬ２−５ＯＡから
のＰｓｔ　Ｉインサートの完全なヌクレオチド配列はＭ
ａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔの方法（Ｍａｘａｍ
、　Ａ、　Ｗ、　ｅｔａｌ、、　Ｅｎｚｙｍ、　６５．
、４９９−５６０．１９８０）により決定した。全構造
を第２図（ａ）に示す。

実施例２ 実施例１に記載された方法に従ってジュルカット細胞か
らクローン化された構成的ＩＬ−２産生細胞株Ｊ−Ａ　
１８８６　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１３０）は同様にロー
ラー培養ボトルで生育した。生育した細胞は初期細胞密
度１×ＩＯｂ個／ｄで新鮮な合成培地ＲＩＴＣ−５５−
９に再懸濁し、培養開始８時間後に、実施例１で詳細に
示したステップに従って３Ｘ１０’個の細胞から１１〜
１２３分画としてのＩＬ−２，ＲＮＡ抽出のために使用
された。

ｄｓ−ｃＤＮＡは実施例１と同様に合成され、６（１０
塩基対より長いｃＤＮＡ（２，４ＩＩ　ｇ　）が蔗糖密
度勾配遠心法による分画により得られた。次にこのｃＯ
ＮＡをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエ
ラーゼを用い、ｄＣＭＰ残基で伸長し、その５０ｎｇが
ｄＧＭＰで伸長したＰｓｔ　　Ｉ切断ｐＢＲ３２２２５
０ｎｇとアニールされた。

生成したハイブリッドプラスミドはエシェリヒア・コリ
　χ１７７６に形質転換され、約４．（１００クロ二ツ
のトランスホーマントが得られた。

Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−！（ｏｇｎｅｓｓの方法に従い、
プローブとして用いたプラスミド３−１６　ｃＤＮＡと
相補的な３個のクローンが選択された。すなわち、この
ようにして選択された形質転換されたクローンはヒトＩ
Ｌ−２遺伝子を有するクローンである。

実施例３ エシェリヒア・コリ細胞でヒトＩＬ、−２の合成を指令
するプラスミドを以下の如き方法で構築した。

プラスミドｐＴ　ＩＬ２−２２は第４（ａ）図で図解さ
れている如く、一連の改変の方法によりｐＴｒＳ−３（
Ｎｉｓｈｉ　Ｔ。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ＥＩＫ
ＡＧＡＫＵ　ｕ、　９６７、　（１９８１）。

同５４．６７６（１９８２））及びＩＬ−２ｃＤＮＡを
含むｐＴＬ２−５ＯＡから構築した。プラスミドｐＴｒ
Ｓ−３はＴｒｐプロモーター　トｐＢＲ３２２のＥｃｏ
Ｒ１部位とＣ１ａ　　１部位の間に５ｈｉｎｅ　Ｄａｌ
ｇａｒｎｏ　（以後ＳＤと略号する）の領域の挿入を含
む。

本プラスミドはまた第３図で示した如く、単一のＳｐｈ
　　１部位と同様にＳＤ配列の下流１３ｂｐにＡＴＧイ
ニシェーションコードンを含んでいる。

言及している蛋白に対応するＤＮＡ配列がＡＴＧコード
ンの丁度下流の部位に挿入されるとそのベクターはこの
蛋白を生産するには非常に効果的である。

このＡＴＧコードンはｐＴｒＳ−３の力仇■消化に引続
きＴ４　ＯＮＡポリメラーゼによる処理によって生成さ
れる。それ故プラスミドｐＴｒＳ−３（３０μｇ）は制
限酵素鋤■で、常法により切断され、引続きフェノール
、クロロホルム処理、エタノール沈澱法により回収され
両末端が７４　ＤＮＡポリメラーゼ処理によりフラッシ
ュにされた。

次に、同様の方法によりフェノール、クロロホルム処理
及びエタノール沈澱法により［１ＮＡ（２１，４μｇ）
を回収した。他方ＩＬ−２ｃＤＮＡを含むｐＩＬ２−５
０＾３８０μｇはＰｓｔ　Ｉにより切断され、ＩＬ−２
ｃＤＮ＾インサートはアガロースゲル電気泳動により単
離された。ｃＤＮＡインサート（１１μｇ）は町１＾Ｉ
により切断され、Ｔ４　ＯＮＡポリメラーゼによって処
理され、大きい方の部分のＤＮＡｌ０μｇがアガロース
ゲル電気泳動により単離された。本性に従って１３２個
のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ　（７，２μｇ）が得
られ、このＤＮＡ断片はプラントエンドを有していた（
第４（ａ）図）。

次に、このようにして得られたｃＤＮＡ断片をＡＴＧ配
列の丁度下流で、前もって星　１により消化されたＴ４
　ＤＮへポリメラーゼにより処理されたｐＴｒＳ−３ベ
クターへ連結した。このように連結したプラスミドはそ
れから、常法に従いエシェリヒア・コリ１１８１０１へ
形質転換された。この連結は次のようにして行った。Ｉ
Ｌ　−２ｃＤＮＡ（０，４ｕ　ｇ　）の前述の大きい方
の断片およびｐＴｒＳ−３ベクターＤＮＡ０．２μｇを
６．６　ｍＭ　ＭｇＣｌ　ｚ、　１　ｍＭ　ＡＴＰおよ
び１０ｍＭ　ＤＴＴを含むｐ）１７．５の６６ｍＭ）リ
ス−塩酸中でＴ４　ＤＮＡリガーゼ０．８単位と共に混
合し、混合物を４°Ｃ１−晩反応させた。アンピシリン
を含むし培地寒天プレート上に出現するトランスホーマ
ントの中で、１３２個のアミノ酸をコードしているＩＬ
−２ｃＤＮＡ部分を含むプラスミドを持つコロニーをそ
の場でコロニーハイブリダイゼーションアッセイ法によ
り選択した。こうして選択したコロニーを再び培養（１
０ｉｆ）ｌ、、リゾチーム処理および凍結。

融解による処理によりプラスミドＤｌｔＡを調製した。

このプラスミドＤＮＡをｂ↓■とμｒａ　　Ｉで切断し
、その結果の生成物をアガロースゲル電気泳動により分
析し、ｃＤＮＡがｐＴｒＳ−３の＾ＴＧ配列の後に正し
い方向で凍結しているｐＴＩＬ−２−２２を同定した。

ｐＴＩＬ−２−２２を含むエシェリヒア・コリＨＢ　ｌ
（Ｈを微生物の増殖のために知られている通常法の下に
培養した。細胞は２５μｇ／ｍｌストレプトマイシンお
よび２５μｇ／ｍ１．のアンピシリンを含むχ培地（２
，５％バクトドリブトン、１％酵母エキス、０．１％グ
ルコース、　　２０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，５０ｍＭトリス
−塩酸、　ｐＨ７，５）　１０　ｍｌ中で３７°Ｃで一
晩生育させた。ついで培養懸濁液１　ｍｌを同じχ培地
（１（１０ｍｆ）へ接種し、３７°Ｃで培養した。

６５０ｍμの０．０．がおよそ１．５−２．０に達した
時点で３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を加えた。

インデューサーの添加３時間後に、細胞を集め、２０ｍ
Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ７，５、３０ｍＭ　ＮａＣ１を含
む）で洗浄し、同じ緩衝液８　ｍｌ中に再び懸濁した。

Ｔｒｐプロモーターの効果的な機能発現のために、ＩＡ
Ａの如きインデューサーを最終濃度５０μｇ／Ｉｌ！に
なるように添加した。かくして細菌細胞中に産生される
蛋白をソニック処理（０’Ｃ，２分間）またはりゾチー
ム（８μｇ）消化（０°Ｃｌ２Ｏ分）に引き続き凍結融
解を３回行う事により抽出した。

この方法により、−船釣にＩＬ−２は細胞から抽出され
た。抽出されたＩＬ−２活性は１０，（１００から１２
０　、（１００単位／ｌａｎの範囲であった。

ｐＴＩＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリ　ＩＩ８１
０１（ＡＪ１２（１０９）はＦＥＲＭ−ＢＰ２４５とし
て寄託されている。

実施例４ ＩＬ−２ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＴｕｌＬ２−２
２はｐＴｕＢＩＰ−５（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｓｅｉｋａｇａｋｕ、　５３＋９６６
、１９８１）および実施例３に示したｐＴＩＬ２−２２
から第６図に図解した方法により構築された。プラスミ
ドｐＴｕＢＩＰ−５はｐＢＲ３２２中にｔｕｆＢのプロ
モーター配列が挿入されている。このプラスミドはまた
単一の」■部位を含んでおり、これは第６図に示した如
＜ＳＤ配列の２ｂｐ下流に位置している。ｐＴｒＳ−３
もまたＳＤ配列とＡＴＧイニシェーションコードンの間
にＣ１ａ　　１部位を含んでおり、このΦ　１部位は実
施例３に記載した如（ｐＴｒＳ−３およびＩＬ−２ｃＤ
ＮＡを用いる事による発現プラスミド構築中に破壊され
ないことから、ＴｒｐプロモーターをｔｕｆＢプロモー
ターに置き換える事はきわめて簡単であり、その結果Ｉ
Ｌ−２ｃＤＮＡはｔｕｆＢプロモーターの制御下で発現
される。

それ故、プラスミドｐＴＩＬ２−２２　（３０μｇ）は
制限酵素Ｃ１ａ　　Ｉと均α■により通常の方法で切断
された。ＩＬ−２ｃＤＮＡを含む断片（約２．２　ｋｂ
）はアガロースゲル電気泳動により単離精製され、３μ
ｇのＤＮＡが回収された。他方、ｐＴｕＢＩＰ−５ベク
タ一２０μｇが同様にＣ１ａ　　Ｉとハｔｇ　［により
切断され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大きい方の断
片（約３．４　ｋｂ）がアガロースゲル電気泳動により
単Ｍｉｌｌ製され、ＤＮＡ　３．５μｇが回収された。

次にこのようにして得られた２個の断片は１つはｔｕｆ
Ｂプロモーターを含み（約３．４ｋｂ）、他方はＩＬ−
２ｃＤＮＡを含んでおり（約２．２　ｋｂ）以下に示す
如く連結した。

ＩＬ　−２ｃＤＮＡ（１，２ｕ　ｇ　）を含む断片およ
びｔｕｆＢプロモーターを含む断片０．３μｇを６．６
ｍＭ　ＭｇＣｌ！ｚ　。

１ｍＭＡＴＰおよび１０ｍＭ　ＤＴＴを含むｐＨ７，５
の６６ｍＭトリス−塩酸中で、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ０
．８単位と混合し、４°Ｃで一晩反応した。次にこのよ
うにして連結したプラスミドは常法に従いエシェリヒア
・コリＨＢ　１０１へ形質転換された。

アンピシリンを含むし培地寒天プレート上に出現するト
ランスホーマントの中で第６図のｐＴｕｌＬ２２２の如
＜ＩＬ−２ｃＤＮＡ部分を含む組み換え体ＤＮＡを持つ
８個のコロニーが選択され、プラスミドＤＮＡは実施例
３に記載された如く調製された。

ｐＴｕｌＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリ　ＨＢ　
１０１を３７°ＣでＬ培地（１（１０ｍｆ）中で培養し
た。

６５０ｍｇの０．Ｄ、がおよそ０．５−１．０に達した
時、菌体を集め、３０ｍＭ　ＮａＣｊ２を含む２０ｆｆ
１Ｍトリスー塩酸（ｐＨ７，５）で洗浄し、同じ緩衝液
２　ｍｌ中に再び懸濁した。このようにして産生じた蛋
白は実施例３と同様に抽出された。抽出液中のＩＬ２活
性は６，（１００から５６，（１００単位／ｍｌの範囲
であった。

ｐＴｕｌＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリ　ＨＢ　
１０１（ＡＪ１２０１０）はＦＥＲＭ−ＢＰ　２４６と
して寄託されている。

実施例５ ＩＬ−２ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＧＩＬ２−２２
はｐｃｉ。

１０１（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｔ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｌａ
ｕｃｅｒ　Ｇ、　Ｄ、、　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍ、。

６８、４７３−４８３．（１９７９）、Ｇａ１ｌ　Ｌａ
ｕｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　Ｌ　Ｎｏ、　２．１３９
〜１４７（１９８１）、　Ｔ。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７７、　Ｎａ　９．５２３０〜５２３３（１９８０）、
Ｅｇｏｎ　Ａｍａｎｎ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｇｅｎｅ、　２５．１６７〜１７８（１９８３））と実
施例３に示されたｐＴＩＬ２−２２とから構築された。

すなわち、慝プロモーターを含むプラスミドｐＧＬ　ｔ
ｏｌ（２０ｕ　ｇ　）が制限酵素Ｐｖｕ　Ｕで常法によ
り切断され、引続きフェノール、クロロホルム処理およ
びエタノール沈澱法により１７μｇのＤＮＡが回収され
た。他方、ｐＴＩＬ２−２２　（７５μｇ）の方はりａ
ｌおよびＳａｌ　　１で切断し、アガロースゲル電気泳
動によりＩＬ−２ｃＤＮＡが含むＤＮＡ断片２．２μｇ
−を回収した。この断片はＤＮＡポリメラーゼＩ（フレ
ノウ断片）で処理する事によりフラッシュにされた。次
にこのようにして得られた２個の断片（０，２５ａｇお
よび０．６６ａｇ）を実施例４と同じ方法でＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼ１．０単位でもって連結した。か（してこの
連結したプラスミドは常法に従いエシェリヒア・コリＨ
Ｂ　１０１に形質転換された。トランスホーマントの中
で、ＩＬ−２ｃＤＮＡを含むＣ１ａ　　Ｉ　−５ａｔ　
　Ｉ断片の挿入を有するトランスホーマント３ｔＰラベ
ルしたＩＬ−２ｃＤＮＡをプローブとして選択した。次
にこれ等のトランスホーマントを、アンピシリン２５μ
ｇ／ｍｌを含む１０ｍＡのχ培地中で培養し、実施例３
で記載した方法により）゛ラスミドＤＮへを剰製した。

かくしてＩａｃフ゛ロモーターの丁度下流にＩＬ−２ｃ
ＤＮＡの開始配列ＡＴＧを有するプラスミドＤＮＡばＰ
ｓｔ　　ｌおよびＸｂａ　　Ｉでの切断部位を検定する
事により得られた。このようにして得られたｐｃｌＬ２
−２２を含むエシェリヒア・コリＨＢ　１０１は２５ａ
ｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５ａｇ／ｒａｎストレプ
トマイシンを含有するし培地Ｉ（１０■ｌに接種し培養
した。６５０ｍμの０．０．が約０．５に達した時イソ
プロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴ
Ｇ）を１ｍＭの濃度で加え、１時間後に菌体を集め、実
施例４に記載した方法に従って菌体抽出液を調製した。

抽出液のＩＬ−２活性は６．（１００から８０．（１０
０単位／ｍｌの範囲であった。

ｐＧＩＬ２−２２を含む！　’／　ｓ　’）　ヒフ　・
コ’）　＋１８１０１（ＡＪ１２０１１）はＦＥＲＭ−
ＢＰ　２４７として寄託されている。

実施例６ プラスミドｐＴｒＳ−３（１０ａｇ）を先ず制限酵素Ｓ
ａｌ　　Ｉで切断しＳａｌ　　１部位をＤＮＡポリメラ
ーゼ（フレノウ断片）あるいはＴ４　ＯＮ八へリメラー
ゼ処理によりフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）にした。

Ｃ１ａ　　Ｉで切断後、Ｔｒｐプロモーター領域を有す
る大きい方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳
動により単離精製し、ＤＮ＾３μｇを回収した。

他方、ｐｌＬ２−５ＯＡのＰｓｔ　　Ｉ切断により得ら
れるｃＤＮＡインサートｌｌμｇがＨＢ４　Ａ　Ｉで切
断され、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ処理され、大きい方
の断片がアガロースゲル電気泳動により単離、精製され
た。このようにしてＩＬ−２の１３２個のアミノ酸をコ
ードするｃＤＮＡ断片が７．２μｇ得られた。次に、ｔ
ｒＰプロモーター（上記）を含む断片０．４５μｇ。

ＩＬ−２ｃＤＮＡを含むＨｇ１ＡＩ−Ｐｓｔ　　ｒ断片
０．５　ｕ　ｇおよび合成オリゴヌクレオチド（５°）
ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡ（３゛）と（３°）Ｔ
ＡＴＴＣＧＡＴＡＣＣＧＴ（５’）（各々２０　ｐｍｏ
ｌｅ）は両方とも５′末端でリン酸化されているが、こ
れ等を実施例３に記載されている方法と同じ方法でＴ４
ＤＮＡリガーゼ１単位で連結した（第４図（ｂ））。こ
のように連結されたプラスミドはエシェリヒア・コリＨ
Ｂ　１０１に形質転換された。出現したトランスホーマ
ントの中で、目標とするトランスホーマントは次のよう
にして選択した。まず最初に、ＩＬ２　ｃＤＮ＾および
合成オリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイズ可能な
トランスホーマントがコロニーハイブリダイゼーション
法により選択された。次に、ＡＴＧＧＣＡ配列の丁度下
流に第２図（ａ＞の１１１から１１３の位置０ＣＴＴ配
列から始まるＤＮＡ断片（ＣＣＴＡＣＴ・・・・・・・
・・）が挿入されているプラスミドＤＮＡを持ったトラ
ンスホーマントをＰｓｔ　Ｔ　、Ｘｂａ　１切断個所を
検定することにより選択した。

ｐＴＩＬ２−２１ａまたはｐＴＩＬ２−２１ｂを含む上
記のトランスホーマントを実施例３に示す方法によりＬ
培地中で培養し、そして実施例３に示す方法により分析
した時トランスホーマントの菌体抽出物には高いｆＬ−
２活性が認められた。ｐＴＩＬ２−２１ａを有するエシ
ェリヒア・コリ　１１８１０１（ＡＪ　１２０１３）お
よびｐＴＩＬ２−２１ｂを有するエシェリヒア・コリ（
ＡＪ　１２０１４）を有するエシェリヒア・コリＨＢ　
１０１はそれぞれＦＥＲＭ−ＢＰ　２４８．ＦＥＲＭ−
ＢＰ　２４９として寄託されている。

上記の実施例で用いられた宿主、エシェリヒア・コリ　
Ｚ　１７７６およびｌ（Ｂ　Ｌｏｔ（Ｂｏｙｅｒ　Ｈ，
Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４１．４５９．（１９６
９））は公知であり、容易に入手可能である。更につけ
加えれば、トランスホーマント中の組換えＤＮＡ体を遊
離させるためにＬ培地で３７゛Ｃでトランスホーマント
を培養し、テトラサイタリンおよびアンピシリンに感受
性となった菌体を分離すれば寄託したトランスホーマン
トから宿主は容易に得られる。

プラスミドベクターｐＢＲ３２２（例えばヘセスダリサ
ーチラボラトリーから購入可能）　、　ｐｃＥ−１，ｐ
ＴｒＳ−３およびｐａｔ、　１０１は公知であり容易に
入手可能である。更に、常法によりトランスホーマント
中の組換え体プラスミドを分離することによってさらに
それぞれの実施例での説明から当然に明らかな如くプラ
スミドベクターを分離することによって寄託されたトラ
ンスホーマントからプラスミドベクターを得る事が出来
る。ｐＴｒＳ−３およびｐＴｕＢＩＰ−５はそれぞれエ
シェリヒア・コリ　ＦＥＲＭ−Ｐ６７３５（ＢＰ　３２
８）およびエシェリヒア・コリ　ＡＴＣＣ３１８７ｇと
して寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図はＩＬ−２活性を有するポリペプチドをコードし
たクローン化遺伝子の制限酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断マツプを示し、第２図（ａ）はクローン化遺伝子
の塩基配列を示し、第２図（ｂ）はＩＬ−２活性を有す
るポリペプチドのアミノ酸配列Ｉ、■および■を示す。 第３図はプラスミドベクターｐＴｒＳ−３を示すゆ第４
図（ａ）、第４図（ｂ）および第４図（ｃ）はベクター
としてｐＴｒＳ−３を使用している組換えＤＮＡ５（ｐ
ＴＩＬ２−２２．　ｐＴＩＬ２−２１．　ｐＴＩＬ２−
１４およびρＴＩＬ２−１５）の構成を示すフローチャ
ートである。第５図はベクターとしてＩ）ＫＴ　２１Ｂ
を使用している組換えＤＮ＾（ｐＫＩＬ２−２１）の構
成を示すフローチャートである。第６図はベクターとし
てｐＴＵＢＩＰ−５を使用している組換えＤＮＡ　（ｐ
Ｔｕ　ＩＬ２−２２）の構成を示すフローチャートであ
る。 図中、“Ａ″”Ｇ”、“Ｃ”および“Ｔ”はデオキシア
デニル酸、デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸お
よびチミジル酸をそれぞれ表わす。 特許出願人　財団法人　癌　研　究　会同　味の素株式
会社 第３図 ｍｐ ２　　　：＋　　　し　　　り　　　−　　　り　　　
−　　　コ１１１ＱＩ　　　　ぶ　　　ａＩ　　　　Φ
　　　傷　　　ぶ　　　Φに　　−←　　−ψ　　−ト
　　− プ　　　２ 中− 一〇 　ｌ −← コ　　　・　　　− 春　　−− 一　　−ベ コ ψ コ 山 コ 】 ト 々 ｔ　上　、！ｉ　ぶ　旧　二　シ　２ ＝　　ト　　じ　　ト　　Ｃ　　ｔ　　ｏ　　−１Ｊ　
　　　−　　　フ　　　ｏＩ　　ｚ　　　　哨　　　コ
　　　Φ　　　−Φ　　リ　　ａｌＭ　　　−　　為　
　−　　−　　ぶ工　　Ｌｎ　　　−　　に　　ｌｊｔ
Ｊｃ５１−１？区 ≦ｉ 寸 綜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプチ
   ドをコードする遺伝子を含有する原核生物を形質転換す
   るための組換えＤＮＡ体。 （２）ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配列を含む
   ものである特許請求の範囲第１項記載の原核生物を形質
   転換するための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （３）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもので
   ある特許請求の範囲第２項記載の原核生物を形質転換す
   るための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （４）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもので
   ある特許請求の範囲第２項記載の原核生物を形質転換す
   るための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （５）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもので
   ある特許請求の範囲第２項記載の原核生物を形質転換す
   るための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （６）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもので
   ある特許請求の範囲第２項記載の原核生物を形質転換す
   るための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （７）ポリペプチドをコードする遺伝子が次の塩基配列
   を有するものである特許請求の範囲第４項記載の原核生
   物を形質転換するための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （８）ポリペプチドをコードする遺伝子が次の塩基配列
   を有するもである特許請求の範囲第６項記載の原核生物
   を形質転換するための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （９）ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプチ
   ドをコードする遺伝子を含有するエシェリヒア・コリを
   形質転換するための組換えＤＮＡ体。 （１０）ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配列を含
   むものである特許請求の範囲第９項記載のエシェリヒア
   ・コリを形質転換するための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （１１）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもの
   である特許請求の範囲第１０項記載のエシェリヒア・コ
   リを形質転換するための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （１２）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもの
   である特許請求の範囲第１０項記載のエシェリヒア・コ
   リを形質転換するための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （１３）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもの
   である特許請求の範囲第１０項記載のエシェリヒア・コ
   リを形質転換するための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （１４）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもの
   である特許請求の範囲第１０項記載のエシェリヒア・コ
   リを形質転換するための組換えＤＮＡ体。 【遺伝子配列があります】 （１５）ポリペプチドをコードする遺伝子が次の塩基配
   列を有するものである特許請求の範囲第１２項記載のエ
   シェリヒア・コリを形質転換するための組換えＤＮＡ体
   。 【遺伝子配列があります】 （１５）ポリペプチドをコードする遺伝子が次の塩基配
   列を有するものである特許請求の範囲第１４項記載のエ
   シェリヒア・コリを形質転換するための組換えＤＮＡ体
   。 【遺伝子配列があります】 （１７）ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ体によ
   り形質転換された原核生物の細胞。 （１８）ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配列を含
   むものである特許請求の範囲第１７項記載の原核生物の
   細胞。 【遺伝子配列があります】 （１９）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもの
   である特許請求の範囲第１８項記載の原核生物の細胞。 【遺伝子配列があります】 （２０）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもの
   である特許請求の範囲第１８項記載の原核生物の細胞。 【遺伝子配列があります】 （２１）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもの
   である特許請求の範囲第１８項記載の原核生物の細胞。 【遺伝子配列があります】 （２２）ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有するもの
   である特許請求の範囲第１８項記載の原核生物の細胞。 【遺伝子配列があります】 （２３）ポリペプチドをコードする遺伝子が下記の塩基
   配列を有するものである特許請求の範囲第２０項記載の
   原核生物の細胞。 【遺伝子配列があります】 （２４）ポリペプチドをコードする遺伝子が次の塩基配
   列を有するものである特許請求の範囲第２２項記載の原
   核生物の細胞。 【遺伝子配列があります】 （２５）ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ体によ
   り形質転換されたエシェリヒア・コリ。 （２６）ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配列を含
   むものである特許請求の範囲第２５項記載のエシェリヒ
   ア・コリ。 【遺伝子配列があります】 （２７）ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配列を有
   するものである特許請求の範囲第２６項記載のエシェリ
   ヒア・コリ。 【遺伝子配列があります】 （２８）ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配列を有
   するものである特許請求の範囲第２６項記載のエシェリ
   ヒア・コリ。 【遺伝子配列があります】 （２９）ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配列を有
   するものである特許請求の範囲第２６項記載のエシェリ
   ヒア・コリ。 【遺伝子配列があります】 （３０）ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配列を有
   するものである特許請求の範囲第２６項記載のエシェリ
   ヒア・コリ。 【遺伝子配列があります】 （３１）ポリペプチドをコードする遺伝子が次の塩基配
   列を有するものである特許請求の範囲第２８項記載のエ
   シェリヒア・コリ。 【遺伝子配列があります】 （３２）ポリペプチドをコードする遺伝子が次の塩基配
   列を有するものである特許請求の範囲第３０項記載のエ
   シェリヒア・コリ。 【遺伝子配列があります】