JPS62278994A - ヒトインタ−リユ−キン - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
6、発明の詳細な説明
遺伝子m換え、または遺伝子工学とも呼ばれる組換えD
NA技法の発展により、広く各種生物由来産物の生産が
可能となった。現在の組換えDNA技術では、特定のD
NA配列を適当なりNA運搬体またはベクターに挿入し
て宿主細胞中で複製可能な組換えDNA分子を作製する
。グラスミドと呼ばれる環状二重鎖DNA分子がベクタ
ーとしてよく使用され、組換えDNA体の調製にはDN
Aの特定の塩基配列を切断することの出来る制限エンド
ヌクレアーゼ酵素の使用を伴なう。このような組換えD
NA分子調製のための一般的方法はCohenら〔米国
特許4.237.224番〕、Co11insら〔米国
特許4.304,863番〕およびManiatisら
(Molec(10)arClonlng + A L
aboratory Mannual、1982年、C
o1d Spring Harbor Laborat
ory 〕にjfi記載されている。
NA技法の発展により、広く各種生物由来産物の生産が
可能となった。現在の組換えDNA技術では、特定のD
NA配列を適当なりNA運搬体またはベクターに挿入し
て宿主細胞中で複製可能な組換えDNA分子を作製する
。グラスミドと呼ばれる環状二重鎖DNA分子がベクタ
ーとしてよく使用され、組換えDNA体の調製にはDN
Aの特定の塩基配列を切断することの出来る制限エンド
ヌクレアーゼ酵素の使用を伴なう。このような組換えD
NA分子調製のための一般的方法はCohenら〔米国
特許4.237.224番〕、Co11insら〔米国
特許4.304,863番〕およびManiatisら
(Molec(10)arClonlng + A L
aboratory Mannual、1982年、C
o1d Spring Harbor Laborat
ory 〕にjfi記載されている。
組換えDNA分子は挿入した遺伝子配列に工りコードさ
れる産物を、多くの条件を満たした場合にのみ生産する
のに使用される。第一の条件は、組換え分子が宿主細胞
と適合性があ)、従って宿主細胞中で自己増殖が出来る
事である。新しい報告の多くはバクテリアのEsche
richia coli (E、coli)を宿主生物
として使用しているが、これはE、coliが広い範囲
の組換えプラスミドと適合性を有するからである。組換
えDNA分子の宿主への導入は、使用するベクター/宿
主細胞系により形質転換、形質導入またはトランスフエ
クシヨンにより行なう。
れる産物を、多くの条件を満たした場合にのみ生産する
のに使用される。第一の条件は、組換え分子が宿主細胞
と適合性があ)、従って宿主細胞中で自己増殖が出来る
事である。新しい報告の多くはバクテリアのEsche
richia coli (E、coli)を宿主生物
として使用しているが、これはE、coliが広い範囲
の組換えプラスミドと適合性を有するからである。組換
えDNA分子の宿主への導入は、使用するベクター/宿
主細胞系により形質転換、形質導入またはトランスフエ
クシヨンにより行なう。
組換えベクターを宿主細胞に単に導入しただけでは目的
の遺伝子産物が十分量生産されることが保証されない。
の遺伝子産物が十分量生産されることが保証されない。
そのためKは、プロモーターと呼ばれるベクター中のシ
グナル領域と適当な関係で異種遺伝子配列が結合されな
ければならない。或いは、宿主が認識する限υ、外来D
NAがそれ自身のプロモータを保有していてもよい。由
来が何であ几、プロモーターとは発現されるべき外来遺
伝子の「上流」側、言い換えれば5′側のDNA配列で
ある。この配列がFLNAポリメラーゼの結合を指示し
、その結果DNAのメツセンジャーRNA (mRNA
)への転写と「プロモート」する。
グナル領域と適当な関係で異種遺伝子配列が結合されな
ければならない。或いは、宿主が認識する限υ、外来D
NAがそれ自身のプロモータを保有していてもよい。由
来が何であ几、プロモーターとは発現されるべき外来遺
伝子の「上流」側、言い換えれば5′側のDNA配列で
ある。この配列がFLNAポリメラーゼの結合を指示し
、その結果DNAのメツセンジャーRNA (mRNA
)への転写と「プロモート」する。
多量のmRNAを提供できる強いプロモーション(促進
)があれば、目的遺伝子産物の最終的生産f’i mR
NAから蛋白質への翻訳の効率による。これVimRN
Aへのりボゾームの結合の効率および宿主細胞中でのm
RNAの安定性に依存する。真核細胞では翻訳効率を支
配する要因はよく理解されていないが、翻訳を開始する
AUGコドンを囲む核酸配列に好ましいものがあるらし
い(Kozak、 Ce1l 。
)があれば、目的遺伝子産物の最終的生産f’i mR
NAから蛋白質への翻訳の効率による。これVimRN
Aへのりボゾームの結合の効率および宿主細胞中でのm
RNAの安定性に依存する。真核細胞では翻訳効率を支
配する要因はよく理解されていないが、翻訳を開始する
AUGコドンを囲む核酸配列に好ましいものがあるらし
い(Kozak、 Ce1l 。
44巻、286頁(1986年)〕。mRNAの安定性
に影響する因子は原核細胞、真核細胞のいずれでもまだ
よくわかっていないが、得られる蛋白質生産量にM要な
影響をもつ。
に影響する因子は原核細胞、真核細胞のいずれでもまだ
よくわかっていないが、得られる蛋白質生産量にM要な
影響をもつ。
現在までの組換えDNA分野での仕事はほとんどE、
coliのようなバクテリアの発現系を使用したものに
焦点があった。しかし、バクテリア細胞の使用には多く
の好ましくない要素がある。例えば、E、 coliで
生産されるほとんどの蛋白質およびポリペプチドはべり
プラズム空間に蓄積する。従ってこれらの遺伝子産物の
回収には細胞の破砕が必要で、これは不完全であると共
に目的産物を多くの他のE、 coli細胞成分から精
製しなければならず、精製で大きい問題となる。また、
バクテリアは、多くの興味ある遺伝子産物の生合成に必
要な糖鎖結合を行なうことができない。さらに、バクテ
リアでは多くの真核細胞蛋白質の適当な構造および生物
活性に必須である特定のS−S結合を形成することが出
来ないと思われる。
coliのようなバクテリアの発現系を使用したものに
焦点があった。しかし、バクテリア細胞の使用には多く
の好ましくない要素がある。例えば、E、 coliで
生産されるほとんどの蛋白質およびポリペプチドはべり
プラズム空間に蓄積する。従ってこれらの遺伝子産物の
回収には細胞の破砕が必要で、これは不完全であると共
に目的産物を多くの他のE、 coli細胞成分から精
製しなければならず、精製で大きい問題となる。また、
バクテリアは、多くの興味ある遺伝子産物の生合成に必
要な糖鎖結合を行なうことができない。さらに、バクテ
リアでは多くの真核細胞蛋白質の適当な構造および生物
活性に必須である特定のS−S結合を形成することが出
来ないと思われる。
バクテリアの発現系での欠点を克服するために遺伝子工
学の注意は組換えDNA分子の発現に真核宿主細胞を使
用する方向に強まっている。酵母や動物細胞は目的遺伝
子産物を培養液中に分泌でき、しかも必須の糖鎖結合も
行なうことが出来る。しかし、組換えDNA分子のクロ
ーニングおよび発現に動物細胞を利用するのにも解決し
なければならない技術点短所がある。例えば、バクテリ
ア中で非常に有効であった外来プラスミドは高等真核細
胞では複製できない。七の結果、他のアプローチを採用
しなければならない。
学の注意は組換えDNA分子の発現に真核宿主細胞を使
用する方向に強まっている。酵母や動物細胞は目的遺伝
子産物を培養液中に分泌でき、しかも必須の糖鎖結合も
行なうことが出来る。しかし、組換えDNA分子のクロ
ーニングおよび発現に動物細胞を利用するのにも解決し
なければならない技術点短所がある。例えば、バクテリ
ア中で非常に有効であった外来プラスミドは高等真核細
胞では複製できない。七の結果、他のアプローチを採用
しなければならない。
一つのアプローチはE、 coliと同じように簡単に
生育、増殖できる下等真核酵母、Saccharomy
cescerevisiaeを使用することであった。
生育、増殖できる下等真核酵母、Saccharomy
cescerevisiaeを使用することであった。
酵母のクローニング系は既にある。そのような系を用い
てヒトインターフェロン遺伝子の酵母中での効率よい発
現も成功している( Hitzemanら、Natur
e(London ) 293巻、717貞(1981
年)〕。
てヒトインターフェロン遺伝子の酵母中での効率よい発
現も成功している( Hitzemanら、Natur
e(London ) 293巻、717貞(1981
年)〕。
しかしインターフェロン遺伝子はイントロンを含まない
。酵母細胞はイントロンを含む少なくとも一つのへテロ
な唾乳動物遺伝子、既ちウサギβ−グロブリン遺伝子、
を正しく転写しないことがわかっているC Beggs
ら、Nature (London ) 283巻、8
35頁(1980年)〕ので酵酵母金主として動物遺伝
子の発現を行なう場合には、イントロンが存在するかし
ないかを考慮しなければならない。
。酵母細胞はイントロンを含む少なくとも一つのへテロ
な唾乳動物遺伝子、既ちウサギβ−グロブリン遺伝子、
を正しく転写しないことがわかっているC Beggs
ら、Nature (London ) 283巻、8
35頁(1980年)〕ので酵酵母金主として動物遺伝
子の発現を行なう場合には、イントロンが存在するかし
ないかを考慮しなければならない。
他のアプローチとしては、異榎遺伝子全直接取シ込みに
よシ哺乳動物細胞に挿入するものがある。
よシ哺乳動物細胞に挿入するものがある。
例工ば、クローン化遺伝子をリン酸カルシウムと共沈澱
することにより行ない、この方法では細胞のお工そ1−
2チが通常DNAの取シ込みを銹導さnる。しかし、こ
のよ5に低レベルの取り込みでは目的遺伝子産物の発現
の程度も低い。チミジンキナーゼ遺伝子を欠損する哺乳
動物細胞(tk−細胞)が得らn\ばtk遺伝子と共−
形質転換と行なった、選択条件下で中背することにより
より良い結果は得られる。TK−細胞はHAT (ヒポ
キサンチン−アミノプテリン−チミジン)培地中で生育
できない。これらの細胞はtk遺伝子を@有する外部D
NA (例えばヘルペス・シ/プンノクスウィルスDN
A )をリン酸カルシウムとの共形質転換により取り込
むと、欠損酵素活性を回復する。tkDNAと共有結合
した他のDNA分子またはそれと単に混合したものも細
胞に取り込まれて同時発現することも多いCScang
osら参照、()ene、14巷、1頁(1981年)
〕。
することにより行ない、この方法では細胞のお工そ1−
2チが通常DNAの取シ込みを銹導さnる。しかし、こ
のよ5に低レベルの取り込みでは目的遺伝子産物の発現
の程度も低い。チミジンキナーゼ遺伝子を欠損する哺乳
動物細胞(tk−細胞)が得らn\ばtk遺伝子と共−
形質転換と行なった、選択条件下で中背することにより
より良い結果は得られる。TK−細胞はHAT (ヒポ
キサンチン−アミノプテリン−チミジン)培地中で生育
できない。これらの細胞はtk遺伝子を@有する外部D
NA (例えばヘルペス・シ/プンノクスウィルスDN
A )をリン酸カルシウムとの共形質転換により取り込
むと、欠損酵素活性を回復する。tkDNAと共有結合
した他のDNA分子またはそれと単に混合したものも細
胞に取り込まれて同時発現することも多いCScang
osら参照、()ene、14巷、1頁(1981年)
〕。
三つ目のアプローチは異種遺伝子を咽乳動物細胞中に導
入するためにウィルス遺伝子をベクターとして利用する
ものである。シミアンウィルス40、乳頭腫ウィルスお
よびアデノウィルス遺伝子を基にしたベクターは報告さ
れている[P、W、J。
入するためにウィルス遺伝子をベクターとして利用する
ものである。シミアンウィルス40、乳頭腫ウィルスお
よびアデノウィルス遺伝子を基にしたベクターは報告さ
れている[P、W、J。
Rigby、 ” Expression of C1
oned Genes 1nEukaryotic C
e1ls Using l/actor System
s Derivedfrom Viral Repli
cons ”、 : C)enetic Engiue
ering。
oned Genes 1nEukaryotic C
e1ls Using l/actor System
s Derivedfrom Viral Repli
cons ”、 : C)enetic Engiue
ering。
3巻; R,Williamson @集、Acade
mic Press、 =ニーヨーク、83−141頁
(1982年)の総説参照のこと〕。しかし、これらの
ベクター系は宿主範囲が限られているという欠点がある
。その上、これらの系でのウィルス複製によジ宿主細胞
の死滅が生じる。レトロウィルスDNAの調節要素を使
用することによυこれらウィルスベクター系の短所の多
くを避けることができる。例えば、()ormanら(
Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 U、
S、A、 79巻、6777頁(1982年)〕はラウ
スデルコマウィルスの長い末端リビー) (LTR)は
強いプロモータであシ、cv−1サル腎臓細胞、トリ胎
児繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、He
La細胞およびマウスNIH/3T3細胞を含む各種細
胞にDNA−仲介トランスフェクションによシ取り込ま
れる。
mic Press、 =ニーヨーク、83−141頁
(1982年)の総説参照のこと〕。しかし、これらの
ベクター系は宿主範囲が限られているという欠点がある
。その上、これらの系でのウィルス複製によジ宿主細胞
の死滅が生じる。レトロウィルスDNAの調節要素を使
用することによυこれらウィルスベクター系の短所の多
くを避けることができる。例えば、()ormanら(
Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 U、
S、A、 79巻、6777頁(1982年)〕はラウ
スデルコマウィルスの長い末端リビー) (LTR)は
強いプロモータであシ、cv−1サル腎臓細胞、トリ胎
児繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、He
La細胞およびマウスNIH/3T3細胞を含む各種細
胞にDNA−仲介トランスフェクションによシ取り込ま
れる。
遺伝子発現の調節が遺伝子のコード配列の直前または直
後の配列である5′および6′側の非コード領域に工り
成されるという事実は癌遺伝子および高等真核細胞のm
RNAの研究から明かとなっている。これらの配列を削
除または改変した時の遺伝子発現への影響が真核細胞で
観察されている。例えは、Treisman [Ce1
l、42巻、889頁(1985年)]はクローン化し
たヒト c−fos遺伝子()I’BJネズミ骨肉腫ウ
ィルスが保有するc−fosHと命名した癌遺伝子の細
胞ホモログ)をトランスフェクトしたマウス繊維芽細胞
で、血清誘導の後c−fos RNAが蓄積することを
見つけた。
後の配列である5′および6′側の非コード領域に工り
成されるという事実は癌遺伝子および高等真核細胞のm
RNAの研究から明かとなっている。これらの配列を削
除または改変した時の遺伝子発現への影響が真核細胞で
観察されている。例えは、Treisman [Ce1
l、42巻、889頁(1985年)]はクローン化し
たヒト c−fos遺伝子()I’BJネズミ骨肉腫ウ
ィルスが保有するc−fosHと命名した癌遺伝子の細
胞ホモログ)をトランスフェクトしたマウス繊維芽細胞
で、血清誘導の後c−fos RNAが蓄積することを
見つけた。
通常、この細胞を血清誘導するとc−fos mRNA
の強いが一時的な増加が見られ、それは10〜15分で
最大となって急速に減少し、mRNAの急速な分解のた
め1〜2時間で誘導前の値に戻る。
の強いが一時的な増加が見られ、それは10〜15分で
最大となって急速に減少し、mRNAの急速な分解のた
め1〜2時間で誘導前の値に戻る。
しかし、c−fosHの5′末端配列を正常なc−fo
sH6′側末端配列非存在下で異種遺伝子と融合すると
、得られる遺伝子は血清因子によシ誘導と受けるがその
結果生成するmRNAは血清誘導の後4時までも持続す
る。雑種転写単位の実験からc−fosH遺伝子の6′
末端および6′の非コード領域を含有する遺伝子のみが
誘導の後典型的な急速なmRNA分解を示す。従って、
c−fosの6′末端はそれを含むRNAを反安定化す
る作用があるのであろう。これらの配列の削除または修
飾によシ遺伝子発現にプラスの効果があると思われる。
sH6′側末端配列非存在下で異種遺伝子と融合すると
、得られる遺伝子は血清因子によシ誘導と受けるがその
結果生成するmRNAは血清誘導の後4時までも持続す
る。雑種転写単位の実験からc−fosH遺伝子の6′
末端および6′の非コード領域を含有する遺伝子のみが
誘導の後典型的な急速なmRNA分解を示す。従って、
c−fosの6′末端はそれを含むRNAを反安定化す
る作用があるのであろう。これらの配列の削除または修
飾によシ遺伝子発現にプラスの効果があると思われる。
6′の非コード領域の調節の役割はさらにSimcox
ら(Mo1. Ce11. Biol、 5巻、369
7頁(1985年)〕のキイロショウゾヨウバエの熱シ
ヨツク蛋白質に関する研究に工)裏づけられた。キイロ
ショウジョウバエを常温から37°Cに生育温度をシフ
トすると、数多くの熱シヨツク蛋白質を急激に生産し、
七の中の主要蛋白質はhsp 70と呼ばれる。温度シ
フトはRNA生成の増加を誘導する。正常の生育温度に
戻った後、hsp 7 Q遺伝子の転写は急激に抑制さ
れ、対応するmRNAレベルも急激に低下し、その結果
hsp 7 Q蛋白質の合成も急速に終了する。S i
mcoxらはしかしながら、熱ショックから解放後のh
sp 70の蛋白質合成の急激な抑制は3′配列を除去
しておくと遅くなる事を見つけ、6′配列が通常、温度
低下の後のhsp 70 mMAの非安定化に作用する
ことを暗示している。
ら(Mo1. Ce11. Biol、 5巻、369
7頁(1985年)〕のキイロショウゾヨウバエの熱シ
ヨツク蛋白質に関する研究に工)裏づけられた。キイロ
ショウジョウバエを常温から37°Cに生育温度をシフ
トすると、数多くの熱シヨツク蛋白質を急激に生産し、
七の中の主要蛋白質はhsp 70と呼ばれる。温度シ
フトはRNA生成の増加を誘導する。正常の生育温度に
戻った後、hsp 7 Q遺伝子の転写は急激に抑制さ
れ、対応するmRNAレベルも急激に低下し、その結果
hsp 7 Q蛋白質の合成も急速に終了する。S i
mcoxらはしかしながら、熱ショックから解放後のh
sp 70の蛋白質合成の急激な抑制は3′配列を除去
しておくと遅くなる事を見つけ、6′配列が通常、温度
低下の後のhsp 70 mMAの非安定化に作用する
ことを暗示している。
mRNA制御の役割は5′側の非コード領域にもあるこ
とを示す事実が得られている。Butnickら(Mo
1. Ce11. Biol、 5巻、6(11)9頁
(1985年)〕はヒトc−myc遺伝子(トリ骨髄球
種症ウィルス癌遺伝子の細胞ホモログ)のおよそ550
ヌクレオチドを含む5′非コード配列(exon iと
命名)が、開始点欠損シミアンウィルス40で形質転換
したcv1サル腎臓細胞(COS細胞と命名)中で該遺
伝子を保有するプラスミドの″発現に影響することを見
つけた。c−myc遺伝子の5′非コ一1配列を削除し
たプラスミドからの転写物は完全な遺伝子を保有するプ
ラスミドからの転写物よりも高い定常状態で存在するこ
とがわかシ、これは5′の非コード配列が対応するmR
NAを何らかの方法で非安定化する作用があることを示
している。
とを示す事実が得られている。Butnickら(Mo
1. Ce11. Biol、 5巻、6(11)9頁
(1985年)〕はヒトc−myc遺伝子(トリ骨髄球
種症ウィルス癌遺伝子の細胞ホモログ)のおよそ550
ヌクレオチドを含む5′非コード配列(exon iと
命名)が、開始点欠損シミアンウィルス40で形質転換
したcv1サル腎臓細胞(COS細胞と命名)中で該遺
伝子を保有するプラスミドの″発現に影響することを見
つけた。c−myc遺伝子の5′非コ一1配列を削除し
たプラスミドからの転写物は完全な遺伝子を保有するプ
ラスミドからの転写物よりも高い定常状態で存在するこ
とがわかシ、これは5′の非コード配列が対応するmR
NAを何らかの方法で非安定化する作用があることを示
している。
別の実験でRabbittsら(EMBOJ、 4巻、
6727負(1985年)〕はc−myc遺伝子からエ
クソン1を削除すると、C0L0320 m胞中でc−
mycmRIJAの安定性が増加することを見つけた。
6727負(1985年)〕はc−myc遺伝子からエ
クソン1を削除すると、C0L0320 m胞中でc−
mycmRIJAの安定性が増加することを見つけた。
同じようにEickら(EMBOJ、 4巻、6717
頁(1985年))はバーキットリンパ腫細胞で、C−
m7c遺伝子のエクソン1に転位が起っていると生成す
るmRNAがはるかに高い安定性を示すことを明かにし
た。
頁(1985年))はバーキットリンパ腫細胞で、C−
m7c遺伝子のエクソン1に転位が起っていると生成す
るmRNAがはるかに高い安定性を示すことを明かにし
た。
上述の文献は全て、多くの遺伝子でその5′および6′
の非コード領域がそれらの遺伝子から転写される対応す
るmRNAの不安定性に何らかの関与をしていることを
示す。それらの非コード領域の削除または変化にようm
RNAの安定性が増加し、従って全体の遺伝子発現レベ
ルが上る。しかしながら、その工5な非コード配列の修
飾や削除の遺伝子発現への効果は確信もって子側するこ
とは出来ない。
の非コード領域がそれらの遺伝子から転写される対応す
るmRNAの不安定性に何らかの関与をしていることを
示す。それらの非コード領域の削除または変化にようm
RNAの安定性が増加し、従って全体の遺伝子発現レベ
ルが上る。しかしながら、その工5な非コード配列の修
飾や削除の遺伝子発現への効果は確信もって子側するこ
とは出来ない。
例えば、Johansenら(: Proc、 Nat
l、 Acad、 Sci。
l、 Acad、 Sci。
U、S、A、 81巻、7698頁(1984年)〕は
Escherichia coliのがラクトキナーゼ
(galK )遺伝子と融合した遺伝子調節要素を含む
組換ベクター糸で、5′側の非コード領域の長さを変え
た。
Escherichia coliのがラクトキナーゼ
(galK )遺伝子と融合した遺伝子調節要素を含む
組換ベクター糸で、5′側の非コード領域の長さを変え
た。
その結果、非コード領域の長さを変えてもgalK発現
には全く影響しなかった。同様にKatzら(Mo1.
Ce1l Biol 6巻、672頁(1986年)〕
はトリレトロウィルスmRNAの5′側の非翻訳リーダ
ーに削除と置換との両方を行なった。全体として、これ
らの削除および置換によ、!l) env遺伝子の発現
は実質的に低下した。しかし、これらの発現の低下はm
RNA分子の数の減少によるものでなかった。それは非
コード領域の変化の結果、翻訳の不完全が起シ、全体の
発現低下となったのである。
には全く影響しなかった。同様にKatzら(Mo1.
Ce1l Biol 6巻、672頁(1986年)〕
はトリレトロウィルスmRNAの5′側の非翻訳リーダ
ーに削除と置換との両方を行なった。全体として、これ
らの削除および置換によ、!l) env遺伝子の発現
は実質的に低下した。しかし、これらの発現の低下はm
RNA分子の数の減少によるものでなかった。それは非
コード領域の変化の結果、翻訳の不完全が起シ、全体の
発現低下となったのである。
インタリューキン−2(IL−2)はリンパ球の反応性
を調節し、抗体特異性のT + +7ンパ球の長期試験
管内生育を促する可溶性蛋白質である。
を調節し、抗体特異性のT + +7ンパ球の長期試験
管内生育を促する可溶性蛋白質である。
過去にはIL−2はマイトジェン誘導動物培養細胞の上
澄液から主に単離された。例えば、Morganら(5
cienca 193巻、1(11)7頁(1976年
)およびRus c e t t iら(J、 Imm
unol、119巻、161頁(1977年)〕は正常
植物性血球凝集素(PHA )誘導ヒトIJンパ球の上
澄液を集めてIL−2を回収している。−万、gill
isら(Nature 268巻、154頁(1977
年)〕はコンカナバリンAで誘導した正常DBA /
2マウス牌臓細胞を蛋白質源として使用した。最近では
5tern [米国特許4,490.289 )はIL
−2の原料として誘導ヒト悪性細胞を使用している。
澄液から主に単離された。例えば、Morganら(5
cienca 193巻、1(11)7頁(1976年
)およびRus c e t t iら(J、 Imm
unol、119巻、161頁(1977年)〕は正常
植物性血球凝集素(PHA )誘導ヒトIJンパ球の上
澄液を集めてIL−2を回収している。−万、gill
isら(Nature 268巻、154頁(1977
年)〕はコンカナバリンAで誘導した正常DBA /
2マウス牌臓細胞を蛋白質源として使用した。最近では
5tern [米国特許4,490.289 )はIL
−2の原料として誘導ヒト悪性細胞を使用している。
IL−2生産を組換えDNA手法を用いて行なう検討も
成されてきた。例えば呑口ら(Nature302巻、
605頁(1983年)〕はジュルカソト白血病細胞株
からのメツセンジャーRNAから調製したヒトIL−2
をコードする相補DNA(cDNA )の配列分析、ク
ローニングおよび発現を報告している。IL−2の発現
は呑口らによりサルCO8培養細胞で行なわれているが
、著者らによるとz、 coliO組換えDNAベクタ
ーを用いたIL−2の発現の研究も進行中で、間もな(
E。
成されてきた。例えば呑口ら(Nature302巻、
605頁(1983年)〕はジュルカソト白血病細胞株
からのメツセンジャーRNAから調製したヒトIL−2
をコードする相補DNA(cDNA )の配列分析、ク
ローニングおよび発現を報告している。IL−2の発現
は呑口らによりサルCO8培養細胞で行なわれているが
、著者らによるとz、 coliO組換えDNAベクタ
ーを用いたIL−2の発現の研究も進行中で、間もな(
E。
l coli系でのIL−2の大量生産が可能となる
だろうと報告している。IL−2は細胞中で156アミ
ノ酸残基のポリペプチド前駆体の形で合成される。細胞
から分泌される際に20アミノ酸残基の長いシグナルペ
プチド配列が切断される。成熟IL−2はアミノ酸残基
166のポリペプチドとして細胞から分泌される。E、
coli中での成熟IL−2の発現にはIL−2をコ
ードする遺伝子のシグナルペプチドをコードする配列部
分を組換えDNA法に工す除去する必要がある。それは
Lcoliでは真核細胞のシグナルペプチド配列を切断
できないからである。
だろうと報告している。IL−2は細胞中で156アミ
ノ酸残基のポリペプチド前駆体の形で合成される。細胞
から分泌される際に20アミノ酸残基の長いシグナルペ
プチド配列が切断される。成熟IL−2はアミノ酸残基
166のポリペプチドとして細胞から分泌される。E、
coli中での成熟IL−2の発現にはIL−2をコ
ードする遺伝子のシグナルペプチドをコードする配列部
分を組換えDNA法に工す除去する必要がある。それは
Lcoliでは真核細胞のシグナルペプチド配列を切断
できないからである。
Rosenbergら(5cience 223巻、1
412頁(1984年)〕もゾユルカット細胞株から単
離した遺伝子を用いてE、coli中でIL−2を発現
した。最近、5ouzaら〔欧州特許出願AI 136
,489)は成熟IL−2のアミン配列および性状を有
するポリペプチドをコードする構造遺伝子より成る化学
合成りNA配列をクローニングし、微生物中で発現した
と報告している。5OuZaらはまた、天然のIL−2
とアミン配列の異なるIL−2アナログを生産するのに
合成遺伝子を利用することも開示している。5ouza
らの特許出願で示される実施例では宿主としてE、 c
oli k使用している。
412頁(1984年)〕もゾユルカット細胞株から単
離した遺伝子を用いてE、coli中でIL−2を発現
した。最近、5ouzaら〔欧州特許出願AI 136
,489)は成熟IL−2のアミン配列および性状を有
するポリペプチドをコードする構造遺伝子より成る化学
合成りNA配列をクローニングし、微生物中で発現した
と報告している。5OuZaらはまた、天然のIL−2
とアミン配列の異なるIL−2アナログを生産するのに
合成遺伝子を利用することも開示している。5ouza
らの特許出願で示される実施例では宿主としてE、 c
oli k使用している。
Barrら〔国際特許出願851022(11)番〕は
化学合成したと)IL−2遺伝子の酵母でのクローニン
グお工び発現を報告している。
化学合成したと)IL−2遺伝子の酵母でのクローニン
グお工び発現を報告している。
本発明はヒトインタリューキン−2(HIL−2)およ
びシグナルペプチド配列をコードし、HIL−2および
シグナルペプチド配列をコードして遺伝子の5′側非コ
ード配列を異種の5′非コード配列、例えばラットのイ
ンシュリン遺伝子、好ましくはラットのプロインシュリ
ンI遺伝子の配列と置換した遺伝子よυ成るDNA配列
に関するものである。
びシグナルペプチド配列をコードし、HIL−2および
シグナルペプチド配列をコードして遺伝子の5′側非コ
ード配列を異種の5′非コード配列、例えばラットのイ
ンシュリン遺伝子、好ましくはラットのプロインシュリ
ンI遺伝子の配列と置換した遺伝子よυ成るDNA配列
に関するものである。
さらにシグナルペプチド配°列をコードする頭載である
隣接ヌクレオチドを対応する異種配列、即ち、上述の異
種5′非コード配列に隣接するシグナルペプチド配列を
コードするヌクレオチドで置換することも本発明の範囲
である。シグナルペプチド配列をコードする頭域のヌク
レオチドヲ置換する場合にはHIL−2遺伝子の読みワ
クが維持さnるよう注意する必要がある。さらに本発明
は、上記定義のDNA配列を含む組換えベクターおよび
上記DNA配列またはそれを含有する組換えベクターを
保有する動物細胞に関するものである。本発明はさらに
、ヒトインタリューキン−2の製造方法、該製法により
得られるインタリューキン−2それ自体およびヒトイン
タリューキン−2の疾患治療および予防への使用に関す
るものである。さらに、本発明はそのようなインクリュ
ーキン−2を含有する医薬組成物に関するものである。
隣接ヌクレオチドを対応する異種配列、即ち、上述の異
種5′非コード配列に隣接するシグナルペプチド配列を
コードするヌクレオチドで置換することも本発明の範囲
である。シグナルペプチド配列をコードする頭域のヌク
レオチドヲ置換する場合にはHIL−2遺伝子の読みワ
クが維持さnるよう注意する必要がある。さらに本発明
は、上記定義のDNA配列を含む組換えベクターおよび
上記DNA配列またはそれを含有する組換えベクターを
保有する動物細胞に関するものである。本発明はさらに
、ヒトインタリューキン−2の製造方法、該製法により
得られるインタリューキン−2それ自体およびヒトイン
タリューキン−2の疾患治療および予防への使用に関す
るものである。さらに、本発明はそのようなインクリュ
ーキン−2を含有する医薬組成物に関するものである。
HIL−2の天然のb′非コード配列′s?よびシグナ
ルペプチド配列上コードする配列の最初の4ヌクレオチ
ドATGT 會ラットのインシュリン遺伝子、具体的に
はラットのプレプロインシュリン■のシグナルペプチド
配列tコードする配列のヌクレオチドATGGCOCT
GTGGATCG 、で置換した新規なりローニングお
よび発現ベクターを使用することにより、HIL−2の
凡くべき高い発現が得らnた。シグナルペプチドは成熟
段階で切断されるため、HIL−2シグナルペプチドの
N宋端の改変は生産細胞から分泌される成熟H工L−2
ポリペプチドには全く影響しない。
ルペプチド配列上コードする配列の最初の4ヌクレオチ
ドATGT 會ラットのインシュリン遺伝子、具体的に
はラットのプレプロインシュリン■のシグナルペプチド
配列tコードする配列のヌクレオチドATGGCOCT
GTGGATCG 、で置換した新規なりローニングお
よび発現ベクターを使用することにより、HIL−2の
凡くべき高い発現が得らnた。シグナルペプチドは成熟
段階で切断されるため、HIL−2シグナルペプチドの
N宋端の改変は生産細胞から分泌される成熟H工L−2
ポリペプチドには全く影響しない。
本発明は以下の図面(一定の尺度で描いてない)を参照
することによりよシ容易に理解される。
することによりよシ容易に理解される。
第1図はHIL−2発現ベクター構築のための出発ベク
ターであるプラスミドpB012M工を図示したもので
ある。
ターであるプラスミドpB012M工を図示したもので
ある。
第2図はプラスミドpBc12 / REV / IL
−2中の新規シグナルペプチドのN宋鴻の構造およびプ
ラスミド構築に使用したインシュリンおよびH工り一2
配列を示す。特定の制限および結合部位に下線を引いで
ある。
−2中の新規シグナルペプチドのN宋鴻の構造およびプ
ラスミド構築に使用したインシュリンおよびH工り一2
配列を示す。特定の制限および結合部位に下線を引いで
ある。
第3図は最終のIL−2発現ベクター、pBC12/R
SV /工L−2 / dhfrの図示である。
SV /工L−2 / dhfrの図示である。
第4図はpBc40ΔT構築のため部位考異変真により
プラスミドpBc40から削除しtヌクレオチド配列を
示す。
プラスミドpBc40から削除しtヌクレオチド配列を
示す。
本発明の方法は順序に従って以下のステップを伴なう。
(1)HIL−2お工びシグナルペプチド配列をコード
するDNA配列の調製、(2+5’−非コード配列およ
び多分そnに隣接するシグナルペプチド配列をコードす
る部分配列のヌクレオチドの相当する配列、好ましくは
ラットのプレプロインシュリン■遺伝子の配列とのHI
L−2コード領域の挽みワクを維持した−ま\での置換
、(J);nr規DNA配列を含有する組換えベクター
の適当な哨乳動物宿王細胞への挿入、(41新規H工L
−2遺伝子の増幅お工び修飾宿主細胞の選択、および(
5)生産したHIL −2の同定と精製。
するDNA配列の調製、(2+5’−非コード配列およ
び多分そnに隣接するシグナルペプチド配列をコードす
る部分配列のヌクレオチドの相当する配列、好ましくは
ラットのプレプロインシュリン■遺伝子の配列とのHI
L−2コード領域の挽みワクを維持した−ま\での置換
、(J);nr規DNA配列を含有する組換えベクター
の適当な哨乳動物宿王細胞への挿入、(41新規H工L
−2遺伝子の増幅お工び修飾宿主細胞の選択、および(
5)生産したHIL −2の同定と精製。
不明IIII書で使用する「ヒトインタリューキン−2
」或いは「HIL−2」という言葉は上述のDNA配列
またはその改変配列によυ転質転換まfcはトランスフ
ェクトてれた哺乳動物細胞により生産される糖鎖のつい
た蛋白5Lを言う。DNA配列は;(a)天然のヒトイ
ンタリューキン−2のアミノ酸配列と少なくとも実質的
に同一のアミノ酸配列を有し、(1))天然ヒトインタ
リューキン−2に共通した生物活性を有する蛋白質全コ
ードする。アミノ酸配列の実質的向−というのは配列が
同一であるか或いは天然ヒトインタリューキン−2と合
成蛋白質との間に悪い機能的差を生じないような一個ま
たはそれ以上のアミノ酸の変化(削除、挿入、または置
換)を意味する。
」或いは「HIL−2」という言葉は上述のDNA配列
またはその改変配列によυ転質転換まfcはトランスフ
ェクトてれた哺乳動物細胞により生産される糖鎖のつい
た蛋白5Lを言う。DNA配列は;(a)天然のヒトイ
ンタリューキン−2のアミノ酸配列と少なくとも実質的
に同一のアミノ酸配列を有し、(1))天然ヒトインタ
リューキン−2に共通した生物活性を有する蛋白質全コ
ードする。アミノ酸配列の実質的向−というのは配列が
同一であるか或いは天然ヒトインタリューキン−2と合
成蛋白質との間に悪い機能的差を生じないような一個ま
たはそれ以上のアミノ酸の変化(削除、挿入、または置
換)を意味する。
七のような蛋白質の例は欧州特許出願
インタリューキン−2分子である。こnらのインタリュ
ーキン−2ポリペプチドはバクテリア系で成熟しに形で
生産される。
ーキン−2ポリペプチドはバクテリア系で成熟しに形で
生産される。
ヒトインタリューキン−2およびシグナルペプチド配列
をコードするDNA配列はこの技術で通常用いられるい
かなる方法ででも調製できる。例えば、HIL−2合成
のできるヒト細胞株iH工L−2mRNAを合成するた
め誘導し、mRNA ’fl鋳型としてHIL −2c
DNA f作成する。、Rosenbergら(5ci
ence ’125巻、1412頁(1984年)]は
同様なcDNA k作成するのにヒト白血病T−細胞株
および正常ヒト末梢m IJンパ球を用いた。呑口ら(
Nature 302巻、305Ef(1983年)〕
は同じ目的のためヒト白廂病T−細胞ケ使用した。
をコードするDNA配列はこの技術で通常用いられるい
かなる方法ででも調製できる。例えば、HIL−2合成
のできるヒト細胞株iH工L−2mRNAを合成するた
め誘導し、mRNA ’fl鋳型としてHIL −2c
DNA f作成する。、Rosenbergら(5ci
ence ’125巻、1412頁(1984年)]は
同様なcDNA k作成するのにヒト白血病T−細胞株
および正常ヒト末梢m IJンパ球を用いた。呑口ら(
Nature 302巻、305Ef(1983年)〕
は同じ目的のためヒト白廂病T−細胞ケ使用した。
呑口らはヌクレオチド配列?開示したので、HIL −
2およびシダナルジペプチド自己夕11 ’にコードす
るDNA配列會ホスホトリエステル法或いは他の方法を
用い、好ましくは固相法で化学合成することも出来る。
2およびシダナルジペプチド自己夕11 ’にコードす
るDNA配列會ホスホトリエステル法或いは他の方法を
用い、好ましくは固相法で化学合成することも出来る。
そのような化学合成はBOuZaら〔欧州特奸出JBI
A1 136 489)により記載されている。Bar
rら〔国際時許出awa851022(11)コも、比
較的短いオリゴヌクレオチド全合成し、そ詐らを結合す
ることによりH工I、−2遺伝子を調製した。また他の
方法により、HIL−2′に生産できるヒト細胞から遺
伝子DNA ?!−早離することもできる。HIL −
2a伝子は報告されているHIL−2遺伝子^じ列に基
づい′fc佛識DNAプローブを用い、標準ハイブリダ
・fゼーション法により同定できる。
A1 136 489)により記載されている。Bar
rら〔国際時許出awa851022(11)コも、比
較的短いオリゴヌクレオチド全合成し、そ詐らを結合す
ることによりH工I、−2遺伝子を調製した。また他の
方法により、HIL−2′に生産できるヒト細胞から遺
伝子DNA ?!−早離することもできる。HIL −
2a伝子は報告されているHIL−2遺伝子^じ列に基
づい′fc佛識DNAプローブを用い、標準ハイブリダ
・fゼーション法により同定できる。
本発明の例示的具体例では、HIL−2の459bpの
全コード傾城に31 ’bpの5′仲非翻訳配列お工ひ
3(15) bpの6′側非翻訳配列がついたcDNA
コv−1含むプラスミドル工L−2−2bをヒトインタ
リューキン−2およびシグナルペプチド配列をコードす
るDNA配列の原料として用いた。このH工り一2 C
DNAコピーのpXL−2−’lbプラスミドへのクロ
ーニングはSm1thら(Proc、 Natl、 A
Caa、 Sci。
全コード傾城に31 ’bpの5′仲非翻訳配列お工ひ
3(15) bpの6′側非翻訳配列がついたcDNA
コv−1含むプラスミドル工L−2−2bをヒトインタ
リューキン−2およびシグナルペプチド配列をコードす
るDNA配列の原料として用いた。このH工り一2 C
DNAコピーのpXL−2−’lbプラスミドへのクロ
ーニングはSm1thら(Proc、 Natl、 A
Caa、 Sci。
U、El、A、 82巻、8404頁(1985年〕〕
により報告されている。HIL−2遺伝子葡クローン化
するのに用いた方法のため、cDNAにr、1o−cホ
モd〈IJママ−列とそれに続くB已mH工部位が結合
している。
により報告されている。HIL−2遺伝子葡クローン化
するのに用いた方法のため、cDNAにr、1o−cホ
モd〈IJママ−列とそれに続くB已mH工部位が結合
している。
5′の非コーV配列および恐らく隣接するHIL−2の
シグナルペプチド全コードする部分配列のヌクレオチド
の置換および得らnるIJNA配列の適当な発現ベクタ
ーへの挿入は必要な配列およびクローニングベクター全
回じ制限酵素で切断すると容易に得られる。相補的DN
A末端を有する断片が生成し、それらは相互に容易に結
合するからである。
シグナルペプチド全コードする部分配列のヌクレオチド
の置換および得らnるIJNA配列の適当な発現ベクタ
ーへの挿入は必要な配列およびクローニングベクター全
回じ制限酵素で切断すると容易に得られる。相補的DN
A末端を有する断片が生成し、それらは相互に容易に結
合するからである。
これが出来ない場合には、切断末端全修飾すること、例
えば−重鎖IJNA才端を消化して平滑末端とすること
、が必侠となる。−不知床端をDNAポリメラーゼへの
フレナラ断片のような適当なりNAポリメラーゼによっ
て充填することによっても同様な結果が得られる。平滑
末端は次にT 4 DNA IJガーゼ等を用いて酵素
結合する。
えば−重鎖IJNA才端を消化して平滑末端とすること
、が必侠となる。−不知床端をDNAポリメラーゼへの
フレナラ断片のような適当なりNAポリメラーゼによっ
て充填することによっても同様な結果が得られる。平滑
末端は次にT 4 DNA IJガーゼ等を用いて酵素
結合する。
ベクターへのHIL−2m仏子の挿入のためにもDNA
!端にヌクレオチド配列(リンカ−)を結合すること
により目的のどんな結合部位ケも作ることが出来る。そ
nらのリンカ−は制限酵素の認識部位kmむ特定のオリ
ゴヌクレオチド配列より成る。開環したベクターおよび
H工L−11−コードする修飾1)NA配列もMorr
ow (Methods in Knzymo−10g
768巻、6員(1979年)〕によシ記載されるホモ
ポリマーティリングにより修飾できる。
!端にヌクレオチド配列(リンカ−)を結合すること
により目的のどんな結合部位ケも作ることが出来る。そ
nらのリンカ−は制限酵素の認識部位kmむ特定のオリ
ゴヌクレオチド配列より成る。開環したベクターおよび
H工L−11−コードする修飾1)NA配列もMorr
ow (Methods in Knzymo−10g
768巻、6員(1979年)〕によシ記載されるホモ
ポリマーティリングにより修飾できる。
本発明の実施では、王L−2遺伝子の5′非コード配列
は全てラットプレプロインシュリン■遺伝子の対応配列
と置換されてなげnばならない。
は全てラットプレプロインシュリン■遺伝子の対応配列
と置換されてなげnばならない。
H’III −2遺伝子の隣接するコード配列のいくつ
かのヌクレオチドも削除さnてい工もよいが、それはこ
れらの配列が最終的にはH工L−2遺伝子が挿入さn発
現する宿主?l胞中で成熟の過程で切断されるシグナル
ボリペプチドヤコードしているからである。勿論コー
ド配列の惟域全削除しすぎるとシグナルポリペプチド機
能を失ない、その結果生成H工L−2m胞からの適当な
分あが妨げられる。
かのヌクレオチドも削除さnてい工もよいが、それはこ
れらの配列が最終的にはH工L−2遺伝子が挿入さn発
現する宿主?l胞中で成熟の過程で切断されるシグナル
ボリペプチドヤコードしているからである。勿論コー
ド配列の惟域全削除しすぎるとシグナルポリペプチド機
能を失ない、その結果生成H工L−2m胞からの適当な
分あが妨げられる。
本発明の例示的実施態様では、pbc12M工と命名し
た真核細胞発現ベクター會発現ベクターおLびラットプ
レプロインシュリン証遺伝子配列の亦料として使用した
。天然5′非コード領域およびコード配列の最初の4つ
のヌクレオチドを削除したH工I、−2遺伝子をベクタ
ーpBc12Ml中にラットプレプロインシュリン]遺
伝子の対応する配列に並べて挿入することによジ5′非
コード頒域の置換ができる。
た真核細胞発現ベクター會発現ベクターおLびラットプ
レプロインシュリン証遺伝子配列の亦料として使用した
。天然5′非コード領域およびコード配列の最初の4つ
のヌクレオチドを削除したH工I、−2遺伝子をベクタ
ーpBc12Ml中にラットプレプロインシュリン]遺
伝子の対応する配列に並べて挿入することによジ5′非
コード頒域の置換ができる。
ベクターpBC!12M工はButnickら(Mo1
. Ce1lBill 5巻、6(11)9頁(198
5年)〕により詳細に記載さnている真核細胞発現ベク
ターpBa12Blと類似している。本ベクターはpB
R322由来のプラスミドベクターpXf3 (Han
ahan、 J−Mo1.B101166巻、557頁
(19B3年)〕を基本とし、さらに5v40 ori
’1A域およびラウス肉腫ウィルスの効率よい長い末
端リビー) (LTR)プC1−F−−タ(Gunla
nら、Nature 5 [17巻、241頁(−19
84年)〕およびラットインシュリン猛遺伝子の遺伝子
コピーQ Lomeaicoら、Qal118巻、54
5員(1979年)〕を含んでいる。
. Ce1lBill 5巻、6(11)9頁(198
5年)〕により詳細に記載さnている真核細胞発現ベク
ターpBa12Blと類似している。本ベクターはpB
R322由来のプラスミドベクターpXf3 (Han
ahan、 J−Mo1.B101166巻、557頁
(19B3年)〕を基本とし、さらに5v40 ori
’1A域およびラウス肉腫ウィルスの効率よい長い末
端リビー) (LTR)プC1−F−−タ(Gunla
nら、Nature 5 [17巻、241頁(−19
84年)〕およびラットインシュリン猛遺伝子の遺伝子
コピーQ Lomeaicoら、Qal118巻、54
5員(1979年)〕を含んでいる。
以下に述べる構築に使用したベクターpBci ’2j
A工はpBCl 2”工と同一で、但し、含まれるL’
I’R断片が3′力向にさらに70 bp長くなってい
るものでおる(第1図参照)。この差はベクターによシ
コードされる遺伝子の発現レベルには影響しない。
A工はpBCl 2”工と同一で、但し、含まれるL’
I’R断片が3′力向にさらに70 bp長くなってい
るものでおる(第1図参照)。この差はベクターによシ
コードされる遺伝子の発現レベルには影響しない。
勿論、先ず始めに5′非コード領域および開始コドンが
ラットインシュリン遺伝子の配列と置換した工I、−2
遺伝子’i DNA組換えまたは直接的化学合成により
調製し、次に適当なベクターに挿入することもできる。
ラットインシュリン遺伝子の配列と置換した工I、−2
遺伝子’i DNA組換えまたは直接的化学合成により
調製し、次に適当なベクターに挿入することもできる。
哺乳動物細胞での使用に適し、本発明で用いることので
きるベクターとしては、pBcl 2M工、pBol
2B工、psV2ahfr 、 p91023(B)、
pcDViおよびpR8Vcatがあるが、これらに限
定さnるものではない。これらのベクターは転質転換、
転質尋入讐にはトランスフェクションにより適当な哺乳
動物宿主細胞に導入さnる。
きるベクターとしては、pBcl 2M工、pBol
2B工、psV2ahfr 、 p91023(B)、
pcDViおよびpR8Vcatがあるが、これらに限
定さnるものではない。これらのベクターは転質転換、
転質尋入讐にはトランスフェクションにより適当な哺乳
動物宿主細胞に導入さnる。
本発明で使用できるクローニングベクターの多くは、例
えばpB012B工および1)BO12M工のアンtシ
リン耐性およびpBV2ahfrのジヒドロ葉酸レダク
ターゼ活性のような、目的の形質転換株?11−選択す
るのに利用する一つまたはそれ以上のマーカー活性をコ
ードする遺伝子(選択用遺伝子)を含む。
えばpB012B工および1)BO12M工のアンtシ
リン耐性およびpBV2ahfrのジヒドロ葉酸レダク
ターゼ活性のような、目的の形質転換株?11−選択す
るのに利用する一つまたはそれ以上のマーカー活性をコ
ードする遺伝子(選択用遺伝子)を含む。
ベクターがないとそのような活性會呈すことのない宿主
で、そのベクターが挿入さnた宿生全選択することによ
り操作が非常に容易になる。その場合、細胞を、プラス
ミド保有形質転換株のみが生育できるような制限条件下
で生育させる。
で、そのベクターが挿入さnた宿生全選択することによ
り操作が非常に容易になる。その場合、細胞を、プラス
ミド保有形質転換株のみが生育できるような制限条件下
で生育させる。
本発明の好ましい具体例では、H工L −2生産プラス
ミドは、通常ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を持たない
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO−dhfr−
F8胞)に対してジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を付加
する。ヒポキサンチンおよびチミジン全欠く培地中で生
育することにより、形質転換株を容易に非転換株から選
択できる。
ミドは、通常ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を持たない
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO−dhfr−
F8胞)に対してジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を付加
する。ヒポキサンチンおよびチミジン全欠く培地中で生
育することにより、形質転換株を容易に非転換株から選
択できる。
宿主細胞では欠如している活性がプラスミドに存在する
ことは形質転換株の選択にもう一つ有利な点がある。制
限生育下でdhfr遺伝子の多コピー七保有し、発現す
る転換株は一個または数コーーで低レベルのdhfr発
現している転換株より早い速度で生育する。従ってその
ような条件で発現するdhfr遺伝子のコピー数が増加
または増幅した細胞を選択できる。発現したい目的の遺
伝子がプラスミド中でこの選択用遺伝子の近辺にあれば
、目的の遺伝子も一緒に増幅され、該遺伝子の発現も増
加する。本発明では転換株全プリンの新合成の阻害剤で
あるアミノプテリン全徐々に高濃度に含有しfc培地で
培養することによりジヒドロ葉酸レダクターゼおよびH
工L−2の両方の生産レベルを高めた。不法は[共増@
(コ・アンプリフイケーション〕」と呼ばれる。
ことは形質転換株の選択にもう一つ有利な点がある。制
限生育下でdhfr遺伝子の多コピー七保有し、発現す
る転換株は一個または数コーーで低レベルのdhfr発
現している転換株より早い速度で生育する。従ってその
ような条件で発現するdhfr遺伝子のコピー数が増加
または増幅した細胞を選択できる。発現したい目的の遺
伝子がプラスミド中でこの選択用遺伝子の近辺にあれば
、目的の遺伝子も一緒に増幅され、該遺伝子の発現も増
加する。本発明では転換株全プリンの新合成の阻害剤で
あるアミノプテリン全徐々に高濃度に含有しfc培地で
培養することによりジヒドロ葉酸レダクターゼおよびH
工L−2の両方の生産レベルを高めた。不法は[共増@
(コ・アンプリフイケーション〕」と呼ばれる。
本発明では他の同様な選択用遺伝子系を使用できるが、
必ずしも全の系で共増幅が起るものでもない。例えば、
他の系で共増幅が起らないものとしてE、coliのキ
サンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
をコードするgpt遺伝子がある。 M(10)lig
anら[Proc NatIAaad日ci 。
必ずしも全の系で共増幅が起るものでもない。例えば、
他の系で共増幅が起らないものとしてE、coliのキ
サンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
をコードするgpt遺伝子がある。 M(10)lig
anら[Proc NatIAaad日ci 。
T1.S、A、、 78巻、2072貞(1981年)
〕はgpt遺伝子を保有するプラスミドでトランスフェ
クションさnたサルおよびマウス細胞全選択する(7)
K細胞をミコフェノール酸(グアニル酸の新合成のIJ
W剤)、アデニンおよびキサンチン存在下で培養した。
〕はgpt遺伝子を保有するプラスミドでトランスフェ
クションさnたサルおよびマウス細胞全選択する(7)
K細胞をミコフェノール酸(グアニル酸の新合成のIJ
W剤)、アデニンおよびキサンチン存在下で培養した。
この系での選択はさらに選択培地にアミノプテリン(ア
ミノプテリンのアナログ)全添加することにより高めら
nる。
ミノプテリンのアナログ)全添加することにより高めら
nる。
他の選択系としてはバクテリアのアミノグリコシド6′
−ホスフォトランスフェラーゼ、バクテリアのネオマイ
シンおよびカナマイシン耐性ケ呈する産物、の遺伝子が
用いられる。colbsre −Garapinら[J
、 MO1’ Biol、 150巻、1頁(198’
1年)〕はヘルペスシンプレックスウィルスのチミジン
キナーゼ(H8V tk )遺伝子プロモータの制御下
にあるフォスフオドランスフェラーゼ遺伝子を保有する
プラスミドでトランスフェクトしだ補乳細胞fA択する
のに、剛胞kX核細胞の蛋白合成を阻害する2−デオキ
シストレプタミン抗性物質であるG−418存在下で生
育させた。Eerg[8ciencs213巻、296
頁(1981年)〕はホスフォトランスフェラーゼ遺伝
子がSV4[]プロモータの制御下にある一連のpsV
ベクターを用いて同じ結果ケ得ている。
−ホスフォトランスフェラーゼ、バクテリアのネオマイ
シンおよびカナマイシン耐性ケ呈する産物、の遺伝子が
用いられる。colbsre −Garapinら[J
、 MO1’ Biol、 150巻、1頁(198’
1年)〕はヘルペスシンプレックスウィルスのチミジン
キナーゼ(H8V tk )遺伝子プロモータの制御下
にあるフォスフオドランスフェラーゼ遺伝子を保有する
プラスミドでトランスフェクトしだ補乳細胞fA択する
のに、剛胞kX核細胞の蛋白合成を阻害する2−デオキ
シストレプタミン抗性物質であるG−418存在下で生
育させた。Eerg[8ciencs213巻、296
頁(1981年)〕はホスフォトランスフェラーゼ遺伝
子がSV4[]プロモータの制御下にある一連のpsV
ベクターを用いて同じ結果ケ得ている。
4f:産細胞より分泌したH几−2は本技術で仰ら1し
るどんな方法によっても培地中で同定できる。
るどんな方法によっても培地中で同定できる。
例えば、増殖に関してH工L −2依存性の細胞上使用
したバイオアッセイを用いることが出来る。さらに、H
工L−2に対する抗体を用いてラジオイムノアッセイ′
または酵素結合免疫アッセイを利用することもできる。
したバイオアッセイを用いることが出来る。さらに、H
工L−2に対する抗体を用いてラジオイムノアッセイ′
または酵素結合免疫アッセイを利用することもできる。
ポリアクリルアミドデル電気泳動ノ後りエスタンプロッ
ト〔・rowbin C)、ProcHate、 Ac
a、1−8ci−U、S、A、 7 (5巻、4550
頁(1979年)]L9ユ同様な分析方法も使用できる
。また、高速酸体クロマトグラフィー(HPLO)もq
tern [米国”4 許4,49 o、289番〕に
より記載さnているように使用できる。
ト〔・rowbin C)、ProcHate、 Ac
a、1−8ci−U、S、A、 7 (5巻、4550
頁(1979年)]L9ユ同様な分析方法も使用できる
。また、高速酸体クロマトグラフィー(HPLO)もq
tern [米国”4 許4,49 o、289番〕に
より記載さnているように使用できる。
本発明のH工L−2は硫酸ナトリウムまた硫酸アンモニ
ウムなどの埴による沈澱、限外濾過まlζはこの分舒に
熟練した名に工く仰られるその他の方法により濃縮さ7
Lる。その後の和製はデル濾過、イオン又換クロマ1グ
りフィー、分虚用′4気永動、イソエレクトロフォカス
、低己刊<fA ’kj W分画、HPLC、或いは向
流分配などの退席の蛋白和製技術により達成できるが、
こlLI:)に限定さ九るものではない。Gtern
C上述)により2歳て几る方法−イiド L會〕1ト
入II)L−tb:乙 −ヤ I 、lA一本発明によ
ると、前述の和製H工L−2は例えば免疫低下状態の治
療などの疾患の治療および予防に他の免疫調節化合物と
同じ目的で使用される。
ウムなどの埴による沈澱、限外濾過まlζはこの分舒に
熟練した名に工く仰られるその他の方法により濃縮さ7
Lる。その後の和製はデル濾過、イオン又換クロマ1グ
りフィー、分虚用′4気永動、イソエレクトロフォカス
、低己刊<fA ’kj W分画、HPLC、或いは向
流分配などの退席の蛋白和製技術により達成できるが、
こlLI:)に限定さ九るものではない。Gtern
C上述)により2歳て几る方法−イiド L會〕1ト
入II)L−tb:乙 −ヤ I 、lA一本発明によ
ると、前述の和製H工L−2は例えば免疫低下状態の治
療などの疾患の治療および予防に他の免疫調節化合物と
同じ目的で使用される。
これは医薬的に容虻さnる経口、注射または局所用組成
物として投与される。投与量および投与頻度は現在臨床
に使用されている既仰の免疫調節化合物と相関し、典型
的には一日およそ1−2(11)XIO’単位である。
物として投与される。投与量および投与頻度は現在臨床
に使用されている既仰の免疫調節化合物と相関し、典型
的には一日およそ1−2(11)XIO’単位である。
不発明のこれらの医薬組成物に該H工L −2,と共に
適合した医薬的1f−1’容相体物質を含も・。通常の
どんな相体物質でも利用できる。
適合した医薬的1f−1’容相体物質を含も・。通常の
どんな相体物質でも利用できる。
囲体物質は経口、公皮または非経口投与に通した有機ま
たは無機の不活性相体物質などである。適当な相体とし
ては水、ゼラチン、アラビアゴム、乳糖、でん粉、ステ
アリン酸マグネシウム、メルク、植物性油脂、?リアル
キレングリコール、特にボリエ°チし・ングリコール、
黄色ワセリン等がある。さらに、医薬調製物は他の医薬
もら性Ail ’、を含ひことができろ。孔料、保存剤
、安定剤、乳化剤、緩備剤などのg:j加物も医35品
に1製のWト容実施に沿って添加できる。
たは無機の不活性相体物質などである。適当な相体とし
ては水、ゼラチン、アラビアゴム、乳糖、でん粉、ステ
アリン酸マグネシウム、メルク、植物性油脂、?リアル
キレングリコール、特にボリエ°チし・ングリコール、
黄色ワセリン等がある。さらに、医薬調製物は他の医薬
もら性Ail ’、を含ひことができろ。孔料、保存剤
、安定剤、乳化剤、緩備剤などのg:j加物も医35品
に1製のWト容実施に沿って添加できる。
医薬調製物は如何なる適当な医薬剤型にも作成でき、例
えばa)!’剤、カプセル、ピル錠、粉ス、顆粒などの
固型剤、b)溶液、シロップ、けん濁液、エレキシル等
の液剤、C)滅菌水、滅菌けん濁液または乳化液のよう
な非経口投与剤、およびd)溶液、けん濁液、軟膏、ク
リーム、デル、微細粉末、エアロゾール等の局所投与剤
などがある。
えばa)!’剤、カプセル、ピル錠、粉ス、顆粒などの
固型剤、b)溶液、シロップ、けん濁液、エレキシル等
の液剤、C)滅菌水、滅菌けん濁液または乳化液のよう
な非経口投与剤、およびd)溶液、けん濁液、軟膏、ク
リーム、デル、微細粉末、エアロゾール等の局所投与剤
などがある。
医薬調製物は滅菌し、そして/または保存剤、安定剤、
湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塙、および/または緩
衝剤のようなアジュバントに含有できるO
曳非経口剤型は冷浸剤また
は静注或いは筋注用注射剤である。こnらの剤型もまた
他の医薬活性物質を含むことができる。医薬製剤で許容
される実施に沿って保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤な
どの添加剤km加しても構わない。
湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塙、および/または緩
衝剤のようなアジュバントに含有できるO
曳非経口剤型は冷浸剤また
は静注或いは筋注用注射剤である。こnらの剤型もまた
他の医薬活性物質を含むことができる。医薬製剤で許容
される実施に沿って保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤な
どの添加剤km加しても構わない。
実施例
以下の実施例は制限することな(H工L−20晴乳動物
細胞中でのクローニングおよび発現を実施する方法を示
す。以下の例によりH工L−2遺伝子の正常な5′非コ
ード碩域をラットインシュリン遺伝子の配列と置換した
事によるlJ!云子発子発現強が証明される。
細胞中でのクローニングおよび発現を実施する方法を示
す。以下の例によりH工L−2遺伝子の正常な5′非コ
ード碩域をラットインシュリン遺伝子の配列と置換した
事によるlJ!云子発子発現強が証明される。
DNAの調製
定常期の一晩培養物よりプラスミドDNAの小規模単離
はBirnboimら(Nucleic Ac1as
Re5earch7巻、1516頁(1979年)〕の
方法に促って行なった。本法では分析用の少雪のDNA
をバクテリア培養物より単離することが出来る。特に記
載しない限り、大量のプラスミl−’DNAはc1θw
ellら(、T、Bacteriol、 11 Q巻、
1135@(1972生り〕の記載の通りv!4製した
。プラスミドDNAな特定の制限酵素で切断して得られ
る断片は1%の低融解アガロース(5eaplaque
、 JFMc工QC,、メイン州ロックランド)中の
分離用電気泳動で単離した。
はBirnboimら(Nucleic Ac1as
Re5earch7巻、1516頁(1979年)〕の
方法に促って行なった。本法では分析用の少雪のDNA
をバクテリア培養物より単離することが出来る。特に記
載しない限り、大量のプラスミl−’DNAはc1θw
ellら(、T、Bacteriol、 11 Q巻、
1135@(1972生り〕の記載の通りv!4製した
。プラスミドDNAな特定の制限酵素で切断して得られ
る断片は1%の低融解アガロース(5eaplaque
、 JFMc工QC,、メイン州ロックランド)中の
分離用電気泳動で単離した。
DNAは先ずトリス−酢酸緩衝液中で9X5’凛デルで
分離しく maniatisら、Mo1ec(10)a
r (31oning:ムLaboracory Ma
nual 、 198’1手、OO]111−5pri
n Harbor Laboratory 、 454
貞〕、次に1μp/me、エチソウムデロミドで栗色し
て検出した。
分離しく maniatisら、Mo1ec(10)a
r (31oning:ムLaboracory Ma
nual 、 198’1手、OO]111−5pri
n Harbor Laboratory 、 454
貞〕、次に1μp/me、エチソウムデロミドで栗色し
て検出した。
目的のDNA断片を言むrル切片を切り出して65°C
10分間融屏し、20mM)リス■塩酸(−7・4)、
0.2 M NaC1、1mM ff1DTA 5 m
lで希釈した。次にDNAをKlutip−Dカラム(
5chleicher ana 5chucll工nc
、、ニューI・ンプシャー州キーン)を用いテ製造元の
指示に従って−一し、酵母tRNA (Bethesd
aRessaceh Laboratories 、メ
リーランド州ベセスダ)10μIの存在下−20″Cで
エタノール化でんを行なった。
10分間融屏し、20mM)リス■塩酸(−7・4)、
0.2 M NaC1、1mM ff1DTA 5 m
lで希釈した。次にDNAをKlutip−Dカラム(
5chleicher ana 5chucll工nc
、、ニューI・ンプシャー州キーン)を用いテ製造元の
指示に従って−一し、酵母tRNA (Bethesd
aRessaceh Laboratories 、メ
リーランド州ベセスダ)10μIの存在下−20″Cで
エタノール化でんを行なった。
酵素反応
罪1限酵素、DNAポリメラーゼエ(フレナラ断片)お
工びT 4 DNA IJが一ゼはマサチュセツツ州の
New fflngland Biolabsの製品で
ある。これらの酵素の使用法および吠用粂件は本員的に
は製遺元のものと同じである。
工びT 4 DNA IJが一ゼはマサチュセツツ州の
New fflngland Biolabsの製品で
ある。これらの酵素の使用法および吠用粂件は本員的に
は製遺元のものと同じである。
+tjll Itエンげヌクレアーゼについては、1単
位の活性は全反応液0−05aJで67°060分間行
なった消化で1.Op、9のDNAを完全に消化するの
に必要な酵累量と定義する。これらの酵素全てVC[i
用した緩衝液(以後制限酵素緩衝液という)は1(11
)mM NaC1、i Q mM ) リ
ス − 塩tfi (P)(7−5) 、5 m
M ’jhg、C12および1mM2−メルカプトエタ
ノールエリ成る。
位の活性は全反応液0−05aJで67°060分間行
なった消化で1.Op、9のDNAを完全に消化するの
に必要な酵累量と定義する。これらの酵素全てVC[i
用した緩衝液(以後制限酵素緩衝液という)は1(11
)mM NaC1、i Q mM ) リ
ス − 塩tfi (P)(7−5) 、5 m
M ’jhg、C12および1mM2−メルカプトエタ
ノールエリ成る。
T J DNA J合反応d4−016時間、60mM
トリス−4戚(pH7,5)、10 mM Mg012
.1Q mMジチオスライトールおよび0.1 mM
ATPq 含有する緩#i液(以後ライr−ンヨン護面
液と呼ぶ)中で行なった。T 4 DNA IJガーぜ
r古注の1111泣はラムダDNAのHlna l断片
の5’ DNA末端一度0.127’M (3(11)
μjJ / ml )を反Lrf;e2Gpl中で16
’060分で50%の結合を行なうのに必女な菫と定義
する。
トリス−4戚(pH7,5)、10 mM Mg012
.1Q mMジチオスライトールおよび0.1 mM
ATPq 含有する緩#i液(以後ライr−ンヨン護面
液と呼ぶ)中で行なった。T 4 DNA IJガーぜ
r古注の1111泣はラムダDNAのHlna l断片
の5’ DNA末端一度0.127’M (3(11)
μjJ / ml )を反Lrf;e2Gpl中で16
’060分で50%の結合を行なうのに必女な菫と定義
する。
DNAポリメラーゼエのフレナラ断片を用いた一本鎖D
NAグ〕平滑末端乍成はi mM aGTP 、 aA
TP、aeTP ’ji−工びaTTP馨言むLf)に
調整した制限酵素後備牧牛で行なった。活性011−泣
は67′CろO分間で1Q nmolθのデオキシリボ
ヌクレオチドを酸不靜性に変換するI!#累の量と定義
する。
NAグ〕平滑末端乍成はi mM aGTP 、 aA
TP、aeTP ’ji−工びaTTP馨言むLf)に
調整した制限酵素後備牧牛で行なった。活性011−泣
は67′CろO分間で1Q nmolθのデオキシリボ
ヌクレオチドを酸不靜性に変換するI!#累の量と定義
する。
培養培地
イスコープの改良イーグル培地(工MEM )〔工5c
oveら、y、gzp、Me(1,147巻、926頁
(1978f−)]はニューヨーク州グランドアイラン
ドのGrancL l5land Biologica
l Co、より購入した。
oveら、y、gzp、Me(1,147巻、926頁
(1978f−)]はニューヨーク州グランドアイラン
ドのGrancL l5land Biologica
l Co、より購入した。
ルリア堵地(L12)は1リットル当り59 tRクト
イーストエキストラクト、10yバクトドリゾトンおよ
び101 maazを苫み、−は八5に調整する。アン
ぎンリンは6己載がろれば終一度50μ/l / rn
tで添加する。
イーストエキストラクト、10yバクトドリゾトンおよ
び101 maazを苫み、−は八5に調整する。アン
ぎンリンは6己載がろれば終一度50μ/l / rn
tで添加する。
l5cherichia coliの菌株v1. Pe
acockら(Biochim Biophys、
Acta 655巻、246頁1981年)〕の方法に
従い、本質的に以下の通り形質転換した。LB培地で生
胃させた細胞を集め、Norgaraら(、T、 Bi
ol、 ahem、 225巻、7665貞(1980
年)〕の方法により°形質転換りため調製した。但し、
Oa、C12緩衝液は70mMのMn0J2.4 Q
mM Na0ACお工び3 [1mM 0ts012を
含有するように改変し、PI″lは5.6とした。
acockら(Biochim Biophys、
Acta 655巻、246頁1981年)〕の方法に
従い、本質的に以下の通り形質転換した。LB培地で生
胃させた細胞を集め、Norgaraら(、T、 Bi
ol、 ahem、 225巻、7665貞(1980
年)〕の方法により°形質転換りため調製した。但し、
Oa、C12緩衝液は70mMのMn0J2.4 Q
mM Na0ACお工び3 [1mM 0ts012を
含有するように改変し、PI″lは5.6とした。
0aOJ2緩4Jii液にけん濁した細胞試料1(11
)μlを50から1.(11)On、!ilのDNAを
含むシラスミげ試料50 pgと合わせる。混合物を氷
上に1時間保持した後、37’Cで2分間加温する。細
胞をアンピシリン含有のLBM天培地上4 ”Cでまい
てから67゛C16時間インキュベートして形質転換株
を選択する。
)μlを50から1.(11)On、!ilのDNAを
含むシラスミげ試料50 pgと合わせる。混合物を氷
上に1時間保持した後、37’Cで2分間加温する。細
胞をアンピシリン含有のLBM天培地上4 ”Cでまい
てから67゛C16時間インキュベートして形質転換株
を選択する。
以下の逼り、Grahamら(vtrology 52
巻、456頁(1973年)〕の方法によりチャイニー
ズ/・ムスター卵巣細胞をトランスフェクトした。
巻、456頁(1973年)〕の方法によりチャイニー
ズ/・ムスター卵巣細胞をトランスフェクトした。
1リットル当り81のNaCAt 、 0−371のK
Cl 。
Cl 。
0.1251 cD Na2f(po’、・21(20
,11のグルコース、3Fのトリスおよび125mmの
QhC12の混合液Q、5 #ft K DNA it
101’l ’< 2有したものを11]’M3ポキ
サンチンお工び10−6Mチミゾンサセの工Ml!iM
4 ttd3を含む6αのペトリ皿中の5X105個
の細胞に加える。混合成牛のDNAは担体と[7ての5
μIの仔牛胸線高分子量DNAおよびPvu工で開環し
たpBo i 2/RBV/ f L −2/、1hf
rDNA 5 ilMより取る。
,11のグルコース、3Fのトリスおよび125mmの
QhC12の混合液Q、5 #ft K DNA it
101’l ’< 2有したものを11]’M3ポキ
サンチンお工び10−6Mチミゾンサセの工Ml!iM
4 ttd3を含む6αのペトリ皿中の5X105個
の細胞に加える。混合成牛のDNAは担体と[7ての5
μIの仔牛胸線高分子量DNAおよびPvu工で開環し
たpBo i 2/RBV/ f L −2/、1hf
rDNA 5 ilMより取る。
培養を加湿した5%CO2インキュベーター中、67℃
で一晩行なった後、培地を除去し、10−4Mヒポキサ
ンチンおよび10−5Mチミゾン(HT)添加の新しい
培地5 rnlと置換する。さらに−日インキュベート
の後、細胞をトリプシン−!DTA溶液(Gよりeりを
用いてぺl−IJ皿エリ剥離し、透析した仔牛脂児皿y
(Fcs) 10%を言み、HT非含有のXMlgt
A 2[1mlを含有する2枚の10mペトリ皿にプレ
ートする。さらに67°Cで10日間インキュベート仮
、標準のクローニングシリンダー法を用いてトランスフ
ェクトしたコロニーを単離した。
で一晩行なった後、培地を除去し、10−4Mヒポキサ
ンチンおよび10−5Mチミゾン(HT)添加の新しい
培地5 rnlと置換する。さらに−日インキュベート
の後、細胞をトリプシン−!DTA溶液(Gよりeりを
用いてぺl−IJ皿エリ剥離し、透析した仔牛脂児皿y
(Fcs) 10%を言み、HT非含有のXMlgt
A 2[1mlを含有する2枚の10mペトリ皿にプレ
ートする。さらに67°Cで10日間インキュベート仮
、標準のクローニングシリンダー法を用いてトランスフ
ェクトしたコロニーを単離した。
アフリカミドリプル腎臓細胞(COS)をButnic
lcら(Mo1. Ce11. Biol、 5巻、6
(11)9 A (1985年月の記載する方法を用い
てトランスフェクトする。
lcら(Mo1. Ce11. Biol、 5巻、6
(11)9 A (1985年月の記載する方法を用い
てトランスフェクトする。
10/:rrLcr)組戦培養皿に、13 % Fe2
および50μI/ lnl U) r ンタマイシンを
添加したiQig工1cM中のaos細IM5X11J
’個を嶺イ血し、力uW 5 % CO2インキュベー
ター中で67′C−晩インキユベートする。M2Rを3
7−Of/)りん酸緩衝塩液(1’Bs)で−回、そし
て2Mの5(11) pg / ml DzhT−デキ
ストラン(Pharmacia)含有PBSで洗滌する
。次にトランスフェクトするDNAを細胞に添加する。
および50μI/ lnl U) r ンタマイシンを
添加したiQig工1cM中のaos細IM5X11J
’個を嶺イ血し、力uW 5 % CO2インキュベー
ター中で67′C−晩インキユベートする。M2Rを3
7−Of/)りん酸緩衝塩液(1’Bs)で−回、そし
て2Mの5(11) pg / ml DzhT−デキ
ストラン(Pharmacia)含有PBSで洗滌する
。次にトランスフェクトするDNAを細胞に添加する。
続いてCO8細胞を5分間隔で培養皿7静かに振とうし
ながら60分間インキュベートする。インギュベーショ
ン後、10%FC8,501’:j/ tllcO’y
’ ンl マイクンおよび80μMのクロロキンを含有
する工MEMを20ゴ各皿に疹加する。さらに2.5時
間インキュベートした仮、培地を10%FC!お工び5
0μi / lnl )y’ンタマイシン言有の新しい
IMI培地でvL懐する。インキュベーションンろ7
”Cで72時間読けた後、細胞および培地を以下のよう
に分析する。
ながら60分間インキュベートする。インギュベーショ
ン後、10%FC8,501’:j/ tllcO’y
’ ンl マイクンおよび80μMのクロロキンを含有
する工MEMを20ゴ各皿に疹加する。さらに2.5時
間インキュベートした仮、培地を10%FC!お工び5
0μi / lnl )y’ンタマイシン言有の新しい
IMI培地でvL懐する。インキュベーションンろ7
”Cで72時間読けた後、細胞および培地を以下のよう
に分析する。
細胞培養
本明細書では2株のgscherichia colk
菌株を使用した。m、 coli G M 1i 9休
i MarinuBら(J、Bacteriol、 1
14 巷、1146頁(197%、l)にニリajtk
Eされており、1nerican ’]”ype C(
10)cureCo11ection K 寄託番号A
Taa 53339として、1985年11月26日に
制限なしで寄託されている。E、collMO1061
9は0asaaabanら[J、+401. B111
. i 3 F3巻、179貞(1980年)]により
記載されている。本菌株も1985手11月26日にA
merican Type C!(10)ture 0
ollection(ATCりにATcc 53338
として制限なしに寄託されている。
菌株を使用した。m、 coli G M 1i 9休
i MarinuBら(J、Bacteriol、 1
14 巷、1146頁(197%、l)にニリajtk
Eされており、1nerican ’]”ype C(
10)cureCo11ection K 寄託番号A
Taa 53339として、1985年11月26日に
制限なしで寄託されている。E、collMO1061
9は0asaaabanら[J、+401. B111
. i 3 F3巻、179貞(1980年)]により
記載されている。本菌株も1985手11月26日にA
merican Type C!(10)ture 0
ollection(ATCりにATcc 53338
として制限なしに寄託されている。
6株の哨乳動物細胞株を開用した。一つはゾと一〇葉虚
レダクターゼを欠損したチャイニーズ・・ムスター卵巣
細胞株(CkiO/ dhfr−)である。この細胞株
は元来、[Jrlaub I;) (Proc、Nat
l、Acad、Sci。
レダクターゼを欠損したチャイニーズ・・ムスター卵巣
細胞株(CkiO/ dhfr−)である。この細胞株
は元来、[Jrlaub I;) (Proc、Nat
l、Acad、Sci。
σ、S、A、 77巻、4216頁(1980年)〕に
より単離された。不利1施株は1986年5月7日にA
merican Type Ou1℃ure Co11
ectionにを託番号ORL 9(15)6として寄
託されている。開始点欠損sv4[1ワイルス道伝子に
エリ形質転換されたアフリカミトリずルの′Ilf城細
胞株(CO8)[Gluzman、 Ce1l i
3巻、175頁(1981年)]r1.ATOCエリa
xL−1651として人手可能である。
より単離された。不利1施株は1986年5月7日にA
merican Type Ou1℃ure Co11
ectionにを託番号ORL 9(15)6として寄
託されている。開始点欠損sv4[1ワイルス道伝子に
エリ形質転換されたアフリカミトリずルの′Ilf城細
胞株(CO8)[Gluzman、 Ce1l i
3巻、175頁(1981年)]r1.ATOCエリa
xL−1651として人手可能である。
Ro bb(Methods in fiuzy*ol
ogy 1i 6巻、493貞(1985年)〕にLり
記載されているネズミzL−2X存注細@株(cTLh
) HATCC工りTより214として人手可能である
。
ogy 1i 6巻、493貞(1985年)〕にLり
記載されているネズミzL−2X存注細@株(cTLh
) HATCC工りTより214として人手可能である
。
プライマー指示変異
プライマー指示変異処理はmorinagaら[BiO
technOIOg72巻、666頁(1984年)]
にLり記載される方法に従って行なった。変異処理を行
なうために防用した合成オリゴヌクンオチドy@ Ma
tteucciら[J、Am、Chem、Soc、 I
O3巷、6185頁(1981年)〕のホスフォアミ
シト固体担体法にエリ調製した。
technOIOg72巻、666頁(1984年)]
にLり記載される方法に従って行なった。変異処理を行
なうために防用した合成オリゴヌクンオチドy@ Ma
tteucciら[J、Am、Chem、Soc、 I
O3巷、6185頁(1981年)〕のホスフォアミ
シト固体担体法にエリ調製した。
コロニーハイテリタイゼーション
コロニーハイフリタイゼゞ−ンヨンハManiatis
ら[Mo1sc(10)ar (jloning ;
A Laboratory ;Janual、1982
手、Co1d Spring Harbor Laoo
ratory 。
ら[Mo1sc(10)ar (jloning ;
A Laboratory ;Janual、1982
手、Co1d Spring Harbor Laoo
ratory 。
312−315頁]にエリ配或される方法ンこより行な
った。!ライマー指示V異に開用したと同じオリゴヌク
レオチVをManiatisら〔上述、696貝〕の方
法に従い、ポリヌクVオチドキナーゼを用いてγ−”P
−ATPで5′末畑を標識してハイブリダイゼーシヨ
ンに用いた。工L−2およびdhf r遺伝子の検出に
用いる大きいDNA 7′ロープはニックトランスレー
ションキット(Amerθham) ヲ用’Aて製造元
の指示通りに標識した。
った。!ライマー指示V異に開用したと同じオリゴヌク
レオチVをManiatisら〔上述、696貝〕の方
法に従い、ポリヌクVオチドキナーゼを用いてγ−”P
−ATPで5′末畑を標識してハイブリダイゼーシヨ
ンに用いた。工L−2およびdhf r遺伝子の検出に
用いる大きいDNA 7′ロープはニックトランスレー
ションキット(Amerθham) ヲ用’Aて製造元
の指示通りに標識した。
pBC12/ R8V 7エh−2/ ahfrの構築
本発明の最終発現ベクターは以下の段階を経て調製した
:(1)悌飾したヒトミ工L−2選云子を押入するベク
ターの調製、(2)H工し+−2遺云千の6′非コード
頭域の大部分、5′の非コード碩域の全ておよびシグナ
ルペゾチド配列をコードする配列の最初の4個のヌクレ
オチドの削除による1じ飾、および(3)1φ飾■工L
−21を云十のベクターへの一人。
本発明の最終発現ベクターは以下の段階を経て調製した
:(1)悌飾したヒトミ工L−2選云子を押入するベク
ターの調製、(2)H工し+−2遺云千の6′非コード
頭域の大部分、5′の非コード碩域の全ておよびシグナ
ルペゾチド配列をコードする配列の最初の4個のヌクレ
オチドの削除による1じ飾、および(3)1φ飾■工L
−21を云十のベクターへの一人。
pB012Mニブラスミド1)NA (第1凶会照)1
μIを1(11)μeの匍jI波酵素緩衝孜中2U単位
の8a;ki工で67“C51時間処理する。シラスミ
ドp8t312M工を百MするW、 0oli g C
1061床は1986年5月7日に、American
Typa (j(10)cure (3o11ect
ionにhTaa 67 I Q 9番として寄託され
ている。
μIを1(11)μeの匍jI波酵素緩衝孜中2U単位
の8a;ki工で67“C51時間処理する。シラスミ
ドp8t312M工を百MするW、 0oli g C
1061床は1986年5月7日に、American
Typa (j(10)cure (3o11ect
ionにhTaa 67 I Q 9番として寄託され
ている。
Baau工で消化したシラスミドを4単位のDNAポリ
メラーゼエクレナウ断片で15”0,2時間処理した後
、反応液乞65°05分間加熱して反応を停止する。反
応液2μlを2イデーシヨン緩衝液で1コする。
メラーゼエクレナウ断片で15”0,2時間処理した後
、反応液乞65°05分間加熱して反応を停止する。反
応液2μlを2イデーシヨン緩衝液で1コする。
ライr−ジョン反応液を直接F:、coli aMl
19の形質転換に便用する。形質転換株をアンビンリン
富有LBg天上で選択する。得られるアンピシリン附注
コロニーからのDNA Kつき?l111限酵素切断で
検索する。単離しfc7″ラス f DNA ’y(先
ずBaau(工またはCla工で消化し、得られるDN
A断片を1%アがロースモル戒気泳動で分離し、10μ
、!+7 /utlの臭化エチジウムで検出する。Ba
mH工% Mを欠失し、その代りにCla■部位を獲得
した一つのシラスミドを同定し、シラスミドpBOi2
0I と命名し友。
19の形質転換に便用する。形質転換株をアンビンリン
富有LBg天上で選択する。得られるアンピシリン附注
コロニーからのDNA Kつき?l111限酵素切断で
検索する。単離しfc7″ラス f DNA ’y(先
ずBaau(工またはCla工で消化し、得られるDN
A断片を1%アがロースモル戒気泳動で分離し、10μ
、!+7 /utlの臭化エチジウムで検出する。Ba
mH工% Mを欠失し、その代りにCla■部位を獲得
した一つのシラスミドを同定し、シラスミドpBOi2
0I と命名し友。
次にシラスミドpBc!120工を01eTvellら
の界面n5°で1三メ1すtM 法 (J 、Bact
eriol、 1 1 [1巻、 1165頁(
1972年)〕により火種に調製した。クローニングベ
クターの最後の調製は1μJのpBO120工を20単
位の01eh工で切断し、消化生成物をDNAポリメラ
ーゼエリ〕クレナウげ「片で平滑末端とする。
の界面n5°で1三メ1すtM 法 (J 、Bact
eriol、 1 1 [1巻、 1165頁(
1972年)〕により火種に調製した。クローニングベ
クターの最後の調製は1μJのpBO120工を20単
位の01eh工で切断し、消化生成物をDNAポリメラ
ーゼエリ〕クレナウげ「片で平滑末端とする。
ヒトエr、−2の459 bpの全コード鎖酸に61b
pの5′非翻訳配列および3 Ll 9 DPの6′非
翻訳配列が結合しfCCDNA ニアビー[: Tan
1qucniら、Naturli1302舎、605貞
(1983年9〕を言ひシラスミHe pIL−2−2
bを工L−2.1云子の材料として用いた。HIL−2
1yi云子のヌクレオチげ配列はTaniguchiら
Kより明かにされているので、HIり一2遺伝子な言む
遣云子断片は5ouzaら〔−x州特許出顕爾A/13
4489)の記載する方法を用いて合成することも出来
る。10μ、yv)p工h−2−2bをRsa工お工び
Bam1(工を谷20単位で1(11)μlの制限酵素
d両液中37 ’01時間処理する。Rea工はHIL
−2c DNAをHIL−2の開始コドンの1 bp
3’側のm−15Tで切断する。反応献を次にf)HA
ポリメラーゼのフレナラ断片で処理し、1%融解アがロ
ースデル中で分離用電気泳動を行なう。目的の760b
pのRsa工/ BamdI HIL −2cD ri
h断片を同定し、前述のとおりデルより抽出する。
pの5′非翻訳配列および3 Ll 9 DPの6′非
翻訳配列が結合しfCCDNA ニアビー[: Tan
1qucniら、Naturli1302舎、605貞
(1983年9〕を言ひシラスミHe pIL−2−2
bを工L−2.1云子の材料として用いた。HIL−2
1yi云子のヌクレオチげ配列はTaniguchiら
Kより明かにされているので、HIり一2遺伝子な言む
遣云子断片は5ouzaら〔−x州特許出顕爾A/13
4489)の記載する方法を用いて合成することも出来
る。10μ、yv)p工h−2−2bをRsa工お工び
Bam1(工を谷20単位で1(11)μlの制限酵素
d両液中37 ’01時間処理する。Rea工はHIL
−2c DNAをHIL−2の開始コドンの1 bp
3’側のm−15Tで切断する。反応献を次にf)HA
ポリメラーゼのフレナラ断片で処理し、1%融解アがロ
ースデル中で分離用電気泳動を行なう。目的の760b
pのRsa工/ BamdI HIL −2cD ri
h断片を同定し、前述のとおりデルより抽出する。
前に調製したベクターpBc12c工1(11) nN
を2単位の74 DNAりが−ゼを言む30 ptlの
2イデーシヨン緩衝液中でi o o nJのRea工
/ BamH工H工L−2M片と混ぜ合し、4′cで一
晩インキユベートする。得られるDNAをfij、co
li Me 1061株の形質転換に用い、アンビンリ
ン貧有のLB摩大平板上で形質転換株を選択する。
を2単位の74 DNAりが−ゼを言む30 ptlの
2イデーシヨン緩衝液中でi o o nJのRea工
/ BamH工H工L−2M片と混ぜ合し、4′cで一
晩インキユベートする。得られるDNAをfij、co
li Me 1061株の形質転換に用い、アンビンリ
ン貧有のLB摩大平板上で形質転換株を選択する。
2(11) nJの単離H工L−2断片を用いて、Am
ersham !!ニックトランスレーションキットを
開用して製造元の南示通りに32p標識デローデをmf
i L7t。平板上のコロニーをニトロセルロースフィ
ルター(Schleichsr ana 5cnuel
l工ne、)Vこ吊り上げ、標識プローブを用い、Ma
niall、18ら(Mo1ec(10)ar Olo
aing: A Laboratory manual
、、1982年、(11)1(L Spring Ha
rbor Laboratory )の方法VC従って
mより一2坤人乞検索した。ハイデリダイゼーンヨン陽
性コロニーを選択し、Birnboimらの方法VC工
りDdAミニA製を行なった。得られたDNAをHln
a iお工びStu工で切断し、ベクターが正しく構築
されている事を示す特徴的な690 bp断片の存在を
デル電気体動で検索した。正しい構築ベクター乞pdU
10と砧名する。
ersham !!ニックトランスレーションキットを
開用して製造元の南示通りに32p標識デローデをmf
i L7t。平板上のコロニーをニトロセルロースフィ
ルター(Schleichsr ana 5cnuel
l工ne、)Vこ吊り上げ、標識プローブを用い、Ma
niall、18ら(Mo1ec(10)ar Olo
aing: A Laboratory manual
、、1982年、(11)1(L Spring Ha
rbor Laboratory )の方法VC従って
mより一2坤人乞検索した。ハイデリダイゼーンヨン陽
性コロニーを選択し、Birnboimらの方法VC工
りDdAミニA製を行なった。得られたDNAをHln
a iお工びStu工で切断し、ベクターが正しく構築
されている事を示す特徴的な690 bp断片の存在を
デル電気体動で検索した。正しい構築ベクター乞pdU
10と砧名する。
1)BC10DNA を大1tKFA製L、そ(i’)
10μ、9を制限酵素緩衝液中2o単位のHind I
および16単位のSt、u 工で37°c、 1時間
消化する。得られる6 90 bpのHIL −2DN
A断片を前述と同様に調製用アがロースrAI電気泳動
により単離する。
10μ、9を制限酵素緩衝液中2o単位のHind I
および16単位のSt、u 工で37°c、 1時間
消化する。得られる6 90 bpのHIL −2DN
A断片を前述と同様に調製用アがロースrAI電気泳動
により単離する。
プラスミドpB012 MI DNAの14をBam
HIで切断し、続いてフレナラDNAポリメラーゼで前
述のように処理する。65°Cでインキュベーション後
、DNAをHind Iで切断し、水溶解フェノールー
クロロホルムで抽出後す容量の7.5M酢酸アンモニウ
ムおよび2容量のエタノールを添加し一70°Cにイン
キュベートして沈澱する。沈澱したpBC12MI D
NA k遠心分離で回収後エタノールで洗滌して水にけ
ん濁する。
HIで切断し、続いてフレナラDNAポリメラーゼで前
述のように処理する。65°Cでインキュベーション後
、DNAをHind Iで切断し、水溶解フェノールー
クロロホルムで抽出後す容量の7.5M酢酸アンモニウ
ムおよび2容量のエタノールを添加し一70°Cにイン
キュベートして沈澱する。沈澱したpBC12MI D
NA k遠心分離で回収後エタノールで洗滌して水にけ
ん濁する。
準備しりpBC12MI ヘク1−10 On、9 k
30μgのライデーンヨン緩衝液中で2(11) n
iの単離したIL −2のHind l / Szu
I断片と前述のとおりに結合する。反応液をそのまま用
いてB、 coliMCi 口61株を形質転換し、形
質転換株をアンビンリン含有LB寒天地上上で選択する
。各コロニーにつき690 t)T)のHind l
/ Bato HI断片の存在を前述のように検索し、
この基準に合ったもノThpBC12/RSV/ IL
−2と命名した。
30μgのライデーンヨン緩衝液中で2(11) n
iの単離したIL −2のHind l / Szu
I断片と前述のとおりに結合する。反応液をそのまま用
いてB、 coliMCi 口61株を形質転換し、形
質転換株をアンビンリン含有LB寒天地上上で選択する
。各コロニーにつき690 t)T)のHind l
/ Bato HI断片の存在を前述のように検索し、
この基準に合ったもノThpBC12/RSV/ IL
−2と命名した。
このようにして構築したプラスミドpBC12/FIS
V/IL−2は、HIL −2の5′非コード領域とシ
グナルペプチド配列をコードする配列の最初の4ヌクレ
オチドATGTおよび6′非コード領域のほとんど全て
がpBC12MIベクターに存在するラッテプレプロイ
ンシュリン■遺伝子の対応する配列で[tllれたキメ
ラHIL −2遺伝子を含有している。部分的には一定
の6′非コード領域を有するものも調製した。しかし、
以下に示すように、HIL−2遺伝子の発現レベルを非
常に増加させるのは5′の非コード領域の置換である。
V/IL−2は、HIL −2の5′非コード領域とシ
グナルペプチド配列をコードする配列の最初の4ヌクレ
オチドATGTおよび6′非コード領域のほとんど全て
がpBC12MIベクターに存在するラッテプレプロイ
ンシュリン■遺伝子の対応する配列で[tllれたキメ
ラHIL −2遺伝子を含有している。部分的には一定
の6′非コード領域を有するものも調製した。しかし、
以下に示すように、HIL−2遺伝子の発現レベルを非
常に増加させるのは5′の非コード領域の置換である。
HIL −2ングナルペプチドN末端の最終構造を第2
図に示す。
図に示す。
第2図に示すように、IL −2の最初の2つのアミノ
酸(Mez−Tyr )がインシュリンシグナルペプチ
ドの最初の5個のアミノ酸(Mez−Ala−Leu−
Trp−Ile )および、ライプ−ジョン接点で新た
に出来たヌクレオチドでコードされる6番目のアミノ酸
(Asp )を含むキメラシグナルペプチドが形成され
た。この変化によりシグナルペプチドの機能に影響はな
く、通常のとおり成熟中にIL −2遺伝子から切断さ
れる。
酸(Mez−Tyr )がインシュリンシグナルペプチ
ドの最初の5個のアミノ酸(Mez−Ala−Leu−
Trp−Ile )および、ライプ−ジョン接点で新た
に出来たヌクレオチドでコードされる6番目のアミノ酸
(Asp )を含むキメラシグナルペプチドが形成され
た。この変化によりシグナルペプチドの機能に影響はな
く、通常のとおり成熟中にIL −2遺伝子から切断さ
れる。
pBC12/ R8V/ IL−21μgk Szu
Iで切断する。DNA iフェノール/クロロホルムで
抽出しエタノール沈澱抜水にけん濁する。10μyのp
sV 2 dhfr DNA C3uMamaniら、
mol、 Ce1lBio11巻、854頁(198
1年) ] k Pvu IIおよびBam HIで切
断する。プラスミドpsV 2dhfrはL coli
MC1061(psV 2 dhfr )の形で19
86年5月7日にAmerican TypeC(10
)zure Co11ect、ionに寄託し、ATC
C’ 67110として登録されている。プラスミドp
SV 2 dhfrからSV 40 / dhfr遺伝
子断片を1%の調製用アガロースデルで単離した後、1
(11) n、rのI)BC12/RSV/IL−2ベ
クターを40μ! のライプ−ジョン緩ig中で40
On、!i+の単離SV 40 / dhfr断片と4
℃−晩反応して結合する。反応液を直接用いてE、 c
oli MC1061株を形質転換する。
Iで切断する。DNA iフェノール/クロロホルムで
抽出しエタノール沈澱抜水にけん濁する。10μyのp
sV 2 dhfr DNA C3uMamaniら、
mol、 Ce1lBio11巻、854頁(198
1年) ] k Pvu IIおよびBam HIで切
断する。プラスミドpsV 2dhfrはL coli
MC1061(psV 2 dhfr )の形で19
86年5月7日にAmerican TypeC(10
)zure Co11ect、ionに寄託し、ATC
C’ 67110として登録されている。プラスミドp
SV 2 dhfrからSV 40 / dhfr遺伝
子断片を1%の調製用アガロースデルで単離した後、1
(11) n、rのI)BC12/RSV/IL−2ベ
クターを40μ! のライプ−ジョン緩ig中で40
On、!i+の単離SV 40 / dhfr断片と4
℃−晩反応して結合する。反応液を直接用いてE、 c
oli MC1061株を形質転換する。
形質転換株はアンピシリン含有LB寒天平板上で選択す
る。
る。
形質転換株コロニーをニトロセルロースフィルター上に
吊り上げ、単離SV 40 / dhfr遺伝子断片に
対する32pニツクトランスレージヨー47L識−fロ
ーブで検索する。プローブはSV 40 / dhfr
のPvu■/ BamI断片20 On&を前述のAm
ershamニックトランスレーションキットを用いて
標識して調製した。Birnboin Sの方法(上述
)全周いてハイブリダイゼーション陽性コロニーよりプ
ラスミドDNAを単離し、デル電気泳動分析によりBa
m HI断片を検索した。
吊り上げ、単離SV 40 / dhfr遺伝子断片に
対する32pニツクトランスレージヨー47L識−fロ
ーブで検索する。プローブはSV 40 / dhfr
のPvu■/ BamI断片20 On&を前述のAm
ershamニックトランスレーションキットを用いて
標識して調製した。Birnboin Sの方法(上述
)全周いてハイブリダイゼーション陽性コロニーよりプ
ラスミドDNAを単離し、デル電気泳動分析によりBa
m HI断片を検索した。
Bam HIの存在によりSV 40 / dhfrの
存在を断片はsv 40ウイルスの初期領域プロモータ
ー制御下に全ネズミdhfr遺伝子を含有する。HIL
−2とdhfr遺伝子がシラスミド中で同じ方向aを有
するクローンを選択し、そのクローンThpBR12/
RPV / IL −2/ dhfr (第3図参照
)と命名した。
存在を断片はsv 40ウイルスの初期領域プロモータ
ー制御下に全ネズミdhfr遺伝子を含有する。HIL
−2とdhfr遺伝子がシラスミド中で同じ方向aを有
するクローンを選択し、そのクローンThpBR12/
RPV / IL −2/ dhfr (第3図参照
)と命名した。
HIL −2遺伝子の高発現
HIL −2遺伝子音発現するため、トランスフェクシ
ョンの一日前に5×105個のCHO/ dhfr−細
@ヲ10−4Mのヒポキサンチンおよびiu−” Mの
チミン727I] (HT) IMEM 4 aを含む
6(:IrLの組織培養皿に接種する。加湿5%CO2
インキュベーター中67°C−晩インキュペートの後、
細@をpBC12/ R8V / IL−2/ dhf
rでトランスフェクトする。
ョンの一日前に5×105個のCHO/ dhfr−細
@ヲ10−4Mのヒポキサンチンおよびiu−” Mの
チミン727I] (HT) IMEM 4 aを含む
6(:IrLの組織培養皿に接種する。加湿5%CO2
インキュベーター中67°C−晩インキュペートの後、
細@をpBC12/ R8V / IL−2/ dhf
rでトランスフェクトする。
トランスフェクトしたコロニーを前述の通り選択する。
このようにしてd51−d56と命名したクローン化コ
ロニーを得、これらをIMEM中で生付させて)(IL
−2生産につき他のクローンおよびクローン化前の混
合dhfr+細胞培養物と比較した。
ロニーを得、これらをIMEM中で生付させて)(IL
−2生産につき他のクローンおよびクローン化前の混
合dhfr+細胞培養物と比較した。
HIL −2生産はネズミIL −2依存性細胞株CT
LLに基づく定量バイオアッセイにより測定した。不ア
ッセイはRobb IICよりB己載され[Meiho
ds inEnzymology 116巻、496頁
(1985年)〕、異なるdhfr+細胞クローンから
の培養上澄液の2倍希釈をネズミエL−2依存細胞株C
’TLLと温合することによる。CTLL株はIL −
2存在下でのみ生育できるので、この細胞の増殖の程度
を3H−dTのとり込みで測定することによりdhfr
+クローンにより分泌されるIL −2の量を正確に測
定することが出来る。別法として、HIL −2生産測
定にヒトPHA−芽細@を使用することもできる( R
obbら。
LLに基づく定量バイオアッセイにより測定した。不ア
ッセイはRobb IICよりB己載され[Meiho
ds inEnzymology 116巻、496頁
(1985年)〕、異なるdhfr+細胞クローンから
の培養上澄液の2倍希釈をネズミエL−2依存細胞株C
’TLLと温合することによる。CTLL株はIL −
2存在下でのみ生育できるので、この細胞の増殖の程度
を3H−dTのとり込みで測定することによりdhfr
+クローンにより分泌されるIL −2の量を正確に測
定することが出来る。別法として、HIL −2生産測
定にヒトPHA−芽細@を使用することもできる( R
obbら。
上述)。ヒトPHA−芽細胞はヒト末梢血リンパ球を4
8時間ファイトヘマグルチン(PHA)で誘導すること
により得られる。クローン化したコロニーの分析結果を
第1表に示す。工L −2活性は培地1N当りの単位数
および細胞106個当りの単位数の両方で表わしている
。1単位のIL −2活性は、上述のRobbにより記
載されているNazional CancerInsz
izuze (米国国立がン研究所)のBiologi
calResponse Modifiers Pro
gram (生物応答調節物lX7110グラム)のF
rederick、 MD [Thurma。
8時間ファイトヘマグルチン(PHA)で誘導すること
により得られる。クローン化したコロニーの分析結果を
第1表に示す。工L −2活性は培地1N当りの単位数
および細胞106個当りの単位数の両方で表わしている
。1単位のIL −2活性は、上述のRobbにより記
載されているNazional CancerInsz
izuze (米国国立がン研究所)のBiologi
calResponse Modifiers Pro
gram (生物応答調節物lX7110グラム)のF
rederick、 MD [Thurma。
Lymphokine Res、3巻、276頁(19
84年)〕より入入手症なIL −2標準物質の応答に
調整した1/2最大増殖応答に対応する希釈の逆数と定
義する。
84年)〕より入入手症なIL −2標準物質の応答に
調整した1/2最大増殖応答に対応する希釈の逆数と定
義する。
第1表から明かなとおり、d51およびd53が最も強
い工L −2活性を生産した。前述の選択的遺伝子増幅
効果を確認するたぬ、クローンd 5−1の細胞を7〜
14日間アメトプテリン濃度を徐々に上げて生育てせ、
5 X 10−’ M濃度のアメトプテリン耐性株を得
た。第1表に示すように、この細胞株は高レベルのHI
L −2を分泌した。予想したとおり、本細胞のすずン
分析(Maniatis ラ。
い工L −2活性を生産した。前述の選択的遺伝子増幅
効果を確認するたぬ、クローンd 5−1の細胞を7〜
14日間アメトプテリン濃度を徐々に上げて生育てせ、
5 X 10−’ M濃度のアメトプテリン耐性株を得
た。第1表に示すように、この細胞株は高レベルのHI
L −2を分泌した。予想したとおり、本細胞のすずン
分析(Maniatis ラ。
Mo1ec(10)ar Cloning : A
Laboratory Manual。
Laboratory Manual。
1982年、Co1d Spring Harbor
Laborazory382−389頁〕の結果、細胞
当りおよそ1(11)コピーのpBC12/ R8V
/ 工L−2/ dhfrプラスミドを含有しているこ
とがわかった。HIL −2cCNAコピーにプラスミ
ドpIL −2−2bへの挿入を容易にするためはじめ
につけたホモポリマーa−Cは工L −2遺伝子の発現
に阻害効果がある。
Laborazory382−389頁〕の結果、細胞
当りおよそ1(11)コピーのpBC12/ R8V
/ 工L−2/ dhfrプラスミドを含有しているこ
とがわかった。HIL −2cCNAコピーにプラスミ
ドpIL −2−2bへの挿入を容易にするためはじめ
につけたホモポリマーa−Cは工L −2遺伝子の発現
に阻害効果がある。
正常な5′非コード領域を有する遺伝子とその領域がラ
ッテインシュリンからのものとのIL −2発現の割合
を正しく比較するために、阻害的なホモポリマーチイル
を削除したプラスミドヲ調製する。
ッテインシュリンからのものとのIL −2発現の割合
を正しく比較するために、阻害的なホモポリマーチイル
を削除したプラスミドヲ調製する。
このプラスミドはpBC40ΔTと命名した。
HIL −2遺伝子をクローン化する切断ベクターを1
μgのpBC12MIを制限酵素緩衝液中で20単位の
Bam H工および20単位のBind lで37℃1
時間消化して調製する。得られる断片を次にDNAポリ
メラーゼのフレナラ断片で処理し、フェノール/クロロ
ホルムで抽出後上述のように沈澱する。
μgのpBC12MIを制限酵素緩衝液中で20単位の
Bam H工および20単位のBind lで37℃1
時間消化して調製する。得られる断片を次にDNAポリ
メラーゼのフレナラ断片で処理し、フェノール/クロロ
ホルムで抽出後上述のように沈澱する。
pxL−2−2b DNA 10 t4を20単位のB
amH工おまひ8単位のSr、u Iで消化してHIL
−2DNA断片を調製する。1%の調製用アがロース
デルから前述のようにしておよそ550 bpのHIL
−2断片を単離する。
amH工おまひ8単位のSr、u Iで消化してHIL
−2DNA断片を調製する。1%の調製用アがロース
デルから前述のようにしておよそ550 bpのHIL
−2断片を単離する。
調製Lf pBo 12 MNベクターの10On、9
e150 n、9のHIL −2Bam H工/ Sr
、u I断片と25μノのライプ−ジョン緩wa中で既
に述べたように結合する。反応液を直接用い”’CE、
coli MC1061株を形質転換し、形質転換株を
アンピシリン含有LBII!天平板上で選択する。アン
ピシリン耐性コロニーヲ平板からニトロセルロースフィ
ルターに移し、2(11) n、!i’の精製Bam
MI / St、u断片に対して調製した32p−標識
二ックトランスレーションプローブによるコロニーハイ
ブリダイゼーションでHIL −2挿入の存在を検索す
る。
e150 n、9のHIL −2Bam H工/ Sr
、u I断片と25μノのライプ−ジョン緩wa中で既
に述べたように結合する。反応液を直接用い”’CE、
coli MC1061株を形質転換し、形質転換株を
アンピシリン含有LBII!天平板上で選択する。アン
ピシリン耐性コロニーヲ平板からニトロセルロースフィ
ルターに移し、2(11) n、!i’の精製Bam
MI / St、u断片に対して調製した32p−標識
二ックトランスレーションプローブによるコロニーハイ
ブリダイゼーションでHIL −2挿入の存在を検索す
る。
ハイブリダイゼーション陽性のコロニーヲ選択し、Bi
rnborinら、の方法(プラスミドDNAの制限酵
素分析)によりおよそ560 bpのBsz Ell
/Bam HI断片の存在を検索する。該断片を含有す
るクローンを同定し、pBC40と命名した。プラスミ
ドpBC40はインシュリンの5′非コード領域を欠損
し、代りに天然HIL −2の31 bp 5’非コー
ド領域を有する点板外はpBC12/ R8V / I
L−2と同じである。本プラスミドはまた天然)IIL
−2の開始コドンおよび5′非コード領域に17bp
のホモポリマーチイルを保持している。大量のpBC4
[、I DNAをC1ewellらの方法[J、Bac
+cerio1110巻、1135頁(1972年〕〕
により調製する。
rnborinら、の方法(プラスミドDNAの制限酵
素分析)によりおよそ560 bpのBsz Ell
/Bam HI断片の存在を検索する。該断片を含有す
るクローンを同定し、pBC40と命名した。プラスミ
ドpBC40はインシュリンの5′非コード領域を欠損
し、代りに天然HIL −2の31 bp 5’非コー
ド領域を有する点板外はpBC12/ R8V / I
L−2と同じである。本プラスミドはまた天然)IIL
−2の開始コドンおよび5′非コード領域に17bp
のホモポリマーチイルを保持している。大量のpBC4
[、I DNAをC1ewellらの方法[J、Bac
+cerio1110巻、1135頁(1972年〕〕
により調製する。
HIL −2遺伝子のホモポリマーチイル部分はMor
inagaらのプライマー指示変異CBio /Tec
haolsgy 2巻、666頁(1984年)〕によ
り削除する。これを行なうためりん酸化24塩基デオキ
シオリゴヌクレオチドプライマーを前述のホスフォラミ
シト固体担体法により調製した。
inagaらのプライマー指示変異CBio /Tec
haolsgy 2巻、666頁(1984年)〕によ
り削除する。これを行なうためりん酸化24塩基デオキ
シオリゴヌクレオチドプライマーを前述のホスフォラミ
シト固体担体法により調製した。
これは削除しようとするホモポリマー領域のDNAの一
本鎖の各側の塩基と配列が相補的な12個のデオキシヌ
クレオチドを含んでいる。この24塩基ゾライマーおよ
び削除するホモポリマー領域の配列を第4図に示す。変
異処理の際ハイブリダイゼ−ションを起す領域を下線で
示す。ホモポリマー領域を削除することにより、新たに
Hind 1部位が出来る。
本鎖の各側の塩基と配列が相補的な12個のデオキシヌ
クレオチドを含んでいる。この24塩基ゾライマーおよ
び削除するホモポリマー領域の配列を第4図に示す。変
異処理の際ハイブリダイゼ−ションを起す領域を下線で
示す。ホモポリマー領域を削除することにより、新たに
Hind 1部位が出来る。
変異処理を行なうには、1μgのpBC40DNAをP
vu Iで開環し、フェノール/クロロホルム抽出、エ
タノール沈澱後20μ召の水にけん濁する。
vu Iで開環し、フェノール/クロロホルム抽出、エ
タノール沈澱後20μ召の水にけん濁する。
さらに’IO4のpE+c 40 k Eco RIで
消化し、最大のベクター断片″ギャップ保有ベクター′
を1省の調製用アがロースケ9ルで単離する。
消化し、最大のベクター断片″ギャップ保有ベクター′
を1省の調製用アがロースケ9ルで単離する。
開環グラスミドおよびギャッププラスミドの各20 O
nlずつを20倍のモル過剰量のりん酸化オリゴヌクレ
オチドを含む10μノの水で混合し、2μlの1(11
)倍濃縮フレナラ衝液r 1 M NaC! 。
nlずつを20倍のモル過剰量のりん酸化オリゴヌクレ
オチドを含む10μノの水で混合し、2μlの1(11
)倍濃縮フレナラ衝液r 1 M NaC! 。
65mMトリス塩酸(pH7,4)、45 mM Mz
CJ2および10 mM 2−メルカプトエタノール〕
を添加する。混合物を順?′Kioo°C1室温、4°
Cおよび氷上にそれぞれ5,30.30および5分間イ
ンキュベートした後、反応液に2μlの10mMATP
。
CJ2および10 mM 2−メルカプトエタノール〕
を添加する。混合物を順?′Kioo°C1室温、4°
Cおよび氷上にそれぞれ5,30.30および5分間イ
ンキュベートした後、反応液に2μlの10mMATP
。
4 dの2.5 mM dCTP 、 dATP 、
aGTPおよびdTTP混合液、0.5μlのクレナウ
ボリメラーセ゛I(活性2.5単位)および1μlのT
4 DNAりが−セ゛(活性0.8単位)全添加して
20μlとする。
aGTPおよびdTTP混合液、0.5μlのクレナウ
ボリメラーセ゛I(活性2.5単位)および1μlのT
4 DNAりが−セ゛(活性0.8単位)全添加して
20μlとする。
反応液を15°C1,15時間インキュベートし、直接
E、 coli MC1061株を形質転換する。形質
転換株はアンピシリン含有LB寒天平板上で速択シ、平
板上のコロニーをニトロセルロースフィルターにより、
α−”P −ATPで標識した合成オリゴヌクレオチド
をゾローブとして変異処理に使用した24塩基プライマ
ーに相当する配列の存在を検出する。
E、 coli MC1061株を形質転換する。形質
転換株はアンピシリン含有LB寒天平板上で速択シ、平
板上のコロニーをニトロセルロースフィルターにより、
α−”P −ATPで標識した合成オリゴヌクレオチド
をゾローブとして変異処理に使用した24塩基プライマ
ーに相当する配列の存在を検出する。
陽性コロニーはさらにBirnboinらの方法により
予想される5 30 bpのHind l / Bam
HI断片の存在を検索する。この方法で得られたコロ
ニーは混合物であるので(M+l:+rinagaら、
前述)、陽性DNA試料で再度E、 coli MCi
O61を形質転換し、得られるコロニーを再ひ530
bpのHindII / Bam HI断片の検索をし
た。このようにして選択した陽性コロニーk pBC4
0ΔTと命名し、これは主に17bpのホモポリマー〇
−C配列より成る非翻訳リーダーの22 bp部分を欠
損している以外はpBo 40と同じである。
予想される5 30 bpのHind l / Bam
HI断片の存在を検索する。この方法で得られたコロ
ニーは混合物であるので(M+l:+rinagaら、
前述)、陽性DNA試料で再度E、 coli MCi
O61を形質転換し、得られるコロニーを再ひ530
bpのHindII / Bam HI断片の検索をし
た。このようにして選択した陽性コロニーk pBC4
0ΔTと命名し、これは主に17bpのホモポリマー〇
−C配列より成る非翻訳リーダーの22 bp部分を欠
損している以外はpBo 40と同じである。
上述の三つのプラスミド構築についてヒトHIL−2の
合成能f BuuniCkらCMo1. Ce1l。B
iol。
合成能f BuuniCkらCMo1. Ce1l。B
iol。
5巻、6(11)9頁(1985年)〕のトトランスフ
エフしたCO8を用いた定量短期発現アッセイにより比
較した。本床では、比較するDNAの等モル量f ()
luT、zman [Ce1123巻、175頁(19
81年)〕により記載されるアフリカミトリずル腎臓細
胞株CO8にトランフエクションにより導入し、それを
開始点欠損SV 40ウイルス遺伝子でトランスフオー
ムする。これらの細胞に導入されたsv 40″fXl
製開始点含有のDNA (例えば試験するプラスミドの
ように)は高コピー数で複製し、従って細胞内に存在す
るSV 4 Q依存のDNA複製機構により効率よく発
現される。
エフしたCO8を用いた定量短期発現アッセイにより比
較した。本床では、比較するDNAの等モル量f ()
luT、zman [Ce1123巻、175頁(19
81年)〕により記載されるアフリカミトリずル腎臓細
胞株CO8にトランフエクションにより導入し、それを
開始点欠損SV 40ウイルス遺伝子でトランスフオー
ムする。これらの細胞に導入されたsv 40″fXl
製開始点含有のDNA (例えば試験するプラスミドの
ように)は高コピー数で複製し、従って細胞内に存在す
るSV 4 Q依存のDNA複製機構により効率よく発
現される。
トランスフオームしたcosaeにより生成するHIL
−2の葉はRobb (前述)の定z CTLL細胞
株アッセイを用いて測定し、その結果を4つの異なる実
験につぎ第2表に示す。
−2の葉はRobb (前述)の定z CTLL細胞
株アッセイを用いて測定し、その結果を4つの異なる実
験につぎ第2表に示す。
第2表に示すように、プラスミドpBC12/ R8V
/ IL−2はプラスミドpBC40お!びpBC40
ΔTよりもかなり高いレベルで合成を行なう。pBc4
0で5′非コード領域にホモポリマ一部分が存在するこ
とでpBo 40による発現がpBC40ΔTよりも効
率が悪くなってはいるが、これら三つのプラスミド間の
主要な差はpBC4QおよびpBC4QΔTの5′非翻
訳配列が天然のヒトの配列であるのに対し、プラスミド
pBc12 / R3V / IL −2ではラッテプ
レプロインシュリン■遺伝子の対応する配列が存在する
点である。
/ IL−2はプラスミドpBC40お!びpBC40
ΔTよりもかなり高いレベルで合成を行なう。pBc4
0で5′非コード領域にホモポリマ一部分が存在するこ
とでpBo 40による発現がpBC40ΔTよりも効
率が悪くなってはいるが、これら三つのプラスミド間の
主要な差はpBC4QおよびpBC4QΔTの5′非翻
訳配列が天然のヒトの配列であるのに対し、プラスミド
pBc12 / R3V / IL −2ではラッテプ
レプロインシュリン■遺伝子の対応する配列が存在する
点である。
正常ヒト5′非コード領域をラッテインシュリン遺伝子
により置換することにより理由はわからないがHIL
−2発現が著しく高められる。この発現増強の機構を理
解することは本発明に必須ではない。mRNAの安定性
の増加がこの効果の原因カモ知れない。逆に、天然IL
−2のAUGコドンをインシュリンのAUGコドンと
置換した(第2図)ことでインンユリン開始コドンに隣
接するより理想的配列[Kozak、 Ce1l 44
巻、286頁(1986年)〕のためより高い翻訳効率
が得られた可能性もある。
により置換することにより理由はわからないがHIL
−2発現が著しく高められる。この発現増強の機構を理
解することは本発明に必須ではない。mRNAの安定性
の増加がこの効果の原因カモ知れない。逆に、天然IL
−2のAUGコドンをインシュリンのAUGコドンと
置換した(第2図)ことでインンユリン開始コドンに隣
接するより理想的配列[Kozak、 Ce1l 44
巻、286頁(1986年)〕のためより高い翻訳効率
が得られた可能性もある。
本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明に多
くの修飾および変化をさせることが出来るのは本技術の
熟練者に明かである。本明細書に記載する特定の具体態
様は例示であり、本発明は特許請求の範囲の条件でのみ
限定されるものである。
くの修飾および変化をさせることが出来るのは本技術の
熟練者に明かである。本明細書に記載する特定の具体態
様は例示であり、本発明は特許請求の範囲の条件でのみ
限定されるものである。
第1図は本発明の出発材料であるプラスミドpBC12
MIの模式図である。第2図はイン7ュリンおよびイン
ターリューキン−2遺伝子並びにプラスミドpBC12
/ R8V / IL −2中のングナルペプチドN末
端配列を示す構造図である。第6図はIL −2発現ペ
ククーpBc12 / R8V / IL−2/ dh
frの構造を図示した模式図である。第4図はpBC4
0ΔT構築のためpBc40より削除したヌクレオチド
配列を示す構造図である。
MIの模式図である。第2図はイン7ュリンおよびイン
ターリューキン−2遺伝子並びにプラスミドpBC12
/ R8V / IL −2中のングナルペプチドN末
端配列を示す構造図である。第6図はIL −2発現ペ
ククーpBc12 / R8V / IL−2/ dh
frの構造を図示した模式図である。第4図はpBC4
0ΔT構築のためpBc40より削除したヌクレオチド
配列を示す構造図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)ヒトインターリユーキン−2およびシグナルペプチ
ド配列をコードし、遺伝子の5′非コード配列が異種5
′非コード配列と置き換えられた遺伝子より成るヒトイ
ンターリユーキン−2およびシグナルペプチド配列をコ
ードするDNA配列。 (2)異種5′非コード配列がラットインシュリン遺伝
子由来である特許請求の範囲第(1)項記載のDNA配
列。 (3)さらにシグナルペプチドをコードする部分配列の
隣接ヌクレオチドも対応する異種配列で置換した特許請
求の範囲第(1)項記載のDNA配列。 (4)シグナルペプチド配列をコードする部分配列の隣
接ヌクレオチドATGTがラットプレプロインシュリン
IIのシグナルペプチド配列をコードする部分配列である
ヌクレオチドATGGCCCTGTGGATCGで置換
した特許請求の範囲第(3)項記載のDNA配列。 (5)ベクターおよび特許請求の範囲第(1)項から(
4)項のいずれか記載のDNA配列とから成り、適合性
哺乳動物細胞中でDNA配列の発現を指示できる組換え
ベクター。 (6)ベクターがSV40のori領域、ラウス肉腫ウ
ィルスの長い末端リピートプロモーターおよびラッテイ
ンシュリンII遺伝子を含む特許請求の範囲第(5)項記
載の組換えベクター。 (7)pBC12/RSV/IL−2およびpBC12
/RSV/IL−2/dhfrのグループより選択され
る特許請求の範囲第(5)項記載の組換えベクター。 (8)特許請求の範囲第(1)項から(4)項のいずれ
か記載のDNA配列を含み、該DNA配列でコードされ
るヒトインターリユーキン−2の発現を行なうことの出
来る哺乳動物細胞。 (9)特許請求の範囲第(5)項から(7)項のいずれ
か記載の組換えベクターを含み、該ベクター中に含有さ
れるDNA配列によりコードされるヒトインターリユー
キン−2を発現することの出来る哺乳動物細胞。 (10)含有する組換えベクターまたはDNA配列が増
幅されている特許請求の範囲第(8)項または(9)項
記載の哺乳動物細胞。 (11)特許請求の範囲第(5)項から(7)項のいず
れか記載の組換えベクターを含有する哺乳動物細胞を培
養し、培養液よりヒトインターリユーキン−2を単離す
ることより成るヒトインターリユーキン−2の製造方法
。 (12)組換えベクターを哺乳動物細胞中にトランスフ
エクシヨンにより導入した特許請求の範囲第(11)項
記載の方法。 (13)組換えベクターが選択用遺伝子を含み、哺乳動
物細胞を選択培地中で培養することにより選択用遺伝子
およびヒトインターリユーキン−2をコードするDNA
配列の多重コピーが共増幅により生成する特許請求の範
囲第(11)項記載の方法。 (14)選択用遺伝子がジヒドロ葉酸レダクターゼをコ
ードし、哺乳動物細胞がそれ自体ではジヒドロ葉酸レダ
クターゼ活性を欠損し、選択培地がヒポキサンチンおよ
びチミジンを含有しないでアメトプテリンを含有してい
る特許請求の範囲第(13)項記載の方法。 (15)哺乳動物細胞がCHO/dhfr^−細胞であ
る特許請求の範囲第(14)項記載の方法。 (16)特許請求の範囲第(5)から(7)項のいずれ
か記載の組換えベクターを哺乳動物細胞へ導入すること
より成る、特許請求の範囲第(8)項から(10)項の
いずれかに規定される哺乳動物細胞を調製する方法。 (17)特許請求の範囲第(11)項から(15)項の
いずれかに記載の方法により得られるヒトインターリユ
ーキン−2。 (18)特許請求の範囲第(11)項から(15)項の
いずれか記載の方法により調製したヒトインターリユー
キン−2。 (19)本質的に純粋な、特許請求の範囲第(17)項
または(18)項記載のヒトインターリユーキン−2。 (20)医薬品としての特許請求の範囲第(17)項か
ら(19)項のいずれか記載のヒトインターリユーキン
−2。 (21)特許請求の範囲第(17)項から(19)項の
いずれか記載のヒトインターリユーキン−2を含有する
医薬組成物。 (22)特許請求の範囲第(17)項から(19)項の
いずれか記載のヒトインターリユーキン−2の疾患治療
および予防ヘの使用。 (23)特許請求の範囲第(17)項から(19)項の
いずれか記載のヒトインターリユーキン−2の免疫調節
化合物としての使用。 (24)特許請求の範囲第(17)項から(19)項の
いずれか記載のヒトインターリユーキン−2の免疫抑制
状態の治療のための使用。 (25)本明細書に記載される発明。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US862082 | 1986-05-12 | ||
US06/862,082 US4992367A (en) | 1986-05-12 | 1986-05-12 | Enhanced expression of human interleukin-2 in mammalian cells |
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JPS62278994A true JPS62278994A (ja) | 1987-12-03 |
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP62114378A Pending JPS62278994A (ja) | 1986-05-12 | 1987-05-11 | ヒトインタ−リユ−キン |
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JP (1) | JPS62278994A (ja) |
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LU (1) | LU86874A1 (ja) |
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NL (1) | NL8701132A (ja) |
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FR2619719B1 (fr) * | 1987-09-01 | 1991-05-10 | Sanofi Sa | Procede d'obtention d'interleukine-2 a partir de cellules eucaryotes, vecteurs necessaires a sa mise en oeuvre et lignees cellulaires hautement productrices |
FR2636231A1 (fr) * | 1988-09-09 | 1990-03-16 | Sanofi Sa | Cellules eucaryotes recombinees productrices d'interleukine-1 (beta) mature n-glycosylee, procede et vecteurs necessaires pour leur obtention et procede d'obtention d'interleukine-1 (beta) mature n-glycosylee |
WO1990010069A1 (en) * | 1989-02-28 | 1990-09-07 | Institut Organicheskogo Sinteza Akademii Nauk Latviiskoi Ssr | RECOMBINANT PLASMID DNA pAA 1213-23 AND pAC 262-33 CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF THEIR CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI RRI/pAC 262-33 AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2 |
IL95330A0 (en) * | 1989-08-11 | 1991-06-30 | Lilly Co Eli | Expression of a functional insect specific toxin gene in mammalian cells |
GB9106185D0 (en) * | 1991-03-22 | 1991-05-08 | Wellcome Found | Biological control agents |
US5856178A (en) * | 1993-08-30 | 1999-01-05 | Utah State University | DNA cassettes for expression of lytic peptides in mammalian cells and transgenic organisms containing same |
US5548075A (en) * | 1993-08-30 | 1996-08-20 | Utah State University | DNA cassette and transgenic organisms carrying lytic peptide-encoding genes |
US5641665A (en) * | 1994-11-28 | 1997-06-24 | Vical Incorporated | Plasmids suitable for IL-2 expression |
US5686246A (en) * | 1995-08-03 | 1997-11-11 | Kornman; Kenneth S. | Detecting genetic predisposition to periodontal disease |
CN1200037A (zh) | 1995-10-17 | 1998-11-25 | 韦恩州立大学 | 鸡白细胞介素-15及其用途 |
US6001613A (en) * | 1996-05-24 | 1999-12-14 | Board Of Regents Of University Of Nebraska | Plasmid bearing a cDNA copy of the genome of bovine viral diarrhea virus, chimeric derivatives thereof, and method of producing an infectious bovine viral diarrhea virus using said plasmid |
AUPP655698A0 (en) | 1998-10-16 | 1998-11-05 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Delivery system for porcine somatotropin |
US20070025958A1 (en) | 2000-10-27 | 2007-02-01 | Hadden John W | Vaccine immunotherapy |
KR20020043448A (ko) * | 2000-12-04 | 2002-06-10 | 리송알렉스인근 | 인터루킨-2 재조합 단백질 및 그의 제조방법 |
CA2698079C (en) * | 2001-02-20 | 2015-01-13 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | A cell therapy method for the treatment of tumors |
US20040071671A1 (en) * | 2001-02-20 | 2004-04-15 | Leturcq Didier J. | Cell therapy method for the treatment of tumors |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2814039C3 (de) * | 1978-03-31 | 1981-02-19 | Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf), 3300 Braunschweig | Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien |
US4405712A (en) * | 1981-07-01 | 1983-09-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | LTR-Vectors |
US4738927A (en) * | 1982-03-31 | 1988-04-19 | Ajinomoto Co. Inc. | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
AU556353B2 (en) * | 1982-12-15 | 1986-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Interleukin-2 polypeptide |
AU579089B2 (en) * | 1983-02-08 | 1988-11-17 | Biogen, Inc. | Human interleukin-2-like polypeptides |
EP0119621A1 (en) * | 1983-03-21 | 1984-09-26 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Interleukin-2 |
WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
GB8327880D0 (en) * | 1983-10-18 | 1983-11-16 | Ajinomoto Kk | Saccharomyces cerevisiae |
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FR2559782B1 (fr) * | 1984-02-16 | 1986-07-18 | Transgene Sa | Vecteur d'expression dans les levures de l'interleukine-2, levures transformees et procede de preparation de l'interleukine-2 |
ATE48641T1 (de) * | 1984-05-08 | 1989-12-15 | Genetics Inst | Ein menschlicher t-zellwachstumsfaktor. |
DE3419995A1 (de) * | 1984-05-29 | 1985-12-05 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-interleukin-2 und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
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FR2583770B1 (fr) * | 1985-06-21 | 1988-08-19 | Transgene Sa | Expression de l'il-2 humaine dans les cellules de mammiferes par un poxvirus recombine |
FR2619719B1 (fr) * | 1987-09-01 | 1991-05-10 | Sanofi Sa | Procede d'obtention d'interleukine-2 a partir de cellules eucaryotes, vecteurs necessaires a sa mise en oeuvre et lignees cellulaires hautement productrices |
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