JPH0335795A - ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドの製造法 - Google Patents
ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドの製造法Info
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプ
チドの製造法に関する。
チドの製造法に関する。
インターロイキン2(以下、rlL−2Jと略記する。
)は、以前はT細胞増殖因子と呼ばれており、レクチン
あるいは抗原で活性化されたT細胞より産生される可溶
性たんばく (一般には「リンホカイン」として知られ
ている)である(Morgan ら。
あるいは抗原で活性化されたT細胞より産生される可溶
性たんばく (一般には「リンホカイン」として知られ
ている)である(Morgan ら。
5cience、 Jj%、 1007〜1008(1
976) + G11lisら、J。
976) + G11lisら、J。
Immunol、、 120. 2027〜2033
(1978))、IL−2はリンパ球の反応性を調節で
き、抗原特異的なエフェクターT−リンパ球のin v
itroにおける長期培養を可能ならしめることができ
る(Gillisら、 Nature。
(1978))、IL−2はリンパ球の反応性を調節で
き、抗原特異的なエフェクターT−リンパ球のin v
itroにおける長期培養を可能ならしめることができ
る(Gillisら、 Nature。
垣、154〜156 (1977) )。またIL−2
は、胸腺細胞の***の促進(Chenら、 Ce1l
Immunol、+22+ 221〜224(1977
)、 5ha−ら、 J、 Immunol、 、 1
20.1967〜1973 (1978) ) 、ヌー
ドマウスの肺細胞の培養系での細胞障害性Tリンパ球活
性(Wagnerら、 Na ture+ 28.44
+278〜280. (1980) )や抗−5RBC
プラ一ク形戒細胞反応の誘導(Gillisら、 J
、 Exp、 Med、 149.1960〜1968
(1979))等の関連する他の生物活性をもつこと
が明らかにされている。従って、このリンパ球調節因子
は液体免疫や細胞性免疫反応を増強したり免疫不全状態
を正常な液体や細胞性免疫の状態に一回復させるのに有
用である。これらの明らかにされたIL−2の免疫学的
活性は、IL−2が悪性腫瘍、細菌またはウィルス感染
、免疫不全、自己免疫疾患等(Paper++aste
rら、 Adv、 Immunopharm、+507
、 (1980))に対する医科免疫療法に有用である
ことを示している。インターフェロンと同様に、IL−
2はナチュラルキラー細胞活性を増強することが示され
てきたが、これは悪性腫瘍治療への有用性を強く示唆し
ている。更に、TL−2は単クローン性の活性化T細胞
の保持を可能とし、この事は、T細胞分化の分子機構、
T細胞機能の分化機積、′r細胞の抗原リセプターの機
構を研究する上で重要な役割を担っていることを示して
いる。また、IL−2は単りローン性T細胞を長期培養
することにより、他の種々の分野で有用な様々なT細胞
由来のリンホカインを製造するためにも使用できる。更
に、IL−2の産生とリンパ球のIL−2に対する応答
性は、免疫学的機能の重要なパラメーターであり、免疫
異常の臨床診断に有用である。
は、胸腺細胞の***の促進(Chenら、 Ce1l
Immunol、+22+ 221〜224(1977
)、 5ha−ら、 J、 Immunol、 、 1
20.1967〜1973 (1978) ) 、ヌー
ドマウスの肺細胞の培養系での細胞障害性Tリンパ球活
性(Wagnerら、 Na ture+ 28.44
+278〜280. (1980) )や抗−5RBC
プラ一ク形戒細胞反応の誘導(Gillisら、 J
、 Exp、 Med、 149.1960〜1968
(1979))等の関連する他の生物活性をもつこと
が明らかにされている。従って、このリンパ球調節因子
は液体免疫や細胞性免疫反応を増強したり免疫不全状態
を正常な液体や細胞性免疫の状態に一回復させるのに有
用である。これらの明らかにされたIL−2の免疫学的
活性は、IL−2が悪性腫瘍、細菌またはウィルス感染
、免疫不全、自己免疫疾患等(Paper++aste
rら、 Adv、 Immunopharm、+507
、 (1980))に対する医科免疫療法に有用である
ことを示している。インターフェロンと同様に、IL−
2はナチュラルキラー細胞活性を増強することが示され
てきたが、これは悪性腫瘍治療への有用性を強く示唆し
ている。更に、TL−2は単クローン性の活性化T細胞
の保持を可能とし、この事は、T細胞分化の分子機構、
T細胞機能の分化機積、′r細胞の抗原リセプターの機
構を研究する上で重要な役割を担っていることを示して
いる。また、IL−2は単りローン性T細胞を長期培養
することにより、他の種々の分野で有用な様々なT細胞
由来のリンホカインを製造するためにも使用できる。更
に、IL−2の産生とリンパ球のIL−2に対する応答
性は、免疫学的機能の重要なパラメーターであり、免疫
異常の臨床診断に有用である。
11、−2は従来の技術では、マイトジェンでマウス、
ラットあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製
造されてきた(Gt1口Sら+ N a t u r
e + 釘濾+154〜156. (1977)) 、
Farrarら、 J、 Immunol、+■4+
1353〜1360.(1978)、 G11lisら
、 J、 Immunol、+120+2027〜20
33. (1978))。ヒトの末梢血リンパ球をマイ
トジェンで刺激することにより(Gillisら、J。
ラットあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製
造されてきた(Gt1口Sら+ N a t u r
e + 釘濾+154〜156. (1977)) 、
Farrarら、 J、 Immunol、+■4+
1353〜1360.(1978)、 G11lisら
、 J、 Immunol、+120+2027〜20
33. (1978))。ヒトの末梢血リンパ球をマイ
トジェンで刺激することにより(Gillisら、J。
Immunol、、 124.1954〜1962.(
1980))、G11lisらはTリンホーマ細胞株か
らのマウスIL−2の製造(Gillisら、 J、
Im+++uno1.、 125.2570〜257
8(1980))とヒト白血病細胞株からのヒトIL−
2の製造(Gillisら、 J、 tixp、 Me
d、、 152.1709〜1719. (1980
))を報告している。
1980))、G11lisらはTリンホーマ細胞株か
らのマウスIL−2の製造(Gillisら、 J、
Im+++uno1.、 125.2570〜257
8(1980))とヒト白血病細胞株からのヒトIL−
2の製造(Gillisら、 J、 tixp、 Me
d、、 152.1709〜1719. (1980
))を報告している。
G11lisらによる上記の技法は、細胞培養法を用い
てマイトジェンで活性化されたT白血病細胞株からヒト
IL−2を製造する方法に関するものである。しかしな
がら、この方法では低濃度のヒトIL−2しか産生され
ないのが難点で、大量の培養液から微量のIL−2を得
るために、複雑な精製工程を必要とする。更に、ヒl−
T白血病細胞株は少量のし)IL−2に酷似した他の生
理活性物質も産生ずるので、IL−2をこれらの他の免
疫活性を有する分子と分離、あるいは時として共存する
細胞毒物質(toxic Iectin)と分離するに
はかなりの困難が伴う。
てマイトジェンで活性化されたT白血病細胞株からヒト
IL−2を製造する方法に関するものである。しかしな
がら、この方法では低濃度のヒトIL−2しか産生され
ないのが難点で、大量の培養液から微量のIL−2を得
るために、複雑な精製工程を必要とする。更に、ヒl−
T白血病細胞株は少量のし)IL−2に酷似した他の生
理活性物質も産生ずるので、IL−2をこれらの他の免
疫活性を有する分子と分離、あるいは時として共存する
細胞毒物質(toxic Iectin)と分離するに
はかなりの困難が伴う。
IL−2を製造する他の方法として、インターフェロン
のような他の生理活性ヒト由来たんばくを製造するため
に用いられた組換えDNA (デオキシリボ核酸の略)
法(Grayら、 Nature 牝、 503〜50
8゜(1981)、 Nagataら、 Nature
’1JJ3.316〜320 (1980)Tan
iguch iら、 Gene 10.11〜15.
(1980))が好ましいと思われる。しかしながら
、本発明の以前には組替えDNA法によってIL−2を
製造する試みは成功していなかった。例えば、組桑えD
NA体によってIL−2を産生ずる生命体を作成しよう
とする試みは、恐ら(IL−2ポリペプチドをコードす
る遺伝子が未だクローン化されていなかったために成功
していないという事が、“日経バイオチクノロジー、第
19号、 1982年7月5日”に報告されていた。
のような他の生理活性ヒト由来たんばくを製造するため
に用いられた組換えDNA (デオキシリボ核酸の略)
法(Grayら、 Nature 牝、 503〜50
8゜(1981)、 Nagataら、 Nature
’1JJ3.316〜320 (1980)Tan
iguch iら、 Gene 10.11〜15.
(1980))が好ましいと思われる。しかしながら
、本発明の以前には組替えDNA法によってIL−2を
製造する試みは成功していなかった。例えば、組桑えD
NA体によってIL−2を産生ずる生命体を作成しよう
とする試みは、恐ら(IL−2ポリペプチドをコードす
る遺伝子が未だクローン化されていなかったために成功
していないという事が、“日経バイオチクノロジー、第
19号、 1982年7月5日”に報告されていた。
従って、rL−2をコードするクローン化遺伝子とその
遺伝子を持った組換えDNA体が渇望されてき−た。ま
た、組換えDNA体を有する生細胞様と、その細胞株を
使ってIL−2を製造する方法が渇望されてきた。
遺伝子を持った組換えDNA体が渇望されてき−た。ま
た、組換えDNA体を有する生細胞様と、その細胞株を
使ってIL−2を製造する方法が渇望されてきた。
本発明の要旨は以下の記述から更に容易に明自となる。
本発明の目的はIL−2活性を有するポリペプチドの製
造法を創出したことにある。
造法を創出したことにある。
すなわち、本発明は原核細胞に適合しうるプラスミドベ
クターのDNA鎖の上流より、それぞれ原核細胞内で機
能するプロモーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始コ
ドンおよびヒトインターロイキン2活性をもつポリペプ
チドをコードする遺伝子がこの順序で配列された組換え
DNA体により形質転換された原核生物の細胞を培地中
で培養することを特徴とする糖類を伴わず、ヒト由来の
他の蛋白質を含有しないヒトインターロイキン2活性を
もつポリペプチドの製造法を提供するものである。
クターのDNA鎖の上流より、それぞれ原核細胞内で機
能するプロモーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始コ
ドンおよびヒトインターロイキン2活性をもつポリペプ
チドをコードする遺伝子がこの順序で配列された組換え
DNA体により形質転換された原核生物の細胞を培地中
で培養することを特徴とする糖類を伴わず、ヒト由来の
他の蛋白質を含有しないヒトインターロイキン2活性を
もつポリペプチドの製造法を提供するものである。
本発明により製造されるポリペプチドとしては、ヒトイ
ンタ70イキン2活性を有するものであればいずれでも
よい。
ンタ70イキン2活性を有するものであればいずれでも
よい。
該ヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチドの
例としては、たとえば分子中に次のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドが挙げられる。
例としては、たとえば分子中に次のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドが挙げられる。
Pro Thr Ser Ser Ser
Thr Lys Lys Thr GIN
LeuGIN Leu Glu tlis L
eu Leu Leu Asp Leu G
IN Metlle Leu AsN Gly li
e AsN AsN Tyr Lys AsN Pr。
Thr Lys Lys Thr GIN
LeuGIN Leu Glu tlis L
eu Leu Leu Asp Leu G
IN Metlle Leu AsN Gly li
e AsN AsN Tyr Lys AsN Pr。
Lys Leu Thr Arg Met Leu T
hr Phe Lys Phe TyrMet Pro
Lys Lys Ala Thr Glu Leu
Lys His LeuGIN Cys Leu Gl
u Glu Glu Leu Lys Pro Leu
GluGlu Val Leu AsN Leu A
la GIN Ser Lys AsN PheHis
Leu Arg Pro Arg Asp Leu
Tie Ser AsN TleAsN Val Il
e Val Leu Glu Leu Lys Gly
Ser GluThr Thr Phe Met C
ys Glu Tyr Ala Asp Glu Th
rAla Thr lie Vat Glu Phe
Leu AsN Arg Trp l1eThr Ph
e Cys GIN Ser Ile Ile Ser
Thr Leu Thr上記ヒトインターロイキン2
活性を有するポリペプチドの具体例としては、たとえば
次のアミノ酸配列を有するものなどが挙げられる。
hr Phe Lys Phe TyrMet Pro
Lys Lys Ala Thr Glu Leu
Lys His LeuGIN Cys Leu Gl
u Glu Glu Leu Lys Pro Leu
GluGlu Val Leu AsN Leu A
la GIN Ser Lys AsN PheHis
Leu Arg Pro Arg Asp Leu
Tie Ser AsN TleAsN Val Il
e Val Leu Glu Leu Lys Gly
Ser GluThr Thr Phe Met C
ys Glu Tyr Ala Asp Glu Th
rAla Thr lie Vat Glu Phe
Leu AsN Arg Trp l1eThr Ph
e Cys GIN Ser Ile Ile Ser
Thr Leu Thr上記ヒトインターロイキン2
活性を有するポリペプチドの具体例としては、たとえば
次のアミノ酸配列を有するものなどが挙げられる。
Ala Pro Thr
Leu GIN Leu
Met lie Leu
Pro Lys・Leu
Tyr Met Pr。
Leu GIN Cys
Glu Glu Val
Phe His Leu
11e AsN Val
Glu Thr Thr
Thr Ala Thr
lie Thr Phe
Thr。
Met Ala Pr。
GIN Leu GIN
GIN Met l1e
AsN Pro Lys
Phe Pro Thr
Leu GIN Leu
Met lie Leu
Ser Ser 5er
Glu His Leu
AsN Gly 1ie
Thr Arg Met
Lys Lys Ala
Leu Glu Glu
Leu AsN Leu
Arg Pro Arg
lie Val Leu
Phe Met Cys
11e Vat Glu
Cys GIN Ser
Thr
Lea
Lea
Lea
Ser
Glu
5N
Ser 5er
Glu tlis
AsN Gly
Thr Arg
Ser 5er
His Leu
Gly l1e
Thr Lys Lys
Lea Leu Asp
AsN AsN Tyr
Leu Thr Phe
Thr Glu Leu
Glu Leu Lys
Ala GIN Ser
Asp Leu l1e
Glu Leu Lys
Glu Tyr Ala
Phe Leu AsN
11e Ile Ser
Ser
Lea
1e
Met
Thr
Lea
5N
Thr Lys
Leu Leu
AsN AsN
Leu Thr
Lys Lys
Leu Asp
AsN Tyr
Thr GIN
Leu GIN
Lys AsN
Lys Phe
Lys 1lis
Pro Leu
Lys AsN
5er AsN
Gly 5er
Asp Glu
Arg Trp
Thr Leu
Lys Thr
Asp Leu
Tyr Lys
Phe Lys
Thr GIN
Leu GIN
Lys AsN
Pro Lys Leu
Tyr Met Pr。
Leu GIN Cys
Glu Glu Val
Phe His Leu
rle AsN Vat
Glu Thr Thr
Thr Ala Thr
lie Thr Phe
Thr。
もしくは
Met Pro Thr
Lea GIN Leu
Met lie Leu
Pro Lys Leu
Tyr Met Pr。
Leu GIN Cys
Glu Glu Val
Phe His Leu
11e AsN Val
Thr Arg Met
しys Lys Ala
Leu Glu Glu
Leu AsN Leu
Arg Pro Arg
He Vat Leu
Phe Met Cys
lie Val Glu
Cys GIN 5er
Ser Ser 5er
Glu tlis Leu
AsN Gly l1e
Thr Arg Met
Lys Lys Ala
Leu Glu Glu
Leu AsN Leu
Arg Pro Arg
目e Val Leu
Leu Thr
Thr Glu
Glu Leu
Ala GIN
Asp Leu
Glu Leu
Glu Tyr
Phe Leu
11e l1e
Phe Lys Phe
Leu Lys His
LY3 Pro Leu
Ser Lys AsN
11e Ser AsN
Lys Gly Ser
Ala Asp Glu
AsN Arg Trp
Ser Thr Leu
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Leu Leu
AsN AsN
Leu Thr
Thr Glu
Glu Leu
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Asp Leu
Glu Leu
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Asp Leu GIN
Tyr Lys、、AsN
Phe Lys Phe
Leu Lys His
Lys Pro Leu
Ser Lys AsN
Tie Ser AsN
Lys Gly 5er
Gru Thr Thr Phe Met Cys
Glu Tyr Ala Asp GluThr
Ala Thr Ile Val Glu
Phe Leu AsN Arg Trpl
le Thr Phe Cys GIN Ser
Ile Ile Ser Thr LeuT
hr Met Pro Lys Lys A
la Thr Glu Leu Lys H
isLeu GIN Cys Leu Glu G
lu Glu Leu Lys Pro Leu
Glu Glu Val Leu AsN Le
u Ala GIN Ser Lys AsNP
he His Leu Arg Pro Arg As
p Leu Ile Ser AsN11e AsN
Vat Ile Val Leu Glu Leu
Lys Gly 5erGlu Thr Thr P
he Met Cys Glu Tyr Ala As
p GluThr Ala Thr lie
Val Glu Phe Leu AsN
Arg Trplie Thr Phe Cys G
IN Ser Ile Ile Ser Thr
LeuThr 本発明により製造されるポリペプチドとし°ζは、上記
アミノ酸配列の中で1個ないしそれ以上のアミノ酸を欠
くポリペプチド;上記アミノ酸配列の中の1個ないしそ
れ以上のアミノ酸が1個ないしそれ以上のアミノ酸で置
換されたポリペプチド;上記アミノ酸配列に対して1個
ないしそれ以上のアミノ酸が追加されたポリペプチドで
あってもよい。
Glu Tyr Ala Asp GluThr
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くポリペプチド;上記アミノ酸配列の中の1個ないしそ
れ以上のアミノ酸が1個ないしそれ以上のアミノ酸で置
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ないしそれ以上のアミノ酸が追加されたポリペプチドで
あってもよい。
本発明における原核生物の細胞としてはエシェリヒア属
に属するものが好ましく、さらにエシェリヒア・コリに
属するものが好ましい。
に属するものが好ましく、さらにエシェリヒア・コリに
属するものが好ましい。
本発明によって、IL−2はIL−2活性を有するポリ
ペプチドを産生ずべくコードされた遺伝子の挿入と、細
胞の中で複製され得るベクターDNAの挿入で組換え法
により修飾され、該遺伝子のコードシーケンスが、プロ
モーターシーケンスの下流に位置するDNAによってI
L−2を産生ずべく形質転換させた原核生物細胞株、特
にエシェリヒア・コリを培地に浮遊培養(好気的)する
ことによって製造される。
ペプチドを産生ずべくコードされた遺伝子の挿入と、細
胞の中で複製され得るベクターDNAの挿入で組換え法
により修飾され、該遺伝子のコードシーケンスが、プロ
モーターシーケンスの下流に位置するDNAによってI
L−2を産生ずべく形質転換させた原核生物細胞株、特
にエシェリヒア・コリを培地に浮遊培養(好気的)する
ことによって製造される。
IL−2ポリペプチドをコードしたクローン化遺伝子は
、IL−2活性を有するポリペプチドを産生ずる能力を
もつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞に由来す
るIL−2に相当するメツセンジャーRNA(mRNA
;”RNA”はリボ核酸の略、以下”IL−2mRNA
”という)を相補的DNA(cDNA)に逆転写するこ
とによって得ても良い。得られた一重鎖cDNA(ss
−cDNA)は2重鎖cDNA(ds−cDNA)に変
換させることができる。
、IL−2活性を有するポリペプチドを産生ずる能力を
もつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞に由来す
るIL−2に相当するメツセンジャーRNA(mRNA
;”RNA”はリボ核酸の略、以下”IL−2mRNA
”という)を相補的DNA(cDNA)に逆転写するこ
とによって得ても良い。得られた一重鎖cDNA(ss
−cDNA)は2重鎖cDNA(ds−cDNA)に変
換させることができる。
cDNAを調製するための鋳型として用いるmRNAは
、IL−2ポリペプチドを産生ずる哺乳動物細胞から単
離することができる。単離されたRNAはポリアデニル
化され(GiLLisら、 1mmunologjca
I Rev、16u。
、IL−2ポリペプチドを産生ずる哺乳動物細胞から単
離することができる。単離されたRNAはポリアデニル
化され(GiLLisら、 1mmunologjca
I Rev、16u。
167〜209 (1982)) 、ポリアデニル化さ
れたRNAは、例えばシー!糖蜜度勾配遠心法によって
11〜12s画分に分画することができる。L3Sのm
RNAにIL 2 mRNA活性が現われることがあ
るが、この場合は11〜12 SmRNAの凝集物であ
ることが考えられる。
れたRNAは、例えばシー!糖蜜度勾配遠心法によって
11〜12s画分に分画することができる。L3Sのm
RNAにIL 2 mRNA活性が現われることがあ
るが、この場合は11〜12 SmRNAの凝集物であ
ることが考えられる。
本発明に用いるmRNAの供給源となるIL−2を産生
ずることができる哺乳動物細胞は、哺乳動物より摘出で
きる末梢血単核球、扁桃腺細胞、肺臓細胞のようなT−
リンパ球で良い。細胞にIL−2産生能を与えたり、ま
たはIL−2活性を増強するために、ナイロンカラム処
理、抗血清と補体処理。
ずることができる哺乳動物細胞は、哺乳動物より摘出で
きる末梢血単核球、扁桃腺細胞、肺臓細胞のようなT−
リンパ球で良い。細胞にIL−2産生能を与えたり、ま
たはIL−2活性を増強するために、ナイロンカラム処
理、抗血清と補体処理。
密度勾配分画、ノイラミニダーゼとガラクトースオキシ
ダーゼの組合せ処理、トリプシン処理のような様々な酵
素処理、X線照射など従来知られた方法で前処理しても
良い。上記哺乳動物細胞をT細胞増殖因子存在下で培養
役得られるクローン化Tリンパ球もmRNAの供給源と
して用いることができ、これはより好ましいT−リンパ
球である。白血病やリンパ腫細胞株に由来するTリンパ
球それ自体または上記の方法で前処理または変異したそ
れらの誘導体などの形質転換されたリンパ球細胞株また
はクローニングされた形質転換細胞株もmRNAの供給
源として好ましい。明らかに、クローン化した細胞株は
通常クローン化前の親株に比較して多量のIL −2m
RNAを含んでいる。上記したリンパ球由来細胞とCE
M、 Mo1t 4F、 BW5147のごとき腫瘍細
胞株を融合することによって得られたT細胞ハイブリド
ーマもまた本発明に使用するのに好ましい哺乳動物細胞
である。この場合のリンパ球由来細胞は、(1)rL−
2の自発産生細胞および(2)It、−2産生を補助す
る他の細胞の存在下または非存在下に培養液中にマイト
ジェンが導入され存在している時のみIL−2を産生ず
る細胞を含む。
ダーゼの組合せ処理、トリプシン処理のような様々な酵
素処理、X線照射など従来知られた方法で前処理しても
良い。上記哺乳動物細胞をT細胞増殖因子存在下で培養
役得られるクローン化Tリンパ球もmRNAの供給源と
して用いることができ、これはより好ましいT−リンパ
球である。白血病やリンパ腫細胞株に由来するTリンパ
球それ自体または上記の方法で前処理または変異したそ
れらの誘導体などの形質転換されたリンパ球細胞株また
はクローニングされた形質転換細胞株もmRNAの供給
源として好ましい。明らかに、クローン化した細胞株は
通常クローン化前の親株に比較して多量のIL −2m
RNAを含んでいる。上記したリンパ球由来細胞とCE
M、 Mo1t 4F、 BW5147のごとき腫瘍細
胞株を融合することによって得られたT細胞ハイブリド
ーマもまた本発明に使用するのに好ましい哺乳動物細胞
である。この場合のリンパ球由来細胞は、(1)rL−
2の自発産生細胞および(2)It、−2産生を補助す
る他の細胞の存在下または非存在下に培養液中にマイト
ジェンが導入され存在している時のみIL−2を産生ず
る細胞を含む。
IL−2自発産生細胞においてTL −2mRNAを誘
導するために、IL−2自発産生細胞は、細胞培養の分
野でよく知られた方法で培養される。マイトジェン存在
下のみでIL−2を産生ずる細胞においてmRNAを産
生ずる場合は、培養した細胞は培地で良く洗った後、血
清を含むかまたは含まないローズウエルパークメモリア
ルインスティテユート1640(以下、“RPMI 1
640”と略す。)、ダルベラコラ変法イーグル培地(
以下”DMEM”と略す。)またはクリック培地のごと
き培地に再び浮遊する。これらの細胞培養培地には、ペ
ニシリン、ストレプトマイシンまたは他の抗生物質、L
−グルタミン、ヘペス緩衝液、または炭酸水素ナトリウ
ムのような種々の添加物を細胞培養の分野で一般に使わ
れる濃度で加えても良い。好ましい細胞濃度は0.5〜
4X10”細胞/−である。mRNAの活性化とIl、
−2の産生を誘導するために適当な刺激剤が加えられる
。この適当な刺激剤の中には、マイトジェン。
導するために、IL−2自発産生細胞は、細胞培養の分
野でよく知られた方法で培養される。マイトジェン存在
下のみでIL−2を産生ずる細胞においてmRNAを産
生ずる場合は、培養した細胞は培地で良く洗った後、血
清を含むかまたは含まないローズウエルパークメモリア
ルインスティテユート1640(以下、“RPMI 1
640”と略す。)、ダルベラコラ変法イーグル培地(
以下”DMEM”と略す。)またはクリック培地のごと
き培地に再び浮遊する。これらの細胞培養培地には、ペ
ニシリン、ストレプトマイシンまたは他の抗生物質、L
−グルタミン、ヘペス緩衝液、または炭酸水素ナトリウ
ムのような種々の添加物を細胞培養の分野で一般に使わ
れる濃度で加えても良い。好ましい細胞濃度は0.5〜
4X10”細胞/−である。mRNAの活性化とIl、
−2の産生を誘導するために適当な刺激剤が加えられる
。この適当な刺激剤の中には、マイトジェン。
ノイラミニダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ。
塩化亜鉛の如き亜鉛化合物またはプロティンA。
ストレプトリジン−〇の如き細菌由来のリンパ球活性化
因子が含まれる。刺激された細胞は回収され、洗浄され
る。マイトジェン刺激の際、マクロファージまたはプン
トリティック細胞を共存させるとやはりmRNAを活性
化し、あるいは活性化mRNAの収量を増大させ得る。
因子が含まれる。刺激された細胞は回収され、洗浄され
る。マイトジェン刺激の際、マクロファージまたはプン
トリティック細胞を共存させるとやはりmRNAを活性
化し、あるいは活性化mRNAの収量を増大させ得る。
同様にRaji、 ’Daudi、 K562゜BAL
L−1の如きBリンパ球またはBリンパ球細胞株に由来
する細胞株を共存させてもmRNAは活性化され、また
は活性化mRNAの収量を増大させ得る。
L−1の如きBリンパ球またはBリンパ球細胞株に由来
する細胞株を共存させてもmRNAは活性化され、また
は活性化mRNAの収量を増大させ得る。
哺乳動物細胞を増殖させるために、細胞は通常の条件下
でin vitroで細胞培養により、または組織適合
動物の体内で維持される。mRNAの供給源を調製する
ためにin vitro培養による継代を行なう場合に
は、従来T細胞の生育を促進することが知られている培
地であればどのような培地にもこれら細胞は生育する。
でin vitroで細胞培養により、または組織適合
動物の体内で維持される。mRNAの供給源を調製する
ためにin vitro培養による継代を行なう場合に
は、従来T細胞の生育を促進することが知られている培
地であればどのような培地にもこれら細胞は生育する。
これらの培地には哺乳動物の血清、血清成分または血清
アルブミンを添加しても良い。mRNAの活性化のため
の培養時間は、mRNAを生成するための活性化に必要
な時間に対応する。
アルブミンを添加しても良い。mRNAの活性化のため
の培養時間は、mRNAを生成するための活性化に必要
な時間に対応する。
この時間は、通常IL−2の培地中への産生が開始され
るまでに必要な時間と対応している。好ましい時間は、
マイトジェン等の刺激剤を添加してから3〜12時間で
ある。培養時間が長すぎる場合、生成したIL−2mR
NAが分解されることがある。■し一2産生細胞の活性
化に際し、PMAまたはTPAの如きホルボールエステ
ル類を10〜50ng/Id添加して活性化レベルを上
昇させることもできる。
るまでに必要な時間と対応している。好ましい時間は、
マイトジェン等の刺激剤を添加してから3〜12時間で
ある。培養時間が長すぎる場合、生成したIL−2mR
NAが分解されることがある。■し一2産生細胞の活性
化に際し、PMAまたはTPAの如きホルボールエステ
ル類を10〜50ng/Id添加して活性化レベルを上
昇させることもできる。
IL2mRNA活性化のための上記工程はpl+7.0
〜7.4.温度範囲32〜38°Cの飽和水蒸気の環境
下で行なわれる。
〜7.4.温度範囲32〜38°Cの飽和水蒸気の環境
下で行なわれる。
IL−2を産生ずる哺乳動物細胞を取得し培養する方法
を以下に述べる。
を以下に述べる。
(イ)IL−2自発産生株の取得
ヒl−Tリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細
胞(フレンド・ハッチンソン・癌研究所/シアトル/ア
メリカ、ソータ研究所/サンジエゴ/アメリカ、西ドイ
ツ国立点センター/ハイデルベルヒ/西、ドイツ等で自
由に手に入る。)をl×lOh個/IIiの細胞密度で
クリック培地中に懸濁させ、150レントゲン/分の照
射速度で合計8.000レントゲンのX線照射を行なう
。この後、本細胞を0.1細胞7200μi培地の細胞
密度で96穴の平底マイクロタイタープレート(「ファ
ルコン3072」)に添加し、5%牛脂児血清を含むク
リック培地中で3週間37°Cにて5%COzインキュ
ベーター中にて培養する(限界希釈法によるクローニン
グ)、細胞の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、
細胞が底面全体をおおう密度に到達する前に24穴のヌ
ンク社製培養プレートに移し、クリック培地中にて5日
間細胞を増殖させる。さらに、本細胞を1〜2X10’
個/成の細胞密度にて血清も血清由来アルブミンも含ま
ない無血清合成培地に懸濁して2日間培養し、本培養上
清を遠心分離操作で分離し、次いで0.22μのξリボ
アフィルターにてデブリス除去と無菌化を行なった。こ
のようにして得た培養上清のIL−2活性を測定するこ
とによってIL−2を自発産生ずるX線処理変異株が選
択され、かつクローニングされた。
胞(フレンド・ハッチンソン・癌研究所/シアトル/ア
メリカ、ソータ研究所/サンジエゴ/アメリカ、西ドイ
ツ国立点センター/ハイデルベルヒ/西、ドイツ等で自
由に手に入る。)をl×lOh個/IIiの細胞密度で
クリック培地中に懸濁させ、150レントゲン/分の照
射速度で合計8.000レントゲンのX線照射を行なう
。この後、本細胞を0.1細胞7200μi培地の細胞
密度で96穴の平底マイクロタイタープレート(「ファ
ルコン3072」)に添加し、5%牛脂児血清を含むク
リック培地中で3週間37°Cにて5%COzインキュ
ベーター中にて培養する(限界希釈法によるクローニン
グ)、細胞の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、
細胞が底面全体をおおう密度に到達する前に24穴のヌ
ンク社製培養プレートに移し、クリック培地中にて5日
間細胞を増殖させる。さらに、本細胞を1〜2X10’
個/成の細胞密度にて血清も血清由来アルブミンも含ま
ない無血清合成培地に懸濁して2日間培養し、本培養上
清を遠心分離操作で分離し、次いで0.22μのξリボ
アフィルターにてデブリス除去と無菌化を行なった。こ
のようにして得た培養上清のIL−2活性を測定するこ
とによってIL−2を自発産生ずるX線処理変異株が選
択され、かつクローニングされた。
(II)ヒト末梢血単核細胞よりIL−2産生株の取得
ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球(以下、PBLと略す
)、を採取する。本PBLをlXl0”個/dの細胞密
度で5%FCSを含むクリック培地に懸濁し、各2−宛
24穴のヌンクの培養プレートに接種する。ここにフィ
トヘマグルチニン−M(ギブコ社製)を5μg/dの終
末濃度になるように1OOuI!、添加し、上述の条件
下に48時間培養し、次いで細胞を培養液で洗浄し、再
びl×10’個/−の細胞密度でクリック培地1 tt
rflに接種する。さらに、コンカナバリンA(以下、
ConAと略す、)2.5μg / mlで48時間刺
激したヒト牌細胞から調製したコンディショニングした
培地III&を加え、該コンディショニングした培地5
0%を含む培地を3日毎に取り換えて、PBLからのヒ
トTリンパ球を長期継代培養する。このように長期継代
培養して得たTリンパ球を、前述と同様の限界希釈法で
コンディショニングした培地に由来するヒト牌細胞の存
在下、クローニングを行ない、かつ同様に細胞増殖を行
なう、こうして得られたクローン化Tリンパ球を1×1
06個/ ttrlの細胞密度に10μg / m(l
のフィトヘマグルチニン(以下、PHAと略す。)の存
在下、24穴のタンク培養プレート中のRP旧1640
培地lIdに接種し、24時間、37°Cで7.5%C
O,インキュベーター中にて培養した。本培養上清を遠
心分離操作で分離し、次いで0.22μのごリボアフィ
ルターで無菌化を行なった後、IL−2産生ヒト正常下
リンパ球クローンを同定するために、IL−2活性検定
を行なった。
ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球(以下、PBLと略す
)、を採取する。本PBLをlXl0”個/dの細胞密
度で5%FCSを含むクリック培地に懸濁し、各2−宛
24穴のヌンクの培養プレートに接種する。ここにフィ
トヘマグルチニン−M(ギブコ社製)を5μg/dの終
末濃度になるように1OOuI!、添加し、上述の条件
下に48時間培養し、次いで細胞を培養液で洗浄し、再
びl×10’個/−の細胞密度でクリック培地1 tt
rflに接種する。さらに、コンカナバリンA(以下、
ConAと略す、)2.5μg / mlで48時間刺
激したヒト牌細胞から調製したコンディショニングした
培地III&を加え、該コンディショニングした培地5
0%を含む培地を3日毎に取り換えて、PBLからのヒ
トTリンパ球を長期継代培養する。このように長期継代
培養して得たTリンパ球を、前述と同様の限界希釈法で
コンディショニングした培地に由来するヒト牌細胞の存
在下、クローニングを行ない、かつ同様に細胞増殖を行
なう、こうして得られたクローン化Tリンパ球を1×1
06個/ ttrlの細胞密度に10μg / m(l
のフィトヘマグルチニン(以下、PHAと略す。)の存
在下、24穴のタンク培養プレート中のRP旧1640
培地lIdに接種し、24時間、37°Cで7.5%C
O,インキュベーター中にて培養した。本培養上清を遠
心分離操作で分離し、次いで0.22μのごリボアフィ
ルターで無菌化を行なった後、IL−2産生ヒト正常下
リンパ球クローンを同定するために、IL−2活性検定
を行なった。
(ハ)マイトジェン刺激でIL−2を生産するヒトリン
パ球由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法によりク
ローン化されたJ−111株は、前記の無血清培地や血
清1〜2%を含むBPMI 1640培地中にてCon
A 10 II g /−やpH八2へ5μg/dの
存在下に24時間培養すると、lO〜4.000単位/
−のIL−2を産生ずることができる。また、これらヒ
ト悪性化細胞は塩化亜鉛、プロティンA。
パ球由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法によりク
ローン化されたJ−111株は、前記の無血清培地や血
清1〜2%を含むBPMI 1640培地中にてCon
A 10 II g /−やpH八2へ5μg/dの
存在下に24時間培養すると、lO〜4.000単位/
−のIL−2を産生ずることができる。また、これらヒ
ト悪性化細胞は塩化亜鉛、プロティンA。
ピシバニール存在下に培養しても、IL−2を産生ずる
。
。
(ニ)他の細胞もしくはその細胞の産生ずる因子の存在
下にマイトジェンで刺激することによりIL−2を産生
ずる細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Mo1t4Fや前述の限界希釈
法でクローン化されたジュルカット細胞の1つのクロー
ン、ジェルカフ199株は、上述のごときレクチンやマ
イトジェンを広い濃度範囲で加えて24〜72時間培養
してもIL−2を産生じない。ところが、この間モノ力
インの1種であるインターロイキン1を5〜10u/m
Rまたは50%のに562やラージ(Raji)細胞を
共存させて37°C224時間培養すると、IL−2を
確認しうる量(1(1〜L OOu/ml)産生ずる。
下にマイトジェンで刺激することによりIL−2を産生
ずる細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Mo1t4Fや前述の限界希釈
法でクローン化されたジュルカット細胞の1つのクロー
ン、ジェルカフ199株は、上述のごときレクチンやマ
イトジェンを広い濃度範囲で加えて24〜72時間培養
してもIL−2を産生じない。ところが、この間モノ力
インの1種であるインターロイキン1を5〜10u/m
Rまたは50%のに562やラージ(Raji)細胞を
共存させて37°C224時間培養すると、IL−2を
確認しうる量(1(1〜L OOu/ml)産生ずる。
このようにして活性化された細胞よりIL −2mRN
Aを抽出するには、細胞の種類を問わず常法によって行
なえばよい。たとえば、NP 40. SO3,Tr
iton−X100.デオキシコール酸などの界面活性
剤を添加して細胞を部分的または完全に分解するか、ホ
モゲナイザーや凍結融解などの物理的方法を用いて、細
胞を部分的あるいは完全に破壊、可溶化する。その際に
RNaseによるRNAの分解を防ぐために、抽出液中
にRNaseインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビ
ニル硫酸、ベントナイト、マカロイド、ジエチルピロカ
ーボネート、バナジウム複合体などを添加しておくのが
好ましい、また、場合に応じては、抗IL−2抗体を用
いてIL−2合成途上のポリゾームを沈降せしめ、これ
よりmRNAを界面活性剤などで抽出する方法も行ない
得る。
Aを抽出するには、細胞の種類を問わず常法によって行
なえばよい。たとえば、NP 40. SO3,Tr
iton−X100.デオキシコール酸などの界面活性
剤を添加して細胞を部分的または完全に分解するか、ホ
モゲナイザーや凍結融解などの物理的方法を用いて、細
胞を部分的あるいは完全に破壊、可溶化する。その際に
RNaseによるRNAの分解を防ぐために、抽出液中
にRNaseインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビ
ニル硫酸、ベントナイト、マカロイド、ジエチルピロカ
ーボネート、バナジウム複合体などを添加しておくのが
好ましい、また、場合に応じては、抗IL−2抗体を用
いてIL−2合成途上のポリゾームを沈降せしめ、これ
よりmRNAを界面活性剤などで抽出する方法も行ない
得る。
また、poliAを含むmRNAの精製についてはオリ
ゴdT−セルロース、セファロース2Bを担体とするポ
リU−セファロースなどのアフィニテイ・カラムあるい
はバッチ法による精製法、 SDG遠心法による分画、
アガロースゲル電気泳動法等によって行なうことができ
る。
ゴdT−セルロース、セファロース2Bを担体とするポ
リU−セファロースなどのアフィニテイ・カラムあるい
はバッチ法による精製法、 SDG遠心法による分画、
アガロースゲル電気泳動法等によって行なうことができ
る。
上記の如くして得られたmRNAがIL 2m1RN
^活性を有するものであることを確認するためには、m
RNAを蛋白に翻訳させ、その生理活性を調べるか、抗
」L−2ペプチド単クロ一ン性抗体を用い該翻訳蛋白を
同定する等の方法を行なえばよい。たとえばmRNAは
通常、アフリカッメガエル(k辿坐旺1aevis)の
卵にマイクロインジェクションすることにより(Gur
donら、 Nature、 233.177〜182
(1972))あるいは網状赤血球または小麦胚無細胞
翻訳システムを使用することにより対応する蛋白に翻訳
される。
^活性を有するものであることを確認するためには、m
RNAを蛋白に翻訳させ、その生理活性を調べるか、抗
」L−2ペプチド単クロ一ン性抗体を用い該翻訳蛋白を
同定する等の方法を行なえばよい。たとえばmRNAは
通常、アフリカッメガエル(k辿坐旺1aevis)の
卵にマイクロインジェクションすることにより(Gur
donら、 Nature、 233.177〜182
(1972))あるいは網状赤血球または小麦胚無細胞
翻訳システムを使用することにより対応する蛋白に翻訳
される。
IL−2活性は、先にG111isら(Gillisら
、J。
、J。
Immunol、、 月段、 2027〜2033(1
97B))によって基本的には述べられているミクロ検
定法によって確認できる。この検定法では、G11li
sらによって確立された方法に従って作成した細胞障害
性Tリンパ球細胞株(以下、CTLLと略す。)のIL
−2に依存細胞のDN^合威合算上昇L −2depe
ndent cellularproliferati
on)を指標としている。即ち、4X10’個のCTL
L細胞を2%のFCSを含むRPMI−1640培地1
00ufに懸濁し、100ufの連続希釈した翻訳産物
と共に96穴の平底マイクロプレートに接種する。37
°C,5%CO,下で20時間培養した後、細胞を0.
5μCi/ウエルのH−TdRで4時間ラベルし、自動
細胞ハーベスタ−を用いて帯状ガラス繊維上に細胞を回
収し、細胞が取り込んだ放射能を液体シンチレーション
法で測定する。
97B))によって基本的には述べられているミクロ検
定法によって確認できる。この検定法では、G11li
sらによって確立された方法に従って作成した細胞障害
性Tリンパ球細胞株(以下、CTLLと略す。)のIL
−2に依存細胞のDN^合威合算上昇L −2depe
ndent cellularproliferati
on)を指標としている。即ち、4X10’個のCTL
L細胞を2%のFCSを含むRPMI−1640培地1
00ufに懸濁し、100ufの連続希釈した翻訳産物
と共に96穴の平底マイクロプレートに接種する。37
°C,5%CO,下で20時間培養した後、細胞を0.
5μCi/ウエルのH−TdRで4時間ラベルし、自動
細胞ハーベスタ−を用いて帯状ガラス繊維上に細胞を回
収し、細胞が取り込んだ放射能を液体シンチレーション
法で測定する。
この検定により、IL−2存在下に培養されたCTLL
細胞が投与量に依存して”H−TdRを取込むことが判
明し、このことから検体中に含まれるIL−2量を明確
に計算することができる。
細胞が投与量に依存して”H−TdRを取込むことが判
明し、このことから検体中に含まれるIL−2量を明確
に計算することができる。
IL−2はTリンパ球の増殖を促す活性を有するので、
IL−2活性をTリンパ球の増殖を指標として測定する
ことができる。即ち、5個のCTLL細胞を2%のFC
Sを含むDMEM100uj!に懸濁し、100μlの
連続希釈した翻訳産物と共に96穴の平底マイクロプレ
ートに接種する。72〜96時間、37°C,5%CO
□下で培養した後、活性化し増殖した細胞の数を顕微鏡
下で計測する。対照群として1oou、’Ml、IOU
/−のIL−2を用い、この対照群の増殖した生細胞数
と比較して検体のIL−2活性を求める。
IL−2活性をTリンパ球の増殖を指標として測定する
ことができる。即ち、5個のCTLL細胞を2%のFC
Sを含むDMEM100uj!に懸濁し、100μlの
連続希釈した翻訳産物と共に96穴の平底マイクロプレ
ートに接種する。72〜96時間、37°C,5%CO
□下で培養した後、活性化し増殖した細胞の数を顕微鏡
下で計測する。対照群として1oou、’Ml、IOU
/−のIL−2を用い、この対照群の増殖した生細胞数
と比較して検体のIL−2活性を求める。
このようにして最も高活性の両分から得られたIL−2
mRNAはds −cDNAを合成するための鋳型とし
て用い、ds −cDNAはベクターDNAと結合させ
る。
mRNAはds −cDNAを合成するための鋳型とし
て用い、ds −cDNAはベクターDNAと結合させ
る。
cDNAの合或は従来の方法によって行なう。
まず、mRNAを鋳型とし、オリゴdTをブライマーと
してdATP、 dGTP、 dCTP、 dTTPの
存在下で逆転写酵素によりmRNAと相補的なss −
cDNAを合成し、アルカリ処理で鋳型mRNAを分解
除去した後、今度は一単鎖cDNAを鋳型にして逆転写
酵素あるいはDNAポリメラーゼを用いてds −cD
NAを台底する。
してdATP、 dGTP、 dCTP、 dTTPの
存在下で逆転写酵素によりmRNAと相補的なss −
cDNAを合成し、アルカリ処理で鋳型mRNAを分解
除去した後、今度は一単鎖cDNAを鋳型にして逆転写
酵素あるいはDNAポリメラーゼを用いてds −cD
NAを台底する。
このようにして得られたds −cDNAと原核生物で
複製できるレプリコンを含むベクターDNAから組み換
えDNA体が作られる。しかる後、この組み換えDNA
体は宿主細胞に組み込まれる。
複製できるレプリコンを含むベクターDNAから組み換
えDNA体が作られる。しかる後、この組み換えDNA
体は宿主細胞に組み込まれる。
このds −cDNA及び原核生物で増殖し得るベクタ
ーDNAは、これらを結合させる前にエキソヌクレアー
ゼ処理、化学合成DNA断片の追加、 ds−cDNA
やベクターDNAの末端に連結可能な端末をつけるため
にG、C−鎖を伸ばすなど各種処理によって修飾される
。これらの連結可能なDNAは、例えばATP共存下に
T4ファージのDNAライゲースによってつぎ合せるこ
とが出来る。
ーDNAは、これらを結合させる前にエキソヌクレアー
ゼ処理、化学合成DNA断片の追加、 ds−cDNA
やベクターDNAの末端に連結可能な端末をつけるため
にG、C−鎖を伸ばすなど各種処理によって修飾される
。これらの連結可能なDNAは、例えばATP共存下に
T4ファージのDNAライゲースによってつぎ合せるこ
とが出来る。
このようにして調製された組換えDNA体によってクロ
ーン化されたcDNAを増巾させるため又はIL−2ポ
リペプチドを製造するために生細胞を形質転換する。
ーン化されたcDNAを増巾させるため又はIL−2ポ
リペプチドを製造するために生細胞を形質転換する。
IL−2生産のための宿主細胞として、本発明ではバチ
ルス・ズブチリスなどの原核生物細胞またはエシェリヒ
ア・コリを用いる。宿主細胞中でのDNA増巾のために
はエシェリヒア・コリを宿主とすることが出来るが、そ
の他の宿主細胞とすることも出来る。
ルス・ズブチリスなどの原核生物細胞またはエシェリヒ
ア・コリを用いる。宿主細胞中でのDNA増巾のために
はエシェリヒア・コリを宿主とすることが出来るが、そ
の他の宿主細胞とすることも出来る。
適当なエシェリヒア・コリ用ベクターとしてはE″に型
プラスミドベクター(ストリンゼント型)としてpsc
lol、 pRK353. pRK646. pRK2
4B、 pDF41など、、EKタイププラスミドベク
ター(リラックスドタイブ) : Co1E1. p
VH51,pAc105. R5F2124゜pcRl
、1M89. pBR313,pBR322,pBR3
24,pBR325゜pBR327,pBR32B、
pKY2289. pKY2700. pKN80.
pKc?。
プラスミドベクター(ストリンゼント型)としてpsc
lol、 pRK353. pRK646. pRK2
4B、 pDF41など、、EKタイププラスミドベク
ター(リラックスドタイブ) : Co1E1. p
VH51,pAc105. R5F2124゜pcRl
、1M89. pBR313,pBR322,pBR3
24,pBR325゜pBR327,pBR32B、
pKY2289. pKY2700. pKN80.
pKc?。
pKB15B、 pMK2004. pAcYcl、
pAcYc184. dul等、、λgtタイプファー
ジベクター:λgt、λc、λgt、λB。
pAcYc184. dul等、、λgtタイプファー
ジベクター:λgt、λc、λgt、λB。
λWES、λC,λ−ES、λB、λZJvir、、
λB+l λALO,λB。
λB+l λALO,λB。
λWES、Ts622.λDaI11等が含まれテイル
。一般ニ、pBR322はエシェリヒア・コリ用ベクタ
ーとしてしばしば利用されてきたが、この場合最も良い
クローニング部位はPs tlならびにEcoR1部位
である。
。一般ニ、pBR322はエシェリヒア・コリ用ベクタ
ーとしてしばしば利用されてきたが、この場合最も良い
クローニング部位はPs tlならびにEcoR1部位
である。
MJ、換えIIIIIA体を用いた宿主細胞の形質転換
には、通常よく用いられる次の方法がある。エシェリヒ
ア・コリの如き原核生物が宿主の場合、このDNAを取
り込むことの出来るコンピテント細胞は対数増殖期にお
ける細胞を回収後、床く知られているCaCIlx法に
よって形質転換出来る。形質転換反応液中にMgCjl
!、又はRbCfを共存させれば形質転換効率は向上す
る。また、宿主細胞のプロトプラスト調製後形質転換さ
せることも可能である。
には、通常よく用いられる次の方法がある。エシェリヒ
ア・コリの如き原核生物が宿主の場合、このDNAを取
り込むことの出来るコンピテント細胞は対数増殖期にお
ける細胞を回収後、床く知られているCaCIlx法に
よって形質転換出来る。形質転換反応液中にMgCjl
!、又はRbCfを共存させれば形質転換効率は向上す
る。また、宿主細胞のプロトプラスト調製後形質転換さ
せることも可能である。
IL−2遺伝子を保有する細胞は、次の2つの方法の何
れかを用いて形質転換後分離可能である。
れかを用いて形質転換後分離可能である。
(1)プラス−マイナス法:抗原刺激した哺乳動物細胞
抽出液より蔗糖密度勾配遠心分離にて1l−12S画分
として部分精製したIL−2*RNAを調製し、この部
分精製mRNAを鋳型として2Rp−放射性5s−cD
NAを合成する。アルカリ処理にて鋳型+sRNAを除
去後、単離されたcDNAは、抗原刺激しない哺乳動物
細胞から抽出され、部分精製した1112 Sn+RN
^でハイブリダイズする。引続いてハイブリダイズしな
かったcDNAとハイブリダイズしたcDNAはハイド
ロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画する
。ハイブリダイズしなかったcDNAとハイブリダイズ
したcDN^をそれぞれプローブA、及びプローブBと
呼ぶ。何れの組換え体も同一の方法によりそれぞれニト
ロセルロース濾紙上で生育させる。そして、細胞のDN
Aをアルカリ処理にて濾紙上に固定する。プローブA及
びBをそれぞれ、二つの異った濾紙上でDNAとハイブ
リダイズさせる。その後、オートラジオグラフィーを行
ってプローブAと陽性に反応する組換え体(プラス)、
プローブBと僅か又は全熱反応しない組換え体(マイナ
ス)を選別する(各日ら; Proc。
抽出液より蔗糖密度勾配遠心分離にて1l−12S画分
として部分精製したIL−2*RNAを調製し、この部
分精製mRNAを鋳型として2Rp−放射性5s−cD
NAを合成する。アルカリ処理にて鋳型+sRNAを除
去後、単離されたcDNAは、抗原刺激しない哺乳動物
細胞から抽出され、部分精製した1112 Sn+RN
^でハイブリダイズする。引続いてハイブリダイズしな
かったcDNAとハイブリダイズしたcDNAはハイド
ロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画する
。ハイブリダイズしなかったcDNAとハイブリダイズ
したcDN^をそれぞれプローブA、及びプローブBと
呼ぶ。何れの組換え体も同一の方法によりそれぞれニト
ロセルロース濾紙上で生育させる。そして、細胞のDN
Aをアルカリ処理にて濾紙上に固定する。プローブA及
びBをそれぞれ、二つの異った濾紙上でDNAとハイブ
リダイズさせる。その後、オートラジオグラフィーを行
ってプローブAと陽性に反応する組換え体(プラス)、
プローブBと僅か又は全熱反応しない組換え体(マイナ
ス)を選別する(各日ら; Proc。
Jap、 Acad、、 V155B 464〜46
9(1979)。
9(1979)。
(2)第2の方法は、例えば1000〜10.000の
組換体りP−ンを2〜30ないし2〜300クローン宛
のクローングループに大別し、それぞれのクローングル
ープをそれぞれ常法によって培養しプラスミドDNA5
を調製する。次いで、これらプラスミドDNA5を例え
ば熱変性して5s−cDNAをニトロセルロース濾紙上
に固定し、活性化IL−2−mRNAを含有する哺乳動
物細胞から調製されたmRNAと相補的にハイプリダイ
ゼーシゴンを行う。あるいはまた、IL−2mRNAを
含有するmRNA (混合物)を熱変性したプラスミド
DNA (混合物)とハイブリダイズさせるとDNA
−mRNAハイブリッドがニトロセルロース濾紙上に固
定される。この濾紙を1mMの11EPEs、あるいは
10mMの食塩水のごとき低塩類緩衝液で洗浄し、濾紙
上に吸着されたmRNAを0.5mM EDTA;0.
I X SDS溶液含有液で例えば95°C11分間
処理して抽出する。精製mRNAはこれをolig。
組換体りP−ンを2〜30ないし2〜300クローン宛
のクローングループに大別し、それぞれのクローングル
ープをそれぞれ常法によって培養しプラスミドDNA5
を調製する。次いで、これらプラスミドDNA5を例え
ば熱変性して5s−cDNAをニトロセルロース濾紙上
に固定し、活性化IL−2−mRNAを含有する哺乳動
物細胞から調製されたmRNAと相補的にハイプリダイ
ゼーシゴンを行う。あるいはまた、IL−2mRNAを
含有するmRNA (混合物)を熱変性したプラスミド
DNA (混合物)とハイブリダイズさせるとDNA
−mRNAハイブリッドがニトロセルロース濾紙上に固
定される。この濾紙を1mMの11EPEs、あるいは
10mMの食塩水のごとき低塩類緩衝液で洗浄し、濾紙
上に吸着されたmRNAを0.5mM EDTA;0.
I X SDS溶液含有液で例えば95°C11分間
処理して抽出する。精製mRNAはこれをolig。
dT−セルロースカラムクロマトグラフィーにてン容出
回収する。次いで、mRNAをアフリカッメガエル卵母
細胞にマイクロインジェクションして蛋白質に翻訳して
IL−2活性を確認する。あるいはmRNAに依存性の
網状赤血球系又は小麦胚のin vitro無細胞合成
系を用いてこのmRNAを蛋白に翻訳させ、。
回収する。次いで、mRNAをアフリカッメガエル卵母
細胞にマイクロインジェクションして蛋白質に翻訳して
IL−2活性を確認する。あるいはmRNAに依存性の
網状赤血球系又は小麦胚のin vitro無細胞合成
系を用いてこのmRNAを蛋白に翻訳させ、。
抗IL−2抗体を用いてIL−2−活性を分析すること
が出来る。これらの方法によってIL−2活性が検出さ
れたグループをさらに少数の組換え体クローンを含有す
る群に類別し最終的にはIL−2DNAを有する単一ク
ローンが得られるまで繰返し実施する。
が出来る。これらの方法によってIL−2活性が検出さ
れたグループをさらに少数の組換え体クローンを含有す
る群に類別し最終的にはIL−2DNAを有する単一ク
ローンが得られるまで繰返し実施する。
IL−2産生能のある組換え体よりIL−2ポリペプチ
ドをコードするcDNAを得るには、先ずトランスフォ
ーマント中の組換えDNA体を分離し、これを制限酵素
エンドヌクレアーゼで切断する。切断によって得られる
DNA分画より組込まれたcDNA画分を分離する。
ドをコードするcDNAを得るには、先ずトランスフォ
ーマント中の組換えDNA体を分離し、これを制限酵素
エンドヌクレアーゼで切断する。切断によって得られる
DNA分画より組込まれたcDNA画分を分離する。
plL−2−50Aを組換えたDNAよりIL−2ポリ
ペプチドをコードするPstl DNAインサートの全
ヌクレオチド配列は、Maxan+ and G11b
ert法(Meth。
ペプチドをコードするPstl DNAインサートの全
ヌクレオチド配列は、Maxan+ and G11b
ert法(Meth。
[Unzym、 f15.499〜560.(1980
));ならびにニブオキシヌクレオチド鎖末端法(Sm
ith、^、 J、 M、 Meth。
));ならびにニブオキシヌクレオチド鎖末端法(Sm
ith、^、 J、 M、 Meth。
Unzym、 F4.560〜580. (1980)
)にて決定された。
)にて決定された。
cDNAインサートの制限酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断図を第1図及び第2図(a)に示す。第2図(a
)に示すごとく、このcDNAはそれぞれBstNl、
χha T 、 BstN Iなる制限酵素エンドヌク
レアーゼで切断される構造を有する。
る切断図を第1図及び第2図(a)に示す。第2図(a
)に示すごとく、このcDNAはそれぞれBstNl、
χha T 、 BstN Iなる制限酵素エンドヌク
レアーゼで切断される構造を有する。
本cDNAインサートのDNA配列は一つの大きなオー
プンリーディングフレームを保有する。真核生物の読み
取り開始配列となることの多い第一のATG配列(Ko
zak、 M、 Cel!、 15.1109〜112
3(1978))は、5”一端から48−50ヌクレオ
チド位に存在し、読み終り配列TGAが存在するヌクレ
オチド位507−509迄152の配列がこのATGに
つ太がっている。mRNAの3’ −poly (A)
末端に相当するAのつながりがcDNA末端に見出され
、通常真核生物mRNAのほとんどに見出される6個か
らなるヌクレオチドAATAAA(771−776位)
が先に位置する。
プンリーディングフレームを保有する。真核生物の読み
取り開始配列となることの多い第一のATG配列(Ko
zak、 M、 Cel!、 15.1109〜112
3(1978))は、5”一端から48−50ヌクレオ
チド位に存在し、読み終り配列TGAが存在するヌクレ
オチド位507−509迄152の配列がこのATGに
つ太がっている。mRNAの3’ −poly (A)
末端に相当するAのつながりがcDNA末端に見出され
、通常真核生物mRNAのほとんどに見出される6個か
らなるヌクレオチドAATAAA(771−776位)
が先に位置する。
(Proudfoot、 N、J、 & Brownl
ee C,G、、 Nature 263゜211−2
14. (1976)) cDNAによってコードされる75ノ酸配列は第2図(
b)(アミノ酸配列1)のごとく演えきでき、しかもア
ミノ酸配列■のポリペプチドは153個のアミノ酸から
なり、その分子量は17631.7ダルトンと計算され
る。今日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると
報告されているように(BlobelG、 et al
、 5yts、 Soc、 Exp、 Med、、 3
3.9〜36(1979))、上記演えきIL−2ポリ
ペプチドのN末端領域はやはり疎水性である。本領域は
戒PIL−2の分泌時に切断されるシグナルペプチドの
役割を果しているであろう。切断は20−21位のSe
tとAla間で起るか21−22位間の^1a−Pro
間で切断され、アミノ酸配列■および■を有するポリペ
プチドを生成する。何故ならば同様な切断位置は今迄知
られたその他の分泌蛋白にもしばしば見出されているか
らである(Blobel、 G、 et al、 Sy
mp、 Soc、Exp。
ee C,G、、 Nature 263゜211−2
14. (1976)) cDNAによってコードされる75ノ酸配列は第2図(
b)(アミノ酸配列1)のごとく演えきでき、しかもア
ミノ酸配列■のポリペプチドは153個のアミノ酸から
なり、その分子量は17631.7ダルトンと計算され
る。今日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると
報告されているように(BlobelG、 et al
、 5yts、 Soc、 Exp、 Med、、 3
3.9〜36(1979))、上記演えきIL−2ポリ
ペプチドのN末端領域はやはり疎水性である。本領域は
戒PIL−2の分泌時に切断されるシグナルペプチドの
役割を果しているであろう。切断は20−21位のSe
tとAla間で起るか21−22位間の^1a−Pro
間で切断され、アミノ酸配列■および■を有するポリペ
プチドを生成する。何故ならば同様な切断位置は今迄知
られたその他の分泌蛋白にもしばしば見出されているか
らである(Blobel、 G、 et al、 Sy
mp、 Soc、Exp。
Med、、 33.9〜36(1979))、従って、
或y6rL−2ポリペプチドは133ないし132個の
アミノ酸から成り、分子量は15420.5または15
349.4ダルトンと算出される。本分子量値はジュル
カソト細胞から得られたヒトIL−2蛋白の分子(41
(15000ダルトン)として報告されたものを対比さ
れる(Gi!lis et al、、 Immunol
ogical Rev、、 63+ 61〜209 (
1982) )。また実施例3に示すごとく塩基配列1
11〜113位にあるCCT配列から始まるDNA画分
、即ち、22位に位置するProから始まるポリペプチ
ドに対するコード(第2(b)図中のアミノ酸配列■)
はIL−2活性を有するポリペプチドを表現しているこ
とが確認された。塩基配列107〜110位にあるGC
Aから始まるDNA画分、即ち第2(b)図のアミノ酸
配列Hに示すごとく、21位に位置するAlaから始ま
るポリペプチドをコードするDNA画分は、実施例6に
示すごと(IL−2活性を有するポリペプチドを表現し
ていることが確認された。
或y6rL−2ポリペプチドは133ないし132個の
アミノ酸から成り、分子量は15420.5または15
349.4ダルトンと算出される。本分子量値はジュル
カソト細胞から得られたヒトIL−2蛋白の分子(41
(15000ダルトン)として報告されたものを対比さ
れる(Gi!lis et al、、 Immunol
ogical Rev、、 63+ 61〜209 (
1982) )。また実施例3に示すごとく塩基配列1
11〜113位にあるCCT配列から始まるDNA画分
、即ち、22位に位置するProから始まるポリペプチ
ドに対するコード(第2(b)図中のアミノ酸配列■)
はIL−2活性を有するポリペプチドを表現しているこ
とが確認された。塩基配列107〜110位にあるGC
Aから始まるDNA画分、即ち第2(b)図のアミノ酸
配列Hに示すごとく、21位に位置するAlaから始ま
るポリペプチドをコードするDNA画分は、実施例6に
示すごと(IL−2活性を有するポリペプチドを表現し
ていることが確認された。
有核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子でも知
られている様に多形現象を示すことが知られている(各
日ら、 Gene 10.11〜15(1980) 、
大野、呑口、、 Proc、 Natl、 Acad、
Sci、 USA+ 775305〜5309(19
81); Gray et al、 Nature 2
95.501〜50B (1981) )。この多形現
象によって、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換さ
れる場合もあれば、塩基配列の変化はあっても全く変ら
ない場合もある。ヒトIL −2・cDNAの場合、p
lL−2−50AcDN^0503位のA残基がG残基
で置き換えられた他のcDNAクローン(pIL−2−
503)も検出できる。plL−2−50A cDNA
とは塩基配列が異なるその他のcDNAクローンの存在
も期待できる。
られている様に多形現象を示すことが知られている(各
日ら、 Gene 10.11〜15(1980) 、
大野、呑口、、 Proc、 Natl、 Acad、
Sci、 USA+ 775305〜5309(19
81); Gray et al、 Nature 2
95.501〜50B (1981) )。この多形現
象によって、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換さ
れる場合もあれば、塩基配列の変化はあっても全く変ら
ない場合もある。ヒトIL −2・cDNAの場合、p
lL−2−50AcDN^0503位のA残基がG残基
で置き換えられた他のcDNAクローン(pIL−2−
503)も検出できる。plL−2−50A cDNA
とは塩基配列が異なるその他のcDNAクローンの存在
も期待できる。
上記説明からも明らかなごとく、本発明に係る遺伝子は
、第2(a)図に示された塩基配列を有するl)N八、
48−50位のATG配列から始まり、504〜506
位にある少くともACT配列に至る連続塩基配列を有す
るDNA5.108−110位のGCA配列から始まり
、GCA配列から少くともAC丁配列に至る連続塩基配
列を有するDNA、また111−113位のCCT配列
から少くともACT配列に至る連続塩基配列を有するD
NAを包含する。本発明に係る遺伝子はまた、504〜
506位のACT配列に終り、1位のAに始まるDNA
、 48−50位のATGで始まるDNA、 108
−110位のGC^配列で始まるDNA又は111−1
13位のCCT配列で始まるDNAを包含する。更に本
発明に係る遺伝子は、507〜509位のTGA配列に
終り、1位の八に始まるDNA、48〜50位のATG
配列で始まるD[IA、 108〜110位のGCA配
列で始まるDNAまたは111−113位のCCT配列
で始まるDNAを包含する。更に本発明に係る遺伝子は
、801位のCで終り、■位のAで始まるDNA、 4
B−50位のATGで始まるDNA、 1.08−11
0位のGCAで始まるDNAまたは111−113位の
CCT配列で始まるDNAを包含する。
、第2(a)図に示された塩基配列を有するl)N八、
48−50位のATG配列から始まり、504〜506
位にある少くともACT配列に至る連続塩基配列を有す
るDNA5.108−110位のGCA配列から始まり
、GCA配列から少くともAC丁配列に至る連続塩基配
列を有するDNA、また111−113位のCCT配列
から少くともACT配列に至る連続塩基配列を有するD
NAを包含する。本発明に係る遺伝子はまた、504〜
506位のACT配列に終り、1位のAに始まるDNA
、 48−50位のATGで始まるDNA、 108
−110位のGC^配列で始まるDNA又は111−1
13位のCCT配列で始まるDNAを包含する。更に本
発明に係る遺伝子は、507〜509位のTGA配列に
終り、1位の八に始まるDNA、48〜50位のATG
配列で始まるD[IA、 108〜110位のGCA配
列で始まるDNAまたは111−113位のCCT配列
で始まるDNAを包含する。更に本発明に係る遺伝子は
、801位のCで終り、■位のAで始まるDNA、 4
B−50位のATGで始まるDNA、 1.08−11
0位のGCAで始まるDNAまたは111−113位の
CCT配列で始まるDNAを包含する。
本発明に係る遺伝子はまたpoly(A)で終り、4B
−50位のATG配列から始まるDNA、 10B−1
10位のGCA配列で始まるDNAまたは1it−11
3位のCCT配列で始まるDNAを含む。また、本発明
は、アミノ酸配列1.II。
−50位のATG配列から始まるDNA、 10B−1
10位のGCA配列で始まるDNAまたは1it−11
3位のCCT配列で始まるDNAを含む。また、本発明
は、アミノ酸配列1.II。
■に相当する塩基配列を有する遺伝子を含む。アミノ酸
配列■の中で1個ないしそれ以上のアミノ酸を欠くポリ
ペプチド、あるいはアミノ酸配列Iの中の1個ないしそ
れ以上のアミノ酸が1個ないしそれ以上のアミノ酸で置
換されたポリペプチドはIL−2活性を有することもあ
り、従ってこの様なポリペプチドをコードする遺伝子は
本発明に係る遺伝子として使える。同様にアミノ酸配列
1.IIまたは■に対して1個ないしそれ以上のアミノ
酸を表現し得る1個ないしそれ以上の塩基を余分に結合
した遺伝子であっても追加されたアミノ酸が、ポリペプ
チドのIL−2活性発現に邪魔しない限り本発明の中に
包含される。IL−2としてのポリペプチドa能を阻害
する追加アミノ酸配列を有する修飾領域であっても新た
に追加された領域が容易に除去出来るものならば本発明
に係る遺伝子として利用出来る。同じことはアaノ酸配
列1.IIおよび■に対応する遺伝子のアミノ酸配列1
.IIおよび■のC−末端にア多ノ酸追加をコードする
DNAが3゛−末端に追加結合せしめたDNAの場合に
も言える。従って、この樺なポリペプチドをコードする
遺伝子の利用は、本発明に包含される。
配列■の中で1個ないしそれ以上のアミノ酸を欠くポリ
ペプチド、あるいはアミノ酸配列Iの中の1個ないしそ
れ以上のアミノ酸が1個ないしそれ以上のアミノ酸で置
換されたポリペプチドはIL−2活性を有することもあ
り、従ってこの様なポリペプチドをコードする遺伝子は
本発明に係る遺伝子として使える。同様にアミノ酸配列
1.IIまたは■に対して1個ないしそれ以上のアミノ
酸を表現し得る1個ないしそれ以上の塩基を余分に結合
した遺伝子であっても追加されたアミノ酸が、ポリペプ
チドのIL−2活性発現に邪魔しない限り本発明の中に
包含される。IL−2としてのポリペプチドa能を阻害
する追加アミノ酸配列を有する修飾領域であっても新た
に追加された領域が容易に除去出来るものならば本発明
に係る遺伝子として利用出来る。同じことはアaノ酸配
列1.IIおよび■に対応する遺伝子のアミノ酸配列1
.IIおよび■のC−末端にア多ノ酸追加をコードする
DNAが3゛−末端に追加結合せしめたDNAの場合に
も言える。従って、この樺なポリペプチドをコードする
遺伝子の利用は、本発明に包含される。
生細胞中でIL−2産生をする組換えDNA体は、次の
各種方法で作られる。例えば、IL−2・cDNAをコ
ードする配列を発現ベクターのプロモーター配列下流に
挿入する。あるいはプロモーター配列を持つcDNA片
を発現ベクターのcDNA挿入の前あるいは後にIL−
2をコードする配列の上流に挿入することが出来る。
各種方法で作られる。例えば、IL−2・cDNAをコ
ードする配列を発現ベクターのプロモーター配列下流に
挿入する。あるいはプロモーター配列を持つcDNA片
を発現ベクターのcDNA挿入の前あるいは後にIL−
2をコードする配列の上流に挿入することが出来る。
IL −2−cDNAを発現し、IL−2−ポリペプチ
ドを産生ずる原核生物の造成法を詳述すれば以下の通り
である。
ドを産生ずる原核生物の造成法を詳述すれば以下の通り
である。
(1) エシェリヒア・コリによるIL−2−cDN
Aの発現 エシェリヒア・コリ中でIL−2−cDNAを発現させ
るには、先ずcDNAを各種細菌プロモーターと結合せ
しめた後、プロモーター下流にcDNAを含有するバイ
ブリドプラス逅ドを作る。このプラスミドを、例えばエ
シェリヒア・コリHBIOIに感染さセ、ヒトIL−2
活性を有する蛋白を生合成する細菌がクローンされる0
本来細菌のプロモーターならば如何なるものでもcDN
Aに適当に接続されていればIL 2−cDNAを発
現する。この様なcDNAの発現例は以下のとおりであ
る。
Aの発現 エシェリヒア・コリ中でIL−2−cDNAを発現させ
るには、先ずcDNAを各種細菌プロモーターと結合せ
しめた後、プロモーター下流にcDNAを含有するバイ
ブリドプラス逅ドを作る。このプラスミドを、例えばエ
シェリヒア・コリHBIOIに感染さセ、ヒトIL−2
活性を有する蛋白を生合成する細菌がクローンされる0
本来細菌のプロモーターならば如何なるものでもcDN
Aに適当に接続されていればIL 2−cDNAを発
現する。この様なcDNAの発現例は以下のとおりであ
る。
IL−2をコードするクローン化cONAは第2図に示
される様な153個のアミノ酸からなるポリペプチドを
コードする。本ポリペプチドの20個のアミノ酸に相当
するN−末端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分泌
蛋白の特徴でもある。この様な疎水性配列はシグナル配
列と称し分泌過程で切断される。故に、成熟IL−2ポ
リペプチドは、153個のアミノ酸より少ない筈である
。このことから、成熟IL−2ポリペプチドをコードす
るcDN^DNA発現させることが望ましく、IL−2
シグナル配列相当部分を発現させるのは望ましくはない
。
される様な153個のアミノ酸からなるポリペプチドを
コードする。本ポリペプチドの20個のアミノ酸に相当
するN−末端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分泌
蛋白の特徴でもある。この様な疎水性配列はシグナル配
列と称し分泌過程で切断される。故に、成熟IL−2ポ
リペプチドは、153個のアミノ酸より少ない筈である
。このことから、成熟IL−2ポリペプチドをコードす
るcDN^DNA発現させることが望ましく、IL−2
シグナル配列相当部分を発現させるのは望ましくはない
。
(i) プラスミドベクターpTrS−3の構築pT
rs−3は、エシェリヒア・コリTrpブロモークーを
含み、pTrS−3のリーダーペプチドのためのリポソ
ーム結合部位(SD配列)は既に報告されている(G、
Miozzari and Yanofsky J、
Bacteriol、 133+1457〜1466
(1978) )、SD配列の下流13塩基対にある
^TGコードンの存在も報告されている(Nishi
etal、生化学54. Na8.676 (19B2
))、 コ(Dプラスミドベクターはまた、ATG開始
配列(第3図)の下流に一つのsph 1部位を含ん
でいる。
rs−3は、エシェリヒア・コリTrpブロモークーを
含み、pTrS−3のリーダーペプチドのためのリポソ
ーム結合部位(SD配列)は既に報告されている(G、
Miozzari and Yanofsky J、
Bacteriol、 133+1457〜1466
(1978) )、SD配列の下流13塩基対にある
^TGコードンの存在も報告されている(Nishi
etal、生化学54. Na8.676 (19B2
))、 コ(Dプラスミドベクターはまた、ATG開始
配列(第3図)の下流に一つのsph 1部位を含ん
でいる。
IL−2・cDNAを発現させるため、先ずプラスミド
をsph 1で消化しエシェリヒア・コリDNAポリ
メラーゼ■(フレノウ(Klenow)フラグメント)
または、バクテリオファージT4 ONAポリメラーゼ
■で処理し3°−位突き出し末端を除去する(第4図(
a))。プラスミドpIL−2−5OAをPst Iお
よびtlgiAIで2回消化し、より大きいcDNA画
分を単離する。
をsph 1で消化しエシェリヒア・コリDNAポリ
メラーゼ■(フレノウ(Klenow)フラグメント)
または、バクテリオファージT4 ONAポリメラーゼ
■で処理し3°−位突き出し末端を除去する(第4図(
a))。プラスミドpIL−2−5OAをPst Iお
よびtlgiAIで2回消化し、より大きいcDNA画
分を単離する。
次いでDNAをエシェリヒア・コリDNAポリメラーゼ
■ (フレノウフラグメント)又はバクテリオファージ
T4 ONAポリメラーゼで処理して3”−突き出し末
端を切りはなす。この処理をしたcDNAは132個の
アミノ酸のIL−2ポリペプチドをコードする(第4(
a)図)、このcDNAを上述のごとく前処理したpT
rS −3プラス果ドDNAに結合せしめ、^TG開始
コードンをIL−2cDN^のCCT (Pro)配列
につなぎ合せる。こうしてプラスξドpTIL−2−2
2が得られる。↑rpプロモーター配列とpTIL−2
−22のIL−2cDNA配列の結合は第4(a)図に
示す。
■ (フレノウフラグメント)又はバクテリオファージ
T4 ONAポリメラーゼで処理して3”−突き出し末
端を切りはなす。この処理をしたcDNAは132個の
アミノ酸のIL−2ポリペプチドをコードする(第4(
a)図)、このcDNAを上述のごとく前処理したpT
rS −3プラス果ドDNAに結合せしめ、^TG開始
コードンをIL−2cDN^のCCT (Pro)配列
につなぎ合せる。こうしてプラスξドpTIL−2−2
2が得られる。↑rpプロモーター配列とpTIL−2
−22のIL−2cDNA配列の結合は第4(a)図に
示す。
プラスミドルi IL〜2−22はエシェリヒア・コリ
によりプロリンから始まる132個のアミノ酸からなる
IL−2ポリペプチド合或を指令する。
によりプロリンから始まる132個のアミノ酸からなる
IL−2ポリペプチド合或を指令する。
(11)成熟IL−2はプロリンの代りにN−末端ア主
ノ酸としてアラニン(21位)を含むこともあり、13
3個のアミノ酸から戒るIL−2ポリペプチド合威を指
示するプラスミドを以下の如く作ることができる。
ノ酸としてアラニン(21位)を含むこともあり、13
3個のアミノ酸から戒るIL−2ポリペプチド合威を指
示するプラスミドを以下の如く作ることができる。
プラスミドpTrS 3はSD配列とATG配列との
間に1つのC1a I切断部位がある(第3図)。本
プラスミドはC1a IとSat Iで切断される
。プラスミドplL−2−50八をPst Iで部分分
解し、エシェリヒア・コリDNAポリメラーゼIで処理
し、最も長いDN^を単離する。次いでDNAを制限酵
素Xho I切断部位を含む合成DNAリンカーと結
合させ、IL−2をコードする配列の3°−側下流にD
NAリンカ−を導入したプラスごドPIL−2−5OA
(Xho)を含むクローンを単離する。プラスミドpl
L−2−5OA(Xho)を先ずl1g1A Iで切断
し、エシェリヒア・コリ フレノウフラグメントまたは
T4 DNAポリメラーゼで処理し、Xho Iで消化
すればcDNA画分が単離できる。
間に1つのC1a I切断部位がある(第3図)。本
プラスミドはC1a IとSat Iで切断される
。プラスミドplL−2−50八をPst Iで部分分
解し、エシェリヒア・コリDNAポリメラーゼIで処理
し、最も長いDN^を単離する。次いでDNAを制限酵
素Xho I切断部位を含む合成DNAリンカーと結
合させ、IL−2をコードする配列の3°−側下流にD
NAリンカ−を導入したプラスごドPIL−2−5OA
(Xho)を含むクローンを単離する。プラスミドpl
L−2−5OA(Xho)を先ずl1g1A Iで切断
し、エシェリヒア・コリ フレノウフラグメントまたは
T4 DNAポリメラーゼで処理し、Xho Iで消化
すればcDNA画分が単離できる。
このcDNAフラグメントをC1a IおよびSat
Iで前処理したpTrS−3DNAに結合させ第4
(b〉図の如く合成DNAにつなげる。かくしてAla
からスタートする133個のアミノ酸から威るIL−2
ポリペプチドをエシェリヒア・コリ中で合成させるプラ
スミドpTIL−2−21が得られる。(第4(b)図
)。同様なことはXho Iリンカ−を使用しなくと
も作られる。
Iで前処理したpTrS−3DNAに結合させ第4
(b〉図の如く合成DNAにつなげる。かくしてAla
からスタートする133個のアミノ酸から威るIL−2
ポリペプチドをエシェリヒア・コリ中で合成させるプラ
スミドpTIL−2−21が得られる。(第4(b)図
)。同様なことはXho Iリンカ−を使用しなくと
も作られる。
(iii)異ったN−末端アミノ酸を有する異った大き
さのIL−2ポリペプチドはpTrS−3発現プラスミ
ドヘクターを用いても作られる。以下に示すごと< 、
pIL−2−50AにクローンされたIL−2cDNA
はヌクレオチド結合部位81−85に唯一ツタケDde
部分を有する。プラスミドplL−2−5OA (Xh
o)を、Dbe Iで切断し、cDNAのより大きい区
分を含有するDNA画分を単離する。木画分はpBR3
22より3000塩基対を有するDNAを含んでいる(
第4(C)図)。
さのIL−2ポリペプチドはpTrS−3発現プラスミ
ドヘクターを用いても作られる。以下に示すごと< 、
pIL−2−50AにクローンされたIL−2cDNA
はヌクレオチド結合部位81−85に唯一ツタケDde
部分を有する。プラスミドplL−2−5OA (Xh
o)を、Dbe Iで切断し、cDNAのより大きい区
分を含有するDNA画分を単離する。木画分はpBR3
22より3000塩基対を有するDNAを含んでいる(
第4(C)図)。
DNA画分をエクソヌクレアーゼBal 31で処理し
、次いでXho Tで切断する。ここで得られたDNA
をsph Iで切断したpTrS−3と結合せしめ、
に1eno−フラグメントまたはT4 DNAポリメラ
ーゼで処理し次いでSal Iで消化する(第4(C
)図)。つなぎ合せたDNAをエシェリヒア・コリJI
B Lotに感染させ、ヒ1−IL−2を発現するクロ
ーンを検索する。これらのクローンは色色な大きさのヒ
トIL−2を発現する筈である。何故ならばヒトIL−
2のN−末端領域に相当するDNAは種々切断除去され
るからである。かくしてIL−2cDNAを含有するp
TIL−2−14■ と15が得られる。
、次いでXho Tで切断する。ここで得られたDNA
をsph Iで切断したpTrS−3と結合せしめ、
に1eno−フラグメントまたはT4 DNAポリメラ
ーゼで処理し次いでSal Iで消化する(第4(C
)図)。つなぎ合せたDNAをエシェリヒア・コリJI
B Lotに感染させ、ヒ1−IL−2を発現するクロ
ーンを検索する。これらのクローンは色色な大きさのヒ
トIL−2を発現する筈である。何故ならばヒトIL−
2のN−末端領域に相当するDNAは種々切断除去され
るからである。かくしてIL−2cDNAを含有するp
TIL−2−14■ と15が得られる。
(iv) IL−2cDNAはまたpKT 218 (
Talmageより提供を受けた; Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci、 USA。
Talmageより提供を受けた; Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci、 USA。
出、 P、3369〜3373 (1980) )を用
いても発現可能である。プラスミドpKT 21BはP
st Iで切断し、prt。
いても発現可能である。プラスミドpKT 21BはP
st Iで切断し、prt。
−2−5OAをHgiΔ■とPst Iで切断(第5
図)して得たIL−2cDN^挿入部分とつなぎ合わせ
る。出来上ったプラスミドpKIL−2−21は第5図
に示したように、蛋白合成開始の始発位に配列を有して
いる。
図)して得たIL−2cDN^挿入部分とつなぎ合わせ
る。出来上ったプラスミドpKIL−2−21は第5図
に示したように、蛋白合成開始の始発位に配列を有して
いる。
したがって、このプラスξドpKIL−2−21はIL
−2の133個のアくノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ
酸からなる両者が融合したポリペプチドからなり、これ
をエシェリヒア・コリ中で合成することが出来る筈であ
る(R初のメチオニンはエシェリヒア・コリでは切断除
去される〉。
−2の133個のアくノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ
酸からなる両者が融合したポリペプチドからなり、これ
をエシェリヒア・コリ中で合成することが出来る筈であ
る(R初のメチオニンはエシェリヒア・コリでは切断除
去される〉。
(v ) p−BR・322にtufBに対するプロモ
ーター配列を挿入したプラスごドpTuBlp−5の発
現は既に行なわれている(呑口ら5生化学53966(
1981))。
ーター配列を挿入したプラスごドpTuBlp−5の発
現は既に行なわれている(呑口ら5生化学53966(
1981))。
このプラス壽ドは一つのC1a I切断部位を含み、
第6図に示すごとく本切断部位はsD配列の2塩基対だ
け下流に位置する。pTrS−3もまたSD配列とAT
G始発配列の間にある一つのC1a L切断部位を含
み、同時にこのC1a 1部位はpTrS−3とIL
−2cDNAを用いて発現用プラスミドを作る過程で壊
されないので細菌TrpプロモーターをtufBプロモ
ーターで置き換えることは極めて簡単である。従ってヒ
トIL−2cDNAはtufBプロモーターの制御下で
発現される。例えばpTIL−2−22をC1a I
とPvu Ifで切断し、IL−2cDNAを含むD
NA画分を分離する。
第6図に示すごとく本切断部位はsD配列の2塩基対だ
け下流に位置する。pTrS−3もまたSD配列とAT
G始発配列の間にある一つのC1a L切断部位を含
み、同時にこのC1a 1部位はpTrS−3とIL
−2cDNAを用いて発現用プラスミドを作る過程で壊
されないので細菌TrpプロモーターをtufBプロモ
ーターで置き換えることは極めて簡単である。従ってヒ
トIL−2cDNAはtufBプロモーターの制御下で
発現される。例えばpTIL−2−22をC1a I
とPvu Ifで切断し、IL−2cDNAを含むD
NA画分を分離する。
次いでこの画分をpTuBIP−5でつなぎ合わせ、C
1a IとPvu IIで予め切断後、第6図に図示
される様にプラスミドpTulL−2−22が造成され
る。IL−2活性はプラス稟ドpTulL−2−22を
含むエシェリヒア・コリII 8101の抽出液に検出
できる。
1a IとPvu IIで予め切断後、第6図に図示
される様にプラスミドpTulL−2−22が造成され
る。IL−2活性はプラス稟ドpTulL−2−22を
含むエシェリヒア・コリII 8101の抽出液に検出
できる。
(vi)例えばpTIL−2−21を使っても、また基
本的にはpTrS−3を用いて達成したすべての発現用
プラスミドを用いることによっても同様に造成できる。
本的にはpTrS−3を用いて達成したすべての発現用
プラスミドを用いることによっても同様に造成できる。
また例えばpTu IL−2−22をC1a Iで切
断し、Bat31またはSIまたはDNAポリメラーゼ
■ (エシェリヒア・コリ)にてDNAの塩基対2−3
個を除去または補充し再度プラスミドをつなげることに
よってSDおよびATG配列の距離を至適の長さにする
ことも可能である。
断し、Bat31またはSIまたはDNAポリメラーゼ
■ (エシェリヒア・コリ)にてDNAの塩基対2−3
個を除去または補充し再度プラスミドをつなげることに
よってSDおよびATG配列の距離を至適の長さにする
ことも可能である。
組換えDNA体を挿入したエシェリヒア・コリまたはバ
チルス・ズブチリスの如き形質転換された原核生物細胞
を培養して組換えDNA体を増巾し又はIL−2ポリペ
プチドを生産する。この培養は通常の方法で行なわれる
。
チルス・ズブチリスの如き形質転換された原核生物細胞
を培養して組換えDNA体を増巾し又はIL−2ポリペ
プチドを生産する。この培養は通常の方法で行なわれる
。
細胞内または細胞外に生産されたIL−2は硫安沈澱、
塩類除去のための透析(常圧または減圧下)。
塩類除去のための透析(常圧または減圧下)。
ゲル濾過、クロマトグラフィー、等電点平板上濃縮、ゲ
ル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(以下II
P L Cと略記)、(イオン交換、ゲル濾過並びに逆
相クロマトグラフィー)、及び色素結合担体、IL−2
に対するモノクローナル抗体を結合した活性化セファロ
ース4B又はレクチン結合セファロース4B等によるア
フィニティクロマトグラフィー等、公知の方法によって
回収することができる。
ル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(以下II
P L Cと略記)、(イオン交換、ゲル濾過並びに逆
相クロマトグラフィー)、及び色素結合担体、IL−2
に対するモノクローナル抗体を結合した活性化セファロ
ース4B又はレクチン結合セファロース4B等によるア
フィニティクロマトグラフィー等、公知の方法によって
回収することができる。
IL−2の単離精製法はWa tsonら(J、 Hx
p、 Med、。
p、 Med、。
150、849−861(1979L G11lis
et al、 J、 I+u+uno1.。
et al、 J、 I+u+uno1.。
月口、 1954−1962(1980)、 Moc
hizuki et al、 J。
hizuki et al、 J。
Immunol、 Methods 33. 185
−201(1980)、 Welte。
−201(1980)、 Welte。
K et al、 J、 Kxp、 Med、、 15
6.454−464(19B2))によって報告されて
いる。
6.454−464(19B2))によって報告されて
いる。
かくして得られたポリペプチドはマイトジェン刺激によ
って哺乳動物細胞から作られるTL−2について知られ
ているものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し
IL−2活性を有する。分子量は約15000ダルトン
でありIシー2活性は、Igsorb(t!nzy+s
e Center)の様な免疫吸着剤の有無にかかわら
ず完全に中和され、またはモノクローナル抗IL−2抗
体で沈澱した。免疫電気泳動において、IL−2ポリペ
プチドは、対応する抗IL−2抗体に対して唯1個の沈
降線を示す。IL−2活性は2−メルカプトエタノール
で還元後も安定であり、DNA5e及びRNA5e処理
しても、又56°C230分熱処理しても安定である。
って哺乳動物細胞から作られるTL−2について知られ
ているものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し
IL−2活性を有する。分子量は約15000ダルトン
でありIシー2活性は、Igsorb(t!nzy+s
e Center)の様な免疫吸着剤の有無にかかわら
ず完全に中和され、またはモノクローナル抗IL−2抗
体で沈澱した。免疫電気泳動において、IL−2ポリペ
プチドは、対応する抗IL−2抗体に対して唯1個の沈
降線を示す。IL−2活性は2−メルカプトエタノール
で還元後も安定であり、DNA5e及びRNA5e処理
しても、又56°C230分熱処理しても安定である。
活性はpi(2〜9で安定である。この様にして生産さ
れたIL−2はモノクローナルな機能を有するT細胞(
細胞障害性Tリンパ球)の増殖を促進し、胸腺細胞の分
裂を強め、更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特
異的細胞障害Tリンパ球への分化を惹き起こす。また、
YAC−1細胞やl’1Ls1細胞に対するナチュラル
キラー細胞の活性化の増強に役立つ。
れたIL−2はモノクローナルな機能を有するT細胞(
細胞障害性Tリンパ球)の増殖を促進し、胸腺細胞の分
裂を強め、更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特
異的細胞障害Tリンパ球への分化を惹き起こす。また、
YAC−1細胞やl’1Ls1細胞に対するナチュラル
キラー細胞の活性化の増強に役立つ。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例1
(1) ヒトT細胞系白血病細胞株であるジュルカッ
ト細胞(日本、***および米国では自由に人手可能であ
る)を10%FC5を含むRPMI 1640培地にけ
ん濁し、X線照射装置Exs 150/300−4(東
芝・日本)により50秒間、室温で10,000レント
ゲンに達するまで照射した。その後照射された細胞は上
述の培地中、初期細胞密度lXl0’個/成で5%炭酸
ガス、37°Cのインキュベーター中で5日間培養した
。
ト細胞(日本、***および米国では自由に人手可能であ
る)を10%FC5を含むRPMI 1640培地にけ
ん濁し、X線照射装置Exs 150/300−4(東
芝・日本)により50秒間、室温で10,000レント
ゲンに達するまで照射した。その後照射された細胞は上
述の培地中、初期細胞密度lXl0’個/成で5%炭酸
ガス、37°Cのインキュベーター中で5日間培養した
。
この変異細胞(0,2個/穴)を96穴の平底のマイク
ロプレートの10穴にまき、5%炭酸ガス、37°Cの
インキュベーター中で21日間培養した。
ロプレートの10穴にまき、5%炭酸ガス、37°Cの
インキュベーター中で21日間培養した。
生育してくる穴から得られるクローンはクローン量を増
加させるため新たな培地へ移し、その増加したクローン
はConA 50 u g/d存在下で初期細胞密度
lXl0”個/ll11で24時間培養した。そしてI
L−2活性は前述の方法に従って測定した。
加させるため新たな培地へ移し、その増加したクローン
はConA 50 u g/d存在下で初期細胞密度
lXl0”個/ll11で24時間培養した。そしてI
L−2活性は前述の方法に従って測定した。
この結果、ジェルカット−111(ATCCCRL81
29) (以後“J−111”と称する)と命名された
ヒトT細胞株が親株のジュルカットからクローン化、選
択され、この細胞のIL−2産生能は親株の40倍に増
加していた。
29) (以後“J−111”と称する)と命名された
ヒトT細胞株が親株のジュルカットからクローン化、選
択され、この細胞のIL−2産生能は親株の40倍に増
加していた。
このクローン化したJ−111細胞株は通常条件下で増
殖し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとん
ど同じであった。
殖し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとん
ど同じであった。
(2)J−111細胞(l×10S個/Ir11)を無
血清合成培地RIT C55−9(Sato、 T、
et al、、 Exp。
血清合成培地RIT C55−9(Sato、 T、
et al、、 Exp。
Ce1l Res、、 138.127−134.(1
982)) 1000−に接種し、ローラー培養ボトル
(ファルコン3027)内で37°C14日間培養し、
増殖した細胞を遠心分離により取得した。この細胞を再
び4X10’個/ mlとなるよう上述のCon^25
μg/ml含有培地に接種した。ローラー培養ボトル(
ファルコン)4バツチの各々に細胞を接種した培養液1
00dを入れ、6時間回転培養した。
982)) 1000−に接種し、ローラー培養ボトル
(ファルコン3027)内で37°C14日間培養し、
増殖した細胞を遠心分離により取得した。この細胞を再
び4X10’個/ mlとなるよう上述のCon^25
μg/ml含有培地に接種した。ローラー培養ボトル(
ファルコン)4バツチの各々に細胞を接種した培養液1
00dを入れ、6時間回転培養した。
(3)このようにConA 25gg7m1で6時間刺
激したジュルカット細胞(1,2X10”)は生理食塩
−リン酸緩衝液(以後PBSと略す) 8.0OOdに
懸濁した。この細胞は遠心操作により2回洗浄し、ヌク
レアーゼ胆害剤であるリボヌクレオシドーバナデイル複
合体(10mM)を含有するRSB溶液(10戚トリス
−塩酸緩衝液、pH7,5、I OmM NaC1!、
、1、5mM MgC12) 800dに再懸濁した。
激したジュルカット細胞(1,2X10”)は生理食塩
−リン酸緩衝液(以後PBSと略す) 8.0OOdに
懸濁した。この細胞は遠心操作により2回洗浄し、ヌク
レアーゼ胆害剤であるリボヌクレオシドーバナデイル複
合体(10mM)を含有するRSB溶液(10戚トリス
−塩酸緩衝液、pH7,5、I OmM NaC1!、
、1、5mM MgC12) 800dに再懸濁した。
その後、界面活性剤NP−40を最終濃度0.05%と
なるように加え、ゆっくり混合し、細胞核を3.000
rp1m。
なるように加え、ゆっくり混合し、細胞核を3.000
rp1m。
5分、4°C下で遠心し分離した。5DS(0,5%)
及びEDTA (5mM)を上清液へ加え、細II逸質
RN^を上清液と同量のフェノールを加え抽出した。フ
ェノールによる抽出を3回繰返した後、RNA 4よ2
倍量のエタノールにより沈澱され、本沈澱物を遠心によ
り集め、pH7,5の10mMトリス−塩酸に溶解した
。得られたI?NAiは196■であった。
及びEDTA (5mM)を上清液へ加え、細II逸質
RN^を上清液と同量のフェノールを加え抽出した。フ
ェノールによる抽出を3回繰返した後、RNA 4よ2
倍量のエタノールにより沈澱され、本沈澱物を遠心によ
り集め、pH7,5の10mMトリス−塩酸に溶解した
。得られたI?NAiは196■であった。
mRNへの分画はオリゴ(dT)−セルロース(P、
L。
L。
Biochemicals+ Type 7)のアフィ
ニティークロマトグラフィーを使用し行った。吸着液は
20mMトリス−塩酸、0.5MNaCff1.1 m
M EDTA及び0.5%SDSを含むpl+7.5
の溶液であり、溶出はカラムを緩衝液(20a+M)リ
ス−塩酸、pH7,5,0,5M NaC1,1mM
EDTA)で洗浄後、水と10mMトリス−塩酸(pH
7,5)で交互に行った。溶出により得られたmRNA
は3.6mgであった。次にこの得られたmRNA 2
.4111gを蔗糖密度勾配遠心法(50mM)リス−
塩酸、1 mM EDTA、0.2M NaC1を含
むpH7,5の溶液中で蔗糖密度勾配5−25%、26
.00Orpmで4°C下24時間)により分画した。
ニティークロマトグラフィーを使用し行った。吸着液は
20mMトリス−塩酸、0.5MNaCff1.1 m
M EDTA及び0.5%SDSを含むpl+7.5
の溶液であり、溶出はカラムを緩衝液(20a+M)リ
ス−塩酸、pH7,5,0,5M NaC1,1mM
EDTA)で洗浄後、水と10mMトリス−塩酸(pH
7,5)で交互に行った。溶出により得られたmRNA
は3.6mgであった。次にこの得られたmRNA 2
.4111gを蔗糖密度勾配遠心法(50mM)リス−
塩酸、1 mM EDTA、0.2M NaC1を含
むpH7,5の溶液中で蔗糖密度勾配5−25%、26
.00Orpmで4°C下24時間)により分画した。
mRNAの11から12Sが分画Na12.13.14
へ分画され、各々59μg、46μg、60dgであっ
た。
へ分画され、各々59μg、46μg、60dgであっ
た。
(4)Na13の分画に得られたmRNAをアフリカッ
メガエル7 Iaevis)の卵母細胞−・注入した(
50ngmRN^/卵母細胞)、この卵母細胞の培養液
をIL−2活性測定した。表1に示す如く、3)(−チ
ミジン(−H−↑dR)の取込みの上昇及び活性化T
IJンパ球数の増加が確認され、明らかにこの分画中の
mRNAはヒトIL−2 mRNAを含んでいる事が立証 された。
メガエル7 Iaevis)の卵母細胞−・注入した(
50ngmRN^/卵母細胞)、この卵母細胞の培養液
をIL−2活性測定した。表1に示す如く、3)(−チ
ミジン(−H−↑dR)の取込みの上昇及び活性化T
IJンパ球数の増加が確認され、明らかにこの分画中の
mRNAはヒトIL−2 mRNAを含んでいる事が立証 された。
表
!
(a)
分画1
3の翻
×
14.683
2
訳生底物
×32
10.1
5
(b)
分画1
3の翻
×
■
訳生成物
×16
5
* 単位は標JL−2(10単位/−)の3)1−Td
R取込み量と比較する事により算出した。
R取込み量と比較する事により算出した。
(5)その後IL−2mRNAを含むl l〜I 2S
mRNAのは13分画からin vitrorcDN
Aを台底した。
mRNAのは13分画からin vitrorcDN
Aを台底した。
組換え体DNAはプラス5ドベクターPBR322と構
成した。組換え体DNAをエシェリヒア・コリに形質転
換し、rL−2cDN^クローンを薙得したクローンを
以下に示す如き方法により選択した。
成した。組換え体DNAをエシェリヒア・コリに形質転
換し、rL−2cDN^クローンを薙得したクローンを
以下に示す如き方法により選択した。
(51)50mM)リス−塩酸緩衝液(pH7,5)、
30mM NaC1,6mM MgC1z 、5mMジ
チオスレイトール(以後DTTと略す)、0.5mMの
各dATP、 dGTr’、dCTP、 dTTP (
dCTPは32p放射標識したものを含む)、0.1μ
g オリゴ(dT) lo、10ugmRNA及び15
単位AMV逆転写酵素(J、 W、 Beard)を混
合し、41°C下で90分保った。反応終了後、DNA
はフェノール処理後エタノール沈澱物として回収し、こ
のDNAを20d)リスおよび1 mMHDTAを含む
pl+7.5の溶液に溶解した。
30mM NaC1,6mM MgC1z 、5mMジ
チオスレイトール(以後DTTと略す)、0.5mMの
各dATP、 dGTr’、dCTP、 dTTP (
dCTPは32p放射標識したものを含む)、0.1μ
g オリゴ(dT) lo、10ugmRNA及び15
単位AMV逆転写酵素(J、 W、 Beard)を混
合し、41°C下で90分保った。反応終了後、DNA
はフェノール処理後エタノール沈澱物として回収し、こ
のDNAを20d)リスおよび1 mMHDTAを含む
pl+7.5の溶液に溶解した。
5s−cDN42.5μgが合成された。本反応液より
mRNAを除くために反応液にNa0Il溶液を加えて
0、33 N NaOH溶液とし、室温にて15時間置
き、次いでpH7,5のLM)リス−塩酸緩衝液を同量
加えて中和しセファデックスG−50カラムをカラムを
通した。回収されたcDNAは1.8μgであった。
mRNAを除くために反応液にNa0Il溶液を加えて
0、33 N NaOH溶液とし、室温にて15時間置
き、次いでpH7,5のLM)リス−塩酸緩衝液を同量
加えて中和しセファデックスG−50カラムをカラムを
通した。回収されたcDNAは1.8μgであった。
(52)50mM リン酸緩衝液(pif 7.5
)、10mM MgCjl# 、10n+M DTT、
0.75mMの各dATP、dGTP、 dCTP%d
TTP (dCTPは3Hで標識したものを含む) 、
1.8 p g 5s−cDNAおよび8単位ポリメレ
ースI (BRL、米国)を混ぜ15時間、15°cで
反応を行った。反応終了後DNAをフェノール及びクロ
ロホルム処理後エタノール沈澱物として回収した。i、
10μgのds −cDNAが生成した。50mM酢酸
ソーダ(pH4,5) 、0.2 M NaCl!、、
1mMZn(、exおよび1.10 u g二本鎖cD
NAの混合物を37°Cで30分間インキュベートした
後0.25単位のヌクレアーゼSt(三井、日本)を加
え、さらに15分間インキュベートした。反応終了後、
フェノール処理を2回行った反応生成物をセファデック
スG−50へ供し、二本鎖cDNA O,55II g
を得た。
)、10mM MgCjl# 、10n+M DTT、
0.75mMの各dATP、dGTP、 dCTP%d
TTP (dCTPは3Hで標識したものを含む) 、
1.8 p g 5s−cDNAおよび8単位ポリメレ
ースI (BRL、米国)を混ぜ15時間、15°cで
反応を行った。反応終了後DNAをフェノール及びクロ
ロホルム処理後エタノール沈澱物として回収した。i、
10μgのds −cDNAが生成した。50mM酢酸
ソーダ(pH4,5) 、0.2 M NaCl!、、
1mMZn(、exおよび1.10 u g二本鎖cD
NAの混合物を37°Cで30分間インキュベートした
後0.25単位のヌクレアーゼSt(三井、日本)を加
え、さらに15分間インキュベートした。反応終了後、
フェノール処理を2回行った反応生成物をセファデック
スG−50へ供し、二本鎖cDNA O,55II g
を得た。
(5−3)0.14Mカコジル酸カリウム、30mM
ト’Jス塩基、0.1 rmM DTT、 1 m
M CoC1z、0.64mM ”P−dCTP (比
活性2.7 X 10 ’ cps/n mol)、0
、551! g ds−cDNAおよび5単位のター主
ナルトランスフェラーゼ(BRL)を混合し、37°C
で7分間インキエベートした後フェノール処理し、次い
でセファデックスG−50カラムに供し、エタノール沈
澱物として0.50μg DNAを得た。回収したこの
DNAは約50個のdCMP残基が両3°末端に付加さ
れている事が判明した。
ト’Jス塩基、0.1 rmM DTT、 1 m
M CoC1z、0.64mM ”P−dCTP (比
活性2.7 X 10 ’ cps/n mol)、0
、551! g ds−cDNAおよび5単位のター主
ナルトランスフェラーゼ(BRL)を混合し、37°C
で7分間インキエベートした後フェノール処理し、次い
でセファデックスG−50カラムに供し、エタノール沈
澱物として0.50μg DNAを得た。回収したこの
DNAは約50個のdCMP残基が両3°末端に付加さ
れている事が判明した。
pBR322ONA 10μgを制限酵素焉匹■で切
断したのちdCTPのかわりにdGTPを用いたこと以
外は前述のds −cDNAにdCMP鎖を付加したと
きに用いた方法と全く同じ条件により、切断したDNA
の両3゛末端にdGMP鎖を付加した。
断したのちdCTPのかわりにdGTPを用いたこと以
外は前述のds −cDNAにdCMP鎖を付加したと
きに用いた方法と全く同じ条件により、切断したDNA
の両3゛末端にdGMP鎖を付加した。
(5−4) 50mM )リス−塩酸(pH7,5)
0、1 M NaC1,5mM DETA、 0.05
u g dGMP残基付加pBR322および0.−
01 a g dCMP残基付加cDNAをまず65°
cで2時間、次いで46°Cで120分間、さらに37
℃で60分間、そして室温で6゜分間インキエベートし
た。
0、1 M NaC1,5mM DETA、 0.05
u g dGMP残基付加pBR322および0.−
01 a g dCMP残基付加cDNAをまず65°
cで2時間、次いで46°Cで120分間、さらに37
℃で60分間、そして室温で6゜分間インキエベートし
た。
エシェリヒア・コリZ 1776(Curtiss m
* R,etal、、 in Mo1ecular C
loning of Recombinant DNA
。
* R,etal、、 in Mo1ecular C
loning of Recombinant DNA
。
(W、 A、 5cott & R,Werner e
d、) Academic Press。
d、) Academic Press。
(1977))を50戚のL培地(100μg/成のシ
ア旦ノビメリン酸、50μg / rrdlのチミジン
、1%トリプトファン、0.5%酵母エキス、0.5%
NaC42および0.1%グルコースを含む)に接種し
培養液の吸光度が562μmで0.3付近になるまで3
7°Cで振とう培養した。培養終了後、培養液を30分
間O′Cに保持し、菌体を遠心分離により集め、5−
トリス−塩酸(p)I 7.6)、0.1 M NaC
j! 。
ア旦ノビメリン酸、50μg / rrdlのチミジン
、1%トリプトファン、0.5%酵母エキス、0.5%
NaC42および0.1%グルコースを含む)に接種し
培養液の吸光度が562μmで0.3付近になるまで3
7°Cで振とう培養した。培養終了後、培養液を30分
間O′Cに保持し、菌体を遠心分離により集め、5−
トリス−塩酸(p)I 7.6)、0.1 M NaC
j! 。
5s+MMgCj!xおよび10mM Rh(/!を含
む溶液25−で2回洗浄した。
む溶液25−で2回洗浄した。
得られた菌体を5mM)リス−塩酸(pl! 7.6
)、0.25M KCj!、 5ml’l F’Ig
C1t 、 0. I M CaC1tおよび10+a
M RbCj!を含む溶液20dに懸濁し、0°Cで2
5分間静置後、菌体を集め上記と同じ溶液1.dに菌体
を再懸濁し、得られた菌体懸濁液の0.2ad!に上記
組換え体DNAを入れ、O″Cで60分間静置した。そ
の後り培地0.1mlを加え37°Cで30分間振とう
培養した。こうして得られた培養液(0,1d)を10
0μg/−シアミノピメリン酸、50μg/−チミジン
および15μg/rnllテトラサイタリンを含むL培
地の1.5%寒天培地上に一面に塗抹し、37°Cで2
日間インキエベートした。
)、0.25M KCj!、 5ml’l F’Ig
C1t 、 0. I M CaC1tおよび10+a
M RbCj!を含む溶液20dに懸濁し、0°Cで2
5分間静置後、菌体を集め上記と同じ溶液1.dに菌体
を再懸濁し、得られた菌体懸濁液の0.2ad!に上記
組換え体DNAを入れ、O″Cで60分間静置した。そ
の後り培地0.1mlを加え37°Cで30分間振とう
培養した。こうして得られた培養液(0,1d)を10
0μg/−シアミノピメリン酸、50μg/−チミジン
および15μg/rnllテトラサイタリンを含むL培
地の1.5%寒天培地上に一面に塗抹し、37°Cで2
日間インキエベートした。
(5−5)出現した432のコロニーを18のグループ
に分け、(その各グループは24の異なるバクテリアク
ローンを含む)l’ooμg/1nllのシアミノピメ
リン酸、50μg/m1のチミジンおよび10μgのテ
トラサイクリンを含むL培地200−に接種し、37゛
Cで5〜7時間振とう培養した。次に最終濃度170μ
g/dとなるように加えられたクロラムフェニコールを
含む新たなL培地200dを加え、さらに−晩培養した
。
に分け、(その各グループは24の異なるバクテリアク
ローンを含む)l’ooμg/1nllのシアミノピメ
リン酸、50μg/m1のチミジンおよび10μgのテ
トラサイクリンを含むL培地200−に接種し、37゛
Cで5〜7時間振とう培養した。次に最終濃度170μ
g/dとなるように加えられたクロラムフェニコールを
含む新たなL培地200dを加え、さらに−晩培養した
。
このようにして増強されたプラスミドDNAを常法に従
い精製した。
い精製した。
IL−2cDNAを有するクローンはInRNAハイブ
リダイゼーションートランスレーションアッセイ(以後
H−Tアッセイと略称する)により選択した。
リダイゼーションートランスレーションアッセイ(以後
H−Tアッセイと略称する)により選択した。
ここで用いられたH−Tアッセイは以下に示す如く行っ
た。
た。
純化したDNA(25μg)を制限酵素11indll
lにより開裂しフェノールで3回、フェノール−クロロ
ホルムおよびクロロホルムで各々処理し、エタノールで
沈澱させ80%エタノールで洗浄し、80%ホルムアミ
ド40−に溶解した。
lにより開裂しフェノールで3回、フェノール−クロロ
ホルムおよびクロロホルムで各々処理し、エタノールで
沈澱させ80%エタノールで洗浄し、80%ホルムアミ
ド40−に溶解した。
反応液を変性させるため90°Cで5分間加熱後10
X5SC(1,5M HaCl、0.15M クエン
酸ソーダ)で1.3mlに希釈した。その後、本DNA
をニトロセルロース濾紙上に固定し、これを80″Cで
3時間乾燥させ、50%ホルムアミド、20 mM P
ipes(pH6,5)、0.75 M NaC1,5
m1l EDTA、0.2%SOS及びJ−111細胞
由来のpoly (A) mRNA250μgを含む重
点中で37°C118時間インキュベートし、濾紙上に
固定されたDNAとIL−2mRN^をハイブリダイズ
した。
X5SC(1,5M HaCl、0.15M クエン
酸ソーダ)で1.3mlに希釈した。その後、本DNA
をニトロセルロース濾紙上に固定し、これを80″Cで
3時間乾燥させ、50%ホルムアミド、20 mM P
ipes(pH6,5)、0.75 M NaC1,5
m1l EDTA、0.2%SOS及びJ−111細胞
由来のpoly (A) mRNA250μgを含む重
点中で37°C118時間インキュベートし、濾紙上に
固定されたDNAとIL−2mRN^をハイブリダイズ
した。
次にその濾紙を65°Cで3回pl+6.5の10a+
MPipes、 o、 15 M NaC1溶液、
1mM Pipes+ 10mMNacf溶液で洗浄
し0.5 mM EDTA、 0.1%SO3溶液で9
5°C,1分間処理し濾紙からハイブリダイズしたmR
NAを回収した。
MPipes、 o、 15 M NaC1溶液、
1mM Pipes+ 10mMNacf溶液で洗浄
し0.5 mM EDTA、 0.1%SO3溶液で9
5°C,1分間処理し濾紙からハイブリダイズしたmR
NAを回収した。
このようにして抽出したmRNAを常法に従ってオリゴ
dT−セルロースカラム上で精製し、アフリカッメガエ
ル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−2活性を
測定した。
dT−セルロースカラム上で精製し、アフリカッメガエ
ル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−2活性を
測定した。
各々24クローンからなる18グループのうちの1グル
ープが前述の38−TdR取込みによるアッセイで48
単位/dのIL−2活性陽性を示した。
ープが前述の38−TdR取込みによるアッセイで48
単位/dのIL−2活性陽性を示した。
一方他のグループは明らかに陰性であった。
次に、陽性のグループに属する24の各単一コロニーを
既述と同じ組成のL培地200 mlへ接種し、37°
Cで5〜7時間好気的に培養し、同様にクロラムフェニ
コール含有のL培地をさらに添加した。
既述と同じ組成のL培地200 mlへ接種し、37°
Cで5〜7時間好気的に培養し、同様にクロラムフェニ
コール含有のL培地をさらに添加した。
一晩培養して、プラスミドDNAを増強後、プラスミド
DNAを同様に標準法に従って精製した。tlind量
で各プラス壽ドDNA約5μgを開裂後、各プラスミド
を同様にニトロセルロース濾紙へ固定した。その濾紙を
IL −2mRNAとハイブリダイズし、ハイブリダイ
ズしたmRNAをアフリカッメガエル卵母細胞へ注入し
、翻訳された蛋白のIL−2活性を測定するため回収し
た。
DNAを同様に標準法に従って精製した。tlind量
で各プラス壽ドDNA約5μgを開裂後、各プラスミド
を同様にニトロセルロース濾紙へ固定した。その濾紙を
IL −2mRNAとハイブリダイズし、ハイブリダイ
ズしたmRNAをアフリカッメガエル卵母細胞へ注入し
、翻訳された蛋白のIL−2活性を測定するため回収し
た。
表2に示す如(、p3−16と表示した単一コロニーか
ら精製されたプラスミドDNAのみが陽性のIL−2活
性を示した。それ故、本クローンがIL−2cDNAを
有するクローン(旦、 coli z 1776/p
3−16AJ11995 (FERM−BP−225)
)と同定された。このようにプラスミドDNA、 p3
−16はIL 2 mRNAと特異的ハイブリッドを
形成する能力のあるDNA(IL−2遺伝子)を確かに
有している事が確認された。
ら精製されたプラスミドDNAのみが陽性のIL−2活
性を示した。それ故、本クローンがIL−2cDNAを
有するクローン(旦、 coli z 1776/p
3−16AJ11995 (FERM−BP−225)
)と同定された。このようにプラスミドDNA、 p3
−16はIL 2 mRNAと特異的ハイブリッドを
形成する能力のあるDNA(IL−2遺伝子)を確かに
有している事が確認された。
/
/
/
表
(a)
mRNAの翻訳
×
20.453
8
生成物
×32
20.96
(b)
mRNA”
の翻訳
×
8
2
生成物
×32
2
*
グラ。スミ
ドル3−16からのcDNAとハイブリダイズしたmR
NA プラスミドル3−16のcDNAインサートは制限酵素
Xba lにより1部位で、又Bst NIにより2
部位(Xba I開裂部位の上流及び下流)で切断さ
れるという特徴を示した。しかしながら、プラスミドル
3−16は約650塩基対より構成されるcDNAイン
サートを含んでおり、これは明らかに11〜12Sの大
きさのIL−2mRNAの一部分に相当するものである
。それ故、他のcDNAライブラリーを、鋳型としてI
L−2mRNAを用い、Land等の方法(Lande
t al、、 Nucleic Ac1ds Res、
、 VOI Ml p2551.(1981))に従っ
て作製した。−本鎖cDNA(1,6μg)を、dCM
P残基を付加したIL2mRN八4μgをへいて合成し
、そしてds −cDNAを、DNAポリメラーゼ■(
Klenow断片)によりプライマーとしてオリゴ(d
G)12=18を用いる事により合成した。680塩基
対DNAサイズマーカー(size marker)よ
り長いcDNA(0,6μg)は蔗糖密度勾配遠心法に
よって得られ、標準的なG−Cティリング法によりpB
R322のPst 1部位へ挿入出来た。
NA プラスミドル3−16のcDNAインサートは制限酵素
Xba lにより1部位で、又Bst NIにより2
部位(Xba I開裂部位の上流及び下流)で切断さ
れるという特徴を示した。しかしながら、プラスミドル
3−16は約650塩基対より構成されるcDNAイン
サートを含んでおり、これは明らかに11〜12Sの大
きさのIL−2mRNAの一部分に相当するものである
。それ故、他のcDNAライブラリーを、鋳型としてI
L−2mRNAを用い、Land等の方法(Lande
t al、、 Nucleic Ac1ds Res、
、 VOI Ml p2551.(1981))に従っ
て作製した。−本鎖cDNA(1,6μg)を、dCM
P残基を付加したIL2mRN八4μgをへいて合成し
、そしてds −cDNAを、DNAポリメラーゼ■(
Klenow断片)によりプライマーとしてオリゴ(d
G)12=18を用いる事により合成した。680塩基
対DNAサイズマーカー(size marker)よ
り長いcDNA(0,6μg)は蔗糖密度勾配遠心法に
よって得られ、標準的なG−Cティリング法によりpB
R322のPst 1部位へ挿入出来た。
組換えDNA体によるエシェリヒア・コリ χ1776
の形質転校後、その場所でプローブとしてニック翻訳さ
れた(nick−translated)p3−16
cDN^インサートを用いたGruns tein−H
ognessのハイブリダイゼーション法により約20
00コロニーを選別し、およそ850塩基対を含むプラ
スミドplL 2−50^を含有するコロニー及び形質
転換されたクローン(エシェリヒア・コリ χ 177
6/plL 2−5OA、 AJ11996(FERM
−BP−226))を同定した。plL2−5OAのc
DNAインサートの制限酵素切断図を第1図に示した。
の形質転校後、その場所でプローブとしてニック翻訳さ
れた(nick−translated)p3−16
cDN^インサートを用いたGruns tein−H
ognessのハイブリダイゼーション法により約20
00コロニーを選別し、およそ850塩基対を含むプラ
スミドplL 2−50^を含有するコロニー及び形質
転換されたクローン(エシェリヒア・コリ χ 177
6/plL 2−5OA、 AJ11996(FERM
−BP−226))を同定した。plL2−5OAのc
DNAインサートの制限酵素切断図を第1図に示した。
形質転換されたエシェリヒア・コリ χ1776/pl
L2−5OAからのIL−2ペプタイドをコードしてい
る遺伝子を単離するため、プラスミドDNAを通常法に
従い、菌体からDNAを単離後制限酵素Pst 1に
より切断した。この処理により生成する2つのDNA断
片のうちより小さな断片はIL−2ペプタイドをコード
しているDNA遺伝子であった。 plL2−5OAか
らのPst Iインサートの完全なヌクレオチド配列
はMaxa@and G11bertの方法(Maxa
Ill、^、 W、 etat、、 Bnzym、 6
5+、 499−560.1980)により決定した。
L2−5OAからのIL−2ペプタイドをコードしてい
る遺伝子を単離するため、プラスミドDNAを通常法に
従い、菌体からDNAを単離後制限酵素Pst 1に
より切断した。この処理により生成する2つのDNA断
片のうちより小さな断片はIL−2ペプタイドをコード
しているDNA遺伝子であった。 plL2−5OAか
らのPst Iインサートの完全なヌクレオチド配列
はMaxa@and G11bertの方法(Maxa
Ill、^、 W、 etat、、 Bnzym、 6
5+、 499−560.1980)により決定した。
全構造を第2図(a)に示す。
実施例2
実施例1に記載された方法に従ってジュルカット細胞か
らクローン化された構成的IL−2産生細胞株J−A
1886 (ATCCCRL 8130)は同様にロー
ラー培養ボトルで生育した。生育した細胞は初期細胞密
度lXl06個/dで新鮮な合成培地RITC−55−
9に再Q濁し、培養開始8時間後に、実施例tで詳細に
示したステップに従って3X10”個の細胞から11〜
123分画としてのIL−2,RNA抽出のために使用
された。
らクローン化された構成的IL−2産生細胞株J−A
1886 (ATCCCRL 8130)は同様にロー
ラー培養ボトルで生育した。生育した細胞は初期細胞密
度lXl06個/dで新鮮な合成培地RITC−55−
9に再Q濁し、培養開始8時間後に、実施例tで詳細に
示したステップに従って3X10”個の細胞から11〜
123分画としてのIL−2,RNA抽出のために使用
された。
ds−cDNAは実施例1と同様に合成され、600塩
基対より長いcDNA(2,4μg)が蔗糖密度勾配遠
心法による分画により得られた。次にこのcDNAをタ
ーξナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを
用い、dCMP残基で伸長し、その50^gがdGMP
で伸長したPst I切断pBR322250^gと
アニールされた。
基対より長いcDNA(2,4μg)が蔗糖密度勾配遠
心法による分画により得られた。次にこのcDNAをタ
ーξナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを
用い、dCMP残基で伸長し、その50^gがdGMP
で伸長したPst I切断pBR322250^gと
アニールされた。
生成したハイブリッドプラスミドはエシェリヒア・コリ
χ1776に形質転換され、約4.000クローンの
トランスホーマントが得られた。
χ1776に形質転換され、約4.000クローンの
トランスホーマントが得られた。
GrunsLein−Hognessの方法に従い、プ
ローブとして用いたプラスミド3−15 cDNAと相
補的な3個のクローンが選択された。すなわち、このよ
うにして選択された形質転換されたクローンはヒトIL
−2遺伝子を有するクローンである。
ローブとして用いたプラスミド3−15 cDNAと相
補的な3個のクローンが選択された。すなわち、このよ
うにして選択された形質転換されたクローンはヒトIL
−2遺伝子を有するクローンである。
実施例3
エシェリヒア・コリ細胞でヒトIL−2の合成を指令す
るプラスミドを以下の如き方法で構築した。
るプラスミドを以下の如き方法で構築した。
プラスごドp’r r+、2−22は第4(a)図で図
解されている如く、一連の改変の方法によりpTrS−
3(Nishj T、。
解されている如く、一連の改変の方法によりpTrS−
3(Nishj T、。
Taniguchi T、 et allSEIKAG
AKU 53.967、 (1981)。
AKU 53.967、 (1981)。
同54.676(1982))及びIL−2cDNAを
含むplL2−5OAから構築した。プラスミドpTr
S−3はTrpプロモーターとpBR322のEcg
R1部位とC1a 1部位の間に5hine Dal
garno (以後SDと略号する)の領域の挿入を含
む。
含むplL2−5OAから構築した。プラスミドpTr
S−3はTrpプロモーターとpBR322のEcg
R1部位とC1a 1部位の間に5hine Dal
garno (以後SDと略号する)の領域の挿入を含
む。
本プラスミドはまた第3図で示した如く、単一のSph
r部位と同様にSD配列の下流13bpにATGイ
ニシェーションコードンを含んでいる。
r部位と同様にSD配列の下流13bpにATGイ
ニシェーションコードンを含んでいる。
言及している蛋白に対応するDNA配列がATGコート
ンの丁度下流の部位に挿入されるとそのベクターはこの
蛋白を生産するには非常に効果的である。
ンの丁度下流の部位に挿入されるとそのベクターはこの
蛋白を生産するには非常に効果的である。
このATGコードンはpTrS−3の5B4T消化に引
続きT4 DNAポリメラーゼによる処理によって生成
される。それ故プラスξドpTrS−3 (30μg)
は制限酵素胎 1で、常法により切断され、引続きフェ
ノール、クロロホルム処理、エタノール沈澱法により回
収され両末端が74 DNAポリメラーゼ処理によりフ
ラッシュにされた。
続きT4 DNAポリメラーゼによる処理によって生成
される。それ故プラスξドpTrS−3 (30μg)
は制限酵素胎 1で、常法により切断され、引続きフェ
ノール、クロロホルム処理、エタノール沈澱法により回
収され両末端が74 DNAポリメラーゼ処理によりフ
ラッシュにされた。
次に、同様の方法によりフェノール、クロロホルム処理
及びエタノール沈澱法によりDNA(21,4μgjを
回収した。他方IL 2 cDNAを含むplL2−
5OA 380μgはPst Iにより切断され、I
L−2cDNAインサートはアガロースゲル電気泳動に
より単離された。cDN^インサーt−(11μg)は
)IgiA Tにより切断され、T4 DNAポリメラ
ーゼによって処理され、大きい方の部分のDNAl0μ
gがアガロースゲル電気泳動により単離された。本性に
従って132個のア果ノ酸をコードするcDNA (7
,2μg)が得られ、このDNA断片はプラントエンド
を有していた(第4(a)図)。
及びエタノール沈澱法によりDNA(21,4μgjを
回収した。他方IL 2 cDNAを含むplL2−
5OA 380μgはPst Iにより切断され、I
L−2cDNAインサートはアガロースゲル電気泳動に
より単離された。cDN^インサーt−(11μg)は
)IgiA Tにより切断され、T4 DNAポリメラ
ーゼによって処理され、大きい方の部分のDNAl0μ
gがアガロースゲル電気泳動により単離された。本性に
従って132個のア果ノ酸をコードするcDNA (7
,2μg)が得られ、このDNA断片はプラントエンド
を有していた(第4(a)図)。
次に、このようにして得られたcDNA断片をATG配
列の丁度下流で、前もって4iにより消化されたT4
DNAポリメラーゼにより処理されたpTrS−3ベク
ターへ連結した。このように連結したプラスミドはそれ
から、常法に従いエシェリヒア・コリHB 101へ形
質転換された。この連結は次のようにして行った。 I
L −2cDNA(0,4u g )の前述の大きい方
の断片およびpTrS−3ベクターDNA 0.2 u
gを6.6 mM MgC1z、I n+M ATP
およびl OmM DTTを含むpH7,5の66m1
1トリス−塩酸中でT4 DN^リガーゼ0.8単位と
共に混合し、混合物を4°C2−晩反応させた。アンピ
シリンを含むL培地寒天プレート上に出現するトランス
ホーマントの中で、132個のア果ノ酸をコードしてい
るIL−2cDNA部分を含むプラスミドを持つコロニ
ーをその場テコロニーハイブリダイゼーションアッセイ
法により選択した。こうして選択したコロニーを再び培
#(10IIIjlりシ、リゾチーム処理および凍結。
列の丁度下流で、前もって4iにより消化されたT4
DNAポリメラーゼにより処理されたpTrS−3ベク
ターへ連結した。このように連結したプラスミドはそれ
から、常法に従いエシェリヒア・コリHB 101へ形
質転換された。この連結は次のようにして行った。 I
L −2cDNA(0,4u g )の前述の大きい方
の断片およびpTrS−3ベクターDNA 0.2 u
gを6.6 mM MgC1z、I n+M ATP
およびl OmM DTTを含むpH7,5の66m1
1トリス−塩酸中でT4 DN^リガーゼ0.8単位と
共に混合し、混合物を4°C2−晩反応させた。アンピ
シリンを含むL培地寒天プレート上に出現するトランス
ホーマントの中で、132個のア果ノ酸をコードしてい
るIL−2cDNA部分を含むプラスミドを持つコロニ
ーをその場テコロニーハイブリダイゼーションアッセイ
法により選択した。こうして選択したコロニーを再び培
#(10IIIjlりシ、リゾチーム処理および凍結。
融解による処理によりプラスミドDNAを調製した。
このプラスミドDNAをハ±IとXba Iで切断し
、その結果の生成物をアガロースゲル電気泳動により分
析し、cDNAがpTrs−3のATG配列の後に正し
い方向で凍結しているpTIL−2−22を同定した。
、その結果の生成物をアガロースゲル電気泳動により分
析し、cDNAがpTrs−3のATG配列の後に正し
い方向で凍結しているpTIL−2−22を同定した。
pTIL−2−22を含むエシェリヒア・コリJI81
01を微生物の増殖のために知られている通常法の下に
培養した。細胞は25μg/lanストレプトマイシン
および25μg/lalのアンピシリンを含むχ培地(
2,5%バクトドリブトン、1%酵母エキス、0.1%
グルコース、 20++M Mg5Oa、 50m
M)リス−塩酸、 pH7,5) 10 @l中で3
7°Cで一晩生育させた。ついで培養M濁液1 mA!
を同じχ培地(1001ml)へ接種し、37°Cで培
養した。
01を微生物の増殖のために知られている通常法の下に
培養した。細胞は25μg/lanストレプトマイシン
および25μg/lalのアンピシリンを含むχ培地(
2,5%バクトドリブトン、1%酵母エキス、0.1%
グルコース、 20++M Mg5Oa、 50m
M)リス−塩酸、 pH7,5) 10 @l中で3
7°Cで一晩生育させた。ついで培養M濁液1 mA!
を同じχ培地(1001ml)へ接種し、37°Cで培
養した。
650rrlの0.D、がおよそ1.5−2.0に達し
た時点で3−インドールアクリル酸(IAA)を加えた
。
た時点で3−インドールアクリル酸(IAA)を加えた
。
インデューサーの添加3時間後に、細胞を集め、20+
Mトリス−塩酸(flH7,5、30mM NaCj!
を含む)で洗浄し、同じ緩衝液B ran中に再び懸濁
した。
Mトリス−塩酸(flH7,5、30mM NaCj!
を含む)で洗浄し、同じ緩衝液B ran中に再び懸濁
した。
Trpプロモーターの効果的な機能発現のために1、I
AAの如きインデューサーを最終濃度50μg/mlに
なるように添加した。かくして細菌細胞中に産生される
蛋白をソニック処理(0”C,2分間)またはりゾチー
ム(8μg)消化(0”C,20分)に引き続き凍結融
解を3回行う事により抽出した。
AAの如きインデューサーを最終濃度50μg/mlに
なるように添加した。かくして細菌細胞中に産生される
蛋白をソニック処理(0”C,2分間)またはりゾチー
ム(8μg)消化(0”C,20分)に引き続き凍結融
解を3回行う事により抽出した。
この方法により、−i的にIL−2は細胞から抽出され
た。抽出されたIL−2活性はio、oooから120
.000単位/mlの範囲であった。
た。抽出されたIL−2活性はio、oooから120
.000単位/mlの範囲であった。
’ pTIL2−22を含むエシェリヒア・コリ IB
101(へJ12009)はFl!RM−BP245
として寄託されている。
101(へJ12009)はFl!RM−BP245
として寄託されている。
実施例4
IL−2cDNAを有するプラスミドpTulL2−2
2はpTuBIP−5(Taniguchi、 T、
et al、、 Seikagaku+ 53+966
、1981)および実施例3に示したpTIL2−22
から第6図に図解した方法により構築された。プラスミ
ドpTuBIP−5はpBR322中にtufBのプロ
モーター配列が挿入されている。このプラスミドはまた
単一のC1a 1部位を含んでおり、これは第6図に
示した如<SD配列の2bp下流に位置している。pT
rS−3もまたSD配列とATGイニシェーシゴンコー
ドンの間にC1a 1部位を含んでおり、このC1a
1部位は実施例3に記載した如< pTrS−3お
よびIL−2cDN^を用いる事による発現プラスミド
構築中に破壊されないことから、Trpプロモーターを
tufBプロモーターに置き換える事はきわめて簡単で
あり、その結果IL 2 cDNAはtufBプロモ
ーターの制御下で発現される。
2はpTuBIP−5(Taniguchi、 T、
et al、、 Seikagaku+ 53+966
、1981)および実施例3に示したpTIL2−22
から第6図に図解した方法により構築された。プラスミ
ドpTuBIP−5はpBR322中にtufBのプロ
モーター配列が挿入されている。このプラスミドはまた
単一のC1a 1部位を含んでおり、これは第6図に
示した如<SD配列の2bp下流に位置している。pT
rS−3もまたSD配列とATGイニシェーシゴンコー
ドンの間にC1a 1部位を含んでおり、このC1a
1部位は実施例3に記載した如< pTrS−3お
よびIL−2cDN^を用いる事による発現プラスミド
構築中に破壊されないことから、Trpプロモーターを
tufBプロモーターに置き換える事はきわめて簡単で
あり、その結果IL 2 cDNAはtufBプロモ
ーターの制御下で発現される。
それ故、プラスミドpTrL2−22 (30μg)は
制限酵素C1a IとPvu IIにより通常の方法
で切断された。IL−2cDNAを含む断片(約2.2
kb)はアガロースゲル電気泳動により単離精製され
、3μgのDNAが回収された。他方、 pTuBIP
5ベクタ一20μgが同様にC1a Iと±■に
より切断され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大きい方
の断片(約3.4 kb)がアガロースゲル電気泳動に
より単離精製され、DNA 3.5μgが回収された。
制限酵素C1a IとPvu IIにより通常の方法
で切断された。IL−2cDNAを含む断片(約2.2
kb)はアガロースゲル電気泳動により単離精製され
、3μgのDNAが回収された。他方、 pTuBIP
5ベクタ一20μgが同様にC1a Iと±■に
より切断され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大きい方
の断片(約3.4 kb)がアガロースゲル電気泳動に
より単離精製され、DNA 3.5μgが回収された。
次にこのようにして得られた2個の断片は1つはtuf
Bプロモーターを含み(約3.4kb)、他方はIL−
2cDNAを含んでおり(約2.2 kb)以下に示す
如く連結した。
Bプロモーターを含み(約3.4kb)、他方はIL−
2cDNAを含んでおり(約2.2 kb)以下に示す
如く連結した。
IL −2cDNA(1,2μg )を含む断片および
tufBプロモーターを含む断片0.3μgを6.6m
MMgCj2z1mMATPおよび10mM DTTを
含むpH7,5の66mMトリス−塩酸中で、T4 D
NAリガーゼ0.8単位と混合し、4°Cで一晩反応し
た。次にこのようにして連結したプラスもドは常法に従
いエシェリヒア・コリHB lotへ形質転換された。
tufBプロモーターを含む断片0.3μgを6.6m
MMgCj2z1mMATPおよび10mM DTTを
含むpH7,5の66mMトリス−塩酸中で、T4 D
NAリガーゼ0.8単位と混合し、4°Cで一晩反応し
た。次にこのようにして連結したプラスもドは常法に従
いエシェリヒア・コリHB lotへ形質転換された。
アンピシリンを含むL培地寒天プレート上に出現するト
ランスホーマントの中で第6図のpTuIL2−22の
如(IL −2cDNA部分を含む組み換え体DNAを
持つ8個のコロニーが選択され、プラスミドDNAは実
施例3に記載された如く調製された。
ランスホーマントの中で第6図のpTuIL2−22の
如(IL −2cDNA部分を含む組み換え体DNAを
持つ8個のコロニーが選択され、プラスミドDNAは実
施例3に記載された如く調製された。
pTulL2−22を含むエシェリヒア・コリHB 1
01を37°CでL培地(100mf)中で培養した。
01を37°CでL培地(100mf)中で培養した。
650muの0.D、がおよそ0.5−1.0に達した
時、菌体を集め、30mM NaC/!を含む20mM
)リス−塩酸(pH7,5’)で洗浄し、同じ緩衝液2
ml中に再び懸濁した。このようにして産生した蛋白
は実施例3と同様に抽出された。抽出液中のIL−2活
性は6,000から56,000単位/arlの範囲で
あった。
時、菌体を集め、30mM NaC/!を含む20mM
)リス−塩酸(pH7,5’)で洗浄し、同じ緩衝液2
ml中に再び懸濁した。このようにして産生した蛋白
は実施例3と同様に抽出された。抽出液中のIL−2活
性は6,000から56,000単位/arlの範囲で
あった。
pTulL2−22を含むエシェリヒア・コリHB 1
01(AJ12010)はFERM−BP 246とし
て寄託されている。
01(AJ12010)はFERM−BP 246とし
て寄託されている。
実施例5
rL−2cDNAを有するプラスξドpGIL2−22
はpci。
はpci。
101(Roberts、 T、 M、 and La
ucer G、 D、、 Math Enzym。
ucer G、 D、、 Math Enzym。
68+ 473−483.(1979)、Ga1l L
auer、 et al、 J、 Mol。
auer、 et al、 J、 Mol。
Appl、 Genet、、 L、 Nα2.139〜
147(1981)、 T。
147(1981)、 T。
Taniguchj、 et al、 Proc、 N
aLl、 Acad、 Sci、 USA+77+ N
O,9+ 5230〜5233(1980)、Egon
A+++ann、 et al。
aLl、 Acad、 Sci、 USA+77+ N
O,9+ 5230〜5233(1980)、Egon
A+++ann、 et al。
Gene、 25.16.7〜17B(1983))と
実施例3に示されたpTrL2−22とから構築された
。
実施例3に示されたpTrL2−22とから構築された
。
すなわち、lacプロモーターを含むプラスミドDNA
101(20p g )が制限酵素Pvu Ifで常
法により切断され、引続きフェノール、クロロホルム処
理およびエタノール沈澱法により17μgのDNAが回
収された。他方、pTIL2−22 (75μg)の方
はC1a IおよびSal iで切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりIL−2cDNAが含むDNA断
片2.2μgを回収した。この断片はDNAポリメラー
ゼ■(フレノウ断片)で処理する事によりフラッシュに
された0次にこのようにして得られた2個の断片(0,
25μgおよび0,66μg)を実施例4と同じ方法で
T4 DNAリガーゼ1.0単位でもって連結した。か
くしてこの連結したプラスミドは常法に従いエシェリヒ
ア・コリHB 101に形質転換された。トランスホー
マントの中で、IL−2cDNAを含むCJ、11−9
al I断片の挿入を有するl・ランスホーマント3
2pラベルしたIL−2cDNAをプローブとして選択
した。次にこれ等のトランスホーマントを、アンピシリ
ン25μg/r1.を含む10mj2のχ培地中で培養
し、実施例3で記載した方法によりプラスミドDNAを
調製した。かくしてlacプロモーターの丁度下流にI
L−2cDNAの開始配列ATGを有するプラスミドD
NAはハエ■および旦υ丁での切断部位を検定する事に
より得られた。このようにして得られたpGIL2−2
2を含むエシェリヒア・コリHB 101は25μg/
mlアンピシリンおよび25μg7mlストレプトマイ
シンを含有するL培地100m1に接種し培養した。6
50mμの0.0.が約0.5に達した時イソプロピル
ーβ−D−チオガラクトピラノサイド(IPTG)を1
mHの濃度で加え、1時間後に菌体を集め、実施例4に
記載した方法に従って菌体抽出液を調製した。抽出液の
Iシー2活性は6.000から80.OQO単位/me
の範囲であった。
101(20p g )が制限酵素Pvu Ifで常
法により切断され、引続きフェノール、クロロホルム処
理およびエタノール沈澱法により17μgのDNAが回
収された。他方、pTIL2−22 (75μg)の方
はC1a IおよびSal iで切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりIL−2cDNAが含むDNA断
片2.2μgを回収した。この断片はDNAポリメラー
ゼ■(フレノウ断片)で処理する事によりフラッシュに
された0次にこのようにして得られた2個の断片(0,
25μgおよび0,66μg)を実施例4と同じ方法で
T4 DNAリガーゼ1.0単位でもって連結した。か
くしてこの連結したプラスミドは常法に従いエシェリヒ
ア・コリHB 101に形質転換された。トランスホー
マントの中で、IL−2cDNAを含むCJ、11−9
al I断片の挿入を有するl・ランスホーマント3
2pラベルしたIL−2cDNAをプローブとして選択
した。次にこれ等のトランスホーマントを、アンピシリ
ン25μg/r1.を含む10mj2のχ培地中で培養
し、実施例3で記載した方法によりプラスミドDNAを
調製した。かくしてlacプロモーターの丁度下流にI
L−2cDNAの開始配列ATGを有するプラスミドD
NAはハエ■および旦υ丁での切断部位を検定する事に
より得られた。このようにして得られたpGIL2−2
2を含むエシェリヒア・コリHB 101は25μg/
mlアンピシリンおよび25μg7mlストレプトマイ
シンを含有するL培地100m1に接種し培養した。6
50mμの0.0.が約0.5に達した時イソプロピル
ーβ−D−チオガラクトピラノサイド(IPTG)を1
mHの濃度で加え、1時間後に菌体を集め、実施例4に
記載した方法に従って菌体抽出液を調製した。抽出液の
Iシー2活性は6.000から80.OQO単位/me
の範囲であった。
pGTL2−22を含むエシェリヒア・コリ IIB
101(AJ12011)はFIERM−BP 247
として寄託されている。
101(AJ12011)はFIERM−BP 247
として寄託されている。
実施例6
プラスミドpTrs−3(10μg)を先ず制限酵素l
a1.Iで切断し1a11部位をDNAポリメラーゼ(
フレノウ断片)あるいはT4 DNAポリメラーゼ処理
によりフランシュ(flush)にした。
a1.Iで切断し1a11部位をDNAポリメラーゼ(
フレノウ断片)あるいはT4 DNAポリメラーゼ処理
によりフランシュ(flush)にした。
C1a Iで切断後、Trpプロモーター領域を有す
る大きい方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳
動により単離精製し、DNA 3μgを回収した。
る大きい方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳
動により単離精製し、DNA 3μgを回収した。
他方、pTL2−50^のハエ1切断により得られるc
DNAインサートllugがtlgiAIで切断され、
T4 DNAポリメラーゼ処理され、大きい方の断片が
アガロースゲル電気泳動により単離、精製された。この
ようにしてIL−2の132個のアミノ酸をコードする
cDNA断片が7.2μg得られた。次に、trPプロ
モーター(上記)を含む断片0.45μg。
DNAインサートllugがtlgiAIで切断され、
T4 DNAポリメラーゼ処理され、大きい方の断片が
アガロースゲル電気泳動により単離、精製された。この
ようにしてIL−2の132個のアミノ酸をコードする
cDNA断片が7.2μg得られた。次に、trPプロ
モーター(上記)を含む断片0.45μg。
IL −2cDNAを含むlIgiAI−Pst (断
片0.5 tt gおよび台底オリゴヌクレオチド(5
’ )CGATAAGCTATGGCA(3′)と(3
’)TATTCGATACCGT(5’) (各々20
pmole)は両方とも5゛末端でリン酸化されてい
るが、これ等を実施例3に記載されている方法と同じ方
法でT4DNAリガーゼ1単位で連結した(第4図(b
))。このように連結されたプラスミドはエシェリヒア
・コリHB 101に形質転換された。出現したトラン
スホーマントの中で、目標とするトランスホーマントは
次のようにして選択した。まず最初に、IL2 cDN
Aおよび台底オリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイ
ズ可能なトランスホーマントがコロニーハイブリダイゼ
ーション法により選択された0次に、ATGGCA配列
の丁度下流に第2図(a)の111から113の位置の
CTT配列から始まるDNA断片(CCTACT・・・
・・・・・・)が挿入されているプラスミドDNAを持
ったトランスホーマントをPst r 、Xba 1
切断個所を検定することにより選択した。
片0.5 tt gおよび台底オリゴヌクレオチド(5
’ )CGATAAGCTATGGCA(3′)と(3
’)TATTCGATACCGT(5’) (各々20
pmole)は両方とも5゛末端でリン酸化されてい
るが、これ等を実施例3に記載されている方法と同じ方
法でT4DNAリガーゼ1単位で連結した(第4図(b
))。このように連結されたプラスミドはエシェリヒア
・コリHB 101に形質転換された。出現したトラン
スホーマントの中で、目標とするトランスホーマントは
次のようにして選択した。まず最初に、IL2 cDN
Aおよび台底オリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイ
ズ可能なトランスホーマントがコロニーハイブリダイゼ
ーション法により選択された0次に、ATGGCA配列
の丁度下流に第2図(a)の111から113の位置の
CTT配列から始まるDNA断片(CCTACT・・・
・・・・・・)が挿入されているプラスミドDNAを持
ったトランスホーマントをPst r 、Xba 1
切断個所を検定することにより選択した。
pTIL2−21aまた。はpTIL2−21bを含む
上記のトランスホーマントを実施例3に示す方法により
L培地中で培養し、そして実施例3に示す方法により分
析した時トランスホーマントの菌体抽出物には高いIL
−2活性が認められた。 pTIL2−21aを有する
エシェリヒア・コリJI8101(AJ 12013)
およびpTIL2−21bを有するエシェリヒア・コリ
(AJ 12014)を有するエシェリヒア・コリHB
101はそれぞれFERM−BP 248.FERM
−BP 249として寄託されている。
上記のトランスホーマントを実施例3に示す方法により
L培地中で培養し、そして実施例3に示す方法により分
析した時トランスホーマントの菌体抽出物には高いIL
−2活性が認められた。 pTIL2−21aを有する
エシェリヒア・コリJI8101(AJ 12013)
およびpTIL2−21bを有するエシェリヒア・コリ
(AJ 12014)を有するエシェリヒア・コリHB
101はそれぞれFERM−BP 248.FERM
−BP 249として寄託されている。
上記の実施例で用いられた宿主、エシェリヒア・コリ
z 1776およびHB 101(llloyer H
,W、 et al、。
z 1776およびHB 101(llloyer H
,W、 et al、。
J、 Mo1. Biol、 iL、 459.(19
69))は公知であり、容易に入手可能である。更につ
け加えれば、トランスホーマント中の組換えDNA体を
遊離させるためにL培地で37℃でトランスホーマント
を培養し、テトラサイクリンおよびアンピシリンに感受
性となった菌体を分離すれば寄託したトランスホーマン
トから宿主は容易に得られる。
69))は公知であり、容易に入手可能である。更につ
け加えれば、トランスホーマント中の組換えDNA体を
遊離させるためにL培地で37℃でトランスホーマント
を培養し、テトラサイクリンおよびアンピシリンに感受
性となった菌体を分離すれば寄託したトランスホーマン
トから宿主は容易に得られる。
プラスミドベクターρBR322(例えばベセスダリサ
ーチラボラトリーから購入可能) 、 pCE−1,p
Trs−3およびpGL 101は公知であり容易に人
手可能である。更に、常法によりトランスホーマント中
の組換え体プラスミドを分離することによってさらにそ
れぞれの実施例での説明から当然に明らかな如くプラス
ミドベクターを分離することによって寄託されたトラン
スホーマントからプラスミドベクターを得る事が出来る
。pTrS−3およびpTuBIP−5はそれぞれエシ
ェリヒア・コリFERM、、P6735(BP 32B
)およびエシェリヒア・コリATCC31879として
寄託されている。
ーチラボラトリーから購入可能) 、 pCE−1,p
Trs−3およびpGL 101は公知であり容易に人
手可能である。更に、常法によりトランスホーマント中
の組換え体プラスミドを分離することによってさらにそ
れぞれの実施例での説明から当然に明らかな如くプラス
ミドベクターを分離することによって寄託されたトラン
スホーマントからプラスミドベクターを得る事が出来る
。pTrS−3およびpTuBIP−5はそれぞれエシ
ェリヒア・コリFERM、、P6735(BP 32B
)およびエシェリヒア・コリATCC31879として
寄託されている。
第1図はIL−2活性を有するポリペプチドをコードし
たクローン化遺伝子の制限酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断マツプを示し、第2図(a)はクローン化遺伝子
の塩基配列を示し、第2図(b)はIL−2活性を有す
るポリペプチドのアミノ酸配列1.IIおよび■を示す
。 第3図はプラスミドベクターpTrS−3を示す。 第4図(a)1第4図(b)および第4図(c)はベク
ターとしてpTrS−3を使用している組換えDNA5
(pTIL2−22. p↑IL2−21. pTIL
2−14およびpTIL2−15)の構成を示すフロー
チャートである。第5図はベクターとしてpK7218
を使用している組換えDNA(pKIL2−21)の構
成を示すフローチャートである。第6図はベクターとし
てpTUBIP−5を使用している組換えDNA (p
TulL2−22)の構成を示すフローチャートである
。 図中、“A″、“G”、“Cmおよび“T”はデオキシ
アデニル酸、デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸
およびチミジル酸をそれぞれ表わす。
たクローン化遺伝子の制限酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断マツプを示し、第2図(a)はクローン化遺伝子
の塩基配列を示し、第2図(b)はIL−2活性を有す
るポリペプチドのアミノ酸配列1.IIおよび■を示す
。 第3図はプラスミドベクターpTrS−3を示す。 第4図(a)1第4図(b)および第4図(c)はベク
ターとしてpTrS−3を使用している組換えDNA5
(pTIL2−22. p↑IL2−21. pTIL
2−14およびpTIL2−15)の構成を示すフロー
チャートである。第5図はベクターとしてpK7218
を使用している組換えDNA(pKIL2−21)の構
成を示すフローチャートである。第6図はベクターとし
てpTUBIP−5を使用している組換えDNA (p
TulL2−22)の構成を示すフローチャートである
。 図中、“A″、“G”、“Cmおよび“T”はデオキシ
アデニル酸、デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸
およびチミジル酸をそれぞれ表わす。
Claims (1)
- 原核細胞に適合しうるプラスミドベクターのDNA鎖の
上流より、それぞれ原核細胞内で機能するプロモーター
、リボゾーム結合部位、翻訳開始コドンおよびヒトイン
ターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺
伝子がこの順序で配列された組換えDNA体により形質
転換された原核生物の細胞を培地中で培養することを特
徴とする糖類を伴わず、ヒト由来の他の蛋白質を含有し
ないヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドの
製造法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB83101035.0 | 1983-02-03 | ||
EP83101035A EP0091539B2 (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58041358A Division JPS59144719A (ja) | 1983-02-03 | 1983-03-12 | ヒトインタ―ロイキン2活性を有するポリペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0335795A true JPH0335795A (ja) | 1991-02-15 |
JPH0832238B2 JPH0832238B2 (ja) | 1996-03-29 |
Family
ID=8190276
Family Applications (7)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58041358A Granted JPS59144719A (ja) | 1983-02-03 | 1983-03-12 | ヒトインタ―ロイキン2活性を有するポリペプチド |
JP59120492A Pending JPS6034915A (ja) | 1983-02-03 | 1984-06-12 | ポリペプチド |
JP1109058A Expired - Lifetime JPH0832238B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドの製造法 |
JP1109061A Expired - Lifetime JPH0659220B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
JP1109062A Expired - Lifetime JPH0832239B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えdna体および該組換えdna体により形質転換された原核生物細胞 |
JP1109059A Expired - Lifetime JPH0698000B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
JP1109060A Expired - Lifetime JPH0659219B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコートする遺伝子 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58041358A Granted JPS59144719A (ja) | 1983-02-03 | 1983-03-12 | ヒトインタ―ロイキン2活性を有するポリペプチド |
JP59120492A Pending JPS6034915A (ja) | 1983-02-03 | 1984-06-12 | ポリペプチド |
Family Applications After (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1109061A Expired - Lifetime JPH0659220B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
JP1109062A Expired - Lifetime JPH0832239B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えdna体および該組換えdna体により形質転換された原核生物細胞 |
JP1109059A Expired - Lifetime JPH0698000B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
JP1109060A Expired - Lifetime JPH0659219B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコートする遺伝子 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (7) | JPS59144719A (ja) |
SU (1) | SU1479005A3 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101041986B1 (ko) * | 2008-03-06 | 2011-06-16 | (주)한국비엠아이 | 인간 인터루킨-2의 대량 생산을 위한 신규한 균주 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU579089B2 (en) * | 1983-02-08 | 1988-11-17 | Biogen, Inc. | Human interleukin-2-like polypeptides |
GB8303383D0 (en) * | 1983-02-08 | 1983-03-16 | Biogen Nv | Sequences recombinant dna molecules |
NZ210634A (en) * | 1983-12-23 | 1989-05-29 | Hoffmann La Roche | Purification of recombinant human interleukin - 2; pharmaceutical compositions |
WO1986006405A1 (en) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel transformant and its use |
WO1986006410A1 (en) * | 1985-04-30 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Process for increasing yield of interleukin-2 |
JPS62185098A (ja) * | 1986-02-10 | 1987-08-13 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | インタ−ロイキン−2活性を有するポリペプチド |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6419879A (en) * | 1987-07-15 | 1989-01-23 | Asahi Optical Co Ltd | Tv viewer |
-
1983
- 1983-03-12 JP JP58041358A patent/JPS59144719A/ja active Granted
- 1983-12-14 SU SU833679351A patent/SU1479005A3/ru active
-
1984
- 1984-06-12 JP JP59120492A patent/JPS6034915A/ja active Pending
-
1989
- 1989-05-01 JP JP1109058A patent/JPH0832238B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-01 JP JP1109061A patent/JPH0659220B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-01 JP JP1109062A patent/JPH0832239B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-01 JP JP1109059A patent/JPH0698000B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-01 JP JP1109060A patent/JPH0659219B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101041986B1 (ko) * | 2008-03-06 | 2011-06-16 | (주)한국비엠아이 | 인간 인터루킨-2의 대량 생산을 위한 신규한 균주 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6034915A (ja) | 1985-02-22 |
JPH0698000B2 (ja) | 1994-12-07 |
JPS59144719A (ja) | 1984-08-18 |
JPH02195888A (ja) | 1990-08-02 |
JPH0659219B2 (ja) | 1994-08-10 |
JPH02200189A (ja) | 1990-08-08 |
SU1479005A3 (ru) | 1989-05-07 |
JPH02195887A (ja) | 1990-08-02 |
JPH0832239B2 (ja) | 1996-03-29 |
JPH02195886A (ja) | 1990-08-02 |
JPH0832238B2 (ja) | 1996-03-29 |
JPH0142279B2 (ja) | 1989-09-11 |
JPH0659220B2 (ja) | 1994-08-10 |
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