JPH0832239B2 - ヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えdna体および該組換えdna体により形質転換された原核生物細胞 - Google Patents
ヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えdna体および該組換えdna体により形質転換された原核生物細胞Info
- Publication number
- JPH0832239B2 JPH0832239B2 JP1109062A JP10906289A JPH0832239B2 JP H0832239 B2 JPH0832239 B2 JP H0832239B2 JP 1109062 A JP1109062 A JP 1109062A JP 10906289 A JP10906289 A JP 10906289A JP H0832239 B2 JPH0832239 B2 JP H0832239B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- amino acid
- dna
- cells
- recombinant dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 81
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 80
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 80
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 63
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 54
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 49
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 title claims description 22
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 title claims description 11
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 title description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 53
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 30
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 18
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 26
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 162
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 159
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 133
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 100
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 87
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 69
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 description 57
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 56
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 15
- 239000002585 base Substances 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 13
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 11
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 10
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 10
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 9
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 9
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101150056072 TUFB gene Proteins 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 101150099542 tuf gene Proteins 0.000 description 8
- 101150071165 tuf1 gene Proteins 0.000 description 8
- 101150010742 tuf2 gene Proteins 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 7
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 6
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 6
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 125000000086 dCMP group Chemical group 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 4
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PLVPPLCLBIEYEA-AATRIKPKSA-N (E)-3-(indol-3-yl)acrylic acid Chemical compound C1=CC=C2C(/C=C/C(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-AATRIKPKSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 101900234631 Escherichia coli DNA polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 108010015133 Galactose oxidase Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N deoxyguanylic acid Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N Diethylenetriamine Chemical compound NCCNCCN RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100232904 Homo sapiens IL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000981253 Mus musculus GPI-linked NAD(P)(+)-arginine ADP-ribosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229940122426 Nuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 241001582367 Polia Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000131487 Polygala subtilis Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical group N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004791 biological behavior Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 235000019788 craving Nutrition 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 125000003791 dGMP group Chemical group 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N deoxyadenylic acid Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000003125 jurkat cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- -1 macaloid Chemical compound 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 1
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 108010075210 streptolysin O Proteins 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N vanadium atom Chemical compound [V] LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003752 zinc compounds Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターロイキン2活性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えDNA体、
および該組換えDNA体により形質転換された原核生物細
胞に関する。
ペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えDNA体、
および該組換えDNA体により形質転換された原核生物細
胞に関する。
インターロイキン2(以下、「IL−2」と略記す
る。)は、以前はT細胞増殖因子と呼ばれており、レク
チンあるいは抗原で活性化されたT細胞より産生される
可溶性たんぱく(一般には「リンホカイン」として知ら
れている)である(Morganら,Science,193,1007〜1008
(1976),Gillisら,J.Immunol.,120,2027〜2033(197
8))。IL−2はリンパ球の反応性を調節でき、抗原特
異的はエフエクターT−リンパ球のin vitroにおける長
期培養を可能ならしめることができる(Gillisら,Natur
e,268,154〜156(1977))。またIL−2は、胸線細胞の
***の促進(Chenら,Cell Immunol.,22,221〜224(197
7),Shawら,J.Immunol.,120,1967〜1973(1978)),ヌ
ードマウスの卑細胞の培養系での細胞障害性Tリンパ球
活性(Wagnerら,Nature,284,278〜280,(1980))や抗
−SRBCプラーク形成細胞反応の誘導(Gillisら,J.Exp.M
ed.149,1960〜1968(1979))等の関連する他の生物活
性をもつことが明らかにされている。従って、このリン
パ球調節因子は液体免疫や細胞性免疫反応を増強したり
免疫不全状態を正常な液体や細胞性免疫の状態に回復さ
せるのに有用である。これらの明らかにされたIL−2の
免疫学的活性は、IL−2が悪性腫瘍,細菌またはウイル
ス感染,免疫不全,自己免疫疾患等(Papermasterら,Ad
v.Immunopharm.,507,(1980))に対する医科免疫療法
に有用であることを示している。インターフェロンと同
様に、IL−2はナチュラルキラー細胞活性を増強するこ
とが示されてきたが、これは悪性腫瘍治療への有用性を
強く示唆している。更に、IL−2は単クローン性の活性
化T細胞の保持を可能とし、この事は、T細胞分化の分
子機構、T細胞機能の分化機構,T細胞の抗原リセプター
の機構を研究する上で重要な役割を担っていることを示
している。また、IL−2は単クローン性T細胞を長期培
養することにより、他の種々の分野で有用な様々なT細
胞由来のリンホカインを製造するためにも使用できる。
更に、IL−2の産生とリンパ球のIL−2に対する応答性
は、免疫学的機能の重要なパラメーターであり、免疫異
常の臨床診断に有用である。
る。)は、以前はT細胞増殖因子と呼ばれており、レク
チンあるいは抗原で活性化されたT細胞より産生される
可溶性たんぱく(一般には「リンホカイン」として知ら
れている)である(Morganら,Science,193,1007〜1008
(1976),Gillisら,J.Immunol.,120,2027〜2033(197
8))。IL−2はリンパ球の反応性を調節でき、抗原特
異的はエフエクターT−リンパ球のin vitroにおける長
期培養を可能ならしめることができる(Gillisら,Natur
e,268,154〜156(1977))。またIL−2は、胸線細胞の
***の促進(Chenら,Cell Immunol.,22,221〜224(197
7),Shawら,J.Immunol.,120,1967〜1973(1978)),ヌ
ードマウスの卑細胞の培養系での細胞障害性Tリンパ球
活性(Wagnerら,Nature,284,278〜280,(1980))や抗
−SRBCプラーク形成細胞反応の誘導(Gillisら,J.Exp.M
ed.149,1960〜1968(1979))等の関連する他の生物活
性をもつことが明らかにされている。従って、このリン
パ球調節因子は液体免疫や細胞性免疫反応を増強したり
免疫不全状態を正常な液体や細胞性免疫の状態に回復さ
せるのに有用である。これらの明らかにされたIL−2の
免疫学的活性は、IL−2が悪性腫瘍,細菌またはウイル
ス感染,免疫不全,自己免疫疾患等(Papermasterら,Ad
v.Immunopharm.,507,(1980))に対する医科免疫療法
に有用であることを示している。インターフェロンと同
様に、IL−2はナチュラルキラー細胞活性を増強するこ
とが示されてきたが、これは悪性腫瘍治療への有用性を
強く示唆している。更に、IL−2は単クローン性の活性
化T細胞の保持を可能とし、この事は、T細胞分化の分
子機構、T細胞機能の分化機構,T細胞の抗原リセプター
の機構を研究する上で重要な役割を担っていることを示
している。また、IL−2は単クローン性T細胞を長期培
養することにより、他の種々の分野で有用な様々なT細
胞由来のリンホカインを製造するためにも使用できる。
更に、IL−2の産生とリンパ球のIL−2に対する応答性
は、免疫学的機能の重要なパラメーターであり、免疫異
常の臨床診断に有用である。
IL−2は従来の技術では、マイトジェンでマウス,ラ
ットあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製造
されてきた(Gillisら,Nature,268,154〜156,(197
7)),Farrarら,J.Immunol.,121,1353〜1360,(1978),
Gillisら,J.Immunol.,120,2027〜2033,(1978))。ヒ
トの末梢血リンパ球をマイトジェンで刺激することによ
り(Gillisら,J.Immunol.,124,1954〜1962,(198
0))、GillisらはTリンホーマ細胞株からのマウスIL
−2の製造(Gillisら,J.Immunol.,125,2570〜2578(19
80))とヒト白血病細胞株からのヒトIL−2の製造(Gi
llisら,J.Exp.Med.,152,1709〜1719,(1980))を報告
している。
ットあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製造
されてきた(Gillisら,Nature,268,154〜156,(197
7)),Farrarら,J.Immunol.,121,1353〜1360,(1978),
Gillisら,J.Immunol.,120,2027〜2033,(1978))。ヒ
トの末梢血リンパ球をマイトジェンで刺激することによ
り(Gillisら,J.Immunol.,124,1954〜1962,(198
0))、GillisらはTリンホーマ細胞株からのマウスIL
−2の製造(Gillisら,J.Immunol.,125,2570〜2578(19
80))とヒト白血病細胞株からのヒトIL−2の製造(Gi
llisら,J.Exp.Med.,152,1709〜1719,(1980))を報告
している。
Gillisらによる上記の技法は、細胞培養法を用いてマ
イトジェンで活性化されたT白血病細胞株からヒトIL−
2を製造する方法に関するものである。しかしながら、
この方法では低濃度のヒトIL−2しか産生されないのが
難点で、大量の培養液から微量のIL−2を得るために、
複雑な精製工程を必要とする。更に、ヒトT白血病細胞
株は少量のヒトIL−2に酷似した他の生理活性物質も産
生するので、IL−2をこれらの他の免疫活性を有する分
子と分離、あるいは時として共存する細胞毒物質(toxi
c lectin)と分離するにはかなりの困難が伴う。
イトジェンで活性化されたT白血病細胞株からヒトIL−
2を製造する方法に関するものである。しかしながら、
この方法では低濃度のヒトIL−2しか産生されないのが
難点で、大量の培養液から微量のIL−2を得るために、
複雑な精製工程を必要とする。更に、ヒトT白血病細胞
株は少量のヒトIL−2に酷似した他の生理活性物質も産
生するので、IL−2をこれらの他の免疫活性を有する分
子と分離、あるいは時として共存する細胞毒物質(toxi
c lectin)と分離するにはかなりの困難が伴う。
IL−2を製造する他の方法として、インターフェロン
のような他の生理活性ヒト由来たんぱくを製造するため
に用いられた組換えDNA(デオキシリボ核酸の略)法(G
rayら,Nature 295,503〜508,(1981),Nagataら,Nature
284,316〜320(1980),Taniguchiら,Gene 10,11〜15,
(1980))が好ましいと思われる。しかしながら、本発
明の以前には組換えDNA法によってIL−2を製造する試
みは成功していなかった。例えば、組換えDNA体によっ
てIL−2を産生する生命体を作成しようとする試みは、
恐らくIL−2ポリペプチドをコードする遺伝子が未だク
ローン化されていなかったために成功していないという
事が、“日経バイオテクノロジー,第19号,1982年7月
5日”に報告されていた。
のような他の生理活性ヒト由来たんぱくを製造するため
に用いられた組換えDNA(デオキシリボ核酸の略)法(G
rayら,Nature 295,503〜508,(1981),Nagataら,Nature
284,316〜320(1980),Taniguchiら,Gene 10,11〜15,
(1980))が好ましいと思われる。しかしながら、本発
明の以前には組換えDNA法によってIL−2を製造する試
みは成功していなかった。例えば、組換えDNA体によっ
てIL−2を産生する生命体を作成しようとする試みは、
恐らくIL−2ポリペプチドをコードする遺伝子が未だク
ローン化されていなかったために成功していないという
事が、“日経バイオテクノロジー,第19号,1982年7月
5日”に報告されていた。
縦って、IL−2をコードするクローン化遺伝子とその
遺伝子を持った組換えDNA体が渇望されてきた。また、
組換えDNA体を有する生細胞株と、その細胞株を使ってI
L−2を製造する方法が渇望されてきた。
遺伝子を持った組換えDNA体が渇望されてきた。また、
組換えDNA体を有する生細胞株と、その細胞株を使ってI
L−2を製造する方法が渇望されてきた。
本発明の要旨は以下の記述から更に容易に明白とな
る。本発明の目的はIL−2活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子を含有する組換えDNA体を創出したこ
と、および該組換えDNA体によってIL−2を産出すべく
形質転換させた原核生物の細胞を創出したことにある。
る。本発明の目的はIL−2活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子を含有する組換えDNA体を創出したこ
と、および該組換えDNA体によってIL−2を産出すべく
形質転換させた原核生物の細胞を創出したことにある。
すなわち、 本発明は次の式 で示されるアミノ酸配列を有するヒトインターロイキン
2活性を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのア
ミノ酸配列に対し1もしくは数個のアミノ酸残基の欠
失、付加あるいは置換がされたアミノ酸配列を有するヒ
トインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含有する原核生物を形質転換するための
組換えDNA体並びに上記式で示されるアミノ酸配列を有
するヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチド
または該ポリペプチドのアミノ酸配列に対し1もしくは
数個のアミノ酸残基の欠失、付加あるいは置換がされた
アミノ酸配列を有するヒトインターロイキン2活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換え
DNA体により形質転換された細菌を提供するものであ
る。なお、本明細書においてアミノ酸のうちGlnとAsnを
それぞれGlNとAsNと記載することがある。
2活性を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのア
ミノ酸配列に対し1もしくは数個のアミノ酸残基の欠
失、付加あるいは置換がされたアミノ酸配列を有するヒ
トインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含有する原核生物を形質転換するための
組換えDNA体並びに上記式で示されるアミノ酸配列を有
するヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチド
または該ポリペプチドのアミノ酸配列に対し1もしくは
数個のアミノ酸残基の欠失、付加あるいは置換がされた
アミノ酸配列を有するヒトインターロイキン2活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換え
DNA体により形質転換された細菌を提供するものであ
る。なお、本明細書においてアミノ酸のうちGlnとAsnを
それぞれGlNとAsNと記載することがある。
上記ヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチ
ドとしては、ヒトインターロイキン2活性を有するもの
であればいずれでもよい。
ドとしては、ヒトインターロイキン2活性を有するもの
であればいずれでもよい。
上記において、ヒトインターロイキン2活性を有する
ポリペプチドの具体例としては、たとえば分子中に次の
アミノ酸配列を含むポリペプチド(I)が挙げられる。
ポリペプチドの具体例としては、たとえば分子中に次の
アミノ酸配列を含むポリペプチド(I)が挙げられる。
当該ポリペプチド(I)の具体例としては例えば、下
記のアミノ酸配列を有するポリペプチド(II); 下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド(III); 下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド(IV); 下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド(V)など
が挙げられる。
記のアミノ酸配列を有するポリペプチド(II); 下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド(III); 下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド(IV); 下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド(V)など
が挙げられる。
上記ヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含有する組換えDNA体の具体例
としては、たとえば上記ポリペプチド(III)をコード
する下記の塩基配列を有する組換えDNA体; もしくは 上記ポリペプチド(V)をコードする下記の塩基配列
を有する組換えDNA体などが挙げられる。
ドをコードする遺伝子を含有する組換えDNA体の具体例
としては、たとえば上記ポリペプチド(III)をコード
する下記の塩基配列を有する組換えDNA体; もしくは 上記ポリペプチド(V)をコードする下記の塩基配列
を有する組換えDNA体などが挙げられる。
本発明におけるポリペプチドとしては、上記アミノ酸
配列の中で1個ないしそれ以上のアミノ酸を欠くポリペ
プチド;上記アミノ酸配列の中の1個ないしそれ以上ア
ミノ酸が1個ないしそれ以上のアミノ酸で置換されたポ
リペプチド;上記アミノ酸配列に対して1個ないしそれ
以上のアミノ酸が追加されたポリペプチドであってもよ
い。
配列の中で1個ないしそれ以上のアミノ酸を欠くポリペ
プチド;上記アミノ酸配列の中の1個ないしそれ以上ア
ミノ酸が1個ないしそれ以上のアミノ酸で置換されたポ
リペプチド;上記アミノ酸配列に対して1個ないしそれ
以上のアミノ酸が追加されたポリペプチドであってもよ
い。
本発明における細菌としてはエシェリヒア属に属する
ものが好ましく、さらにエシェリヒア・コリに属するも
のが好ましい。
ものが好ましく、さらにエシェリヒア・コリに属するも
のが好ましい。
本発明の組換えDNA体を利用することによって、IL−
2はIL−2活性を有するポリペプチドを産生すべくコー
ドされた遺伝子の挿入と、細胞の中で複製され得るベク
ターDNAの挿入で組換え法により修飾され、該遺伝子の
コードシーケンスが、プロモーターシーケンスの下流に
位置するDNAによってIL−2を産生すべく形質転換させ
た本発明の細菌あるいはエシェリヒア・コリを培地に浮
遊培養(好気的)することによって製造される。
2はIL−2活性を有するポリペプチドを産生すべくコー
ドされた遺伝子の挿入と、細胞の中で複製され得るベク
ターDNAの挿入で組換え法により修飾され、該遺伝子の
コードシーケンスが、プロモーターシーケンスの下流に
位置するDNAによってIL−2を産生すべく形質転換させ
た本発明の細菌あるいはエシェリヒア・コリを培地に浮
遊培養(好気的)することによって製造される。
IL−2ポリペプチドをコードしたクローン化遺伝子
は、IL−2活性を有するポリペプチドを産生する能力を
もつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞に由来す
るIL−2に相当するメッセンジャーRNA(mRNA;“RNA"は
リボ核酸の略,以下“IL−2 mRNA"という)を相補的DNA
(cDNA)に逆転写することによって得られる。得られた
一重鎖cDNA(ss−cDNA)は2重鎖cDNA(ds−cDNA)に変
換させることができる。
は、IL−2活性を有するポリペプチドを産生する能力を
もつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞に由来す
るIL−2に相当するメッセンジャーRNA(mRNA;“RNA"は
リボ核酸の略,以下“IL−2 mRNA"という)を相補的DNA
(cDNA)に逆転写することによって得られる。得られた
一重鎖cDNA(ss−cDNA)は2重鎖cDNA(ds−cDNA)に変
換させることができる。
cDNAを調製するための鋳型として用いるmRNAは、IL−
2ポリペプチドを産生する哺乳動物細胞から単離するこ
とができる。単離されたRNAはポリアデニル化され(GiL
Lisら,Immunological Rev.,63,167〜209(1982))、ポ
リアデニル化されたRNAは、例えばショ糖密度勾配遠心
法によって11〜12S画分に分画することができる。13Sの
mRNAにIL−2 mRNA活性が現われることがあるが、この場
合は11〜12SmRNAの凝集物であることが考えられる。
2ポリペプチドを産生する哺乳動物細胞から単離するこ
とができる。単離されたRNAはポリアデニル化され(GiL
Lisら,Immunological Rev.,63,167〜209(1982))、ポ
リアデニル化されたRNAは、例えばショ糖密度勾配遠心
法によって11〜12S画分に分画することができる。13Sの
mRNAにIL−2 mRNA活性が現われることがあるが、この場
合は11〜12SmRNAの凝集物であることが考えられる。
mRNAの供給源となるIL−2を産生することができる哺
乳動物細胞は、哺乳動物より摘出できる末梢血単核球,
扁桃腺細胞,脾臓細胞のようなT−リンパ球で良い。細
胞にIL−2産生能を与えたり、またはIL−2活性を増強
するために、ナイロンカラム処理,抗血清と捕体処理,
密度勾配分画,ノイラミニダーゼとガラクトースオキシ
ダーゼの組合せ処理,トリプシン処理のような様々な酵
素処理,X線照射など従来知られた方法で前処理しても良
い。上記哺乳動物細胞をT細胞増殖因子存在下で培養後
得られるクローン化Tリンパ球もmRNAの供給源として用
いることができ、これはより好ましいT−リンパ球であ
る。白血病やリンパ腫細胞株に由来するTリンパ球それ
自体または上記の方法で前処理または変異したそれらの
誘導体などの形質転換されたリンパ球細胞株またはクロ
ーニングされた形質転換細胞株もmRNAの供給源として好
ましい。明らかに、クローン化した細胞株は通常クロー
ン化前の親株に比較して多量のIL−2 mRNAを含んでい
る。上記したリンパ球由来細胞とCEM,Molt 4F,BW5147の
ごとき腫瘍細胞株を融合することによって得られたT細
胞ハイブリドーマもまた本発明に使用するのに好ましい
哺乳動物細胞である。この場合のリンパ球由来細胞は、
(1)IL−2の自発産生細胞および(2)IL−2産生を
補助する他の細胞の存在下または非存在下に培養液中に
マイトジェンが導入され存在している時のみIL−2を産
生する細胞を含む。
乳動物細胞は、哺乳動物より摘出できる末梢血単核球,
扁桃腺細胞,脾臓細胞のようなT−リンパ球で良い。細
胞にIL−2産生能を与えたり、またはIL−2活性を増強
するために、ナイロンカラム処理,抗血清と捕体処理,
密度勾配分画,ノイラミニダーゼとガラクトースオキシ
ダーゼの組合せ処理,トリプシン処理のような様々な酵
素処理,X線照射など従来知られた方法で前処理しても良
い。上記哺乳動物細胞をT細胞増殖因子存在下で培養後
得られるクローン化Tリンパ球もmRNAの供給源として用
いることができ、これはより好ましいT−リンパ球であ
る。白血病やリンパ腫細胞株に由来するTリンパ球それ
自体または上記の方法で前処理または変異したそれらの
誘導体などの形質転換されたリンパ球細胞株またはクロ
ーニングされた形質転換細胞株もmRNAの供給源として好
ましい。明らかに、クローン化した細胞株は通常クロー
ン化前の親株に比較して多量のIL−2 mRNAを含んでい
る。上記したリンパ球由来細胞とCEM,Molt 4F,BW5147の
ごとき腫瘍細胞株を融合することによって得られたT細
胞ハイブリドーマもまた本発明に使用するのに好ましい
哺乳動物細胞である。この場合のリンパ球由来細胞は、
(1)IL−2の自発産生細胞および(2)IL−2産生を
補助する他の細胞の存在下または非存在下に培養液中に
マイトジェンが導入され存在している時のみIL−2を産
生する細胞を含む。
IL−2自発産生細胞においてIL−2 mRNAを誘導するた
めに、IL−2自発産生細胞は、細胞培養の分野でよく知
られた方法で培養される。マイトジェン存在下のみでIL
−2を産生する細胞においてmRNAを産生する場合は、培
養した細胞は培地で良く洗った後、血清を含むかまたは
含まないローズウエルパークメモリアルインスティテュ
ート1640(以下、“RPMI 1640"と略す。),ダルベッコ
ウ変法イーグル培地(以下“DMEM"と略す。)またはク
リック培地のごとき培地に再び浮遊する。これらの細胞
培養培地には、ペニシリン,ストレプトマイシンまたは
他の抗生物質,L−グルタミン,ヘペス緩衝液,または炭
酸水素ナトリウムのような種々の添加物を細胞培養の分
野で一般に使われる濃度で加えても良い。好ましい細胞
濃度は0.5〜4×106細胞/mlである。mRNAの活性化とIL
−2の産生を誘導するために適当な刺激剤が加えられ
る。この適当な刺激剤の中には、マイトジェン,ノイラ
ミニダーゼ,ガラクトースオキシダーゼ,塩化亜鉛の如
き亜鉛化合物またはプロテインA,ストレプトリシン−O
の如き細菌由来のリンパ球活性化因子が含まれる。刺激
された細胞は回収され、洗浄される。マイトジェン刺激
の際、マクロファージまたはデンドリティック細胞を共
存させるとやはりmRNAを活性化し、あるいは活性化mRNA
の収量を増大させ得る。同様にRaji,Daudi,K562,BALL−
1の如きBリンパ球またはBリンパ球細胞株に由来する
細胞株を共存させてもmRNAは活性化され、または活性化
mRNAの収量を増大させ得る。
めに、IL−2自発産生細胞は、細胞培養の分野でよく知
られた方法で培養される。マイトジェン存在下のみでIL
−2を産生する細胞においてmRNAを産生する場合は、培
養した細胞は培地で良く洗った後、血清を含むかまたは
含まないローズウエルパークメモリアルインスティテュ
ート1640(以下、“RPMI 1640"と略す。),ダルベッコ
ウ変法イーグル培地(以下“DMEM"と略す。)またはク
リック培地のごとき培地に再び浮遊する。これらの細胞
培養培地には、ペニシリン,ストレプトマイシンまたは
他の抗生物質,L−グルタミン,ヘペス緩衝液,または炭
酸水素ナトリウムのような種々の添加物を細胞培養の分
野で一般に使われる濃度で加えても良い。好ましい細胞
濃度は0.5〜4×106細胞/mlである。mRNAの活性化とIL
−2の産生を誘導するために適当な刺激剤が加えられ
る。この適当な刺激剤の中には、マイトジェン,ノイラ
ミニダーゼ,ガラクトースオキシダーゼ,塩化亜鉛の如
き亜鉛化合物またはプロテインA,ストレプトリシン−O
の如き細菌由来のリンパ球活性化因子が含まれる。刺激
された細胞は回収され、洗浄される。マイトジェン刺激
の際、マクロファージまたはデンドリティック細胞を共
存させるとやはりmRNAを活性化し、あるいは活性化mRNA
の収量を増大させ得る。同様にRaji,Daudi,K562,BALL−
1の如きBリンパ球またはBリンパ球細胞株に由来する
細胞株を共存させてもmRNAは活性化され、または活性化
mRNAの収量を増大させ得る。
哺乳動物細胞を増殖させるために、細胞は通常の条件
下でin vitroで細胞培養により、または組織適合動物の
体内で維持される。mRNAの供給源を調製するためにin v
itro培養による継代を行なう場合には、従来T細胞の生
育を促進することが知られている培地であればどのよう
な培地にもこれら細胞は生育する。これらの培地には哺
乳動物の血清,血清成分または血清アルブミンを添加し
ても良い。mRNAの活性化のための培養時間は、mRNAを生
成するための活性化に必要な時間に対応する。この時間
は、通常IL−2の培地中への産生が開始されるまでに必
要な時間と対応している。好ましい時間は、マイトジェ
ン等の刺激剤を添加してから3〜12時間である。培養時
間が長すぎる場合、生成したIL−2 mRNAが分解されるこ
とがある。IL−2産生細胞の活性化に際し、PMAまたはT
PAの如きホルボールエステル類を10〜50ng/ml添加して
活性化レベルを上昇させることもできる。IL−2 mRNA活
性化のための上記工程はpH7.0〜7.4,温度範囲32〜38℃
の飽和水蒸気の環境下で行なわれる。
下でin vitroで細胞培養により、または組織適合動物の
体内で維持される。mRNAの供給源を調製するためにin v
itro培養による継代を行なう場合には、従来T細胞の生
育を促進することが知られている培地であればどのよう
な培地にもこれら細胞は生育する。これらの培地には哺
乳動物の血清,血清成分または血清アルブミンを添加し
ても良い。mRNAの活性化のための培養時間は、mRNAを生
成するための活性化に必要な時間に対応する。この時間
は、通常IL−2の培地中への産生が開始されるまでに必
要な時間と対応している。好ましい時間は、マイトジェ
ン等の刺激剤を添加してから3〜12時間である。培養時
間が長すぎる場合、生成したIL−2 mRNAが分解されるこ
とがある。IL−2産生細胞の活性化に際し、PMAまたはT
PAの如きホルボールエステル類を10〜50ng/ml添加して
活性化レベルを上昇させることもできる。IL−2 mRNA活
性化のための上記工程はpH7.0〜7.4,温度範囲32〜38℃
の飽和水蒸気の環境下で行なわれる。
IL−2を産生する哺乳動物細胞を取得し培養する方法
を以下に述べる。
を以下に述べる。
(イ)IL−2自発産生株の取得 ヒトTリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細
胞(フレッド・ハッチンソン・癌研究所/シアトル/ア
メリカ,ソーク研究所/サンジエゴ/アメリカ,西ドイ
ツ国立癌センター/ハイデルベルヒ/西ドイツ等で自由
に手に入る。)を1×106個/mlの細胞密度でクリック培
地中に懸濁させ、150レントゲン/分の照射速度で合計
8,000レントゲンのX線照射を行なう。この後、本細胞
を0.1細胞/200μ培地の細胞密度で96穴の平底マイク
ロタイタープレート(「ファルコン3072」)に添加し、
5%牛胎児血清を含むクリック培地中で3週間37℃にて
5%CO2インキュベーター中にて培養する(限界希釈法
によるクローニング)。細胞の生育が認められた培養ウ
エル中の細胞は、細胞が底面全体をおおう密度に到達す
る前に24穴のヌンク社製培養プレートに移し、クリック
培地中にて5日間細胞を増殖させる。さらに、本細胞を
1〜2×106個/mlの細胞密度にて血清も血清由来アルブ
ミンも含まない無血清合成培地に懸濁して2日間培養
し、本培養上清を遠心分離操作で分離し、次いで0.22μ
のミリポアフィルターにてデブリス除去の無菌化を行な
った。このようにして得た培養上清のIL−2活性を測定
することによってIL−2を自発産生するX線処理変異株
が選択され、かつクローニングされた。
胞(フレッド・ハッチンソン・癌研究所/シアトル/ア
メリカ,ソーク研究所/サンジエゴ/アメリカ,西ドイ
ツ国立癌センター/ハイデルベルヒ/西ドイツ等で自由
に手に入る。)を1×106個/mlの細胞密度でクリック培
地中に懸濁させ、150レントゲン/分の照射速度で合計
8,000レントゲンのX線照射を行なう。この後、本細胞
を0.1細胞/200μ培地の細胞密度で96穴の平底マイク
ロタイタープレート(「ファルコン3072」)に添加し、
5%牛胎児血清を含むクリック培地中で3週間37℃にて
5%CO2インキュベーター中にて培養する(限界希釈法
によるクローニング)。細胞の生育が認められた培養ウ
エル中の細胞は、細胞が底面全体をおおう密度に到達す
る前に24穴のヌンク社製培養プレートに移し、クリック
培地中にて5日間細胞を増殖させる。さらに、本細胞を
1〜2×106個/mlの細胞密度にて血清も血清由来アルブ
ミンも含まない無血清合成培地に懸濁して2日間培養
し、本培養上清を遠心分離操作で分離し、次いで0.22μ
のミリポアフィルターにてデブリス除去の無菌化を行な
った。このようにして得た培養上清のIL−2活性を測定
することによってIL−2を自発産生するX線処理変異株
が選択され、かつクローニングされた。
(ロ)ヒト末梢血単核細胞よりIL−2産生株の取得ヒト
の末梢血を採血し、フイコール・ハイパークの密度勾配
遠心法により末梢血リンパ球(以下、PBLと略す。)を
採取する。本PBLを1×106個/mlの細胞密度で5%FCSを
含むクリック培地に懸濁し、各2ml宛24穴のヌンクの培
養プレートに接種する。ここにフイトヘマグルチニン−
M(ギブコ社製)を5μg/mlの終末濃度になるように10
0μ添加し、上述の条件下に48時間培養し、次いで細
胞を培養液で洗浄し、再び1×105個/mlの細胞密度でク
リック培地1mlに接種する。さらに、コンカナバリンA
(以下、ConAと略す。)2.5μg/mlで48時間刺激したヒ
ト脾細胞から調製したコンディショニングした培地1ml
を加え、該コンディショニングした培地50%を含む培地
を3日毎に取り換えて、PBLからのヒトTリンパ球を長
期継代培養する。このように長期継代培養して得たTリ
ンパ球を、前述と同様の限界希釈法でコンディショニン
グした培地に由来するヒト脾細胞の存在下、クローニン
グを行ない、かつ同様に細胞増殖を行なう。こうして得
られたクローン化Tリンパ球を1×106個/mlの細胞密度
に10μg/mlのフイトヘマグルチニン(以下、PHAと略
す。)の存在下、24穴のヌンク培養プレート中のRPMI 1
640倍地1mlに接種し、24時間,37℃で7.5% CO2インキュ
ベーター中にて培養した。本培養上清を遠心分離操作で
分離し、次いで0.22μのミリポアフィルターで無菌化を
行なった後、IL−2産生ヒト正常Tリンパ球クローンを
同定するために、IL−2活性検定を行なった。
の末梢血を採血し、フイコール・ハイパークの密度勾配
遠心法により末梢血リンパ球(以下、PBLと略す。)を
採取する。本PBLを1×106個/mlの細胞密度で5%FCSを
含むクリック培地に懸濁し、各2ml宛24穴のヌンクの培
養プレートに接種する。ここにフイトヘマグルチニン−
M(ギブコ社製)を5μg/mlの終末濃度になるように10
0μ添加し、上述の条件下に48時間培養し、次いで細
胞を培養液で洗浄し、再び1×105個/mlの細胞密度でク
リック培地1mlに接種する。さらに、コンカナバリンA
(以下、ConAと略す。)2.5μg/mlで48時間刺激したヒ
ト脾細胞から調製したコンディショニングした培地1ml
を加え、該コンディショニングした培地50%を含む培地
を3日毎に取り換えて、PBLからのヒトTリンパ球を長
期継代培養する。このように長期継代培養して得たTリ
ンパ球を、前述と同様の限界希釈法でコンディショニン
グした培地に由来するヒト脾細胞の存在下、クローニン
グを行ない、かつ同様に細胞増殖を行なう。こうして得
られたクローン化Tリンパ球を1×106個/mlの細胞密度
に10μg/mlのフイトヘマグルチニン(以下、PHAと略
す。)の存在下、24穴のヌンク培養プレート中のRPMI 1
640倍地1mlに接種し、24時間,37℃で7.5% CO2インキュ
ベーター中にて培養した。本培養上清を遠心分離操作で
分離し、次いで0.22μのミリポアフィルターで無菌化を
行なった後、IL−2産生ヒト正常Tリンパ球クローンを
同定するために、IL−2活性検定を行なった。
(ハ)マイトジェン刺激でIL−2を生産するヒトリンパ
球由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法により
クローン化されたJ−111株は、前記の無血清倍地や血
清1〜2%を含むBPMI 1640倍地中にてConA 10μg/mlや
PHA 2.5μg/mlの存在下に24時間培養すると、10〜4,000
単位/mlのIL−2を産生することができる。また、これ
らヒト悪性化細胞は塩化亜鉛,プロテインA,ピシバニー
ル存在下に培養しても、IL−2を産生する。
球由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法により
クローン化されたJ−111株は、前記の無血清倍地や血
清1〜2%を含むBPMI 1640倍地中にてConA 10μg/mlや
PHA 2.5μg/mlの存在下に24時間培養すると、10〜4,000
単位/mlのIL−2を産生することができる。また、これ
らヒト悪性化細胞は塩化亜鉛,プロテインA,ピシバニー
ル存在下に培養しても、IL−2を産生する。
(ニ)他の細胞もしくはその細胞の産生する因子の存在
下にマイトジェンで刺激することによりIL−2を産生す
る細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Molt 4Fや前述の限界希釈法
でクローン化されたジュルカット細胞の1つのクロー
ン,ジュルカット99株は、上述のごときレクチンやマイ
トジェンを広い濃度範囲で加えて24〜72時間培養しても
IL−2を産生しない。ところが、この間モノカインの1
種であるインターロイキン1を5〜10u/mlまたは50%の
K562やラージ(Raji)細胞を共存させて37℃,24時間培
養すると、IL−2を確認しうる量(10〜100u/ml)産生
する。
下にマイトジェンで刺激することによりIL−2を産生す
る細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Molt 4Fや前述の限界希釈法
でクローン化されたジュルカット細胞の1つのクロー
ン,ジュルカット99株は、上述のごときレクチンやマイ
トジェンを広い濃度範囲で加えて24〜72時間培養しても
IL−2を産生しない。ところが、この間モノカインの1
種であるインターロイキン1を5〜10u/mlまたは50%の
K562やラージ(Raji)細胞を共存させて37℃,24時間培
養すると、IL−2を確認しうる量(10〜100u/ml)産生
する。
このようにして活性化された細胞よりIL−2 mRNAを抽
出するには、細胞の種類を問わず常法によって行なえば
よい。たとえば、NP−40,SDS,Triton−X100,デオキシコ
ール酸などの界面活性剤を添加して細胞を部分的または
完全に分解するか、ホモゲナイザーや凍結融解などの物
理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に破壊,
可溶化する。その際にRNaseによるRNAの分解を防ぐため
に、抽出液中にRNaseインヒビター、たとえばヘパリ
ン,ポリビニル硫酸,ベントナイト,マカロイド,ジエ
チルピロカーボネート,バナジウム複合体などを添加し
ておくのが好ましい。また、場合に応じては、抗IL−2
抗体を用いてIL−2合成途上のポリゾームを沈降せし
め、これよりmRNAを界面活性剤などで抽出する方法も行
ない得る。
出するには、細胞の種類を問わず常法によって行なえば
よい。たとえば、NP−40,SDS,Triton−X100,デオキシコ
ール酸などの界面活性剤を添加して細胞を部分的または
完全に分解するか、ホモゲナイザーや凍結融解などの物
理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に破壊,
可溶化する。その際にRNaseによるRNAの分解を防ぐため
に、抽出液中にRNaseインヒビター、たとえばヘパリ
ン,ポリビニル硫酸,ベントナイト,マカロイド,ジエ
チルピロカーボネート,バナジウム複合体などを添加し
ておくのが好ましい。また、場合に応じては、抗IL−2
抗体を用いてIL−2合成途上のポリゾームを沈降せし
め、これよりmRNAを界面活性剤などで抽出する方法も行
ない得る。
また、poliAを含むmRNAの精製についてはオリゴdT−
セルロース,セファロース2Bを担体とするポリU−セフ
ァロースなどのアフィニティ・カラムあるいはバッチ法
による精製法,SDG遠心法による分画,アガロースゲル電
気泳動法等によって行なうことができる。
セルロース,セファロース2Bを担体とするポリU−セフ
ァロースなどのアフィニティ・カラムあるいはバッチ法
による精製法,SDG遠心法による分画,アガロースゲル電
気泳動法等によって行なうことができる。
上記の如くして得られたmRNAがIL−2 mRNA活性を有す
るものであることを確認するためには、mRNAを蛋白に翻
訳させ、その生理活性を調べるか、抗IL−2ペプチド単
クローン性抗体を用い該翻訳蛋白を同定する等の方法を
行なえばよい。たとえばmRNAは通常、アフリカツメガエ
ル(Xenopus laevis)の卵にマイクロインジェクション
することにより(Gurdonら,Nature,233,177〜182(197
2))あるいは網状赤血球または小麦胚無細胞翻訳シス
テムを使用することにより対応する蛋白に翻訳される。
るものであることを確認するためには、mRNAを蛋白に翻
訳させ、その生理活性を調べるか、抗IL−2ペプチド単
クローン性抗体を用い該翻訳蛋白を同定する等の方法を
行なえばよい。たとえばmRNAは通常、アフリカツメガエ
ル(Xenopus laevis)の卵にマイクロインジェクション
することにより(Gurdonら,Nature,233,177〜182(197
2))あるいは網状赤血球または小麦胚無細胞翻訳シス
テムを使用することにより対応する蛋白に翻訳される。
IL−2活性は、先にGillisら(Gillisら,J.Immunol.,
120,2027〜2033(1978))によって基本的には述べられ
ているミクロ検定法によって確認できる。この検定法で
は、Gillisらによって確立された方法に従って作成した
細胞障害性Tリンパ球細胞株(以下、CTLLと略す。)の
IL−2に依存細胞のDNA合成上昇(IL−2 dependent cel
lular proliferation)を指標としている。即ち、4×1
03個のCTLL細胞を2%のFCSを含むRPMI−1640培地100μ
に懸濁し、100μの連続希釈した翻訳産物と共に96
穴の平底マイクロプレートに接種する。37℃,5%CO2下
で20時間培養した後、細胞を0.5μCi/ウエルの3H−TdR
で4時間ラベルし、自動細胞ハーベスターを用いて帯状
ガラス繊維上に細胞を回収し、細胞が取り込んだ放射能
を液体シンチレーション法で測定する。この検定によ
り、IL−2存在下に培養されたCTLL細胞が投与量に依存
して3H−TdRを取込むことが判明し、このことから検体
中に含まれるIL−2量を明確に計算することができる。
120,2027〜2033(1978))によって基本的には述べられ
ているミクロ検定法によって確認できる。この検定法で
は、Gillisらによって確立された方法に従って作成した
細胞障害性Tリンパ球細胞株(以下、CTLLと略す。)の
IL−2に依存細胞のDNA合成上昇(IL−2 dependent cel
lular proliferation)を指標としている。即ち、4×1
03個のCTLL細胞を2%のFCSを含むRPMI−1640培地100μ
に懸濁し、100μの連続希釈した翻訳産物と共に96
穴の平底マイクロプレートに接種する。37℃,5%CO2下
で20時間培養した後、細胞を0.5μCi/ウエルの3H−TdR
で4時間ラベルし、自動細胞ハーベスターを用いて帯状
ガラス繊維上に細胞を回収し、細胞が取り込んだ放射能
を液体シンチレーション法で測定する。この検定によ
り、IL−2存在下に培養されたCTLL細胞が投与量に依存
して3H−TdRを取込むことが判明し、このことから検体
中に含まれるIL−2量を明確に計算することができる。
IL−2はTリンパ球の増殖を促す活性を有するので、
IL−2活性をTリンパ球の増殖を指標として測定するこ
とができる。即ち、5個のCTLL細胞を2%のFCSを含むD
MEM100μに懸濁し、100μの連続希釈した翻訳産物
と共に96穴と平底マイクロプレートに接種する。72〜96
時間,37℃,5%CO2下で培養した後、活性化し増殖した細
胞の数を顕微鏡下で計測する。対照群として100U/ml,10
U/mlのIL−2を用い、この対照群の増殖した生細胞数と
比較して検体のIL−2活性を求める。
IL−2活性をTリンパ球の増殖を指標として測定するこ
とができる。即ち、5個のCTLL細胞を2%のFCSを含むD
MEM100μに懸濁し、100μの連続希釈した翻訳産物
と共に96穴と平底マイクロプレートに接種する。72〜96
時間,37℃,5%CO2下で培養した後、活性化し増殖した細
胞の数を顕微鏡下で計測する。対照群として100U/ml,10
U/mlのIL−2を用い、この対照群の増殖した生細胞数と
比較して検体のIL−2活性を求める。
このようにして最も高活性の画分から得られたIL−2
mRNAはds−cDNAを合成するための鋳型として用い、ds−
cDNAはベクターDNAと結合させる。cDNAの合成は従来の
方法によって行なう。
mRNAはds−cDNAを合成するための鋳型として用い、ds−
cDNAはベクターDNAと結合させる。cDNAの合成は従来の
方法によって行なう。
まず、mRNAを鋳型とし、オリゴdTをプライマーとして
dATP,dGTP,dCTP,dTTPの存在下で逆転写酵素によりmRNA
と相補的なss−cDNAを合成し、アルカリ処理で鋳型mRNA
を分解除去した後、今度は単鎖cDNAを鋳型にして逆転写
酵素あるいはDNAポリメラーゼを用いてds−cDNAを合成
する。
dATP,dGTP,dCTP,dTTPの存在下で逆転写酵素によりmRNA
と相補的なss−cDNAを合成し、アルカリ処理で鋳型mRNA
を分解除去した後、今度は単鎖cDNAを鋳型にして逆転写
酵素あるいはDNAポリメラーゼを用いてds−cDNAを合成
する。
このようにして得られたds−cDNAと原核生物あるいは
エシェリヒア・コリで複製できるレプリコンを含むベク
ターDNAから本発明の組換えDNA体が作られる。しかる
後、この組み換えDNA体は宿主細胞に組み込まれる。
エシェリヒア・コリで複製できるレプリコンを含むベク
ターDNAから本発明の組換えDNA体が作られる。しかる
後、この組み換えDNA体は宿主細胞に組み込まれる。
このds−cDNA及び原核生物で増殖し得るベクターDNA
は、これらを結合させる前にエキソヌクレアーゼ処理,
化学合成DNA断片の追加,ds−cDNAやベクターDNAの末端
に連結可能な端末をつけるためにG,C−鎖を伸ばすなど
各種処理によって修飾される。これらの連結可能なDNA
は、例えばATP共存下にT4ファージのDNAライゲースによ
ってつぎ合せることが出来る。
は、これらを結合させる前にエキソヌクレアーゼ処理,
化学合成DNA断片の追加,ds−cDNAやベクターDNAの末端
に連結可能な端末をつけるためにG,C−鎖を伸ばすなど
各種処理によって修飾される。これらの連結可能なDNA
は、例えばATP共存下にT4ファージのDNAライゲースによ
ってつぎ合せることが出来る。
このようにして調製された本発明の組換えDNA体によ
ってクローン化されたcDNAを増巾させるため又はIL−2
ポリペプチドを製造するために細菌あるいはエシェリヒ
ア・コリを形質転換することにより、本発明の組換えDN
A体により形質転換された細菌あるいはエシェリヒア・
コリが得られる。
ってクローン化されたcDNAを増巾させるため又はIL−2
ポリペプチドを製造するために細菌あるいはエシェリヒ
ア・コリを形質転換することにより、本発明の組換えDN
A体により形質転換された細菌あるいはエシェリヒア・
コリが得られる。
IL−2生産のための適当な細菌宿主としてはパチルス
・ズブチリスなどあるいはエシェリヒア・コリが含まれ
る。宿主細胞中でのDNA増巾のためにはエシェリヒア・
コリを宿主とすることが出来るが、その他の宿主細胞と
することも出来る。
・ズブチリスなどあるいはエシェリヒア・コリが含まれ
る。宿主細胞中でのDNA増巾のためにはエシェリヒア・
コリを宿主とすることが出来るが、その他の宿主細胞と
することも出来る。
適当なエシェリヒア・コリ用ベクターとしてはEK型プ
ラスミドベクター(ストリンゼント型)としてpSC101,p
RK353,pRK646,pRK248,pDF41など.,EKタイププラスミド
ベクター(リラックスドタイプ):ColE1,pVH51,pAC105,
RSF2124,pCR1,pMB9,pBR313,pBR322,pBR324,pBR325,pBR3
27,pBR328,pKY2289,pKY2700,pKN80,pKC7,pKB158,pMK200
4,pACYC1,pACYC184,dul等.,λgtタイプファージベクタ
ー:λgt.λc,λgt,λB,λWES,λC,λWES.λB,λZJvi
r.,λB′,λALO,λB,λWES.Ts622,λDam等が含まれて
いる。一般に、pBR322はエシェリヒア・コリ用ベクター
としてしばしば利用されてきたが、この場合最も良いク
ローニング部位はPst1ならびにEcoR1部位である。
ラスミドベクター(ストリンゼント型)としてpSC101,p
RK353,pRK646,pRK248,pDF41など.,EKタイププラスミド
ベクター(リラックスドタイプ):ColE1,pVH51,pAC105,
RSF2124,pCR1,pMB9,pBR313,pBR322,pBR324,pBR325,pBR3
27,pBR328,pKY2289,pKY2700,pKN80,pKC7,pKB158,pMK200
4,pACYC1,pACYC184,dul等.,λgtタイプファージベクタ
ー:λgt.λc,λgt,λB,λWES,λC,λWES.λB,λZJvi
r.,λB′,λALO,λB,λWES.Ts622,λDam等が含まれて
いる。一般に、pBR322はエシェリヒア・コリ用ベクター
としてしばしば利用されてきたが、この場合最も良いク
ローニング部位はPst1ならびにEcoR1部位である。
組換えDNA体を用いた宿主細胞の形質転換には、通常
よく用いられる次の方法がある。エシェリヒア・コリが
宿主の場合、このDNAを取り込むことの出来るコンピテ
ント細胞は対数増殖期における細胞を回収後、良く知ら
れているCaCl2法によって形質転換出来る。形質転換反
応液中にMgCl2又はRbClを共存させれば形質転換効率は
向上する。また、宿主細胞のプロトプラスト調製後形質
転換させることも可能である。
よく用いられる次の方法がある。エシェリヒア・コリが
宿主の場合、このDNAを取り込むことの出来るコンピテ
ント細胞は対数増殖期における細胞を回収後、良く知ら
れているCaCl2法によって形質転換出来る。形質転換反
応液中にMgCl2又はRbClを共存させれば形質転換効率は
向上する。また、宿主細胞のプロトプラスト調製後形質
転換させることも可能である。
IL−2遺伝子を保有する細胞は、次の2つの方法の何
れかを用いて形質転換後分離可能である。
れかを用いて形質転換後分離可能である。
(1) プラス−マイナス法:抗原刺激した哺乳動物細
胞抽出液より庶糖密度勾配遠心分離にて11−12S画分と
して部分精製したIL−2 mRNAを調製し、この部分精製mR
NAを鋳型として32P−放射性ss−cDNAを合成する。アル
カリ処理にて鋳型mRNAを除去後、単離されたcDNAは、抗
原刺激しない哺乳動物細胞から抽出され、部分精製した
11−12SmRNAでハイブリダイズする。引続いてハイブリ
ダイズしなかったcDNAとハイブリダイズしたcDNAはハイ
ドロキシアパタイトカラムクロマドグラフィーで分画す
る。ハイブリダイズしなかったcDNAとハイブリダイズし
たcDNAをそれぞれプローブA、及びプローブBと呼ぶ。
何れの組換え体も同一の方法によりそれぞれニトロセル
ロース濾紙上で生育させる。そして、細胞のDNAをアル
カリ処理にて濾紙上に固定する。プローブA及びBをそ
れぞれ、二つの異った濾紙上でDNAとハイブリダイズさ
せる。その後、オートラジオグラフィーを行ってプロー
ブAと陽性に反応する組換え体(プラス)、プローブB
と僅か又は全然反応しない組換え体(マイナス)を選別
する(谷口ら;Proc.Jap.Acad.,V155B 464〜469(197
9). (2) 第2の方法は、例えば1000〜10,000の組換体ク
ローンを2〜30ないし2〜300クローン宛のクローング
ループに大別し、それぞれのクローングループをそれぞ
れ常法によって培養しプラスミドDNAsを調製する。次い
で、これらプラスミドDNAsを例えば熱変性してss−cDNA
をニトロセルロース濾紙上に固定し、活性化IL−2−mR
NAを含有する哺乳動物細胞から調製されたmRNAと相補的
にハイブリダイゼーションを行う。あるいはまた、IL−
2 mRNAを含有するmRNA(混合物)を熱変性したプラスミ
ドDNA(混合物)とハイブリダイズさせるとDNA−mRNAハ
イブリッドがニトロセルロース濾紙上に固定される。こ
の濾紙を1mMのHEPES、あるいは10mMの食塩水のごとき低
塩類緩衝液で洗浄し、濾紙上に吸着されたmRNAを0.5mM
EDTA;0.1% SDS溶液含有液で例えば95℃,1分間処理して
抽出する。精製mRNAはこれをoligodT−セルロースカラ
ムクロマトグラフィーにて溶出回収する。次いで、mRNA
をアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクシ
ョンして蛋白質に翻訳してIL−2活性を確認する。ある
いはmRNAに依存性の網状赤血球系又は小麦胚のin vitro
無細胞合成系を用いてこのmRNAを蛋白に翻訳させ、抗IL
−2抗体を用いてIL−2−活性を分析することが出来
る。これらの方法によってIL−2活性が検出されたグル
ープをさらに少数の組換え体クローンを含有する群に類
別し最終的にはIL−2 DNAを有する単一クローンが得ら
れるまで繰返し実施する。
胞抽出液より庶糖密度勾配遠心分離にて11−12S画分と
して部分精製したIL−2 mRNAを調製し、この部分精製mR
NAを鋳型として32P−放射性ss−cDNAを合成する。アル
カリ処理にて鋳型mRNAを除去後、単離されたcDNAは、抗
原刺激しない哺乳動物細胞から抽出され、部分精製した
11−12SmRNAでハイブリダイズする。引続いてハイブリ
ダイズしなかったcDNAとハイブリダイズしたcDNAはハイ
ドロキシアパタイトカラムクロマドグラフィーで分画す
る。ハイブリダイズしなかったcDNAとハイブリダイズし
たcDNAをそれぞれプローブA、及びプローブBと呼ぶ。
何れの組換え体も同一の方法によりそれぞれニトロセル
ロース濾紙上で生育させる。そして、細胞のDNAをアル
カリ処理にて濾紙上に固定する。プローブA及びBをそ
れぞれ、二つの異った濾紙上でDNAとハイブリダイズさ
せる。その後、オートラジオグラフィーを行ってプロー
ブAと陽性に反応する組換え体(プラス)、プローブB
と僅か又は全然反応しない組換え体(マイナス)を選別
する(谷口ら;Proc.Jap.Acad.,V155B 464〜469(197
9). (2) 第2の方法は、例えば1000〜10,000の組換体ク
ローンを2〜30ないし2〜300クローン宛のクローング
ループに大別し、それぞれのクローングループをそれぞ
れ常法によって培養しプラスミドDNAsを調製する。次い
で、これらプラスミドDNAsを例えば熱変性してss−cDNA
をニトロセルロース濾紙上に固定し、活性化IL−2−mR
NAを含有する哺乳動物細胞から調製されたmRNAと相補的
にハイブリダイゼーションを行う。あるいはまた、IL−
2 mRNAを含有するmRNA(混合物)を熱変性したプラスミ
ドDNA(混合物)とハイブリダイズさせるとDNA−mRNAハ
イブリッドがニトロセルロース濾紙上に固定される。こ
の濾紙を1mMのHEPES、あるいは10mMの食塩水のごとき低
塩類緩衝液で洗浄し、濾紙上に吸着されたmRNAを0.5mM
EDTA;0.1% SDS溶液含有液で例えば95℃,1分間処理して
抽出する。精製mRNAはこれをoligodT−セルロースカラ
ムクロマトグラフィーにて溶出回収する。次いで、mRNA
をアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクシ
ョンして蛋白質に翻訳してIL−2活性を確認する。ある
いはmRNAに依存性の網状赤血球系又は小麦胚のin vitro
無細胞合成系を用いてこのmRNAを蛋白に翻訳させ、抗IL
−2抗体を用いてIL−2−活性を分析することが出来
る。これらの方法によってIL−2活性が検出されたグル
ープをさらに少数の組換え体クローンを含有する群に類
別し最終的にはIL−2 DNAを有する単一クローンが得ら
れるまで繰返し実施する。
IL−2産生能のある組換え体よりIL−2ポリペチドを
コードするcDNAを得るには、先ずトランスフォーマント
中の組換えDNA体を分離し、これを制限酵素エンドヌク
レアーゼで切断する。切断によって得られるDNA分画よ
り組込まれたcDNA画分を分離する。
コードするcDNAを得るには、先ずトランスフォーマント
中の組換えDNA体を分離し、これを制限酵素エンドヌク
レアーゼで切断する。切断によって得られるDNA分画よ
り組込まれたcDNA画分を分離する。
pIL−2−50Aを組換えたDNAよりIL−2ポリペプチド
をコードするPst1 DNAインサートの全ヌクレオチド配列
は、Maxam and Gilbert法(Meth.Enzym.65,499〜560,
(1980));ならびに二デオキシヌクレオチド鎖末端法
(Smith,A.J.M.Meth.Enzym.65,560〜580,(1980))に
て決定された。
をコードするPst1 DNAインサートの全ヌクレオチド配列
は、Maxam and Gilbert法(Meth.Enzym.65,499〜560,
(1980));ならびに二デオキシヌクレオチド鎖末端法
(Smith,A.J.M.Meth.Enzym.65,560〜580,(1980))に
て決定された。
cDNAインサートの制限酵素エンドヌクレアーゼによる
切断図を第1図及び第2図(a)に示す。第2図(a)
に示すごとく、このcDNAはそれぞれBstN1,Xba I,BstN I
なる制限酵素エンドヌクレアーゼで切断される構造を有
する。
切断図を第1図及び第2図(a)に示す。第2図(a)
に示すごとく、このcDNAはそれぞれBstN1,Xba I,BstN I
なる制限酵素エンドヌクレアーゼで切断される構造を有
する。
本cDNAインサートのDNA配列は一つの大きなオープン
リーディングフレームを保有する。真核生物の読み取り
開始配列となることの多い第一のATG配列(Kozak,M.Cel
l.15,1109〜1123(1978))は、5′−端から48−50ヌ
クレオチド位に存在し、読み終り配列TGAが存在するヌ
クレオチド位507−509迄152の配列がこのATGにつながっ
ている。mRNAの3′−poly(A)末端に相当するAのつ
ながりがcDNA末端に見出され、通常真核生物mRNAのほと
んどに見出される6個からなるヌクレオチドAATAAA(77
1−776位)が先に位置する。
リーディングフレームを保有する。真核生物の読み取り
開始配列となることの多い第一のATG配列(Kozak,M.Cel
l.15,1109〜1123(1978))は、5′−端から48−50ヌ
クレオチド位に存在し、読み終り配列TGAが存在するヌ
クレオチド位507−509迄152の配列がこのATGにつながっ
ている。mRNAの3′−poly(A)末端に相当するAのつ
ながりがcDNA末端に見出され、通常真核生物mRNAのほと
んどに見出される6個からなるヌクレオチドAATAAA(77
1−776位)が先に位置する。
(Proudfoot,N.J.& Brownlee C.G.,Nature 263,211−2
14,(1976)) cDNAによってコードされるアミノ酸配列は第2図
(b)(アミノ酸配列I)のごとく演えきでき、しかも
アミノ酸配列Iのポリペプチドは153個のアミノ酸から
なり、その分子量は17631.7ダルトンと計算される。今
日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると報告さ
れているように(Blobel G.et al,Sym.Soc.Exp.Med.,3
3,9〜36(1979))、上記演えきIL−2ポリペプチドの
N末端領域はやはり疎水性である。本領域は成熟IL−2
の分泌時に切断されるシグナルペプチドの役割を果して
いるであろう。切断は20−21位のSerとAla間で起るか21
−22位間のAla−Pro間で切断され、アミノ酸配列IIおよ
びIIIを有するポリペプチドを生成する。何故ならば同
様な切断位置は今迄知られたその他の分泌蛋白にもしば
しば見出されているからである(Blobel,G.et al,Symp.
Soc.Exp.Med.,33,9〜36(1979))。従って、成熟IL−
2ポリペプチドは133ないし132個のアミノ酸から成り、
分子量は15420.5または15349.4ダルトンと算出される。
本分子量値はジュルカット細肪から得られたヒトIL−2
蛋白の分子量(15000ダルトン)として報告されたもの
を対比される(Gillis et al.,Immunological Rev.,63,
67〜209(1982))。また実施例3に示すごとく塩基配
列111〜113位にあるCCT配列から始まるDNA画分、即ち、
22位に位置するProから始まるポリペプチドに対するコ
ード(第2(b)図中のアミノ酸配列III)はIL−2活
性を有するポリペプチドを表現していることが確認され
た。塩基配列107〜110位にあるGCAから始まるDNA画分、
即ち第2(b)図のアミノ酸配列IIに示すごとく、21位
に位置するAlaから始まるポリペプチドをコードするDNA
画分は、実施例6に示すごとくIL−2活性を有するポリ
ペプチドを表現していることが確認された。
14,(1976)) cDNAによってコードされるアミノ酸配列は第2図
(b)(アミノ酸配列I)のごとく演えきでき、しかも
アミノ酸配列Iのポリペプチドは153個のアミノ酸から
なり、その分子量は17631.7ダルトンと計算される。今
日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると報告さ
れているように(Blobel G.et al,Sym.Soc.Exp.Med.,3
3,9〜36(1979))、上記演えきIL−2ポリペプチドの
N末端領域はやはり疎水性である。本領域は成熟IL−2
の分泌時に切断されるシグナルペプチドの役割を果して
いるであろう。切断は20−21位のSerとAla間で起るか21
−22位間のAla−Pro間で切断され、アミノ酸配列IIおよ
びIIIを有するポリペプチドを生成する。何故ならば同
様な切断位置は今迄知られたその他の分泌蛋白にもしば
しば見出されているからである(Blobel,G.et al,Symp.
Soc.Exp.Med.,33,9〜36(1979))。従って、成熟IL−
2ポリペプチドは133ないし132個のアミノ酸から成り、
分子量は15420.5または15349.4ダルトンと算出される。
本分子量値はジュルカット細肪から得られたヒトIL−2
蛋白の分子量(15000ダルトン)として報告されたもの
を対比される(Gillis et al.,Immunological Rev.,63,
67〜209(1982))。また実施例3に示すごとく塩基配
列111〜113位にあるCCT配列から始まるDNA画分、即ち、
22位に位置するProから始まるポリペプチドに対するコ
ード(第2(b)図中のアミノ酸配列III)はIL−2活
性を有するポリペプチドを表現していることが確認され
た。塩基配列107〜110位にあるGCAから始まるDNA画分、
即ち第2(b)図のアミノ酸配列IIに示すごとく、21位
に位置するAlaから始まるポリペプチドをコードするDNA
画分は、実施例6に示すごとくIL−2活性を有するポリ
ペプチドを表現していることが確認された。
有核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子でも
知られている様に多形現象を示すことが知られている
(谷口ら,Gene 10,11〜15(1980),大野,谷口.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,77,5305〜5309(1981);Gray et a
l,Nature 295,501〜508(1981))。この多形現象によ
って、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換される場
合もあれば、塩基配列の変化はあっても全く変らない場
合もある。ヒトIL−2・cDNAの場合、pIL−2−50A cDN
Aの503位のA残基がG残基で置き換えられた他のcDNAク
ローン(pIL−2−503)も検出できる。pIL−2−50A c
DNAとは塩基配列が異なるその他のcDNAクローンの存在
も期待できる。
知られている様に多形現象を示すことが知られている
(谷口ら,Gene 10,11〜15(1980),大野,谷口.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,77,5305〜5309(1981);Gray et a
l,Nature 295,501〜508(1981))。この多形現象によ
って、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換される場
合もあれば、塩基配列の変化はあっても全く変らない場
合もある。ヒトIL−2・cDNAの場合、pIL−2−50A cDN
Aの503位のA残基がG残基で置き換えられた他のcDNAク
ローン(pIL−2−503)も検出できる。pIL−2−50A c
DNAとは塩基配列が異なるその他のcDNAクローンの存在
も期待できる。
上記説明からも明らかなごとく、本発明に係る遺伝子
は、第2(a)図に示された塩基配列を有するDNA,48−
50位のATG配列から始まり、504〜506位にある少くともA
CT配列に至る連続塩基配列を有するDNAs,108−110位のG
CA配列から始まり、GCA配列から少くともACT配列に至る
連続塩基配列を有するDNA,また111−113位のCCT配列か
ら少くともACT配列に至る連続塩基配列を有するDNAを包
含する。本発明に係る遺伝子はまた、504〜506位のACT
配列に終り、1位のAに始まるDNA,48−50位のATGで始
まるDNA,108−110位のGCA配列で始まるDNA又は111−113
位のCCT配列で始まるDNAを包含する。更に本発明に係る
遺伝子は、507〜509位のTGA配列に終り、1位のAに始
まるDNA,48〜50位のATG配列で始まるDNA,108〜110位のG
CA配列で始まるDNAまたは111〜113位のCCT配列で始まる
DNAを包含する。更に本発明に係る遺伝子は、801位のC
で終り、1位のAで始まるDNA,48−50位のATGで始まるD
NA,108−110位のGCAで始まるDNAまたは111−113位のCCT
配列で始まるDNAを包含する。本発明に係る遺伝子はま
たpoly(A)で終り、48−50位のATG配列から始まるDN
A,108−110位のGCA配列で始まるDNAまたは111−113位の
CCT配列で始まるDNAを含む。また、本発明は、アミノ酸
配列I,II,IIIに相当する塩基配列を有する遺伝子を含
む。アミノ酸配列Iの中で1個ないしそれ以上のアミノ
酸を欠くポリペプチド、あるいはアミノ酸配列Iの中の
1個ないしそれ以上のアミノ酸が1個ないしそれ以上の
アミノ酸で置換されたポリペプチドはIL−2活性を有す
ることもあり、従ってこの様なポリペプチドをコードす
る遺伝子は本発明に係る遺伝子として使える。同様にア
ミノ酸配列I,IIまたはIIIに対して1個ないしそれ以上
のアミノ酸を表現し得る1個ないしそれ以上の塩基を余
分に結合した遺伝子であっても追加されたアミノ酸が、
ポリペプチドのIL−2活性発現に邪魔しない限り本発明
の中に包含される。IL−2としてのポリペプチド機能を
阻害する追加アミノ酸配列を有する修飾領域であっても
新たに追加された領域が容易に除去出来るものならば本
発明に係る遺伝子として利用出来る。同じことはアミノ
酸配列I,IIおよびIIIに対応する遺伝子のアミノ酸配列
I,IIおよびIIIのC−末端にアミノ酸追加をコードするD
NAが3′−末端に追加結合せしめたDNAの場合にも言え
る。上記のようなアミノ酸の欠失,付加あるいは置換
は、出願前周知技術である部位特異的変異技術(Geneti
c Engineering,vol.3,pp1−32,Plenum Press,New York
(1981),Nucleic Acid Research,vol.10,pp6487−6500
(1982)等)により実施することができ、1もしくは数
個のアミノ酸の欠失,付加あるいは置換とは、部位特異
的変異技術により欠失,付加あるいは置換できる程度の
数のアミノ酸を意味する。従って、この様なポリペプチ
ドをコードする遺伝子の利用は、本発明に包含される。
は、第2(a)図に示された塩基配列を有するDNA,48−
50位のATG配列から始まり、504〜506位にある少くともA
CT配列に至る連続塩基配列を有するDNAs,108−110位のG
CA配列から始まり、GCA配列から少くともACT配列に至る
連続塩基配列を有するDNA,また111−113位のCCT配列か
ら少くともACT配列に至る連続塩基配列を有するDNAを包
含する。本発明に係る遺伝子はまた、504〜506位のACT
配列に終り、1位のAに始まるDNA,48−50位のATGで始
まるDNA,108−110位のGCA配列で始まるDNA又は111−113
位のCCT配列で始まるDNAを包含する。更に本発明に係る
遺伝子は、507〜509位のTGA配列に終り、1位のAに始
まるDNA,48〜50位のATG配列で始まるDNA,108〜110位のG
CA配列で始まるDNAまたは111〜113位のCCT配列で始まる
DNAを包含する。更に本発明に係る遺伝子は、801位のC
で終り、1位のAで始まるDNA,48−50位のATGで始まるD
NA,108−110位のGCAで始まるDNAまたは111−113位のCCT
配列で始まるDNAを包含する。本発明に係る遺伝子はま
たpoly(A)で終り、48−50位のATG配列から始まるDN
A,108−110位のGCA配列で始まるDNAまたは111−113位の
CCT配列で始まるDNAを含む。また、本発明は、アミノ酸
配列I,II,IIIに相当する塩基配列を有する遺伝子を含
む。アミノ酸配列Iの中で1個ないしそれ以上のアミノ
酸を欠くポリペプチド、あるいはアミノ酸配列Iの中の
1個ないしそれ以上のアミノ酸が1個ないしそれ以上の
アミノ酸で置換されたポリペプチドはIL−2活性を有す
ることもあり、従ってこの様なポリペプチドをコードす
る遺伝子は本発明に係る遺伝子として使える。同様にア
ミノ酸配列I,IIまたはIIIに対して1個ないしそれ以上
のアミノ酸を表現し得る1個ないしそれ以上の塩基を余
分に結合した遺伝子であっても追加されたアミノ酸が、
ポリペプチドのIL−2活性発現に邪魔しない限り本発明
の中に包含される。IL−2としてのポリペプチド機能を
阻害する追加アミノ酸配列を有する修飾領域であっても
新たに追加された領域が容易に除去出来るものならば本
発明に係る遺伝子として利用出来る。同じことはアミノ
酸配列I,IIおよびIIIに対応する遺伝子のアミノ酸配列
I,IIおよびIIIのC−末端にアミノ酸追加をコードするD
NAが3′−末端に追加結合せしめたDNAの場合にも言え
る。上記のようなアミノ酸の欠失,付加あるいは置換
は、出願前周知技術である部位特異的変異技術(Geneti
c Engineering,vol.3,pp1−32,Plenum Press,New York
(1981),Nucleic Acid Research,vol.10,pp6487−6500
(1982)等)により実施することができ、1もしくは数
個のアミノ酸の欠失,付加あるいは置換とは、部位特異
的変異技術により欠失,付加あるいは置換できる程度の
数のアミノ酸を意味する。従って、この様なポリペプチ
ドをコードする遺伝子の利用は、本発明に包含される。
宿主生細肪中でIL−2産生をする組換えDNA体により
形質転換された細菌あるいはエシェリヒア・コリは、次
の各種方法で作られる。例えば、IL−2・cDNAをコード
する配列を発現ベクターのプロモーター配列下流に挿入
する。あるいはプロモーター配列を持つcDNA片を発現ベ
クターのcDNA挿入の前あるいは後にIL−2をコードする
配列の上流に挿入することが出来る。
形質転換された細菌あるいはエシェリヒア・コリは、次
の各種方法で作られる。例えば、IL−2・cDNAをコード
する配列を発現ベクターのプロモーター配列下流に挿入
する。あるいはプロモーター配列を持つcDNA片を発現ベ
クターのcDNA挿入の前あるいは後にIL−2をコードする
配列の上流に挿入することが出来る。
IL−2−cDNAを発現し、IL−2−ポリペプチドを産生
する細菌あるいはエシェリヒア・コリの造成法を詳述す
れば以下の通りである。
する細菌あるいはエシェリヒア・コリの造成法を詳述す
れば以下の通りである。
(1) エシェリヒア・コリによるIL−2−cDNAの発現 エシェリヒア・コリ中でIL−2−cDNAを発現させるに
は、先ずcDNAを各種細菌プロモーターと結合せしめた
後、プロモーター下流にcDNAを含有するハイブリドプラ
スミドを作る。このプラスミドを、例えばエシェリヒア
・コリHB101に感染させ、ヒトIL−2活性を有する蛋白
を生合成する細菌がクローンされる。本来細菌のプロモ
ーターならば如何なるものでもcDNAに適当に接続されて
いればIL−2−cDNAを発現する。この様なcDNAの発現例
は以下のとおりである。
は、先ずcDNAを各種細菌プロモーターと結合せしめた
後、プロモーター下流にcDNAを含有するハイブリドプラ
スミドを作る。このプラスミドを、例えばエシェリヒア
・コリHB101に感染させ、ヒトIL−2活性を有する蛋白
を生合成する細菌がクローンされる。本来細菌のプロモ
ーターならば如何なるものでもcDNAに適当に接続されて
いればIL−2−cDNAを発現する。この様なcDNAの発現例
は以下のとおりである。
IL−2をコードするクローン化cDNAは第2図に示され
る様な153個のアミノ酸からなるポリペプチドをコード
する。本ポリペプチドの20個のアミノ酸に相当するN−
末端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分泌蛋白の特
徴でもある。この様な疎水性配列はシグナル配列と称し
分泌過程で切断される。故に、成熟IL−2ポリペプチド
は、153個のアミノ酸より少ない筈である。このことか
ら、成熟IL−2ポリペプチドをコードするcDNA部分を発
現させることが望ましく、IL−2シグナル配列相当部分
を発現させるのは望ましくはない。
る様な153個のアミノ酸からなるポリペプチドをコード
する。本ポリペプチドの20個のアミノ酸に相当するN−
末端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分泌蛋白の特
徴でもある。この様な疎水性配列はシグナル配列と称し
分泌過程で切断される。故に、成熟IL−2ポリペプチド
は、153個のアミノ酸より少ない筈である。このことか
ら、成熟IL−2ポリペプチドをコードするcDNA部分を発
現させることが望ましく、IL−2シグナル配列相当部分
を発現させるのは望ましくはない。
(i) プラスミドベクターpTrS−3の構築 pTrS−3は、エシェリヒア・コリTrpプロモーターを
含み、pTrS−3のリーダーペプチドのためのリボソーム
結合部位(SD配列)は既に報告されている(G.Miozzari
and Yanofsky J.Bacteriol.133,1457〜1466(197
8))。SD配列の下流13塩基対にあるATGコードンの存在
も報告されている(Nishi et al,生化学54,No.8.676(1
982))。このプラスミドベクターはまた、ATG開始配列
(第3図)の下流に一つのSph I部位を含んでいる。
含み、pTrS−3のリーダーペプチドのためのリボソーム
結合部位(SD配列)は既に報告されている(G.Miozzari
and Yanofsky J.Bacteriol.133,1457〜1466(197
8))。SD配列の下流13塩基対にあるATGコードンの存在
も報告されている(Nishi et al,生化学54,No.8.676(1
982))。このプラスミドベクターはまた、ATG開始配列
(第3図)の下流に一つのSph I部位を含んでいる。
IL−2・cDNAを発現させるため、先ずプラスミドをSp
h Iで消化しエシェリヒア・コリDNAポリメラーゼI(ク
レノウ(Klenow)フラグメント)または、バクテリオフ
ァージT4 DNAポリメラーゼIで処理し3′−位突き出し
末端を除去する(第4図(a))。プラスミドpIL−2
−50AをPst IおよびHgiA Iで2回消化し、より大きいcD
NA画分を単離する。次いでDNAをエシェリヒア・コリDNA
ポリメラーゼI(クレノウフラグメント)又はバクテリ
オファージT4 DNAポリメラーゼで処理して3′−突き出
し末端を切りはなす。この処理をしたcDNAは132個のア
ミノ酸のIL−2ポリペプチドをコードする(第4(a)
図)。このcDNAを上述のごとく前処理したpTrS−3プラ
スミドDNAに結合せしめ、ATG開始コードンをIL−2 cDNA
のCCT(Pro)配列につなぎ合せる。こうしてプラスミド
pT IL−2−22が得られる。Trpプロモーター配列とpT I
L−2−22のIL−2 cDNA配列の結合は第4(a)図に示
す。
h Iで消化しエシェリヒア・コリDNAポリメラーゼI(ク
レノウ(Klenow)フラグメント)または、バクテリオフ
ァージT4 DNAポリメラーゼIで処理し3′−位突き出し
末端を除去する(第4図(a))。プラスミドpIL−2
−50AをPst IおよびHgiA Iで2回消化し、より大きいcD
NA画分を単離する。次いでDNAをエシェリヒア・コリDNA
ポリメラーゼI(クレノウフラグメント)又はバクテリ
オファージT4 DNAポリメラーゼで処理して3′−突き出
し末端を切りはなす。この処理をしたcDNAは132個のア
ミノ酸のIL−2ポリペプチドをコードする(第4(a)
図)。このcDNAを上述のごとく前処理したpTrS−3プラ
スミドDNAに結合せしめ、ATG開始コードンをIL−2 cDNA
のCCT(Pro)配列につなぎ合せる。こうしてプラスミド
pT IL−2−22が得られる。Trpプロモーター配列とpT I
L−2−22のIL−2 cDNA配列の結合は第4(a)図に示
す。
プラスミドpT IL−2−22はエシェリヒア・コリによ
りプロリンから始まる132個のアミノ酸からなるIL−2
ポリペプチド合成を指令する。
りプロリンから始まる132個のアミノ酸からなるIL−2
ポリペプチド合成を指令する。
(ii)成熟IL−2はプロリンの代りにN−末端アミノ酸
としてアラニン(21位)を含むこともあり、133個のア
ミノ酸から成るIL−2ポリペプチド合成を指示するプラ
スミドを以下の如く作ることができる。
としてアラニン(21位)を含むこともあり、133個のア
ミノ酸から成るIL−2ポリペプチド合成を指示するプラ
スミドを以下の如く作ることができる。
プラスミドpTrS−3はSD配列とATG配列との間に1つ
のCla I切断部位がある(第3図)。本プラスミドはCla
IとSa1 Iで切断される。プラスミドpIL−2−50AをPst
Iで部分分解し、エシェリヒア・コリDNAポリメラーゼ
Iで処理し、最も長いDNAを単離する。次いでDNAを制限
酵素Xho I切断部位を含む合成DNAリンカーと結合させ、
IL−2をコードする配列の3′−側下流にDNAリンカー
を導入したプラスミドpIL−2−50A(Xho)を含むクロ
ーンを単離する。プラスミドpIL−2−50A(Xho)を先
ずHgiA Iで切断し、エシェリヒア・コリ クレノウフラ
グメントまたはT4 DNAポリメラーゼで処理し、Xho Iで
消化すればcDNA画分が単離できる。このcDNAフラグメン
トをCla IおよびSal Iで前処理したpTrS−3 DNAに結合
させ第4(b)図の如く合成DNAにつなげる。かくしてA
laからスタートする133個のアミノ酸から成るIL−2ポ
リペプチドをエシェリヒア・コリ中で合成させるプラス
ミドpTIL−2−21が得られる。(第4(b)図)。同様
なことはXho Iリンカーを使用しなくとも作られる。
のCla I切断部位がある(第3図)。本プラスミドはCla
IとSa1 Iで切断される。プラスミドpIL−2−50AをPst
Iで部分分解し、エシェリヒア・コリDNAポリメラーゼ
Iで処理し、最も長いDNAを単離する。次いでDNAを制限
酵素Xho I切断部位を含む合成DNAリンカーと結合させ、
IL−2をコードする配列の3′−側下流にDNAリンカー
を導入したプラスミドpIL−2−50A(Xho)を含むクロ
ーンを単離する。プラスミドpIL−2−50A(Xho)を先
ずHgiA Iで切断し、エシェリヒア・コリ クレノウフラ
グメントまたはT4 DNAポリメラーゼで処理し、Xho Iで
消化すればcDNA画分が単離できる。このcDNAフラグメン
トをCla IおよびSal Iで前処理したpTrS−3 DNAに結合
させ第4(b)図の如く合成DNAにつなげる。かくしてA
laからスタートする133個のアミノ酸から成るIL−2ポ
リペプチドをエシェリヒア・コリ中で合成させるプラス
ミドpTIL−2−21が得られる。(第4(b)図)。同様
なことはXho Iリンカーを使用しなくとも作られる。
(iii)異ったN−末端アミノ酸を有する異った大きさ
のIL−2ポリペプチドはpTrS−3発現プラスミドベクタ
ーを用いても作られる。以下に示すごとく、pIL−2−5
0AにクローンされたIL−2 cDNAはヌクレオチド結合部位
81−85に唯一つだけDde I部分を有する。プラスミドpIL
−2−50A(Xho)を、Dbe Iで切断し、cDNAのより大き
い区分を含有するDNA画分を単離する。本画分はpBR322
より3000塩基対を有するDNAを含んでいる(第4(c)
図)。DNA画分をエクソヌクレアーゼBal 31で処理し、
次いでXho Iで切断する。ここで得られたDNAをSph Iで
切断したpTrS−3と結合せしめ、Klenowフラグメントま
たはT4 DNAポリメラーゼで処理し次いでSal Iで消化す
る(第4(c)図)。つなぎ合せたDNAをエシェリヒア
・コリHB 101に感染させ、ヒトIL−2を発現するクロー
ンを検索する。これらのクローンは色色な大きさのヒト
IL−2を発現する筈である。何故ならばヒトIL−2のN
−末端領域に相当するDNAは種々切断除去されるからで
ある。かくしてIL−2 cDNAを含有するpTIL−2−14と15
が得られる。
のIL−2ポリペプチドはpTrS−3発現プラスミドベクタ
ーを用いても作られる。以下に示すごとく、pIL−2−5
0AにクローンされたIL−2 cDNAはヌクレオチド結合部位
81−85に唯一つだけDde I部分を有する。プラスミドpIL
−2−50A(Xho)を、Dbe Iで切断し、cDNAのより大き
い区分を含有するDNA画分を単離する。本画分はpBR322
より3000塩基対を有するDNAを含んでいる(第4(c)
図)。DNA画分をエクソヌクレアーゼBal 31で処理し、
次いでXho Iで切断する。ここで得られたDNAをSph Iで
切断したpTrS−3と結合せしめ、Klenowフラグメントま
たはT4 DNAポリメラーゼで処理し次いでSal Iで消化す
る(第4(c)図)。つなぎ合せたDNAをエシェリヒア
・コリHB 101に感染させ、ヒトIL−2を発現するクロー
ンを検索する。これらのクローンは色色な大きさのヒト
IL−2を発現する筈である。何故ならばヒトIL−2のN
−末端領域に相当するDNAは種々切断除去されるからで
ある。かくしてIL−2 cDNAを含有するpTIL−2−14と15
が得られる。
(iv)IL−2 cDNAはまたpKT 218(Talmageより提供を受
けた;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,P.3369〜3373(198
0))を用いても発現可能である。プラスミドpKT 218は
Pst Iで切断し、pIL−2−50AをHgiA IとPst Iで切断
(第5図)して得たIL−2 cDNA挿入部分とつなぎ合わせ
る。出来上ったプラスミドpKIL−2−21は第5図に示し
たように、蛋白合成開始の始発位に配列を有している。
したがって、このプラスミドpKIL−2−21はIL−2の13
3個のアミノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ酸からなる
両者が融合したポリペプチドからなり、これをエシェリ
ヒア・コリ中で合成することが出来る筈である(最初の
メチオニンはエシェリヒア・コリでは切断除去され
る)。
けた;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,P.3369〜3373(198
0))を用いても発現可能である。プラスミドpKT 218は
Pst Iで切断し、pIL−2−50AをHgiA IとPst Iで切断
(第5図)して得たIL−2 cDNA挿入部分とつなぎ合わせ
る。出来上ったプラスミドpKIL−2−21は第5図に示し
たように、蛋白合成開始の始発位に配列を有している。
したがって、このプラスミドpKIL−2−21はIL−2の13
3個のアミノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ酸からなる
両者が融合したポリペプチドからなり、これをエシェリ
ヒア・コリ中で合成することが出来る筈である(最初の
メチオニンはエシェリヒア・コリでは切断除去され
る)。
(v)p−BR・322にtufBに対するプロモーター配列を
挿入したプラスミドpTuBlp−5の発現は既に行なわれて
いる(谷口ら,生化学53 966(1981))。このプラスミ
ドは一つのCla I切断部位を含み、第6図に示すごとく
本切断部位はSD配列の2塩基対だけ下流に位置する。pT
rS−3もまたSD配列とATG始発配列の間にある一つのCla
I切断部位を含み、同時にこのCla I部位はpTrS−3とI
L−2 cDNAを用いて発現用プラスミドを作る過程で壊さ
れないので細菌TrpプロモーターをtufBプロモーターで
置き換えることは極めて簡単である。従ってヒトIL−2
cDNAはtufBプロモーターの制御下で発現される。例えば
pTIL−2−22をCla IとPvu IIで切断し、IL−2 cDNAを
含むDNA画分を分離する。
挿入したプラスミドpTuBlp−5の発現は既に行なわれて
いる(谷口ら,生化学53 966(1981))。このプラスミ
ドは一つのCla I切断部位を含み、第6図に示すごとく
本切断部位はSD配列の2塩基対だけ下流に位置する。pT
rS−3もまたSD配列とATG始発配列の間にある一つのCla
I切断部位を含み、同時にこのCla I部位はpTrS−3とI
L−2 cDNAを用いて発現用プラスミドを作る過程で壊さ
れないので細菌TrpプロモーターをtufBプロモーターで
置き換えることは極めて簡単である。従ってヒトIL−2
cDNAはtufBプロモーターの制御下で発現される。例えば
pTIL−2−22をCla IとPvu IIで切断し、IL−2 cDNAを
含むDNA画分を分離する。
次いでこの画分をpTuBlP−5でつなぎ合わせ、Cla I
とPvu IIで予め切断後、第6図に図示される様にプラス
ミドpTuIL−2−22が造成される。IL−2活性はプラス
ミドpTuIL−2−22を含むエシェリヒア・コリHB101の抽
出液に検出できる。
とPvu IIで予め切断後、第6図に図示される様にプラス
ミドpTuIL−2−22が造成される。IL−2活性はプラス
ミドpTuIL−2−22を含むエシェリヒア・コリHB101の抽
出液に検出できる。
(vi)例えばpTIL−2−21を使っても、また基本的には
pTrS−3を用いて達成したすべての発現用プラスミドを
用いることによっても同様に造成できる。また例えばpT
uIL−2−22をCla Iで切断し、Bal 31またはSIまたはDN
AポリメラーゼI(エシェリヒア・コリ)にてDNAの塩基
対2−3個を除去または補充し再度プラスミドをつなげ
ることによってSDおよびATG配列の距離を至適の長さに
することも可能である。
pTrS−3を用いて達成したすべての発現用プラスミドを
用いることによっても同様に造成できる。また例えばpT
uIL−2−22をCla Iで切断し、Bal 31またはSIまたはDN
AポリメラーゼI(エシェリヒア・コリ)にてDNAの塩基
対2−3個を除去または補充し再度プラスミドをつなげ
ることによってSDおよびATG配列の距離を至適の長さに
することも可能である。
本発明の組換えDNA体により形質転換された原核生物
細胞、あるいはエシェリヒア・コリを培養して、組換え
DNA体を増巾し、またはIL−2ポリペプチドを生産する
ことができる。この培養な通常の方法で行なわれる。
細胞、あるいはエシェリヒア・コリを培養して、組換え
DNA体を増巾し、またはIL−2ポリペプチドを生産する
ことができる。この培養な通常の方法で行なわれる。
細胞内または細胞外に生産されたIL−2は硫安沈澱,
塩類除去のための透析(常圧または減圧下),ゲル濾
過,クロマトグラフィー,等電点平板上濃縮,ゲル電気
泳動,高速液体クロマトグラフィー(以下HPLCと略
記),(イオン交換,ゲル濾過並びに逆相クロマトグラ
フィー),及び色素結合担体,IL−2に対するモノクロ
ーナル抗体を結合した活性化セファロース4B又はレクチ
ン結合セファロース4B等によるアフィニティクロマトグ
ラフィー等,公知の方法によって回収することができ
る。IL−2の単離精製法はWatsonら(J.Exp.Med.,150,8
49−861(1979),Gillis et al,J.Immunol.,124,1954−
1962(1980),Mochizuki et al,J.Immunol.Methods 39,
185−201(1980),Welte,K et al,J.Kxp.Med.,156,454
−464(1982))によって報告されている。
塩類除去のための透析(常圧または減圧下),ゲル濾
過,クロマトグラフィー,等電点平板上濃縮,ゲル電気
泳動,高速液体クロマトグラフィー(以下HPLCと略
記),(イオン交換,ゲル濾過並びに逆相クロマトグラ
フィー),及び色素結合担体,IL−2に対するモノクロ
ーナル抗体を結合した活性化セファロース4B又はレクチ
ン結合セファロース4B等によるアフィニティクロマトグ
ラフィー等,公知の方法によって回収することができ
る。IL−2の単離精製法はWatsonら(J.Exp.Med.,150,8
49−861(1979),Gillis et al,J.Immunol.,124,1954−
1962(1980),Mochizuki et al,J.Immunol.Methods 39,
185−201(1980),Welte,K et al,J.Kxp.Med.,156,454
−464(1982))によって報告されている。
かくして得られたポリペプチドはマイトジェン刺激に
よって哺乳動物細胞から作られるIL−2について知られ
ているものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し
IL−2活性を有する。分子量は約15000ダルトンでありI
L−2活性は、Igsorb(Enzyme Center)の様な免疫吸着
剤の有無にかかわらず完全に中和され、またはモノクロ
ーナル抗IL−2抗体で沈澱した。免疫電気泳動におい
て、IL−2ポリペプチドは、対応する抗IL−2抗体に対
して唯1個の沈降線を示す。IL−2活性は2−メルカプ
トエタノールで還元後も安定であり、DNAse及びRNAse処
理しても、又56℃,30分熱処理しても安定である。活性
はpH2〜9で安定である。この様にして生産されたIL−
2はモノクローナルな機能を有するT細胞(細胞障害性
Tリンパ球)の増殖を促進し、胸線細胞の***を強め、
更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特異的細胞障
害Tリンパ球への分化を惹き起こす。また、YAC−1細
胞やRL 1細胞に対するナチュラルキラー細胞の活性化の
増強に役立つ。
よって哺乳動物細胞から作られるIL−2について知られ
ているものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し
IL−2活性を有する。分子量は約15000ダルトンでありI
L−2活性は、Igsorb(Enzyme Center)の様な免疫吸着
剤の有無にかかわらず完全に中和され、またはモノクロ
ーナル抗IL−2抗体で沈澱した。免疫電気泳動におい
て、IL−2ポリペプチドは、対応する抗IL−2抗体に対
して唯1個の沈降線を示す。IL−2活性は2−メルカプ
トエタノールで還元後も安定であり、DNAse及びRNAse処
理しても、又56℃,30分熱処理しても安定である。活性
はpH2〜9で安定である。この様にして生産されたIL−
2はモノクローナルな機能を有するT細胞(細胞障害性
Tリンパ球)の増殖を促進し、胸線細胞の***を強め、
更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特異的細胞障
害Tリンパ球への分化を惹き起こす。また、YAC−1細
胞やRL 1細胞に対するナチュラルキラー細胞の活性化の
増強に役立つ。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例1 (1) ヒトT細胞系白血病細胞株であるジュルカット
細胞(日本、***および米国では自由に入手可能であ
る)を10%FCSを含むRPMI 1640培地にけん濁し、X線照
射装置Exs 150/300−4(東芝・日本)により50秒間、
室温で10,000レントゲンに達するまで照射した。その後
照射された細胞は上述の培地中、初期細胞密度1×105
個/mlで5%炭酸ガス、37℃のインキュベーター中で5
日間培養した。
細胞(日本、***および米国では自由に入手可能であ
る)を10%FCSを含むRPMI 1640培地にけん濁し、X線照
射装置Exs 150/300−4(東芝・日本)により50秒間、
室温で10,000レントゲンに達するまで照射した。その後
照射された細胞は上述の培地中、初期細胞密度1×105
個/mlで5%炭酸ガス、37℃のインキュベーター中で5
日間培養した。
この変異細胞(0.2個/穴)を96穴の平底のマイクロ
プレートの10穴にまき、5%炭酸ガス、37℃のインキュ
ベーター中で21日間培養した。生育してくる穴から得ら
れるクローンはクローン量を増加させるため新たな培地
へ移し、その増加したクローンはConA 50μg/ml存在下
で初期細胞密度1×106個/mlで24時間培養した。そして
IL−2活性は前述の方法に従って測定した。
プレートの10穴にまき、5%炭酸ガス、37℃のインキュ
ベーター中で21日間培養した。生育してくる穴から得ら
れるクローンはクローン量を増加させるため新たな培地
へ移し、その増加したクローンはConA 50μg/ml存在下
で初期細胞密度1×106個/mlで24時間培養した。そして
IL−2活性は前述の方法に従って測定した。
この結果、ジュルカット−111(ATCC CRL 8129)(以
後“J−111"と称する)と命名されたヒトT細胞株が親
株のジュルカットからクローン化、選択され、この細胞
のIL−2産生能は親株の40倍に増加していた。
後“J−111"と称する)と命名されたヒトT細胞株が親
株のジュルカットからクローン化、選択され、この細胞
のIL−2産生能は親株の40倍に増加していた。
このクローン化したJ−111細胞株は通常条件下で増
殖し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとん
ど同じであった。
殖し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとん
ど同じであった。
(2) J−111細胞(1×105個/ml)を無血清合成培
地RIT C 55−9(Sato,T.et al.,Exp.Cell Res.,138,12
7−134,(1982))1000mlに接種し、ローラー培養ボト
ル(ファルコン3027)内で37℃、4日間培養し、増殖し
た細胞を遠心分離により取得した。この細胞を再び4×
106個/mlとなるよう上述のConA 25μg/ml含有培地に接
種した。ローラー培養ボトル(ファルコン)4バッチの
各々に細胞を接種した培養液100mlを入れ、6時間回転
培養した。
地RIT C 55−9(Sato,T.et al.,Exp.Cell Res.,138,12
7−134,(1982))1000mlに接種し、ローラー培養ボト
ル(ファルコン3027)内で37℃、4日間培養し、増殖し
た細胞を遠心分離により取得した。この細胞を再び4×
106個/mlとなるよう上述のConA 25μg/ml含有培地に接
種した。ローラー培養ボトル(ファルコン)4バッチの
各々に細胞を接種した培養液100mlを入れ、6時間回転
培養した。
(3) このようにConA 25μg/mlで6時間刺激したジ
ュルカット細胞(1.2×106)は生理食塩−リン酸緩衝液
(以後PBSと略す)8,000mlに懸濁した。この細胞は遠心
操作により2回洗浄し、ヌクレアーゼ阻害剤であるリボ
ヌクレオシド−バナデイル複合体(10mM)を含有するRS
B溶液(10mlトリス−塩酸緩衝液、pH7.5、10mM NaCl、
1.5mM MgCl2)800mlに再懸濁した。その後、界面活性剤
NP−40を最終濃度0.05%となるように加え、ゆっくり混
合し、細胞核を3,000rpm、5分、4℃下で遠心し分離し
た。SDS(0.5%)及びEDTA(5mM)を上清液へ加え、細
胞質RNAを上清液と同量のフェノールを加え抽出した。
フェノールによる抽出を3回繰返した後、RNAは2倍量
のエタノールにより沈澱され、本沈澱物を遠心により集
め、pH7.5の10mMトリス−塩酸に溶解した。得られたRNA
量は196mgであった。
ュルカット細胞(1.2×106)は生理食塩−リン酸緩衝液
(以後PBSと略す)8,000mlに懸濁した。この細胞は遠心
操作により2回洗浄し、ヌクレアーゼ阻害剤であるリボ
ヌクレオシド−バナデイル複合体(10mM)を含有するRS
B溶液(10mlトリス−塩酸緩衝液、pH7.5、10mM NaCl、
1.5mM MgCl2)800mlに再懸濁した。その後、界面活性剤
NP−40を最終濃度0.05%となるように加え、ゆっくり混
合し、細胞核を3,000rpm、5分、4℃下で遠心し分離し
た。SDS(0.5%)及びEDTA(5mM)を上清液へ加え、細
胞質RNAを上清液と同量のフェノールを加え抽出した。
フェノールによる抽出を3回繰返した後、RNAは2倍量
のエタノールにより沈澱され、本沈澱物を遠心により集
め、pH7.5の10mMトリス−塩酸に溶解した。得られたRNA
量は196mgであった。
mRNAの分画はオリゴ(dT)−セルロース(P.L.Bioche
micals,Type 7)のアフィニティークロマトグラフィー
を使用し行った。吸着液は20mMトリス−塩酸、0.5M NaC
l、1mM EDTA及び0.5%SDSを含むpH7.5の溶液であり、溶
出はカラムを緩衝液(20mMトリス−塩酸、pH7.5、0.5M
NaCl、1mM EDTA)で洗浄後、水と10mMトリス−塩酸(pH
7.5)で交互に行った。溶出により得られたmRNAは3.6mg
であった。次にこの得られたmRNA 2.4mgを庶糖密度勾配
遠心法(50mMトリス−塩酸、1mM EDTA、0.2 M NaClを含
むpH7.5溶液中で庶糖密度勾配5−25%、26,000rpmで4
℃下24時間)により分画した。mRNAの11から12Sが分画N
o.12、13、14へ分画され、各々59μg、46μg、60μg
であった。
micals,Type 7)のアフィニティークロマトグラフィー
を使用し行った。吸着液は20mMトリス−塩酸、0.5M NaC
l、1mM EDTA及び0.5%SDSを含むpH7.5の溶液であり、溶
出はカラムを緩衝液(20mMトリス−塩酸、pH7.5、0.5M
NaCl、1mM EDTA)で洗浄後、水と10mMトリス−塩酸(pH
7.5)で交互に行った。溶出により得られたmRNAは3.6mg
であった。次にこの得られたmRNA 2.4mgを庶糖密度勾配
遠心法(50mMトリス−塩酸、1mM EDTA、0.2 M NaClを含
むpH7.5溶液中で庶糖密度勾配5−25%、26,000rpmで4
℃下24時間)により分画した。mRNAの11から12Sが分画N
o.12、13、14へ分画され、各々59μg、46μg、60μg
であった。
(4) No.13の分画に得られたmRNAをアフリカツメガ
エル(Xenopus Iaevis)の卵母細胞へ注入した(50ng m
RNA/卵母細胞)。この卵母細胞の培養液をIL−2活性測
定した。表1に示す如く、3H−チミジン(3H−TdR)の
取込みの上昇及び活性化Tリンパ球数の増加が確認さ
れ、明らかにこの分画中のmRNAはヒトIL−2 mRNAを含ん
でいる事が立証された。
エル(Xenopus Iaevis)の卵母細胞へ注入した(50ng m
RNA/卵母細胞)。この卵母細胞の培養液をIL−2活性測
定した。表1に示す如く、3H−チミジン(3H−TdR)の
取込みの上昇及び活性化Tリンパ球数の増加が確認さ
れ、明らかにこの分画中のmRNAはヒトIL−2 mRNAを含ん
でいる事が立証された。
(5) その後IL−2 mRNAを含む11〜12S mRNAのNo.13
分画からin vitroでcDNAを合成した。
分画からin vitroでcDNAを合成した。
組換え体DNAはプラスミドベクターpBR 322と構成し
た。組換え体DNAをエシェリヒア・コリに計質転換し、I
L−2 cDNAクローンを獲得したクローンを以下に示す如
き方法により選択した。
た。組換え体DNAをエシェリヒア・コリに計質転換し、I
L−2 cDNAクローンを獲得したクローンを以下に示す如
き方法により選択した。
(5−1)50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、30mM
NaCl、6mM MgCl2、5mMジチオスレイトール(以後DTTと
略す)、0.5mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP(dCTPは32P
放射標識したものを含む)、0.7μgオリゴ(dT)10、1
0μg mRNA及び15単位AMV逆転写酵素(J.W.Beard)を混
合し、41℃下で90分保った。反応終了後、DNAはフェノ
ール処理後エタノール沈澱物として回収し、このDNAを2
0mMトリスおよび1mM EDTAを含むpH7.5の溶液に溶解し
た。
NaCl、6mM MgCl2、5mMジチオスレイトール(以後DTTと
略す)、0.5mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP(dCTPは32P
放射標識したものを含む)、0.7μgオリゴ(dT)10、1
0μg mRNA及び15単位AMV逆転写酵素(J.W.Beard)を混
合し、41℃下で90分保った。反応終了後、DNAはフェノ
ール処理後エタノール沈澱物として回収し、このDNAを2
0mMトリスおよび1mM EDTAを含むpH7.5の溶液に溶解し
た。
ss−cDNA2.5μgが合成された。本反応液よりmRNAを
除くために反応液にNaOH溶液を加えて0.33N NaOH溶液と
し、室温にて15時間置き、次いでpH7.5の1Mトリス−塩
酸緩衝液を同量加えて中和しセファデックスG−50カラ
ムをカラムを通した。回収されたcDNAは1.8μgであっ
た。
除くために反応液にNaOH溶液を加えて0.33N NaOH溶液と
し、室温にて15時間置き、次いでpH7.5の1Mトリス−塩
酸緩衝液を同量加えて中和しセファデックスG−50カラ
ムをカラムを通した。回収されたcDNAは1.8μgであっ
た。
(5−2)50mMリン酸緩衝液(pH7.5)、10mM MgC
l2、10mM DTT、0.75mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP(dC
TPは3Hで標識したものを含む)、1.8μg ss−cDNAおよ
び8単位ポリメレースI(BRL、米国)を混ぜ15時間、1
5℃で反応を行った。反応終了後DNAをフェノール及びク
ロロホルム処理後エタノール沈澱物として回収した。1.
10μgのds−cDNAが生成した。50mM酢酸ソーダ(pH4.
5)、0.2M NaCl、1mM ZnCl2および1.10μg二本鎖cDNA
の混合物を37℃で30分間インキュベートした後0.25単位
のヌクレアーゼS1(三井、日本)を加え、さらに15分間
インキュベートした。反応終了後、フェノール処理を2
回行った反応生成物をセファデックスG−50へ供し、二
本鎖cDNA 0.55μgを得た。
l2、10mM DTT、0.75mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP(dC
TPは3Hで標識したものを含む)、1.8μg ss−cDNAおよ
び8単位ポリメレースI(BRL、米国)を混ぜ15時間、1
5℃で反応を行った。反応終了後DNAをフェノール及びク
ロロホルム処理後エタノール沈澱物として回収した。1.
10μgのds−cDNAが生成した。50mM酢酸ソーダ(pH4.
5)、0.2M NaCl、1mM ZnCl2および1.10μg二本鎖cDNA
の混合物を37℃で30分間インキュベートした後0.25単位
のヌクレアーゼS1(三井、日本)を加え、さらに15分間
インキュベートした。反応終了後、フェノール処理を2
回行った反応生成物をセファデックスG−50へ供し、二
本鎖cDNA 0.55μgを得た。
(5−3)0.14Mカコジル酸カリウム、30mMトリス塩
基、0.1mM DTT、1mM CoCl2、0.64mM 32P−dCTP(比活性
2.7×106cpm/n mol)、0.55μg ds−cDNAおよび5単位
のターミナルトランスフェラーゼ(BRL)を混合し、37
℃で7分間インキュベートした後フェノール処理し、次
いでセファデックスG−50カラムに供し、エタノール沈
澱物として0.50μg DNAを得た。回収したこのDNAは約50
個のdCMP残基が両3′末端に付加されている事が判明し
た。
基、0.1mM DTT、1mM CoCl2、0.64mM 32P−dCTP(比活性
2.7×106cpm/n mol)、0.55μg ds−cDNAおよび5単位
のターミナルトランスフェラーゼ(BRL)を混合し、37
℃で7分間インキュベートした後フェノール処理し、次
いでセファデックスG−50カラムに供し、エタノール沈
澱物として0.50μg DNAを得た。回収したこのDNAは約50
個のdCMP残基が両3′末端に付加されている事が判明し
た。
pBR 322 DNA 10μgを制限酵素Pst Iで切断したのちd
CTPのかわりにdGTPを用いたこと以外は前述のds−cDNA
にdCMP鎖を付加したときに用いた方法と全く同じ条件に
より、切断したDNAの両3′末端にdGMP鎖を付加した。
CTPのかわりにdGTPを用いたこと以外は前述のds−cDNA
にdCMP鎖を付加したときに用いた方法と全く同じ条件に
より、切断したDNAの両3′末端にdGMP鎖を付加した。
(5−4)50mMトリス−塩酸(pH7.5)0.1M NaCl、5m
M DETA、0.05μg dGMP残基付加pBR 322および0.01μg d
CMP残基付加cDNAをまず65℃で2時間、次いで46℃で120
分間、さらに37℃で60分間、そして室温で60分間インキ
ュベートした。
M DETA、0.05μg dGMP残基付加pBR 322および0.01μg d
CMP残基付加cDNAをまず65℃で2時間、次いで46℃で120
分間、さらに37℃で60分間、そして室温で60分間インキ
ュベートした。
エシェリヒア・コリχ1776(Curtiss III,R.et al.,i
n Molecular Cloning of Recombinant DNA,(W.A.Scott
&R.Werner ed.)Academic Press,(1977))を50mlの
L培地(100μg/mlのジアミノピメリン酸、50μg/mlの
チミジン、1%トリプトファン、0.5%酵母エキス、0.5
% NaClおよび0.1%グルコースを含む)に接種し培養液
の吸光度が562nmで0.3付近になるまで37℃で振とう培養
した。培養終了後、培養液を30分間0℃に保持し、菌体
を遠心分離により集め、5mMトリス−塩酸(pH7.6)、0.
1M NaCl、5mM MgCl2および10mM RbClを含む溶液25mlで
2回洗浄した。
n Molecular Cloning of Recombinant DNA,(W.A.Scott
&R.Werner ed.)Academic Press,(1977))を50mlの
L培地(100μg/mlのジアミノピメリン酸、50μg/mlの
チミジン、1%トリプトファン、0.5%酵母エキス、0.5
% NaClおよび0.1%グルコースを含む)に接種し培養液
の吸光度が562nmで0.3付近になるまで37℃で振とう培養
した。培養終了後、培養液を30分間0℃に保持し、菌体
を遠心分離により集め、5mMトリス−塩酸(pH7.6)、0.
1M NaCl、5mM MgCl2および10mM RbClを含む溶液25mlで
2回洗浄した。
得られた菌体を5mMトリス−塩酸(pH7.6)、0.25M KC
l、5mM MgCl2、0.1M CaCl2および10mM RbClを含む溶液2
0mlに懸濁し、0℃で25分間静置後、菌体を集め上記と
同じ溶液1mlに菌体を再懸濁し、得られた菌体懸濁液の
0.2mlに上記組換え体DNAを入れ、0℃で60分間静置し
た。その後L培地0.7mlを加え37℃で30分間振とう培養
した。こうして得られた培養液(0.1ml)を100μg/mlジ
アミノピメリン酸、50μg/mlチミジンおよび15μg/mlテ
トラサイクリンを含むL培地の1.5%寒天培地上に一面
に塗抹し、37℃で2日間インキュベートした。
l、5mM MgCl2、0.1M CaCl2および10mM RbClを含む溶液2
0mlに懸濁し、0℃で25分間静置後、菌体を集め上記と
同じ溶液1mlに菌体を再懸濁し、得られた菌体懸濁液の
0.2mlに上記組換え体DNAを入れ、0℃で60分間静置し
た。その後L培地0.7mlを加え37℃で30分間振とう培養
した。こうして得られた培養液(0.1ml)を100μg/mlジ
アミノピメリン酸、50μg/mlチミジンおよび15μg/mlテ
トラサイクリンを含むL培地の1.5%寒天培地上に一面
に塗抹し、37℃で2日間インキュベートした。
(5−5)出現した432のコロニーを18のグループに
分け、(その各グループは24の異なるバクテリアクロー
ンを含む)100μg/mlのジアミノピメリン酸、50μg/ml
のチミジンおよび10μgのテトラサイクリンを含むL培
地200mlに接種し、37℃で5〜7時間振とう培養した。
次に最終濃度170μg/mlとなるように加えられたクロラ
ムフェニコールを含む新たなL培地200mlを加え、さら
に一晩培養した。
分け、(その各グループは24の異なるバクテリアクロー
ンを含む)100μg/mlのジアミノピメリン酸、50μg/ml
のチミジンおよび10μgのテトラサイクリンを含むL培
地200mlに接種し、37℃で5〜7時間振とう培養した。
次に最終濃度170μg/mlとなるように加えられたクロラ
ムフェニコールを含む新たなL培地200mlを加え、さら
に一晩培養した。
このようにして増強されたプラスミドDNAを常法に従
い精製した。
い精製した。
IL−2 cDNAを有するクローンはmRNAハイブリダイゼー
ション−トランスレーションアッセイ(以後H−Tアッ
セイと略称する)により選択した。
ション−トランスレーションアッセイ(以後H−Tアッ
セイと略称する)により選択した。
ここで用いられたH−Tアッセイは以下に示す如く行
った。
った。
純化したDNA(25μg)を制限酵素Hind IIIにより開
裂しフェノールで3回、フェノール−クロロホルムおよ
ひクロロホルムで各々処理し、エタノールで沈澱させ80
%エタノールで洗浄し、80%ホルムアミド40mlに溶解し
た。
裂しフェノールで3回、フェノール−クロロホルムおよ
ひクロロホルムで各々処理し、エタノールで沈澱させ80
%エタノールで洗浄し、80%ホルムアミド40mlに溶解し
た。
反応液を変性させるため90℃で5分間加熱後10×SSC
(1.5M NaCl、0.15Mクエン酸ソーダ)で1.3mlに希釈し
た。その後、本DNAをニトロセルロース濾紙上に固定
し、これを80℃で3時間乾燥させ、50%ホルムアミド、
20mM Pipes(pH6.5)、0.75M NaCl、5mM EDTA、0.2%SD
S及びJ−111細胞由来のpoly(A)mRNA250μgを含む
溶液中で37℃、18時間インキュベートし、濾紙上に固定
されたDNAとIL−2 mRNAをハイブリダイズした。
(1.5M NaCl、0.15Mクエン酸ソーダ)で1.3mlに希釈し
た。その後、本DNAをニトロセルロース濾紙上に固定
し、これを80℃で3時間乾燥させ、50%ホルムアミド、
20mM Pipes(pH6.5)、0.75M NaCl、5mM EDTA、0.2%SD
S及びJ−111細胞由来のpoly(A)mRNA250μgを含む
溶液中で37℃、18時間インキュベートし、濾紙上に固定
されたDNAとIL−2 mRNAをハイブリダイズした。
次にその濾紙を65℃で3回pH6.5の10mM Pipes,0.15M
NaCl溶液、1mM Pipes,10mM NaCl溶液で洗浄し0.5mM EDT
A、0.1%SDS溶液で95℃、1分間処理し濾紙からハイブ
リダイズしたmRNAを回収した。
NaCl溶液、1mM Pipes,10mM NaCl溶液で洗浄し0.5mM EDT
A、0.1%SDS溶液で95℃、1分間処理し濾紙からハイブ
リダイズしたmRNAを回収した。
このようにして抽出したmRNAを常法に従ってオリゴdT
−セルロースカラム上で精製し、アフリカツメガエル卵
母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−2活性を測定し
た。
−セルロースカラム上で精製し、アフリカツメガエル卵
母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−2活性を測定し
た。
各々24クローンからなる18グループのうちの1グルー
プが前述の3H−TdR取込みによるアッセイで48単位/mlの
IL−2活性陽性を示した。一方他のグループは明らかに
陰性であった。
プが前述の3H−TdR取込みによるアッセイで48単位/mlの
IL−2活性陽性を示した。一方他のグループは明らかに
陰性であった。
次に、陽性のグループに属する24の各単一コロニーを
既述と同じ組成のL培地200mlへ接種し、37℃で5〜7
時間好気的に培養し、同様にクロラムフェニコール含有
のL培地をさらに添加した。
既述と同じ組成のL培地200mlへ接種し、37℃で5〜7
時間好気的に培養し、同様にクロラムフェニコール含有
のL培地をさらに添加した。
一晩培養して、プラスミドDNAを増強後、プラスミドD
NAを同様に標準法に従って精製した。Hind IIIで各プラ
スミドDNA約5μgを開裂後、各プラスミドを同様にニ
トロセルロース濾紙へ固定した。その濾紙をIL−2 mRNA
とハイブリダイズし、ハイブリダイズしたmRNAをアフリ
カツメガエル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−
2活性を測定するため回収した。
NAを同様に標準法に従って精製した。Hind IIIで各プラ
スミドDNA約5μgを開裂後、各プラスミドを同様にニ
トロセルロース濾紙へ固定した。その濾紙をIL−2 mRNA
とハイブリダイズし、ハイブリダイズしたmRNAをアフリ
カツメガエル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−
2活性を測定するため回収した。
表2に示す如く、p3−16と表示した単一コロニーから
精製されたプラスミドDNAのみが陽性のIL−2活性を示
した。それ故、本クローンがIL−2 cDNAを有するクロー
ン(E.coli χ 1776/p3−16AJ11995(FERM−BP−22
5))と同定された。このようにプラスミドDNA、p3−16
はIL−2 mRNAと特異的ハイブリッドを形成する能力のあ
るDNA(IL−2遺伝子)を確かに有している事が確認さ
れた。
精製されたプラスミドDNAのみが陽性のIL−2活性を示
した。それ故、本クローンがIL−2 cDNAを有するクロー
ン(E.coli χ 1776/p3−16AJ11995(FERM−BP−22
5))と同定された。このようにプラスミドDNA、p3−16
はIL−2 mRNAと特異的ハイブリッドを形成する能力のあ
るDNA(IL−2遺伝子)を確かに有している事が確認さ
れた。
プラスミドp3−16のcDNAインサートは制限酵素Xba I
により1部位で、又Bst NIにより2部位(Xba I開裂部
位の上流及び下流)で切断されるという特徴を示した。
しかしながら、プラスミドp3−16は約650塩基対より構
成されるcDNAインサートを含んでおり、これは明らかに
11〜12Sの大きさのIL−2 mRNAの一部分に相当するもの
である。それ故、他のcDNAライブラリーを、鋳型として
IL−2 mRNAを用い、Land等の方法(Land et al.,Nuclei
c Acids Res.,vol 9,p2551,(1981))に従って作製し
た。一本鎖cDNA(1.6μg)を、dCMP残基を付加したIL
−2 mRNA 4μgを用いて合成し、そしてds−cDNAを、DN
AポリメラーゼI(Klenow断片)によりプライマーとし
てオリゴ(dG)12=18を用いる事により合成した。680
塩基対DNAサイズマーカー(size marker)より長いcDNA
(0.6μg)は庶糖密度勾配遠心法によって得られ、標
準的なG−Cテイリング法によりpBR 322のPst I部位へ
挿入出来た。
により1部位で、又Bst NIにより2部位(Xba I開裂部
位の上流及び下流)で切断されるという特徴を示した。
しかしながら、プラスミドp3−16は約650塩基対より構
成されるcDNAインサートを含んでおり、これは明らかに
11〜12Sの大きさのIL−2 mRNAの一部分に相当するもの
である。それ故、他のcDNAライブラリーを、鋳型として
IL−2 mRNAを用い、Land等の方法(Land et al.,Nuclei
c Acids Res.,vol 9,p2551,(1981))に従って作製し
た。一本鎖cDNA(1.6μg)を、dCMP残基を付加したIL
−2 mRNA 4μgを用いて合成し、そしてds−cDNAを、DN
AポリメラーゼI(Klenow断片)によりプライマーとし
てオリゴ(dG)12=18を用いる事により合成した。680
塩基対DNAサイズマーカー(size marker)より長いcDNA
(0.6μg)は庶糖密度勾配遠心法によって得られ、標
準的なG−Cテイリング法によりpBR 322のPst I部位へ
挿入出来た。
組換えDNA体によるエシェリヒア・コリχ1776の形質
転換後、その場所でプローブとしてニック翻訳された
(nick−translated)p3−16 cDNAインサートを用いたG
runstein−Hognessのハイブリダイゼーション法により
約2000コロニーを選別し、およそ850塩基対を含むプラ
スミドpIL2−50Aを含有するコロニー及び形質転換され
たクローン(エシェリヒア・コリχ1776/pIL2−50A、AJ
11996(FERM−BP−226))を同定した。pIL2−50AのcDN
Aインサートの制限酵素切断図を第1図に示した。
転換後、その場所でプローブとしてニック翻訳された
(nick−translated)p3−16 cDNAインサートを用いたG
runstein−Hognessのハイブリダイゼーション法により
約2000コロニーを選別し、およそ850塩基対を含むプラ
スミドpIL2−50Aを含有するコロニー及び形質転換され
たクローン(エシェリヒア・コリχ1776/pIL2−50A、AJ
11996(FERM−BP−226))を同定した。pIL2−50AのcDN
Aインサートの制限酵素切断図を第1図に示した。
形質転換されたエシェリヒア・コリχ1776/pIL2−50A
からのIL−2ペプタイドをコードしている遺伝子を単離
するため、プラスミドDNAを通常法に従い、菌体からDNA
を単離後制限酵素Pst Iにより切断した。この処理によ
り生成する2つのDNA断片のうちより小さな断片はIL−
2ペプタイドをコードしているDNA遺伝子であった。pIL
2−50AからのPst Iインサートの完全なヌクレオチド配
列はMaxam and Gilbertの方法(Maxam,A.W.et al.,Enzy
m.65,,499−560,1980)により決定した。全構造を第2
図(a)に示す。
からのIL−2ペプタイドをコードしている遺伝子を単離
するため、プラスミドDNAを通常法に従い、菌体からDNA
を単離後制限酵素Pst Iにより切断した。この処理によ
り生成する2つのDNA断片のうちより小さな断片はIL−
2ペプタイドをコードしているDNA遺伝子であった。pIL
2−50AからのPst Iインサートの完全なヌクレオチド配
列はMaxam and Gilbertの方法(Maxam,A.W.et al.,Enzy
m.65,,499−560,1980)により決定した。全構造を第2
図(a)に示す。
実施例2 実施例1に記載された方法に従ってジュルカット細胞
からクローン化された構成的IL−2産生細胞株J−A 18
86(ATCC CRL 8130)は同様にローラー培養ボトルで生
育した。生育した細胞は初期細胞密度1×106個/mlで新
鮮な合成培地RITC−55−9に再懸濁し、培養開始8時間
後に、実施例1で詳細に示したステップに従って3×10
9個の細胞から11〜12S分画としてのIL−2mRNA抽出のた
めに使用された。
からクローン化された構成的IL−2産生細胞株J−A 18
86(ATCC CRL 8130)は同様にローラー培養ボトルで生
育した。生育した細胞は初期細胞密度1×106個/mlで新
鮮な合成培地RITC−55−9に再懸濁し、培養開始8時間
後に、実施例1で詳細に示したステップに従って3×10
9個の細胞から11〜12S分画としてのIL−2mRNA抽出のた
めに使用された。
ds−cDNAは実施例1と同様に合成され、600塩基対よ
り長いcDNA(2.4μg)が庶糖密度勾配遠心法による分
画により得られた。次にこのcDNAをターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを用い、dCMP残基で
伸長し、その50ngがdGMPで伸長したPst I切断pBR 322 2
50ngとアニールされた。
り長いcDNA(2.4μg)が庶糖密度勾配遠心法による分
画により得られた。次にこのcDNAをターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを用い、dCMP残基で
伸長し、その50ngがdGMPで伸長したPst I切断pBR 322 2
50ngとアニールされた。
生成したハイブリッドプラスミドはエシェリヒア・コ
リχ1776に形質転換され、約4,000クローンのトランス
ホーマントが得られた。
リχ1776に形質転換され、約4,000クローンのトランス
ホーマントが得られた。
Grunstein−Hognessの方法に従い、プローブとして用
いたプラスミド3−16cDNAと相補的な3個のクローンが
選択された。すなわち、このようにして選択された形質
転換されたクローンはヒトIL−2遺伝子を有するクロー
ンである。
いたプラスミド3−16cDNAと相補的な3個のクローンが
選択された。すなわち、このようにして選択された形質
転換されたクローンはヒトIL−2遺伝子を有するクロー
ンである。
実施例3 エシェリヒア・コリ細胞でヒトIL−2の合成を指令す
るプラスミドを以下の如き方法で構築した。
るプラスミドを以下の如き方法で構築した。
プラスミドpT IL2−22は第4(a)図で図解されてい
る如く、一連の改変の方法によりpTrS−3(Nishi T.,T
aniguchi T.et al.,SEIKAGAKU 53,967,(1981),同54,
676(1982))及びIL−2 cDNAを含むpIL2−50Aから構築
した。プラスミドpTrS−3はTrpプロモーターとpBR 322
のEcoR I部位とCla I部位の間にShine Dalgarno(以後S
Dと略号する)の領域の挿入を含む。
る如く、一連の改変の方法によりpTrS−3(Nishi T.,T
aniguchi T.et al.,SEIKAGAKU 53,967,(1981),同54,
676(1982))及びIL−2 cDNAを含むpIL2−50Aから構築
した。プラスミドpTrS−3はTrpプロモーターとpBR 322
のEcoR I部位とCla I部位の間にShine Dalgarno(以後S
Dと略号する)の領域の挿入を含む。
本プラスミドはまた第3図で示した如く、単一のSph
I部位と同様にSD配列の下流13bpにATGイニシエーション
コードンを含んでいる。
I部位と同様にSD配列の下流13bpにATGイニシエーション
コードンを含んでいる。
言及している蛋白に対応するDNA配列がATGコードンの
丁度下流の部位に挿入されるとそのベクターはこの蛋白
を生産するには非常に効果的である。このATGコードン
はpTrS−3のSph I消化に引続きT4 DNAポリメラーゼに
よる処理によって生成される。それ故プラスミドpTrS−
3(30μg)は制限酵素Sph Iで、常法により切断さ
れ、引続きフェノール,クロロホルム処理,エタノール
沈澱法により回収され両末端がT4 DNAポリメラーゼ処理
によりフラッシュにされた。
丁度下流の部位に挿入されるとそのベクターはこの蛋白
を生産するには非常に効果的である。このATGコードン
はpTrS−3のSph I消化に引続きT4 DNAポリメラーゼに
よる処理によって生成される。それ故プラスミドpTrS−
3(30μg)は制限酵素Sph Iで、常法により切断さ
れ、引続きフェノール,クロロホルム処理,エタノール
沈澱法により回収され両末端がT4 DNAポリメラーゼ処理
によりフラッシュにされた。
次に、同様の方法によりフェノール,クロロホルム処
理及びエタノール沈澱法によりDNA(21.4μg)を回収
した。他方IL−2 cDNAを含むpIL2−50A 380μgはPst I
により切断され、IL−2 cDNAインサートはアガロースゲ
ル電気泳動により単離された。cDNAインサート(11μ
g)はHgiA Iにより切断され、T4 DNAポリメラーゼによ
って処理され、大きい方の部分のDNA10μgがアガロー
スゲル電気泳動により単離された。本法に従って132個
のアミノ酸をコードするcDNA(7.2μg)が得られ、こ
のDNA断片はブラントエンドを有していた(第4(a)
図)。
理及びエタノール沈澱法によりDNA(21.4μg)を回収
した。他方IL−2 cDNAを含むpIL2−50A 380μgはPst I
により切断され、IL−2 cDNAインサートはアガロースゲ
ル電気泳動により単離された。cDNAインサート(11μ
g)はHgiA Iにより切断され、T4 DNAポリメラーゼによ
って処理され、大きい方の部分のDNA10μgがアガロー
スゲル電気泳動により単離された。本法に従って132個
のアミノ酸をコードするcDNA(7.2μg)が得られ、こ
のDNA断片はブラントエンドを有していた(第4(a)
図)。
次に、このようにして得られたcDNA断片をATG配列の
丁度下流で、前もってSpH Iにより消化されたT4 DNAポ
リメラーゼにより処理されたpTrS−3ベクターへ連結し
た。このように連結したプラスミドはそれから、常法に
従いエシェリヒア・コリHB 101へ形質転換された。この
連結は次のようにして行った。IL−2 cDNA(0.4μg)
の前述の大きい方の断片およびpTrS−3ベクターDNA0.2
μgを6.6mM MgCl2,1mM ATPおよび10mM DTTを含むpH7.5
の66mMトリス−塩酸中でT4 DNAリガーゼ0.8単位と共に
混合し、混合物を4℃,一晩反応させた。アンピシリン
を含むL培地寒天プレート上に出現するトランスホーマ
ントの中で、132個のアミノ酸をコードしているIL−2 c
DNA部分を含むプラスミドを持つコロニーをその場でコ
ロニーハイブリダイゼーションアッセイ法により選択し
た。こうして選択したコロニーを再び培養(10ml)し、
リゾチーム処理および凍結,融解による処理によりプラ
スミドDNAを調製した。このプラスミドDNAをPst IとXba
Iで切断し、その結果の生成物をアガロースゲル電気泳
動により分析し、cDNAがpTrS−3のATG配列の後に正し
い方向で凍結しているpTIL−2−22を同定した。
丁度下流で、前もってSpH Iにより消化されたT4 DNAポ
リメラーゼにより処理されたpTrS−3ベクターへ連結し
た。このように連結したプラスミドはそれから、常法に
従いエシェリヒア・コリHB 101へ形質転換された。この
連結は次のようにして行った。IL−2 cDNA(0.4μg)
の前述の大きい方の断片およびpTrS−3ベクターDNA0.2
μgを6.6mM MgCl2,1mM ATPおよび10mM DTTを含むpH7.5
の66mMトリス−塩酸中でT4 DNAリガーゼ0.8単位と共に
混合し、混合物を4℃,一晩反応させた。アンピシリン
を含むL培地寒天プレート上に出現するトランスホーマ
ントの中で、132個のアミノ酸をコードしているIL−2 c
DNA部分を含むプラスミドを持つコロニーをその場でコ
ロニーハイブリダイゼーションアッセイ法により選択し
た。こうして選択したコロニーを再び培養(10ml)し、
リゾチーム処理および凍結,融解による処理によりプラ
スミドDNAを調製した。このプラスミドDNAをPst IとXba
Iで切断し、その結果の生成物をアガロースゲル電気泳
動により分析し、cDNAがpTrS−3のATG配列の後に正し
い方向で凍結しているpTIL−2−22を同定した。
pTIL−2−22を含むエシェリヒア・コリHB 101を微生
物の増殖のために知られている通常法の下に培養した。
細胞は25μg/mlストレプトマイシンおよび25μg/mlのア
ンピシリンを含むχ培地(2.5%バクトトリプトン,1%
酵母エキス,0.1%グルコース,20mM MgSO4,50mMトリス−
塩酸,pH7.5)10ml中で37℃で一晩生育させた。ついで培
養懸濁液1mlを同じχ培地(100ml)へ接種し、37℃で培
養した。650mμのO.D.がおよそ1.5−2.0に達した時点で
3−インドールアクリル酸(IAA)を加えた。インデュ
ーサーの添加3時間後に、細胞を集め、20mMトリス−塩
酸(pH7.5,30mM NaClを含む)で洗浄し、同じ緩衝液8ml
中に再び懸濁した。
物の増殖のために知られている通常法の下に培養した。
細胞は25μg/mlストレプトマイシンおよび25μg/mlのア
ンピシリンを含むχ培地(2.5%バクトトリプトン,1%
酵母エキス,0.1%グルコース,20mM MgSO4,50mMトリス−
塩酸,pH7.5)10ml中で37℃で一晩生育させた。ついで培
養懸濁液1mlを同じχ培地(100ml)へ接種し、37℃で培
養した。650mμのO.D.がおよそ1.5−2.0に達した時点で
3−インドールアクリル酸(IAA)を加えた。インデュ
ーサーの添加3時間後に、細胞を集め、20mMトリス−塩
酸(pH7.5,30mM NaClを含む)で洗浄し、同じ緩衝液8ml
中に再び懸濁した。
Trpプロモーターの効果的な機能発現のために、IAAの
如きインデューサーを最終濃度50μg/mlになるように添
加した。かくして細菌細胞中に産生される蛋白をソニッ
ク処理(0℃,2分間)またはリゾチーム(8μg)消化
(0℃,20分)に引き続き凍結融解を3回行う事により
抽出した。この方法により、一般的にIL−2は細胞から
抽出された。抽出されたIL−2活性は10,000から120,00
0単位/mlの範囲であった。
如きインデューサーを最終濃度50μg/mlになるように添
加した。かくして細菌細胞中に産生される蛋白をソニッ
ク処理(0℃,2分間)またはリゾチーム(8μg)消化
(0℃,20分)に引き続き凍結融解を3回行う事により
抽出した。この方法により、一般的にIL−2は細胞から
抽出された。抽出されたIL−2活性は10,000から120,00
0単位/mlの範囲であった。
pTIL2−22を含むエシェリヒア・コリHB 101(AJ1200
9)はFERM−BP245として寄託されている。
9)はFERM−BP245として寄託されている。
実施例4 IL−2 cDNAを有するプラスミドpTuIL2−22はpTuBlP−
5(Taniguchi,T.et al.,Seikagaku,53,966,1981)およ
び実施例3に示したpTIL2−22から第6図に図解した方
法により構築された。プラスミドpTuBlP−5はpBR322中
にtufBのプロモーター配列が挿入されている。このプラ
スミドはまた単一のCla I部位を含んでおり、これは第
6図に示した如くSD配列の2bp下流に位置している。pTr
S−3もまたSD配列とATGイニシェーションコードンの間
にCla I部位を含んでおり、このCla I部位は実施例3に
記載した如くpTrS−3およびIL−2 cDNAを用いる事によ
る発現プラスミド構築中に破壊されないことから、Trp
プロモーターをtufBプロモーターに置き換える事はきわ
めて簡単であり、その結果IL−2 cDNAはtufBプロモータ
ーの制御下で発現される。
5(Taniguchi,T.et al.,Seikagaku,53,966,1981)およ
び実施例3に示したpTIL2−22から第6図に図解した方
法により構築された。プラスミドpTuBlP−5はpBR322中
にtufBのプロモーター配列が挿入されている。このプラ
スミドはまた単一のCla I部位を含んでおり、これは第
6図に示した如くSD配列の2bp下流に位置している。pTr
S−3もまたSD配列とATGイニシェーションコードンの間
にCla I部位を含んでおり、このCla I部位は実施例3に
記載した如くpTrS−3およびIL−2 cDNAを用いる事によ
る発現プラスミド構築中に破壊されないことから、Trp
プロモーターをtufBプロモーターに置き換える事はきわ
めて簡単であり、その結果IL−2 cDNAはtufBプロモータ
ーの制御下で発現される。
それ故、プラスミドpTIL2−22(30μg)は制限酵素C
la IとPvu IIにより通常の方法で切断された。IL−2 cD
NAを含む断片(約2.2kb)はアガロースゲル電気泳動に
より単離精製され、3μgのDNAが回収された。他方,pT
uBlP−5ベクター20μgが同様にCla IとPvu IIにより
切断され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大きい方の断
片(約3.4kb)がアガロースゲル電気泳動により単離精
製され、DNA3.5μgが回収された。次にこのようにして
得られた2個の断片は1つはtufBプロモーターを含み
(約3.4kb)、他方はIL−2 cDNAを含んでおり(約2.2k
b)以下に示す如く連結した。
la IとPvu IIにより通常の方法で切断された。IL−2 cD
NAを含む断片(約2.2kb)はアガロースゲル電気泳動に
より単離精製され、3μgのDNAが回収された。他方,pT
uBlP−5ベクター20μgが同様にCla IとPvu IIにより
切断され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大きい方の断
片(約3.4kb)がアガロースゲル電気泳動により単離精
製され、DNA3.5μgが回収された。次にこのようにして
得られた2個の断片は1つはtufBプロモーターを含み
(約3.4kb)、他方はIL−2 cDNAを含んでおり(約2.2k
b)以下に示す如く連結した。
IL−2 cDNA(1.2μg)を含む断片およびtufBプロモ
ーターを含む断片0.3μgを6.6mM MgCl2,1mM ATPおよび
10mM DTTを含むpH7.5の66mMトリス−塩酸中で、T4 DNA
リガーゼ0.8単位と混合し、4℃で一晩反応した。次に
このようにして連結したプラスミドは常法に従いエシェ
リヒア・コリHB 101へ形質転換された。
ーターを含む断片0.3μgを6.6mM MgCl2,1mM ATPおよび
10mM DTTを含むpH7.5の66mMトリス−塩酸中で、T4 DNA
リガーゼ0.8単位と混合し、4℃で一晩反応した。次に
このようにして連結したプラスミドは常法に従いエシェ
リヒア・コリHB 101へ形質転換された。
アンピシリンを含むL培地寒天プレート上に出現する
トランスホーマントの中で第6図のpTuIL2−22の如くIL
−2 cDNA部分を含む組み換え体DNAを持つ8個のコロニ
ーが選択され、プラスミドDNAは実施例3に記載された
如く調製された。
トランスホーマントの中で第6図のpTuIL2−22の如くIL
−2 cDNA部分を含む組み換え体DNAを持つ8個のコロニ
ーが選択され、プラスミドDNAは実施例3に記載された
如く調製された。
pTuIL2−22を含むエシェリヒア・コリHB 101を37℃で
L培地(100ml)中で培養した。650mμのO.D.がおよそ
0.5−1.0に達した時、菌体を集め、30mM NaClを含む20m
Mトリス−塩酸(pH7.5)で洗浄し、同じ緩衝液2ml中に
再び懸濁した。このようにして産生した蛋白は実施例3
と同様に抽出された。抽出液中のIL−2活性は6,000か
ら56,000単位/mlの範囲であった。
L培地(100ml)中で培養した。650mμのO.D.がおよそ
0.5−1.0に達した時、菌体を集め、30mM NaClを含む20m
Mトリス−塩酸(pH7.5)で洗浄し、同じ緩衝液2ml中に
再び懸濁した。このようにして産生した蛋白は実施例3
と同様に抽出された。抽出液中のIL−2活性は6,000か
ら56,000単位/mlの範囲であった。
pTuIL2−22を含むエシェリヒア・コリHB 101(AJ1201
0)はFERM−BP 246として寄託されている。
0)はFERM−BP 246として寄託されている。
実施例5 IL−2 cDNAを有するプラスミドpGIL2−22はgGL101(R
oberts,T.M.and Laucer G.D.,Meth Enzym.,68,473−48
3,(1979),Gail Lauer,et al,J.Mol.Appl.Genet.,1,N
o.2,139〜147(1981),T.Taniguchi,et al,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,77,No.9,5230〜5233(1980),Egon Amann,
et al,Gene,25,167〜178(1983))と実施例3に示され
たpTIL2−22とから構築された。
oberts,T.M.and Laucer G.D.,Meth Enzym.,68,473−48
3,(1979),Gail Lauer,et al,J.Mol.Appl.Genet.,1,N
o.2,139〜147(1981),T.Taniguchi,et al,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,77,No.9,5230〜5233(1980),Egon Amann,
et al,Gene,25,167〜178(1983))と実施例3に示され
たpTIL2−22とから構築された。
すなわち、lacプロモーターを含むプラスミドpGL 101
(20μg)が制限酵素Pvu IIで常法により切断され、引
続きフェノール,クロロホルム処理およびエタノール沈
澱法により17μgのDNAが回収された。他方、pTIL2−22
(75μg)の方はCla IおよびSal Iで切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりIL−2 cDNAが含むDNA断片2.2μg
を回収した。この断片はDNAポリメラーゼI(クレノウ
断片)で処理する事によりフラッシュにされた。次にこ
のようにして得られた2個の断片(0.25μgおよび0.66
μg)を実施例4と同じ方法でT4 DNAリガーゼ1.0単位
でもって連結した。かくしてこの連結したプラスミドは
常法に従いエシェリヒア・コリHB 101に形質転換され
た。トランスホーマントの中で、IL−2 cDNAを含むCla
I−Sal I断片の挿入を有するトランスホーマント32Pラ
ベルしたIL−2 cDNAをプローブとして選択した。次にこ
れ等のトランスホーマントを、アンピシリン25μg/mlを
含む10mlのχ培地中で培養し、実施例3で記載した方法
によりプラスミドDNAを調製した。かくしてlacプロモー
ターの丁度下流にIL−2 cDNAの開始配列ATGを有するプ
ラスミドDNAはPst IおよびXba Iでの切断部位を検定す
る事により得られた。このようにして得られたpGIL2−2
2を含むエシェリヒア・コリHB 101は25μg/mlアンピシ
リンおよび25μg/mlストレプトマイシンを含有するL培
地100mlに接種し培養した。650mμのO.D.が約0.5に達し
た時イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノサイド
(IPTG)を1mMの濃度で加え、1時間後に菌体を集め、
実施例4に記載した方法に従って菌体抽出液を調製し
た。抽出液のIL−2活性は6,000から80,000単位/mlの範
囲であった。
(20μg)が制限酵素Pvu IIで常法により切断され、引
続きフェノール,クロロホルム処理およびエタノール沈
澱法により17μgのDNAが回収された。他方、pTIL2−22
(75μg)の方はCla IおよびSal Iで切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりIL−2 cDNAが含むDNA断片2.2μg
を回収した。この断片はDNAポリメラーゼI(クレノウ
断片)で処理する事によりフラッシュにされた。次にこ
のようにして得られた2個の断片(0.25μgおよび0.66
μg)を実施例4と同じ方法でT4 DNAリガーゼ1.0単位
でもって連結した。かくしてこの連結したプラスミドは
常法に従いエシェリヒア・コリHB 101に形質転換され
た。トランスホーマントの中で、IL−2 cDNAを含むCla
I−Sal I断片の挿入を有するトランスホーマント32Pラ
ベルしたIL−2 cDNAをプローブとして選択した。次にこ
れ等のトランスホーマントを、アンピシリン25μg/mlを
含む10mlのχ培地中で培養し、実施例3で記載した方法
によりプラスミドDNAを調製した。かくしてlacプロモー
ターの丁度下流にIL−2 cDNAの開始配列ATGを有するプ
ラスミドDNAはPst IおよびXba Iでの切断部位を検定す
る事により得られた。このようにして得られたpGIL2−2
2を含むエシェリヒア・コリHB 101は25μg/mlアンピシ
リンおよび25μg/mlストレプトマイシンを含有するL培
地100mlに接種し培養した。650mμのO.D.が約0.5に達し
た時イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノサイド
(IPTG)を1mMの濃度で加え、1時間後に菌体を集め、
実施例4に記載した方法に従って菌体抽出液を調製し
た。抽出液のIL−2活性は6,000から80,000単位/mlの範
囲であった。
pGIL2−22を含むエシェリヒア・コリHB 101(AJ 1201
1)はFERM−BP 247として寄託されている。
1)はFERM−BP 247として寄託されている。
実施例6 プラスミドpTrS−3(10μg)を先ず制限酵素Sal I
で切断しSal I部位をDNAポリメラーゼ(クレノウ断片)
あるいはT4 DNAポリメラーゼ処理によりフラッシュ(fl
ush)にした。
で切断しSal I部位をDNAポリメラーゼ(クレノウ断片)
あるいはT4 DNAポリメラーゼ処理によりフラッシュ(fl
ush)にした。
Cla Iで切断後、Trpプロモーター領域を有する大きい
方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳動により
単離精製し、DNA3μgを回収した。
方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳動により
単離精製し、DNA3μgを回収した。
他方、pIL2−50AのPst I切断により得られるcDNAイン
サート11μgがHgiAIで切断され、T4 DNAポリメラーゼ
処理され、大きい方の断片がアガロースゲル電気泳動に
より単離,精製された。このようにしてIL−2の132個
のアミノ酸をコードするcDNA断片が、7.2μg得られ
た。次に、trPプロモーター(上記)を含む断片0.45μ
g,IL−2 cDNAを含むHgiAI−Pst I断片0.5μgおよび合
成オリゴヌクレオチド(5′)CGATAAGCTATGGCA
(3′)と(3′)TATTCGATACCGT(5′)(各々20pmo
le)は両方とも5′末端でリン酸化されているが、これ
等を実施例3に記載されている方法と同じ方法でT4 DNA
リガーゼ1単位で連結した(第4図(b))。このよう
に連結されたプラスミドはエシェリヒア・コリHB 101に
形質転換された。出現したトランスホーマントの中で、
目標とするトランスホーマントは次のようにして選択し
た。まず最初に、IL−2 cDNAおよび合成オルゴヌクレオ
チドの両方とハイブリダイズ可能なトランスホーマント
がコロニーハイブリダイゼーション法により選択され
た。次に、ATGGCA配列の丁度下流に第2図(a)の111
から113の位置のCTT配列から始まるDNA断片(CCTACT…
……)が挿入されているプラスミドDNAを持ったトラン
スホーマントをPst I,Xba I切断個所を検定することに
より選択した。
サート11μgがHgiAIで切断され、T4 DNAポリメラーゼ
処理され、大きい方の断片がアガロースゲル電気泳動に
より単離,精製された。このようにしてIL−2の132個
のアミノ酸をコードするcDNA断片が、7.2μg得られ
た。次に、trPプロモーター(上記)を含む断片0.45μ
g,IL−2 cDNAを含むHgiAI−Pst I断片0.5μgおよび合
成オリゴヌクレオチド(5′)CGATAAGCTATGGCA
(3′)と(3′)TATTCGATACCGT(5′)(各々20pmo
le)は両方とも5′末端でリン酸化されているが、これ
等を実施例3に記載されている方法と同じ方法でT4 DNA
リガーゼ1単位で連結した(第4図(b))。このよう
に連結されたプラスミドはエシェリヒア・コリHB 101に
形質転換された。出現したトランスホーマントの中で、
目標とするトランスホーマントは次のようにして選択し
た。まず最初に、IL−2 cDNAおよび合成オルゴヌクレオ
チドの両方とハイブリダイズ可能なトランスホーマント
がコロニーハイブリダイゼーション法により選択され
た。次に、ATGGCA配列の丁度下流に第2図(a)の111
から113の位置のCTT配列から始まるDNA断片(CCTACT…
……)が挿入されているプラスミドDNAを持ったトラン
スホーマントをPst I,Xba I切断個所を検定することに
より選択した。
pTIL2−21aまたはpTIL2−21bを含む上記のトランスホ
ーマントを実施例3に示す方法によりL培地中で培養
し、そして実施例3に示す方法により分析した時トラン
スホーマントの菌体抽出物には高いIL−2活性が認めら
れた。pTIL2−21aを有するエシェリヒア・コリHB 101
(AJ 12013)およびpTIL2−21bを有するエシェリヒア・
コリ(AJ 12014)を有するエシェリヒア・コリHB 101は
それぞれFERM−BP 248,EFRM−BP 249として寄託されて
いる。
ーマントを実施例3に示す方法によりL培地中で培養
し、そして実施例3に示す方法により分析した時トラン
スホーマントの菌体抽出物には高いIL−2活性が認めら
れた。pTIL2−21aを有するエシェリヒア・コリHB 101
(AJ 12013)およびpTIL2−21bを有するエシェリヒア・
コリ(AJ 12014)を有するエシェリヒア・コリHB 101は
それぞれFERM−BP 248,EFRM−BP 249として寄託されて
いる。
上記の実施例で用いられた宿主,エシェリヒア・コリ
χ1776およびHB 101(Boyer H.W.et al.,J.Mol.Biol.4
1,459,(1669))は公知であり、容易に入手可能であ
る。更につけ加えれば、トランスホーマント中の組換え
DNA体を遊離させるためにL培地で37℃でトランスホー
マントを培養し、テトラサイクリンおよびアンピシリン
に感受性となった菌体を分離すれば寄託したトランスホ
ーマントから宿主は容易に得られる。
χ1776およびHB 101(Boyer H.W.et al.,J.Mol.Biol.4
1,459,(1669))は公知であり、容易に入手可能であ
る。更につけ加えれば、トランスホーマント中の組換え
DNA体を遊離させるためにL培地で37℃でトランスホー
マントを培養し、テトラサイクリンおよびアンピシリン
に感受性となった菌体を分離すれば寄託したトランスホ
ーマントから宿主は容易に得られる。
プラスミドベクターpBR 322(例えばベセスダリサー
チラボラトリーから購入可能),pCE−1,pTrS−3および
pGL 101は公知であり容易に入手可能である。更ひ、常
法によりトランスホーマント中の組換え体プラスミドを
分離することによってさらにそれぞれの実施例での説明
から当然に明らかな如くプラスミドベクターを分離する
ことによって寄託されたトランスホーマントからプラス
ミドベクターを得る事が出来る。pTrS−3およびpTuBlP
−5はそれぞれエシェリヒア・コリFERM−P6735(BP 32
8)およびエシェリヒア・コリATCC 31878として寄託さ
れている。
チラボラトリーから購入可能),pCE−1,pTrS−3および
pGL 101は公知であり容易に入手可能である。更ひ、常
法によりトランスホーマント中の組換え体プラスミドを
分離することによってさらにそれぞれの実施例での説明
から当然に明らかな如くプラスミドベクターを分離する
ことによって寄託されたトランスホーマントからプラス
ミドベクターを得る事が出来る。pTrS−3およびpTuBlP
−5はそれぞれエシェリヒア・コリFERM−P6735(BP 32
8)およびエシェリヒア・コリATCC 31878として寄託さ
れている。
第1図はIL−2活性を有するポリペプチドをコードした
クローン化遺伝子の制限酵素エンドヌクレアーゼによる
切断マップを示し、第2図(a)はクローン化遺伝子の
塩基配列を示し、第2図(b)はIL−2活性を有するポ
リペプチドのアミノ酸配列I,IIおよびIIIを示す。 第3図はプラスミドベクターpTrS−3を示す。 第4図(a),第4図(b)および第4図(c)はベク
ターとしてpTrS−3を使用している組換えDNAs(pTIL2
−22,pTIL2−21,pTIL2−14およびpTIL2−15)の構成を
示すフローチャートである。第5図はベクターとしてpK
T 218を使用している組換えDNA(pKIL2−21)の構成を
示すフローチャートである。第6図はベクターとしてpT
UBlP−5を使用している組換えDNA(pTuIL2−22)の構
成を示すフローチャートである。 図中、“A",“G",“C"および“T"はデオキシアデニル
酸,デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸およびチ
ミジル酸をそれぞれ表わす。
クローン化遺伝子の制限酵素エンドヌクレアーゼによる
切断マップを示し、第2図(a)はクローン化遺伝子の
塩基配列を示し、第2図(b)はIL−2活性を有するポ
リペプチドのアミノ酸配列I,IIおよびIIIを示す。 第3図はプラスミドベクターpTrS−3を示す。 第4図(a),第4図(b)および第4図(c)はベク
ターとしてpTrS−3を使用している組換えDNAs(pTIL2
−22,pTIL2−21,pTIL2−14およびpTIL2−15)の構成を
示すフローチャートである。第5図はベクターとしてpK
T 218を使用している組換えDNA(pKIL2−21)の構成を
示すフローチャートである。第6図はベクターとしてpT
UBlP−5を使用している組換えDNA(pTuIL2−22)の構
成を示すフローチャートである。 図中、“A",“G",“C"および“T"はデオキシアデニル
酸,デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸およびチ
ミジル酸をそれぞれ表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松井 裕 神奈川県横浜市金沢区並木1丁目19―16― 101 (72)発明者 鹿島 信一 神奈川県横浜市旭区若葉台2―21―603 (72)発明者 羽室 淳爾 神奈川県横浜市戸塚区深谷町241―32
Claims (32)
- 【請求項1】次の式 で示されるアミノ酸配列を有するヒトインターロイキン
2活性を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのア
ミノ酸配列に対し1もしくは数個のアミノ酸残基の欠
失、付加あるいは置換がされたアミノ酸配列を有するヒ
トインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含有する原核生物を形質転換するための
組換えDNA体。 - 【請求項2】ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配列
を含むものである特許請求の範囲第1項記載の原核生物
を形質転換するための組換えDNA体。 - 【請求項3】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有する
ものである特許請求の範囲第2項記載の原核生物を形質
転換するための組換えDNA体。 - 【請求項4】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有する
ものである特許請求の範囲第2項記載の原核生物を形質
転換するための組換えDNA体。 - 【請求項5】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有する
ものである特許請求の範囲第2項記載の原核生物を形質
転換するための組換えDNA体。 - 【請求項6】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有する
ものである特許請求の範囲第2項記載の原核生物を形質
転換するための組換えDNA体。 - 【請求項7】ポリペプチドをコードする遺伝子が次の塩
基配列を有するものである特許請求の範囲第4項記載の
原核生物を形質転換するための組換えDNA体。 - 【請求項8】ポリペプチドをコードする遺伝子が次の塩
基配列を有するものである特許請求の範囲第6項記載の
原核生物を形質転換するための組換えDNA体。 - 【請求項9】原核生物がエシェリヒア・コリである特許
請求の範囲第1項記載の組換えDNA体。 - 【請求項10】ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配
列を含むものである特許請求の範囲第9項記載のエシェ
リヒア・コリを形質転換するための組換えDNA体。 - 【請求項11】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有す
るものである特許請求の範囲第10項記載のエシェリヒア
・コリを形質転換するための組換えDNA体。 - 【請求項12】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有す
るものである特許請求の範囲第10項記載のエシェリヒア
・コリを形質転換するための組換えDNA体。 - 【請求項13】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有す
るものである特許請求の範囲第10項記載のエシェリヒア
・コリを形質転換するための組換えDNA体。 - 【請求項14】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有す
るものである特許請求の範囲第10項記載のエシェリヒア
・コリを形質転換するための組換えDNA体。 - 【請求項15】ポリペプチドをコードする遺伝子が次の
塩基配列を有するものである特許請求の範囲第12項記載
のエシェリヒア・コリを形質転換するための組換えDNA
体。 - 【請求項16】ポリペプチドをコードする遺伝子が次の
塩基配列を有するものである特許請求の範囲第14項記載
のエシェリヒア・コリを形質転換するための組換えDNA
体。 - 【請求項17】次の式 で示されるアミノ酸配列を有するヒトインターロイキン
2活性を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのア
ミノ酸配列に対し1もしくは数個のアミノ酸残基の欠
失、付加あるいは置換がされたアミノ酸配列を有するヒ
トインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含有する組換えDNA体により形質転換さ
れた原核生物。 - 【請求項18】ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配
列を含むものである特許請求の範囲第17項記載の原核生
物。 - 【請求項19】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有す
るものである特許請求の範囲第18項記載の原核生物。 - 【請求項20】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有す
るものである特許請求の範囲第18項記載の原核生物。 - 【請求項21】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有す
るものである特許請求の範囲第18項記載の原核生物。 - 【請求項22】ポリペプチドが次のアミノ酸配列を有す
るものである特許請求の範囲第18項記載の原核生物。 - 【請求項23】ポリペプチドをコードする遺伝子が下記
の塩基配列を有するものである特許請求の範囲第20項記
載の原核生物。 - 【請求項24】ポリペプチドをコードする遺伝子が次の
塩基配列を有するものである特許請求の範囲第22項記載
の原核生物。 - 【請求項25】原核生物がエシェリヒア・コリである特
許請求の範囲第17項記載の原核生物。 - 【請求項26】ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配
列を含むものである特許請求の範囲第25項記載のエシェ
リヒア・コリ。 - 【請求項27】ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配
列を有するものである特許請求の範囲第25項記載のエシ
ェリヒア・コリ。 - 【請求項28】ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配
列を有するものである特許請求の範囲第25項記載のエシ
ェリヒア・コリ。 - 【請求項29】ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配
列を有するものである特許請求の範囲第25項記載のエシ
ェリヒア・コリ。 - 【請求項30】ポリペプチドが分子中に次のアミノ酸配
列を有するものである特許請求の範囲第25項記載のエシ
ェリヒア・コリ。 - 【請求項31】ポリペプチドをコードする遺伝子が次の
塩基配列を有するものである特許請求の範囲第28項記載
のエシェリヒア・コリ。 - 【請求項32】ポリペプチドをコードする遺伝子が次の
塩基配列を有するものである特許請求の範囲第30項記載
のエシェリヒア・コリ。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP83101035A EP0091539B2 (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells |
EP83101035.0 | 1983-02-03 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58041358A Division JPS59144719A (ja) | 1983-02-03 | 1983-03-12 | ヒトインタ―ロイキン2活性を有するポリペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02195888A JPH02195888A (ja) | 1990-08-02 |
JPH0832239B2 true JPH0832239B2 (ja) | 1996-03-29 |
Family
ID=8190276
Family Applications (7)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58041358A Granted JPS59144719A (ja) | 1983-02-03 | 1983-03-12 | ヒトインタ―ロイキン2活性を有するポリペプチド |
JP59120492A Pending JPS6034915A (ja) | 1983-02-03 | 1984-06-12 | ポリペプチド |
JP1109058A Expired - Lifetime JPH0832238B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドの製造法 |
JP1109061A Expired - Lifetime JPH0659220B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
JP1109062A Expired - Lifetime JPH0832239B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えdna体および該組換えdna体により形質転換された原核生物細胞 |
JP1109059A Expired - Lifetime JPH0698000B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
JP1109060A Expired - Lifetime JPH0659219B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコートする遺伝子 |
Family Applications Before (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58041358A Granted JPS59144719A (ja) | 1983-02-03 | 1983-03-12 | ヒトインタ―ロイキン2活性を有するポリペプチド |
JP59120492A Pending JPS6034915A (ja) | 1983-02-03 | 1984-06-12 | ポリペプチド |
JP1109058A Expired - Lifetime JPH0832238B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドの製造法 |
JP1109061A Expired - Lifetime JPH0659220B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1109059A Expired - Lifetime JPH0698000B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
JP1109060A Expired - Lifetime JPH0659219B2 (ja) | 1983-02-03 | 1989-05-01 | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコートする遺伝子 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (7) | JPS59144719A (ja) |
SU (1) | SU1479005A3 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU579089B2 (en) * | 1983-02-08 | 1988-11-17 | Biogen, Inc. | Human interleukin-2-like polypeptides |
GB8303383D0 (en) * | 1983-02-08 | 1983-03-16 | Biogen Nv | Sequences recombinant dna molecules |
NZ210634A (en) * | 1983-12-23 | 1989-05-29 | Hoffmann La Roche | Purification of recombinant human interleukin - 2; pharmaceutical compositions |
WO1986006405A1 (en) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel transformant and its use |
WO1986006410A1 (en) * | 1985-04-30 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Process for increasing yield of interleukin-2 |
JPS62185098A (ja) * | 1986-02-10 | 1987-08-13 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | インタ−ロイキン−2活性を有するポリペプチド |
KR101041986B1 (ko) * | 2008-03-06 | 2011-06-16 | (주)한국비엠아이 | 인간 인터루킨-2의 대량 생산을 위한 신규한 균주 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6419879A (en) * | 1987-07-15 | 1989-01-23 | Asahi Optical Co Ltd | Tv viewer |
-
1983
- 1983-03-12 JP JP58041358A patent/JPS59144719A/ja active Granted
- 1983-12-14 SU SU833679351A patent/SU1479005A3/ru active
-
1984
- 1984-06-12 JP JP59120492A patent/JPS6034915A/ja active Pending
-
1989
- 1989-05-01 JP JP1109058A patent/JPH0832238B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-01 JP JP1109061A patent/JPH0659220B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-01 JP JP1109062A patent/JPH0832239B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-01 JP JP1109059A patent/JPH0698000B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-01 JP JP1109060A patent/JPH0659219B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6034915A (ja) | 1985-02-22 |
JPH0698000B2 (ja) | 1994-12-07 |
JPS59144719A (ja) | 1984-08-18 |
JPH0335795A (ja) | 1991-02-15 |
JPH02195888A (ja) | 1990-08-02 |
JPH0659219B2 (ja) | 1994-08-10 |
JPH02200189A (ja) | 1990-08-08 |
SU1479005A3 (ru) | 1989-05-07 |
JPH02195887A (ja) | 1990-08-02 |
JPH02195886A (ja) | 1990-08-02 |
JPH0832238B2 (ja) | 1996-03-29 |
JPH0142279B2 (ja) | 1989-09-11 |
JPH0659220B2 (ja) | 1994-08-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5620868A (en) | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell | |
US4582800A (en) | Novel vectors and method for controlling interferon expression | |
KR940010865B1 (ko) | 종양 괴사 인자의 생산 방법 및 종양 괴사 인자의 수율을 증가시키는 방법 | |
NL8104400A (nl) | Microbiele bereiding van menselijk fibroblast interferon. | |
EP0547026A1 (en) | Gene coding for human colony-stimulating factors | |
EP0118617A2 (en) | Interleukin-2 polypeptides | |
GB2079291A (en) | Interferons and process for their preparation | |
NZ205675A (en) | Swine growth hormone-like peptides (sgh) | |
US4761375A (en) | Human interleukin-2 cDNA sequence | |
JPH0832239B2 (ja) | ヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えdna体および該組換えdna体により形質転換された原核生物細胞 | |
DK173788B1 (da) | DNA-fragment, som koder for et polypeptid med interleukin-2-aktivitet, rekombinant DNA omfattende dette DNA-fragment, cellelinie transformeret med det rekombinante DNA og fremgangsmåde til fremstilling af interleukin-2 ved anvendelse af denne cellelinie | |
NZ224371A (en) | Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor (gm-csf) | |
EP0163603B1 (en) | A human t-cell growth factor | |
KR940002537B1 (ko) | 인터로이킨-2 폴리펩타이드를 코드화하는 dna 서열, 재조합체 dna, 및 인터로이킨-2의 제조방법 | |
JPH06102021B2 (ja) | 新規なポリペプチド | |
JPH0119879B2 (ja) | ||
JP2612158B2 (ja) | ヒト造血系細胞増殖増強因子 | |
AU583018B2 (en) | Gibbon interleukin | |
KR920002312B1 (ko) | 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자 | |
JP2721854B2 (ja) | 抗腫瘍活性物質 | |
BE898473A (fr) | Gène codé pour polypeptide d'interleukine-2, ADN recombinant portant ce gène, cellules vivantes contenant l'ADN recombinant et production d'interleukine-2 | |
JPH05294997A (ja) | 魚類のポリペプチド | |
JPH01165399A (ja) | 組換えヒトインターロイキン2およびその製造法 | |
JPH06336497A (ja) | B細胞分化因子及びその製造法 | |
JPH0832237B2 (ja) | ヒトインターロイキン2活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターおよび該ベクターにより形質転換された真核生物 |