JPS6034915A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、ポリペプチドに関し、特に詳しくはインタ
ーロイキン２活性を有するポリペプチドに関する。

インターロイキン２（以下ｒｒＬ−２Ｊと記す）は、Ｔ
　−’）ンパ球の活性化増殖に重要な働きをしておシ、
癌、細菌感染、ウィルス性疾患、免疫不全症、自己免疫
疾患などの免疫疾患の治療剤として使用できることが示
咳されている。

本発明者らは、遺伝子組換え法によシ育成されたエシェ
リヒア・コリの細胞に蓄積されたＩＬ−２活性を有する
新規ポリペプチド金見出した。このポリ被プチドはＣ−
末端にスレオニンを有し、かつ糖を含まないものである
。

具体的には、Ｎ−末端がアラニンを有し、更に詳細には
、次のアミノ酸配列Ｉｋ有するポリペプチド、及びＮ−
末端がプロリンであυ、更に詳細には次のアミノ酸配列
Ｕ’ｒ有するポｊｌ−２７’チドがある。

アミノ酸配列式■ Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔ！ｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　
Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＧＩ　Ｎ　Ｌｅｕ　Ｇ
Ｉ　Ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ
ｅｕ　ＡｓｐＬｅｕ　ＧＩ　Ｎ　Ｍｅｔ　ＩＩｅＬｅｕ
　Ａｓ　Ｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓ　Ｎ　ＡｓＮ　Ｔｙ
ｒ　Ｌｙｓ　Ａｓ　Ｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈ
ｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　ＬｅｕＴｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　
Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａ
ｌａＴｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ
　ＧＩ　Ｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＧｌｕ　Ｇｌｕ　
Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖ
ａｌ　Ｌｅｕ　ＡｓＮ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＧＩ　Ｎ　Ｓ
ｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓ　Ｎ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　ＬｅｕＡｒ
ｇ　Ｐ’ｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅ
ｒ　Ａｓ　Ｎ　Ｉｌｅ　Ａｓ　ＮＶａｌ　Ｉｌｅ　Ｖａ
ｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ
　ＧｌｕＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇ
ｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ＧｌｕＴｈｒ　Ａｌａ
　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　
Ａｓ　Ｎ　ＡｒｇＴｒｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃ
ｙｓ　ＧＩ　Ｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　５ｅｒＴｈ
ｒ’Ｌｅｕ　Ｔｈｒ アミノ酸配列式■ Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＧＩ　ＮＬｅｕ　ＧＩ　Ｎ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓ
ｐ　ＬｅｕＧＩ　ＮＭｅｔ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓ　Ｎ
　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓ　ＮＡｓＮＴｙｒＬｙｓ　Ａｓ
　Ｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅ
ｔ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＰｈｅ　ＬｙＢＰｈｅ　Ｔｙｒ　Ｍ
ｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｕＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　ＧＩ　Ｎ　Ｃｙｓ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐ
ｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓ
　Ｎ　ＬｅｕＡｌａ　ＧＩ　Ｎ　８ｅｒ　Ｌｙｓ　Ａａ
　Ｎ　Ｐｈｅ　Ｉｒ１ｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓ　Ｎ　
Ｉｌｅ　Ａｓ　Ｎ　Ｖａｌ　ｌ１ｅＶａｌ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈ
ｒ　ＴｈｒＰｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　
Ａｌａ　Ａａｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ＡｌａＴｈｒ　Ｉｌ
ｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓ　Ｎ　Ａｒ
ｇ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　ＴｈｒＰｈｅ　Ｃｙｓ　ＧＩ　Ｎ
　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　
Ｔｈｒこのような本発明のＩＬ−２，Ｎリペプチドは、
実施例１及び２に示す方法によシ育成されたエシェリヒ
ア・コＩＪ　ｆｆｉ培養すれば、細胞内又は細胞外に生
成、蓄積される。

安沈澱、塩類除去のための透析（常圧または減圧下）、
グル濾過、クロマトグラフィー、等電点平板上濃縮、グ
ル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬ
Ｃと略記）、（イオン交換、ダル渥過並びに逆相クロマ
トグラフィー）、及び色累結合担体、ＩＬ−２に対する
モノクローナル抗体を結合した活性化セファロース４Ｂ
又はレクチン結合セファロース４Ｂ等によるアフィニテ
ィクロマトグラフィー等、公知の方法によって回収する
ことができる。ＩＬ−２の単離精製法はＷａ　ｔ　ｓ　
ｏ　ｎら（Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１５０．８４９
−８６１　（１９７９）　）　。

Ｇ１１ｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ　（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｚ
　１２４＋　１９５４−１９６２（１９８０）　）　＋
　Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ　（Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　３９．１８５−２０１　（１９８０）
　）　、Ｗｅｌｔｅ、　Ｋ　ｅｔａｌ　（Ｊ、　Ｅｘｐ
、　Ｍｅｄ、、　１５６．４５４−４６４　（１９８２
））によって報告されている。

ＩＬ−２活性は、先にＧ１１ｌｉａら（Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｚ１２０、２０２７〜２０３３　（１９７８）　
）によって述べられているミクロ検定法によって確認で
きる。この検定て作成した細胞障害性Ｔ　ＩＪンパ球細
胞株（以下、ＣＴＬＬと略す。）のＩＬ−２に依存した
細胞のＤＮＡ合成能を指標としている。即ち、４×１０
　個０ＣＴＬＬ細胞を２チのＦＣ８全含むＲＰＭＩ−１
６４０培地１００μｌに懸濁し、１００μｌの連続宿駅
したアッセイサンプルと共に９６穴の平底マイクロプレ
ートに接種する。３７℃、５％ＣＯ２下で２０時間培養
した後、細胞全０．５μＣｉ／ウエルの３Ｈ７’ｒｄＲ
で４時間ラベルし、自動細胞ハーベスタ−を用いてグラ
スフィルター上に細胞全回収し、細胞が取シ込んだ放射
能を液体シンチレーション法で測定する。この検定法で
は、ＩＬ−２存在下に培養されたＣＴＬＬはそのＩＬ−
２活性に応じて’Ｈ−ＴｄＲの取シ込みが上昇するので
、検体中のＩＬ−２活性全計算によりめることができる
。

ＩＬ−２は’］’　１７７２球の増殖を促す活性を有す
るので、ＩＬ−２活性’ｋＴＩＪンパ球の増殖全指標と
して測定することもできる。即ち５個０ＣＴＬＬ細胞を
２％のＦＣ８金含むＤＭｇＭ　１００μｌＫ懸濁し、１
００μｌの連続希釈したアッセイサンプルと共に９６大
の平底マイクロプレートに接種する。７２〜９６時間、
３７℃、５％ＣＯ２下で培養した後、活性化し増殖した
細胞の数を顕微鏡下で計測する。

対照群として１００　Ｕ／ｍｌ　、　１０　Ｕ／ｍｌの
ＩＬ−２を用い、この対照群の増殖した生細胞数と比較
して検体のＩＬ−２活性をめる。

カくシて得うれたポリペプチドは抗原刺激によって哺乳
動物細胞から作られるＩＬ−２について知られているも
のと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示しＩＬ−２
活性を有する。分子量は約１５．０００ダルトンであｆ
ｉＩＬ−２活性は、Ｉｇｓｏｒｂ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｅ
ｎｔｅｒ　）の様な免疫吸着剤の有無にかかわらず完全
に中和され抗モノクローナルＩＬ−２抗体で沈澱するこ
とが出来た。免疫電気泳動ＩＬ−２ポリペゾチドは、抗
ＩＬ−２抗体に対して特異的に沈降線ヶ示す。ＩＬ−２
活性は２−メルカプトエタノールで還元後も安定であり
、ＤＮＡ５ｅ及びＲＮＡ　ｓ　ｅ処理しても又５６℃、
３０分熱処理しても安定である。活性はＰＨ２〜９で安
定である。この様にして生産されたＩＬ−２はモノクロ
ーナルな機能を有するＴ細胞（細胞障害性’ｌ’　ＩＪ
ン・９球）の増殖を促進し、胸腺細胞の***を強め、更
に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特異的細胞障害
性７９７７９球への分化を惹き起こす。またＹＡＣ−１
細胞やＲＬ♂１細胞に対するナチュラルキラー細胞の活
性化の増強に役立つ。

本発明のＩＬ−２ポリペプチド製品には、ヒト細胞によ
って生成された生理活性物質が含まれていなく、従って
、ヒト細胞から作られた公知のＩＬ−２ポリペプチド製
品よシも、治療に使用する際に便利である。とシわけ本
発明において得られたポリペプチド標品は、実質的に不
純物を含１ず、医薬品として使用できるものである。

実施例１ （１）　ヒ）Ｔ細胞系白血病細胞株であるノールカント
細胞（日本、***および米国では自由に入手可能である
）全１０％ＦＣ８’ｉ含むＲＰＭ１１６４０培地にけん
濁し、Ｘ／ｉｉｌ照射装置Ｅｘｓ　１５０　／　３００
−’　（東芝・日本）によシ５０秒間、室温で１０，０
００レントゲンに達するまで照射した。その後照射され
た細胞は上述の培地中、初期細胞密度１×１０５個／ゴ
で５チ炭酸ガス、３７℃のインキュベーター中で５日間
培養した。

この変異細胞（０，２個／穴）全９６穴の平底のマイク
ロプレートの１０穴にまき、５％炭酸ガス、３７℃ツイ
ンキュベーター中で２１日間培養した。

生育してくる穴から得られるクローンはクローン量全増
加させるため新たな培地へ移し、その増加したクローン
はＣｏｎＡ３０μ９／ｍｌ存在下で初期細胞密度Ｉ　Ｘ
　１０６コ７ｍｌで２４時間培養した。そしてＩＬ−２
活性は前述の方法に従って測定した。

この結果、ジュルカット−１１１（ＡＴＣＣＣＲＬ８１
２９）（以後”Ｊ−１１１”と称する）と命名されたヒ
）Ｔ細胞株が親株のジュルカットからクローン化、選択
され、この細胞のＩＬ−２産生能は親株の４０倍に増加
していた。

このクローン化したＪ−１１１細胞株は通常秦件下で増
殖し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとん
ど同じであった。

（２）ＩＬ−２生産能を有するシールカット１１１細胞
株（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１２９　）　’ｅ　ｌＸＩＯ３
個／　ｍｌ！　（７）細胞密度で無血清合成培地ＲＩＴ
Ｃ５５−９１，０００ｍ１ＶＣ懸濁し、ファルコン社製
回転培養瓶に入れ、３７℃で４日間培養し、遠沈操作に
よシ細胞を集めた。この細胞’ｔ　４　Ｘ　１０’個／
　ｒｎｌの細胞密度にて上述の培地中に懸濁し、ここに
ＣｏｎＡ２５μｇ／ηｌｉを添加し、上記ファルコン社
製回転培養瓶（４本）に１，０００ｍ１で張シ込み６時
間回転培養した。

このようにして得たＣｏｎＡ２５μ９／ｍｌで６時間誘
導したジュルカット細胞（１，２ＸＩＱ１０細胞）をＰ
ＢＳ溶液８０（ｌＩｌｌｃ懸濁し、細胞を遠心によって
２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であるＲｉｂｏ
ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　−Ｖａｎａｄｙｌ　Ｃｏｍｐ
ｌｅｘ　（１０ｍＭ　）を含んだＲ８Ｂ溶液（１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５。

１０　ｍＭＮａｃｔ、　１．５　ｒｒＭＩＭｇｃＬ２）
　８００ｍｌＫＭ濁した。次に、ディタージエン）　Ｎ
Ｐ−４０’ｋ　０．０５％になるように加えた後、ゆる
やかに攪拌後３，０００ｒｐｍで４℃、５分遠心して核
全除去し、その上清液にＳＤＳ　（０，５％）とＥＤＴ
Ａ　（５ｍＭ　）　ｆ加えた後、ただちにフェノールを
等量加え細胞質ＲＮＡ　’に抽出した。合計３回フェノ
ール抽出を繰返してから２容エタノールでＲＮＡ’を沈
澱し、遠心でこの沈澱を集め１０　ｍＦｖｉ　Ｔｒｉｓ
　−ＨＣｌ　、　ｐＨ７，５で溶解した。

このようにしてジュルカット細胞から得られたＲＮＡ　
ｉは１９６ｍ９であった。

次に、このＲＮＡからｍＲＮＡ　ｆ取得するためにオリ
ゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｐ、　Ｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ　＋Ｔｙｐｅ７）ｋ用い、カラムクロマトグ
ラフィー全行った。吸着は２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７，５、０，５ＭＮａＣ４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ
、　０．５％ＳＤＳ溶液にＲＮＡ　ｉ溶解して行い、溶
出は緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−１（ＣＬ　、　ｐ
Ｈ７、５、０，５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）
で洗浄後、水と１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７
，５）で交互にｍＲＮＡ　ｋ溶出することによシ行った
。この結果、溶出されたｍＲＮＡ量は３．６　ｍ９であ
った〇 さらに、このｍＲＮＡの一部（２，４ｍ９）　ｆ：　Ｓ
ＤＧ遠心（５０ｍＭＴｒｊｓ−ＨＣｔ、ｐＨ７，５，１
ｍＭＥＤＴＡ、０．２ＭＮａＣ１ｆ含む５〜２５％シヨ
糖密度勾配（Ｈｉ　ｔａｃｈｉ　）ＲＰＳ　２８０−タ
ー、　２６．００Ｏｒｐｍ　、　２４時間、４℃）によ
り分画し、１ｌ−１２ＳのｍＲＮＡ画分を分画番号１２
，１３．１４としてそれぞれ５９μＩ。

４６μｓ、６０μＪ得た。

（３）　ここに得られた分画番号１３のｍＲＮＡ　全前
出の検定法に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞に１
個当Ｊ５０ｎｇ’ｒマイクロインジェクション法により
注入して得られた卵母細胞培養上清”、（Ｉ　Ｌ　−２
の活性検定に供したところ、次表に示す’）Ｉ−）リチ
ウム化チミジンの取シ込みおよび活性化Ｔリンパ球数の
増加がみられ、これら分画のｍＲＮＡは本発明のヒ）　
Ｉ　Ｌ　−２ｍＲＮＡ　ｆ含有することが証明された（
表−■）。

表　−Ｉ （（） 対照Ｉ （アッセイ培地）　−５５３０ 分画１３の翻訳物　Ｘ２　１１５ Ｘ１６　５５　４０ ＊各希釈度の３Ｈ−トリチウム化チミジンの取シ込み量
（ｃｐｍ　）のプロビット・プロッ）Ｔｈｋｉ準ＩＬ−
２（１０単位／ａ）と比較してめた。

（４）次に、ここで得られたＩ　Ｌ　−２ｍＲＮＡを含
む１１〜１２　Ｓ　ｍＲＮＡ分画１３よ’ｐ　ｃＤＮＡ
　ｋインビトロで合成し、プラスミドベクターｐＢＲ３
２２と組換え体ＤＮＡ　ｉ作シ、これをエシェリヒア・
コリにトランスホームしてＩ　Ｌ　−２ｃＤＮＡクロー
ンヲ持つ菌体を以下の方法で選択した。

５０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＥＩＣｔ緩衝液（ＰＨ７，
５）　、　３０　ｍＭＮａＣｔ、　６　ｍＭ　ＭｇＣｔ
２．５　ｍｈクジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、　０
．５　ｍＭの各ｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ　、　ｄＣＴＰ
　。

ｄＴＴＰ　（ｄＣＴＰは３２Ｐラベルしたものを含む）
。

０．７μｌオリゴ（ｄＴ）１ｏ、　１０μ９　ｍＲＮＡ
および１５ユニツトハ■逆転写酵素（Ｊ、Ｗ、　Ｂｅａ
ｒｄ　）を混ぜ、４１℃に９０分間保った。反応終了後
、フェノール処理１圓全行い、エタノール沈澱としてＤ
ＮＡ　”、（回収し、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　１　
ｍＭ　ＥＤＴＡｐｌ（７，５溶液に溶解した。これによ
シ２．５μＩの１重鎖ｃ　ＤＮＡが合成された。この溶
液からｍＲＮＡ　ｆ除くために、ＮａＯＨｍ液を加えて
０．３３　Ｎ　ＮａＯＨとし室温にて１５時間置き、次
いで溶液ｋ　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ　、　ＦＪ（
７，５の等量で中和し「セファデックスＧ−５０Ｊカラ
ムに通した。これによシ１．８μｇのｃＤＮＡ　ｆ回収
した。

５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，５）　、　１０　ｍＭ
ＭｇＣｔ２　＊　ｌ　Ｏ忌１ＤＴＴ　、　０．７５−の
各ｄＡＴＰ　。

ｄＧＴＰ　、ｄＣＴＰ　、　ｄＴＴＰ　、　（ｄＣＴＰ
は３Ｈでラベルされたもの奮含む）、１．８μｇ１本鎖
ｃＤＮＡ　、　８ユニツトボリメレース（Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ　）　Ｉ　Ｋｌｅｎｏｗ（米国ＢＲＬ製）を混
ぜ、１５℃で１５時間反応を行った。

反応終了後、フェノール処理１回、クロロホルム処理１
ロ全行い、エタノール沈澱としてＤＮＡ　全回収した。

この反応により１．１０μＩの二重鎖ｃＤＮＡを得た◎ 次いで、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）。

０、２　Ｍ　ＮａＣ１、１ｍＭ　ＺｎＣ２２，１，１０
ｔ４二重鎖ｃＤＮＡ　’ｊｃ混ぜて３７℃で２０分間イ
ンキュベートした後、０．２５ユニツトのヌクレアーゼ
Ｓ、（三共■製）を加え、さらに１５分間インキ−ベー
トした。

反応終了後、フェノール処理を２回行い、「セファデッ
クスＧ−５０４カラムに通し、０５５μｓの二重鎖ｃＤ
ＮＡを回収した。

０．１４Ｍカコジル酸カリウム、３０ｍＭ）リス塩基、
　０．１　ｍＭＤＴＴ　、　１　ｍＭｃｏＣｔ２．０．
６４　ｍＭ　Ｐ−ｄＣＴＰ　（ｓｐｃ、　ａｃｔ、　２
．７　Ｘ　１１０６ｃｐ／ｎ　ｍｏｌ　）　ｌ００５５
μｙ二重鎖ｃＤＮＡおよび５ユニツトのターミナルトラ
ンスフェラーゼ（ＢＲＬ　）　’ｉ混ぜ３７℃で７分間
インキ−ベートし、反応終了後、フェノール処理を１口
金行い、「セファデックスＧ　−５０Ｊカラムに通しエ
タノール沈澱としてＤＮＡ０．５０μｇを回収したとこ
ろ約５０個のｄｃＭＰが両３′末端に付加された。

ｐＢＲ３２２ＤＮＡ　１０μｇ全制限酵素Ｐｓｔ　ｌで
切断したのち、前述の二重鎖ｃＤＮＡにｄＣＭＰ鎖全付
加したのと全く同じ方法でｄＣＴＰの代りにｄＧＴＰ　
ｋ用いて両３′末塙にｄＧＭＰ鎖を付加した。かくして
約５０個のｄＧＭＰが両３′末端に付加された。

５０　ｍＭｌ”ｒｉｓ−ＫＣＬ　（ｐＨ７，５）　、　
０．１　ＭＮａＣ４゜５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．０
５１４のｄＧＭＰが付加されたｐＢＲ３２２、０，０１
μ９のｄ　ＣＭＰが付加きれたｃＤＮＡ　ｋまず６５℃
で２分間、次いで４６℃で１２０分間、さらに３７℃で
６０分間、そして室温で６０分間インキュベートした。

（５）　エシェリヒア・コ！ｊ多１７７６ｉ１００μｇ
／　ｍｌのジアミノピメリン酸と５０μ９７ｍ１のチミ
ジンを含むＬ培地（１ｑｂ）リノトン、０．５％酵母エ
キス、０．５％ＮａＣｔおよび０．１係グルコースを含
む）５ＯＮに接種し、培養液の５６２ｎｍにおける吸光
度がおよそ０．３になるまで３７℃で振とう培養した。

培養終了後、培養液＝ａ℃で３０分間放置し、次に菌体
を遠心分離により集め、５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（
ｐＨ７，６）　、　０．１　ＭＮａＣ２，５ｍＭＭｇｃ
ｔ２．１０ｍＭＲｂ１ｊの溶液２５ｒｎｌで２回況浄し
た。得られた菌体ｆ　５　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣｔ（ｐ
１４７．６　）　、　０．２５　Ｍ　ＫＣｌ。

５　ｍＭ　ＭｇＣＬ　＊　０．　Ｉ　Ｍ　ＣａＣＺ２お
よび１０　ｍＭ　ＲｂＣｔを含む溶液２０ｍ１Ｋ懸濁し
、０℃にて２５分間静置後、遠心分離によυ菌体を集め
た。上記と同じ溶液１　ｍｌに菌体を再び懸濁し、得ら
れた菌体懸濁液の０．２　ｍｌに上記組換えＤＮＡ　ｋ
入れ、０℃で６０分間静置した。次に、これに前記り培
地Ｑ、　７　ｍｌを加えて３７℃で３０分間振とり培養
した。この培養液０．１＋１ｌｉｌＯＯμｇ／αジアミ
ノピメリン酸、５０μ９７ｍ１チミジンと１５μｇ／ｍ
ｌテトラサイクリンを含むＬ培地の１．５係寒天培地上
に一面に塗抹し、３７℃にて２日間インキュベートした
。

上記において出現したコロニー４３２個全それぞれ２４
コロニーを１集団とする１８集団の混合体として１００
μ９７ｍ１のジアミノピメリン酸、５０μ９７ｍ１のチ
ミジンと１０μ９７ｍ１のテトラサイクリンを含むＬ培
地２００　ｍｌに接種し、３７℃で５〜７時間振とう培
養後、クロラムフェニコールを最終濃度で１７０μｊｉ
／ｍｌになるように加えた新鮮な上記り培地２０Ｑｍ１
６追加し、さらに−晩振とり培養した。こうしてプラス
ミドＤＮＡ　ｉ増幅しておいて常法に従ってプラスミド
ＤＮＡ　’Ｊｃ　”＋’ｌ製した。

このＤＮＡ　’（ｉｌ−用いてｍＲＮＡハイブリダイゼ
ーション・トランスレーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ　−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ法、　ＨＴ法）でＩ
　Ｌ−２ｃＤＮＡ　ｆもっクローンラスクリーニングし
た。ここで用いたＨＴ法は以下のとおりである。

精製したＤＮＡ　２５μｇを制限酵素Ｈｉｎｄ　ｆＪｌ
で切断シ、フェノール処理３回、フェノール−クロロホ
ルム処理１回およびクロロホルム処理１回を行ってＤＮ
Ａ　’（ｆエタノール沈澱せしめて、ＤＮＡｆｔ−８０
％エタノールで洗浄したのち回収し、これを８０係ホル
ムアミド溶液４０μｌに溶解し、９０℃で５分間熱変性
させた。その後、１０　Ｘ　ＳＳＣ（１，５ＭＮａＣ６
゜０、１５　Ｍクエン酸３ナトリウム）で１．３　ｍｌ
に着駅シｆｃ。これをニトロセルロースフィルターに固
定し、８０℃で３時間加熱乾燥した。このフィルター全
５０％ホルムアミド、２０ｍＭビペスＰＨ６，５。

０、７５　Ｍ　ＮａＣｔ、　５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　
０．２　％　ＳＤＳおよび２５０μ９１）Ｏｌｙ（Ａ）
ｍＲＮＡ　ｆ含む溶液中で３７℃。

１８時間インキュベートしてフィルター上のＤＮＡとＩ
　Ｌ　−２ｍＲＮＡとをハイブリダイズさせた。次いで
、このフィルター７、（１０ｍＭビペス、ｐＨ６，５゜
０、１５　Ｍ　ＮａＣ４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．
２％ＳＤＳから成る溶液で６５℃で３回洗浄した後、さ
らに１ｍＭビペス、１０　ｍＭ　ＮａＣ２溶液で３回洗
浄し、次いで０、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．１％Ｓ
ＤＳ溶液で９５℃で１分処理してフィルターに吸着した
ｍＲＮＡ　ｋ溶出した。

これを常法に従ってオリゴｄＴ−セルロースカラムにか
けて回収した。この回収したｍＲＮＡ　ｋアフリカッメ
ガエル卵母細胞に注入し、蛋白に翻訳させＩＬ−２活性
全測定した。この結果、それぞれ２４コロニーを１集団
とする１８集団の中の１集団に前述の３Ｈ−）リチウム
化チミジンの取シ込み量による活性検定法によシ４８単
位／　ｍｌのＩＬ−２の活性が検出された。

そこで、さらにこの集団に属する２４コロニ一全今度は
単独にそれぞれ前記と同一の組成を有するＬ培地２００
ｍＪＫ接種し、３７℃で５〜７時間好気培養後、クロラ
ムフェニコールを加えた新鮮な上記り一培地２００ｍ１
ｆ６）追加し、さらに−夜振とり培養してプラスミドＤ
ＮＡ　’ｉｉ−増幅しておいて常法に従ってグラスミド
ＤＮＡを精製した。そして各プラスミドＤＮＡ約５μｇ
金）ｉｉｎｄｌｌ［で切断した後、前回と同様にニトロ
セルロースフィルターニ固定してＩ　Ｌ　−２ｍＲＮＡ
とハイブリダイズさせ、ｍＲＮＡを回収してアフリカッ
メガエルの卵母細胞に注入して蛋白に翻訳しＩＬ−２活
性を測定した。１コロニーより得られた精製プラスミド
ＤＮＡ　（ｐ３＝１６）にＩＬ−２活性が見出され（表
２）、本クローンｔ５　Ｉ　Ｌ　−２ｃＤＮＡ　ｔ　持
つクローン（エシェリヒア・コリ郊１７７６／ｐ３−１
６　ＡＪＩ　１９９５（ＦＥＲＭ−ＢＰ２２５））であ
ると同定された。即ちプラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡ
はＩ　Ｌ　−２ｍＲＮＡと特異的にハイブリッドを形成
するＤＮＡ　（Ｉ　Ｌ　−２遺伝子）をもつことが証明
された。

表　２　（イ） 表　２　（ロ） 本プラスミドｐ３−１６からのｃＤＮＡとノーイブリダ
イスしたｍＲＮＡ（６）ｆラスミドル３−１６のｃ　Ｄ
ＮＡインサートは制限酵素ＸｂａＩによシ１部位で、又
ＢｓｔＮＩによシ２部位（Ｘｂａ　ｌ開裂部位の上流及
び下流）で切断されるという特徴を示した。しかしなが
らプラスミドｐ３−１６は約６５０塩基対よ多構成され
るｃ　ＤＮＡインサートヲ含んでおシ、これは明らかに
１１〜１２Ｓの大きさのＩ　Ｌ−２ｍＲＮＡの一部分に
相当するものである。それ故、他のｃ　ＤＮＡライブラ
リーを、鋳型として前述の１１〜１２　Ｓ　ｍＲＮＡ分
画１３全用い、Ｌａｎｄ等の方法（Ｌａｎｄ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　ｖｏ
ｌ　９．　ｐ２５５１．（１９８１））に従って作製し
た。

−重鎖ｃＤＮＡ　（１，６ｆｉｇ）　ｋ　Ｉ　Ｌ　−２
ｍＲＮＡ　４　ｆｉｇを用いて合成し、ｄＣＴＰを使っ
て、ｄＣＭＰ残基全付加した。そしてｄ　ｓ　−ｃＤＮ
Ａを、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）によ
シプライマーとしてオリが（ｄＧ）、２〜１８ヲ用いる
事により合成した。６５０塩基対ＤＮＡ　５ｉｚｅ　ｍ
ａｒｋｅｒよシ長いｃＤＮＡ　（０，６ｆｉｇ）は蔗糖
密度勾配遠心法によって得られ、標準的なＧ　−Ｃｔａ
ｉｌｉｎｇ法によＪ　ｐＢＲ３２２のｐｓｔ　１部位へ
挿入出来た。

Ｅ、ｃｏｌｉ／Ｘ／１７７６に組換え体ＤＮＡ　’ｋ　
ｌ”ランスホーム後プローブとしてｎ１ｃｋ−ｔｒａｎ
ｓｌａｔｅｄ　ｐ　３−１６ｃ　ＤＮＡインサートを用
いたＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−ＨｏｇｎｅｓｓのＩｎ　５ｉ
ｔｕハイブリダイズ法によシ約２０００コロニー全、選
別し、およそ８５０塩基対を含むプラスミドｐＩＬ２−
５０Ａ　ｆｆｉ含有するコロニー及びトランスホームク
ローン（Ｅ、　ｃｏｌｉ　／Ｘ／１７７６／　ｐＩＬ２
−５ＯＡ。

Ａ　Ｊ　１１９９６　（ＦＥＲＭ−ＢＰ−２２６）　）
を同定した。ｐＩＬ２−５ＯＡのｃＤＮＡインサートの
制限酵素切断図を図１に示した。

Ｅ、　ｃｏｌｔ　、　′Ｘ／１７７６／　ｐＩＬ２−５
ＯＡからのＩＬ−２ベプタイド全コードしている遺伝子
を単離するため、プラスミドＤＮＡ　ｉ通常法に従い、
菌体からＤＮＡ　（５単離後制限酵素Ｐｓｔ　ｌにより
切断した◇この処理によシ生成する２つのＤＮＡ断片の
うちよシ小さな断片はＩＬ−２ペプタイドをコードして
いるＤＮＡ遺伝子であった。ｐＩＬ２−５ＯＡからのＰ
ｓｔ　ｌインサートの完全なヌクレオチド配列はＭａｘ
ａｍ　ａｎｄＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｍａｘａｍ＋　Ａ
、　Ｗ、　ｅ　ｔ　ａｌ　、　、　Ｅｎｚｙｍ。

６５、４９９−５６０．１９８０　）により決定した。

全構造を第２図に示す。

（カ　エシェリヒア・コリ細胞内でヒトＩＬ−２の合成
を指示するグラスミドは次のようにして作られた。プラ
スミドｐＴＩＬ２−２１は、図３に示すような制限地図
を有するｐＴｒＳ−３（Ｎｊｓｈｉ　ＴｚＴａｎｉｇｕ
ｃｈｉ　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　、　５ＥＪＫＡＧＡＫＵ
　５３．９６７（１９８１））、及びＩ　Ｌ　−２ｃＤ
ＮＡ　ｋ含むｐＩＩ、２−５０Ａから作られた（図４）
。

プラスミドｐＴｒＳ−３（１０Ａｇ）全先ず制限酵素５
ｉｌｌで切断しＳａｌ　１部位をＤＮＡポリメラーゼ（
フレノウ断片）あるいはＴ　４　ＤＮＡ　、１？リメラ
ーゼ処理によりフラッシュ（ｆｌｕｓｈ　）にした。Ｃ
１ａ　ｌで切断後、ｔｒｐプロモーター領域を有する大
きい方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳動に
よシ単離精製し、ＤＮＡ３μｇ全回収した。

他方、ｐｌＬ２−５ＯＡのＰｓｔ（切断により得られる
ｃＤＮＡインサート１１μＩがＨｇ１ＡＩで切断され、
Ｔ　４　ＤＮＡポリメシーゼ処理され、大きい方の断片
がアガロースゲル電気泳動によシ単離、精製された。こ
のようにしてＩＬ−２の１３２個のアミン酸分コードす
るｃＤＮＡ断片が７．２μｇ得られた。次に、ｔｒｐプ
ロモーター（上記）を含む断片０．４５μｇ　、　Ｉ　
Ｌ　−２ｃＤＮＡ　ｋ含むＨｇ１ＡＩ−Ｐｓｔ　Ｉ断片
０．５μｇおよび合成オリゴヌクレオチド（５′）ＣＧ
ＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡ　（３’）　と　（３’）
ＴＡＴＴＣＧＡＴＡ、ＣＣＧＴ（５つ（各々２０　ｐｍ
ｏｌｅ　）は両方とも５′末端でリン酸化されているが
、これ等ｆ　６．６　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１　ｍＭＡＴ
Ｐ　、　］、　ＯｍＭ　ＤＴＴ　’ｃ含む６６　ｍＭ　
）リス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）中テＴ　４　ＤＮＡ
リガー−Ｎ１．０単位を用いて連結し、４℃で一晩反応
させた。このように連結されたプラスミドはエシェリヒ
ア・コリＨＢＩＯＩにトランスホーム芒れた。アンピシ
リンを含むＬ培地寒天プレート上に出現したトランスホ
ーマントの中で、目標とするトランスホーマントは次の
ようにして選択した。１ず最初に、ＩＬ−２ｃＤＮＡお
よび合成オリゴヌクレオチドの両方とハイフリダイズ可
能なトランスホーマントカコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法にょ）選択された。

次に、ＡＴＧＧＣＡ配列の丁度下流で図２の１１１から
１１３の位置のＯＣＴ配列から始まるＤＮＡ断片（ＣＣ
ＴＡＣＴ・・・・・・）が挿入されているトランスポー
マントをＰｓｔ　（、Ｘｂａ　ｌ切断個所全検定するこ
とにより選択した。

ｐＴＩＬ２−２１　ａ又はｐＴＩＬ２−２１ｂ　ｉ含む
エシェリヒア・コ１ＪＨＢ１０１’ｅ微生物の増殖に知
られている通常の条件下で培養した。細胞は２５μｇ／
ｍｌストレプトマイシン及び２５μｇアンピシリン全含
有する１０ｍ１の矛培地（２，５％バクトドリプトン、
１％酵母エキス、０．１％グルーｙ　−、ｘ、　、　２
０　ｍＭ　ＭｇＳＯ４及び５０　ｍＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣ
ｔ、　ｐＨ７，５ｋ含む）に３７℃−晩培養した。培養
懸濁液１　ｍｌを同じ多培地（１００Ｍ）中に接種し、
３７℃で培養した。６５０　ｍμにおける吸光度が約１
．５〜２．０に達した時３−インドールアクリル酸（Ｉ
ＡＡ　）　ｙ、１添加し、添加３時間後、細胞を集め２
０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，５）　。

３０＋雨ＮａＣ４で洗滌し同じ緩衝液８ｍｌ中に再懸濁
した。ＩＡＡは能率的に機能させるために、最終濃度が
５０μ９７ｍｌなるように添加した。かくして細菌細胞
中に生産された蛋白を、超音波処理（０℃・２分）又は
リゾチーム（８μｇ）消ｆヒにょシ抽出し、次いで凍結
融解を３回繰返した。この方法によシＩＬ−２は微生物
細胞より抽出された。抽出されたＩＬ−２活性は１０，
０００〜１２，０００単位／　ｍｌであった。

ｐＴＩＬ２−２１ａ　（ＡＪ１２０１３　）又はｐＴＩ
Ｌ２−２１ｂ（ＡＪ１２０１４）を有するエシェリヒア
・コリＨＢＩＯＩはそれぞれＦＥＲＭ−ＢＰ２４８　、
　ＦＥＲＭ−ＢＰ２４９として寄託されている。

（８）　エシェリヒア・コリＡＪ１２０１３（ＦＥＲＭ
−ＢＰ２４８）全２５μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２
５μ９７ｍ１ストレプトマイシン全含有する１０１のＬ
培地（１％−）リゾトファン、０．５％酵母エキス、０
．５％ＮａＣ２および０．１チのグルコース全台む）に
接種し培養した。６５０ｎｍの吸光度が約１．０に達し
た時３−インドールアクリル酸を５０μｇ／ｍｌの０度
で加え、２時間後に菌体を集め３０　ｍＭ　ＮａＣ４７
ａ；含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄し
、同じ緩衝液１８０ｒｒＬｌ中に再び懸濁した。次に、
リゾチーム溶液２０ｍ１．更に０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ　
（ｐＨ８，０）の２ａ’に添加ののち、０℃にて２０分
間放置し、引き続き一５０℃と３７℃での凍結融解を３
回行なうことによシ菌体を粉砕し、３０．００Ｏｒｐｍ
　３０分間の超遠心分離を行なって粉砕菌体から菌体抽
出液を得た口 得られた菌体抽出液のうち１６０ｍ１（総蛋白量２．４
ｇ、ＩＬ−２活性３　Ｘ　１０”　ｕ／ｍｌ、比活性２
×１０’　ｕ／ｍ９　）　ｔ　ｐ）（７，７，０，２Ｍ
の塩化ナトリウムを含む０．１　Ｍ　）リスヒドロキシ
アミノメタン−塩酸緩衝液であらかじめ平衡化した多孔
質ガラスピーズ（ＣＰＧ　−１０、孔径３５０Ｘ、１２
０−２００メソシユ、Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｎｕｃｌｅｏｎ
ｉｃｓ社製）５（１＋１４充填したカラム（３２ｍ径ｘ
６５ｍｍ）に通液し、ＩＬ−２を吸着させた。

その後、上記の緩衝液１００　ｍｌでカラム全洗浄し、
０．ｉＭ）リスヒドロキシアミノメタン−塩酸緩衝液２
００　ｍｌで吸着ＩＬ−２’ｉ溶離させた。

得らｈｆｃ　Ｉ　Ｌ　−２溶離液１５０ａ（５、ｐＨ６
，ＯＩ）０．０７Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液に対し
て４８時間透析を行なった後、同じ緩衝液であらかじめ
平衡化したＣＭ−セファデックスＣ−２５（ファルマシ
ア社製）４０ｍｌを充填したカラム（２２叫径×１０５
叫）に通液し、ＩＬ−２を吸着させた。引き続き、同じ
緩衝液１０　’Ｏｍｌでカラムを洗浄後、ｐＨ６，０の
０．５Ｍ酢酸−酢酸す）　ＩＪウム緩衝液１００ｍ１で
吸着Ｉ　Ｌ　−２’５溶離させた。

得られた溶離液８０ｒｎｌに固型硫安を加えて８０チ飽
和とし、−夜静置後、遠心分離によって生じた沈澱全集
め、ｐＨ７，０であり、１．２５　Ｍの塩ｆヒナトリウ
ムを含む０．０５Ｍリン酸−リン酸ナトリウム緩衝液ｌ
Ｏ−に溶解し、同じ緩衝液によって平ｍ（ｋしたセファ
デックスＧ−７５スーパーフアイン（ファルマシア社製
）５００ｍｌｋ用いてダル濾過（３２咽径Ｘ　６５　ｃ
ｍ　）　ｋ行なった。Ｉｆ、−２は分子量１４，０００
〜１６，０００ダルトンに単一の活性ピークとして溶出
された。

得られたＩＬ−２画分２０麻に、グルコース全最終濃度
ＩＭとなるように加え、ｐＨ７，Ｑであシ１、２５　Ｍ
の塩化ナトリウムおよび１Ｍグルコースを含む０．０５
Ｍリン酸−リン酸ナトリウム緩衝液であらかじめ平衡ｆ
ヒしたフェニルセファロースＣＬ−１５Ｂ　（ファルマ
シア社製）　５　ｒａ１３　ｆ充填したカラム（１０濶
径Ｘ　６　ｃｍ　）にそれ全通液し、ＩＬ−２を吸着さ
せた。次に同じ緩衝液１５ｍ１でカラムを洗浄し、その
後、３０１＋ＩＡ’のｐＨ７，０であり、０．１Ｍ塩化
す）　ＩＪウムおよび１Ｍグルコースを含む００５Ｍリ
ン酸−リン酸ナトリウム緩衝液で吸着したＩＬ−２葡溶
離した。

得られ７ＣＩ　Ｌ　−２画分２０　ｍｌのうち５　ｒｎ
ｌ　ｋ、日立６３８−３０高速液体クロマトグラフィー
装誼（日立製作所製）を用いて、あらかじめｐａｌ　４
．０の０．５Ｍ酢酸−トリエチルアミン緩衝液で平衡化
したＵｌｔｒａｐｏｒｅ　ＲＰＳＣｆ充填した高速液体
クロマトグラフィー用カラム（４６能径Ｘ　７５　ｍｍ
　、Ｂｅｃｋｒｎａｎ社製）にＱ、　５　ｒｒｔｌ　／
　ｍｉｎの流速で通液した後、上記緩衝液（以下溶媒Ａ
と称する）と８０　％　ｖ／ｖ　１．−ゾロパノール水
溶液（以下溶媒Ｂと称する）を用いて、溶出を行なった
。

最初の１０分間は溶媒Ａのみ奮流し、１０分〜２２分の
間は直線グラジェント法で溶媒Ａ１００係から溶媒Ａ７
０％十溶媒Ｂ３０％に変化させて流し、２２分から８６
分の間は直線グラジェント法で、溶媒Ａ７０％十溶媒Ｂ
３０％から溶媒Ａ３０％十溶媒）３７０％に変化させて
流した。なお、タンノ４り質の検出は、日立６３８−４
１波長可変型紫外吸光度モニター（日立製作所製）を用
い、２８０ｎｍにおける吸光度測定によった。ヒ）ＩＬ
−２は溶出を始めてから７０分後に単一、のビークとし
て溶離され、菌体抽出液からの回収率は３０係であった
。ここに得られたＩＬ−２は蛋白質１■当、９５　Ｘ　
１０７ユニツトの活性を示した。

（９）得られたＩＬ−２は、５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分子量約１６，０００ダルトンの位置
に単一のバンド分水し、常法に従ってダンシル法による
Ｎ−末端残基の分析を行なった結果、Ｎ末端アミノ酸と
してアラニンのみが検出された・次に得られたＩＬ−２
約４０μｇ（２５０ピコモル）を用い、気相プロティン
シークエンブー４フ０Ａ型（アプライドバイオシステム
ズ社製）ヲ用いる自動エドマン分解法（Ｔｈｅ　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ＋　２５６巻、　７９９０−７９９７頁、　１９８
１年）によって、ＩＬ−２ｉ構成するアミノ酸全Ｎ−末
端よル逐次決定した。１段目の分解物全高速液体クロマ
トグラフィーにて分析したところ２００ピコモルのＰＴ
Ｈ−プロリンが検出され、他のＰＴＨ−アミノ酸は検出
されなかったので、ＩＬ〜２のＮ−末端アミノ酸はアラ
ニンと決定された。２段目の分解物からは、１８０ピコ
モルのＰＴＨ〜プロリンと少量のＰＴＨ−アラニンが検
出され、他のＰＴＨアミノ酸は検出されなかったので、
ＩＬ−２のＮ−末端から２番目のアミノ酸はプロリンと
決定された。３段目の分解物からは３０ピコモルのＰＴ
ｉ、（−トレオニンと少量のＰＴｉ（−ゾロリンが検出
され、他のＰＴＩ（−アミノ酸は検出されなかっ１ヒの
で、ＩＬ−２のＮ末端から３番目のアミノ酸はトレオニ
ンと決定された。なお、ＰＴＨ−）レオニンハ不安定で
分解しやすいことが知られておＪ　、ＰＴＨ−トレオニ
ンの回収率が低かったことは、この分野でしばしば経験
することである。４段目、５段目、６段目、７段目の分
解物からはそれぞれ２０〜４０ピコモルのＰＴＨ−セリ
ン、ＰＴＨ−セリン、ＰＴＨ−セリン、ＰＴＨ−）レオ
ニンのみが検出された。

ＰＴＨ−セリンも不安定で分解しやすいことが知られて
おシ、このため回収率は低かったが、低のＰＴＨ−アミ
ノ酸は検出されなかったので、ＩＬ−２のＮ−末端から
４番目から７番目までのアミノ酸はそれぞれセリン、セ
リン、セリン、トレオニ／と決定された。８段目、９段
目、１０段目の分解物からは、それぞれ１００ピコモル
のＰＴＨ−ＩＪシパン、１２０ピコモルのＰＴＨ−リジ
ン、２０ピコモルのＰＴＨ−）レオニンが検出され、工
Ｌ−２のＮ−末端から８番目、９番目、１０番目のアミ
ノ酸はそれぞれリジン、リジン、トレオニンと決定され
た。同様にしてＩＬ−２のＮ−末端から１１番目から１
５番目のアミノ酸はグルタミン、ロイシン、グルタミン
、ロイシン、グルタミン酸と決定され、このときの対応
するＰＴＨ−アミノ酸の検出値は６０〜１２０ピコモル
であった。

１６段目の分解物には、２０ぎコモルのＰＴＩ（−ヒス
チジンが検出された。尚、ＰＴＨ−ヒスチジンも回収率
の低いことが知られている。同様にしてＩＬ−２のＮ末
端から１７段目から３０段目のアミノ酸はそれぞれロイ
シン、ロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、ロイシン
、グルタミン、メチオニン、インロイシン、ロイシン、
アスパラギン、グリシン、イソロイシン、アスパラギン
、アスパラギンと決定された。このＩＬ−２の部分アミ
ノ酸配列は遺伝子の塩基配列よシ予想されたものと完全
に一致している。

次に、得られたＩＬ−２のＣ末端アミノ酸の決定を行な
った。Ｃ末端の決定はカルボキシペプチダーゼＹｉ用い
るＣｈａｎｇらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌ＋１９９
　、５４７〜５５５　（１９８１）　）の方法に準じて
行なった。ＩＬ−２約８０μｇ（５００ピコモル）を３
０μｌの０．０５モル酢酸緩衝液（ｐＨ５，４）に溶解
し、これにカルボキシペプチダーゼＹのＱ、　ｌ　ｍｙ
　／　ｍｌ溶液１μｌを加え、２５℃に保った。反応液
よシフμｌの試料を経時的に採取し、それぞれ全凍結乾
燥したのち１０　ｔｔｌｌの０．１モルＮａＨＣＯ３（
ｐＬ（９，０に調整）を加えた０次に再結晶によシ精製
したジメチルアミンアゾベンゼンスルホニルクロライド
の４ｍｍｏｌｅ／ｍｌアセトン溶液２０　μｌｌ　ｋ加
え、７０℃にて１５分加熱した後、７０％エタノール２
００μノを加え、うち１０μｌ全用いてＨＰＩ、Ｃ分析
を行なった。ＨＰＬＣ分析の結果、初期の反応液からは
ジメチルアミノアゾベンゼンスルホニル（以下ＤＡＢＳ
と略す）−トレオニンが検出され、少し遅れてＤＡＢＳ
−ロイシンが検出されたので、ＩＬ−２のＣ末端アミノ
酸はトレオニンであり、Ｃ末端付近のアミノ酸配列はロ
イシン−トレオニン（Ｃ−末端）であることが分った。

以上の実験結果よシ、得られたＩ　Ｌ　−２のＮ−末端
付近、Ｃ−末端付近のアミノ酸配列が、遺伝子の塩基配
列より予想されたものと完全に一致していることが分っ
たので、次に構成アミノ酸の組成比を調べた。

ＩＬ−２約４０μｇ（２５０ピコモル）′＋１−常法に
従い、６　Ｎ　ＨＣＬ中１１０℃、４８時間の加水分解
を行ない、アミノ酸アナライザーを用いて分析した。結
果を表３に示す。なお、上記加水分解条件で分解のおこ
ることが知られているセリン、トレオニン、トリシト７
アンについては、セリン、トレオニンは１１０℃、２４
時間加水分解での分析値を用いて補正し、トリシトファ
ンについてはケイ光分析にて別途求めた。表−３よシ明
らかな様に得られたＩＬ−２のアミノ酸組成は、遺伝子
の塩基配列よシ予想されたものと一致している。以上の
結果より、得られたＩＬ−２の１次構造はアミノ酸配列
式Ｉに示すもめと判定される。

表　３ 更にＴＬ−２の構造は、ＩＬ−２の二種の分解物の分子
量を質量分析計を用いて測定して確めた。

１５μｓのＩＬ−２（約１モル）を１４μノの７０係蟻
酸に醇解し、次いで４６μｓの臭化シアンを添加してメ
チオニンのカルボキシ側全切断し、１μｌの蟻酸中でメ
チオニンをホモセリン又はホモセリンラフトーンに変換
し、室温で一晩放置した。この反応混合物金波圧下で乾
燥させ、４０μｇの水金添加し、次いで凍結真空乾燥さ
せた。これに１４μ１０１ｆｏ炭酸アンモニウムを添加
し、次いで３７℃、０．６μノの炭酸アンモニウム中で
０．３μ、９　）　ＩＪプシン（ワーシントン社製）を
用いて分解し、リジン又はアルギニンのカルボキシ側を
切断しに００．５μｌ酢酸を反応混合物に添加し、３〜
６時間インキ−ベートした後反応混合物の３分の１を取
除き、質量分析を行った。

別の１５μｇのＩＬ−２’ｋ）リノシンの代りに０．３
μＩのスタフィロコッカスアウレウスＤ８プロテアーゼ
（ミルス社製）を用いて分解した以外は上記と同じ方法
で処理し、グルタミン酸のカルボキシ側を切断した。

混合状態の分解生成物の分子量はＪＭＳ−ＨＸ　Ｚｏ。

ｆａｓｔ　ａｔｏｍ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｍａｓ
ｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ法によシスペクロメータ
ー（ＪＥＯＬ社製）を用いて測定した。イツトピックピ
ーク全件った多種の分子のイオンピークがマススペクト
ル上に観察された。

ＩＬ−２の臭化シアン−トリプシン分解生成物の分子量
（ＭＷ＋）に相当する代表的なピークを表４に示す。

表　４ 分子量　同定物 ｍ／ｚ　１７８３　Ｌｙｓ−９ｔｏ　）Ｉｓｅ−２３ｍ
／ｚ　１６６５　Ｔｈｒ−１０ｔｏ　Ｈｓｅ−２３ｍ／
ｚ　１０４９　１１ｏ−２４ｔｏ　Ｌｙｓ−３２ｍ／ｚ
　３８９　Ｌｅｕ−３６ｔｏ　Ａｒｇ−３８ｍ／ｚ　５
０８　Ｌｅｕ−４０ｔｏ　Ｌｙｓ−４３ｍ／ｚ　５６１
　Ａｌａ−５０ｔｏ　Ｌｙｓ−５４ｍ／ｚ　２５６４　
）ｆｉｇ−５５ｔｏ　Ｌｙａ−７６ｍ／ｚ　９３９　Ａ
ｓＮ−７７ｔｏ　Ａｒｇ−８３ｍ／ｚ　１５８３　Ａｓ
ｐ−８４ｔｏ　Ｌｙｓ−９７ｍ／ｚ　１８７４　Ｃｙｓ
−１０５ｔｏ　Ａｒｇ−１２０ＩＬ−２の臭化シアン−
Ｄ８プロテアーゼ分解生成物の分子量（ＭＨ＋）に相当
する代表的なピークを表５に示す。

表　５ ｍ／ｚｌ　６１９　Ａｌａ−１ｔｏ　Ｇｌｕ−１５ｍ／
ｚ　９５２　Ｈｉｓ−１６ｔｏＨｓｅ−２３ｍ／ｚｌ　
８５９　１１ｅ−２４ｔｏ　Ｈｓｅ−３９ｍ／ｚ　９１
９　Ｌｅｕ−４０ｔｏ　Ｈｓｅ−４６ｍ／ｚｌ　２４１
　Ｌｅｕ−５３ｔｏ　Ｇｌｕ−６２ｍ／ｚ　８５７　Ｇ
ｌｕ−６１ｔｏ　Ｇｌｕ−６７ｏｒ　Ｇｌｕ−６２ｔｏ
　Ｇｌｕ−６８ｍ／Ｚ　７２８　Ｇｌｕ−６２Ｌｏ　Ｇ
ｌｕ−６７ｏｒ　Ｇｌｕ−６３ｔｏ　Ｇｌｕ−６８ｍ／
ｚ３１１　Ｇ　Ｖａｔ−６９ｔｏ　Ｇｌｕ−９５ｍ／ｚ
　６３３　Ｔｈｒ−１１１ｔｏ　Ｇｌｕ−１１６上記の
データからＩ　Ｌ、−２の一次構造の８３％が質量分析
によシ同定され、（Δｌａ−１＝Ｍｅｔ４６　。

Ａｌ　ａ５０〜Ｌｙｓ−９７及びＣｙａ−１０５〜Ａｒ
ｙ−１２０：即ち１３３のアミノ酸の内１１０のアミノ
酸）、アミノ酸配列式Ｉを有するＩＬ−２−次構造を確
認した。

実施例２ （１）エシェリヒア・コリ細胞でヒト１．Ｌ　−２の合
成全指令するシラスミド全以下の如き方法で構築した〇 プラスミドｐ’ｒ　ＩＬ２−２２　ｋ図５に示されてい
る一連の方法によりｐＴｒＳ−３（Ｎｉｓｈｉ　Ｔ、　
、　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｔ。

ｅｔ　ａｌ、、　５ＥＩＫＡＧＡＫＵ　５３．９６７、
（１９８１））及びＩＬ−２ｃＤＮＡ　ｋ含むｐＩＬ２
−５０Ａから構築した。

グラスミドｐＴｒｓ−３はＴｒｐゾロモーターとｐＢＲ
３２２のＥ（！ＯＲＩ部位とＣｌａｌ部位の間にＳｈｉ
ｎｅＤａｌｇａｒｎｏ　（以後ＳＤと略号する）の領域
を含む。

本プラスミドはスス３に示した如く、単一のｓｐｈ　１
部位と同様にＳＤ配列の下流１３　ｂｐにＡＴＧイニシ
ェーションコードン全含全台いる。蛋白に対応するＤＮ
Ａ配列かｐＴｒｓ−３のＡＴＧコードンの丁度下流のフ
ェーズに挿入されるとそのベクターはこの蛋白を生産す
るには非常に効果的である。

このＡＴＧコードンはｐＴｒＳ−３の５ｐｈｌ消ｆヒに
引続きＴ　４　ＤＮＡポリメラーゼによる処理によって
生成される。それ故シラスミドｐＴｒＳ−３（３０μｇ
）制限酵素ｓｐｈ　ｌで、常法によシ切断され、引続き
フェノール、クロロホルム処理、エタノール沈澱法によ
シ回収され両末端がＴ　４　ＤＮＡポリメラーゼ処理に
よりフラッシュにされた。

次に同様の方法によジフェノール、クロロホルム処理及
びエタノール沈澱法によりＤＮＡ　（２１，４μ９）全
回収した。他方Ｉ　Ｌ　−２ｃＤＮＡ金含む９ＩＬ２−
５ＯＡ３８０μｇはＰｓｔ　ｌによシ切断され、Ｉ　Ｉ
、　−２ｃＤＮＡインサートはアガロースゲル電気泳動
により単離された。ｃＤＮＡインサート（１１μｇ）は
Ｈｇ　ｉＡＩにより切断され、Ｔ　４　ＤＮＡポリメラ
ーゼによって処理され、大きい方の部分のＤＮＡ　１０
μｇがアガロースゲル電気泳動によシ単離された。本性
に従って１３２個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ　（
７，２１１９）が得られ、このＤＮＡ断片はプラントエ
ンド（ｂｌｕｎｔｅｎｄ　）會有していた（図５）。

次にこのようにして得ら五たｃ　ＤＮＡ断片ｉ　ＡＴＧ
配列の丁度下流で、前もってｓｐｈ　Ｉにより消化され
Ｔ　４　ＤＮＡポリメラーゼにより処理されｌｔ　ｐＴ
ｒＳ　−３ベクターへ連結した。このように連結したプ
ラスミドは次に、常法に従いエシェリヒア・コリＨＢ１
０１へ導入された。この連結は次のようにして行った。

Ｉ　Ｌ　−２ｃＤＮＡ　（０，４μ９）の前述の大きい
方の断片およびｐＴｒＳ　−３ベクターＤＮＡ　０．２
μｇｋ　６．６　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１　ｍＭ　ＡＴＰ
および１０　ｍＭ　ＤＴＴ　ｆ含むＰＨ７，５の６６ｍ
Ｍトリス−塩酸中でＴ４．ＤＮＡりが−ゼ０．８単位と
共に混合し、混合物を４℃、−晩反応させた。アンピシ
リンを含むＬ培地寒天グレート上に出現するトランスホ
ーマントの中で、１３２個のアミノ酸をコードしている
ＩＬ−２ｃＤＮＡ部分を含むコロニー全コロニーノ・イ
ブリダイゼーション法により選択した。こうして選択し
たコロニーを再び培養（１０ｍｌ　）　ｌ、、リゾチー
ム処理および凍結、融解による処理によりプラスミドＤ
ＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡ　ｆ　Ｐｓｔ　
ＩとＸｂａ　Ｉで切断し、その結果の生成物音アがロー
スグル電気泳動によシ分析し、ｃＤＮＡがｐＴｒＳ−３
のＡＴＧ配列の後に正しい方向で連結しているｐＴＩＬ
２−２２を同定した。ｐＴＩＬ２−２２　ｅ含むエシェ
リヒア・コリＨＢＩＯＩ　を微生物の増殖のために知ら
れている通常法の下に培養した。細胞は２５μｇ／ｍｌ
ストレプトマイシンおよび２５μ９７ｍ１のアンピシリ
ンをφ 含む一培地（２，５％「バクトドリプトン」、１幅酵母
エキス、０．１％グルコース、２０ｍＭＭｇＳＯ４゜５
０−トリス−塩酸、　ＰＨ７，５）　１０　ｍｌ中で３
７℃−晩生前させた。ついで培養懸濁液１ｍ１２同じグ
培地（１００ｍｌ）へ接種し、３７℃で培養した。

６５０ｍμの吸光度がおよそ１．５−２．０に達した時
点で５０μｇ／ｍｌの３−インドールアクリル酸（ＩＡ
Ａ　）　’！ｒ培地に加えた。インデューサーの添加３
時間後に、細胞全集め、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７
，５）　、　３０　ｍＭＮａｃｔｉ含むで洗浄し、同じ
緩衝液８ｄ中に再び懸濁した。

かくして細菌細胞中に産生される蛋白をソニック処理（
０℃、２分間）あるいはリゾチーム処理に引き続き凍結
融解全３回行う事によシ抽出した。

抽出されたＩＬ−２活性は１０，０００から１２０，０
００単位／　ｒｎｌの節回であった。

ｐＴＩＬ２−２２　（ＡＪ１２００９　）を含むエシェ
リヒア・コリＨＢＩＯＩはＦＥＲＭ−ＢＰ２４５として
寄託されている。

（２）エシェリヒア・コリＡＪ　１２００９　ｋ実施例
１の（８）に示した方法で培養した。それによって得た
１６０ｄのホモジネートからＩＬ−２活性を有する細胞
のホモジネート全実施例１の（８）の方法テ得た。ＩＬ
−２ポリペプチドの収率は３０チで、約５　Ｘ　１０７
単位／ｍｑのＩＬ−２蛋白を得た。

得うれｌｔ　Ｉ　Ｌ　−２ｄ？ＩＪイプチド調製品はＳ
ＤＳ　−ポリアクリルアミドダル電気泳動で分子量約１
６．０００ダルトンの位置に単一バンドを示した。

（３）得られたＩ　Ｌ　−２１０μｇを用い実施例１の
（９）に示した方法によりＩ　Ｌ　−２ｆｆｉ構成する
アミノ酸をＮ−末端より逐次決定した。Ｎ−末端から１
番目のアミノ酸はプロリン、２番目のアミノ酸はトレオ
ニンと決定された。プロリンのＮ−末端から３番目から
２００番目アミノ酸も実施９１１の（９）に示した方法
によシ、セリン、セリン、セリン、チロシン、リジン、
リジン、チロシン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミ
ン酸、ロイシン、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、
ロイシン、ロイシン、アスパラギン、ロイシンと決定さ
れｉ＋＞ＩＬ−２調製品のＣ−末端も実施列１の（９）
に示した方法により、トレオニンと決定された。実施し
１１１の（９）と同じ方法によシ質量分析によりＩＬ−
２の分解生成物の分子量全測定し、臭化シアン−Ｄ８ノ
ロテアーゼ分解生成物のｍ／ｚ　１６１９のピークの代
りにｍ／ｚ　１５４８　（Ｐｒｏ−１〜Ｇｌｕ　１４に
相当する）におけるピークを認めたほかは、実施向１と
同様の結果が得られた。

以上の結果から、得られ７’１ｘＩＬ−２の一次構造は
アミノ酸配列式（ｎ）に示したようなものである。

実施列３ （１）単独投与による同系癌ＲＬ♂１の退縮効果ＢＡＬ
Ｂ／ｃ　マウスに５×１０５のＲＬ♂１白血病細胞を腰
部皮下に移植し、移植当日、１．２，７．８．９８目の
６回に分けて各回４５，０００単位／　０．１　ｍｌの
ＩＬ−２’ｉ腫瘍近傍の皮下に投与し、１０．１４日目
の腫瘍サイズ全測定、対照（生食投与）の腫瘍サイズか
ら退縮率をめた。ＩＬ−２単独皮下投与で抗腫瘍効果が
ある事が判明した。結果を表６に示す。

用いられたＩＬ−２の標品は、実施例１に記載された方
法によシ得られた、精製されたものである。以下の実験
においても同じＩＬ−２標品を用すた。

表６　ＩＬ−２単独皮下投与による抗腫瘍効果腫瘍移植
後 ＩＬ−２投与”　８４　６５　１７１　４７マウスは１
群１０匹 ＊　ＩＬ−２は４５．ＯＱ　Ｏ単位／回、６回皮下投与
。

軸サイズは長径（個）×短径（悶）で算出。

９．ヤ□ゎあいμ町り重用」粁だ乙Ｘ　１００（％’）
対照サイズ で算出。

（２）単独投与による同系癌ＭＭ４６の退縮効果腰部皮
下に移植し、移植後１１．１２．１３日目の３回に分け
て各回５，０００単位／　Ｑ、　１　ｍｌのＩＩ。

−２を腹腔内に投与し、２６日目の腫瘍重量全測定、対
照（生食投与）の腫瘍重量から退縮率をめた。又、５０
％生存日数をめた。ＩＬ−２単独腹腔内投与で抗腫瘍効
果がある事が判明した。

結果全表７に示す。

表７　ＩＬ−２単独腹腔内投与による抗腫瘍効果腫瘍移
植後２６日目　生　存　日　数 ＩＬ−２投与”　２．２４　５０　５８　１４９マウス
は１群１０匹 ＊　ＩＬ−２は５，０００単位／回、３回腹腔内投与。

で算出。

（３）単独投与による同系層Ｐ８１５の退縮効果ＤＢＡ
／２マウスにＰ８１５マストサイトーマを腰部皮下に移
植し、移植後１．２．３，７．８．９日に６回に分けて
各回４５．０００単位１０．１　ｍｌのＩＬ−２を腫瘍
近傍の皮下に投与し１７日目に肺癌サイズを測定、移植
当日１，２，５，６．７日に６回に分けて各回４５，０
００単位／　０．１　ｄのＩＬ−２全腹腔内に投与し１
５日目に腫瘍サイズを測定、および移植後１２．１３，
１４．１５．１６日に５回に分けて各回４５，０００単
位７０．１　ｍｌのＩＬ−２に静脈内に投与し１７日目
に腫瘍サイズを測定し、各々の対照（生食投与と比較し
、各々の投与ルートで抗腫瘍効果のある事が判明した。

結果全表８に示す。

表８　ＩＬ−２単独投与による抗腫瘍効果＊移植量は２
．５Ｘ１０５ ＊＊移植量はＩ　Ｘ　１０６ 林＊腫瘍サイズは皮下投与は腫瘍移植後１７日目、腹腔
内投与は腫瘍移植後１５日目、及び静脈内投与は腫瘍移
植後１７日目。

退縮率は表６と同様に算出した。

マウスは１群１０匹。

（４）同系層ＭＭ４６に対する化学療法剤との併用によ
る延命効果 Ｃ３Ｈ／ＨｅマウスにＭＭ４６乳癌細胞をｌＸｌ０　腰
部皮下に移植後１２日目にサイフロフォスフアミド（Ｃ
Ｙ）　１００　ｍ９／に９を腹腔内に投与し、ＩＬ−２
を腫瘍移植後１９，２０．２１日目の３回に分けて、各
回１，０００単位／　０．１１ｎｌ腹腔内に投与し対照
（生食投与、ＣＹ単独投与、！Ｉ、−２単独投与）と５
０チ生存日数を比較し、化学療法剤（ｃｙ　）とＩＬ−
２の併用により抗腫瘍効果を認めた。結果を第９表に示
す。

対照（生食）３６一 対照（ＣＹ）　８０　２２２ 対照（ＩＬ−２）　４６　１２８ マウスは１群１０匹 （５）同系層Ｐ８１５に対する化学療法剤との併用によ
る抗腫瘍効果 ＤＢＡ／２マウスにＰ８１５マストサイトーマを１×１
０６腰部皮下に移植後８日目にサイクロフォスフアミド
（ｃｙ）１ｏｏキ／に９を腹腔内投与し、ＩＬ−２を腫
瘍移植後１２，１３，１４，１５゜１６日目の５回に分
けて各回４５，０００単位１０．１ｍｌ静脈内に抗与し
腫瘍移植後１７日目の腫瘍サイズを測定し、対照と比較
し、抗腫瘍効果を認めた。

結果を表１０に示す。

対照（生食）２６６ 対照（ＣＹ　）　１３４　５０ 対照（ＩＬ−２）　１９４　２７ マウスは１′群ｌＯ匹。

＊＊＊腫瘍サイズは表１の通り。

林林退縮率は表１の算出法と同じ。

【図面の簡単な説明】

図１はＩＬ−２活性を持つポリペプチドをコードするク
ロン化された遺伝子の制限酵素地図でるる。 図２はクローン化された遺伝子の塩基配列を示すＯ 図３はグラスミドベクターｐＴｒｓ−３を示す。 図４は組換えＤＮＡ　ｐＴＩＬ２−２１の造成経過の説
明図である。 図５は組換えＤＮＡ　ｐＴＩＬ２−２２の造成経過の説
明図である。 図中、Ａ、Ｇ、Ｃ，Ｔはそれぞれデオキシアデニル酸、
デオキシグアニル酸、ｒオキシチジリック酸、チミノリ
ン酸を示す。 特許出願人　財団法人癌研北会 味の素株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）Ｃ−末端がスレオニンであり、糖全有せず、かつ
   インターロイキン２活性を有するポリペプチド。 （２）Ｎ−末端がアラニンである特許請求の範囲第（１
   ）項記載のポリペプチド。 （３）Ｎ−末端がゾロリンである特許請求の範囲第（１
   ）項記載のポリペプチド。 （４）下記のアミノ酸配列式Ｉｋ有する特許請求の範囲
   第（１）項記載のポリペプチド。 アミノ酸配列式Ｉ Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔ
   ｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＧＩ　Ｎ　Ｌｅｕ　ＧＩ
   　Ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅ
   ｕ　ＡｓｐＬｅｕ　ＧＩ　Ｎ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ
   　Ａｓ　Ｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓ　Ｎ　ＡｓＮＴｙｒ
   　Ｌｙｓ　Ａｓ　Ｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ
   　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＰｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐ
   ｈｅ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌ
   ａ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　
   ＧＩ　Ｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＬ
   ｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａ
   ｌ　Ｌｅｕ　Ａｓ　Ｎ　ＬｅｕＡｌａ　ＧＩ　Ｎ　Ｓｅ
   ｒ　Ｌｙｓ　Ａｓ　Ｎ　Ｐｈｅ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ａｒ
   ｇ　Ｐｒ。 Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓ　Ｎ　
   Ｉｌｅ　Ａｓ　Ｎ　Ｖａｌ　ｌ１ｅＶａｌ　Ｌｅｕ　Ｇ
   ｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈ
   ｒ　Ｔｈｒ　ＰｈｅＭｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　
   Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ｌ
   １ｅＶａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓ　ＮＡｒｇ
   　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　ＣｙｓＧＩ　Ｎ　
   Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔ
   ｈｒ（５）下記のアミノ酸配列式■全有する特許請求の
   範囲第（１）項記載のポリペプチド。 アミノ酸配列式■ Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌ
   ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＧＩ　ＮＬｅｕ　ＧＩ　Ｎ　Ｌ
   ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓ
   ｐ　ＬｅｕＧＩ　Ｎ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓ　
   Ｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓ　Ｎ　ＡｓＮＴｙｒ　Ｌｙｓ
   　Ａｓ　Ｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ
   　Ｍｅｔ　ＬｅｕＴｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔ
   ｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＡｌａＴｈｒ
   　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　ＧＩ　Ｎ
   　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌ
   ｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅ
   ｕＡｓ　Ｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＧＩ　Ｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙ
   ｓ　Ａｓ　Ｎ　Ｐｈｅ　ＨｉｓＬｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ
   　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓ　Ｎ
   　ｌ１ｅＡｓ　Ｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　
   Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＳｅｒＧｌｕ　Ｔｈ
   ｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ
   　Ａｌａ　ＡｓｐＧｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉ
   ｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓ　ＮＡｒ
   ｇ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＧＩ　
   Ｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　ｌ１ｅＳｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　
   Ｔｈｒ （６）Ｃ−末端がスレオニンであシ、糖を有せずかつイ
   ンターロイキン２活性を有するポリ啄プチドの医薬用に
   実質的に精製された標品。